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FRAGILIDAD OSMOTICA DE LOS ERITROCITOS DE CARNERO EN RELACION CON SU USO EN EL LABORATORIO CLINICO Jorge Granados Ziga.

* Palabras clave: Hematologa, animales de laboratorio, carnero. RESUMEN Al notar que los eritrocitos de carnero del Bioterio del Hospital San Juan de Dios, San Jos, Costa Rica, hemolizaban espontneamente, fueron comparados, por medio de una serie de ensayos de fragilidad osmtica, con los de la Universidad Nacional de Costa Rica, que no mostraban tal caracterstica. Se encontraron diferencias significativas (P<0.05), las cuales se pueden relacionar con condiciones de higiene y nutricin en el mantenimiento de los carneros de laboratorio. (Rev. Cost. Cienc. Med. 1993; 14 (1, 2): 55-59). INTRODUCCION La membrana celular de los eritrocitos es flexible, pero prcticamente carece de elasticidad, lo que significa que la clula se rompe si le entra agua hasta exceder un volumen crtico (13). La susceptibilidad de los eritrocitos a hemlilis en solucin hipotnica guarda una

relacin inversa con su tamao (13), por lo que es interesante notar que los glbulos rojos de carnero estn entre los ms pequeos encontrados entre los mamferos (4). Por otra parte, como la resistencia de los eritrocitos a la hemlisis puede aumentar o disminuir en estados de enfer* Laboratorio Clnico, Hospital San Juan de Dios, San Jos, Costa Rica. medad (13), se debe considerar la importancia que tiene controlar las condiciones de mantenimiento de los animales de laboratorio y el manejo de los reactivos biolgicos que se producen a partir de ellos, para mantener su calidad, tomando en cuenta que cada especie animal tiene sus propias caractersticas fisiolgicas. Por ejemplo, se ha indicado que, respecto a la sangre, entre distintas especies vara el tiempo de coagulacin, la fragilidad celular, la composicin del suero, el pH y otras caractersticas (6). Al notar que los eritrocitos de carneros del Hospital San Juan de Dios de Costa Rica (HSJD) hemolizaban espontneamente (Dra. Judith Muoz,

comunicacin personal, 1989) se obtuvo eritrocitos de carnero de la Universidad Nacional de Costa Rica (UNA), que resultaron ser ms resistentes. Se decidi hacer una comparacin mediante pruebas de fragilidad osmtica y discutir las posibles causas de esa diferencia, si existiera, y su importancia para su uso en laboratorio clnico. Los objetivos del estudio fueron: 1. Comparar la fragilidad osmtica de eritrocitos de carneros criados en diferentes condiciones (UNA vs. HSJD); 2. Comparar la fragilidad osmtica de los eritrocitos de sangre recin obtenida con los de sangre almacenada por 75 horas a temperatura ambiente y con los de sangre almacenada durante el mismo tiempo pero a 4C; 3. Relacionar las caractersticas hematolgicas de los carneros de la UNA y del HSJD con las condiciones de crianza de cada poblacin. 49 OBJETIVOS Nuestro objetivo es realizar la prueba de fragilidad osmtica de los eritrocitos

frente a soluciones salinas hipotnicas. Tambin tenemos que comprender el fenmeno de la osmosis y entender lo que son los trminos que utilizaremos, como son isotnico, hipotnico e hipertnico. Detectar que soluciones producen cambios en los eritrocitos y porque, e identificar la fragilidad anormal de los glbulos rojos. INTRODUCCION Tenemos que entender que el eritrocito tiene una membrana semipermeable, sea que permite el paso libre de agua a travs, pero esta misma separa o no deja pasar a ciertos solutos inicos (Cl, K, Na). Se denomina fragilidad osmtica eretrocitaria a la medida de capacidad que una poblacin de eritrocitos tiene para resistir el efecto hipotnico, o bien para detectar la fragilidad anormal de los glbulos rojos, es por esto que ciertas soluciones producen cambios en los eritrocitos. La osmolaridad del plasma en la sangre es normalmente de 290 a 310 miliosmolas por litro, una solucin con esta osmolaridad es isotnica con respecto al plasma y recibe el nombre de solucin fisiolgica. Las soluciones que poseen un mayor nmero de osmolas por litro que el plasma son hipertnicas con respecto al plasma, en tanto que las que tienen menor nmero de osmolas son hipotnicas con respecto al mismo. Si se colocan glbulos rojos en una solucin hipertnica, se producira un flujo de agua desde el interior de la clula hacia afuera de esta misma, es decir pierde agua y se deshidrata lo cual produce la crenacin de las clulas, pues adquiere un aspecto dentado por la disminucin de su volumen. Si las clulas se colocan en una solucin hipotnica se producir un efecto contrario, es decir que entrara agua a la clula y esto es una hidratacin para el eritrocito, lo cual puede llegar a causar que las clulas se hinchen y si supera cierto lmite hasta romper su membrana por la cual se produce la salida masiva de hemoglobina. El proceso de ruptura de la pared celular es llamada hemolisis, cuando la hipotona es absoluta la hemolisis es del 100%. Cuando se depositan glbulos rojos en una solucin isotnica al plasma, estos no sufren cambios en su volumen y contenidos.

DESARROLLO MATERIAL | REACTIVOS | 6 tubos de ensayo de 10 ml. 5 tubos de ensayo de 5 ml. gradilla pipetas graduadas de ml. pipeta Pasteur torunda de algodn con alcohol ligadura jeringa y aguja estriles guantes desechables tubos para toma de muestra con anticoagulante

| Solucin de cloruro de sodio al 0.5% Solucin de cloruro de sodio al 0.4% Solucin de cloruro de sodio al 0.3% Solucin de cloruro de sodio al 0.2% agua destilada | El profesor obtuvo por puncin venosa de un compaero sangre y esta se coloco en el tubo anticoagulante. Marcamos los tubos de ensayo de 10ml. Del #1 al #6. En el tubo #1 y #6 se colocaron 5ml de agua destilada, en el tubo #2 colocamos 5 ml. De solucin de NaCl al 0.5%, en el tubo #3 vertimos 5 ml. De la misma solucin (NaCl) pero ahora al 0.4%, en el tubo #4 colocamos igual ml. De solucin de NaCl al 0.3% y en el tubo #5 agregamos 5ml de la misma solucin al 0.2%. A los tubos del #2 al #6 agregamos una gota de la muestra de sangre que mencionamos en un principio, luego que cada uno de los 6 tubos tenan ya la solucin a experimentar tapamos cada uno y los agitamos suavemente por inversin para evitar la hemolisis mecnica segn nuestro profesor. Dejamos reposar los tubos en la gradilla y al regresa a observarlos ya podamos

determinar si la solucin de cada tubo era hipotnica isotnica o hipertnica. RESULTADOS

Tubos de ensayo con su solucin respectiva despus del reposo listos para observar las reacciones de la fragilidad osmtica de los eritrocitos. Obtuvimos como resultado que la solucin del tubo #1 tena una hemolisis total, pues 100% de ella era solo agua destilada, el tubo #2 obtuvo una hemolisis isotnica pues no sufri cambios en el volumen de lo eritrocitos ni se vio algn resto de hemoglobina; el tubo #3 adquiri una hemolisis similar a la anterior, tampoco se observo hemoglobina tan claramente solo se fue decolorando proporcionalmente lo cual nos hace pensar que no hubo alteracin de eritrocitos y contenidos. El tubo #4 parece ser una solucin hipotnica con una hemolisis parcial pues ya se ve un ligero rastro de hemoglobina, el tubo #5 igual es una solucin hipotnica pero a diferencia de la #4 esta ya presenta una hemolisis total, se ve claramente la hemoglobina que se produjo a causa de la hiperhidratacion que hizo destrozar la membrana de la clula. El tubo #6 obtuvo por lo visto un control de claridad pues solo se mezclo agua destilada y una gota de la muestra de sangre. Ejemplificacin de los 6 tubos de ensayo de acuerdo al tono de color adquirido y tipo de hemolisis obtenida despus del reposo. Explicacin de la perdida de la membrana en un condicionamiento esplnico lo cual lleva a una hemolisis. DISCUSIN Los eritrocitos o glbulos rojos son los elementos formes cuantitativamente ms numerosos de la sangre. La hemoglobina es uno de sus principales componentes, y su objetivo es transportar el oxgeno hacia los diferentes tejidos del cuerpo. Los eritrocitos humanos carecen de ncleo y de mitocondrias, por lo que deben obtener su energa metablica a travs de la fermentacin lctica. La cantidad considerada normal flucta entre 4.500.000 (en la mujer) y 5.000.000 (en el hombre) por milmetro cbico. La Fragilidad osmtica de los eritrocitos se define como la susceptibilidad de los eritrocitos a la hemlisis cuando se exponen crecientemente a una solucin salina hipotnica. El agua penetra en el interior del eritrocito que se hincha, hasta que la capacidad de la membrana celular se sobrepasa y estalla. Esta prueba se utiliza en el diagnstico de anemia hemoltica

(Libro de Laboratorio de Anatoma y Fisiologa, Anne B. Donnersberger, Anne E. Lesak) Descubrimos que los eritrocitos tienen una fragilidad osmtica dependiendo de el ambiente en donde se encuentren, en nuestro caso en las soluciones con mayor y menor cantidad de sal. Al llevar a cabo la experimentacin nos damos cuenta que a mayor cantidad de sal se llega a una solucin isotnica la cual podra llegar dependiendo del NaCl a ser hipertnica por el exceso de sal. En cambio las que no tenan gran cantidad de cloruro de sodio se volvan hipotnicas, esto llego a romper dicha membrana y nos hizo ver la hemoglobina. Ahora estamos seguros de cules son las soluciones hipotnicas, hipertnicas e isotnicas y la reaccin de los glbulos rojos en cada una de ellas. CONCLUCIONES Comprendimos y adquirimos el conocimiento de lo que le pasa a los eritrocitos de la sangre cuando se depositan en ciertas soluciones. Isotnicas: no sufren cambios en su volumen y contenidos Hipertnica: sale agua del interior de la clula y se deseca el glbulo rojo. Hipotnica: el agua penetra al interior de las clulas; incluso puede entrar tanta que los glbulos rojos llegan a explotar. Tambin sabemos los fundamentos de la esferocitosis hereditaria y las complicaciones que podemos llegar a tener por exceso o insuficiencia de sal en las vas sanguneas a causa de lo que ya conocemos la fragilidad osmtica. BIBLIOGRAFIA LIBROS. -Libro de Laboratorio de Anatoma y Fisiologa ( Anne B. Donnersberger, Anne E. Lesak) WEB SIDE. -http;//www.fullquimica.com CUESTIONARIO 1. Definiciones OSMOLARIDAD: La osmolaridad es la medida usada por farmacuticos, mdicos y bilogos para expresar la concentracin total (medida enosmoles/litro en vez de en moles/litro como se hace en qumica) de sustancias en disoluciones usadas en medicina. El prefijo "osmo-" indica la posible variacin de la presin osmtica en las clulas, que se producir al introducir la disolucin en el organismo.

OSMOSIS: Es un proceso fsico-qumico que hace referencia al pasaje de un disolvente, aunque no de soluto, entre dos disoluciones que estn separadas por una membrana con caractersticas de semipermeabilidad. Estas disoluciones por otra parte, poseen diferente concentracin. SOLUCION ISOTONICA: sustancia con una concentracin de slidos igual a la concentracin interna de slidos de la clula, donde se aplique. SOLUCION HIPERTONICA: sustancia que nos indica que la concentracin extracelular es mayor que la intracelular, por lo tanto el solvente (agua) tiende a moverse al lugar donde es mayor concentracin de soluto. SOLUCION HIPOTONICA: Sustancia en la cual la concentracin de soluto( iones) es mayor dentro de la clula que afuera, por lo tanto el agua tiende a moverse de afuera hacia adentro, lo que produce un aumento de la presin intracelular que podra causar la destruccin de la membrana plasmtica. FRAGILIDAD OSMOTICA: Es la susceptibilidad de los eritrocitos a la hemlisis cuando se exponen crecientemente a una solucin salina hipotnica. El agua penetra en el interior del eritrocito que se hincha, hasta que la capacidad de la membrana celular se sobrepasa y estalla. Esta prueba se utiliza en el diagnstico de anemia hemoltica. 2. SEALE 3 PATOLOGIAS EN DONDE LA PRUEBA DE FRAGILIDAD OSMOTICA DE LOS ERITROCITOS SEA UTIL. - esferocitosis hereditaria - talasemia -anemia 3QUE CARACTERISTICA TIENEN LOS ERITROCITOS EN LA ESFEROCITOCIS HEREDITARIA QUE LOS HACE SUCEPTIBLES A LA ILISIS? R= En la enfermedad hereditaria, se produce la alteracin de la forma del eritrocito por el dficit de ciertas sustancias necesarias, formndose microesferocitos que son ms frgiles que los eritrocitos normales. Esto hace que la membrana de los eritrocitos se pierda, disminuye la deformabilidad celular, despus vienen las retenciones en el vaso, disminucin de ATP de PH y se da una hemolisis

OBJETIVO: Aprender a realizar la determinacin de la fragilidad osmtica de los eritrocitos para demostrar el fenmeno de osmosis.

FUNDAMENTO: Existen varios mtodos para medir la presin osmtica celular; la mayor parte son fsicos. Algunos de stos mtodos son utilizando tanto a la zanahoria como al celofn, por lo que es conveniente comparar los anteriores modelos utilizando clulas vivas, como en este caso sern glbulos rojos. La forma de disco bicncavo del eritrocito normal, implica un exceso de extensin superficial con relacin a su volumen, lo que le proporciona una gran capacidad de deformabilidad. Como la membrana eritrocitaria es semipermeable, cuando los eritrocitos son colocados en una solucin hipotnica, el agua entra osmticamente haciendo que aumente el volumen y adquiere la forma esfrica. Con ello, la superficie disminuye respecto a su volumen dando a la clula cierto grado de rigidez que interfiere con el paso de la misma a travs de pequeas aberturas, por lo que fcilmente se rompe. Otro fenmeno adicional es la salida de hemoglobina, que es permitida por el estiramiento de la membrana eritrocitaria. En esta prctica se harn una serie de diluciones de NaCl, de concentracin progresiva, en las que los eritrocitos problema se sometern a diferentes concentraciones y se valorar la concentracin de NaCl que produce la hemlisis en comparacin con una sangre normal. (1) GENERALIDADES: La prueba de fragilidad osmtica es una medida de resistencia del eritrocito, a la hemolisis por estrs osmtico la cual depende una medida de la resistencia del eritrocito, a la hemlisis por estrs osmtico, la cual depende principalmente del volumen de la clula, del rea de su superficie y de la funcin de su membrana (Ver Fig. 8.1). Los eritrocitos se incuban en solucin hipotnica de NaCl, los eritrocitos absorben agua en un esfuerzo para conservar o para lograr el equilibrio osmtico, y las clulas se hinchan hasta que se forma un esferocito. La captacin adicional del agua produce una membrana porosa que permite la liberacin de hemoglobina (hemlisis). Las clulas normales comienzan a hemolizar a concentraciones de NaCl cercanas a 0.50% y la hemlisis es completa a una concentracin aproximadamente de 0.30 % de NaCl. Debido a la disminucin en la proporcin de superficie a volumen, los esferocitos son incapaces de expandirse tanto como las clulas normales de forma discoide. Se necesita absorber muy poco liquido antes que las clulas se hemolicen. Los esferocitos tambin tienen un aumento en la permeabilidad de la membrana, la cual contribuye al aumento de su fragilidad. (4) Mezclar del contenido de los tubos. 5. Agregar a cada tubo 0.2 ml de sangre. Invertir cuidadosamente cada tubo con papel parafilm, para asegurar la mezcla. 6. Las gradillas que contienen los tubos se dejan reposar a temperatura ambiente

durante 30 minutos. 7. Transcurrido el tiempo indicado se mezcla cuidadosamente su contenido y se centrifugan los tubos a 2000 rpm durante 5 minutos. 8. Examinar los tubos observando macroscpicamente en que punto comienza la hemlisis y en que punto es completa. El menor indicio de color rojo en el lquido sobrenadante indica el inicio de la hemlisis de los glbulos menos resistentes; la hemlisis completa queda indicada por una solucin rojo claro y ausencia de eritrocitos residuales en el fondo del tubo o enturbiamiento al agitar el tubo ligeramente. OBSERVACIONES CON DIBUJOS: En esta practica no es necesario algn uso del microscopio , todo es de forma visul ya que cada tubo de ensayo cuenta con una concentracin diferente de NaCl en la cual se disuelven 0.2ml de sangre. De esta forma se ordenarn y analizarn.

En estas imagenes son16 muestras cada una con una concentracin de Nacl diferente, con variacines entre estas. Sin embargo no fueron los resultados esperados. Se piensa que posiblemente es a causa de la contaminacin de los reactivos.

(imagen tomada de internet d e acuerdo a la misma prctica.) CONCLUSIONES: pudimos comprender la fragilidad osmtica de los eritrocitos y demostramos que la osmosis que es de gran ayuda para poder hacer alguna determinacin en el campo de la clnica.

CUESTIONARIO: 1) Qu es la fragilidad osmtica? mtodo utilizado para determinar la probabilidad de que los globulos rojos se descompongan sometindolos a diferentes concentraciones 2) Qu es osmolaridad? medida usada por farmacuticos, mdicos y bilogos para expresar la concentracin total de sustancias en disoluciones usadas en medicina Qu importancia clnica tiene la fragilidad osmtica? se utiliza para determinar diferentes padecimientos ya que hay enfermedades en que la fragilidad osmtica es mayor y esto puede causar anemia.

FECHA DE REALIZACIN: 17/09/12 BIBLIOGRAFA: 1. Balcells, A. 1998. La ciencia y el laboratorio. Medicina. Barcelona, Espaa. 18 Edicin. Editorial Masson-Salvat. Pgs. 87-93 2. Mckenzie, S. 2000. Hepatologa clnica Editorial El Manual Moderno. Segunda edicin. Mxico D.F. Pgs. 104-112 3. Lynch, M. 1992. Mtodos de laboratorio. Mxico. Segunda edicin. Editorial interamericana. Pgs. 358-365 4. Tortora, G. 2002. Principios de anatoma y fisiologa. Mxico. Novena edicin. Editorial Oxford. Pgs. 68-70, 622-626 -----------------------

FRAGILIDAD OSMOTICA OBJETIVO: Determinar la Fragilidad Osmtica de los eritrocitos a determinadas concentraciones de NaCl. INTRODUCCINFragilidad osmtica Si una membrana separa dos soluciones que se encuentran en diferentes concentraciones de solutos,la diferencia de presin osmtica causa un flujo en sentido opuesto al de la presin.El intercambio catinico que produce la clula esta determinado por las propiedades de la membrana delhemate, que controla el flujo pasivo de iones y la competencia metablica de la clula, que determina a suvez el bombeo activo de los cationes contra los gradientes de concentracin.(2)Tanto el liquido intracelular como extracelular contienen protenas no difusibles a travs de la membranadebido a su gran tamao. En condiciones normales no hay movimiento transmembranal de agua debido aq u e l a o s m o l a r i d a d t o t a l y l a c o n c e n t r a c i n d e s o l u t o s n o d i f u s i b l e s e s i g u a l a a m b o s l a d o s d e l a s membranas, en otras palabras, los lquidos intra y extracelulares son isoosmoticos e isotnicos entre si. Estas i t u a c i n s i n e m b a r g o , s e p u e d e a l t e r a r c u a n d o d i s m i n u ye l a c o n c e n t r a c i n d e p r o t e n a s e n e l p l a s m a sanguneo como consecuente perdida de protenas en la orina. Al disminuir la concentracin de protenas,este se hace hipotnico respecto del lquido circundante, el que a su vez se hace hipertnico respecto alanterior. (2)Los trminos hipertnico, hipotnico e isotnico, se refieren a los movimientos de agua que causan las perspectivas soluciones.La fragilidad osmtica de los hemates refleja su capacidad de captar una cierta cantidad de agua antes de lalisis. Viene dada por el cociente volumen/rea de superficie. La capacidad del hemate normal para soportar la hipotonicidad se debe a su forma bicncava, que permite que la clula incremente su volumen en cerca deu n 7 0 % a n t e s d e q u e l a s u p e r f i c i e d e s u m e m b r a n a s e

d i s t i e n d a ; u n a v e z q u e s e a l c a n z a e s t e l i m i t e s e produce lisis.(1)Cuando existe una alteracin de la forma, como por ejemplo, en la esferocitosis hereditaria, este limitedisminuye y la hemolisis ocurre en presencia de soluciones salinas mas concentradas.(3)El aumento de la fragilidad osmtica de los hemates normales que se produce se debe a la hinchazn de lasc l u l a s a s o c i a d a s c o n u n a a c u m u l a c i n d e s o d i o q u e e x c e d e l a p e r d i d a d e p o t a s i o . O t r a c a u s a e s t relacionado con el incremento de la osmolaridad interna de los eritrocito por el reemplazo del polianin 2,3-DPG por Cl-, que ejerce aproximadamente 3.7 veces ms efecto osmtico.(1)El test de fragilidad osmtica que consiste en mezclar sangre del paciente con soluciones decrecientes de NaCL y medir la hemolisis que se produce para cada una de alas. Prueba se basa en la pobre capacidad delesferocito para soportar la hipotona del medio externo.La medicin de la fragilidad osmtica eritrocitaria nos da una informacin valiosa sobre la normalidad de loshemates del paciente, ya que un resultado anormal indica la presencia de una anomala.(4) 25/04/10

El aumento de la fragilidad osmtica o la reduccin de resistencia a l a h e m o l i s i s e s u n r a s g o d e l o s esferocito, por los tanto esta prueba puede indicar esferocitosis congnita, anemia hemoltica idiopticaadquirida, enfermedad hemoltica isoinmune del recin nacido, y otras anemias hemolticas, por consiguientese muestra un cuadro de enfermedades identificadas de acuerdo al aumento o disminucin de la fragilidadosmtica. (6 Comnmente estas drogas estn asociadas a hemolisis por oxidacin.A veces el frmaco acta como un hapteno y el eritrocito acta como un portador. En este caso, se producenanticuerpos fijadores de complemento que provocan la aparicin de la hemolisis intravascular. Otras veces elanticuerpo es una IgG no fijadora de complemento dirigida contra el frmaco y se produce una anemia parecida a la provocada por anticuerpos calientes, con hemolisis extravascular.U n a a l t e r a c i n i m p o r t a n t e q u e c a u s a h e m o l i s i s e r i t r o c i t a r i a e s l a d e f i c i e n c i a d e g l u c o s a - 6 - f o s f a t o deshidrogenasa (6GDP), las alteraciones de las enzimas que intervienen en el cortocircuito de la hexosa o enel metabolismo del glutatin, disminuye la capacidad de los eritrocitos para protegerse de la lesin oxidativaque los frmacos provocan y por consiguiente causan una anemia hemoltica.L a 6 G D P e s u n c o m p u e s t o c o m p r o m e t i d o e n d i v e r s o s p r o c e s o s f i s i o l g i c o s , p o r e j e m p l o d e f e n s a antioxidante. GSH son los responsables del potencial redox efectivo para proteger del estrs oxidativo tantoa los grupos sulfhidrilo de

la membrana celular, como a las enzimas y a la hemoglobina que compromete lasupervivencia del eritrocito