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UNIVERSITE DE NGAOUNDERE FACULTE DES SCIENCES Dpartement des Sciences Biomdicales Filire Sciences Biomdicale-Option : Bactriologie et Virologie mdicale

UNIVERSITY OF NGAOUNDERE FACULTY OF SCIENCES Department of Biomedical Sciences Biomedical Sciences-Option: Medical Bacteriology and Virology

UE : BIOCHIMIE CLINIQUE

TRAVAIL PERSONNEL DE LETUDIANT

THEMES A DEVELOPER :

1. Principe et mthode de llectrophorse 2. Principe de mthode de dosage du glucose 3. Technique et principe de dosage de la cratinine, 4. Technique et principe de dosage de lure 5. Technique et principe de dosage lacide urique 6. Les mthodes immunomtriques dans le dosage de la myoglobine Rdig par :

KAGNING TSINDA Emmanuel Matricule: 08N042FS Niveau : Etudiant en Master 1 Option : Bactriologie et virologie mdicale Enseignant Dr Jules Clment Nguedia Assob Anne acadmique : 2011-2012

Travail Personnel de lEtudiant Kagning Tsinda Emmanuel

SOMMAIRE
SOMMAIRE ........................................................................................................................................... 1 INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................................ 3 THEME 1 : LE PRINCIPE ET LA PROCEDURE DE REALISATION DE ......................................... 4 I. II. INTERET DE LELECTROPHORESE ................................................................................. 4 PRINCIPE GENERAL (1) ................................................................................................... 4

III. PROCEDURES DE REALISATION DE LELECTROPHORESE : mthode avec les Instruments MIDIGEL ................................................................................................................. 6 IV. APPLICATIONS DE LELECTROPHORESE ............................................................... 12 VI.1 Application de lElectrophorse lidentification des phnotypes molculaires et des gnotypes ; cas de la drpanocytose (3) ..................................................................................... 12 VI.2 Application de l'lectrophorse en immunologie : sparation des anticorps sriques ......... 14 Thme 2 : PRINCIPE ET PROCEDURE DE DOSAGE DU GLUCOSE ........................................... 18 I. II. Intrt clinique de la mesure de la Glycmie ........................................................................ 18 Mthode de Dosage : ............................................................................................................... 18 II.1 Principe se basant sur la mthode enzymatique de Trinder ........................................... 18 II.2 Procdure .............................................................................................................................. 19 THEME 3 : PRINCIPE ET DOSAGE DE L'UREE PAR LA METHODE CINETIQUE .................... 22 I. II. III. I. Intrt du dosage ..................................................................................................................... 22 Principe du dosage enzymatique ...................................................................................... 22 Mthode de dosage .............................................................................................................. 22 INTERET CLINIQUE (10).................................................................................................. 25

THEME 4 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LA CREATININE .................................. 25 II. PRINCIPE ET METHODE DU DOSAGE : mthode photomtrique colorimtrique selon la raction de JAFFE............................................................................................................................. 25 II.1 Principe ..................................................................................................................................... 25 II.2 Mthode de dosage (8) ............................................................................................................ 25 THEME 5 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LACIDE URIQUE (10) ......................... 30 I. II. INTERET DU DOSAGE ........................................................................................................ 30 PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE ........................................................................ 30 II.1 Principe ................................................................................................................................. 30 II.b Mthode Uricase de dosage .................................................................................................... 30 THEME 6 : TECHNIQUES IMMUNOMETRIQUES DU DOSAGE DE LA MYOGLOBINE ......... 34 I. Gnralits et Intrt clinique du dosage de la myoglobine (11) ....................................... 34 Page 1/39

Principe et mthode de dosage de la Cratinine

Travail Personnel de lEtudiant Kagning Tsinda Emmanuel II. 1. 2. a. b. c. Mthodes du dosage ............................................................................................................ 34 Immunoprcipitation .............................................................................................................. 35 Immuno-turbidimetrie et immuno-nphlomtrie............................................................... 35 Immuno-turbidimetrie............................................................................................................ 35 immuno-nphlomtrie : Cas particulier de la nphlmtrie (2) ...................................... 36 Mthode du dosage via lImmuno-turbidimetrie et immuno-nphlomtrie .................... 37

CONCLUSION GENERALE ............................................................................................................... 38 BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................................ 39

Principe et mthode de dosage de la Cratinine

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INTRODUCTION GENERALE

La Biochimie clinique est lapplication des aspects chimiques de la vie de lhomme sain ou malade et lapplication des mthodes chimiques employes au laboratoire pour le diagnostic, le control dun traitement, et la prvention des maladies. Pour ce faire, la connaissance des principes et procdures de diagnostic des diffrents composs marqueurs de pathologies est indispensable. Le cours sur la grande majorit de mthodes de dosages biochimiques nous a t dispens par le Dr Jules Clment Assob Nguedia. Cependant, il nous est demande, dans le cadre dun travail Personnel de ltudiant, de prsenter le principe et mthode de ralisation de llectrophorse, le principe de mthode de dosage du glucose, la technique et principe de dosage de la cratinine, de lure, de lacide urique, et enfin, le principe et mthode immunomtriques dans le dosage de la myoglobine.

Introduction Gnrale

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THEME 1 : LE PRINCIPE ET LA PROCEDURE DE REALISATION DE LELECROPHORESE I. INTERET DE LELECTROPHORESE

De nos jours, llectrophorse est devenue une technique de routine dans les laboratoires o on lutilise pour sparer notamment les protines et les acides nucliques. Llectrophorse des protines peut tre ralise sur des supports varis, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel dagarose selon les informations recherches. Llectrophorse de protines sur gel dagarose est la technique la plus aise et la moins coteuse mettre en uvre dans un tablissement denseignement avec un matriel limit. Elle ncessite simplement une cuve lectrophorse et une alimentation continue. (1) Durant notre prsentation, tout en prcisant que llectrophorse peut aussi semployer pour sparer les acides nucliques, nous tacherons de parler du principe gnral de llectrophorse ensuite, nous prsenterons ses applications selon quon se trouve en hmatologie et en immunologie. II. PRINCIPE GENERAL (1)

L'lectrophorse est une technique biochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant des charges lectriques diffrentes migrent des vitesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique. Llectrophorse sur support ou lectrophorse de zones permet de stabiliser la phase liquide grce lutilisation dun support poreux imprgn d'un solvant tamponn. Principes de la migration lectrophortique : la migration dpend de plusieurs facteurs : de la mobilit lectrophortique U, qui est fonction de la charge et de la gomtrie de la particule. Une particule de charge lectrique Q, place dans un champ lectrique E, est soumise une force F qui l'entrane vers l'lectrode de signe oppos :

Des forces de frottement f, dues la viscosit du milieu , s'opposent la migration de la particule, et ce d'autant plus que la particule est grosse (r = rayon) et que la vitesse de migration (v) est grande :

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(N.B. Le coefficient de viscosit dpend de la temprature)

Il arrive un moment o ces deux forces s'quilibrent, et la particule se dplace alors vitesse constante; on peut alors crire:

On dfinit pour chaque particule sa mobilit , de manire indpendante du champ lectrique, par la relation :

La mobilit est une caractristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une sparation en se basant sur cette proprit. La charge Q est fonction du pH isolectrique de la particule et du pH du solvant : on appelle pH isolectrique d'une particule (pHi ou pI) le pH pour lequel cette particule ne migre pas dans un champ lectrique (ceci est une dfinition exprimentale). Pour les molcules de petite taille, on peut prvoir la valeur du pHi en calculant le pH isoionique, pH pour lequel la charge nette est nulle, partir des pKa des diffrents groupements ionisables de la molcule; mais cela n'est pas possible pour les macromolcules, car leur environnement ionique modifie notablement leur charge relle. La diffrence pH - pHi dtermine le signe de la charge Q d'une particule. (1) A chaque acide amin correspond une valeur de pH isolectrique, (pHi auquel les acides amins sont lectriquement neutres). En dehors de ce " point isolectrique " les acides amins sont globalement chargs et migrent sous l'effet d'un champ lectrique. Ainsi, en travaillant un pH fix (dans une solution tampon), on peut sparer diffrents acides amins par
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lectrophorse. Lorsque des acides amins sont placs dans un champ lectrique, ils migrent vers l'lectrode de polarit oppose, les molcules neutres ne migrant pas. Ainsi : quand pH>pHi, l'acide amin a une charge globale ngative : il migre vers l'lectrode positive(anode). Quand pH<pHi, l'acide amin a une charge globale positive : il migre vers l'lectrode ngative(cathode). Quand pH=pHi, l'acide amin est sous forme zwitterionique (neutre): il ne migre pas et reste au point de dpart. (1)

III.

PROCEDURES DE REALISATION DE LELECTROPHORESE : mthode avec les Instruments MIDIGEL

II.1 lectrophorse de protines sur gel dagarose support : protocole gnral Protocole (chantillon = Sang, le srum, ou bien tout acide nuclique.)

Les gels prts l'emploi prsentent l'avantage d'tre couls sur un support plastique ce qui, d'une part, vite de les prparer et facilite leur manipulation et, d'autre part, permettent de conserver indfiniment les rsultats aprs coloration et schage. Comme pour les mthodes spcifiques d'lectrophorse, il faut disposer d'une cuve dans laquelle est plac le gel et d'une alimentation continue. On peut utiliser une mini-cuve identique celle utilise pour l'lectrophorse de l'ADN ou une cuve pour lectrophorse clinique, de meilleur prix. Dans le premier cas, la cuve tant conue pour un gel immerg, on remplit les deux rservoirs avec le tampon d'lectrophorse et on tablit le contact lectrique entre gel et tampon par des ponts de papier filtre tremps dans le tampon. Il en est de mme si l'on utilise une cuve pour lectrophorse clinique car ce type de cuve est conu initialement pour des bandes d'actate de cellulose suffisamment souples pour que les extrmits plongent dans les rservoirs de tampon alors que les gels supports sont couls sur un support rigide.

Principe et mthode de ralisation de llectrophorse

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Une cuve pour lectrophorse clinique est forme de deux rservoirs de tampon spars munis chacun d'une lectrode de platine.

Figure 1 : Cuve pour lectrophorse clinique (couvercle enlev. Taille relle : 22 cm)

Chaque support de gel est plac cheval au-dessus de la cloison qui spare les deux rservoirs. Le protocole d'lectrophorse comporte en general: le dpt des chantillons, la mise en place des gels, la migration lectrophortique, la fixation du gel et sa coloration puis une dcoloration du fond. Une fois schs, les gels peuvent tre conservs indfiniment.

Prparation du gel et dpt des chantillons Les gels supports prts l'emploi sont constitus d'une mince couche d'agarose coule sur un support plastique de 100 mm x 75 mm permettant leur manipulation aise.

Fig. 1 : Gel dagarose prt lemploi

Principe et mthode de ralisation de llectrophorse

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Une fois le gel sorti de son emballage, la zone de dpt est essore avec une bande de papier filtre pour faciliter la diffusion des chantillons lors du dpt.

Figure 2 : Essorage de la zone de dpt

La bande est ensuite retire et jete et on dispose la mme place un masque de dpt form d'une bande de plastique comportant 10 fentes.

Figure 3 : Mise en place du masque de dpt

Un volume de 5 L des chantillons analyser est dpos sur les fentes et abandonn pendant 5 minutes pour assurer leur diffusion au niveau de la zone de dpt.

Figure 3 : Dpt des chantillons

Le liquide non absorb par le gel est ensuite essor avec une autre bande de papier filtre et le masque de dpt est jet.

Principe et mthode de ralisation de llectrophorse

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Fig. 4 : Essorage du liquide en excs Le gel est alors mis en place dans la cuve et le contact lectrique entre le tampon plac dans les deux rservoirs et le gel est assur par des bandes de papier filtre trempes dans le tampon.

Fig. 5 : Gel en place dans la cuve Aprs fermeture du couvercle et mise en marche de l'alimentation, la migration des protines dmarre. La tension applique au gel et le temps de migration dpendent de la nature des chantillons analyser.

Fig. 6 : Ensemble du dispositif d'lectrophorse

Principe et mthode de ralisation de llectrophorse

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Fixation et coloration

Une fois la migration lectrophortique termine, le gel est plong pendant dix minutes dans le fixateur, sch puis plong pendant 10 minutes dans le colorant. Une succession de bains dans la solution de dcoloration permet ensuite d'liminer la coloration du fond de faon faire apparatre les bandes correspondant aux diverses protines spares.

Fig. 7 : Dcoloration du fond Le gel est ensuite sch ce qui permet de le conserver dans de bonnes conditions.

Fig. 8 : Schage final du gel

Principe et mthode de ralisation de llectrophorse

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Les Solutions utilises sont :


o

Tampon Tris barbital : Tris (hydroxy mthyl) aminomthane : 7,2 g Acide dithylbarbiturique : 1,82 g Dithylbarbiturate de sodium : 10,2 g Ethylmercurithiosalicylate : 0,02 g Eau distille : 1 L

Fixateur : Mthanol : 90 ml Acide actique glacial : 20 ml Eau distille : 90 ml

Colorant : Noir amidon : 1,25 g Acide actique 5 % : 500 ml

Dcolorant : Acide actique 5 %

Principe et mthode de ralisation de llectrophorse

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IV.

APPLICATIONS DE LELECTROPHORESE

Llectrophorse peut tre applique dans plusieurs domaines tels que la biochimie, lhmatologie, et limmunologie. En dautres termes, cette technique peut servir dans : Lestimation du poids molculaire de fragment d'ADN aprs une digestion par des enzymes de restriction (2) LAnalyse d'ADN ou d'ARN aprs une amplification par PCR (2) La Sparation de fragments ADN digrs avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot. (2) Lidentification des phnotypes molculaires et des gnotypes (Ex : cas de la drpanocytose) (1) La sparation des protines plasmatiques (1) Pour tre un peu plus explicite et illustratif, nous allons retenir les 2 derniers cas, afin de prsenter leurs principes spcifiques, la procdure. . VI.1 Application de lElectrophorse lidentification des phnotypes molculaires et des gnotypes ; cas de la drpanocytose (3)

a. intrt clinique
Plusieurs maladies hrditaires qualifies d'hmoglobinopathies, comme les thalassmies et la drpanocytose, affectent l'un des deux gnes codant les chanes de l'hmoglobine humaine adulte, hmoprotine ttramrique constitue de deux chanes alpha et de deux chanes bta. La drpanocytose est une affection gntique due une mutation ponctuelle dans le gne codant la chane bta. Elle est caractrise par la substitution de l'acide glutamique en position 6 de la structure primaire par une valine. Il en rsulte une hmoglobine anormale (HbS) qui a tendance polymriser lorsque la pression partielle en dioxygne diminue, en particulier dans le sang priphrique, contrairement l'hmoglobine normale (HbA) qui ne prsente pas cette proprit. La prsence de cette hmoglobine anormale dans les globules rouges aboutit une pathologie qui peut tre plus ou moins grave en fonction de divers autres facteurs gntiques et environnementaux, principalement chez les homozygotes, et elle peut tre dtecte par l'observation microscopique du sang qui contient des hmaties dformes, qualifies de falciformes (en forme de faucille). La simple substitution de la valine en position 6 dans la structure primaire de la chane bta
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confre l'hmoglobine S une charge lectrique globale infrieure celle de l'hmoglobine A. Il en rsulte que lorsque les deux hmoglobines sont places sur un gel d'lectrophorse, elles ne migrent pas de la mme faon ce qui permet de les identifier dans un simple hmolyst de globules rouges. On peut aisment en dduire le phnotype molculaire du porteur et en dduire son gnotype.

b. Protocole spcifique
Le protocole de ralisation est semblable celui dtaill ci-dessus. Cependant, on utilise du sang total quon dilue dans de leau physiologique afin de lyser les hmaties et librer lhmoglobine en solution. Les chantillons utiliser pour mener llectrophorse sont donc des solutions ralises artificiellement avec des hmoglobines A ou S dissoutes a raison de 2,5 mg/ml dans du tampon d'lectrophorse pralablement oxygn par une agitation vigoureuse. Cependant, on ne saurait raliser un examen juste pour le plaisir de le faire, mais pour contribuer soit au diagnostic des maladies, ou bien au suivi des patients, et mme dans le cadre de la recherche

c. Rsultats et exploitation
Le recours l'lectrophorse peut tre justifi par le problme suivant : chez les membres d'une mme famille dont un fils est atteint de drpanocytose, on a extrait l'hmoglobine des globules rouges et on a soumis les chantillons l'lectrophorse sur gel d'agarose afin d'identifier les gnotypes pour construire l'arbre gnalogique de la famille. Les sept membres dont l'hmoglobine a t analyse sont les deux parents (pistes 1 et 2), leurs quatre enfants (pistes 3 6) et un petit enfant (piste 7). En outre, deux rfrences sont constitues par un chantillon d'hmoglobine S (piste 8) et un chantillon d'hmoglobine A (piste 9). Le gel ci-contre montre les rsultats obtenus.

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Fig. 9 : Exemple dlectrophorse des hmoglobines A et S (1)

Fig 11: interprtation VI.2 Application de l'lectrophorse en immunologie : sparation des anticorps sriques (4) a. Intrt clinique La sparation et l'identification de protines par lectrophorse de liquides biologiques est utilise en immunologie, notamment pour confirmer le diagnostic de certaines atteintes du systme immunitaire, en particulier celles concernant l'immunit humorale.
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Des pathologies rares affectant la production des anticorps comme l'agammaglobulinmie (absence de scrtion des gammaglobulines) et l'hypo-gammaglobulinmie, (scrtion insuffisante des gammaglobulines) peuvent tre dtectes par lectrophorse des protines sriques. En effet, de rares exceptions prs, les atteintes de l'immunit humorale se traduisent par une diminution de la concentration d'une ou plusieurs classes d'immunoglobulines dans le srum, mme si les larges variations de concentration observes parmi la population adulte rendent difficile la dtermination de la fourchette des valeurs normales. C'est pourquoi, en pratique clinique, d'autres tests sont utiliss pour complter l'information du mdecin comme, par exemple, la mesure des iso-hmagglutinines et de l'antistreptolysine O ou celle des agglutinines typhodiques H et O avant et aprs immunisation par le vaccin contre la fivre typhode. b. Protocole spcifique Les procdures suivre pour raliser les lectrophorses sont indiques la page du protocole gnral. Les rsultats prsents ci-dessous correspondent au dpt d'chantillons de plasma ou srum d'un volume de 5 L soumis lectrophorse pendant 60 minutes 140 V. Les profils lectrophortique sont tracs avec l'un des deux outils logiciels distribus librement sur le Web, Digispec et Mesurim. Cependant, on ne saurait raliser un examen juste pour le plaisir de le faire, mais pour contribuer soit au diagnostic des maladies, ou bien au suivi des patients, et mme dans le cadre de la recherche c. Rsultats et exploitation cliniques
o

Dtection d'anomalies immunitaires

Srum humain normal

Les globulines sriques ont t nommes par Tiselius en 1950 d'aprs leur vitesse de migration lectrophortique par rapport l'albumine qui migre le plus rapidement et prsente la concentration la plus leve. On distingue ainsi les alpha (1 et 2), bta (1 et 2) et gamma globulines dans l'ordre des vitesses de migration dcroissantes.

Les anticorps prsents dans le srum migrent des vitesses diffrentes selon leur nature. Les IgA migrent avec les fractions alpha 2 ou bta 1, les IgM avec la fraction gamma rapide et les IgG avec la fraction gamma lente.

La figure ci-contre prsente le profil lectrophortique du srum humain normal et son


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analyse densitomtrique. Il servira de rfrence pour interprter les rsultats des lectrophorses des divers patients.

Fig. 10 : Piste d'lectrophorse et analyse densitomtrique (srum humain normal)

Srums pathologiques

Dans le but d'identifier la nature de leur pathologie, on a soumis l'lectrophorse, le srum de deux patients atteints de dysfonctionnements du systme immunitaire. Outre le srum des deux patients (pistes 2 et 3), on a galement soumis l'lectrophorse deux chantillons de srum normal (pistes 1 et 5) ainsi qu'un chantillon d'immunoglobulines pour servir de rfrence (piste 4).

Les rsultats obtenus et les diffrents profils densitomtriques des pistes sont prsents cidessous.

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Fig. 11 : Cinq pistes d'lectrophorse

Fig. 12 : Profils densitomtriques correspondants

L'examen visuel des profils lectrophortique complt par l'analyse densitomtrique permet d'identifier certaines anomalies : L'individu 2 prsente un srum particulirement concentr en immunoglobulines mais les autres protines sriques prsentent une concentration infrieure la normale. Inversement, le srum de l'individu 3 est dpourvu de gamma globulines tandis que les autres bandes sont normales. Dans le premier cas, il s'agit d'une hyper-gammaglobulinmie tandis que dans le second, il s'agit d'une agammaglobulinmie.

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Thme 2 : PRINCIPE ET PROCEDURE DE DOSAGE DU GLUCOSE

I.

Intrt clinique de la mesure de la Glycmie

La glycmie et le paramtre fondamental de diagnostic, du pronostic et de la surveillance du traitement lors de l'tude volutive du DIABETE, extrmement banal en pratique mdical courante. La Rgulation de la glycmie obit aux lois suivantes : - L'autorgulation : les ractions biochimiques sont en presque totalit rversibles. - Le systme hypoglycmiant : assure exclusivement par linsuline qui est une hormone secrte par les cellules B des ilots de Langerhans. Linsuline favorise la pntration du glucose dans la cellule hpatique, active la glucokinase et favorise la glycogense par activation du glycogne synthtase. - Le systme hyperglycmiant : assure en grande partie par le glucagon qui est une hormone secrte par les cellules alpha des lots de Langerhans du pancras endocrine. Le glucagon favorise aussi la glycognolyse hpatique. (5) La concentration en glucose sanguin est maintenue lintrieur de limites relativement troites dans diffrentes situations (absorption de nourriture, jene ou exercice intense) par des hormones rgulatrices comme linsuline, le glucagon ou lpinphrine. Le dosage du glucose est un des tests les plus frquemment raliss au laboratoire danalyses mdicales, conjointement avec dautres tests de tolrance (preuve dhyperglycmie provoque, glycmie postprandiale). (6) Le dsordre du mtabolisme des carbohydrates sanguins le plus couramment rencontr est lhyperglycmie due au diabte de type 1. Une hyperglycmie suprieure 3,0 g/L (16,5 mmol/L) peut conduire une cto-acidose et un coma hyperosmolaire. De mme, Toute hypoglycmie durable, infrieure 0,30 g/L (1,7 mmol/L), est susceptible dentraner des lsions encphaliques graves et irrversibles. (6) II. Mthode de Dosage : II.1 Principe se basant sur la mthode enzymatique de Trinder Cest une mthode enzymatique qui est la plus utilise car elle est trs la plus sensible, trs fiable et spcifique. (7)

Principe et mthode de dosage du Glucose

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Le glucose est oxyd par la Glucose oxydase en acide gluconique et H2O2 qui ragit (en prsence de Peroxydase) avec le chloro-4-phnol et le 4-Amino-antipyrine pour former une quinonimine rouge. Labsorbance du complexe color, proportionnelle la concentration en glucose dans le spcimen est mesure 500 nm. II.2 Procdure Ractions mises en jeu :

Figure 13: Schma ractionnel par la mthode de Trinder (7) Ractifs: Solution Tampon-enzymes (S1) : 150 mmol/L > 20 000 UI/L > 1000 UI/L

Tampon phosphate Glucose oxydase (GOD) Peroxydase (POD)

4-Amino-antipyrine (PAP) 0,8 mmol/L Substance chromogne : Chloro-4-phnol 2 mmol/L (S2) Solution Etalon : Glucose 1 g/L (5,55 mmol/L) Prlvement et prparation du spcimen (8) Srum ou plasma : Sparer rapidement des cellules sanguines pour prvenir la glycolyse. Si le fluorure est utilis comme conservateur, une diminution de 0,09 g/L (0,5 mmol/L) est observe dans les
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deux premires heures, la concentration se stabilise ensuite. Le glucose est stable dans le srum et le plasma hparin : 8 h 25C. 72 h 2-8C. Le glucose est stable dans le plasma (fluorure de sodium ou iodoactate) : 24 h temprature ambiante. LCR : Analys immdiatement aprs collecte pour viter des rsultats sous valus. Conserver -20C. Urines : collectes en flacon opaque et conserves 2-8C. Conserver les urines de 24 h avec 5 ml dacide actique glacial ou 5 g de sodium benzoate ou fluorure. Limite de linarit : La raction est linaire jusqu 5 g/L (28 mmol/L). Au-del, diluer le spcimen avec une solution NaCl 9 g/L et refaire le dosage en tenant compte de la dilution dans le calcul du rsultat. La limite de linarit dpend du rapport de volume spcimen/ractif. Mode opratoire (technique manuelle)

Matriel : Equipement de base du laboratoire danalyses mdicales, 2. Srums de contrle normaux et pathologiques. Le ractif de travail est constitu en mlangeant les solutions S1 et S2. Ramener les ractifs et spcimens temprature ambiante.

CALCUL de la concentration

Le rsultat est dtermin daprs la formule suivante :


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Abs (dosage) Rsultat = x Concentration de lEtalon Abs (Etalon)

Cette mthode de Trinder peut aussi tre ralise l'aide de bandelettes ractives (ressemblant celles utilises pour les urines) dont l'extrmit, imprgne de ractifs, reoit une goutte de sang. La variation de coloration est apprcie soit visiblement l'aide d'une chelle colore soit par un lecteur portable indpendant et elle permet d'estimer la valeur de la glycmie. Le prlvement au bout du doigt permet donc de raliser facilement cet autocontrle glycmique si important maintenant pour l'quilibrage de la glycmie des diabtiques, en particulier ceux porteurs d'une pompe insuline, implante ou non.

Principe et mthode de dosage du Glucose

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THEME 3 : PRINCIPE ET DOSAGE DE L'UREE PAR LA METHODE CINETIQUE A L'UREASE (9)

I.

Intrt du dosage

Lure, CO (NH2)2 provient du catabolisme des protines et des acides amins par transamination ou par dsamination. Elle est forme dans le foie partir de l'ammoniac. Elle passe dans la circulation sanguine. Elle est limine essentiellement par le rein. Le taux d'ure dpend la fois de la fonction rnale, de la production hpatique, des apports azots alimentaires, du catabolisme protidique et de l'tat d'hydratation. II. Principe du dosage enzymatique

La dtermination enzymatique de l'ure par mthode cintique se fait selon les ractions suivantes: Ure + H2O>en presence d urease > 2NH3 + CO2 2NH4+ + 2 alphoctoglutarate +2 NADH> en presence de GLDH > 2 Glutamate + 2NAD + 2H2O GLDH= 2-L-Glutamate dshydrognase Cette mthode est plus sensible et plus spcifique que la mthode la diactyl-monoxime. III. a) Echantillons L'ure sanguine est ralise chez un sujet jeun depuis 10 heures environ. Le dosage de l'ure se fait sur le srum, le plasma et les urines de 24 heures qui peuvent tre congels moins 20C pendant 3 mois. Il est conseill d'viter de traiter les chantillons hmolyses, contamins ou ayant subi plus d'une dconglation. Le plasma est recueilli sur hparinate de lithium. Il faut viter les anticoagulants contenant les ions ammoniums et les fluorures. Il faut sparer le plus rapidement possible le srum ou le plasma du culot globulaire (dans les 2 heures qui suivent le prlvement). Les
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Mthode de dosage

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urines de 24 heures sont conserves +4C pour viter la pullulation microbienne, il faut les diluer au 1/100 dans de l'eau distille avant le dosage. b) Ractifs Ce sont des coffrets commercialiss dont il faut suivre le protocole fix par le fabricant. Ils contiennent en gnral les ractifs suivants: Ractif 1 : ADP 0,66 mmol/1

GLDH >1 OOOU/l Urase > 30 OOOU/ l NADH 0,32 mmol/1

Alphactoglutarate 9 mmol/1 Ractif 2: Tampon tris pH 8 75 mmol/1

Etalon : n = 0/5g/l = (8,325 mmol/1) Dissoudre le ractif 1 dans le ractif 2 pour obtenir la solution de travail, elle reste stable pendant 5 jours 20 - 25C et 3 semaines +4C. c) Mode opratoire II faut s'assurer avant emploi que les ractifs et les chantillons sont la temprature ambiante pendant 10 20 minutes. Longueur d'onde : 340 nm Temprature d'incubation : 37c Le Zro de l'appareil se rgle avec de leau distille. Domaine de linarit : jusqu' 2g/l Stabilit de la coloration ; 30 minutes 20C-25C ou 10 minutes 37C
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La mthode est linaire jusqu' 2g/l. Si la concentration en ure est suprieure cette valeur, il faut recommencer le dosage sur l'chantillon dilu au 1/2 avec une solution de NaCI 9g/l; en n'oubliant pas de tenir compte de cette dilution avant de rendre le rsultat qui sera multipli par 2. Mlanger et lire les densits optiques (D01) 30 secondes aprs l'addition de l'chantillon ou de l'talon, lire ensuite une seconde fois les densits optiques (D02) exactement 60 secondes aprs la premire lecture. Calcul : Ure (g/1) = (D02 - D01) chantillon x n/ (D02 - D01) talon n =Concentration de l'talon ure en g/1. Tenir compte de la dilution dans le cas des urines (rsultat x 100) Valeurs normales Srum - plasma : 0,15 0,45g/l

Urines de 24 heures 12 30 g/24H Les valeurs normales varient en fonction de l'ge, du rgime protidique et de l'tat d'hydratation du sujet. d) Variations physiopathologiques Srum ou plasma

Augmentation : Rgime riche en protines/ Age>60 ans / Fivre/ Dshydratation/ Insuffisance rnale aigu/ Insuffisance rnale chronique Diminution : Age<4 ans/ Insuffisance hpatique svre (cirrhose)/ Malnutrition proteinocalorique Urines de24H

Augmentation : Rgime riche en protines /Fivre Diminution : Grossesse/ Rgime riche en sucre et pauvre en protines/ Insuffisance hpatique svre/ Nphropathie
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THEME 4 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LA CREATININE

I.

INTERET CLINIQUE (10)

La cratinine, petite molcule cyclique, un produit du mtabolisme musculaire. Elle provient de la dshydratation spontane de lacide N-methylguanido-actique ou cratine, elle-mme issue de la transamination du glycolle (l'amidine provient de lhydrolyse de larginine) dans le tissu rnal et de la trans-methylation classique aux dpens de S-adenosyl mthionine. La cratinine plasmatique et urinaire est le reflet fidle de la masse musculaire globale. L'limination de la cratinine est exclusive urinaire, elle subit une filtration glomrulaire et elle nest par la suite ni rabsorbe, ni secrte au niveau du tubule. Sa concentration urinaire est indpendante de la diurse et de lapport protique alimentaire contrairement l'ure, et devient, en mesurant directement la filtration glomrulaire, un des paramtres nphrologiques les plus apprcis et les plus fidles. La valeur de la clairance de la cratinine revt donc une signification smiologique fondamentale lors de l'tablissement de diagnostic ou de l'tude de l'volution dune insuffisance rnale. II. II.1 Principe En milieu alcalin, la cratinine donne avec lacide picrique un complexe jaune orange dont lintensit de la coloration mesure 492 nm est proportionnelle la concentration en cratinine. Cratinine + acide picrique complexe= cratinine- picrate. II.2 Mthode de dosage (8) Prlvement et prparation du spcimen PRINCIPE ET METHODE DU DOSAGE : mthode photomtrique colorimtrique selon la raction de JAFFE.

Echantillon: Srum ou plasma hparin. Urines : Collecter durant prcisment (4, 12 ou 24 h). Diluer 1+19 dans leau dminralise avant dosage. La cratinine est stable dans le spcimen : Pendant 24 h 2-8C (congeler pour conservation prolonge). Ractifs :
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Ractifs alcalin (R1) Phosphate disodique Hydroxyde de sodium 6,4 mmol/L 150 mmol/L

Ractifs de coloration (R2) Acide picrique 4,0 mmol/L

Dodcylsulfate de sodium 0,75 mmol/L Etalon cratinine 177 =mol/L (20 mg/L) Limite de linarit La raction est linaire jusqu 1327 =mol/L (150 mg/L). Au -del, diluer le spcimen (1+4) avec une solution NaCl 9 g/L et refaire le dosage en tenant compte de la dilution dans le calcul du rsultat. La limite de linarit dpend du rapport des volumes spcimen/ractif. (10) Mode opratoire (technique manuelle) (10)

Porter les ractifs et spcimens temprature de mesure. Raliser tous les essais temprature ambiante et constante. Le ractif de travail est constitu en mlangeant le ractif alcalin au ractif de coloration.

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Remarque : 1. Srum, plasma, ou urines dilues (1 + 19) dans leau distille. 2. Lintervalle de lecture choisi une incidence sur limportance des interfrences, certaines intervenant rapidement (acto-actate) dautres lentement (protines). 3. Pour une meilleure sensibilit, raliser de prfrence le dosage 37C.

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Valeurs Normales et Variations Physiologiques :

Cratinine plasmatique : -Pour lhomme la fourchette de normalit se situe entre 80 et 115 mol/l, valeurs nettement plus basse chez la femme entre 50 90 mol/l. Cratinine urinaire : Son taux est le reflet de la masse musculaire du sujet, il nest influence ni par la diurse, ni par lalimentation, pour un sujet donne, son taux est tellement fixe quil peut servir de rfrence pour estimer la validit dun recueil complet des urines de 24 heures. Elle est de 1000 1500 mg/24H, plus faible chez la femme du fait de la musculature faible. Chez le nourrisson, tout en graisse et trs peu muscle, le taux est minimal. Signification des variations pathologiques : La cratinine plasmatique et urinaire avec lure plasmatique et urinaire et l ionogramme plasmatique et urinaire sont les paramtres fondamentaux de la pathologie lors de linsuffisance rnale, sont difficiles interprter les uns sans les autres. On admet quune cratininmie suprieure 180 mol correspond une altration deau moins 50% de la fonction rnale. Sa clairance mesure le degr de linsuffisance rnale et motive de
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ce fait les attitudes thrapeutiques (ajuster les prescriptions dittiques est mdicamenteux). Chez les transplantes, labaissement significatif de la clairance de la cratinine est un des premiers signes du rejet. Les variations pathologiques concernent exclusivement les atteintes rnales (pathologie nphrotique) : -Insuffisance rnale fonctionnelle et organique. -Glomrulonphrite aigue ou chronique. -Syndrome nphrotique. -Lithiases rnales. -Glomerulosclerose diabtique.

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THEME 5 : PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE DE LACIDE URIQUE (10)

I.

INTERET DU DOSAGE Chez lhumain, lacide urique est le principal produit issu du catabolisme des

nuclosides puriques, Adnosine et Guanosine. Dans le sang, l'acide urique est sous forme de sel soluble (urate) ; lorsque son taux s'lve trop, l'acide urique en excs redevient insoluble et peut prcipiter, en particulier au niveau articulaire. Il peut alors entraner des crises de goutte. II. PRINCIPE ET METHODE DE DOSAGE II.1 Principe Luricase agit sur lacide urique pour produire de lallantone, du dioxyde de carbone et du peroxyde d'hydrogne. En prsence de peroxydase, le peroxyde dhydrogne ragit avec un chromogne (dichloro-hydroxybenzne sulfonate et amino-antipyrine) pour former une quinonimine, complexe de couleur rouge. Labsorbance mesure 520 nm (490-530), est proportionnelle la quantit dacide urique dans le spcimen. II.b Mthode Uricase de dosage Lchantillon L'uricmie est ralise chez un sujet Jeun depuis 10 heures environ. Le prlvement est effectu sur le srum ou le plasma recueilli sur hparinate de lithium et sur les urines de 24 heures, qui peuvent tre congels moins 20C pendant 3 mois. Il est conseill d'viter de traiter les chantillons hmolyses, contamins ou ayant subi plus d'une dconglation. Il faut sparer le plus rapidement possible le srum ou le plasma du culot globulaire (dans les 2 heures qui suivent le prlvement). Les urines de 24 heures seront dilues au 1/10 avec de l'eau distille. Les srums peuvent tre conservs 1 semaine +4C. Les srums ictriques ou hmolyses donnent des erreurs par excs.
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Il faut signaler toute prise mdicamenteuse (thophilline/ cafine, vitamine C et les salycils) qui risque d'interfrer avec le dosage. Ce sont des coffrets commercialiss dont il faut suivre le protocole fix par le fabricant. Ils contiennent en gnral les ractifs suivants : Ractif 1 : Tampon phosphate pH 7,5 : 50 mmol/1 Acide 3-5-dichloro- 2-hydroxybenzne sulfonique : 2 mmol/1 Ractif 2 : Amino4 antipyrine 0,23 mmol/1 Peroxydase > 660 U/l Uricase > 60 U/l Etalon : n = 60 mg/1 = (357 mol/l)

Mode opratoire

II faut s'assurer avant emploi que les ractifs et les chantillons sont la temprature ambiante pendant 10 20 minutes. Longueur d'onde : 510nm (490550 nm) Temprature d'incubation 37C Zro de l'appareil : blanc ractif Domaine de linarit : jusqu' 250mg/l Stabilit de la coloration : 30 minutes 20C-25C ou 10 minutes 37C La mthode est linaire jusqu' 250mg/l. Si la concentration en acide urique est suprieure cette valeur, il faut recommencer le dosage sur l'chantillon dilu au 1/2 avec une solution de NaCI 9g/l; en n'oubliant pas de tenir compte de cette dilution avant de rendre le rsultat qui sera multipli par 2.

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Dissoudre le ractif 2 dans le ractif 1 pour obtenir la solution de travail dont la stabilit est de 1 semaine 20-25C et de 3 semaines +4C.

Calcul : Acide urique (mg/1) = DO chantillon x n / DO talon n = Concentration de l'talon acide urique en mg/1. Tenir compte de la dilution dans le cas des urines (rsultat x 10). Valeurs normales Elles varient selon l'ge et le sexe. Mmol/l Enfant(*) Homme Femme (**) 20-55 35-72 26-60 g/l [119-327] [208-428] [155-357]

Urines

250-750 mg/24h

[1, 48-4, 43 mmol/24 h]

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(*) Taux plus lev chez lenfant nouveau-n. (**) Taux plus faible durant la grossesse. Il est recommand chaque laboratoire de dfinir ses propres valeurs de rfrence pour la population concerne. Variations physiopathologiques

-Srum ou plasma : Augmentation : Goutte/ hmopathies / chimiothrapie/ Insuffisance rnale. Diminution : dficit congnital en xanthine oxydase - Urines Augmentation : Goutte/ leucmies/ Mdicaments uricosuriques Diminution: Mdicaments hypo-uricmiants (allopurinol)

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THEME 6 : TECHNIQUES IMMUNOMETRIQUES DU DOSAGE DE LA MYOGLOBINE

I.

Gnralits et Intrt clinique du dosage de la myoglobine (11)

Des marqueurs biologiques permettent de faire un diagnostic dune ischmie du myocarde, dvaluer le pronostique, dvaluer lefficacit du traitement, et le risque de rcidive. Le marqueur idal devrait tre cardio-spcifique, sensible, et dont le dosage serait rapide et simple. Mais aucun marqueur regroupe toutes ces caractristiques, on va utiliser plusieurs tests. Les marqueurs utiliss de nos jours sont la myoglobine, la troponine et lisoenzyme CK-MB. Il y a apparition des marqueurs dans la circulation en fonction de leur masse molculaire, leur localisation et leur concentration cellulaire. -Avantages du dosage de la myoglobine : Les reins liminent rapidement de la circulation cette protine de 17,8 kDa, rtablissant des concentrations circulantes normales dans les 16 36 heures. Puisque la clairance de cette protine est rapide, les concentrations de myoglobine peuvent indiquer de faon fiable la rcidive d'infarctus. De plus, les dosages de myoglobine permettent d'exclure le diagnostic d'infarctus aigu du myocarde: deux dosages conscutifs bas, le premier lors de l'admission du patient et le second 1 2 heures plus tard, permettent dans presque tous les cas de conclure l'absence d'infarctus aigu du myocarde. Les dosages de myoglobine dtectent galement prcocement une reperfusion aprs traitement thrombolytique -Inconvnients: C'est un marqueur non cardio-spcifique et augmente datteintes musculaires, pricardites, troubles du rythme, et insuffisance rnale. Son dosage peut tre effectu actuellement en urgence d'une faon fiable et prcise par immunoturbidimtrie. La mthode de rfrence est une mthode radio-immunologique mais moins rapide, elle ne peut pas tre effectue en urgence. En chirurgie cardiovasculaire, il n'est pas possible d'utiliser le dosage de la myoglobine car sa valeur augmente par le simple fait de l'intervention. (7) II. Mthodes du dosage
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aussi en cas

Mthodes immunometriques du dosage de la myoglobine

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1. Immunoprcipitation L'immunoprcipitation est la formation de complexes immuns avec des antignes molculaires. En maintenant constante la concentration de l'anticorps, l'antigne est dilu par diffusion, jusqu' la formation d'un prcipite lorsque la rgion dquivalence est atteinte. (12) On l'utilise donc pour isoler et concentrer une protine prcise parmi des milliers d'autres. L'immunoprcipitation impose que l'anticorps se trouve en milieu solide certaines tapes du traitement. Elle peut tre soit directe ou bien indirecte. (2)

Fig 13 : 2. Immuno-turbidimetrie et immuno-nphlomtrie a. Immuno-turbidimetrie La turbidimtrie est la mesure du degr de turbidit d'une suspension. Elle est dtermine grce un systme optique, en gnral un spectrophotomtre classique, qui mesure la diminution, due l'absorbance, de l'intensit d'un rayon lumineux (de longueur d'onde 500nm) traversant la suspension. (2) En pratique, l'chantillon contenant l'antigne (protine de myoglobine) est mis en contact avec un excs d'anticorps spcifiques et dpos dans une cuve d'analyse. La formation de complexes immuns solubles change l'absorbance de la solution qui peut tre mesure par photomtrie/spectrophotomtrie. Lors de la dtermination du point final, la variation de l'absorption dans une priode donne correspond la concentration de l'antigne (12). La turbidimtrie est utilise en complment la nphlomtrie, qui se base plutt sur la diminution de l'intensit par diffusion de la lumire.

Mthodes immunometriques du dosage de la myoglobine

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Fig 14 : techniques de prcipitation en phase liquide (12) b. immuno-nphlomtrie : Cas particulier de la nphlmtrie (2) La nphlomtrie est une des techniques de mesure de la teneur en particules, en suspensions, ou de la turbidit d'un milieu (respectivement gazeux ou liquide). Elle fait partie de la photomtrie des milieux troubles. En effet, le principe est que les complexes immuns dispersent les rayons lumineux passant par la cuve. En dautres termes, la nphlomtrie consiste mesurer la lumire diffuse 90 d'angle par rapport la lumire incidente. Ainsi, les rayons disperss sont focaliss par un systme optique vers un photo-dtecteur, et la concentration de l'antigne est dtermine selon une courbe de calibrage. (12) L'instrument utilis pour faire les mesures est le nphlomtre. Il est gnralement constitu d'une source de lumire blanche ou de lumire infrarouge ou bien laser. Cependant, il importe de prciser la nuance qui existe entre la nphlomtrie et la nphlmtrie. La nphlmtrie a le mme principe que la nphlomtrie, sauf quelle est utilise pour mesurer les concentrations de protines sriques par immuno prcipitation : le srum dilu est mis en prsence d'un anti-srum spcifique et le complexe antigne-anticorps antiprotine prcipite sous forme de fines particules permettant une analyse nphlmtrique. (2)

Mthodes immunometriques du dosage de la myoglobine

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Cette technique consiste mesurer l'intensit d'un rayonnement laser diffus travers un chantillon pour le relier une concentration. En dautres c. Mthode du dosage via lImmuno-turbidimetrie et immuno-nphlomtrie On met en contact le prlvement avec des particules revtues dAc-antimyoglobine, do la formation du complexe immun myoglobine-anti myoglobine. Pour limmunoturbidimtrie, on mesure labsorption dun faisceau lumineux par les complexes immuns, et pour limmunonphlomtrie on mesure lintensit de la lumire diffuse par les complexes immuns. Ces techniques sont rapides, adaptes lurgence, avec un domaine de mesure tendu (de 50 600 g/l), mais il existe des interfrences notamment avec les prlvements hyperlipmies et avec les facteurs rhumatodes. Echantillon : 10 l de srum ou de plasma hparin. Conditions de conservation : 10 jours +2C/+8C ou 2 mois -20C. Interprtation du Rsultat : Au cours de lIDM: lvation entre 2 et 3h, pic entre 8 et 21h, retour la normale entre 24 et 36h Seuil dcisionnel : - si < 50 g/l la 3me heure: exclusion dIDM (98%) - si > 90 g/l : probabilit dIDM - si >130 g/l : prdit lIDM avec une bonne sensibilit

Mthodes immunometriques du dosage de la myoglobine

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CONCLUSION GENERALE

Somme toute, il nous revenait de prsenter le principe et mthode de ralisation de llectrophorse, le principe de mthode de dosage du glucose, la technique et principe de dosage de la cratinine, de lure, de lacide urique, et enfin, le principe et mthode immunomtriques dans le dosage de la myoglobine. Nous avons successivement prsent lintrt clinique, le principe, le mode opratoire, les chantillons, les ractifs, les valeurs de rfrence de ces techniques biochimiques. Il savre que ces techniques sont toutes ncessaires pour un bon diagnostic et suivi des populations atteintes des diverses pathologies. Il est donc important que nous les connaissions et les appliquions (en plus ce celles prsentes par lenseignant, Dr Assob) durant nos pratiques hospitalires, afin dtre mieux outille en ce qui concerne la Biochimie Clinique.

Conclusion Gnrale

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BIBLIOGRAPHIE

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Bibliographie

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