PRAKTIKUM VI PEMERIKSAAN DIREK COOMBS TEST

Hari,tanggal praktikum Tempat

: Senin, 20 Mei 2013 : Unit Transfusi Darah RSUP Sanglah

I.

TUJUAN Menetapkan ada atau tidak adanya antibodi yang coated atau menempel pada sel darah merah pasien

II.

METODE Metode yang digunakan pada praktikum ini adalah Aglutinasi langsung (Direct agutimation)

III. PRINSIP Anti Human Globulin (AHG) yang diperoleh dari immunized non human species berikatan dengan IgG atau komplemen yang bebas pada serum atau yang melekat pada antigen sel darah merah. Antigen yang sudah coated dengan antibody in vivo + anti human globulin membentuk aglutinasi. IV. DASAR TEORI 4.1 Darah Darah adalah jaringan cair yang terdiri atas dua bagian yaitu plasma darah dan sel darah. Sel darah terdiri dari tiga jenis yaitu eritrosit, leukosit dan trombosit. Volume darah secara keseluruhan adalah satu per dua belas berat badan atau kira-kira lima liter. Sekitar 55% adalah plasma darah, sedang 45% sisanya terdiri dari sel darah Darah kita mengandung beberapa

jenis sel yang terangkut di dalam cairan kuning yang disebut plasma darah. Plasma darah tersusun atas 90% air yang mengandung sari makanan, protein, hormon, dan endapan kotoran selain sel-sel darah. ( Evelyn C. Pearce, 2006) Ada tiga jenis sel darah, yaitu sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit). 4.2 Sel Darah Merah Sel darah merah berbentuk piringan pipih yang menyerupai donat. 45% darah tersusun atas sel darah merah yang dihasilkan di sumsum tulang. Dalam setiap 1 cm kubik darah terdapat 5,5 juta sel. Jumlah sel darah merah yang diproduksi setiap hari mencapai 200.000 biliun, rata-rata umurnya hanya 120 hari. Semakin tua semakin rapuh, kehilangan bentuk, dan ukurannya menyusut menjadi sepertiga ukuran mula-mula. Sel darah merah mengandung hemoglobin yang kaya akan zat besi. Warnanya yang merah cerah disebabkan oleh oksigen yang diserap dari paru-paru. Pada saat darah mengalir ke seluruh tubuh, hemoglobin melepaskan oksigen ke sel dan mengikat karbon dioksida. Sel darah merah yang tua akhirnya akan pecah menjadi partikel-partikel kecil di dalam hati dan limpa. Sebagian besar sel yang tua dihancurkan oleh limpa dan yang lolos dihancurkan oleh hati. Hati menyimpan kandungan zat besi dari hemoglobin yang kemudian diangkut oleh darah ke sumsum tulang untuk membentuk sel darah merah yang baru. Persediaan sel darah merah di dalam tubuh diperbarui setiap empat bulan sekali. 4.3 Antiglobulin Test Pada tahun 1945 Mourant, Coombs dan Race menemukan pemeriksaan untuk mendeteksi antibodi yang tidak beraglutinasi menyelimuti sel daah merah dalam serum. Pemeriksaan yang sama dilakukan juga untuk mendeteksi atau memperlihatkan penyelubungan (coating) sel darah merah invivo dengan antibodi dan komplemen dengan melakukan pemeriksaan antiglobulin test. atau antibodi yang

Antiglobulin test ada dua bentuk, yaitu : - Direk antiglobulin Test (DAT) atau disebut juga Direct Coombs Test (DCT) - Indirect Antiglobulin Test (IAT) atau disebut Indirect Coombs Test (ICT) - Direct Antiglobulin Test Direk Antiglobulin Test (DAT) untuk mendeteksi antibodi atau komplemen yang menyelubungi sel darah merah Invivo dengan menggunakan AHG, terutama IgG dan V3d. Setelah sel darah merah dicuci dengan saline (NaCl 0,9 %) kemudian ditambahkan reagen AHG. Pemeriksaan ini berguna untuk mendeteksi penyakit autoimun Hemolitik Anemia (AIHA), reaksi imun oleh karena reaksi transfusi. - Indirect Antiglobulin Test Untuk mendeteksi reaksi antara sel darah merah dengan antibodi atau komplemen yang melekat/menyelubungi pada sel darah merah invitro. Serum pasien diinkubasikan pada sel darah merah lalu sel darah merah dicuci dengan saline dan ditambahkan AHG. Aglutinasi setelah penambahan AHG memiliki makna bahwa serum mengandung antibodi yang reaktif dengan antigen pada sel darah merah. Pemeriksaan ICT dapat digunakan pada pemeriksaan skrining identifikasi antibodi dan uji silang serasi. Molekul antibodi dan komponen komplemen adalah globulin. Antibodi adalah globulin , komplemen adalah globulin . Bila globulin manusia diinjeksikan ke hewan akan terbentuk antihuman globulin (AHG). AHG akan bereaksi dg globulin yg terikat pada eritrosit sehingga menghasilkan aglutinasi eritrosit. Bila AHG bereaksi dg globulin bebas dalam serum maka

tidak terjadi aglutinasi eritrosit. Perlu proses pencucian eritrosit untuk menghilangkan globulin bebas. Reagen AHG dapat polispesifik atau monospesifik. Polispesifik AHG mengandung antibodi terhadap human IgG atau C3d, kadang-kadang juga mengandung anti komplemen lain dan anti imunoglobulin lain. Monospesifik AHG mengandung hanya satu antibodi apakah IgG saja atau anti C3b-C3d. Antiglobulin test mampu mendeteksi 150 sampai 500 molekul IgG tiap sel darah merah. Aglutinasi lengkap terjadi bila sel tersensitisasi oleh 1000 molekul IgG. Pada IAT, hasil reaksi positif bila terdapat 100 sampai 200 molekul IgG atau C3 pada sel. Bila pengikatan globulin pada eritrosit (sensitisasi) terjadi in vivo disebut uji antiglobulin direk (Direct Coombs test). Bila sensitisasi dilakukan in-vitro disebut uji antiglobulin indirek (Indirect Coombs test). DAT digunakan untuk mendeteksi antibodi atau komplemen yang menyelubungi sel darah merah invivo dengan menggunakan AHG, terutama IgG dan C3d. Setelah sel darah merah dicuci dengan saline kemudian ditambahkan reagen AHG. Pemeriksaan ini berguna untuk mendeteksi , misalnya penyakit auto immune hemolytic anemia (AIHA), drug induced hemolisis, allo imun reaksi oleh karena reaksi tranfusi. Indirect Antiglobulin test (IAT) atau ICT digunakan untuk mendeteksi reaksi antara sel darah merah dengan antibodi atau komplemen yang melekat / menyelubungi pada sel darah merah invitro. Serum pasien diinkubasikan dengan sel darah merah, kemudian sel darah merah dicuci dengan saline dan ditambah AHG. Adanya aglutinasi setelah penambahan AHG menandakan, bahwa serum tersebut mengandung antibodi yang reaktif dengan antigen antigen yang terdapat pada sel darah merah. Pemeriksaan ICT dapat digunakan pada pemeriksaan skrining, identifikasi antibody dan uji silang serasi. Direct Antoglobulin Test (DAT) merupakan suatu test yang digunakan untuk mencari adanya globulin manusia pada permukaan sel-sel yang telah

disensitasi.Sel yang tersensitasi merupakan sel yang diselubungi oleh antibodi tetapi bukan teraglutinasi.Antibodi IgG tidak mengakibatkan aglutinasi sel-sel darah merah yang mempunyai antigen pasangannya bila berada dalam larutan fisiologis NaCl . akan tetapi hanya mampu menyelubungi atau mensensitasi . Masa hidup immunoglobulin IgG sekitar 60-70 hari. DAT(Direct Antiglobulin Test) digunakan untuk mendeteksi antibodi atau komplemen yang menyelubungi pada sel darah merah invivo dengan menggunakan AHG terutama IgG dan C3d . Setelah sel darah merah dicuci dengan saline kemudian ditambahkan dengan reagen AHG . Anti Human Globulin (Bovine Albumin22%) digunakan sebagai reagen untuk mereaksikan kelompok darah yang secara spesifik bereaksi dengan globulin manusia.Bila AHG bereaksi dengan globulin bebas dalam serum maka tidak menimbulkan aglutinasi eritrosit .Perlu proses pencucian eritrosit untuk menghilangkan globulin bebas. Antiglobulin test mampu mendeteksi 150 sampai 500 molekul IgG tiap sel darah merah .Aglutinasi lengkap terjadi bila sel tersensitisasi oleh 1000 molekul IgG. Pada DAT deteksi globulin sampai terikat, komponen darah yang diuji adalah eritrosit, sensitisasi terjadi didalam in-vivo, inkubasi dengan suspensi eritrosit menghasilkan nilai negatif, hasil positif ditunjukkan dengan aglutinasi . Pemeriksaan ini berguna untuk mendeteksi misalnya penyakit Auto Immune Hemolytic Anemia (AIHA),drug induced hemolysis, allo imun reaksi oleh karena reaksi tranfusi.Jenis reagen yang digunakan dalam pemeriksaan ini adalah polyspesifik AHG yang mengandung antibodi terhadap IgG manusia dan anti komplemen C3d dari komplemen manusia .Selain mengandung anti-IgG dan anti-C4d.Anti bodi yang mempunyai arti klinis yang terpenting adalah dari AHG yang mendeteksi adanya IgG. Reagen ini disiapkan dan distandarisasi untuk mendeteksi berbagai macam IgG antibodi. Aktivitas Anti-C3d sangat penting artinya untuk pemeriksaan DCT pada pemeriksaan AIHA karena kemungkinan C3d merupakan

globulin satu-satunya yang dapat dideteksi pada sel darah merah penderita AIHA.(Anonim,2011) V. ALAT DAN BAHAN A. Alat 1. 2. 3. 4. 5. 6. Centrifuge Rak tabung Tabung reaksi uk. 12 x 75 mm Pipet pasteur 1ml Labu semprot Gelas pembilas

B. Bahan 1. Suspensi cell 5 %

C. Reagensia 1. 2. VI. Anti human globulin/coombs serum Coombs control cells

CARA KERJA A. Persiapan reagensia 1. 2. Reagen dibiarkan pada suhu kamar Tanggal kadaluarsa dan bantch no (lot. No) dicatat

B. Pemeriksaan Direk Coombs tes 1. Alat dan bahan disiapkan

2. 3.

Tabung reaksi diberi identitas tabung I dan tabung II Masing-masing tabung ditambahkan 1 tetes suspensi sel 5 % darah pasien

4.

Dicuci 3 kali lalu dicentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 1 menit

5. 6. 7. 8. 9.

Supernatannya dibuang Kedalam tabung I ditambahkan 2 tetes coombs serum Ke dalam tabung II ditambahkan 2 tetes saline Diputar pada kecepatan 3000 rpm selama 15 detik Hasilnya dibaca terhadap adanya aglutinasi

C. Uji validitas Bila hasil drect coombs test negatif, dilakukan uji validitas 1. Tabung yang memberi hasil negatif, ditambahkan 2 tetes coombs control cell 2. 3. Dicentrifuge pada kecepatan 3000 rpm selama 15 detik Bila terjadi aglutinasi hasil yang diperoleh berarti valid.

VII. HASIL PENGAMATAN No 1 Gambar Keterangan Bahan yang digunakan dalam uji Coomb tes Urutan bahan 1 : Coombs Serum 2 : Suspensi sel 5% pasien 3 : Coombs Control Cell (CCC) 4 : Saline dalam tabung reaksi

Hasil aglutinasi pada tabung I dan II. Tabung I - Berisi suspensi sel 5% pasien + Coombs serum - Tidak tampak adanya aglutinasi pada tabung - Maka dilanjutkan dengan penambahan CCC Tabung II - Berisi suspensi sel 5% pasien + saline - Tidak tampak adanya aglutinasi pada tabung
Tabung I Tidak ada aglutinasi Tabung II Tidak ada aglutinasi

VIII. PEMBAHASAN Transfusi darah merupakan tindakan medis yang beresiko, karena itu pengelolaannya harus profesional dan sesuai standar. Melakukan transfusi bukannya tanpa resiko. Pasien dapat tertular penyakit infeksi yang mungkin terdapat pada darah donor, karena itu darah yang akan digunakan untuk transfusi haruslah aman. Darah aman apabila disumbangkan oleh donor yang sehat melalui seleksi donor yang seksama, Bebas dari agent yang dapat membahayakan pasien, Ditransfusikan hanya jika dibutuhkan dan ditujukan untuk kesehatan dan kebaikan pasien. Keamanan darah adalah dari vena ke vena Antihuman globulin test suatu tes in vitro untuk menetapkan ada atau tidaknya eritrosit yang coated oleh antibodi. Coombs serum atau antihuman globulin serum, sesuai dengan namanya akan bereaksi dengan globulin manusia (human globulin). antihuman globulin (AHG) yang diperoleh dari immunized nonhuman species berikatan dengan IgG atau komplemen yang bebas pada serum atau yang melekat pada antigen sel darah merah. Direct Coombs Test bertujuan untuk mendeteksi sel darah merah yang tersensitisasi dengan antibodi / komplemen in vivo (dalam tubuh pasien ). Kegunaan : pada kasus AIHA ( Auto Immune Hemolytic Anemia), Drug induced hemolysis, HDN ( Hemolytic Disease of the Newborn), Alloimmunisasi akibat transfusi / hemolytic transfusion reaction (HTR). Prinsipnya yaitu antigen yang sudah coated dengan antibodi in vivo ditambahkan dengan anti human globulin akan menghasilkan aglutinasi. Metoda yang digunakan adalah metode aglutinasi langsung. Sampel yang digunakan sampel darah dengan

antikoagulan lebih disukai karena mudah mendapatkan sel bebas, mencegah sensitisasi invitro oleh komplemen. Reagensia yang digunakan yaitu Antihuman globulin (coombs serum), anti-IgG, antiC3d, saline, dan CCC. Pada praktikum kali ini menggunakan sel darah merah pasien, didapatkan hasil negatif ditandai dengan tidak adanya aglutinasi, ini menunjukkan tidak ada antibodi yang menempel pada sel darah merah. Pencucian dengan salin volume 20 kali, min 3 kali untuk membersihkan sisa antibodi yang dapat menetralisasi serum antihuman globulin sehingga dapat menimbulkan reaksi negatif palsu. Karena hasil direct coomb test menghasilkan hasil negatif, maka perlu dilakukan uji validasi dengan menggunakan CCC. Coombs Control Cell merupakan eritrosit normal (O Rh +) yang sengaja dibuat coated dengan incomplete antibodi. Dibuat sedemikian rupa coatednya dan memberikan hasil 1+ sampai 2+ bila CCC direaksikan dengan Coombs serum yang dipakai sehingga pada uji validasi dengan CCC harus didapatkan hasil positif aglutinasi jika didapatkan hasil negatif berarti coomb serum tidak valid dan serta tes dianggap invalid. Pada praktikum ini, uji validasi menggunakan CCC didapatkan hasil positif aglutinasi sehingga test yang dilakukan valid. VII. KESIMPULAN Dari Praktikum Direct Coombs Test pada sampel sel darah merah Mr. X diperoleh hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya aglutinasi.