Manual de Laboratorio de Microbiología Uc

UNIVERSIDAD CUAUHTMOC ESCUELA DE MEDICINA LICENCIATURA EN MEDICINA
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
ELABOR: M.C ANA MARGARITA MARTNEZ VERSTEGUI San Lus Potos, S.L.P. Semestre Agosto Diciembre 2013
UNIVERSIDAD CUAUHTMOC. LABORATORIO DE MICROBIOLOGA. ESCUELA DE MEDICINA
REGLAMENTO PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA OBJETIVO

Comunicar al alumno y personal de laboratorio la importancia de acatar las disposiciones establecidas para proeger la salud fsica y mental reduciendo al mnimo los riesgos de adquirir enfermedades de trabajo relacionadas con la microbiologa. 1. Dentro del laboratorio es obligatorio el uso de uniforme y la bata de algodn, perfectamente cerrada y zapato cerrado. Cuando se requiera, utilizar guantes, cubrebocas y lentes de seguridad. 2. El alumno se hace responsable del material en el momento de recibirlo SI SE ROMPE ALGN MATERIAL DURANTE LA PRCTICA SE DEBER REPONER INMEDIATAMENTE POR EL ALUMNO. 3. En ninguna prctica el alumno podr pipetear las diversas soluciones con la boca. Es obligatorio el uso de perillas para tal fin, adems ser indispensable el uso de lentes de seguridad cuando la prctica lo requiera. 4. Identificar con claridad los medios de cultivo preparados y/o reactivos con base al procedimiento utilizado. 5. Est terminantemente prohibido fumar, ingerir alimentos o bebidas y hablar por telfono en el laboratorio. 6. Mantener las reas de trabajo limpias despus de cada sesin. 7. El lavado de manos es antes y despus de la prctica. 8. Se debe participar en la separacin ambientalmente adecuada de los Residuos Peligrosos Biolgico Infecciosos (RPBI) generados en el laboratorio, en base a los procedimientos establecidos. 9. En caso de accidente o derrame de cepas bacterianas, avisar al profesor de inmediato. 10. Es necesario que el alumno sea puntual a la sesin del laboratorio, teniendo como tolerancia 15 minutos. 2
11. Leer previamente la prctica y contar con los conocimientos bsicos requeridos sealados.
EVALUACIN DEL LABORATORIO
1. El alumno deber aprobar el 75% del nmero total de prcticas del laboratorio, lo que equivale a un mximo de 3 prcticas rechazadas. 2. El resultado de cada reporte se expresar como ACEPTADO RECHAZADO, y se deber llevar un registro de la calificacin numrica del 0 al 10. 3. La calificacin mnima para considerar ACEPTADA la prctica es de 7.0. Todo reporte evaluado deber ser revisado por el alumno. 4. El reporte ser entregado en la fecha que se indique, de no ser as se considerar reporte RECHAZADO (tomando en cuenta slo la calificacin de las preguntas). 5. La inasistencia (no justificada) a alguna prctica se considera para fines de evaluacin como reporte RECHAZADO.
EVALUACIN DE LA PRCTICA
Un reporte debe contener los siguientes puntos: 1.-Objetivo 2.-Materiales y mtodos 3.-Resultados 4.-Discusin de resultados 5. Cuestionario 6.-Conclusiones 7.-Bibliografa PONDERACIN 1.- Examen PRE-LABORATORO 2.- Objetivo y Materiales y Mtodos (incluir dibujos de metodologa) 3.-Resultados (incluir dibujos y observaciones) 4.-Discusin de resultados 5.- Cuestionario 6.-Conclusiones 7.- Bibliografa 3.0 puntos 1.0 punto 1.5 puntos 0.5 puntos 2.0 puntos 1.0 punto 1.0 punto
Orden y limpieza- Dejar el laboratorio tal y como lo encontraron al inicio de la prctica, de no ser as se restarn 0.5 puntos.
PROGRAMA DE PRCTICAS. Semestre Agosto-Diciembre 2013

FECHA
INSTRUCCIO NES GENERALES
NOMBRE DE LA PRACTICA
OBJETIVO
12/13-Ago
SEGURIDAD E HIGIENE EN Conocimiento de las normas de seguridad e higiene en EL el Laboratorio, la disciplina y precaucin general como 19/20-Ago LABORATORI medidas preventivas. O FUDAMENTOS Manejo y conocimiento del Microscopio y su importancia DE en el diagnostico microbiolgico. 26/27-Ago MICROSCOPIA Conocimiento de las Tcnicas de tincin de Bacterias TINCION DE mas importantes en Microbiologa y la utilidad de 2/3-Sept BACTERIAS identificar las formas microbianas.
PRACTIC A 1 PRACTIC A 2 PRACTIC A 3 PRACTIC A 4 PRACTIC A 5
9/10-Sept
CULTIVO DE LAS BACTERIAS EXUDADO FARINGEO
23/24-Sept
PRACTIC A 6
EXUDADO FARINGEO Y 30/31-Sept ANTIBIOGRA MA LECTURA DE RESULTADOS 7/8-Oct DE LA PRCTICA 6
Conocimiento y precaucin para el cultivo de bacterias, conocer los procedimientos de inoculacin y los medios de cultivo especficos. Conocer las condiciones generales para la toma de muestra del exudado farngeo. La importancia en el diagnostico de una infeccin bacteriana en las vas respiratorias altas, el procedimiento de identificacin del streptoccocus B hemoltico. Comprender los resultados de un exudado farngeo. Aprender las bases de la utilidad e indicaciones de un antibiograma en la prctica clnica, el efecto de los antimicrobianos sobre las bacterias.
PRACTIC A 7
14/15-Oct
ACTIVIDAD BIOQUIMICA EN LOS MOS INTERPRETAC IN DE RESULTADOS PRCTICA 7 COPROPARAS ITOS-COPA
Uso de las pruebas bioqumicas, identificacin y uso de cada una de las pruebas bioqumicas en la identificacin de bacterias.
21/22-Oct
PRACTIC A 8
28/29-Oct
PRACTIC A 9
4/5-Nov
MICOLOGIA (HONGOS)
Conocer el examen coproparasitoscpico para el diagnostico de la parasitosis intestinal, los mtodos utilizados. El procedimiento de flotacin de Faust. Aqu descrito. Conocer la utilidad del examen directo con KOH, (hidrxido de potasio) en la identificacin de agentes micticos, conocer las tcnicas de inoculacin en los medios de cultivo, aprender las diferentes morfologas micticas.
SEMINAR IOS ENTREGA DE CALIFICA CIO-NES
11 y 25 de Nov 02-dic
El alumno realizar la exposicin de un artculo cienfco relacionado con temas de inters microbiolgico.
PRCTICA 1 SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA. OBJETIVOS

Dar capacitacin al alumno y personal de apoyo en el desarrollo de las actividades propias de Microbiologa, a travs de un ambiente seguro. El alumno sera capaz de documentar y aplicar las medidas de seguridad e higiene necesarias para garantizar su seguridad en el Laboratorio de Microbiologa, con base a las normas oficiales que apliquen.
INTRODUCCIN
Desde los tiempos ms remotos de la historia el hombre ha procurado su seguridad, traduciendo este trmino como ausencia de riesgo para la salud. Hoy en da se considera la seguridad como el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud del hombre. La realizacin de buenas prcticas de seguridad e hygiene en el Laboratorio de Microbiologa, reduce significativamente los riesgos para la salud, presentes en el manejo de materiales infecciosos en el ambiente de trabajo. Las prcticas seguras incluyen requisitos necesarios para reducir o eliminar el riesgo de exposicin a agentes potencialmente infecciosos para el personal de laboratorio y el ambiente exerno. Adems nos conducen a trabajar con eficiencia y calidad en las actividades realizadas en los
diferentes procesos microbiolgicos ya sean de enseanza, investigacin o de vinculacin y asesoras o en el servicio de diagnstico. En el alboratorio de Microbiologa, adems de la disciplina y precauciones generales, deben observarse normas especficas, ya que los microorganismos poseen caracersticas muy particulares como ser patgenos, su presencia pasa totalmente inadvertida, an cuando se encuentran en cantidades muy elevadas. Se diseminan rpidamente, se pueden multiplicar fuera de control en otras zonas de laboratorio, como el drenaje, la basura o los reactivos y con ello alterar el equilibrio ecolgico.
PRCTICAS Y PROCEDIMIENTOS SEGUROS Son aspectos sencillos realizados en el trabajo diario de Laboratorio que comprenden principalmente dos tipos de barreras, primarias y secundarias.
Las barreras primarias incluyen: Batas, guantes, cubrebocas, botas, caretas y googles. Campanas de seguridad biolgica. Contenedores cerrados. Rotor. Contenedor cerrado deiseado para evitar la liberacin de aerosoles durante la centrifugacin. Las barreras secundarias incluyen: Diseo y construccin de las instalaciones. Disponibilidad de lavabos, autoclaves, etc. Sistemas especializados de ventilacin para asegurar la
unidireccionalidad del flujo del aire. Iluminacin, ventilacin, etc. 7
Instalaciones Debe proveerse de instalaciones convemientemente situadas para lavarse y secarse las manos, siempre que as lo exija la naturaleza de las operaciones realizadas en el laboratorio. El Laboratorio de Microbiologa debe disponer de agua, jabn y solucin desinfectante para el lavado de manos. Debe contra con un medio higinico apropiado para el secado de las manos. Si se usan toallas desechables debe haber junto a cada lavabo un dispositivo de distrivucin receptculo conviene que los grifos no requieran un accionamiento manual. Los recipientes para desechos y basura deben mantenerse tapados e identificados. Los desechos y basura generada en el area de laboratorio dee ser removida diariamente. Los recubrimientos en paredes, techos y muebles del laboratorio deben ser lavables. Los espacios entre mesas, gabinetes y equipo deben ser accesibles a la limpieza. No son apropiadas las alfombras. Las mesas de trabajo seran impermeables al agua y resistentes al calor moderado, a los solventes orgnicos, a los cidos y a los lcalis, y a los desinfectantes usados para descontaminar las superficies y el equipo. Si el laboratorio tiene ventanas que den al exterior, estas deben estar equipadas con mosquiteros.
Limpieza y desinfeccin.
Se debe llevar a cabo una limpieza eficaz y tegular en el laboratorio y equipo para eliminar residuos de los productos manejados y suciedades que contengan microorganismos. Despus de este proceso de limpieza, se debe efectuar, cuando sea necesario, la desinfeccin, para reducir el nmero de microorganismos que hayan quedado, a un nivel tal que no contaminen las muestras o medios de cultivo que se elaboran.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
En la actualidad existe una clasificacin de los Laboratorios en base a las combinaciones de prcticas y tcnicas de laboratorio, equipos seguridad e instalaciones de laboratorio (ANEXO 2). Nivel de Bioseguridad 1. Son adecuados para laboratorios destinados a la educacin o capacitacin secundaria o universitaria, y para otros laboratorios en los cuales se trabaja con cepas definidas y caracterizadas de microorganismos viables que no se conocen como generadores sistemticos de enfermedades en humanos adultos aparentemente sanos. Requiere de un nivel bsico de contencin que se basa en prcticas microbiolgica estndar sin ninguna barrera primaria o secundaria especialmente recomendada, salvo yna pileta para lavado de manos. Ejemplo de microorganismos que se pueden manejar en este tipo de Laboratorio: Bacillus subtilis. Nivel de Bioseguridad 2. Las prcticas, los equipos, el diseo y la construccin de instalaciones son aplicables a laboratorios educativos, de diagnstico, clnicos u otros laboratorios donde se trabaja con un amplio espectro de agentes de riesgo moderado que se encuentran presentes en la comunidad y que estn asociados con enfermedad humana de variada gravedad. Con buenas tcnicas microbiologicas, estos agentes se pueden utilizar en forma segura en actividades realizadas en una mesa de trabajo. Se deben utilizar las dems barreras primarias que correspondan, tales de
como mascaras contra salpicaduras, proteccin facial, delantales y guantes. Se debe contra con barreras secundarias, tales como iletas para lavado de manos e instalaciones de descontaminacin de desechos a fin de reducir la containacin potencial del medio ambiente. Ejemplo de microorganismos que se pueden manejar en este tipo de Labotatorio: Virus de Hepatitis B, HIV, Salmonella, Toxoplasma ssp. Nivel de Bioseguridad 3. Las prcticas, equipos de seguridad y el diseo y la construccin de las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 3 pueden aplicarse a instalaciones clnicas, de produccin, investigacin, educacin o diagnstico, donde se trabaja con agentes exticos o indgenos con potencial de transmission respiratoria, y que pueden provocar una infeccion grave y potencialmente letal. Las barreras secundarias para este nivel incluyen el acceso controlado al laboratorio y requisitos de ventilacin que minimizan la liberacin de aerosoles infecciosos desde el laboratorio. Ejemplo de microorganismos que se pueden manejar en este tipo de Laboratorio: Mycobacterium, virus de encephalitis de St. Louis, y el Coxiella burnetti. Nivel de Bioseguridad 4. Son aplicables al trabajo con agentes peligrosos o txicos que representan un alto riesgo individual de enfermedades que ponen en peligro la vida, par alas cuales no existen vacunas o terapias disponibles. Los riesgos principales para el personal que trabaja con agentes del Nivel de Bioseguridad 4 son la exposicin respiratoria a aerosoles infecciosos, la exposicin de membranas mucosas o piel lastimada a gotitas infecciosas y la auto inoculacin. El aislamiento completo del personal de laboratorio de los materiales infecciosos en aerosol se logra principalmente trabajando en gabinetes de seguridad biolgica Clase III o en un traje de cuerpo entero, con provision de aire y presin positiva. Por lo general, la instalacin es un edificio separado o una zona totalmente aislada con sistemas de gestin de desechos y requisitos de ventilacin especializados y complejos para prevenir la liberacin de agentes viables al medio ambiente. Ejemplos: Virus como Marburg o la fiebre hemorrgica Congo-Crimeana. 10
Por todo ello se ha hecho indispensable el establecimiento y sobre todo, la observancia rigurosa de Reglamento de Seguridad destinados a preservar y asegurar la integridad e indemnidad de las personas que se desarrollan en el laboratorio. Para contribuir con el aseguramiento de las personas que laboran dentro de un Laboratorio generador de material infeccioso, se deben seguir las indicaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en su fraccin 6.2, que identifica y envasa de la siguiente manera:
PRCTICA 1B- DESCRIPCIN DE EQUIPO DE ESTERILIZACIN OBJETIVOS Descripcin del equipo y material ms frecuentemente utilizado para la esterilizacin. Comprender los mtodos para la realizacin y control de la esterilizacin. Aprender los metodos de esteilizacin adecuados par alas diversas
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necesidades del Laboratorio de Microbiologa.
INTRODUCCIN Para poder estudiar el comportamiento de los microorganismos en el laboratorio, es necesario contra, entre otras cosas, con material y medios de cultivo estriles. La esterilizacin es el proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida de un objeto, medio o superficie. Para lograr este fin, se cuenta con una variedad de mtodos y su eleccin depender de la naturaleza del material que se va a esterilizar. Los mtodos de esterilizacin son: calor ya sea seco o hmedo, filtracin, radiaciones y agentes qumicos. Esterilizacin por calor.- Las temperaturas elevadas pueden causar diversos daos a la celula, que van desde la inactivacin de algunas enzimas hasta la desnaturalizacin de protenas y por tanto de la muerte de los microorganismos. El efecto depender de la temperatura y del tiempo de esposicin. La esterilizacin por calor puede ser en calor hmedo o en seco. a) Calor hmedo- El calor en forma de vapor saturado a presin es el agente de esterilizacin ms empleado, ya que cuando el ambiente es hmedo se faorece la peetracin del calor a la clula y po rconsiguiente hay una coagulacin de las protenas. Para efectuar este proceso se utiliza un aparato denominado autoclave, que consta bsicamente de una cmara de doble pared, un termostato, un termmetro, un manmetro y vlvulas para regular la presin de vapor. El efecto esterilizante se logra a una temperatura de 121C y una presin de 15 lb/in2 aplicadas durante un tiempo de 15 a 20 minutos, en funcin de la carga de material, la tempertura y el tiempo estn en funcin del tipo de material a esterilizar. Este mtodo es applicable para esterilizar la mayor parte de medios de cultivo, soluciones acuosas que resistan temperaturas de 121C, cultivos que se van a desechar, pero no es til para esterilizar
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materiales impermeables al vapor, ni para aquellas sustancias que se desnaturalizan con el calor. b) Calor seco- Este mtodo se recomienda siempre que el vapor de agua a presin no sea deseable o no sea possible que entre en contacto directo con el material que se va a esterilizar. Para que se complete un ciclo de esterilizacin se necesita exponer por una hora a una temperatura de 180C. Se fundamenta en una atmsfera seca, el calor ocasiona la oxidacin de los componentes celulares vitales. Esterilizacin por filtracin.- Se emplea para esterilizar sustanciaa termolbiles, como sueros, vitaminas, antibiticos, azcares, etc. El material filtrante es de diferente naturaleza y puede ser de asbestos, tierra de diatomeas, porcelana y actualmente, el ms usado corresponde a las membranas de ester de celulosa. La eliminacin de microorganismos est en fucin de la carga elctrica y del tamao de los poros del material filtrante.
CUESTIONARIO 1.- Explique en que consiste el proceso de esterilizacin. 2.Cmo podra comprobar que un material est completamente estril despus de haber sido sometido a esterilizacin mediante calor hmedo? 3.- Qu importancia tiene la Esterilizacin en Microbiologa?. Explique. 4.- Realice un diagrama en el cual describa los diferentes niveles de Bioseguridad que puede tener un Laboratorio de Microbiologa. Incluya los tipos de barreras tanto primarias como secundarias que deben existir para cada uno de ellos.
NOTA- Esta prctica no incluye resultados.

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PRCTICA 2 FUNDAMENTOS DE MICROSCOPA OBJETIVO

Que el alumno se familiarice con el manejo del microscopio. Identificar las partes que lo componen, y aprender a manejarlo sin errores; comprendiendo la importancia de ste en el diagnstico microbiolgico.
MATERIALES Y EQUIPO
Microscopio ptico compuesto. Laminillas para observacin. Aceite de inmersin. Papel para limpieza de microscopio.
MARCO TERICO
Para el diagnstico microbiolgico, uno de los aspectos importantes se refiere a la morfologa de los microorganismos, para lo cual es indispensable el microscopio. Para su utilizacin optima, es necesario conocerlo y entender como funciona: es un insrumento de alta precision, cuyo rendimiento est condicionado en gran parte, a su manejo adecuado. Por sus caractersticas propias, su precio es elevado al igual que sus refacciones, mantenimiento y reparacin. Cuando observamos un objeto es porque los rayos luminosos procedentes de l estn llegando a travs de las estructuras anteriores del ojo, la retina; la suma de las recepciones individuales resultan en la imagen completa del objeto. Para que dos objetos muy pequeos (puntos) se puedan ver separados, es necesario que la luz proveniente de cada uno, hiera una clula retiniana, quedando entre los dos, una clula no excitada (separacin 14
entre 70 a 140 m). Esta propiedad se conoce como poder de resolucin del ojo. Se ha estimado que para el ojo humano, el mximo de poder de resolucin corresponde a un objeto que mida 0.1 mm a una distancia de 25cm. Si la unidad de medida de las bacterias y otros microorganismos es el micrometro (m) que equivale a 0.001mm (una milsima de mm) es claro que el ojo humano es incapaz de observar directamente a las bacterias. El dimetro del objeto ms pequeo que puede resolver un microscopio est determinado por: la longitud de onda de la luz empleada y la apertura numrica de la lente (en general, el del objetivo de inmersin es 1.25). La apertura numrica de la lente depende entre otros factores, del ndice de reraccin del medio, en el que se encuentra el objeto de observacin. Al aumentar la refraccin de la substancia (el aire) entre objeto y objetivo del microscopio, se substituye el aire por un lquido que tiene una refraccion mayor. Habitualmente el lquido que se emplea es un aceite compuesto por resinas sintticas denominado aceite de inmersin, el de 100X. El objetivo de inmersin se emplea en Microbiologa, en frotis teidos y no en exmenes en fresco (directos de la muestra sin tincin). Se debe tener presente que el tamao es una caracterstica del objeto y lo que se modifica es el aumento de la imagen. Para identificar o reconocer un objeto se requieren de dos datos, uno es su forma y el otro, su tamao. El microscopio compuesto consta de 3 sistemas: el de iluminacin, el ptico y el mecnico. Entre los mtodos diagnsticos directos se encuentra la observacin directa. Con microscopa de luz se observan a la mayora de las bacterias y hongos, y es donde tiene su mayor aplicacin. Se utilizan las preparaciones en fresco, o bien fijadas y teidas. Cuando las bacterias son demasiado delgadas, se cuenta con la microscopa de campo oscuro, cuyo fundamento consiste en que tiene un accesorio que bloquea la luz central y la luz perifrica es enfocada de manera tal que es reflejada sobre la superficie de las bacterias, y los ngulos de la luz incidente y reflejada acen que el organismo se observe rodeado de un halo brillante con un fondo oscuro. La principal utilidad de este mtodo es para identificar el gnero Treponema.
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La microscopa fluorescente se basa en que los compuestos fluorescentes cuando son excitados por luz de una longitud de onda, emiten una longitud de onda mayor que resulta en un color diferente. La fuente de luz del microscopio, generalmente es de mercurio de alta presin. La fluorescencia de las estructuras biolgicas que no fluorescen por si mismas (como el gnero Cyclospora, por ejemplo), se consigue al aadir colorantes fluorocromos especficos al frotis. Los fluorocromos se depositan en zonas especficas del espcimen y dj el resto sin teir. La microscopa de contraste de fases se basa en los diferentes indices de refraccin de la muestra, que son convertidos en varias intensidades de luz en la imagen, lo que conduce a una optima visualizacin de estructuras en fresco y tienen su aplicacin ms importante en la observacin de parsitos y hongos. El exmen en fresco (preparaciones hmedas) se utiliza en Microbiologa para observar la motilidad de microorganismos que poseen sta caracterstica, identificar la presencia de leucocitos (indicativo de inflamacin), detectar elementos miceliales (en Micologa) y estructuras diagnsticas en Parasitologa, entre otros. El examen en fresco se realiza directamente de la muestra, con solucin salina, hidrxido de potasio, lugol, etc. y se observa al microscopio.
PROCEDIMIENTO
1.- Antes de encender el equipo, verifique que los objetivos se encuentren alejados de la platina. Si se encuentran muy cercanos, aljelos. Nunca gire el revolver de los objetivos, sin antes vigilar la distancia entre ellos. Situar la cabeza a un lado del equipo para porder ver el trayecto del objetivo y hacerlo descender lentamente usando el tornillo MACROMTRICO. 2.- Coloque en la platina el portaobjetos a observar. SIEMPRE seleccione primero el objetivo ms dbil que tenga el microscopio y alinie correctamente. Si el objetivo es el seco dbil (10X), puede bajar hasta su posicin maxima a una distancia aproximada de 8mm de la preparacin. NO DEBE TOPAR el objetivo con la preparacin, ni mucho menos forzar el descenso.
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3.- Encienda el microscopio. Ajuste la iluminacin mediante A) la intensidad de la fuente de luz, para el objetivo dbil la iluminacin debe ser menor, para el objetivo de inmersin sera mayor y B) acercamiento o alejamiento del condensador, con las mismas condiciones referidas. 4.- Observar a travs de los oculares para enfocar la imagen. Corrija la iluminacin en caso necesario y lentamente gire el tornillo MICROMTRICO. Nunca olvidar que no debe topar el objetivo con la preparacin. Una vez enfocada la imagen, pasar al siguiente objetivo con cuidado, el seco fuerte (40X) y ajustar el enfoque con el tornillo MICROMTRICO. 5.- Si va a utilizar el objetivo de inmersin (100X), primero realice el paso 4, luego coloque una pequea gota de aceite de inmersin sobre el frotis (o en su caso sobre el cubreobjetos); gire el revolver lenta y cuidadosamente al objetivo de inmersin, sin perder de vista el descenso como se explic en el punto 1. Con el descenso cuidadoso, se observa cuando el lente toca ligeramente la gota de aceite. De esta manera, el objetivo se encontrar prcticamente dentro de su distancia focal. El enfoque final se realiza con movimiento muy leve del tornillo micromtrico. NO MOVER EL TORNILLO MACROMTRICO. 6.- Si va a suspender temporalmente la observacin, desender la intensidad de la fuente de luz al mnimo, pero no apagar. Si termin su trabajo, retire el portaobjetos de la platina y apague el equipo. Si es el caso, la laminilla se debe descartar en el recipiente destinado para desechos; si se trata de una preparacin fijada (como en este caso) eliminar el exceso de aceite y colocarla en el lugar correspondiente. 7.- Inmediatamente despus, hacer la limpieza del microscopio. No intente limpiar ninguna de las partes del equipo con la bata, pauelos desechables ni mucho menos con papel. Debe utilizar el papel proporcionado po el professor (papel especial para limpiar lentes). 8.- La limpieza solamente se realiza cuando se ha utilizado el objetivo de inmersin. Con el papel, se hacen pequeos y ligeros movimientos circulares sobre el objetivo, cuidando de no tocar con los dedos el lente. Se verifica si el papel queda muy impregnado de aceite, entonces repetir la operacin con otro papel.
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RESULTADOS
Describa brevemente y realice un esquema (incluya el dibujo A COLOR) de las laminillas observadas (mnimo 5) e incluya los datos siguientes.
DIBUJO
Muestra ____________________________ Objetivo ___________________________ Aumento total _______________________ Tincin _____________________________ Observaciones _______________________ _____________________________________ _________________________________ ___________________________________
CUESTIONARIO
1) Realice un esquema del microscopio utilizado en el laboratorio e indique con flechas los nombres de cada una de sus partes. Sealar las partes que corresponden a cada sistema: Iluminacin, ptico y mecnico. 2) Indique 2 pasos que llev a cabo durante la prctica para la observacin de las laminillas, teniendo un uso adecuado del microscopio. 3) Qu importancia tiene el correcto uso del microscopio en la Microbiologa?. Explique.
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PRCTICA 3 TINCIN DE LAS BACTERIAS OBJETIVO Que el alumno utilice last cnicas de coloracin ms importantes en Microbiologa clnica y entienda la utilidad en la identificacin de los agentes bacterianos causantes de infecciones. MATERIALES Y EQUIPO Portaobjetos Cultivos de bacteiras gram-positivas y gram-negativas Gotero con solucin salina estril Asas de inoculacin Reactivos para la tincin de Gram (cistal violeta, lugos, alcoholacetona y safranina) Puentes de vidrio Mechero de Bunsen Cronmetro Marcador para vidrio Aceite de inmersin Microscopio Recipiente para desechos MARCO TERICO La observacin de las estructuras biolgicas en vivo y sin tincin, es difcil porque las clulas microbianas son de tamao muy pequeo y porque son transparentes a la luz visible. Estas propiedades fsicas son desicivas para el desarrollo de nuevas tcnicas, diseadas para proporcionar una mejor definicin de la estructura celular aumentando el poder de resolucin y compensando la transparencia de la clula con un incremento del contraste. Las tinciones pueden ser simples o multiples. Las simples son las que utilizan un solo colorante como el azul de metileno, etc., y sirven para observar la forma y agrupacin del microorganismo.
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Las multiples emplean varios colorantes y se clasifican en diferenciales y especiales. Las diferenciales son, como su denominacin lo indica, para diferenciarlas (positivas o negativas para la coloracin empleada); las especiales sirven para observar caractersticas estructuras especficas de un microorganismo, por ejemplo: tinciones para cpsulas, flagelos, grnulos metacromticos, esporas, etc. Hay una gran variedad de tinciones, pero la ms comn y til en Microbiologa es la tincin descrita en 1884 por el bacterilogo dans Hans Christian Joachim Gram. La tincin de Gram es yba tubcuib duferebcuak y se fundameta en las distintas estructuras y propiedades fsicas de la pared cellular de las bacterias que la poseen, despus de ser sometidos los organismos a decoloracin. Las bacterias gramnegativas pierden el colorante inicial del cristal violeta, mientras que las grampositivas lo retienen y se observan azul-morado. Para las bacterias que pierden el colorante azul, se tien con otro colorante adicional denominado de contraste, para poder visualizarlas (se encuentran sin color) y el que se emplea es la safranina (rojo). La tincin de Gram sirve para: 1.- Diferenciar la morfologa, su agrupacin y clasificar las bacterias en positivas o negativas. Esta clasificacin es la que se emplea en clnica, por ejemplo: infecciones por cocos grampositivos; sepsis por gramnegativos; o para el espectro de accin anitmicrobiana: contra gampositivos, etc. 2.- Diagnstico rpido presuntivo de un agente infeccioso. Cuando se efectua directamente de la uestra, ayuda al diagnstico preliminar y evita en ocasiones, el realizar cultivos innecesarios. La tincin de Gram con ste propsito se emplea para detectar: bacteriuria, uretritis y uretritis gonocccica; vaginosis bacteriana y durante el estudio de rutina en el laboratorio de un exudado vaginal. 3.- Eleccin del tratamiento emprico con antibiticos en infecciones de sistema nervioso central. La visualizacin de organismos en una tincin de Gram de una muestra directa proveniente de un sitio normalmente estril como el lquido cefalorraqudeo, proporciona una gran utilidad diagnstica, pues se puede iniciar de inmediato un tratamiento emprico con antibiticos con stos resultados, y no se pierde tiempo crtico en la espera del resultado del cultivo.
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4.- Gua de procedimientos microbiolgicos. En el trabajo del laboratorio de Microbiologa se usa para: A) valorar la calidad de las muestras clnicas, si son muestras colectadas adecuadamente y si son aceptadas para la realizacin de cultivos (por ejemplo la expectoracin) y para B) seleccionar el medio de cultivo y las pruebas adicionales adecuadas al organismo para lograr su identificacin. Una de las tinciones especiales es la de Albert, que se emplea para identificar presuntivamente Corynebacterium diphteriae. La presencia de grnulos metacromticos es caracterstica del microorganismo, y se evidencan (aparte de la de Albert) por las coloraciones de Loeffler y Neisser y fueron descritos por Babes en 1886 y por Erns en 1888 por lo que se le conocen como grnulos de Babes-Ernst. Son grnulos de reserva bacteriana que contienen fosfatos. Se encuentran distribudos dentro del bacilo de manera irregular, casi siempre cerca de los polos. El principio es que una mezcla de azul de toluidina O y verde de metilo (colorante de Albert), tien los grnulos metacromticos de azul y el bacilo de verde. La fijacin del frotis se realiza con yodo/yoduro (lugol de Albert). El colorante de Albert se dj actuar por 10 minutos, se enjuaga con agua, se fija con el lugos de Albert por 5 minutos y se lava con agua de la llave. Los Bacilos Alcohol cido Resistentes (BAAR), tienen esta caractersitica debido a que su pared cellular tiene un alto contenido de lpidos (arriba del 60%) inluyendo ceras A,B,C y D, unidos a polisacridos. En los microorganismos acidorresistentes, una vez que el colorante se ha combinado con las sustancias creas, stos resisten la decoloracin con alcohol cido, pues ni el fenol ni las ceras son solubles en ste y para observarlos se aplica como coloante de contraste el azul de metileno. Se pueden realizar dos mtodos de tincin: 1.- Utilizando Carbolfucsina, que es una mezcla de fucsina con fenol, en el cual existen dos variantes de sta: ya sea utilizando calor que suaviza las ceras y facilita la solubilidad del colorante en ellas, conocida con el nombre de tincin de Ziehl-Neelsen; o el mtodo en fro que recibe el nombre de tincin de Kinyou. 2.- Si se tiene un microscopio de fluorescencia se pueden hacer bquedas ms sensibles de BAAR empleando fluorocromos como la auramina O y la rodamina. Las tcnicas de coloracin se realizan en preparaciones
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secas, es decir, se efecta un frotis de la muestra que luego se dj secar y despus se fija. Los procedimientos de fijacin de un frotis incluyen el calor sobre el mechero de Bunsen o la inmersin del frotis en substacias fijadoras como el alcohol metlico. PROCEDIMIENTOS FROTIS 1.- Colocar en un portaobjetos limpio una gota pequea de solucin salina estril en el lado izquierdo y otra en el lado derecho de la laminilla. 2.- Sujetar el asa de inoculacin y colocar la punta en el centro de la flama del mechero de Busen hasta que se observe al rojo vivo. Dejar unos segundos. Retirar y enfriar el asa. (No alejarse mucho de la zona de esterilidad). 3.- Tocar una colonia de microorganismos grampositivos con la punta del asa y hacer pequeos crculos sobre la gota de solucin salina izquierda para homogeneizar la supensin microbiana. 4.- Esterilizar el asa inmediatamente como en el paso 2. 5.- Despus de enfriar el asa al aire, repetir el procedimiento con la gota del lado derecho y una colonia de microorganismos gramnegativos. Esterilizar el asa inmediatamente despus. 6.- Marcar un crculo con el marcador, por debajo de la laminilla en el sitio donde se realiz cada frotis o extension. 7.- Para fijar el frotis a la flama, sujetar la laminilla con las pinzas y pasarla por la flama del mechero de Bunsen de 2 a 3 veces. Sin soltar las pinzas ni la laminilla, hacer algunos movimientos ligeros al aire (sobre la mesa) para permitir enfriar. TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM 1.- Colocar el frotis en el Puente de coloracin en el lavabo. 2.- Cubrir solamente en la parte donde est el fortis, con cristal violeta y esperar 1 minuto contando conel cronmetro. 3.- Enjuagar con agua de la llave, con un chorro ligero de agua. Sacudir el exceso de agua.
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4.- Colocar de nuevo el frotis en el Puente de coloracin. Cubrir con lugol durante 1 minuto y repetir el paso 3. 5.- Aadir alcohol-acetona, de manera que cubra el frotis y dejar actuar por no ms de 10 segundos y repetir el paso 3. 6.- Colocar de nuevo el frotis en el puede de coloracin y cubrir con safranina durante 30 segundos y despus respetir el paso 3. 7.- Secar al aire la preparacin y observar al microscopio hasta que est completamente seca. Primero enfocar con el objetivo ms dbil que tenga el microscopio hasta llegar al de inmersin.
Para ver esta pelcula, debe disponer de QuickTime y de un descompresor .
RESULTADOS El alumno realizar un dibujo de cada una de las laminillas observadas al microscopio teidas con Gram (mnimo 2 dibujos). Colorear de azul o rojo a las bacterias de acuerdo con sus hallazgos, as como describir la morfologa que: presentan (cocos, diplococos, bacilos, etc.). Incluya los datos siguientes:
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NOTA: Si en sus resultados nicamente observan bacterias de un tipo (Gram + o Gram - ) incluye una imagen de la faltante. CUESTIONARIO 2) Describa brevemente dos aspectos importantes de la tincin de Gram en su aplicacin clnica. 3) Investigar 2 especmenes clnicos en los que se deba realizar la tincin de Albert. 4) Investigar 2 especmenes clnicos en los que se deba realizar la tincin de BAAR.
Esquema #1. Procedimiento TINCIN DE GRAM
Esquema #2. Morfologa microscpica de las bacterias.
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PRCTICA 4
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CULTIVO DE LAS BACTERIAS OBJETIVO

Que el alumno adquiera las habilidades y precauciones para realizar un cultivo bacteriano. Aprender los diferentes procedimientos de inoculacin de los medios de cultivo y reconocer la importancia de los cultivos en la identificacin bacteriana. MATERIALES Y EQUIPO Cajas de Petri con agar sangre de carnero al 5%/Mc Conkey Cultivo en caldo mixto con bacterias Gram-positivas y Gram-negativas Asas de inoculacin Asas de inoculacin calibradas Mechero de Bunsen Recipiente para desechos MARCO TERICO Para la identificacin de las bacterias, se requiere de su aislamiento, es decir, permitir su desarrollo y serpararla de otras que pudieran estar presentes en la muestra analizada. El cultivo bacteriano es el mtodo ms empleado, sensible y especfico para identificar al agente etiolgico. Solamente unas pocas bacterias son incapaces de desarrollarse in vitro. Para efetuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es posible controlar las condiciones experimentales y menjar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas consiste en trasferir una muestra microbiolgica de una ambiente determinado a un medio de cultivo, al efectuar este procedimiento es necesario considerar que en el aire que nos circunda y en la superficie del rea de trabajo, existen otros muchos microorganismos, debido a esto se deben tomar las precauciones necesarias para impedir que estos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Para favorecer el desarrollo de un microorganismo en particular se tiene que considerar no slo el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural; por lo que en el medio de cultivo se debe 26
ajustar el pH, concentracin de sales y durante la incubacin, condiciones tales como: temperatura, aireacin y luminosidad. La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, as como su aislamiento y obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismos y el propsito estpecfico del estudio. Los medios de cultivo pueden clasificarse de varias maneras. De acuerdo a su estado fsico pueden ser: Medio lquido- Conocidos como caldos, son tiles para hacer diluciones, homogenizar mezcla de microorganismo y determinar su agrupacin natural. Este tipo de medio ser inoculado mediante un asa microbiolgica, un hisopo, una pipeta serolgica o una pipeta Pasteur, depositando dentro del caldo y homogenizando. Se necesita una gran cantidad de microorganismos para apreciar el crecimiento de stos como turbidez. Medio semislido- Es un medio lquido al que se le adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Se inocula con asa recta, en un ngulo de 90 con respecto a la superficie del medio, son usados para estudiar la movilidad de los microorganismos. Medio slido- La siembra se realiza con asa microbiolgica inoculando la superficie del agar con suavidad. Existen varias tcnicas de inculo, cuya finalidad comn es el aislamiento de los microorganismos, los cuales al multiplicarse forman agregados que se hacen visiles a simple vista, a estos agregados se les llama colonias, las que presentan caractersiticas que varan de acuerdo al tipo de microorganismo cultivado y el medio empleado. Pueden ser tambin: Definidos- Contienen ingredientes quimicos conocidos Indefinidos- Preparados con productos de la digestin de animales o protenas vegetales, adicionados con extracto de levadura, suero o sangre, de lo que resultan en formulaciones complejas, y son los ms empleados. Nutritivos- Contienen los requerimientos alimenticios que requieren los microorganismos, aunque no hay un medio universal o comn para todos. El ms utilizado es el agar sangre de carnero. Considerando su aplicacin se clasifican en: 27
Selectivos- Contienen colorantes u otros compuestos qumicos que inhiben el crecimiento de organismos (como comensales o flora normal), permitiendo el crecimiento de los patgenos. Cuando el medio selectivo es un caldo, se llama caldo de enriquecimiento, que se utiliza cuando se considera que el nmero de organismos patgenos en la muestra es muy pequeo. Diferenciales- Contienen generalmente carbohidratos con un indicador de pH que permite demostrar si utiliza el carbohidrato mediante un cambio en la coloracin del medio, que es el resultado a su vez de una modificacin en la acidez del medio, producido por los productos de la fermentacin u oxidacin. Un mismo medio puede ser selectivo y diferencial simultneamente. Uno de los ms comunes es selectivo y diferencial para gramnegativos, el agar MacConkey. Es selectivo porque inhibe el crecimiento de grampositivos si es que se encuentran presentes en la muestra y diferencial porque si fermentan la lactorsa se tornan las colonias color rosa y si no lo hacen (lactosa negativas) permanecen incoloras. Los medios de transporte tienen en comn, que contienen un amortiguador lquido o semislido, con un mnimo de nutrientes que previenen la deshidratacin, mantienen un pH neutro y minimizan el crecimiento. Los medios de transporteson muy importantes en Microbiologa, pues se utilizan cuando las muestras colectadas no se van a procesar de inmediato, situacin comn en los casos que el laboratorio se encuentra distante. El medio de transporte evita que el microorganismo que se intenta aislar, mantenga su viabilidad en condiciones fisiolgicas ptimas y se pueda cultivar par su identificacin posterior sin multiplicarse en el medio. Generalmente los medios de transporte no requieren refrigeracin durante su traslado. El introducir un microorganismo vivo en un medio de cultivo se llama inoculacin. La fuente de las bacterias puede ser muy variada, pero la ms comn son a partir de especmenes clnicos. La tcnica de inoculacin es distinta si el medio a inocular es lquido o slido y si se encuentra en un tubo de ensaye o frasco o bien, en una caja de Petri.. La tcnica de inoculacin de un medio de cultivo se elige de acuerdo a los objetivos que se desean. Ejemplos: si se desea aislar un microorganismo a partir de una muestra clnica por el 28
mtodo de estra en dilucin; pero si se pretende aislarlo y determinar al mismo tiempo una medicin del crecimiento bacteriano por un mtodo que determine el nmero (procedimiento directo), utilizaremos la inoculacin con estra con asa calibrada. MTODOS DE INOCULACIN 1) Estra en dilucin (ED) Este procedimiento se utiliza cuando la muestra se presume, contienen grandes cantidades del microorganismo y para identificarlo se requieren de colonias individuales separadas. 2) Estra con asa calibrada (EAC) Se emplea para cuantificar las colonias (contarlas) y es de gran utilidad en muestras urinarias, donde el numero de colonias establece o no el diagnstico de infeccin de vas urinarias (IVU). El anlisis de la orina para apoyar el diagnstico de IVU inicialmente es mediante el examen general de orina (EGO) donde se detectan parmetros sugestivos de infeccin y la comprobacin cuali y cuantitativa se efecta por el cultivo de la orina (urocultivo) que tiene ms seguridad en la deteccin de bacterias en la orina De la orina directa se realiza una tincin de Gram deonde la presencia de una o ms bacterias por campo de inmersin correlaciona con una cuenta que se denomina significativa. En la tincin de Gra se valora tambin la presencia de leucocitos y levaduras. Cada colonia presente en el medio representa una Unidad Formadora de Colonia por ml (UFC/ml). De la orina sin centrifugar, se homogeniza y con asa calibrada 1:1000 se siembra de rutina un medio de AS/McConkey. El medio se incuba a 37C durante 24hrs. Si est negativo, se reincuba por 24 hrs adicionales. Como el asa es calibrada a una milsima de mililitro, entonces, la presencia de una colonia con este mtodo es igual a 1000 UFC/ml.
PROCEDIMIENTO Cada equipo tendr dos cajas de petri con agar Sangre de Carnero y dos con agar MacConkey. En dos de las cajas realizarn el mtido de inoculacin por estra en dilucin a partir de un cultivo en 29
caldo mixto con bacterias gramositivas y gramnegativas. En las otras dos cajas efectuar el mtodo de inoculacin por estra con asa calibrada del mismo caldo. Estra en dilucin (ED) 1) En cada una de las cajas de Petri identificar con el marcador (por el reveso de la caja): Nombre, grupo o iniciales, fecha y mtodo de inoculacin. 2) Tomar con la mano izquierda el tubo con el cultivo y con la mano derecha el asa y flamearla; enseguida quitar el tapn con el dedo meique de la mano derecha y flamear la boca del tubo. 3) Introducir el asa haciendo contacto con el caldo y tomar una asada del caldo. Tapar de nuevo el tubo y dejarlo en la gradilla. 4) Sembrar en la caja de Petri (primero del lado del agar sangre) de acuerdo con el procedimiento siguiente: colocar en su mano izquierda correctamente alineada la caja en relacin con la divisin central. Inocular la zona de descarga haciendo movimientos de lado a lado sin tocar los bordes de la caja, en forma muy cerrada o cercana uno de otro, de lado a lado. Flamear el asa, enfriar al aire. Girar en la mano la caja. Hacer los mismos movimientos de lado a lado, pero ahora, ms abiertos los movimientos sin tocar los bordes de la caja. Flamear el asa, enfriar al aire. Girar en la mano la caja. Hacer los mismos movimientos de lado a lado pero solamente unos 2 o 3 movimientos y terminar con una parte recta hacia el centro de la caja. Flamear el asa. 5) Repetir el procedimiento en el lado del agar MacConkey. 6) Incubar a 37C por 24hrs.
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Estra con asa calibrada (EAC) Antes de llevar a cabo esta tcnica, el alumno deber realizar diluciones de la muestra: a) En un tubo de ensaye que contenga 9mL de Solucin Salina, colocar 1mL de caldo de cultivo o en su caso una asada del cultivo slido. b) Transferir un mL del tubo 1 a un tubo 2 que contendr 9 mL de solucin salina. A partir de aqu se trabajar con el tubo nmero 2. 1) En cada caja de Petri identificar con el marcador (por el reverso de la caja): nombre, grupo o iniciales, fecha y mtodo de inoculacin (EAC) 2) Tomar con la mano ezquierda el tubo de cultivo y con la mano derecha el asa y flamearla, enseguida quitar el tapn con el dedo 31
meique de la mano derecha y flamear la boca del tubo. 3) Introducir el asa calibrada (NO CONFUNDIR CON EL ASA NORMAL) haciendo contacto con el caldo y tomar una asada. Tapar de nuevo el tubo y dejarlo en la gradilla. 4) Sembrar en las cajas de Petri (primero del lado del agar sangre. Colocar en su mano izquierda correctamente alineada la caja en relacin con la divisin central) de acuerdo con el siguiente procedimiento: inocular una lnea de arriba hacia abajo en la parte superior y otra en la parte inferior. Inmediatamente, en la lnea superior hacer movimientos de lado a lado sin tocar los bordes de la caja y hacer lo mismo con la lnea inferior. 5) Flamear el asa, enfriar, y repetir el paso 3. Iniciar el paso 4 pero en el lado del agar MacConkey. Flamear el asa. 6) Incubar las cajas a 37C por 24hrs 7) Realizar conteo de colonias (UFC/ml)
RESULTADOS 1.- Indicar si despus de la incubacin hubo crecimiento, si se lograron aislar colonias bacterianas y si se observa alguna alteracin en cuanto a la coloracin de los medios de cultivo. (Incluir dibujos o fotografas) 2.- En el mtodo de inoculacin por estra en dilucin indique si su equipo logr separar una sola colonia en la ltima zona de dilucin. En caso negativo, discuta las posibles fuentes de error. 3.- Del procedimiento de estra con asa calibrada reportar cuandas UFC
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se contaron (1 colonia equivale a 1000 UFC). Si no les fue possible cuantificarlas, discuta las posibles causas de error. CUESTIONARIO 1) El alumno investigar dos medios de transporte que se emplean comunmente en Microbiologa y para que muestras se indican. 2) Conteste: Si se busca al agente etiolgico en una muestra de heces. Cul mtodo de inoculacin de los medios de cultivo debe llevar a cabo? Por qu? 3) El alumno investigar aspectos sobre el AGAR que contienen los medios slidos. Qumicamente que es? Desde cuando se emplea? Por qu no lo destruyen las bacterias al desarrollarse sobre el?
PRCTICA 5 EXUDADO FARNGEO
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LEER RESULTADOS DE LA PRCTICA CULTIVO DE LAS BACTERIAS DE ACUERDO CON LAS INDICACIONES SEALADAS EN EL PROCEDIMIENTO. INTRODUCCIN El diagnstico de una enfermedad infecciosa se inicia con la valoracin de las caractersticas clnicas del paciente y epidemiolgicas del padecimiento. El mdico debe seleccionar las pruebas que se requieren para apoyar la impresion diagnstica inicial para as poder emitir un diagnstico y tratamiento adecuado. OBJETIVO El alumno aprender las consideraciones generales sobre la toma de muestras e importancia del exudado farngeo para establecer el diagnstico de infeccin bacteriana de vas respiratorias altas, as como el procedimiento de identificacin en el laboratorio de los Streptococcus B-hemolticos del grupo A. MATERIALES Y EQUIPO Cajas de Petri con agar sangre de carnero al 5%. Hisopos de algodn estriles. Abatelenguas Asas de inoculacin Mechero de Bunsen Tubos de ensayo estriles con tapn de algodn. Recipiente para desechos MARCO TERICO Un microorganismo debe acceder al interior o ala superficie del husped para desaroollar una relacin particular con este usped, esta relacin husped-parsito puede ser simbitica, comensal o parasitaria segn la situacin particular encontrada. La Biota normal desempea un papel importante en la proteccin del husped contra la invasion por microorganismos patgenos. Los mecanismos de esta proteccin son: a) Competencia por nutrientes. b) Competencia por los mismos receptores de las celulas husped.
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c) Produccin de sustancias como: bacteriocinas, cidos grasos volatiles y otros metabolitos. d) Estimulacin continua del sistema inmune. La biota normal albergada por el husped se puede dividir en dos grupos: 1) biota residente normal, que es la hallada en forma regular y que de ser perturada pronto se reestablece; y 2) biota transitoria, que puede colonizar al husped por periodos que varan de horas a semanas pero no se auto establecen en forma permanente. Las especies que conforman la biota normal evidentemente son infludas por factores ambientales tales como la dieta, las condiciones sanitarias, los hbitos de hygiene. Tambin la presencia de enfermedades crnicas, el uso de agentes teraputicos, la ingesta de alcohol y drogas, factores como traumatismos, tension fsica o emocional y las hormonas. El conocimiento de los sitios anatmicos que tienen biota normal es indispensable para determinar si el microorganismo aislado es el causante del proceso infecciosos o solo se trata de microorganismos de biota normal. Es por ello que al momento de realizar algn cultivo como urolcultivo, coprocultivo, hemocultivo, mielocultivo, cultivo de vas respiratorias bajas y altas u otro tipo de secrecin, se debe de realizar este anlisis contemplando que en este tipo de cultivos es probable el crecimiento de Mos de la biota normal. As, de acuerdo con la probabilidad de contaminacin de la muestra con la biota normal, se establecen tres categoras de muestras: 1) TIPO I- Muestras de pacientes que se obtienen de sitios anatmicos donde existe biota normal. EJEMPLO: boca, coprocultivo, toma de exudado farngeo, etc. 2) TIPO II- Son aquellas que se toman de un sitio estril, pero para su recoleccin pasan por un sitio que tiene biota normal. EJEMPLO: esputo, urocultivo, etc. Estas muestras son las s utilizadas, pues estn prcticamente carentes de riesgo pra el paciente, pero tambin presentan el inconveniente de tener una alta probabilidad de dar interpretaciones incorrectas. 3) TIPO III- Aquellas que se consideran libres de microorganismos de biota normal y para su obtencin se utilizan mtodos invasivos. Estas muestras se toman en condiciones aspticas y los resultados obtenidos son determinantes, ya que un resultado positvo es significativo y
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uno negativo puede excluir un proceso infeccioso. EJEMPLO: lquido cefalorraqudeo, hemocultivo, etc. 4) PARA DIAGNSTICO VIRAL- La carencia en general de flora normal viral facilita la obtencin de las muestras y su interpretacin. Comunmente, incluye muestras de faringe, heces y LCR. Las muestras o especmenes que se reciben en el laboratorio, son el punto central del xito o fracaso del diagnstico. Las consideraciones generales son las siguientes: Obtener la muestra del sitio preciso donde se encuentre el agente etiolgico. Utilizar la metodologa adecuada en la obtencin de la muestra, asi como el material con el que se colecta, donde se coloca y su transporte. Colectarla en el momento oportuno del padecimiento en estudiio. Tener los conocimientos acerca de la clasificacin de las diferentes muestras. Las faringitis son originadas con ms frecuencia por agentes virales, sin embargo, la presencia de Streptococcus Bhemolticos del grupo A requiere de especial atencin. Es frecuente que los cuadres de faringitis bacteriana sean secundarios a infecciones virales previas. La faringitis estreptocccica es la infeccin ms frecuene producida por los estreptococos B-hemolticos del grupo A. Ocasiona del 15 al 30% de los casos de faringitis aguda en nios, es de suma importancia sobre todo cuando se presenta con cuadros repetidos, pues se indica tratamiento especfico; adems, tambin es necesario vigilar al paciente y prevenir las secuelas no supurativas a largo plazo como la fiebre reumtica y la glomerulonefritis. De ah que se indica un cultivo de exudado farngeo sobre todo a nios, pero tambin en los adultos. El exudado farngeo generalmente se solicita a toda la familia debido a la alta transmisibilidad del agente por va respiratoria. Las secreciones nasofarngeas de los portadores respiratorios representan menos del 5% de la poblacin adulta. Los portadores permanentes son particularmente peligrosos cuando son parte del personal de enfermera de lass alas de quirfano o de parto; de las aulas de nios pequeos o de guarderas. Se considera que solo un 20% de las infecciones son asintomticas.
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Esta misma situacin de portadores en personal de Salud, aplica a los estafilococos nasales. Para identificar los estrptococcos B-hemoltocos del grupo A, primero se reconoce que la faringe y las amgdaas son sitios que presentan flora normal y entonces, se debe tener conocimiento de los agentes bacterianos que habitan en esa area corporal para luego seleccionar las colonias del agente etiolgico. El proceso de identificacin incluye: Una adecuada toma de muestra (sin contaminacin con saliva o tocar la lengua). Examen directo del espcimen con tincin de Gram. Aunque es dificil diferenciarlos debido a la presencia de estreptocococs -hemolticos de la flora normal (misma morfologa), se realiza como control de calidad: una observacin de cocos grampositivos en cadenas debe coincidir con el cultivo positivo de estreptococos ( Bhemolticos). La prueba de deteccin rpida de antgeno (identifica el carbohidrato de tipo especfico, por aglutinacin o inmunoensayo) en exudados farngeos y lquidos corporales normalmente estriles son tiles, pero la sensibilidad es menor al cultivo. Los cultivos farngeos se consideran el estndar de oro para el diagnstico. Se inocula agar sangre de carnero al 5% y se incuba a 37C. Despus de 24hrs de incubacin se examinan las placas para buscar colonias B-hemolticas. En caso de negatividad, se reincuban por 24hrs adicionales. De las colonias B-hemolticas se realiza la prueba de la catalasa que es negativa y los direrencia del gnero Staphylococcus sp (prueba positiva). Identificacin del grupo A: con la prueba de la bacitracina positiva cuando se presenta un halo de inhibicin de la B hemlisis; aunque tambin es til la prueba PYR (L-pirrolidonil-2-naftilamida). El diagnstico definitivo implica la tipificacin serolgica por inmunoensayo. Tanto el grupo A como los otros grupos, se identifican por reacciones de antisuero especfico para cada grupo. En nuestro medio, generlamente no se realiza la tipificacin serolgica. Una prueba de bacitracina positiva, de colonias Bhemolticas puntiformes y transparentes, catalasa
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negativas es suficiente para identificar y reportar Streptococcus B-hemoltico del grupo A. Si se renen todos stos criterios, menos el de la bacitracina (negativa), entonces se reporta Streptococcus Bhemoltico no grupo A. Nota: NUNCA HACER MENCIN DE LA FLORA NORMAL EN EL REPORTE. Adems se puede utilizar la prueba de anticuerpos fluorescentes y la titulacin de antiestreptolisinas (AELO) en infecciones respiratorias, aunque solamente las detecta uando son recientes y son ocasionadas por cualquier estreptococo que produzca estreptolisina O. Generlamente los Streptococcus B-hemoltico del grupo A son sensibles a la penicilina G. PROCEDIMIENTO. EXUDADO FARNGEO Cada alumno elegir libremente a un compaero para colectar (uno al otro) la muestra farngea. TOMA DE LA MUESTRA Las instrucciones al paciente solo se refieren a la posibilidad de que acuda al muestreo sin aseo reciente dentral (opcional). 1) Pida a su compaero que abra la boca e inspeccione si se observa a simple vista el area amigdalina. En caso positivo observe si presenta zonas con puntos blanquecinos o purulentos, membranan o inflamacin. Si al abrir la boca no logra visualizar estas caractersticas entonces es necesrio el uso de abatelenguas. 2) Sostenga con la mano izquierda el abatelenguas y presiones suavemente la lengua hacia abajo. Tome con la mano derecha elhisopo de algodn estril y frote suavemente la superficie tonsilar del compaero que le correspondi. Se debe evitar tocar con el hisopo, la lengua o la uvula. 3) Colocar el hisopo de algodn en el tubo de ensayo estril: tomar con la mano izquierda el tubo, retirar el tapn de algodn con el dedo meique de la mano derecha y flamear en el mechero de Bunsen la boca del tubo, SIN SOLTAR NI DEJAR SOBRE LA MESA EL HISOPO, introducir hasta el fondo del tubo el hisopo y colocar de Nuevo el tapn de
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algodn. Permitir que el aplicador de madera (del hisopo) sobresalga del tapn, ajustndolo suavemente.
INOCULACIN DEL MEDIO DE CULTIVO 1) En su caja de Petri identificar en el marcador (por el reverso de la caja): No. de grupo o iniciales y fecha. 2) Tomar el tubo con el hisopo de algodn con muestra colectada con la mano izquierda. 3) Retirar el tapn de algodn del tubo con el dedo meique de la mano derecha y realizar la inoculacin en el area de descarga (recordar el mtodo de inoculacin por estra en dilucin que aprendi en la prctica anterior). Rotar el hisopo en esta area Regresar el hisopo al tubo, taparlo y dejarlo en la gradilla. 4) Tomar el asa, flamearla y enfriarla. Continuar la inoculacin girando la caja en la mano, como se indic en los pasos 2 y 3 de la prctica anterior. Flamear el asa. 5) Incubar las cajas a 37C por 24hrs. RESULTADOS 1.- Indicar si se observa o no presencia de B-hemlisis en el
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cultivo. (Incluir imgenes a color) En caso de observar B-hemlisis: a) Realizar tincin de Gram a una de las colonias presentes en el cultivo. b) Realizar prueba de la catalasa: Colocar en un portaobjetos una muestra representativa de una de las colonias b-hemolticas desarrolladas en el cultivo. Aadir una gota de perxido de hidrgeno. Presencia de burbujas---PRUEBA POSTIVA Ausencia de burbujas----PRUEBA NEGATIVA c) Realizar prueba de Bacitracina. En una caja de Petri con agar sangre de carnero al 5%, se inocula con el asa bacteriolgica de 2 a 3 colonias sospechosas. La inoculacin es por agotamiento. Con pinzas estriles, se toma un disco del Taxo A (bacitracina) y se coloca en el centro de la zona inoculada en el agar. Se incuba a 37C/24hrs. Leer la prueba Identificacin del grupo A: la prueba de la bacitracina positva es cuando se presenta un HALO DE INHIBICIN DE LA BHEMLISIS (no del crecimiento) alrededor del disco. 2.- En base a sus resultados reportar presencia o no de Streptococcus B-hemoltico del grupo A.
CUESTIONARIO 1) El alumno har una lista de agentes bacterianos que forman parte de la biota normal de la faringe (mnimo 6 gneros bacterianos escritos correctamente, los ms comunes). 2) El alumno investigar el procedimiento y fundamento de la prueba CATALASA. Describirlo por pasos.
PRCTICA 6 ANTIBIOGRAMA REALIZAR LA INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

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OBTENIDOS EN LA PRCTICA EXUDADO FARNGEO. OJETIVO El alumno comprender las conclusiones de los resultados de su exmen farngeo. Aprendara bases de la utilidad e indicaciones de un antibiograma durante la prctica clnica. Adems, observara los efectos de los antimicrobianos (efecto qumico) sobre las bacterias. MATERIALES Cajas de Petri con agar sangre de carnero al 5% con los cultivos realizados por los alumnos. Gotero con perxido de hidrgeno. Portaobjetos Asas de inoculacin Mechero de Bunzen Recipiente para desechos Taxo A para prueba de Bacitracina Cajas de Petri con agar Mueller Hinton Sensidiscos Pinzas de laboratorio Colorantes para Tincin de Gram.
MARCO TERICO ANTIBIOGRAMA- Las pruebas de susceptibilidad in vitro para las bacterias aerbicas de crecimiento rpido y no fastidiosas pueden determinarse por el mtodo de difusin en disco, descrito por Kirby-Bauer en 1966. La tcnica es simple, pero estrictamente controlada y produce un reporte cualitativo que est basado entre las interrelaciones de los niveles de concentraciones mnimas inhibitorias con los niveles teraputicos ptimos de drogas en la sangre en infecciones sistemicas o niveles de concentraciones de drogas en la orina para agentes antimicrobianos urinarios nicamente. Las purebas con varios gentes antimicrobianos seleccionados, ayudan a orientar al mdico en la eleccin de la droga apropiada para el tratamiento del paciente. Para algunos microorganismos fastidiosos, se puede hacer la misma tcnica con ligeras modificaciones, como por ejemplo en los
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asos de Haemophilus sp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y otras especies de Streptococcus. La prueba de difusin en disco en general, no se recomienda para otros organismos fastidiosos o inusuales que tienen requerimientos especiales de crecimiento, o que no han sido probados lo suficientemente como para ser estandarizados. La medicin del crecimiento microbiano para estimar el nmero de bacterias por un mtodo indirecto, emplea la medicin turbidimtrica mediante curvas de calibracin y el fundamento se basa en que caa clula dispersa la luz. La lectura espectrofotomtrica se compara mediante el sistema denominado nefelmetro que sonsite en una serire de tubos de ensayo con diferente turbidez conocida. Este principio de la nefelometra se utiliza en el antibiograma para estandarizar el inculo al compararlo con el estndar de turbidez 0.5 Mc. Farland (ya conocido). Un inculo estandarizado del organismo es sembrado entonces, con un hisopo sobre la superficie del agar Mueller Hinton. Los discos de papel filtro impregnados con agentes antimicrobianos son colocados sobre el agar. Despus de incubacin durante la noche, se miden los dimetros de las zonas de inhibicin alrededor de cada disco. El tamao de la zona es inversamente proporcional a la concentrcin mnima inhibitoria de los organismos El reporte cualitativo se menciona como susceptible, moderadamente susceptible, intermedio o resistente. Sus principales aplicaciones son: En microorganismos que desarrollan resistencia con mayor frecuencia, por ejemplo: Pseudomonas sp. Cuando el agente infeccioso conduzca a una elevada mortalidad y requiera un tratamiento especfico. Necesidad de combinaciones de frmacos para erradicar al agente infeccioso. Seleccionar racionalmente el frmaco, lo que depende tambin de un diagnstico etiolgico especfico.
PROCEDIMIENTO Nota- Se requiere seguir estrictamento todos los pasos del protocolo para obtener resultados fiables.
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PREPARCIN DEL INCULO- con un asa, transferir varias colonias de la misma morfologa, con crecimiento reciente, a un tubo con caldo de tripticasa de soya estril y ajustar visualmente a la turbidez 0.5 de Mac Farland (1.5x10 8UFC/ml) el cual previemente se ha agitado. La suspensin se agita. INOCULACIN DE LAS CAJAS DE AGAR- Despus de ajustar el inculo, (no dejar pasar ms de 15 min), introducir un hisopo de algodn estril y rotarlo contra las paredes del tubo para remover el exceso de lquido. 1) Pasar el hisopo por la superficie del agar en 3 ocasiones, rotando la placa aproximadamente a 60C entre el estriado para asegurar su buena distribucin. Debe evitarse tocar la periferia de la placa y producir aerosoles. 2) Dejar la placa recien inoculada por 3 minutos (pero no ms de 15 minutos) antes de colorar los discos. APLICACIN DE LOS DISCOS 1) Colocar los discos en la superficie del agar mediante unas pinzas estriles. 2) Una vez depositado cada disco, presionarlo ligeramente contra el agar, con las mismas pinzas. Los discos son colocados a una distancia mnima de 24 mm de centro a centro. Nunca colocar ms de 12 discos por placa de 150mm o no ms de 5 en las de 100 mm. Debe eitarse el reacomodo de discos una vez depositados o que estuvieron en contacto con el agar, ya que la difusin antimicrobiana se inicia instantneamente. INCUBACIN 1) La incubacin de las placas debe hacerse dentro de los 15 min despus de la colocacin de los discos. 2) Invertir las placas y estibarlas no ms de 5 placas hacia arriba en el incubador, a 34-35C en aire ambiente, durante 16 a 18hrs. RESULTADOS
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LECTURA DEL ANTIBIOGRAMA 1) La lectura se realiza solo cuando se obtiene un crecimiento uniforme y confluente. 2) Los medios traslcidos se leen: - Con la base hacia abajo sobre una superficie, o mantenerla arriba a aproximadamente 6cm de distancia sobre una superficie obscura no reflejante. - Iluminar la placa con luz dirigida y reflejada de arriba en un ngulo de 45. - Medir el dimetro de la zona de inhibicin en mm, con la regal colocada sobre la base del agar o reverso de la placa. - Para los estafilococos, la medicin debe ser ms cuidadosa y exacta, cualquier evidencia de crecimiento es indicativo de resistencia. RESULTADOS DE LA LECTURA - Comparar las medidas de los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos con el inserto (includo en la caja de los sensidiscos) y en base a sto establecer si el microorganismo es SUCEPTIBLE, MEDIANAMENTE SUCEPTIBLE o RESISTENTE a cada uno de los diferentes antibiticos. CUESTIONARIO 1) Investigue dos entidades clnicas de etiologa bacteriana donde sea MUY importante realizar antibiograma. 2) En que consiste el mtodo de TURBIDIMETRA para la cuantificacin de microorganismos. 3) Explique como se lleva a cabo la cuantificacin de microorganismos empleando la ESCALA DE MC FARLAND. 4) El alumno investigar y describir un mecanismo de resistencia bacteriana ante los antimicrobianos. PRCTICA 7 ACTIVIDADES BIOQUMICAS DE LOS MICROORGANISMOS
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OBJETIVOS - Conocer las caractersticas metablicas generales para la identificacin de cocos y bacilos. - Relacionar la actividad metablica de los microorganismos con los sustratos, los cambios producidos en los medios de cultivo y la aparicin de diferentes metabolitos. - Interpretar adecuadamente pruebas especficas y relacionarlas con las caractersticas metablicas de diversos microorganimos. INTRODUCCIN Todos los seres vivos tienen la capacidad de efectuar una serie de reacciones que les permiten incorporar y transformar a diversos compuestos. El trmino metabolismo se refiere al conjunto de reacciones que se dan en la clula y que conducen a la transformacin de diversos compuestos, en estas transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan reacciones. Existen dos grandes grupos de Bacterias de inters, los cocos y los bacilos para realizar la identificacin inicial se pueden efectuar a partir de sus aspectos microscpicos. Para hacer una identificacin final del gnero y especie se realizan pruebas que evalan la actividad bioqumica y metablica, lo cual se lleva a cabo mediante el subsucltivo del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales, cuyos resultados de incorporar o transformar los nutrienentes de cada medio se interpretan para lograr la identificacin del microorganismo problema al cabo de 24hrs de incubacin a 37C. MATERIAL -Pruebas bioqumicas -Reactivos reveladores de pruebas bioqumicas: oxidasa, solucin de rojo de metilo, alfa-naftol, hidrxido de potasio, perxido de oxgeno, reactivo de Kovac. - Cultivo de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus mirabilis. CADA EQUIPO TRABAJAR CON MICROORGANISMO PROBLEMA Y REALIZAR UN LAS
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DIFERENTES PRUEBAS BIOQUMICAS; EN BASE A SUS RESULTADOS DETERMINAR DE QUE AGENTE ETIOLGICO SE TRATA. PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE COCOS PRUEBA DE CATALASA 1) Se manejar un cultivo por persona. 2) Tomar con un aplicador de madera una colonia y depositarla en un portaobjetos 3) Adicionar una gota de perxido de hidrgeno, observar si existe produccin de burbujas. 4) Realizar el mismo procedimiento para el control positivo: Staphylococcus aureus. PRUEBAS BIOQUMICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACILOS 1) Se manejar un cultivo por persona, se observarn sus caractersticas macroscpicas culturales y se les har tincin de Gram. 2) Primero debemos sembrar en Citrato de Simmons, para despus sembrar en medios lquidos, despus sembramos en medios semislidos por picadura y por ultimo en medios slidos en pico de flauta. 3) Se incuban a 37C durante 24hrs. 4) Todos los tubos se observan a las 24hrs y se comparan los cambios con pruebas bioqumicas sin sembrar. 5) Se les coloca los reactivos reveladores de la reaccin bioqumica que se llev a cabo, si es que la hubo e interpretamos nuestros resultados. A- Utilizacin de Citrato MTODO 1.- Marcar los tubos y gradillas con el nombre del equipo. 2.- Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismos) y problema. 3.- En condiciones de asepsia, tomar una asada (asa en punta) del cutivo, inocular el tubo con el microorganismo correspondiente. 4.- Incubar a 37C durante 24hrs. 5.- Despus de la incubacin, observar si hubo desarrollo. 6.- El medio se alcaliniza y se torna azul, indicando una prueba
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positiva. B. Prueba de Rojo de metilo MTODO 1.- Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema. 2.- En condiciones de asepsia, tomar una asada del cutivo, inocular el tubo con ell microorganismo correspondiente. 3.- Incubar a 37C durante 24 hrs. 4.- Agregar a cada uno de los tubos 5 gotas del indicador rojo de metilo. 5.- La presencia de un pH menor a 4.4 da una coloracin roja indicando una prueba positiva. C. Prueba de Voges-Proskauer MTODO 1.- Identificar los tubos como control (iniciales de microorganismo) y problema. 2.- En condiciones de asepsia, tomar una asada del cultivo, inocular el tubo con el microorganismo correspondiente. 3.- Incubar a 37C 4.- Al finalizar el periodo de incubacin, aadir 0.6ml de alfa naftol y 0.2 ml de hidrxido de potasio (es esencial que se agreguen los reactivos en este orden). 5.- Agitar cuidadosamente los tubos para exponer el medio al oxgeno y dejarlos reposar durante 10 a 15 min. D. Prueba de la ureasa MTODO 1.- Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema. 2.- En condiciones de asepsia, tomar una asada del cultivo, inocular el tubo con el microorganismo correspondiente. 3.- Incubar a 37C durante 24hrs 4.- Observar los cambios, el desarrollo de un color rosa intenso indica una prueba positiva. E. Indol MTODO 1.- Identificar los tubos como control (iniciales del microorganismo) y problema, la prueba se puede valorar en los medios semislidos SIM (Sulfhdiroco-Indol-Movilidad) o en el medio MIO (Movilidad47
Indol-Ornitina). 2.- En condiciones de asepsia, tomar una asada (asa en punta) del cultivo, inocular el tubo con el microorganismo correspondiente. 3.- Incubar a 37C durante 24hrs. 4.- Al finalizar el periodo, aadir 5 gotas del reactivo de Kovac, si se emplea el reactivo de Erlich, este paso debe ser precedido por la adicin de 1ml de cloroformo. 5.- El desarrollo de un anillo color fucsia en la parte superior del meio segundos despus de aadir el reactivo indica una prueba positiva.
PRUEBA BIOQUMICA Fermentacin de hidratos de Carbono
DESCRIPCIN
Durante el crecimiento fermentativo con azcares o alcoholes de azcares se produce cido y/o gas.
APLICACIN EN EL LABORATORIO La fermentacin de azcares especficos se emplea para diferenciar bacterias entricas as como otros gneros o especies.
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Catalasa Coagulasa Utilizacin de citrato
Detecta la presencia de catalasa, que convierte el perxido de hidrgeno en agua y O2. Detecta la presencia de coagulasa. La coagulasa hace que el plasma se coagule. Cuando se emplea cirato como fuente exclusiva de carbono, alcalinizando el medio. La descarboxilacin de aminocidos libera CO2 y amina Demuestra la presencia de una enzima que escinde la lactosa en glucosa+galactosa. Detecta si una bacteria produce o no proteasas que hidrolizan la gelatina y causan licuefaccin de un medio semislido de gelatina. Detecta la formacin de sulfuro de hidrgeno a partir del aa cistena por la desulfurada de cistena. El Indol, si la bacteria tiene la enzima triptofanasa detecta la produccin de indol a partir del aa triptfano. El Rojo de Metilo es un indicador de pH para determinar si la bacteria ha producido cido a partir de la glucosa, por la va de la fermentacin cida mixta. El Voges Proskauer detecta la produccin de acetona como principal subproducto y menos cantidad de cidos fuertes. Detecta si una bacteria puede emplear nitrato como aceptor de electrones. Detecta la presencia de citrocromo c oxidasa, que es capaz de reducir el O2 y aceptores artificiales de electrones. Detecta la enzima que desdobla la urea en NH3 y CO2
Descarboxilasas (arginina, lisina, ornitina) Prueba de la Bgalactosidasa (ONPG) Licuefaccin de gelatina cido sulfhdrico (H2S) IMVC (Indol, rojo de metilo, VogesProskauer, citrato)
Se emplea para diferenciar Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Bacillus (+) de Clostridium (-). Es una prueba importante para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de S. Epidermidis (-). Se emplea en la clasificacinn de las bacterias entricas. Klebsiella(+), Enterobacter (+), Salmonella (a menudo +), Escherichia (-), Edwardsiella (-) Se emplea en la clasificacin de las bacterias entricas. Se emplea para diferenciar bacterias entricas. (Citrobacter +, Salmonella -), y para identificar Pseudomonas. Se emplea en la identificacin de Clostridium, Serratia, Pseudomonas, y Flavobacterium. Importante en la identificacin de Edwardsiella, Proteus y Salmonella. Se emplea para diferenciar Escherichia (RM +, VP -, indol +) de Enterobacter (RM -, VP +, indol -) y Klebsiella pneumoniae (RM -, VP+, indol -); tambin se emplea para caracterizar a los miembros del gnero Bacillus.
Reduccin de nitratos Oxidasa
Ureasa
Se emplea en la identificacin de bacterias entricas que habitualmente son +. Importante para diferenciar Neisseria y especies de Moraxella + de Acinetobacter y bacterias entricas todas (-) y de Bacilos gram negativos no fermentadores incluyendo Pseudomonas (+) til para diferenciar Proteus, Providencia rettgeri y Klebsiellapneumoniae + de Salmonella, Shigella y Escherichia (-).
RESULTADOS 1.- Reporte los resultados de cada una de las pruebas bioqumicas realizadas (POSITIVA O NEGATIVA). Incluya imgenes. 2.- Utilizando un anexo proporcionado en el Laboratorio, compar con
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ste sus resultados y en base a ellos determinar cual es el Microorganismo con el cul trabajo. CUESTIONARIO 1.- Por qu considera importante la correcta identificacin de un Microorganismo en el Laboratorio de Microbiologa? 2.- En qu consiste el Sistema API? Para qu se utiliza?
PRCTICA 8 COPROPARASITOSCOPA OBJETIVOS Conocer y aprender los procedimientos y tcnicas coproparasitoscpicas ms comnmente empleadas en el laboratorio para el diagnstico de parasitosis. Aprender a identificar los parsitos responsables de infecciones
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ms comunes en base a sus caractersticas morfolgicas. INTRODUCCIN La Parasitologa es una disciplina que estudia a organismos eucariontes que viven a expensas de un husped, al que le pueden producir dao. Comprende agentes biolgicos de diferentes formas y tamao, los parsitos se dividen en tres grandes grupos: protozoos, helmintos y artrpodos. La importancia de la disciplina radica en la gran prevalencia de las infecciones en humanos y animales, en la cantidad y heterogeneidad de los agentes biolgicos, en la diversidad de los ciclos biolgicos, y en la distribucin geogrfica de stos agentes en el mundo. La presencia de una infeccin parasitaria se asocia en forma estrecha a factores geogrficos y climticos, as como a factores antropolgicos y sociales de las poblaciones humanas. Actualmente la importancia de las parasitosis ha aumentado con la presencia de inmunodeprimidos, y con el aumento de poblaciones migrantes y de viajeros. TOMA DE MUESTRA PARA EXAMEN COPROPARASITOSCPICO Regularmente en el rea de Parasitologa, las muestras ms analizadas para demostrar la presencia de parsitos intestinales del hombre son las heces fecales; sin embargo, existen otros parsitos cuya presencia se puede evidenciar en muestras biolgicas como bilis, jugo duodenal, esputo, secrecin, biopsia o frotis perianal, no obstante estas pruebas se harn tomando en cuenta los antecedentes clnicos del paciente. A continuacin, se har referencia a los diversos aspectos con los cuales debern proceder las muestras a analizar con fines parasicolgicos para obtener resultados reproducibles y de esta manera ayudar eficazmente al mdico en el diagnstico, pronstico y tratamiento del paciente. HECES FECALES SLIDAS: Condiciones del paciente: Durante al menos tres das previos a la prueba, el paciente deber evitar tomar medicamentos (antiparasitarios, antibiticos, antidiarreicos, laxantes o purgantes).
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Recipiente de recoleccin Frasco estril de boca ancha, con tapa rosca.
Cantidad de muestra requerida: 3-6 grs Toma de la muestra La muestra deber ser recolectada de la siguiente manera: Con un abatelenguas tome directamente de la cavidad anal un volumen de heces aprox. Entre 3-6 grs (equivalente al tamao de una nuez) NOTA- Evite la contaminacin de la muestra con orina, papel Higinico, jabn, agua o tierra. Transfiera las heces obtenidas al contenedor estril Cierre el envase hermticamente de forma inmediata para evitar contaminaciones bacterianas. A continuacin identifique el frasco con una etiqueta autoadhesiva Finalmente lleve la muestra al laboratorio lo ms pronto posible. NOTA- Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o das, se recomienda adiciones lquido fijador y/o conservador. NOTA- Para aumentar la eficacia de la prueba se recomienda que para el estudio coproparasitoscpico se recolecten un total de tres muestras en 3 das consecutivos. Condiciones de rechazo:
Que el paciento no haya tomado la muestra de forma adecuada. Que la muestra haya sido llevada al laboratorio con ms de 1hr de haber sido tomada o no haya sido adecuadamente conservada. Que el paciente antiparasitario. est recibiendo tratamiento
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HECES FECALES DIARREICAS Cantidad de muestra requerida: 10 ml (un volumen similar al de una cucharada sopera) NOTA- Estas muestras deben procesarse de inmediato (30 min como mximo despus de la deposicin) en caso contrario se debe adicionar algn conservador e indicarlo en la etiqueta de identificacin, pues debe examinarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al acidificarse muchos grmenes patgenos se lisan. PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO DIAGNSTICO PARASITOLGICO-HECES I. PARA EL
EXAMEN COPROPARASITOSCPICO DIRECTO
FUNDAMENTO: Este mtodo permite buscar principalmente en muestras frescas la presencia de formas evolutivas mviles de parsitos de tamao microscpico (trofozoitos, quistes de protozoos Entamoeba histlyitica, Giardia lamblia, Balantidium coli, etc, as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Paragonimus, Fasciola, etc.) METODO a) En un portaobjetos limpio y desengrasado, se colocan separadamente una gota de solucin salina y otra de lugol. b) Con el aplicador de madera se toma una muestra de 1 a 4mg de heces (en muestras con sangre y moco elegir esa parte para estudiar) y se mezcla con la solucin, con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos, procurando hacer una suspensin no un frotis. c) Colocar el cubreobjetos d) Repetir estas operaciones en la gota de lugol e) Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. No es recomendable usar objetivo de inmersin (100X), pues se puede ensuciar el microscopio. Recorrer la lamina siguiendo un sentido direccional, ejemplo: de derecha a izquierda o de arriba abajo. NOTA- Con el suero fisiolgico, los trofozoitos y quistes de los
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protozoarios se observan en forma natural, y con lugol, las estructuras internas, ncleos y vacuolas. II. MTODO DE CONCENTRACIN POR FLOTACIN DE FAUST
FUNDAMENTO- Se basa en que los quistes y/o huevos de los parsitos flotan en la superficie por ser de menor densidad que el sulfato de zinc a 33.3%, cuya densidad es 1180. Es til para la bsqueda de quistes y/o huevos de parsitos y excepcionalmente se observan larvas. Se recomienda controlar la densidad del sulfato de zinc y usar agua filtrada para el lavado previo de la muestra. MTODO a) Se hace una suspensin homognea con 1g de materia fecal y 10 ml de agua. b) Se filtra la suspensin a travs de la gasa colocada en el embudo, colectando el filtrado directamente en el tubo. c) Se centrifugan los tubos a 2000 rpm durante 1 min. d) Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con agua. Se centrifuga nuevamente repitiendo la misma operacin hasta que el sobrenadante se observe limpio. e) Se decanta el ltimo sobrenadante, se resuspende el sedimento y se agrega sulfato de Zinc 1.180Baum y se centrifuga a 2000 rpm durante 1 min. f) Con el asa se recoge la muestra de la pelcula superficial que se encuentra en el menisco, dos o tres ocasiones y se deposita sobre el portaobjetos; se aade una gota de lugol, se mezcla con el ngulo del cubreobjetos y se cubre con el mismo. g) Se observa la preparacin con objetivos de 10x y 40x
RESULTADOS
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Hacer el dibujo de los diferentes parsitos observados en el laboratorio (A COLOR, mnimo 5), as como indicar sus caractersticas morfolgicas principales. Incluir tambin caractersticas principales de la parasitosis causada por el agente etiolgico descrito. (Nombre de la parasitosis, sintomatologa) CUESTIONARIO 1.- Describir un mtodo coproparasitoscpico adicional al descrito en su prctica. (Fundamento y tcnica) 2.- Hacer un esquema de clasificacin de los parsitos ms comunes.
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PRCTICA 9 MICOLOGA
OBJETIVOS Capacitar al alumno para que integre en el laboratorio, los conocimientos tericos adquiridos y establezca correctamente un diagnstico micolgico. Conocer e identificar la morfologa de las especies fngicas responsables de las micosis ms frecuentes. MARCO TERICO La mayora de los tejidos y rganos del cuerpo pueden ser afectados por hongos, por lo que, de acuerdo al tipo de micosis que producen, la muestra biolgicas es muy variable; dependiendo de los tejidos afectados puedes ser: cabello, escamas de piel y uas, sangre, mdula sea, esputo, aspirado bronquial, lquido cefalorraqudeo, pus, etc. La confiabilidad de los resultados que se obtienen en los laboratorios de diagnstico micolgico depende en gran parte de la adecuada toma de muestras; si el procedimiento es deficiente, puede llevar al fracaso al intentar aislar el microorganismo causante de la infeccin. De igual manera, la recuperacin de contaminantes en lugar del agente etiolgico, conduce a una terapia incorrecta cuando son reportados como responsables de un cuadro clnico. En ocasiones los cultivos no son determinantes, ya que los agentes etiolgicos forman parte de la biota habitual de los tejidos, tal es el caso del gnero Cndida que puede presentarse como habitante normal de la mucosa genital y oral, del tracto gastrointestinal (boca, laringe, faringe e intestino) y del tracto respiratorio; de la misma manera, Penicillium y Aspergillus se encuentran habitualmente en el conducto auditivo externo. El examen directo de la muestra al microscopio, constituye una de las etapas ms importantes del diagnstico micolgico, ya que permite identificar la forma parasitaria del agente etiolgico. Es importante resaltar que el nmero de elementos parasitarios en una lesin mictica es inferior al que se encuentra en afecciones bacterianas, y que las estructuras de los hongos miden entre 2 y 20 m, por l que son ms grandes que las de las bacterias que generalmente miden menos de 1 m. La naturaleza de una afeccin que se sospecha es de naturaleza fngica en base a elementos clnicos, debe ser siempre confirmada por el laboratorio a travs de la identificacin de la fase parasitaria del hongo y su cultivo. En caso de un examen micolgico negativo y en presencia de lesiones sugestivas, ste debe repetirse por lo menos tres veces a partir de muestras tomadas en diferentes puntos de la lesin. Dermatofitosis o tias Las dermatofitosis o tias (del cuerpo, cabeza, uas, pies, etc. ) son micosis superficiales ocasionadas por un grupo de hongos denominados dermatofitos, comprendidos en los gneros Microsporum, Trichophyton y Epidermophyton, de ellos, se han identificado 41 especies y solo 11 se consideran importantes como patgenas. En general estos hongos se caracterizan por su queratinofilia, es decir, su afinidad por desarrollarse sobre los tejidos queratinizados (uas, pelos y estrato crneo de la piel). En estado parasitario, los dermatofitos reducen su forma a filamentos 56
ramificados y artroconidios, elementos que permiten orientar el diagnstico de las tias mediante el examen microscpico directo. Al estado saprobio (desarrollado in Vitro mediante cultivo), presentan formas ms complejas y diversas que se emplean para la clasificacin taxonmica. Micetoma El micetoma es un sndrome clnico de la piel y tejidos subyacentes, con tendencia a afectar huesos, que se caracteriza por: lesiones localizadas, inflamatorias y deformantes, no dolorosas, con fstulas a travs de las cuales se elimina pus con presencia de granos caractersticos de los agentes etiolgicos, constituidos por cmulos de filamentos. La triada de signos que define el trmino MICETOMA son: lesiones que semejan un tumor, tractos sinuosos drenantes y presencia de granos. Desde el punto de vista etiolgico, se consideran dos grandes grupos de micetomas; micetoma actinomictico, producido por actinomicetos aerobios y micetoma eumictico, resultan de la invasin por hongos verdaderos. Los actinomicetos son bacterias filamentosas y ramificadas que en el cultivo pueden adquirir macroscpicamente el aspecto de colonias fngicas. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y segn Mariat y Lechevalier, se pueden separar en dos grandes grupos ecolgico-fisiolgicos: los que viven en el suelo y tienen un metabolismo oxidativo, que constituyen el grupo ms importante, y los que habitan frecuentemente en las cavidades del hombre y los animales. Los Actinomicetos se caracterizan porque el dimetro de sus filamentos mide entre 0.5-0.8 mse reproducen asexualmente por medio de esporas. Algunos de ellos son patgenos para el hombre y animales, produciendo lesiones semejantes a las producidas por hongos. Los actinomicetos responsables de micetomas son aerobios, se agrupan en tres gneros: Nocardia, Actinomadurae y Strptomyces, de los cuales las especies ms frecuentes son: N. brasiliensis, N. asteroides, N. caviae, A. madurae, A. pelletieri, y S. somaliensis. Por otra parte, los hongos productores de micetomas son muy variados y se han establecido dos grandes grupos en base a la pigmentacin del micelio: hongos hialinos que originan granos blancos y hongos demateceos que producen granos negros. Dentro de los hongos negros los ms comunes son: Madurella mycetomatis, M. Grisea, Pyrenochaeta romeroi, Phialophora jeanselmii, Leptospora senegalensis, L. Tompkinsii, Curvularia lunata. Los hongos hialinos que se reportan con mayor frecuencia son: Allescheria boydii, Cephalosporium recifei, C. falciforme, Fusarium sp. Neotestudina rosarri, Aspergillus nidulans. Esporotricosis La esporotricosis es una micosis subcutnea granulomatosa, subaguda o crnica, causada por un hongo dimrfico llamado Sporothrix schenckii. Afecta la piel, linfticos y rara vez otros rganos como pulmones, huesos, articulaciones, etc. La esporotricosis es una enfermedad muy polimorfa y al lado de la clsica linfangtica, se pueden observar muchas otras manifestaciones clnicas. Se trata de una micosis cosmopolita que prevalece sobre todo en los trpicos, el hongo responsable tiene como hbitat natural la tierra y los vegetales por lo que la infeccin se adquiere a travs de un traumatismo
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accidental (astillas, espinas, etc,); los camerinos, jardineros, floristas, mineros y amas de casa, constituyen el grupo de mayor riesgo. El diagnstico de laboratorio de la esporotricosis se establece en base a tres aspectos: 1. Inmunolgico: La presencia de S. schenckii y de sus metabolitos en el husped, origina un alto grado de hipersensibilidad por lo que, mediante la prueba intradrmica con esporotricina (polisacridos del hongo) se obtiene una respuesta positiva en todos los caos de esporotricosis clnica. 2. Biopsia: La imagen histopatolgica bsica de la esporotricosis es una combinacin de reaccin pigena y granulomatosa tuberculoide con clulas gigantes, por lo tanto, no es posible diagnosticar por histopatologa. En algunos casos se puede observar clulas levaduriformes redondas de 5mde dimetro, rodeadas de una gran reaccin inflamatoria y cuya tincin con H-E presenta una forma de estrella o cuerpo asteroide, que tampoco es especfico, porque la reaccin eosinoflica radiada que lo constituye puede formarse alrededor de otro cuerpo extrao como bacterias u otro tipo de clulas fngicas. 3. Estudio micolgico: comprende: Examen directo- Generalemente no es til, ya que en preparaciones en fresco es muy raro observar la forma parasitaria del hongo. No obstante algunos autores reportan buenos resultados usando microscopa de contraste de fases. Cultivo- Constituye el mejor mtodo para el diagnstico de la esporotricosis. El material seropurolento obtenido directamente de las lesiones se siembra en medio Sabouraud simple o con antibiticos, a temperatura ambiente, las colonias aparecen del cuarto al sexto da de incubacin; estas colonias, al principio pequeas, blanquecinas y finalmente rayadas, posteriormente presentan micelio areo oscuro y su superficie es plegada y membranosa. La forma de levadura se obtiene cultivndolo a 37C en medios especiales como BHI. Estudio micromorfolgico- Se observan hifas delgadas septadas y ramificadas que producen conidios ovoides o piriformes de paredes delgadas que se agrupan en conidiforos en forma de flor de durazno, o bien se colocan a los lados del micelio, estructuras que corresponden a la fase saprobia del hongo y se obtienen a partir del cultivo en PDA a 28C. A partir del cultivo en BHI, se observan levaduras caractersticas en forma de cigarro y otras redondas de entre 4 y 6 m de longitud.
Cromomicosis La cromomicosis tambin llamada cromoblastomicosis o dermatitis verrucosa es una enfermedad causada por hongos dematiceos de los gneros Fonsecaea Philalophora, Cladosporium, principalmente y en menor grado,
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Exophiala, Acrotheca y Wangiella. Se caracteriza clnicamente por la formacin de ndulos cutneos verrucosos, los cuales se desarrollan muy lentamente y ocasionalmente pueden llegar a ulcerar. Por lo general, las lesiones se presentan en extremidades inferiores, pero pueden aparecer en cualquier otra regin anatmica del cuerpo; la infeccin es consecutiva a la introduccin del hongo a travs de una herida con material contaminado como suelo, madera, productos vegetales, etc. Los agente etiolgicos se presentan en los tejidos como formas redondas de color caf oscuro, a veces tabicadas llamadas clulas fumagoides, la observacin de estas formas al microscopio es fundamental para el diagnstico de cromomicosis. Phialophora verrucosa, Cladosporium carrionii, Fonsecaea pedrosoi, Acrothea aquaspersa y Wagiella dermatitidis, son hongos dematiceos de crecimiento lento, desarrollan colonias aterciopeladas de un color que vara del verde olivo al negro, cada uno presenta estructuras de reproduccin caractersticas que nos permite su deferenciacin en gnero y especie. Candidosis La candidosis es la micosis oportunista ms frecuente. Es una infeccin aguda o crnica de las mucosas, piel, uas, o tejidos profundos, causada por levaduras del gnero Cndida, se considera una levadura comensal del hombre, que habita en la piel, mucosas, tracto respiratorio alto y tracto digestivo. Segn F. Odds, existen aproximadamente 80 especies de Candida, sin embargo, la especie que con mayor frecuencia causa esta infeccin es C. albicans, otras de las especies del gnero son: C. stellatoidea, C. krusei, C. tropicales, C. pseudotropicalis, C. guillermondi, C. parapsilosis, C. glabrata y C zeylanoides. La mayora de los casos con candidosis tienen origen endgeno y se desarrollan a partir de los sitios en los cuales habita como comensal, sin embargo, la fuente de infeccin tambin puede ser exgena, a travs de venoclisis, ciruga cardiaca, alimentacin parenteral, etc. Los hongos del gnero Cndida son levaduras redondas u ovaladas de 3-7mde dimetro, que se reproducen por blastoconidios, forman pseudomicelios, algunas de sus especies forman clamidoconidios y tienen capacidades fermentativas. Ninguna de las especies del gnero produce pigmento carotenoides, ni asimilan el inositol y todas carecen de cpsula. Criptococosis La criptococosis es una micosis crnica o subaguda, causada por el hongo oportunista Cryotococcus neoformans. Inicialmente se produce una infeccin pulmonar primaria asintomtica que posteriormente se dirige al SNC por un tropismo tisular caracterstico, tambin puede diseminar a piel, vsceras, mucosas y otros rganos. C. neoformans es un hongo monomrfico, se presenta como una levadura de aproximadamente 4-8mde dimetro con una cpsula de mucopolisacridos, que llega a medir hasta tres veces el tamao de la levadura y en conjunto alcanzan hasta 20mde dimetro. Se conocen 4 serotipos: A, B, C, D, y 2 variedades: C. neoformans var. neoformans y C. neorormans var. gatti.La variedad neoformans predomina con sus serotipos A (mundial) y D
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(Europa). La fase teleomrfica o sexuada, corresponde a un basidiomiceto del gnero Fillobasidiella. C. neoformans es un microorganismo ubicuo y se encuentra en las excretas de las aves, sobre todo de palomas y pichones, tambin puede encontrarse en diferentes frutas y vegetales. El diagnstico de laboratorio se realiza mediante un examen directo de lquido cefalorraqudeo (LCR) o bien, en los cortes histopatolgicos donde se observan levaduras capsuladas mediante la tincin de mucicarmn de Mayer; otras tinciones permiten la observacin de la levadura ms no tien la cpsula. El aislamiento del hongo de la muestra biolgica se obtiene en medios de cultivo simples libres de antibiticos como el de ASD o PDA, e los cuales desarrolla colonias mucoides caractersticas de color blanco amarillento, o en medios especficos como el medio de cultivo de Staib (niger) en el que desarrolla pigmentacin oscura. La cpsula de la levadura se observa fcilmente en preparaciones con tinta china, Bioqumicamente es un productor de ureasa. Por mtodos serolgicos, es posible hacer la determinacin de antgeno circulante especfico en LCR y suero por aglutinacin de partculas ltex. La identificacin se hace por pruebas Bioqumicas y sondas de DNA. RESULTADOS Hacer el dibujo de las diferentes estructuras fngicas observadas en el laboratorio (Mnimo 5), as como indicar sus caractersticas morfolgicas principales. Incluir la informacin correspondiente al tipo de micosis causada por cada uno de los hongos observados. (Nombre de la micosis, sntomatologa, etc) CUESTIONARIO 1.- Describir la metodologa de toma de muestra para poder establecer el diagnstico de cada una de las micosis descritas en su prctica. 2.- Investigar la sintomatologa correspondiente a cada una de las micosis descritas en la prctica.
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ANEXO 1 PROCEDIMIENTOS ESTANDARIZADOS 1 A.- CUIDADO DE LAS SUPERFICIES DE TRABAJO Se recomienda que las superficies de trabajo se descontaminen antes de trabajar y al final del trabajo cada da. Los compuestos cuaternarios de amonio y el alcohol al 70% son apropiados para los laboratorios que manejan agentes infecciones de bajo riesgo. La solucin debe aplicarse con un algodn o toalla de papel, el equipo y material internos deben de moverse para que toda la superficie se limpie. 1 B.- LAVADO DE MANOS Este procedimiento es muy importante para prevenir la exposicin y diseminacin de agentes infecciosos. a) Abrir el grifo y mojarse las manos con agua. b) Colocr el jabn en las manos. c) Extender el jabn alrededor de las manos y entre los dedos. d) Lavar las manos por 1min con frotamiento vigoroso empezando por unos centmetros antes de las muecas y extendiendo hacia abajo entre los dedos y alrededor y bajo las muecas. e) Enjuagar con agua corriente, empezando con la seccin arriba de la mueca y hacia los dedos. f) Secar las manos con papel y cerrar el grifo usando el papel con el que se sec. 1 C.- DERRAMAMIENTOS DE MEDIOS Y SUSTANCIAS INFECTANTES La persona que va a actuar en el derramamiento traer bata, lentes, etc. y usar el germinicida FENOL al 5% que debe de colocarse alrededor del sitio en cuestin para evitar la formacin de aerosoles y toallas de papel empapadas en germicida sobre el area derramada. El germicida debe permanecer al menos 20 minutos para asegurarse su accin. Los materiales derramados se juntan con el material de enjuague y se destina a la autoclave para su descontaminacin.
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1 D.- DESCONTAMINACIN DESECHOS INFECCIOSOS Los desechos infecciosos del laboratorio (placas petri, tubos de cultivo, instrumentos y vidrieria en general) pueden esterilizarse an autoclave a 121C, 15lb/in2, y un tiempo necesario para conseguir la descontaminacin, el cual depender de factores especficos como tipo de desechos y cantidad de los desechos. La efectividad del proceso de esterilizacin se comprobar con resiembras en medios solidos adecuados del material al final del proceso. 1 E.- ORINA, HECES Y SOLUCIONES QUE DERIVEN DE SU PROCEDIMIENTO a) Coloque en el recipiente destinado al tratamiento 1 mL de hipoclorito de Sodio al 6% por cada 20 mL de residuo lquido o 10 gramos del residuo slido. b) Vierta las orinas y heces al recipiente, homogenizando perfectamente. c) Deje reposar por una hora (coloque un anuncio de que el recipiente se est utilizando para un proceso de desinfeccin). d) Una vez completado el tiempo de desinfeccin, deseche la muestra al sanitario.
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ANEXO 2 DEFINICIONES Almacenamiento- Accin de retener temporalmete residuos en tanto se procesan para su disposicin final o entregan al servicio de recoleccin. Antibiticos- Sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo. Antispticos- Se refiere a sustancias que inhiben el crecimento y desarrollo de microorganismos sin destruirlos necesariamente, que se aplican sobre el cuerpo. Asepsia- Tcnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos al campo de trabajo. Cepa- Cultivo puro de microorganismos procedente de un aislamiento. Contaminacin- Se considera contaminado el especimen o muestra que contenga microorganismos, material extraa, as como cualquier otra sustancia que rebase los lmites permisibles establecidos. CRETIB- Cdigo de clasificacin de las caractersticas que contienen los residuos peligrosos y que significan corrosivo, reactivo, explosivo, txico, inflammable y biolgico infeccioso. Desinfeccin- Reduccin del nmero de microorganismos a un nivel que no da lugar a contaminacin de la muestra, mediante agentes qumicos, mtodos fsicos o ambos, higinicamente satisfactorios. Generalmente no matan las esporas. Desinfectante- Cualquier agente por lo regular qumico, capaz de matar las formas en desarrollo, pero no necesariamente las esporas resistentes de microorganismos patgenos, empleadas sore objetos inanimados. Esterilizacin- Eliminacin de toda forma de vida, includas las esporas. Higiene- Todas las medidas necesarias para garantizar la salud del personal de laboratorio en todas las fases de las prcticas y procedimientos. Inocuo- Aquellos que no hace o causa dao a la salud. Lote- Cantidad de producto elaborada en un mismo lapso para garantizar su homogeneidad. Microorganismos patgenos- Microorganismos capaces de causar alguna enfermedad al ser humano. 63
Microorganismos- Organismos microscpicos tales como parsitos, levaduras, hongos, bacterias, rickettsias y virus. Muestra biolgica- Fraccin de tejido o fludo corporal que se extrae de organisos vivos para su anlisis, durante su diagnstico o tratamiento. Residuo peligroso biolgico-infeccioso- El que contiene bacterias, virus, u otros microorganismos con capacidad de causar infeccin o que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente, que se generan en establecimientos de atencin mdica. Sanidad- Conjunto de servicios para preservar la salud pblica. Spsis- Presencia en la sangre u otros tejidos de microorganismos patgenos y sus toxinas. Txico- Aquello que constituye un riesgo para la salud cuando al penetrar al organismo humano produce alteraciones fsicas, umicas o biolgicas que daan la salud de manera inmediata, mediata, temporal o permanente, o incluso ocasionan la muerte. Tratamiento de residuo peligrosos biolgico infeccionso- Mtodo que elimina las caractersticas de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos.
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