Vous êtes sur la page 1sur 34

TÉCNICAS EN EL ANÁLISIS DE

MICROSATÉLITES
UTILIZADOS EN
IDENTIFICACIÓN HUMANA
PASOS EN EL PROCESAMIENTO DE UNA MUESTRA DE
Muestra obtenida de la ADN
escena del crimen o de BIOLOGÍA
una prueba de paternidad

Extraccion
Extraccion Cuantificacion
Cuantificacion Amplificación
AmplificaciónPCR
PCRde
de
de de
deADN marcadores STRs
deADN
ADN ADN marcadores STRs

TECNOLOGÍA

Separación y Detección de Determinación genotipo


productos PCR ( Alelos de STRs) muestra

Comparación GENÉTICA
Comparación del
del Entrega
Entrega de
de resultados
resultados
genotipo de la muestra
genotipo de la muestra (cálculos estadísiticos)
(cálculos estadísiticos)
con
con otros
otros resultados
resultados

Análisis
Análisis de
de los
los resultados
resultados
(comparación
(comparación con datos
con datos
poblacionales)
poblacionales)
•Describir tipo de
muestra, su color, su
forma, su marca,
etiqueta y talla si
procede, tipo de
envoltorio que lo
contenía y estado de
conservación.

•Muestras dubitadas

•Muestras indubitadas

Muestras utilizadas para extracción


de ADN
EXTRACCION DE ADN
 Extracción orgánica (fenol-
cloroformo)

 Extracción no orgánica
(agentes quelantes): agentes
quelantes: resina Chelex,
formada por copolímeros de
estirenodivinilbenceno que
contienen iones
iminodiacetato que actúan
como grupos quelantes.
CUANTIFICACION DEL ADN
 Fluorometría

 Fundamento: capacidad de
unión del ADN a ciertos tintes
fluorescentes como H33258

 Comparación de las muestras


problema con muestras de
cantidad de ADN conocida

 Se utiliza un Fluorímetro:
lámpara de mercurio y un
detector para medir
fluorescencia relativa a 460nm

 ADN de doble cadena


CUANTIFICACION DEL ADN
 Espectrofotometría
 Medida de la cantidad de luz
ultravioleta que absorben las
bases nitrogenadas

 Utiliza un espectrofotómetro,
medidas de absorbancia a 260 y
280nm

 OD260 /OD280 : pureza del ácido


nucleico

 Poco sensible: no dectecta


concentraciones de ADN
inferiores a 250ng/ml
ESPECTRO DE ABSORBANCIA ADN

http://www.cardiff.ac.uk/biosi/staffinfo/kille/Methods/Gene/Spec_Anal
ysis.html
CUANTIFICACION DEL ADN
 Minigel de agarosa
 Midiendo la fluorescencia
inducida por ultravioleta que
se produce cuando se
intercalan moléculas de
bromuro de etidio entre el
ADN

 Comparar con patrones


estandar de cantidad de ADN
conocida

 Poco sensible

 Ventajas: se puede visualizar


el grado de degradación del
ADN
CUANTIFICACION DEL ADN
 Hibridación con sondas (Dot Blot y
Slot Blot)

 Hibridación de las muestras a


cuantificar con una sonda del
locus humano alfa satélite
D17Z11.

 ADN problema se inmoviliza en


una membrana de nylon (punto:
dot-blot; guión:slot-blot), se pone
en contacto con la sonda

 Sondas marcadas

 Comparación intensidad de señal


de la muestra con estándares
CUANTIFICACION DEL ADN

•Solo cuantifica
ADN humano

•Altamente
sensible, detecta
cantidades del
orden de 20pg

•Cuantifica ADN de
cadena sencilla y
muestras de ADN
no purificadas

 Hibridación con sondas (Dot Blot y Slot Blot)


CUANTIFICACION DEL ADN

QuantiBlot
CUANTIFICACION DEL ADN

Cuantificación enzimática
 Uso de una serie de enzimas para producir una cantidad de ATP que depende
de la cantidad de AD N presente en la muestra seguida de la generación de
una señal luminosa, dependiente de la concentración de ATP
AMPLIFICACION DEL ADN
TÉCNICA DE PCR

5’ 3’
5’ 3’
ADN MOLDE

3’ 5’
3’ 5’

Cadenas
separadas
(denaturación)

Forward primer

5’ 3’ 5’ 3’

Copias (extensión
Adición
de de )
primers
primers 3’ 5’
3’ 5’
(alineamiento) Reverse primer
MULTIPLES COPIAS DE ADN POR PCR

Original DNA target region

Thermal cycle

En
En32
32ciclos
cicloscon
conun
un100%
100%de deeficiencia
eficienciase
sepueden
puedenproducir
producirhasta
hasta
1.07 billones de copias de ADN molde
1.07 billones de copias de ADN molde
MULTIPLEX PCR

 Se pueden analizar hasta


10 loci simultáneamente

 Alta sensibilidad menos de


1 ng de ADN

 Util en análisis de
muestras degradadas y de
mezclas

 Ventajas: disminuye
costos, tiempo,
contaminación del ADN
SEPARACION de PRODUCTOS PCR

 PCR Multiple: diferentes marcadores fluorocromos


pueden ser usados para el análisis de loci donde se
sobrelapan el tamaño de los alelos

 Separación de productos PCR:

 TIPIFICACION MANUAL: Tinción de nitrato de plata


 DETECCION FLUORESCENTE SEMIAUTOMATICA

 Electroforesis capilar
 Electroforesis en geles de poliacrilamida
EJEMPLO DE UN KIT DE MULTIPLEX
AmpFlSTR® Profiler Plus™

100 pb 200 pb 300 pb 400 pb

Separación por tamaño


Separación por color

D3 vWA FGA 5-FAM (blue)

A D8 D21 D18 JOE (green)

D5 D13 D7 NED (yellow)

ROX
(red)
Estandar interno GS500
9 STRs amplificados junto con Amelogenina en una sola reacción de PCR
ELECTROFORESIS

Electroforesis convencional
 Geles de agarosa
 Geles de poliacrilamida

Fundamento
 El ADN está cargado negativamente
y al someterlo a una diferencia de
potencial se moverá hacia el ánodo
a través del gel una distancia
proporcional a su tamaño,
alcanzando mayor distancia las
moléculas de menor peso.
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
ESCALERAS ALELICAS
ELECTROFORESIS CAPILAR
Cuando los fragmentos de ADN alcanzan la ventana capilar,
el láser excita los colorantes fluorescentes. La fluorescencia
emitida por los colorantes es colectada por el detector a
longitudes de onda particulares y registrados como señales
digitales en el computador.
TIPIFICACION DE STRs
TECNICAS DE HIBRIDACION
SECUENCIACION

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Automat1.jpg
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/F/FluorDideoxySeq.gif
El instrumento de secuenciación automática genera un
cromatograma mostrando la emisión de los fluorocromos
cuando ellos pasan por el detector en el instrumento. El orden
de estos colores corresponde a el orden de las bases en el
ADN. Así una secuencia de ADN puede ser leída directamente
desde el cromatograma.
BIOCHIPS

Vous aimerez peut-être aussi