Ann Toxicol Anal. 2008; 20(4): 227-232 c Socit Franaise de Toxicologie Analytique 2009 DOI: 10.

1051/ata/2009036

Disponible en ligne www.ata-journal.org

Article original Dosage des mtabolites urinaires des thers de glycol par chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse
Determination of urinary metabolites of glycol ethers by gas chromatography mass spectrometry
Laurence Labat1 , Luc Humbert1 , Betty Dehon1 , Luc Multigner2, Ronan Garlantezec2 , Catherine Nisse3, Michel Lhermitte1
1 2 3

Laboratoire de Toxicologie et Gnopathies, CHRU de Lille, Avenue du Pr. J. Leclercq, 59037 Lille Cedex, France INSERM U 625, Universit Rennes I, 35042 Rennes Cedex, France Service de Pathologie Professionnelle et Environnement, CHRU de Lille, 1 Avenue Oscar Lambret, 59037 Lille Cedex, France
Rsum Objectif : Les thers de glycol sont utiliss dans de nombreuses prparations usage professionnel ou domestique, en particulier en tant que solvant. Les proprits reprotoxiques de certains sont principalement lies leur biotransformation dans lorganisme. Les mtabolites acides sont limins par voie urinaire, ce qui en fait des indicateurs intressants pour la surveillance en milieu professionnel ou en sant environnementale. Nous prsentons une nouvelle mthode de dosage en chromatographie phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (GC-MS). Mthodes : La dtection se fait en mode dionisation chimique ngative avec du mthane comme gaz ractant et lacquisition est ralise en mode full scan de 85 152 m/z. Cette mthode permet une surveillance biologique par le dosage simultan de huit mtabolites urinaires : les acides mthoxyactique (MAA), mthoxy-thoxyactique (MEAA), thoxyactique (EAA), thoxy-thoxyactique (EEAA), 2-butoxyactique (2-BAA), propoxyactique (PrAA), phnoxyactique (PhAA) et mthoxypropionique (MPA). Rsultats : La mthode est linaire de 0,05 2 mg/L pour MAA, MEAA, EAA, EEAA, PrAA et MPA et de 0,01 2 mg/L pour 2-BAA et PhAA avec des coecients de rgression suprieurs 0,99 pour chacun des mtabolites. Les limites de dtection sont de 0,01 mg/L pour les six premiers mtabolites et de 0,001 mg/L pour 2-BAA et PhAA. Les rptabilits et les dlits intermdiaires dtermines pour les huit mtabolites pour une concentration de 0,5 mg/L sont infrieures 10 %. Les premiers rsultats dune tude pilote (tude INSERM) permettant une estimation de lexposition aux thers de glycols dans une population de femmes enceintes sont prsents. Conclusion : Ces rsultats montrent que notre mthode de dosage en GC-MS est susamment spcique et sensible pour permettre la surveillance de personnes exposes de faibles niveaux en milieu professionnel ou environnemental. Mots cls : thers de glycol, chromatographie en phase gazeuse-spectromtrie de masse, environnement, exposition professionnelle Abstract Introduction: Glycol ethers are solvents that are present in a large number of products used commercially

and domestically. Reprotoxic properties of some of them are associated with the formation of urinary metabolites. Biological monitoring of these alkoxycarboxylic acids in urine is useful in monitoring occupational or environmental exposures. We present a new method developed by gas chromatography equipped with a mass spectrometry (GC-MS). Methods: Detection is realised in negative ionization mode with methane in full scan acquisition between 85 and 152 m/z. This method provides a procedure for the simultaneous urine analysis of eight acids: methoxyacetic (MAA), methoxy-ethoxyacetic (MEAA), ethoxyacetic (EAA), ethoxy-ethoxyacetic (EEAA), 2-butoxyacetic (2-BAA), propoxyacetic (PrAA), phenoxyacetic (PhAA) and methoxypropionic (MPA) acids. Results: The method is linear (r2 > 0.99) from 0.05 to 2 mg/L for MAA, MEAA, EAA, EEAA, PrAA and MPA and from 0.01 to 2 mg/L for 2-BAA and PhAA.

Correspondance : Laurence Labat, Tl. (33) 3 20 44 55 61, Fax (33) 3 20 44 47 29, laurencelabat@yahoo.fr

Article publi par EDP Sciences

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L. Labat et coll.

The limits of detection of the rst six metabolites are 0.01 mg/L and 0.001 mg/L for 2-BAA and PhAA. Repeatability and intermediate delity for the eight metabolites for an urinary concentration of 0.5 mg/L are less than 10%. First results of a biomonitoring pilot study of INSERM Unit 625 are described. Conclusion: This study is an evaluation of exposure to glycol ethers during pregnancy in the general population. The results of this preliminary study show that GC-MS method developed is specic and sensible enough for the evaluation of glycol ethers exposures at low levels in the general population.
Key words: Glycol ethers, gas chromatography, mass spectrometry, environment, occupational exposure

Reu le 15 dcembre 2008, accept aprs modications le 20 janvier 2009 Publication en ligne le 28 avril 2009

1 Introduction
Les thers de glycols forment une famille denviron 80 substances prsentes dans de nombreux produits industriels et domestiques. Ce sont des molcules drives de lthylne glycol ou du propylne glycol. Leur nature amphiphile les rend miscibles dans leau et dans la plupart des solvants organiques et permet dexpliquer leur trs grande utilisation. Leur faible toxicit compare de nombreux autres solvants de mmes proprits, a galement multipli leur prsence dans des produits comme les colles, les encres, les vernis, les peintures, les produits dentretien, les produits cosmtiques et les produits pharmaceutiques. On connat actuellement la toxicit plus importante des drivs de la srie thylnique et en particulier du monomthyl ther (EGME) et du monothyl ther (EGEE) [1, 2] (tableau I). En plus dune toxicit hmatologique [3], il semble exister un lien entre linfertilit masculine et lexposition chronique ces produits [1,2]. Les cas publis dintoxication aigu chez lhomme par des thers de glycol sont trs nombreux [1, 2]. Le mtabolisme des thers de glycols dpend de la position du groupement alcool sur la chane alkyle (gure 1). Les thers de glycol de la srie thylnique possdent une fonction alcool primaire qui se mtabolise dans lorganisme par la voie de lalcool dshydrognase puis de laldhyde dshydrognase lorigine de la formation dacides alkoxyactiques limins dans les urines. Certains de ces acides alkoxyactiques sont reprotoxiques, notamment lacide mthoxyactique (MAA) et lacide thoxyactique (EAA) (tableau I). Ils ont t dcrits comme possdant la toxicit la plus importante de lensemble des mtabolites. Lacide 2-butoxyactique (2-BAA) produit par le mtabolisme de lthylne glycol butyl ther (EGBE) a t dcrit comme le plus puissant compos pour ses proprits hmolytiques [1, 2]. Dans la srie propylnique des thers de glycol, les isomres sont majoritaires et nont pas de fonction alcool primaire. Ils se mtabolisent par les voies oxydatives des cytochromes P450 lorigine de la formation de CO2 , ce qui en fait des produits de choix pour viter les risques de toxicit pour la reproduction. Cependant, il existe aussi les isomres minoritaires nayant pas eux-mmes dintrt commercial mais qui se retrouvent comme impurets de synthse. Ils ont une fonction alcool primaire et peuvent se mtaboliser en acides alkoxypropioniques potentiellement toxiques, comme par exemple lacide mthoxypropionique (MPA). Ces isomres entranent ainsi des eets toxiques semblables aux drivs thylniques [1, 2].
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De nombreuses mthodes de dosages des acides alkoxyactiques et alkoxypropioniques dans les urines ont t publies [48]. Elles permettent le suivi biologique de lexposition aux thers de glycol. Dans ces tudes, la chromatographie en phase gazeuse couple une dtection en mode ionisation de amme (GC-FID) ou en capture dlectrons (GC-EC) est gnralement utilise. En 1989, Groeseneken et coll. dcrivent une mthode de dosage en GC-EC pour le dosage des principaux acides alkoxyactiques. Cette tude montre chez des volontaires sains, que le dosage de ces composs acides dans les urines est parfaitement corrl lexposition des sujets par la mesure des thers de glycol dans lair atmosphrique [5]. Plus rcemment, dautres tudes dcrivent le dosage de certains acides alkoxyactiques en chromatographie phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (GC-MS) [911]. Sakai et coll. en 1994, dcrivent le dosage du 2-BAA en GC-MS aprs hydrolyse [9]. Shih et coll. en 1999 publient une mthode simplie sans drivation en GC-MS pour le dosage des mtabolites MAA, EAA et 2-BAA dans les urines [10]. Dans cette tude les eets de la matrice urinaire non ngligeables pour le MAA et lEAA sont signicatifs pour le 2-BAA [10]. Nous prsentons une nouvelle mthode en GC-MS pour le dosage des mtabolites urinaires des principaux thers de glycols utiliss en milieu industriel. Cette mthode permet une surveillance biologique dans le cadre dexpositions professionnelles aux thers de glycols par le dosage simultan de huit mtabolites urinaires : les acides MAA, EAA, 2-BAA, propoxyactique (PrAA), phnoxyactique (PhAA), mthoxypropionique (MPA), mthoxy-thoxyactique (MEAA) et thoxythoxyactique (EEAA) (tableau I).

2 Matriels et mthodes
2.1 Ractifs

Tous les ractifs utiliss sont de qualit analytique. MAA, EAA, PhAA ont t obtenus chez Sigma Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, France), 2-BAA chez Acros Organics (Noisy-le-Grand, France) et MEAA chez Fluka (SaintQuentin-Fallavier, France). PrAA et lacide 2-pentoxyactique utilis comme talon interne ont t synthtiss par le Laboratoire de Chimie Thrapeutique de la Facult des Sciences Pharmaceutiques de Lille et EEAA nous a t gracieusement fournis par le Dr Juha Pulkkinen (Universit de Kuopio, Finlande). Le sulfate de tetrabutylammonium hydrogn (TBAHS) a t obtenu chez Sigma Aldrich, le bromure de

Annales de Toxicologie Analytique 2008; 20(4): 227-232 Tableau I. thers de glycol et principaux mtabolites acides forms et doss en GC-MS dans les urines [2]. thers de glycol EGME*, EGDME*, DEGME*, DEGDME*, TEGME, TEGDME* DEGME, TEGME EGEE*, EGDEE*, DEGEE, DEGDEE, TEGEE DEGEE, TEGEE EGBE, DEGBE, TEGBE EGnPE EGPhE 1PG2ME* Mtabolites acides A. mthoxyactique A. mthoxythoxyactique A. thoxyactique A. thoxythoxyactique A. butoxyactique A. propoxyactique A. phnoxyactique A. mthoxypropionique Abrviations des mtabolites acides MAA MEAA EAA EEAA BAA PrAA PhAA 2-MPA

L. Labat et coll.

* thers de glycol classs toxiques pour la reproduction ou le dveloppement embryofoetal en 2008.

2.2 Instrumentation et conditions danalyse

La sparation chromatographique est ralise sur un chromatographe en phase gaz de type GC 8000 (ThermoFinnigan, Courtaboeuf, France) coupl un spectromtre de masse de type Automass 30+ (ThermoFinnigan). Un passeur automatique de type AS 800 (CE Instruments, Wigan, UK) permet linjection des chantillons. Lensemble des donnes est acquis sur un logiciel de type XcaliburTM (ThermoFinnigan). Linjection des chantillons est ralise en mode sans division (splitless) une temprature de 200 C. La colonne est une BPX-5MS (25 m 0,25 mm, 0,25 m) (SGE, France). Le gaz vecteur est de lhlium utilis un dbit de 1 mL/min. La temprature initiale du four est de 70 C maintenue pendant 2 min puis augmente de 2 C par minute jusqu 120 C. Aprs 0,5 min 120 C, la temprature augmente jusqu 320 C la vitesse de 25 C par minute et est maintenue pendant 5 min. La temprature de la ligne de transfert est xe 270 C. La dtection se fait en mode dionisation chimique ngative avec du mthane comme gaz ractant. La source est une temprature de 200 C. Lacquisition est ralise en mode spectre complet (full scan) de 85 152 m/z.
2.3 Prparation des solutions talons

partir des solutions aqueuses 1 g/L des huit acides, un mlange 2 mg/L de chacun dentre eux est prpar. Il se conserve un mois labri de la lumire +4 C. Lensemble des chantillons utiliss pour la validation de la mthode (gamme de calibration y compris) sont des prlvements urinaires dans lesquels des ajouts de mlanges de mtabolites ont t raliss.
Fig. 1. Mtabolisme des thers de glycol.

2.4 Prparation de lchantillon

pentauorobenzyl (PFBBr) chez Fluka, le dichloromthane chez Carlo Erba (Peypin, France) et le pentane chez Fluka. Le laboratoire participe au programme de contrles externes de qualit German External Quality Assessment Scheme (G-EQUAS, Nuremberg, Germany) pour les mtabolites EAA et 2-BAA.

100 L durine sont ajouts de lacide 2-pentoxyactique (talon interne, 0,1 g) et 1 mL de TBHAS (0,1 M) pour un ajustement du pH la valeur de 6,0. Aprs incubation pendant 16 h au bain marie 37 C en prsence de PFBBr (5 L) dans du dichloromthane (3 mL), la phase organique est isole. Aprs vaporation sous azote, lextrait est repris par du pentane (50 L).
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L. Labat et coll.

MEAA MAA

EAA MPA

PrAA

BAA PhAA

EI EEAA

Fig. 2. Trac chromatographique dun calibrateur prpar la concentration nale de 1 mg/L pour chacun des mtabolites. Tableau II. Temps de rtention et ions de quantication utiliss en GC-MS pour les huit mtabolites acides et ltalon interne (EI). Mtabolites MAA EAA 2-BAA PrAA PhAA MPA MEAA EEAA EI Temps de retention (min) 23,8 27,5 31,0 29,9 32,7 27,9 31,2 31,6 29,3 m/z 89 103 131 117 151 103 133 147 145

Grossesse et de lInfertilit) et a t ralise partir dchantillons de PELAGIE [12]. Un chantillon urinaire est recueilli chez 200 femmes enceintes provenant de deux rgions de Bretagne. Six mtabolites ont t mesures dans ces chantillons : MAA, EAA, 2-BAA, PrAA, PhAA et MPA. Lensemble des rsultats des concentrations des mtabolites acides dans les urines sont exprims en mg/g de cratinine.

3 Rsultats
Dans les conditions opratoires dcrites, la sparation chromatographique des huit mtabolites et de ltalon interne est ralise en moins de 33 min (gure 2). Les temps de rtention sont rsums dans le tableau II. Une relation linaire est dcrite de 0,05 2 mg/L pour MAA, MEAA, EAA, EEAA, PrAA et MPA et de 0,01 2 mg/L pour 2-BAA et PhAA avec des coecients de rgression suprieurs 0,99 pour chacun des mtabolites. Les limites de dtection sont de 0,01 mg/L pour les six premiers mtabolites et de 0,001 mg/L pour 2-BAA et PhAA. Elles ont t mesures pour chacun des acides partir de la valeur moyenne du bruit de fond mesure sur 20 chantillons laquelle on ajoute trois carts-type. Les rptabilits et les dlits intermdiaires dtermines pour les huit mtabolites pour une concentration de 0,5 mg/L sont infrieures 10 %. Lexactitude mesure partir des derniers contrles externes de qualit G-EQUAS (n = 4) est situe entre 92,7 % et 97,4 % pour lEAA et 104,2 % et 113,3 % pour le 2-BAA.

2.5 Quantication

Pour chaque mtabolite, un ion de quantication est slectionn (tableau II).

2.6 Application une tude pilote en population gnrale

Une tude pilote a t mene lunit INSERM U625 (Rennes, France) pour estimer les expositions professionnelles ou environnementales chez des femmes enceintes dirents solvants dont les thers de glycols. Cette tude est prliminaire ltude environnementale nomme PELAGIE (Perturbateurs Endocriniens, tude Longitudinale sur les Anomalies de la
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Annales de Toxicologie Analytique 2008; 20(4): 227-232 Tableau III. Rsultat de ltude pilote de lexposition des femmes enceintes aux thers de glycol (tude PELAGIE, INSERM U625) [12]. Mtabolites Dtection Moyenne gomtrique Maximum (%) (mg/g cratinine) (mg/g cratinine) MAA 35,00 0,10 0,38 EAA 1,50 0,08 0,31 BAA 18,50 0,08 1,03 PrAA 1,50 0,03 0,11 PhAA 97,00 0,58 73,91 MPA 22,50 0,43 8,75

L. Labat et coll.

Cette nouvelle mthode de dosage a t utilise dans ltude pilote mene lUnit INSERM 625. Des rsultats prliminaires sont prsents dans le tableau III [12]. Pour les mtabolites EAA et PrAA, moins de 2 % des urines de femmes sont dpistes positives cest- dire suprieures une concentration de 0,05 mg/L. Par contre on observe des prvalences leves respectivement de 35 % et 19 % pour des mtabolites dcrits comme reprotoxiques ou hmatotoxiques, MAA et 2BAA respectivement. Pour ces deux derniers, les concentrations moyennes restent faibles (tableau III). Pour le MPA, seul mtabolite de la srie des thers de glycol de la srie des propylniques (1-mthoxy 2-propanol), 23 % des urines sont dpistes positives avec une moyenne gomtrique relativement leve. Enn, PhAA est prsent dans une trs grande majorit des cas et on a pu observer un chantillon avec une concentration leve de 73,9 mg/g de cratinine.

4 Discussion
Cette tude prsente une nouvelle mthode de dosage en GC-MS des principaux marqueurs urinaires des thers de glycol. La mthode dcrite a t optimise pour huit mtabolites sachant que dautres marqueurs comme lacide 2-thoxypropionique (2-EPA) ou lacide butoxythoxyactique (BEAA), nont pas t suivi dans notre laboratoire en raison de la non disponibilit des solutions talons dans le commerce. notre connaissance, cette mthode est la premire dcrite dans la littrature permettant le dosage simultan de huit mtabolites dans les urines. Dautre part, elle permet le suivi de deux nouveaux marqueurs, le MEAA et lEEAA, mtabolites acides de nouveaux thers de glycol de type 2-(2-alkoxyethoxy)-thanol dont trs peu de mthodes de dosage pour une surveillance biologique ont t dcrits dans la littrature [11, 13]. La GC-MS en mode dionisation chimique ngative permet de mesurer des concentrations faibles dans des chantillons urinaires en particulier pour certains mtabolites acides comme le 2-BAA. Nous proposons une prparation dchantillon assez simple mme si elle ncessite un temps dhydrolyse plus long que celui de mthodes publies sans hydrolyse [10]. Dans notre tude, le dosage des mtabolites acides est possible aprs utilisation dun agent estriant, le bromure de pentauorobenzyl. Dans la littrature, direntes mthodes sont utilises et en particulier une tape destrication par de lthanol est dcrite par Laitinen et coll en

1997 [8] ou plus rcemment par BHymer et coll. en 2003 pour le MEAA [11]. Notre mthode est sensible avec des limites de dtection plus faibles que celles dcrites dans la littrature par Shih et coll. (Ldd de 0,055 mg/L pour le MAA) [10] ou par BHymer et coll. (Ldd entre 0,02 et 0,08 mg/L pour le MEAA) [11]. La drivation utilise dans notre mthode permet damliorer la sensibilit et la sparation des acides qui se retrouvent sous une forme moins polaire. La quantication en GC-MS est ralise par la mesure de lion le plus abondant qui correspond dans notre mthode lion M-1 (tableau II). Pour chaque mtabolite, on constate ainsi la perte de lagent drivant sur le seul ion retrouv lors de la fragmentation. Le mode dionisation chimique ngative choisi explique certainement cette fragmentation douce. Cette mthode de dosage a t optimise dans notre laboratoire pour une surveillance de lexposition professionnelle aux thers de glycol [14]. En eet, les concentrations des mtabolites acides dans les urines sont bien corrles au risque pour la sant chez lhomme [1, 2]. Ils deviennent ainsi des paramtres biologiques spciques et intressants dans le cadre dune surveillance. Pour le MAA et le 2-BAA, le NIOSH (National Institute for Occupational Safety and Health) propose des valeurs dexposition professionnelle de 30 et 60 mg/g de cratinine en dbut de poste et n de semaine de travail lors dune exposition 5 ppm de mthoxythanol ou de 2-butoxythanol respectivement [15, 16]. Le tableau IV rsume les recommandations internationales actuelles disponibles pour ces paramtres de biosurveillance. Il existe trs peu de valeurs de rfrence en milieu professionnel ou en population gnrale et celles qui sont aujourdhui en application ne semblent pas toujours adaptes. Les valeurs limites dexpositions professionnelles restent trs leves malgr une classication rcente comme reprotoxiques de certains dentre eux (tableau I). Un exemple de surveillance en population gnrale est prsent et montre que notre mthode de dosage peut galement tre utilise dans le cadre dtudes environnementales. La mthode est susamment sensible pour lensemble des marqueurs et dans la grande majorit des cas une linarit maximum dcrite jusqu 2 mg/L est adapte une estimation correcte des concentrations urinaires de ces mtabolites. On notera cependant, la prsence quasi systmatique de PhAA dans les chantillons urinaires en exposition professionnelle et dans lexemple de ltude pilote prsente dans cet article. La prsence de PhAA, signe dune exposition frquente au phnoxythanol semble compatible avec lutilisation trs importante du phnoxythanol dans les produits cosmtiques largement consomms actuellement par lensemble de la population.

5 Conclusion
Notre mthode de dosage en GC-MS des mtabolites acides des thers de glycol est spcique et sensible et permet une surveillance de personnes exposes de faibles niveaux en milieu du travail ou une surveillance en population gnrale. Mme si lon observe une diminution du suivi de lexposition professionnelle aux thers de glycol en France, la surveillance biologique reste un outil indispensable lvaluation des risques.
231

Annales de Toxicologie Analytique 2008; 20(4): 227-232 Tableau IV. Valeurs recommandes des marqueurs urinaires lors de lexposition aux thers de glycol [15, 16]. Valeurs en population gnrale Indices biologiques dexposition

L. Labat et coll.

MAA PhAA PrAA EEAA EAA

EPA MEAA EEAA BAA

< 0, 5 mg/L [15]

Biological Exposition Index of American conference of Governmental Industrial Hygienists : BEI de lACGIH = 100 mg/g crat. Biologischer Arbeitssto Toleranzwert, valeur biologique de rfrence allemande : BAT = 50 mg/L (n de poste, n de semaine) Valeur guide en France = 100 mg/g crat. (n de poste, n de semaine) Valeur de rfrence en Finlande = 50 mmol/mol crat. (n de poste, n de semaine) Valeur de rfrence en Finlande = 120 mmol/mol crat. (n de poste, n de semaine)

Remerciements. Les auteurs remercient Jermy Thomas et Virginie Clin du Laboratoire de Toxicologie et Gnopathies du CHRU de Lille pour leur aide technique prcieuse dans cette tude.

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