MAKALAH ISOLASI STANDARISASI BAHAN ALAM HIGH PERFERPOMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY ( HPTLC )

Nama Kelompok : Angga Pratama PS M#la$% P#tra M ( 1 !1 111"!) ( 1 !1 11 "&)

Non% Set%an% No'%a Pange(t%

( 1 !1 111 &) ( 1 !1 111 !)

S)KOLAH TIN**I ILM+ ,ARMASI -.A.ASAN ,ARMASI/ S)MARAN*

A0 P)N*)RTIAN High perferpomance thin layer chromatography (HPTLC) adalah suatu metode kromatografi yang merupakan pegembangan dari TLC, hal yang dikembangkan adalah fase diam atau stationary phase dari dari instrumen, yang diharapkan menghasilkan daya pisah yang lebih baik dari TLC baik dilihat dari hasil, efisiensi waktu dan biaya. HPTLC dari sisi peralatan tidak terlalu jauh berbeda dengan TLC hanya biasanya pada fase diam ukuran pori dari fase penyerap lebih ke il sehingga diharapkan terjadi pemisahan yang lebih baik karena terjadi interaksi antara analit dengan absorbent pada permukaan yang lebih luas, kemudian ukuran dari lempeng lebih ke il karena menggunakan suatu absorbent dengan pori yang lebih ke il hal ini akan berpengaruh terhadap waktu pengembangan yang memungkinkan lebih pendek atau singkat. !ari profil hasil kromatogram yang diperoleh dari HPTLC lebih baik dari TLC karena pada HPTLC, H"TP atau efisiensi dari teori keping lebih baik dari pada TLC hal ini disebabkan permukaan dari absorbent ukuran porinya lebih ke il dari absorben# dari TLC sehingga permukaan interaksi analit dengan stationary fase lebih luas. HPTLC mempunyai beberapa kelebihan di banding dengan TLC dalam hal$

Tebal, keseragaman manghasilkan garis dasar stabil dalam densitometry %arak pengembangan dan waktu lebih singkat Pita difusi rendah manghasilkan keterpaduan pita sampel Mikrosample (nanograms dan pi ogram) dapat dianalisis &ifat reproduksibilitas dalam hasil kromatografi.

(!ay. '.(, et,. al. )**+)

B0 KOMPON)N ALAT &e ara umum alat HPTLC dapat dikelompokan menjadi bebrrapoa bagian yang penting antara lain$ ). fase diam (stationary phase) ,. ruang pengembang ( hamber) -. penyemprot penampak .oda (sprayer) /. drops penetes sampel (mi ro pipet) 0. s aner (panampak spot) 1. detektor (keperluan kuantitatif)

a) ,a(e D%am1Sor2ent TLC $an HPTLC 2nsur yang dipandang penting pada lempeng : Format, penunjang, lapisan, dan pengikat: lempeng
Precoated TLC dengan penunjang suatu gelas tersedia dalam format yang banyak, yang berukuran 20 cm 20 cm bisanya dipandang sebagai standar untuk TLC awal Pelat !elas sangat kuat dan dapat dikembangkan secara "ertikal dan #ori$ontal tanpa bergoyang, kemudian pemastian ketetapan gerakan dari fase gerak pada lempeng %ereka benar inert ketika digunakan dengan semua larutan pengembang dan deri"ating agent dan sebab itu dapat diaplikasikan secara uni"ersal Pemisa#an optimum &migration' jarak pada lempeng TLC adala# (2)(* cm +ika #anya sedikit sampel yang akan dipisa#kan pada waktu lempengnya sama, format yang lebi# kecil seperti (0 cm 20 cm atau * cm 20 cm &20 cm dalam pengembangan secara langsung', yang juga memungkinkan perpinda#an jarak optimum, terjadi +ika efisiensi pemisa#an optimum sesunggu#nya kurang penting &sebagai conto#, jika sample mangandung #anya satu atau sangat banyak komponen', +arak pengembangan dapat dikurangi sampai kira,kira cm dan lempeng format 20 cm (0 cm &atau lempeng fraksional sekecil 2 * cm (0 cm' mungkin kurang

*am2ar0 S%l%ka gel #nt#k TLC

lempeng Thin3layer hromatography (TLC) untuk diadsorbsi, partisi, dan teknik ion e4 hange enam pilihan media dengan gelas, polyester, dan dasar aluminum. Lapisan adsorbent sili a3based dalam &igma3(ldri h lempeng TLC dipadukan dengan suatu pengikat polymeri 5 lempeng sili a gel yang lebih murni dipadukan pada suatu pengikat gypsum (Ca&6/7polimer). (tau dengan mengunakan lempeng silika gel yang biasa di gunakan $

*am2ar0 lempeng (%l%ka gel #nt#k HPTLC (le2%3 ke4%l $ar% TLC) Spe(%5%ka(% $ar% ma(%ng6ma(%ng (or2ent :

S%l%ka gel 3 untuk pemisahan polarisasi lamah sampai kuat H%g3 p#r%t7 (%l%ka gel 3asam washed untuk pemisahan dari aflato4ins Sell#lo(a 3 untuk kromatografi partisi Sell#lo(a P)I 3 untuk pemisahan dari anion lemah (amino a ids, peptides) Al#m%n#m o8%$a 8 alumina dasar, untuk pemisahan hormone and antibiotika C3%ral (%l%ka 3 untuk pemisahan dari isomer optis aktif melalui pertukaran ligan

!ibawah ini daftar beberapa spesifikasi sorbent yang dapat digunakan sebagai fase stationary yang sekarang biasa digunakan $ Cat0 No0 Or$er%ng %n5ormat%on layer thi kness9:m; si<e9 m; =uantity 7pa k

#-/.0#-0 HPTLC lempengs ellulose > #-/.0#-1 HPTLC lempengs ellulose > #-/.0+?+ HPTLC lempengs ellulose (without >) #-/.0+?1 HPTLC lempengs ellulose (without >) #-/.01-) HPTLC lempengs sili a gel 1# (without >) #-/.01-- HPTLC lempengs sili a gel 1# (without >) #-/.01/) HPTLC lempengs sili a gel 1# (without >)

)## )## )## )## ,## ,## ,##

)#4)# ,#4)# )#4)# ,#4)# )#4)# )#4)# ,#4)# )#4)#

,0 0# ,0 ,0 ,0 )## 0# ,0

#-/.-+/? HPTLC lempengs sili a gel 1# (without >), ,## on entration <one #-/.-+/* HPTLC lempengs sili a gel 1# (without >), ,## on entration <one #-/.01,? HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/ #-/.01,* HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/ #-/.001/ HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/ @LP #-/.01/, HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/ ,## ,## ,## ,##

,#4)#

0#

)#4)# )#4)# )#4)# ,#4)# ,#4)#

,0 )## ,0 0# ,0

#-/.)+1/ HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/, e4tra )## thin layer #-/.-+,+ HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/, ,## on entration <one #-/.-+,? HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/, ,## on entration <one #-/.01)- HPTLC lempengs sili a gel 1# > ,0/ @LP #-/.)00, HPTLC lempengs sili a gel A' 1# > ,0/s ,## ,##

)#4)#

,0

,#4)#

0#

,#4)# ,#4)#

,0 ,0

#-/.0//0 HPTLC lempengs LiChrospherB &i 1# > )?# ,0/s #-/.00/+ HPTLC aluminium sheets sili a gel 1# ,## (without >) #-/.00/? HPTLC aluminium sheets sili a gel 1# > ,0/ ,## #-/.00/- HPTLC aluminium sheets sili a gel 1# > ,## ,0/s, '(C(. #-/.00?1 HPTLC aluminium sheets LiChrospherB &i )## 1# > ,0/s #-/.-+,1 HPTLC lempengs 'P3, > ,0/s #-/.-+,0 HPTLC lempengs 'P3? > ,0/s #-/./,*1 HPTLC lempengs 'P3)? A (without >) #-/.-),/ HPTLC lempengs 'P3)? A > ,0/s ,## #-/.-+,/ HPTLC lempengs 'P3)? > ,0/s ,## #-/.1/1/ HPTLC lempengs C. > ,0/s #-/.,0+) HPTLC lempengs C. > ,0/s #-/.,0+, HPTLC lempengs .H, (without >) #-/.-)*, HPTLC lempengs .H, > ,0/s #-/.01/+ HPTLC lempengs .H, > ,0/s #-/.,11? HPTLC lempengs !iol > ,0/ #-/.01-1 HPTLC lempengs C"'CD !iol > ,0/ #-/.01#+ 2TLC sili a gel 1# w7o > ,0/ ,## ,## ,## ,## ,## ,## ,## )# ,## ,## ,##

,#4)#

,0

,#4,#

,0

,#4,# )#4)#

,0 ,0

,#4,#

,0

)#4)# )#4)# ,#4)# )#4)# )#4)# )#4)# ,#4)# ,#4)# ,#4)# )#4)# )#4)# ,#4)#

,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0

,0 14-.1 ,0

&e ara umum bentuk dan ukuran dari pelat HPTLC lebih ke il dari pelat TLC ini bisa sampai menjadi sepertiga dari Lempengf TLC hal ini lebih simple namun memang relatif sedikit lebih mahal. Cara memba a kode pada fase diam7solid SILICA *)L 9 * ,:;!

E E E E E

(dalah &ili a @el dengan $ 2kuran pori $ 1# F @ G Ca&6/.H H,6 sebagai binder7gypsum > G bahan fluores en 7 fosfores en yg ditambahkan ,0/ G dituliskan sesudah > atau 2I untuk menandakan panjang gelombang eksitasi bahan fluores ent atau fosfores en yang ditambahkan (&nyder, et al, )**+) 2) Chamber 1 R#ang Pengem2ang Pada dasarnya hamber atau tempat untuk pengembangan dari kromatografi planar tidak terlalu spesifik untuk masing3masing jenis kromatografi, yang membedakan hamber yang digunakan adalah ukuran dari hamber, dimana ukuran dapat disesuaikan dengan kebutuhan$ Jahan dari hamber pisa dari ka a atau bahkan dari plastik yang kedap air, biasanya bentuknya bisa bulat seperti toples atau kotak seperti gambar di bawah ini $

4) In(tr#men Pen$#k#ng 1 Tam2a3an Spra7er &prayer atu penyemprot ber ak noda dari spot yang dihasilkan tidak terlalu berKariasi dari metode planar kromatografi mulai dari alat yang sederhana atau alat yang sudah kompleks dapat digunakan dengan baik pada penampakan noda dari spot yang sudah diperoleh dengan sebelumnya memasukan suatu pereaksi penderiKatisasi agar spot memendarkan ahaya, berikut gambar dari sprayer mulai dari yang sederhana sampai dengan keluaran terbaru:

*am2ar0 Spra7er

Jerikut beberapa deriKating agent yang bisa di gunakan $

(&nyder, et al, )**+)

 Scaner & aner merupakan suatu alat yang dimaksudkan untuk memperjelas suatu spot pada saat mengamati, bisanya pada alat ini disertai dengan lampu baik itu lampu 2I atau yang lainya yang dapat memendarkan ahaya dari spot3spot analit setelah disemprot dengan larutan penampak noda (deriKating agent), berikut beberapa gambar alat s aner $

*am2ar0 +< S4aner :;! nm $an &99 nm Detektor !etektor yang bisa di gunakan pada analisis kromatografi planar adalah adalah detektor photon, diamana sifat dari analit dapat dibuat atau di deriKatisasi dengan senyawa yang membuat senyawa tersebut berflourisensi dan dapat di deteksi atau di s anning dengan detektor yang sesuai. !etektor yang umum digunakan dalah detektor 2I atau flourisensi detektor berikut gambar dari beberapa detektor yang terkait erat dengan kromatografi planar$ beberpa 2I detektor yang bisa digunakan dalam deteksi spot hasil kromatogram dari planar kromatografi. ). ,. -. /. &ili on Photodiodes @ermanium Photodiodes Ln@a(s Photodiodes "4tended Ln@a(s Photodiodes Prinsip kerjanya se ara umum adalah lempeng yang terdapat spot didalamnya dikenai sinar dan nanti akan berflourisensi kemudian flourisensinya akan ditangkap oleh detektor kemudian intensitasnya akan terukur dan akan sebanding dengan kadarnya.

*am2ar0 +<6 $etektor :;! nm $an &99 nm $) Alat Pen$er%'at%(a(% (lat ini dilmaksudkan untuk membuat senyawa yang terdapat pada spot dapat terdeteksi yaitu dengan ara deriKatisasi selain dengan ara disemprotkan dengan sprayer bisanya alat ini di gunakan untuk fosfors ent dan ini mengandung fosfors ent anorganik yaitu spot yang terbentuk di elupkan pada media yang mengandung <at penderiKasi.

*am2ar0 Der%'at%ng tool

e)

5) Spra7 Ca2%net (lat ini untuk sebagai ruang untuk menyemprot spot dengan <at penampak noda7<at penderiKatisasi

*am2ar0 Spra7 Ka2%net g) Lempeng 3eater (lat ini untuk memanaskan lempeng sebelum dipakai atau untuk mengaktifkan dengan ara menguapkan uap air yang dikandungnya selain dengan menggunakan oKen biasa$

*am2ar0 Plate 3) Lempeng Coater (lat ini dapat di gunakan jika kita akan membuat sendiri lapisan penyerap yang akan dilapiskan pada penunjang ka a atau plastik atau alumunium.
kac a Alumunium/plasti k

*am2ar0 Coater Plate

%) P%pet (ampel1$ro$(1Penete( Sampel (dalah suatu kapiler dengan ukuran tertentu yang berguna untuk meneteskan sampel pada lempeng atau fase diam, berikut dapat dilihat alah satunya 5

*am2ar0 Droper1Penete( Sampel

C0 K)+NT+N*AN +TAMA DARI TLC DAN HPTLC: analisis minyak atau lemak dan matriks sampel kompleks lainnya mungkin dilakukan tanpa preparasi sampel. sampel ganda (hingga /#) dapat dianalisis sekaligus dalam kondisi identik. Cetode pemisahan yang lebih epat dan lebih murah dimungkinkan tanpa

memerlukan instrumentasi yang anggih. Pemisahan ,3dimensi yang mudah dengan menggunakan dua fase gerak yang berbeda dalam dua arah yang berbeda memberikan kualitas pemisahan yang unik. 6leh karena material bahan baku yang identik ini tersedia untuk fase stationer TLC dan HPLC, menghasilkan selektiKitas kromatografi yang ekiKalen untuk kedua teknik tersebut (lihat @ambar ))

>ig. )$ Pemisahan TLC (kiri) dan pemisahan HPLC (kanan) Thin Layer hromatography (TLC) merupakan salah satu teknik pemisahan yang paling metode epat HPLC serbaguna dalam industri farmasi, makanan, dan kosmetik serta digunakan juga untuk pengembangan Pelat HPTLC dari Cer k menawarkan ke epatan yang lebih epat dan sensitiKitas yang lebih tinggi dibandingkan TLC klasik dan memberikan pemisahan yang sangat baik. Cenggunakan perlengkapan instrumental, pelat HPTLC memungkinkan kromatografi lapis tipis kuantitatif yang modern yang dapat dibandingkan dengan performa HPLC.(lihat @ambar. ) dan ,). Pemisahan menggunakan HPTLC dan HPLC memperlihatkan hasil yang sama, jika kedua teknik digunakan Contoh$

pada

kondisi

kromatografik

yang

sama.

sorben yang identik fase gerak yang sama

Pemisahan sampel sebenarnya (Lettu e) menggunakan TLC dan HPLC pada kondisi kromatografik yang sama HPTLC HPLC

@ambar ,: pem%(a3an lett#4e ((ampel (e2enarn7a) HPTLC $an HPLC pa$a kon$%(% kromatogra5%k = D%nokap (1)> Parat%on (:)> Ipro$on (&)>Mat%lparat%on (!)> Meto2rom#ron (;) $an D%metoat (9)?

D0 M)TOD)

P"'&L(P(. L('2T(. &T6D Pembuatan larutan standar kuersetin &ebuah larutan stok standar kuersetin (,# mg 7 mL) disiapkan dengan memindahkan , mg =uer etin, ml. P"'&L(P(. L('2T(. &(CP"L !itimbang (kurat ,0# mg hydroal oholi kering ekstrak .. stellata dipindahkan ke mL )## labu ukur dilarutkan dalam ?# mL metanol. kemudian disonikasi selama )# menit dan isi termos disaring melalui kertas Ahatman .6 ). Iolume akhir larutan dibuat sampai )## mL dengan metanol untuk mendapatkan larutan stok yang mengandung kadar ,,0# mg 7 mL. L.&T'2C".T(&L !(. D'6C(T6@'(>L !itimbang akurat, ke dalam labu Kolumetrik )## mL, dilarutkan dalam 0# mL metanol. kemudian disonikasi selama )# menit dan Kolume akhir dari solusi dibuat hingga )##

HPTLC dilakukan pada ,# m M )# m piring aluminium didukung dilapisi dengan silika gel 1#>,0/. Larutan standar kuersetin dan larutan sampel yang diterapkan pada piring sebagai band ?.# mm lebar, -#,# mm terpisah, dan )#,# mm dari bawah tepi lempeng kromatografi yang sama dengan menggunakan sebuah Camag (Cutten<, &wiss) Linomat I sampel aplikator dilengkapi dengan )##3uL Hamilton (2&() jarum suntik. (s ending pengembangan untuk jarak ?# mm dilakukan pada suhu kamar (,? N , O C), dengan toluena$ etil asetat$ asam format, 0$ /$ #,, (K 7 K 7 K), sebagaimana fase gerak, dalam Chamber twin melalui ka a Camag yang sebelumnya jenuh dengan fasa uap bebas selama ,# min. &etelah pengembangan, lempeng dikeringkan dengan pengering dan kemudian dipindai di panjang gelombang -?# nm dengan TLC & anner Camag dengan software AL.C(T, menggunakan lampu deuterium. Cetode ini diKalidasi sesuai dengan LCH guidelines)). D2'I( D(LLJ'(&L D2"'&"TL. Larutan stok standar kuersetin (,#Pg7mL) adalah disiapkan dalam metanol. Kolume larutan stok ,, /, 1, ? dan )# uL, yang terlihat pada pelat TLC diperoleh konsentrasi /#, ?#, ),#, )1#, )?# dan ,## ng 7 spot =uer etin, masing3masing. !ata dari luas pun ak diplot terhadap konsentrasi

yang sesuai (@ambar )) Q

C"T6!" I(LL!(&L Detelitian Lnstrumental presisi, intra3assay presisi, dan presisi menengah metode ditentukan. Presisi Lnstrumental diukur dengan meniru (n G )#) penerapan larutan standar =uer etin yang sama (Donsentrasi ?# ng). Presisi uji Lntra3assay adalah dieKaluasi oleh analisis dari tiga aplikasi mereplikasi baru disiapkan standar solusi yang sama konsentrasi, pada hari yang sama. Presisi menengah dieKaluasi dengan analisis dari tiga aplikasi meniru larutan standar konsentrasi yang sama pada tiga yang berbeda hari. D"T(H(.(. C"T6!"

!engan memperkenalkan perubahan ke il dalam fase gerak komposisi, Kolume fase gerak dan durasi saturasi fase gerak, efek pada hasilnya diperiksa. Detahanan metode ini dilakukan dalam tiga replikasi pada tingkat konsentrasi )1# ng 7 tempat dan '.&.!R luas pun ak dihitung. Dekasaran &ebuah solusi konsentrasi )1# tempat ng 7 disiapkan dan dianalisis pada hari # dan setelah 1, ),, ,/, /? dan +, jam. !ata dirawat karenaR '.&.!. untuk menilai kekasaran dari Cetode. Jatas !eteksi dan Jatas Penghitungan Jatas deteksi (L6!) dan (L6S) ditentukan sebagai jumlah sinyal3to3noise rasio masing3masing adalah -$) dan )#$). P"C2LLH(. &T2!L Deakuratan metode dibuktikan dengan melakukan per obaan re oKery pada tiga tingkat yang berbeda menggunakan metode penambahan standar. Pada , uL (,,0# mg 7mL) dari sampel .. stellata, jumlah yang telah diketahui pada =uer etin standar (?#, ),# dan )1# ng per spot) adalah ditambahkan oleh spiking. .ilai3nilai persen re oKery dan nilai persen rata3rata re oKery untuk kuersetin dihitung, yang terlihat pada Tabel ,.

D"DH2&2&(. Dekhasan dari metode ini dipastikan dengan menganalisis obat standar dan ekstrak. Tempat untuk =uer etin dalam sampel dikonfirmasi dengan membandingkan nilai 'f dan tempat spektrum dengan standar. Demurnian pun ak =uer etin dinilai dengan membandingkan spektra pada tiga tingkat yang berbeda, yaitu pun ak awal, pun ak maksimal dan posisi akhir pun ak tempat. )0 P)N**+NAAN

 (nalisis makanan Lndustri farmasi (plikasi klinik (plikasi industry >orensik Dosmetik

,0 DA,TAR P+STAKA ). ,. -. Chamberlain %, )**0, T3e Anal7(%( Dr#g( %n B%olog%4al ,l#%$(, &e ond "dition, C'C press, .ewTork, P )#03))+.. !ay. '.(, and 2nderwood, (.L. )**1. Anal%(%( K%m%a K#ant%tat%5, "disi kelima, "rlangga press, %akarta. P 00)300/ &herma %oseph, ,##/> Planar C3romatograp370 !epartment of Chemistry, Lafayette College, "aston, PennsylKania )?#/,, (nalyti al Chemistry, Iol. +1, .o. ),, %une )0, /. &nyder, '.L., Dirkland, %.%., and @laj h, %.L., )**+, Pra4t%4al HPLC met3o$ $e'elopment, ,nd edition, p.1?131*+, %ohn Ailey U &on, Ln ., .ew Tork 0. &uherman, C. Culja. )**00 Anal%(%( In(tr#ment. (irlangga 2niKersity Press, &urabaya, P ,,-3,-/. 6. Sachin U. Rakesh,dkk. 2009. HPTLC met3o$ 5or @#ant%tat%'e $eterm%nat%on o5 @#er4et%n %n 37$roal4o3ol%4 e8tra4t o5 $r%e$ 5loAer o5 n7mp3aea (tellata A%ll$0 L&&. $ #*+/3/,*#. @oKt. College of Pharma y, Iidyanagar. Lndia