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Evaluacin de efectos antiinflamatorios y antinociceptivo de Croton pullei var glabrior Lanj. (Euphorbiaceae) Fabio F. Rocha *; Evan M. N.

NairII; Elson A. CostaIII; Lucy G. MatosIII; Adolfo H. MllerIV; Giselle M. S. P. GuilhonIV; Wellington S. corts; Frederick A. Vanderlinde
(I)

Departamento de Ciencias Fisiolgicas, Instituto de Biologia, Universidade Federal Rural

do Rio de Janeiro, 23890-000 Seropdica-RJ, Brasil


II

Curso de medicina veterinaria, Centro Universitrio de Barra Mansa, 27330-550 Barra Departamento de Ciencias Fisiolgicas, Instituto de ciencias biolgicas de la Universidad

Mansa-RIO DE JANEIRO, Brasil


III

Federal de Gois.74001-131 Goinia-GO, Brasil


IV

Departamento de Qumica, Centro de Cincias Exatas e Naturais, Universidade Federal

do Par, 66075-110, Belm-PA, Brasil RESUMEN Croton pullei var glabrior Lanj. (Joseph Lanjouw) (Euphorbiaceae) es una liana, ampliamente distribuida en la Selva Amaznica. En medicina popular, varias plantas del gnero Crotn se han utilizado con fines teraputicos en patologas que involucran enfermedades dolorosas e inflamatorias lo que justifica este trabajo. El objetivo de este estudio fue investigar las actividad antinociceptiva y antiinflamatoria del extracto de metanol de hojas de C. pullei (MECP). MECP redujo de una manera dependiente de la dosis el nmero de contorsiones abdominal inducida por cido actico (1,2%) en los ratones, lo que sugiere una actividad antinociceptiva de la planta. Por otro lado, MECP no modific de manera significativa la reactividad a la estimulacin trmica en la prueba de la placa caliente y la reactividad a la estimulacin qumica en la primera fase de la prueba de formalina, indicando un mecanismo no opiceo. MECP redujo la nocicepcin inducida por formalina en la segunda fase, inhibi el edema de odo inducido por el aceite de crotn y redujo la migracin de los leucocitos en la prueba de la peritonitis inducido por carragenina, indicando una actividad antiinflamatoria. Aunque los mecanismos que subyacen a estos efectos de la planta no estn totalmente dilucidados, estos resultados parecen apoyar el potencial uso medicinal de Croton pullei var glabrior Lanj. contra enfermedades dolorosas e inflamatorias. Palabras clave: Antiinflamatorio, antinociceptivo, Croton pullei var glabrior, fitomedicina. INTRODUCCIN El dolor se considera una de las quejas ms comunes en todo el mundo para la cual los pacientes buscan tratamiento. A lo largo de la historia se han utilizado diferentes tratamientos para aliviar el dolor. Hoy en da, varios agentes antiinflamatorios se utilizan para tratar diferentes tipos de dolor asociado o no con el proceso inflamatorio. Estos agentes son eficaces en la mayora de los casos, pero los efectos colaterales son comunes,

especialmente cuando se utilizan en tratamientos crnicos. El efecto colateral ms comn es el malestar gastrointestinal (Peura y Goldkind, 2005). Un enfoque para resolver este problema es el uso de inhibidores selectivos de la COX-2 con un bajo riesgo de hemorragia gastrointestinal (Bombardier et al, 2000;.. Silverstein et al, 2000). Aunque estos frmacos son bien tolerados, su seguridad cardiovascular ha sido cuestionada hace unos aos (Mukherjee et al., 2001) y, recientemente, el rofecoxib fue retirado del mercado debido a un aumento del riesgo de enfermedades cardiovasculares, principalmente el infarto del miocardio y el accidente cerebrovascular (Singh, 2004). Ante esta situacin, han buscado nuevos frmacos con diferente espectro de accin o menos efectos secundarios. La investigacin de plantas medicinales puede propiciar el descubrimiento de nuevas molculas con mecanismos innovadores o menos efectos secundarios adversos (McCurdy & Scully, 2005). Entre las plantas medicinales la familia euphorbiaceae es la ms conocida, con ms de 8.000 especies ampliamente distribuidas en regiones tropicales y templadas del mundo (Wilson et al., 1979; Agra et al., 2007). En este contexto, un gnero con varias especies usadas en la medicina tradicional para tratar diferentes trastornos es el gnero Croton. Algunas de las especies de Croton han sido estudiados exhaustivamente por sus propiedades medicinales y toxicolgicas siendo demostrados cientficamente (Souza et al., 2006; Costa et al., 2007; Perazzo et al., 2007; Salatino et al., 2007; Torrico et al., 2007). Otras especies de este gnero fueron poco estudiadas, y sus propiedades farmacolgicas y efectos colaterales son todava desconocidos. Croton pullei (Euphorbiaceae) es una liana que crece por encima de otros rboles, distribuidos en las reas tropicales con amplia distribucin en la selva del Amazonas (Gallenmller et al., 2001). Hasta el momento no hemos encontrado ningn informe sobre el uso de esta especie en la medicina popular. Por otro lado, esta planta pertenece a un gnero que se usa comnmente con fines medicinales que justifican este estudio. El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de la glabrior Lanj. variedad de Croton pullei en modelos de nocicepcin e inflamacin. MATERIAL Y MTODOS Extracto de metanol crudo Las hojas de Croton pullei var glabrior Lanj. fueron recolectadas en la ciudad de Peixe-boi, estado de Par, (regin amaznica - Brasil), en diciembre de 1997. Las muestras fueron autenticadas por el Dr. Ricardo de Souza Secco, un botnico del Museo Paranse Emlio Goeldi (MPEG), y los especmenes fueron depositados en el herbario del MPEG bajo el nmero MG-0151738. El extracto metanlico fue obtenido mediante filtracin y despus el concentrado seco bajo presin reducida, por debajo de 40 C, para obtener el extracto crudo de metanol (MECP) (6,1%).

Medicamentos y reactivos Formalina, cido actico, acetona (Merck AG, Darmstadt, Alemania), aceite de crotn, indometacina, carragenina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos), fentanil (farmacutica Janssen, Blgica), dexametasona (Prodome, Brasil). MECP e indometacina se diluyeron en agua de grifo, mientras que el fentanilo y dexametasona se diluyeron en solucin salina. Animales Se utilizaron ratones suizos adultos machos (25-30g) en todos los experimentos. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 7:00) a temperatura constante (23 2 C) con acceso libre a alimentos y agua, excepto durante los experimentos. Los animales control recibieron agua del grifo como vehculo (10 mL/kg, p.o.) y cada animal se us slo una vez. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices actuales para el cuidado de los animales de laboratorio y directrices ticas sobre el uso de animales en investigacin del dolor (Zimmermann, 1986). Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comit local de Cuidado y Uso de Animales (005/2006/CEPEB/UFRRJ). Prueba de contorsiones inducida por cido actico Grupos de 6 a 9 ratones fueron tratados por va oral (p.o.) con vehculo, MECP (0.1 a 1.0 g/kg) o indometacina (10 mg/kg) 60 min antes de la inyeccin de cido actico va intraperitoneal (i.p.) (1,2%, 0,1 mL/10 g) y el nmero de contorciones fueron contados por los siguientes 30 min (Koster et al., 1959). Prueba del plato caliente La latencia (s) del estmulo del calor (55 C 0,5) se midi cada 30 minutos, comenzando 30 minutos antes y hasta 2 horas despus del pre-tratamiento de 8 grupos de ratones con MECP (1.0 g/kg, p.o.), agua o aplicacin subcutnea (s.c.) de fentanilo (200 g/kg) (D'Amour & Smith, 1941). Nocicepcin inducida por formalina Grupos de 7 a 9 ratones fueron tratados por va oral con vehculo, MECP (1 g/kg) o indometacina (10 mg/kg) 60 min antes a la inyeccin de la solucin de formalina (1,2%; 20 L/pata) en la superficie plantar de la pata trasera (inyeccin i.p.). Otro grupo fue tratado con fentanilo (200 g/kg, s.c.) 15 min antes de los estmulos nociceptivos de formalina. El tiempo que los animales pasaron lamiendo la pata inyectada fue medido con un cronmetro y era considerado como un ndice de nocicepcin. Despus de la inyeccin de formalina, la respuesta nociceptiva inicial alcanz su punto mximo en alrededor de 5 min, denominada fase temprana, que fue seguido de un segundo pico (fase tarda) que se produjo entre los 15 y 30 min despus de la inyeccin (Hunskaar et al., 1985).

Edema inducido por aceite de croton en oreja de ratn Una hora tras la administracin oral (n = 7) de agua, MECP (1.0 g/kg) o indometacina (10 mg/kg), cada animal fue tratado con 20L de aceite de croton recin preparada (2,5% en acetona) en el interior de la superficie de la oreja derecha. El odo izquierdo fue tratado con el mismo volumen de acetona (control). Cuatro horas despus de los tratamientos, los ratones se sacrificaron por dislocacin cervical y un tapn (6 mm de dimetro) fue tomado de las orejas, tratada y no tratada, con un punzn. Supervisamos la respuesta inflamatoria (edema) pesando (mg) ambos tapones y probando las diferencias (Zanini Junior et al., 1992). Peritonitis inducida por carragenina Grupos de 7 animales fueron tratados con vehculo, dexametasona (1 mg/kg, s.c.) o MECP (0.1-1.0 g/kg, p.o.), seguido de carragenina de 1% (0,25 mL, i.p.) 1 hora ms tarde. Cuatro horas despus de la inyeccin intraperitoneal, los ratones se sacrificaron y 2 ml de PBS modificado (heparina, 10 UI / ml) se inyectaron en la cavidad peritoneal. El recuento celular total se realiz usando una cmara de Neubauer descrita por Ferrndiz y Alcaraz (1991). Los resultados se expresaron como medias SEM de los nmeros de leucocitos totales (x10
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por ml de lavado peritoneal o porcentaje de inhibicin de la migracin

leucocitaria en comparacin con el grupo control. Anlisis estadstico Los datos se analizaron estadsticamente por ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparaciones mltiples de Dunnet. En la prueba de la placa caliente se utiliz: ANOVA bidireccional seguido por el anlisis de prueba de Bonferroni. Los valores se presentan como media error estndar de la media (SEM). Los valores de p inferior a 0,05 (p <0,05) fueron considerados como significativos. RESULTADOS Prueba de contorsiones inducida por cido actico La figura 1 muestra que MECP (0.3 y 1.0 g/kg, p.o.) produjo una inhibicin significativa (p < 0,05) relacionada con la dosis del retorcimiento abdominal inducida por cido actico de 33.6 y 65,5%, respectivamente, en comparacin con el grupo control. La mayor dosis probada produjo inhibicin de constriccin abdominal similar a la indometacina de control positivo (10 mg/kg), que produjo una inhibicin del 65,1%.

Figura 1. Efecto del extracto de metanol de C. pullei (MECP) o indometacina (INDO) en el retorcimiento inducido por cido actico en ratones. Los valores se expresan como media SEM del nmero de contracciones registradas durante 30 min despus de la inyeccin de cido actico. * p <0,05: ** p <0.0l en comparacin con grupo de control del vehculo (Prueba de ANOVA. Dunnct como la prueba post hoc), n = 6-9.

Prueba del plato caliente El MECP estuvo inactivo en la prueba del plato caliente en la mayor dosis efectiva en la prueba de contorcin abdominal de cido actico (1,0 g/kg, p.o.). Fentanilo (200 g/kg s.c.), utilizado como un frmaco de referencia, produjo un significativo efecto antinociceptivo 30 min despus de la administracin de este frmaco en comparacin con los valores control (figura 2).

Figura2.EfectodelextractodemetanoldeC.pullei(MECP,1,0g/ kgporvaoral)ofentanilo(200ng/kgsc)enlarespuestanociceptiva delosratonesenlapruebadelaplacacaliente.Losvaloresseexpresancomomedia SEMdelalatenciaparaelcomportamientonociceptivo.**p<0,01

encomparacinconelgrupocontroldelvehculo(ANOVAdedosvas. PruebadeBonferronicomolapruebaposthoc),n=8.
Nocicepcin inducida por formalina En la primera fase de nocicepcin formalina-inducida, el tratamiento por va oral previo con MECP (1.0 g/kg) no modific significativamente el tiempo de lamidas de los animales en comparacin con el grupo control. Sin embargo, en la segunda fase una reduccin significativa (71,5%) en el tiempo de lamidas pudo ser observada despus del tratamiento con MECP, con reduccin comparable a la de la indometacina (10 mg/kg), que produjo una reduccin del 68,5% como se muestra en la tabla 1.

Prueba de edema de oreja inducida por el aceite de crotn La tabla 2 muestra que MECP (1.0 g/kg, p.o.) caus una inhibicin del 72,4% en edema de oreja inducida por el aceite de crotn (p < control vs 0,05). Indometacina (10 mg/kg), utilizada como un frmaco de referencia, inhibe el edema de la oreja por 58,1% en comparacin con el resultado del grupo control.

Peritonitis inducido por carragenina Los resultados listados en la tabla 3 muestran que la administracin por va oral de MECP (0.1, 0.3 y 1.0 g/kg) produjo una reduccin, relacionada con la dosis, del nmero de leucocitos que migran a la cavidad peritoneal, con inhibicin del 33.1, 60.1 y 76.7%, respectivamente. La mayor dosis de MECP inhibe la migracin de los leucocitos comparable a la inducida por dexametasona (1 mg/kg, s.c.) que produjo el 81.2% de inhibicin.

DISCUSIN El efecto antinociceptivo de la MECP fue probado en tres modelos de nocicepcin: contorcin abdominal inducida por cido actico, prueba de la placa caliente y nocicepcin formalina-inducida. El tratamiento con MECP haba promovido efecto antinociceptivo relacionado con la dosis en el modelo de contorciones abdominal inducido por cido actico. Aunque este modelo podra ser comnmente utilizado como un mtodo de cribado para identificar frmacos con actividad antinociceptivo potencial, varios grupos de frmacos con diferentes mecanismos de accin pueden inhibir la contorcin abdominal (Koster et al, 1959; Hendershot & Forsaith, 1959). Por otra parte, la participacin de diferentes mediadores como prostaglandinas (Deraedt et al., 1980), Neuroquinina A (Julia & Buno, 1997) y CGRP (Friese et al., 1997), por ejemplo, fue descrita en este experimento que significa que no es posible sugerir cualquier mecanismo para el efecto antinociceptivo de MECP, basado slo en este modelo. En la prueba de la placa caliente, MECP no indujo ningn efecto antinociceptivo. Puesto que los receptores opiceos espinales y supraspinal desempean un papel importante en este ensayo (Schmauss & codujo, 1984) es posible que MECP no acta sobre los receptores opioides centrales o producir liberacin de pptidos opioides endgenos. Esta conclusin se ve reforzada por el hecho de que MECP no redujo el tiempo de lameduras en la primera fase (dolor neurognico) de prueba de formol, que es altamente sensible a los agentes opioides (Hunskaar & agujero, 1987). MECP redujo el tiempo de lameduras en la segunda fase de la prueba de formalina (dolor inflamatorio). Esta fase de la prueba es sensible a los frmacos antiinflamatorios no esteroideos como la indometacina, utilizado como frmaco de referencia (Hunskaar & agujero, 1987). Este resultado sugiere que el efecto antinociceptivo de MECP podra estar relacionado con los mecanismos antiinflamatorios. La hiptesis antiinflamatoria fue probada en dos modelos que evalan distintos aspectos del proceso inflamatorio, el edema y la migracin de leucocitos. MECP redujo significativamente el edema oreja inducida por aceite de crotn del 72% y tambin redujo de alguna manera la relacin dosis con la migracin de leucocitos totales en el peritoneo

despus de estmulo de carragenina. Produccin de exudados en estos modelos se relaciona con la liberacin local de sustancias vasoactivas (histamina y Cininas) y la sntesis de prostaglandinas (Morrow & Roberts II, 2001). Aunque la migracin de los leucocitos no podra estar directamente relacionada con productos de la ciclooxigenasa, el proceso puede ser inhibido por algunos compuestos antiinflamatorios no esteroideos, indicando que muchos mecanismos pueden estar implicados en su control (Mikami & Miyasaka, 1983). Efectos antiinflamatorios no esteroideos en la migracin leucocitaria tambin pueden ser multifactorial, ya que podra estar relacionado con la inhibicin de la fosfolipasa A2 (Morrow & Roberts II, 2001) as como otros mecanismos, por ejemplo, la inhibicin del TNF y la produccin de IL-1 que son potentes activadores de muchas de las acciones implicadas en la migracin leucocitaria (Pereira et al., 2006). Puesto que varios mecanismos pueden estar involucrados en la migracin de leucocitos deben hacerse ms estudios para aclarar el mecanismo del efecto antiinflamatorio de MECP. Trabajo previo con la madera del tronco y corteza de Croton pullei var glabrior Lanj. Se identific los esteroides como ster de sitosterol, estigmasterol, el triterpeno lupeol y el cido kaurenoico diterpeno (Abreu et al., 2001). Los efectos antiinflamatorios y antinociceptivo de estigmasterol (Santos et al., 1995; Garca et al. 1999), beta-sitosterol y beta-sitosteril-beta-D-glucsido (Villaseor et al., 2002), cido kaurenoico (Block et al., 1998; Paiva et al., 2003) y lupeol, (Fernndez et al., 2001a, b; Nikima et al., 2001) aisladas de diferentes especies vegetales se han demostrado en modelos farmacolgicos y pueden contribuir al efecto de MECP. Aunque el beta-sitosterol, estigmasterol, cido kaurenoico y lupeol son compuestos potenciales para justificar las acciones antiinflamatorias y antinociceptivo de la MECP, estos compuestos fueron aislados de la madera del tronco y corteza de Croton pullei var glabrior Lanj. (Abreu et al., 2001) y no de las hojas, material utilizado en el presente estudio. Un fraccionamiento guiado por bioensayo de este extracto es ahora en curso para identificar la sustancia o sustancias bioactivas en el Extracto de metanol de C. pullei, as como los mecanismos de accin involucrados en los efectos descritos antes. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen la Universidad Centro de Barra Mansa y brasileo National Research Council (CNPq) para apoyo financiero.

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