AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS AEROBIAS

OBJETIVO Adquirir conocimientos bsicos tericos y prcticos de la siembra y aislamiento de bacterias.

INTRODUCCION Un medio de cultivo intenta el crecimiento y reproduccin in vitro de las bacterias, para observar sus propiedades y conseguir un mejor estudio bioqumico e inmunolgico, al contar con material en cantidad suficiente. Por ello constare de lagunas propiedades (pH adecuado, sales, nutrientes, condicione de Aero anaerobiosis, etc. que sern las ms idneas para la bacteria que deseamos estudiar y se citan en cada una de ellas en particular, en la bacteriologa sistemtica. Los medios de cultivo se dividen por su finalidad en: medios de enriquecimiento que tratan de aumentar el nmero de bacteria existentes, si consideramos que se encuentran en cantidad muy exigua, a la vez que inhiben la flora de asociacin acompaante y de aislamiento que tienen por fin conseguir una colonia o clon, es decir, grupo de bacterias procedentes de una sola, con todas sus propiedades; los dos primeros son principalmente lquidos y los segundos, slidos. Los medios selectivos son aquellos que poseen algn componente que permite o no el crecimiento de una especie bacteriana, carcter de importancias para su identificacin, y los diferenciales, aquellos que las diversas especies que hay que testar alteran de forma distinta, por lo que suelen llevar indicadores (sustancias que varan su coloracin segn el pH del medio) u otros ndices de reacciones qumicas definidas. SIEMBRA Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicacin, si se incuba en condiciones adecuadas, un tiempo conveniente. Para ello una pequea porcin de cultivo o muestra, que se denomina inculo se transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introduccin de otros microorganismos ajenos al inoculo. La finalidad de una siembra puede ser la de realizar la transferencia o un aislamiento. La transferencia, se efecta con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioqumicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros.

Tcnica asptica, es el conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta. La toma del inoculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente: La siembra siempre debe realizarse alejado de las corrientes de aire (cerrar bien puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin hablar. Coloque frente a usted el mechero y la preparacin o muestra que contiene los microorganismos, as como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos. Se debe trabajar a una distancia no mayo de 15 cm. de la llama de un mechero. El ansa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flamelo hasta que alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inoculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar (enfrelo en la proximidad de la llama unos 10 segundos). Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el ansa o aguja a la llama del mechero antes de depositarla sobre la mesa de trabajo. Nunca debe depositarse un tapn sobre la mesada o gradilla, pues estos elementos estn cargados de microorganismos. Cuando este destapado, mantener el tubo en la forma ms horizontal posible para evitar que los microorganismos del ambiente, en su cada, tenga acceso al interior. Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde sern transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que el ansa o aguja sea introducida. Tambin se debe flamear la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo as el riesgo de contaminacin. Para retirar el inoculo o sembrar medios de cultivos en cajas de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesa de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llvela a la proximidad de la llama del mechero y tome el inoculo con el ansa de siembra. Otro mtodo permitido consiste en retirar el inoculo o sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introduccin del ansa o aguja, para evitar que los microorganismos ambientales se depositen en la superficie del medio. Si la siembra se realiza con pipeta, esta debe estar convenientemente preparada y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta introducindola en una solucin antisptica.

TOMA DE INOCULO Si la muestra proviene de un medio lquido, el inoculo se toma agitando suavemente el ansa (asa de kolle) dentro del mismo quedando la muestra adherida por tensin superficial en el extremo del filamento del ansa de siembra. Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (caja de Petri), tome una pequea porcin de cultivo mediante ligero roce con el ansa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea porcin de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo en el soporte necesario. TRANSFERENCIA La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los contiene. Se puede presentar los siguientes casos: a) Siembra de medio lquido a medio lquido: el procedimiento se puede realizar con ansa en anillo, aguja o pipeta y tubos de ensayo, matraces o frascos. b) Siembra de medio solido a medio lquido: el procedimiento se puede realizar con ansa o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos. c) Siembra de medio solido a medio solido: el procedimiento se pude realizar con ansa o aguja en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en caja de Petri en superficie. d) Siembra de medio lquido a medio solido: el procedimiento se pude realizar con ansa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en caja de Petri, ya sea en superficie o por homogenizacin.

Tcnicas de transferencia en tubos de ensayo a) Tcnica para medio liquido Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la misma altura. Se sostienen con los dedos ndice, medio y anular apoyndolos en el dedo meique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualizacin de toda la superficie del cultivo. Con los dedos pulgares e ndice (como un lpiz) de la otra mano, se toma la pipeta estril o el asa de koll con su aguja o ansa en anillo y se esteriliza. Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el ansa, de la siguiente manera: el tapn del tubo ms alejado del operador (que es el que contiene la muestra) entre el dedo meique y la palma de la mano; el tapn del tubo ms cercano al operador (que contiene el medio de cultivo estril) entre el meique y el anular.

Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inoculo; se siembra; se flamean nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las procedencias de los tapones y se quema el ansa. Como el inoculo procede de un medio liquido antes de realizar la transferencia se debe agitar el tubo para poner en suspensin a los microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza en medio lquido, se agita el tubo sembrado para distribuir homogneamente el inoculo. Para realizar la agitacin se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos ndice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo ndice de la otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos. b) Tcnicas para medio solido b.1. En superficie: a) por estra: introducir el ansa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inoculo en el agua de condensacin que se acumula en esa parte, luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. b) por trazo: introducir el ansa en el anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar una lnea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin ejercer presin para que no se rompa el medio. b.2. En profundidad: Por puncin: el medio de cultivo que se emplea esta solidificado en tubo en forma vertical la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inoculo rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio o excntricamente. b.3. En profundidad y superficie: Por puncin y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta.

Tcnica de transferencia en caja de Petri La siembra en caja de Petri, puede hacerse: a) En superficie a.1. por estra central: se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduccin del ansa con la carga de microorganismos, inicindose la estra al borde del medio ms alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira esta 180 y se continua realizando otra estra de la misma manera. Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa.

a.2.por estra en cuadrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y se siembra en estra cada uno de ellos, partiendo del borde de la caja hacia el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el ms alejado del operador y el inoculo en cada caso puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante.

a.3. Por diseminacin con esptula de drigalsky: Se deposita sobre el medio solido contenido en la placa, una ansada o una gota con pipeta del material a sembrar, que luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de DRIGALSKY. La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un recipiente para su esterilizacin en autoclave o en formaldehido al 5 %.

a.4.Por diseminacin con hisopo: se sumerge en el caldo de cultivo, se escurre el exceso de lquido sobre la pared interior del tubo y se estran ambas mitades de la placa de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego se gira 90 y se estran nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45 y se estran ambas mitades.

b) Por homogeneizacin: b.1. tcnica de la siembra en tubo para volcar en placa: el inoculo se introduce con el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 C en cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeneiza por rotacin y se vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo. b.2. Tcnica del agar volcado: se deposita el inoculo con pipeta en el centro de la caja de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 C. Se homogeneiza por rotacin para la cual se imprime a la caja movimientos circulares, en sentido horario y en sentido anti horario y movimientos rectilneos, horizontales y verticales. Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con medio de cultivo para sembrar debe eliminarse el agua de sinresis (condensacin) antes de efectuar dicha operacin. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipacin y dejarlas invertidas a la temperatura ambiente.

AISLAMIENTO El objeto es obtener cultivos en estado puro, operacin imprescindible y previa al estudio e identificacin de una especie bacteriana. Se pueden realizar aislamientos por mtodos generales y por mtodos especiales. METODOS GENERALES DE AISLAMIENTO Estos mtodos utilizan medios de cultivos slidos en caja de Petri. a) Por diluciones sucesivas: Se homogeniza la muestra y se carga el ansa por nica vez. Luego se pasa el ansa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45C. De esta manera el primer tubo contendr mayor concentracin de microorganismos que el ltimo. Luego se pasa el contenido de los tubos a las cajas de Petri y de all a los tubos con agar en pico de flauta. b) Por agotamiento en superficie en una sola caja: Es el mtodo ms utilizado. Se prepara una caja de Petri con el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedad segn se indic anteriormente. Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. Se carga el ansa con la muestra, se deposita en un punto de la superficie del sector (l) cercano al borde, y se extiende en el mismo con estras prximas y paralelas. A continuacin se quema el ansa y se deja enfriar. Se gira la caja 90, se pasa el ansa una vez sobre la ltima estra de la regin ya inoculada y se arrastra al sector (ll) efectuando sobre l la siembra sin superponer las estras con las realizadas antes.

Se quema nuevamente el ansa y de la misma manera se estra el sector (lll). Luego de quemar el ansa, en el sector (lV) se realizan estras con el material que se arrastra de (lll), ms amplias y que terminan en el centro de la caja. Cualquiera sea el mtodo empleado, si se realiza correctamente, podrn obtenerse colonias aisladas. Estas pueden pertenecer a distintas especies bacterianas, las que generalmente se diferencian macroscpicamente. En general cada colonia se considera formada a partir de una clula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto y pues puede darse el caso de que dos o ms clulas den origen a una colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia resultante ser pura. Caso contrario, la finalidad del trabajo no se habr cumplido, no logrndose el aislamiento. Para comprobar la pureza de la colonia aislada se puede realizar una coloracin de Gram. Para ello se pica la colonia y se la identifica con una marca en el fondo el resto de la colonia en un tubo con agar en estra para obtener un cultivo puro.

A veces la igualdad morfolgica en la coloracin de Gram resulta engaosa por existir bacterias de diferentes especies ( pero iguales morfolgicamente) presentes dentro de la colonia seleccionada pero en muy bajo nmero debido a su imposibilidad de desarrollar. Por consiguiente es necesario realizar siempre aislamiento para observar la uniformidad de las colonias. METODOS ESPECIALES DE AISLAMIENTO. a) Mtodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde una especie puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen ( ya sea por cambios de PH o por precipitacin de elementos del medio). Un ejemplo, es el aislamiento en el llamado agar lactosa- verde- brillante- bilis, donde las bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en el centro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio. b) Mtodos biofsicos: Se basan en el empleo de condiciones fsicas determinadas que afectan a ciertos microorganismos y no a otros. A) Empleo de temperaturas disgensicas: La mayora de las bacterias desarrollan bien a 37|C. Sin embargo hay especies que lo hacen hasta 40C42C y an ms, otras por debajo de 35C. estas caractersticas se pueden usar para la separacin de especies. B) Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias son formas de resistencia que toleran temperaturas que resultan letales para las formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha para la separacin de las especies que tienen la capacidad de esporular. C) Movilidad del microorganismo: Las bacterias mviles desarrollan en gran parte de la superficie del medio, mientras que las inmviles lo hacen solo en el punto de siembra. D) Mtodos biolgicos: Estos mtodos utilizan la propiedad que tienen ciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos. NOTA: Cuando se realizan aislamientos de bacterias anaerobias, se pueden aplicar las mismas tcnicas, teniendo la precaucin de regenerar previamente el medio de cultivo e incubar en anaerobiosis.

AGAR MAC CONKEY El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la deteccin de organismos coliformes y patgenos entricos. Actualmente existen una gran cantidad de medios diseados para el aislamiento, cultivo e identificacin de bacterias entricas. El artculo base sobre el agar MacConkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue publicado en 1905 y contena una descripcin detallada de su composicin y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos. Su composicin se ha modificado en num erosas ocasiones Se parti de la idea de que las sales Biliares precipitan cidos y que ciertos microorganismos entricos fermentan la Lactosa mientras que otros no lo hacen. La frmula del agar MacConkey II es de 1983 y se dise especialmente para mejorar su capacidad de inhibir el "swarming" de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciacin entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otros medios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos. La diferenciacin de organismos entricos se lleva a cabo con la combinacin de Lactosa con el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz de fermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contrario. LECTURA: colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentacin de la Lactosa). Salmonella, Shigella, Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa)

AGAR TSA (TRYPTICASE SOJA AGAR) El AS al 5% con base de Tripticasa-Soja es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de eleccin para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica (digeridos trpticos, digeridos proteicos de soja) con una pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre. La aportacin de casena y peptonas de soja al agar de Tripticasa-soja hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrgeno orgnico, particularmente aminocidos y pptidos de cadena ms larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran varedad de grmenes aerobios y anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero Candida. Tambin permite el crecimiento de algunos grmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella. El cloruro sdico proporciona electrolitos esenciales. La adicin de sangre de carnero desfibrinada enriquece la base y lo hace un medio adecuado para realizar la prueba del factor CAMP. Permite as mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actan sobre los glbulos rojos, ya sea por lisis completa (hemlisis beta, produce un halo transparente alrededor de la colonia hemoltica), parcial (hemlisis alfa, coloracin verdosa alrededor de la colonia) o por ausencia de alteracin (hemlisis gamma). La produccin de hemolisinas por las bacterias depende de muchos factores ambientales como pH o atmsfera de incubacin. Las muestras que puedan contener Brucella o Neisseria deben incubarse en atmsfera enriquecida en CO2. Si se aade al medio el 0,5% de telurito potsico es muy til para el cultivo y aislamiento selectivo de Corynebacterium diphteriae, Candida albicans, Listeria y estreptococos.