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Espectroscopa: elaboracin de una curva patrn para cuantificar la sacarosa

1. Objetivo El objetivo de esta prctica consiste en utilizar la tcnica de espectrofotometra para elaborar una recta patrn de sacarosa a partir de concentraciones conocidas de este disacrido. Mediante interpolacin, esta recta permite determinar la concentracin de sacarosa en una muestra desconocida. Se utilizar un mtodo colormetrico que utiliza el cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) para que reaccione con la sacarosa tras su hidrlisis qumica con HCl.

2. Fundamentos

El DNS reacciona nicamente con los azcares reductores. La sacarosa es un disacrido no reductor, pero tras su hidrlisis en medio cido se liberan glucosa y fructosa que s son reductores y reaccionan con el DNS generando un producto coloreado. La intensidad del color, que se puede medir por mtodos

espectrofotomtricos es proporcional a la concentracin de sacarosa.

Los mtodos espectrofotomtricos permiten calcular la intensidad de radiacin (luz con una longitud de onda determinada) emitida o absorbida por una sustancia. La cuantificacin se realiza aplicando la ley de Lambert-Beer:

A=.c.l donde:
A = Absorbancia medida en el espectrofotmetro

= Coeficiente de absorcin molar a una determinada longitud de onda. Es


la absorcin de luz con una determinada longitud de onda de una disolucin 1M, cuando el paso ptico es de 1cm. Se expresa en M-1. cm-1 c = Concentracin en moles/litro (M) (en las mismas unidades que ) l = Paso ptico (espesor del tubo que contiene la disolucin, en cm). En las cubetas estndar que se utilizan para hacer las medidas es de 1 cm.

3. Preparacin a) Materiales Vasos de precipitados (de 2 de 50 y 2 de 100 ml), gradilla con tubos de 20 ml, rotulador para vidrio, pipetas automticas de diversos volmenes, pipetas de vidrio con su dispositivo para pipetear, cubetas especiales para medir en el espectrofotmetro, espectrofotmetro visible, pipetas Pasteur de plstico, bao de agua a 90C, bao de hielo, agitatubos, agitador magntico, tubo de dilisis.

b) Reactivos cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), sacarosa 10 mM, HCl 2 M, NaOH 2M, NaCl 2M, agua destilada.

b) Preparacin de los tubos con concentraciones conocidas de sacarosa Se utilizarn tubos de cristal de unos 20 ml que se numerarn del 0 al 5. Se les aaden distintos volmenes de una disolucin de sacarosa 10 mM (se utilizar una pipeta automtica) y se aade agua destilada de modo que, al final, todos los tubos tengan un volumen de 8 ml, tal y como se indica en la siguiente tabla:

Tubo n Sacarosa 10 mM (ml) H2O destilada (ml)

0 0 8

1 0,5 7,5

2 1 7

3 1,5 6,5

4 2 6

5 2,5 5,5

c) Tratamiento La sacarosa no lleva carbono anomrico libre, por lo que no es reductor. Por tanto, antes de mezclarla con el reactivo DNS, es necesario hidrolizarla con un cido fuerte como el HCl. Por lo tanto, la reaccin colorimtrica se lleva a cabo en 3 etapas:

1.- Hidrlisis cida:

Tubo n Sacarosa 10 mM (ml) H2O destilada (ml) HCl 2 M (ml)


AGITAR

0 8 1 + + +

0,5 7,5 1 + + +

1 7 1 + + +

1,5 6,5 1 + + +

2 6 1 + + +

2,5 5,5 1 + + +

Calentar 20 minutos a 100C Introducir en agua fra

2.- Neutralizacin:

Tubo n NaOH 2M (ml) AGITAR

0 1 +

1 1 +

2 1 +

3 1 +

4 1 +

5 1 +

En este momento, cada tubo contiene un volumen aproximado de 10 ml. Para continuar con el protocolo hay que tomar 2 ml del contenido de cada tubo y transferirlos a un nuevo juego de tubos de ensayo, numerados igual que los anteriores.

3.- Reaccin con DNS (con aparicin de producto coloreado):

Tubo (nuevo) n ml del juego de tubos anterior cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) (ml)
AGITAR

0 2 1 + + + 7 + +

1 2 1 + + + 7 + +

2 2 1 + + + 7 + +

3 2 1 + + + 7 + +

4 2 1 + + + 7 + +

5 2 1 + + + 7 + +

Calentar 5 minutos a 100C Introducir en agua fra con hielo H2O destilada (ml)
AGITAR

Medir la Absorbancia a 540 nm (A540)

NOTA IMPORTANTE: Cuando se manipule el DNS es necesario utilizar guantes.

d) Medida de la Absorbancia a 540 nm (A540) y elaboracin de la recta patrn Se enciende el espectrofotmetro y se selecciona la longitud de onda de 540 nm (luz de color verde) Se espera al menos 10 minutos para que se estabilice el aparato La absorbancia (A) se mide en tubos especiales adecuados a cada espectrofotmetro. Con el contenido del tubo blanco (tubo 0, [sacarosa] = 0) se ajusta la transmitancia al 100% (T = 100) o la absorbancia a cero (A = 0), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para realizar las medidas se llena el tubo especial del espectrofotmetro hasta 1 cm del borde. El contenido de los tubos no se tira por la fregadera sino que se devuelven al tubo original y se tirar despus de representar la curva patrn en el bidn de residuos preparado a tal efecto. Realizar las medidas comenzando por el tubo de menor concentracin y terminando con el de mayor concentracin. Los valores de A540 se van apuntando en la tabla adjunta:

Tubo n
[sacarosa] (mM) A540

d) Clculos y Resultados 1.- Calcular las concentraciones de sacarosa en cada tubo y aadir ese dato a la tabla anterior

2.- Representar en un grfico los datos de A540 frente a la [sacarosa] 3.- Determinar el coeficiente de absorcin molar () de la sacarosa