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République algérienne démocratique et populaire.

Université Djillali Liabes


Faculté de Médecine
Département de Pharmacie

TP N°02
Dosage des protéines
totales plasmatique.

Réalisée par:
• GHERMI Mohamed.
• TAHRI Mahmoud.
• CHAREF KHODJA Meriem.
• BETTAYEB Mohamed Amine.

4 ème année pharmacie G05.

Année universitaire : 2008 / 2009


TP N° 02 DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

I- Généralités :
Les protéines représentent la plus grande partie des matières solides du plasma. En dehors
du fibrinogène, protéine fibreuse, ce sont toutes des protéines globulaires. Seule la sérum-
albumine est une holoprotéine, toutes les autres étant des hétéroprotéines pouvant
contenir des lipides (lipoprotéines), des métaux (métalloprotéines) et surtout des glucides, la
plupart des protéines plasmatiques sont en effet des glycoprotéines.

Leurs propriétés sont très variables : transporteurs, anticorps, enzymes, agents de pression
oncotique, marqueurs de l'inflammation, marqueurs tumoraux, agents de la coagulation,
facteurs de croissance, etc. Mais il faudra différencier les protéines toujours présentes dans
le plasma, éléments constitutifs de celui-ci et celles, d'origine cellulaire, n'y apparaissant que
transitoirement.

 Maintien de la pression oncotique.


• Molécules présentent en grande quantité
• Molécules ayant des propriétés physico-chimiques particulières.
• Représentant principal est la sérum albumine, les globulines et notamment l’α-
globulines.

 Fonction de transport.
• Assurée par l’albumine et de nombreuses globulines relativement spécifiques vis-à-
vis de leur ligand plus ou moins spécifique.
• Les globulines sont plus spécifiques dans leur ligand.

 Rôle inhibiteur de protéases


• Permettent de limiter l’action des protéases libérées dans le sang par des cellules.
• Inhibent des protéases par des mécanismes diverses.

 Rôle de cofacteur d’enzyme.


• Exemple : α1-glycoproteine acide ou orosomucoïde : Cofacteur de la lipoprotéine
lipase.
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 Rôle dans la coagulation.


• Exemple :
- Le fibrinogène : glycoprotéine asymétrique et de grande taille.
- Protéines C,
- Protéines S,
- … etc.

 Rôle dans l’immunité.


• Les immunoglobulines.
• Les fractions protéiques du complément.
• Toutes les protéines impliquées dans la transmission de l’information.

II- Exploration des protéines :


L'exploration des protéines plasmatiques est réalisée par le dosage individuel de
telle ou telle protéine, par le regroupement de quelques dosages, sous le terme
de profil protéique, par l'électrophorèse qui peut être faite sur des supports
différents et enfin par l'étude éventuelle d'une protéinurie.

 Méthodes colorimétriques
 Électrophorèse des protéines
 Dosages immunologiques
– Turbidimètriques
– Néphélémètriques
– Immunoenzymologiques

1. Réaction de Biuret
1. 1. Principe :
En milieu alcalin, les ions cuivriques donnent avec les liaisons peptidiques
un complexe de coloration violet-pourpre. L’intensité de la coloration est
proportionnelle à la concentration des protéines. Cette coloration est
mesurée par spectrophotométrie en lumière visible. C’est une méthode
simple, rapide et fiable mais peu sensible.

2. Fractionnement des protéines sériques


2. 1. Méthodes électrophorétiques :
Elles se fondent sur la charge électrique des protéines en solution et sur
leur mobilité.
Les protéines, substances amphotères, possèdent à la fois des charges
positives et négatives et selon le pH de la solution, elles se comportent
comme possédant soit plus de charges positives, soit plus de charges

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négatives. La migration des protéines sous l’influence du champ électrique


sera donc fonction du pH.

2. 2. Méthode d’immunodifusion
 Méthode d’Oudin ou d’immunodiffusion simple
On incorpore l’anticorps à la gélose dans un tube; à la surface on
dépose l’antigène, celui-ci diffuse.
Le contact antigène-anticorps s’effectue et une ligne de précipitation
s’établit. C’est la première méthode immunologique en milieu solide.

 Méthode d’Ouchterlony ou de double diffusion


On utilise un bloc de gélose dans lequel on perce trois godets. Dans
l’un on place une préparation contenant un antisérum et dans les
deux autres on place deux antigènes.
Les molécules diffusent dans la gélose en fonction de leur taille et
forment des lignes de précipitation pour chaque système antigène-
anticorps correspondant à leur zone d’équivalence respective c’est à
dire à la formation d’un réseau Ag-Ac.

 Méthode d’immunodiffusion radiale ou de Mancini


Elle sert à l’estimation quantitative d’un antigène. Elle fait appel à
une immunoprécipitation en gel d’agarose entre l’antigène et un
anticorps connu.

2 3. Méthodes d’immunoélectrophorèse
 Définition
L’immunoélectrophorèse, aussi appelée gammaglobuline
électrophorèse ou immunoglobuline électrophorèse est une méthode
mettant en jeu une séparation électrophorétique des protéines dans
un gel d’agarose suivie d’une double diffusion selon une direction
perpendiculaire à l’axe de migration électrophorétique contre un
antisérum. Chaque zone d’équivalence correspondant à un précipité
Ag-Ac se traduit par un arc de précipitation. On peut utiliser des
antisérums globaux reconnaissant toutes les protéines majeures du
sérum ou des antisérums spécifiques.

 Principe
Les protéines sériques sont fractionnées par électrophorèse en gel
d’agarose, puis un antisérum est déposé dans une rigole parallèle à
l’axe de migration. Les protéines diffusent dans le gel à partir de leur
zone de migration, les anticorps à partir de la rigole. Des lignes de
précipitations se forment au niveau des zones d’équivalences.
Selon sa migration, sa concentration et sa diffusion dans la gélose, et
selon la spécificité de l’antisérum utilisé chaque protéine donne lieu à
un arc de précipitation dont la forme et la position sont
caractéristique.

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 Intérêt
L’immunoélectrophorèse est une méthode permettant d’étudier
toutes les protéines, une catégorie de protéines ou une protéine
particulière, si on utilise respectivement un antisérum, un anticorps
spécifique d’un mélange de protéines ou d’une protéine. Elle est
surtout utilisée pour les immunoglobulines. Elle est utilisée dans le
diagnostic des myélomes multiples et dans le diagnostic de
beaucoup de maladies du système immunitaire et dans l’évolution
des réponses thérapeutiques.
Les différentes méthodes utilisées sont :

• Méthode de Williams et Grabar


C’est une combinaison de l’électrophorèse en gélose ou en
agarose, avec une réaction de précipitation spécifique antigène-
anticorps: on réalise d’abord une électrophorèse en milieu gélifié
à pH 8,2 sur une plaque recouverte d’un gel d’agarose, puis on
dépose dans une gouttière centrale un immuno sérum
antiprotéine humaine et on laisse diffuser.
On observe alors des arcs de précipitations, très nets,
correspondant chacun à une fraction protéique particulière.
La migration électrophorétique sépare particulièrement les
protéines. Le sérum de cheval antiprotéique humain mis dans la
gouttière contient des anticorps spécifiques; ceux ci mis au
contact du même antigène ayant migré par électrophorèse dans
le gel, donnent après diffusion un arc local.

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• Méthode de Laurel
On dépose différentes dilutions de protéines antigéniques dans
des puits creusés dans un gel d’acrylamide agarose contenant
l’antisérum. Le courant électrique est appliqué
perpendiculairement à la ligne des godets. Les précipités
triangulaires sont proportionnels à la quantité d’antigène.

3. Autres méthodes :
• Méthode au BCA (acide bicinchonique) 1970 :
Technique ayant une très bonne limite de détectabilité et facile à
mettre en oeuvre.

• Mesure directe de l’absorbance (λ = 280 nm):


Aminoacides aromatiques ou λ = 210 nm : liaisons peptidiques) très
bonne limite de détectabilité (0,1 gL-1) mais utilisable uniquement sur
des solutions parfaitement limpides.

• Méthodes utilisant la fixation de colorants sur les protéines


avec modification de la couleur :

 Technique au méthylorange (hélianthine).


 Technique au vert de bromocrésol.
 Technique de Bradford (1976) : Bleu de Coomassie :
Le bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le
tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F)
(surtout à R; huit fois plus qu'aux autres en fait).
En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux
protéines, il a une forme anionique bleue qui absorbe à 595nm.
La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (0,2
— 20 µg de protéines).

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• Méthode de Lowry (1951) :


Limite de détection 100 fois plus faible que celle de biuret mais dont la
précision n’est que de l’ordre de 5 à 10 % (la loi de Beer Lambert ne
semble pas tout à fait respectée et la spécificité est diminuée par
l’interférence de nombreux dérivés ; réducteurs en particuliers).

III- Application TP « ECH N°56 » :


La méthode utilisée est celle de Biuret.

1- Rappel :
En milieu alcalin (NaOH), à froid, les ions cuivriques (Cu2+) forment avec les
liaisons peptidiques un complexe de coordination coloré en rose, qui ajouté à la
teinte bleue du réactif donne finalement une coloration pourpre (bleu-violet).
Cette réaction est positive dès que la molécule possède 3 à 4 liaisons peptidique,s
elle est donc utilisable pour les protéines et les polypeptides.
La mesure de l’absorbance se fait à 540 nm après avoir laissé la coloration se
développer 30 min.
La technique tire son nom de la molécule le biuret NH2–CO–NH–CO–NH2 (obtenu
par condensation de 2 molécules d’urée NH2–CO–NH2) qui donne une la
coloration violette.
La technique a été développée par Gornall (1949) qui a laissé son nom au réactif
utilisé pour la colorimétrie.

2- Préparation des réactifs :


• R1 :
Tartrate de Na+, K+, 4H20 (160mmol/l):
MM = 282,23 g/mol
V= 200 ml.
M = X.
n= 160 * 200/1000 = 32 mmol ;
X= 32. 10-3 * 282,23 = 9,03136 g.

Sulfate de Cu, 5H20 (20mmol/l) :


MM = 249,69 g/mol
V= 200ml.
M= Y.
n= 20 * 200/1000 = 4 mmol ;
Y= 4.10-3 * 249,69 = 0,99876 g

Iodure de K+ (30mmol/l):
PM= 166g/mol
V= 200ml
M= Z.

Z= 30.10-3*0,2*166 = 0,996 g.
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NaOH (0,2N) :
PM= 40g/mol
V=200ml
M= W
W= 0,2*0,2*40 = 1,6 g.

• R2 :
Iodure de K+ (30mmol/l) qsp 200ml :
M= 0,996g.

NaOH(0,2N) qsp 200ml :


M= 1,6g.

La solution de travail correspond au mélange des deux réactifs dans les


proportions suivantes :

 1 volume R1 + 4 volumes R2 (30ml R1 + 120ml R2)

3- Mode opératoire :
Le tableau suivant résume les étapes procédées lors de ce TP :

Blanc Etalon Echantillon


Eau distillée (ED) 100 µl
Etalon 100 µl
Echantillon 100 µl
Solution de W 5 ml 5 ml 5 ml

Après avoir ajouté la solution de travail :


• Bien mélanger ;
• Laisser à température ambiante pendant 30mn ;
• Lecture au spectrophotomètre à λ = 546 nm.

Remarque :
La concentration de l’étalon [Etalon] = 80 g/l ;
L’échantillon utilisé est le N° 56.

4- Résultats & valeurs normales:


a- Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés sur ce tableau :

Etalon Echantillon

Absorbance (D0) 0,213 0,162

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[ech] = * [Etalon].
 
 

,
[ech] = * 80.
,

[ech] = 60, 845 g/l.

b- Valeurs normales :
• Sang :

• LCR (Protéinorachie): 0,28 < N < 0,52.


• Urine (Protéinurie) : 50 < N < 150 mg/24H.
• Liquide d’épanchement :
- Transsudat : de 10 à 20 g/l ;
- Exsudat : > 25 g/l.

c- Interprétation des résultats :


Les résultats obtenus lors de ce TP concernant le dosage de la protéinémie
du sujet (N°56) peuvent être interprétés de la manière suivante :

 Si le sujet N°56 est un enfant, la valeur obtenue de la protidémie (≈


61g/l) est dans les normes usuelles ;

 Si le sujet est un adulte, il serait en dessous de la limite inférieur des


normes usuelles (Hypo-protidémie), il faudra interpréter selon le
contexte clinique et faire éventuellement des examens
complémentaires tels que :
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- Electrophorèse sur gel ;


- immuno-électrophorèse ;
- dosage spécifique des protéines plasmatique ;
- dosage de la protéinurie ;
-…

Les principales causes d’une hypo-protidémie (jusqu’à 15g/l) sont les


suivantes :
 à une carence d'apport en protéines, à une malabsorption intestinale
des protéines (insuffisance pancréatique) ;

 à un défaut de synthèse lors d'une insuffisance hépatique sévère


(pathologies hépatiques, alcoolisme et hépatite chronique) ou d'un
déficit en immunité humorale ;

 à un catabolisme accéléré (dénutrition sévère, néoplasie) ;


 à une fuite anormale des protéines en cas de pertes extériorisées
(hémorragies aiguës), cutanées (brûlures), intestinales (entéropathies
exsudatives, hémorragies digestives) ou rénales (syndromes
néphrotiques, glomérulonéphrites).
L'apparition d'une protéinurie rénale massive accompagne
l'hypoprotidémie en cas de pertes rénales ;

 à une modification du volume de distribution. Dans les syndromes


inflammatoires généralisés secondaires à un état de choc, sepsis ou
traumatisme, l'augmentation de la perméabilité capillaire
s'accompagne d'une fuite des protéines vers l'espace interstitiel.

 Un excès d'apport hydrique peut faire chuter rapidement la


concentration des protéines surtout chez les prématurés et N.N.

 Certains traitements tels que la dialyse péritonéale peuvent également


induire une baisse de la concentration des protéines lorsqu'ils sont
utilisés de manière prolongée.

Cependant les hyper-protidémie peuvent être dues à :


 le plus souvent à une diminution du volume plasmatique
(déshydratation extracellulaire) observée en cas de pertes
liquidiennes, diabète insipide et hypertension artérielle ;

 à une augmentation de la synthèse des gammaglobulines polyclonales


observées dans certaines pathologies auto-immunes et syndromes
inflammatoires chroniques (le lupus érythémateux disséminé, les
maladies du collagène, le rhumatisme articulaire aigu). Certaines
hyperprotidémies peuvent dépasser 120 g/l en cas de synthèse de
gammaglobulines monoclonales observées dans les contextes de
gammapathies monoclonales (myélomes).

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