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INSTITUTO POLITÉCNICO DE SANTARÉM – ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA

CURSO DE ENGENHARIA DA PRODUÇÃO ANIMAL

BIOQUÍMICA

Doseamento das proteínas


pelo método do bioreto
(Relatório)

#2439 – David Quintino


#2466 – Filipe Sampaio
#2587 – André Chucha
Resumo
Este trabalho teve como objectivo a determinação da quantidade de proteína
numa amostra. Para tal foi utilizada a espectroscopia de absorção molecular, mais
concretamente o método do Biureto. Esta reacção ocorre com todos os compostos que
contenham duas ou mais ligações peptídicas, formando-se um complexo azul púrpura.
A concentração da proteína na amostra foi calculada a partir de uma curva de
calibração feita usando uma solução proteica padrão, a solução de albumina de soro
bovino (BSA) 2mg/mL.
A equação da recta de calibração é y = 0,0371x + 0,0159 e através dela e dos
valores da absorvência para o tubo 6 e 7, podemos concluir que as suas concentrações
são: 21,17 mg/mL e 8,277 mg/mL, respectivamente.
Em relação à Lei de Lambert – Beer podemos concluir que existem desvios, pois
o coeficiente de correlação (r) = 0,9878, quando deveria ser 0,9999.
Introdução Teórica

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ ou emissão de


radiação electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se
movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da
radiação nos comprimentos de onda entre o ultra violeta e o infra vermelho.
A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de
onda que vai desde o ultra violeta ao infra vermelho no espectro da radiação
electromagnética.
O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 µm.
Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz
monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida
por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes
comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz
monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro
permite-nos saber que quantidade de luz é absorvida em cada comprimento de onda.
O conjunto das absorvências dos vários comprimentos de onda para um
composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância, a
espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu
espectro como também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está
relacionada com a concentração da substância.
Existe então princípios de absorção da luz:
A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada;
A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo
feixe luminoso através das amostras.

Juntando estes princípios temos a lei de Lambert – Beer: Abs = E. b. c


A absorvência da luz a cada comprimento de onda é directamente
proporcional à concentração da solução contida na couvette. Esta linearidade deixa de
ocorrer a concentrações muito elevadas da substância, podendo nestes casos diluir
previamente a amostra a medir.
Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas
complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de
onda. Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos, o composto a
quantificar é posto em contacto com um reagente específico, de modo a desenvolver
uma cor cuja intensidade é directamente proporcional à concentração da substância
na mistura original. Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode
medir-se a absorvência a 280µm, sendo esta proporcional à concentração de proteína.
Mas se quisermos saber a concentração de proteína num extracto impuro, este método
já não pode ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo os ácidos
nucleícos, também absorvem a este comprimento de onda. Neste caso, podemos
utilizar, por exemplo, o reagente de Biureto, que reage de modo quantitativo com as
proteínas, originando um complexo violeta, que absorve fortemente a radiação a
540µm.
Para quantificar espectrofotométricamente uma substância é necessário saber
o valor de . Para isso é necessário preparar uma série de soluções do composto a
quantificar, de concentração conhecida, fazê-las contactar com o reagente e medir as
absorvências ao comprimento de onda adequado.
Assim, podemos fazer corresponder uma absorvência medida, a uma concentração
de substância na solução a analisar, obtendo deste modo, uma curva de calibração.
Na determinação da concentração de proteínas, objectivo deste trabalho, há que
ter em conta que nem todas as proteínas exibem o mesmo comportamento perante os
ensaios espectrofotométricos de doseamento.
As características físico-químicas das proteínas exploradas em análises
quantitativas são:

1. As absorvências das cadeias laterais de resíduos aromáticos a 280µm;


2. Absorvências específicas de grupos prostéticos de proteínas, por exemplo do
grupo heme a 415µm;
3. A ligação peptídica que forma um complexo violeta com Cu 2+ na reacção do
Biureto;
4. As cadeias laterais de Tyr e Trp, que reagem com agentes oxidantes no método
de Lowry;
5. A ligação de corantes a regiões hidrofóbicas, como no método de Bradford;
6. As cadeias laterais de Lys e His e o terminal amina que reagem com a ninidrina.

Cada método é aplicável a gamas restritas de concentrações de proteínas e


apresentam sensibilidades e interferências a considerar, quando as amostras contém
outras moléculas para além das proteínas. Entre as vantagens da utilização destes
métodos, figuram a facilidade de execução e o facto de substâncias específicas
poderem ser doseadas em soluções que contenham misturas de várias biomoléculas
sem etapas prévias de purificação.
A reacção do Biureto (método utilizado nesta experiência) é um dos métodos mais
rápidos e mais utilizados no doseamento de proteínas. Foi um dos primeiros ensaios
colorimétricos a ser desenvolvido. A natureza do complexo colorido não é conhecida
em detalhe, no entanto pensa-se que está envolvida a formação de um complexo de
cobre em soluções muito alcalinas com uma ligação peptídica das proteínas e também
com alguns resíduos de tirosina, formando um complexo de cor violeta.
Procedimento Experimental

Material e reagentes:

o Solução padrão de albumina de soro de bovino (BSA) 2 mg/mL


o Solução de proteína de concentração desconhecida
o Reagente do Biureto: dissolveu-se 6g de tartarato de sódio e potássio
tetrahidratado em 500mL de água destilada. Adicionou-se lentamente 1,5g de
sulfato de cobre pentahidratado e 300 mL de hidróxido de sódio10% (m/v).
diluiu-se para 1 L.
o Espectrofotómetro
o Cuvettes para medição no visível (plástico ou vidro)
o Tubos de ensaio
o Copo de precipitação
o Pipetas
o Balança analítica

Procedimento:

1. Preparou-se o branco e os tubos para a curva de calibração de acordo com o


quadro:

Tubo 1 2 3 4 5
mL BSA 0,3 0,5 0,7 1,0 1,2
mL H2O 1,2 1,0 0,8 0,5 0,3
Tubo branco: 1,5 mL de H2O

2. Diluiu-se o extracto proteico preparado na aula anterior 1/50 (0,1 mL de extracto


+ 4,9 mL de H2O) e prepararam-se os tubos com a amostra de proteína:

Tubo 6: 0,2 mL de amostra + 1,3 mL de H2O


Tubo 7: 1,0 mL de amostra + 0,5 mL de H2O

3. Adicionou-se 1,5 mL de reagente do Biureto a todos os tubos e agitou-se.

4. Deixou-se em banho-maria a 37ºC durante 15 minutos;

5. Leu-se a absorvência 540µm (calibrou-se o espectrofotómetro com o branco)


Apresentação e tratamento de resultados

Cálculos:

o Tubo 1
2 mg ------------ 1 mL
x ------------ 0,3 mL x = 0,6 mg

o Tubo 2
2 mg ------------ 1 mL
x ------------ 0,5 mL x = 1,0 mg

o Tubo 3
2 mg ----------- 1mL
x ----------- 0,7 mL x = 1,4 mg

o Tubo 4
2 mg ------------ 1mL
x ------------ 1,0 mL x = 2,0 mg

o Tubo 5
2 mg ----------- 1mL
x ----------- 1,2 mL x = 2,4 mg

Abs mg de proteína
TUBOS mL de BSA
540µm

1 0,051 0,3 0,6

2 0,097 0,5 1,0

3 0,118 0,7 1,4

4 0,170 1,0 2,0

5 0,200 1,2 2,4


Gráfico:

0,25
y = 0,0371x + 0,0159
0,2 R2 = 0,9878
ABS. 540nm

0,15

0,1 Series1
Linear (Series1)
0,05

0
0,6 1,0 1,4 2,0 2,4
mg de proteína

Cálculos: (amostras)

A partir da equação da recta: y = 0,0371 x + 0,0159

o Tubo 6
0,173 = 0,0371 x + 0,0159
x = 4,234 mg

Concentração do tubo 6 = (4,234 x 1) / 0,2 = 21,17 mg/mL

o Tubo 7
0,323 = 0,0371 x + 0,0159
x = 8,277 mg

Concentração do tubo 7 = (8,277 x 1) / 1 = 8,277 mg/mL

Resultados do
cálculo da
massa (mg) Concentrações
TUBOS Amostra (mL) Abs. 540µm (mg/mL)
apartir da
equação da
recta

6 0,2 0,173 4,234 21,17

7 1,0 0,323 8,277 8,277


Discussão e conclusões
De acordo com os nossos princípios teóricos concluímos que existem desvios à
Lei de Lambert–Beer pois o coeficiente de correlação é igual a 0,9878, quando deveria
tomar valores próximos de 0,9999. Podemos também concluir que este é um método
muito sensível, daí a existência de desvios, que podem ter ocorrido devido a pouco
cuidado na execução e utilização da curva de calibração.
No entanto, todos os objectivos foram alcançados, dentro dos quais se destaca
a obtenção, através da recta de calibração y = 0,0371 x + 0,0159, do valor da
concentração da amostra contida no tubo 6 e no tubo 7.
Este trabalho permitiu também a familiarização com a técnica da
espectrofotometria e um dos métodos colorimétricos mais utilizados – o método do
Biureto.

Bibliografia
www.google.com
Protocolo experimental dado na aula
Sebenta teórica de Bioquímica