PRCTICA NO 1: TCNICAS DE EXTRACCIN, SEPARACIN Y PURIFICACIN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS (XANTOFILAS, CAROTENOS, SULFORAFANO). ELIZABETH RODRGUEZ-FLIX. Introduccin.

El mtodo ms extendido y utilizado para la separacin y pre concentracin de trazas de elementos es la extraccin con disolventes, debido a su practicidad. Este mtodo consiste en la distribucin de un soluto entres dos lquidos inmiscibles (fases), usualmente agua y disolvente orgnico. El carbn activo, los polmeros orgnicos (copolmeros de estireno y divinilbenceno), las espumas de poliuretano son los agentes utilizados para la extraccin en fase slida (Prez y cols, 2006). Los carotenoides son colorantes polinicos rojos y amarillos cuya molcula posee un grupo cromforo de dobles enlaces conjugados en una cadena aliftica ramificada (Primo, 2007). Se subdividen en dos grupos: carotenos y xantofilas. Generalmente en la naturaleza, las xantofilas sobrepasan a los carotenos en cantidad, no obstante, el caroteno, es tal vez, el carotenoide de ms importancia en la industria de tecnologa de alimentos (Badui, 1993). El objetivo de esta prctica consisti en adquirir las habilidades en la extraccin de compuestos orgnicos de una matriz compleja por medio de la seleccin adecuada de los disolventes a utilizar y el mtodo de extraccin. separacin (Figura 2), se lav con agua y despus con una solucin saturada de cloruro de sodio. Rpidamente, se descart la fase acuosa. Se extrajeron los extractos (metanlico y etreo). Finalmente se guardaron en refrigeracin.

Figura 1. Zanahoria seca macerada.

Metodologa. Extraccin por solventes de xantofilas y carotenos. Se reban una zanahoria y se sec en un horno a una temperatura de 75C. Despus, se macer (Figura 1), seguidamente 5 gramos, se introdujeron en una mezcla ter de petrleo:metanol:benceno (90:30:10, v/v). Se dej reposar, agitando ocasionalmente. A continuacin, se filtr al vaco la mezcla y se lav el residuo con la mezcla extractora. En seguida, se pas el filtrado a un embudo de

Figura 2. Filtrado de carotenos/xantofilas en embudo de separacin.

Luego, se corrobor la presencia de xantofilas en el extracto metanlico, se emple el resto para hacer un barrido en el espectrofotmetro de 380 a 500 nm. Despus se corrobor la presencia de carotenos en el extracto etreo, y se us el

resto del extracto para realizar un barrido en el espectrofotmetro de 380 a 500 nm. Extraccin de sulforafano y su purificacin en fase slida. Se macer el brcoli (figura 3), se dej reposar y seguidamente se le adicion dicloroetano, se dej en reposo en un tubo, agitando ocasionalmente. Luego, se filtr la mezcla (figura 4). Se recolect el extracto orgnico, y se continu con la preparacin de una columna rellena con silica gel en polvo, se activ la columna por elucin de 3 ml de dicloroetano. Seguidamente se pas el extracto a travs de la columna. Finalmente se eluy el compuesto activo con 5 ml de etanol. Se llev a cabo un barrido en un espectrofotmetro de 200-300 nm del extracto haciendo diluciones.

Resultados y discusin. En los resultados obtenidos durante la extraccin de xantofilas y carotenos, se logr separar la fase metanlica y etrea. Debido a que, los carotenoides son pigmentos liposolubles que pueden ser aislados mediante una extraccin con un solvente (benceno, ter de petrleo, etanol, cloroformo), en nuestro caso utilizamos una mezcla ter de petrleo:metanol:benceno. Los carotenos, son menos polares que las xantofilas y se disuelven mejor en ter de petrleo que en metanol. Mientras que las xantofilas se disuelven mejor en metanol o etanol (Primo, 2007). Segn Freeman (2007), los carotenos, como hidrocarburos son sustancias lipfilas, solubles en ter, aceites y disolventes no polares. A continuacin se presentan las imgenes, donde se corrobora la presencia de xantofilas y carotenos (Figura 5 y 6).

Figura 3. Brcoli fresco macerado.

Figura 5. Presencia de xantofilas en el extracto metanlico.

Figura 4. Filtracin de la mezcla en un embudo de vidrio.

Figura 6. Presencia de carotenos en el extracto etreo.

La absorbancia medida en el espectrofotmetro nos mostr un espectro de absorcin de xantofilas, cuyo valor ms alto fue en 445 nm (Figura 7). En el caso de los carotenos, el valor ms alto fue a 450 nm (Figura 8). Los carotenoides son molculas, que desempean un papel importante en la absorcin de la luz; son largos polienos cuyo espectro de absorcin est entre 400 y 500 nm. Gracias a ellos, existen los colores amarillo y rojos de frutos y flores. El tono otoal, es debido a la degradacin de las molculas de clorofila y los carotenoides se vuelven ms visibles (Freeman, 2007). El espectro de absorcin visible, utilizado para su identificacin y cuantificacin, se debe a que poseen un sistema de dobles enlaces conjugado que actan como cromforos. La mayora de los carotenoides absorben a tres longitudes de onda, entre ms dobles enlaces conjugados posea, mayor sern las longitudes de onda. El solvente utilizado, desempea un papel importante, debido a que el espectro de absorcin de los carotenoides depende grandemente del mismo (Rodrguez, 2001).

Figura 8. Grfica de absorbancia carotenos

A continuacin se muestra una grfica del espectro de absorcin de diferentes pigmentos de plantas (figura 9).

Figura 9. Grfica de absorcin de diversos pigmentos de plantas (Springer, 2010). En el caso de la extraccin del sulforafano y su purificacin en SPE (fase slida), se logr extraerlo y purificarlo adecuadamente. El sulforafano se encuentra en el brcoli, pero no como sulforafano, sino como glucocinalato, por lo que se macer primeramente para poder romper las clulas del brcoli y que stas liberaran enzimas endgenas llamadas mirosinas, las cuales hidrolizan al glucosinalato (Figura 9), por lo que se liberan compuestos biolgicamente activos dando lugar al sulforafano (Hernndez, 2010) . La principal fuente

Figura 7. Grfica de absorbancia de xantofilas.

natural del sulforafano, es su precursor glucorafanina que constituye el 81-84% de los glucosinalatos totales del mismo (Van eylen y cols, 2009).

Conclusiones. La extraccin y purificacin de compuestos bioactivos es usada para la cuantificacin e identificacin de los mismos, generando nuevas habilidades, como lo es conocer la metodologa a emplear para la obtencin de distintos compuestos orgnicos. Referencias.

Figura 10. Reaccin para la transformacin enzimtica de glucorafanina a sulforafano (Fahey, Wade, Stepshon, Chou, 2003).

Badui, D.S. (1993). Qumica de los alimentos. (3era ed.). Mxico, D.F. Edit. Editorial Alhambra Mexicana, S.A. de C.V. Fahey, J.W., Wade, K., Stepshon, K. y Chou, E. (2003). Separation and purification of glucosinolates from crude plant homogenates by highspeed counter-current cromatography. Journal of Chromatography. 996:85-93

La extraccin se llevo a cabo con dicloroetano, debido a que el sulforafano es soluble en ( diclorometano, dicloetano), y stos solventes poseen un punto de ebullicin relativamente bajo por lo que no es necesario calentarlo ni llevarlo a temperaturas altas para lograr que se evapore fcilmente; evitando la posible descomposicin del sulforafano y logrando obtener el extracto del mismo. En el caso del espectro de absorcin del sulforafano nos dio un meseta de 4 entre los rangos 200220 nm, y otro pequeo pico en el rango de 240-250 nm (Figura 10). El mximo de absorcin dentro la regin ultravioleta reportada para el sulforafano es a 236 nm en acetona (Navas, 2004).

Freeman, W.H. (2007). Biochemistry. (5ta ed.). New York, United States of America. Editorial REVERT. Hernndez, A.G. (2010). Tratado de Nutricin: Composicin y Calidad Nutritiva de los Alimentos Volumen 2 de Tratado de nutricin. (2 ed.). Madrid, Espaa. Ed. Editorial Mdica Panamericana. Navas, R.P. (2004). Recuperado el da 09 de febrero de 2013 de: http://biblioteca.usac.edu.gt/tesis/06/06_2258. pdf Ocampo, C., Ros, L., Betancur, L., & Ocampo, S. (2008). Curso prctico de qumica orgnica. Enfocado a biologa y alimentos. (1era ed.). Colombia. Edit. Editorial Universidad de Caldas.

Figura 11. Grfica de absorbancia del sulforafano.

Prez, D., Sierra, I. &Farjado, M. (2006). Preparacin de materiales adsorbentes de Hg (II) con fines analticos y aplicaciones medioambientales. (1era ed.). Madrid, Espaa. Edit. Editorial Dickinson. Primo, Y.E. (2007). Qumica orgnica bsica y aplicada: de la molcula a la industria. (1era ed.). Barcelona, Espaa. Editorial REVERT. Rodrguez, D.B. (2001). A guide to carotenoid analysis in foods. (1era ed.). Estados Unidos de Amrica. Edit. Editorial ILSI PRESS. Springer Science Business Media, LLC. (2010). Recuperado el da 13 de febrero de 2013 de: http://www.springerimages.com/Images/Phys ics/1-10.1007_978-1-4419-1684-6_5-10 Van Eylen, D., Bellostas, N., Strobel, B.W., Oey, O., Hendrickx, M., Van Loey, A., Srensen, H., Srensen, J.C. (2009). Influence of pressure/ temperature treatments on glucosinolate conversion in broccoli (Brassica oleraceae L. cv Italica) heads. Food Chem; 112(3): 646-653