Spectroscopy Systems and Spectroscopy Applications

Atomska fizika i spektroskopija

Predavanje 5

Sadrzaj
Reference Ciljevi Spektroskopija
Sto je spektroskopija ? Osnove: opci principi i pojmovi
Energija molekule Procesi Apsorpcija Emisija Rasprsenje Kratak pregled nekih vrsta (ne svih) spektroskopija Apsorpcijska spektroskopija Fluorescencijska spektroskopija Raman spektroskopija

Sadrzaj nast.
Spektroskopska oprema Komponente
Izvori
Laseri Lampe (broad band)

Spektrografi i resetke
Vezanje Fizika opticke resetke difrakcija redovi ucinkovitost disperzija i razlucivost

Detektori
Array detection i CCD-ovi

Reference
Spektroskopija http://www.chem.vt.edu/chem-ed/spec/spectros.html Internet Journal of Vibrational Spectroscopy http://www.ijvs.com/archive.html The Optics of Spectroscopy http://www.jyinc.com/systems/theory/oos/oos.htm Oriel: TUTORIAL (pdf) http://www.oriel.com/tech/tutori.htm Resetke http://cord.org/cm/leot/course06_mod09/mod06_09.htm Ostali izvori http://www.spectroscopymag.com/ http://directory.google.com/Top/Science/Chemistry/ Analytical/Instruments/

Primjeri biomedicinske spektroskopije

Ne-invazivno promatranje glukoze
Near-Infrared Absorption Spectroscopy
http://www.rgmt.com/

Fluorescence Spectroscopy
http://www.argose.com/

Raman Spectroscopy
http://www.lightouchmedical.com/

Pre-Cancer/Cancer detection
Fluorescence Spectroscopy
http://www.spectrx.com/ http://www.medispectra.com/ http://www.lifespex.com/

Ciljevi Uvod u spektroskopiju

Sto je to?
Energijski nivoi Osnovni procesi Vrste spektroskopija
Pregled primjena

Uvod u spektroskopsku opremu

Koje su glavne komponente i koja je njihova uloga ?
Osnove fizike/optike u pozadini Osnovna razmatranja o sastavljanju opreme

Spectroscopy
Definicija:
Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovog medudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.

Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanje s tvarima

Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su probe za dobivanje informacija o uzorcima Kvantifikacija sastavnih dijelova

Identifikacija (spektralni potpis) Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)

Spectroscopy
Definicija:
Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovog medudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.

Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanje s tvarima

Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su probe za dobivanje informacija o uzorcima Kvantifikacija sastavnih dijelova

Identifikacija (spektralni potpis) Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)

Spectroscopy
Definicija:
Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovog medudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.

Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanje s tvarima

Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su probe za dobivanje informacija o uzorcima Kvantifikacija sastavnih dijelova

Identifikacija (spektralni potpis) Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)

Spectroscopy
Definicija:
Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovog medudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.

Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanje s tvarima

Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su probe za dobivanje informacija o uzorcima Kvantifikacija sastavnih dijelova

Identifikacija (spektralni potpis) Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)

Spectroscopy
Definicija:
Proucavanje strukture i dinamike tvari putem njihovog medudjelovanja s elektromagnetskim zracenjem.

Valna duljina (energija) odreduju medudjelovanje s tvarima

Apsorpcija Emisija Rasprsenje

Ova medudjelovanja su probe za dobivanje informacija o uzorcima Kvantifikacija sastavnih dijelova

Identifikacija (spektralni potpis) Dinamicke promjene u sastavu (kinetika reakcija, itd.)

Energija molekule
Emolecule = Eelectronic + Evibrational + Erotational + Espin + Etranslational

Nas zanimaju: Eelectronic Evibrational Erotational

Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)

Eelectronic 105 106 kJ/mol UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 700 nm Evibrational 10 40 kJ/mol IR Blizu IR (NIR): 800 2500 nm (5000 nm) Srednji IR (MIR): 5000 nm 25000 nm (5 m 25 m) Daleki IR (FIR): 25000 nm 350000 nm Erotational 10 kJ/mol mikrovalovi Mikrovalno podrucje: 10-3 1 m Espin 10-3 J/mole radiovalovi Etranslational kontinuirani spektar

Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)

Eelectronic 105 106 kJ/mol UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 700 nm Evibrational 10 40 kJ/mol IR Blizu IR (NIR): 800 2500 nm (5000 nm) Srednji IR (MIR): 5000 nm 25000 nm (5 m 25 m) Daleki IR (FIR): 25000 nm 350000 nm Erotational 10 kJ/mol mikrovalovi Mikrovalno podrucje: 10-3 1 m Espin 10-3 J/mole radiovalovi Etranslational kontinuirani spektar

Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)

Eelectronic 105 106 kJ/mol UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 700 nm Evibrational 10 40 kJ/mol IR Blizu IR (NIR): 800 2500 nm (5000 nm) Srednji IR (MIR): 5000 nm 25000 nm (5 m 25 m) Daleki IR (FIR): 25000 nm 350000 nm Erotational 10 kJ/mol mikrovalovi Mikrovalno podrucje: 10-3 1 m Espin 10-3 J/mole radiovalovi Etranslational kontinuirani spektar

Energy of a Molecule (ubaciti slike!!!!!!!)

Eelectronic 105 106 kJ/mol UV-Vis UV-Vis podrucje: 200 700 nm Evibrational 10 40 kJ/mol IR Blizu IR (NIR): 800 2500 nm (5000 nm) Srednji IR (MIR): 5000 nm 25000 nm (5 m 25 m) Daleki IR (FIR): 25000 nm 350000 nm Erotational 10 kJ/mol mikrovalovi Mikrovalno podrucje: 10-3 1 m Espin 10-3 J/mole radiovalovi Etranslational kontinuirani spektar

Energija molekule (Jablonski diagram)

Procesi
(sto nam govori prethodna slika?)

Apsorpcija: iz osnovnog u pobudeno stanje

(10-15 s)

Relaksacija: iz pobudenog u osnovno stanje Unutarnja konverzija (IC)

relaksacija vibracijskih stanja bez zracenja (10-12 - 10-14 s)

Emisija
fluorescencija (spontana emisija: 10-10 - 10-8 s) fosforescencija (10-3 - 10-0 s)
zahtjeva intersystem crossing (promjena elektronskog spina) osnovno stanje singlet pobudeno stanje singlet promjena spina triplet intersystem crossing potrebna jos jedna promjena spina kako bi prijelaz u singletno osnovno stanje bilo moguce

Fluorescencija, fosforescencija i intersystem crossing

Opcenito, elektroni u molekulama su spareni po dva u svaki orbital Osnovno stanje vecine molekula je singletno
rezultat dozvoljenih apsorpcija je, takoder, singletno stanje, jer je promjena spina elektrona, tehnicki, zabranjen proces
zabranjen treba shvatiti u smislu vjerojatnosti, a ne apsolutno fotoni ne nose spin

Pobudenjem elektron prelazi u prazni orbital, cime se oslobada nuznosti sparenih spinova

Fluorescencija, fosforescencija i intersystem crossing

Struktura se moze relaksirati direktno u osnovno stanje
fluorescencija

Moguc je, medutim, ISC, koji dopusta pobudenom singletnom stanju da prijede u odgovarajuce pobudeno tripletno stanje
pobudeno elektronsko stanje moze biti ili singletno (svi spinovi spareni) ili tripletno (dva spina nesparena) IC se dogada bez zracenja (sudari, toplina) jednom u tripletnom stanju, vracanje u osnovno singletno stanje je zabranjeno (opet u smislu vjerojatnosti)
zbog toga, molekula ostaje u tripletnom stanju zantno duze nego inace. Kada se emisija konacno dogodi, naziva se fosforescencija

Apsorpcijska spektroskopija
Ako se mjeri u UV-Vis (optickom) dijelu emg spektra
Apsorpcija: prijelaz iz nizeg u vise stanje s prijenosom energije od polja zracenja k apsorberu (molekuli)
ukljucuje prijelaze izmedu elektronskih stanja

spektar atoma ili molekule ovisi o strukturi energijskih nivoa, sto apsorpcijske spektre cini korisnima za identifikaciju sastava Mjerenje koncentracije apsorbera u uzorku se postize primjenom BeerLambertovog zakona
Credit: NASA, Bernard Schmitt, and UKIRT.

Apsorpcija
Excited state

Loss of energy as Absorption radiation, heat, etc ...

Apsorpcija duz zrake zracenja

Ground state

Beerov zakon (Beer-Lambertov zakon)

Empirijska relacija izmedu intenziteta transmitiranog zracenja i broja apsorbera A. Beer, 1852. Vidite H. G. Pfeiffer and H. A. Liebhafsky, J. Chem. Ed. 1951, 28, 123-125, The origins of Beers law. upadno zracenje je monokromatsko dI jedinice apsorbera (atomi, molekule, ioni) djeluju medusobno nezavisno = kI dx apsorpcija je ogranicena na volumen uniformnog presjeka

Integrating over x from 0 to b

I0

dx
Absorbing medium

I = I 0 e kb

I
transmisija

= I 0 e k 'bc = I 0 e bn T= I I
0

k = absorption coefficient, cm-1 b = path length, cm c = concentration, g L-1, moles L-1 a = absorptivity, cm-1 (concn.)-1 = absorption cross section, cm2 n = absorbers cm-3

= e k 'bc = 10 abc

apsorpcija

A = log T = abc

Nota: apsorpcija = Opticka gustoca

Beerov zakon (Beer-Lambertov zakon)

Za odstupanja vidite:
http://www.files.chem.vt.edu/chem-ed/spec/beerslaw.html

Eksponencijalno smanjenje intenziteta s

koncentracijom debljinom uzorka (duljina optickog puta)

Pretpostavke
u uzorku nema rasprsenja
utjecaj rasprsenja:
stvara gubitke na stranama uzorka
prividna apsorpcija tada veca od stvarne

opticki put nije vise samo debljina kuvete (fantomi nasumicno hodaju kroz uzorak stvara zahtjev za teorijom sirenja svjetlosti (teorija difuzije, itd.)

Beerov zakon primjer

Path length / cm %T Absorbance 0 100 0 0.2 50 0.3 0.4 25 0.6 0.6 12.5 0.9 0.8 6.25 1.2 1.0 3.125 1.5

Apsorpcijska spektroskopija
Shema UV-Vis spektrofotometra s dvostrukom zrakom

Apsorpcijski spektar: hemoglobin

He moglobin (lys e d blood) 25

He moglobin (lys e d blood)

20

15 ua(cm-1) 10 5 0 300

350

400

450 Wave le ng th (nm)

500

550

600

650

Spektroskopija
NIR apsorpcijska spektroskopija
gleda vibracijske prijelaze unutar jednog elektronskog stanja valne duljine: 800 nm - 2.5 m
obicno se koristi skala valnih brojeva :12,500 - 4000
valni broj je broj valova po jednom centimetru

valni broj (cm-1): ' = 1 / ne zaboravite konverziju (nm) (cm) npr. 800 nm = 12,500 cm-1

zasto?
valni broj se povecava kako se povecava energija

Emisija
Pobudeno stanje Pobudenje (apsorpcija)

Emisija

Emitirano zracenje izotropno

Osnovno stanje

Fluorescencija: dijagram energijskih nivoa

Zracenje od fluorescencije je pomaknuto prema crvenom u odnosu na apsorbirano zracenje (Stokesov pomak). Zasto?

Fluorescencija: dijagram energijskih nivoa

Ef = Eaps Evib.relax. Esolv.relax. visak energije disipacija (~10-12 s) Kashaino pravilo (Vavilov 1926.): fluorescencijski spektar ne ovisi o valnoj duljini pobudenja

Zracenje od fluorescencije je pomaknuto prema crvenom u odnosu na apsorbirano zracenje (Stokesov pomak). Zasto?

Fluorescencijska spektroskopija
Vrsta UV-Vis (opticke) spektroskopije
Fluorescencija: molekule koje su pobudene u visa stanja mogu pasti na niza stanja emisijom zracenja
ukljucuje prijelaze izmedu elektronskih nivoa

Intenzitet emitiranog zracenja je linearno srazmjerno koncentraciji analiziranog uzorka (pri niskim koncentracijama) Molekularna fluorescencija je korisna za odredivanje kolicine tvari koja emitira

Fluorescencijska spektroskopija
(1) EEM Dil ij S Total i , j N = = 2. 3 Ck k ( i ) k j 4 I ( )L 4 k =1 i dil
N = a k ( i ) k j 4 k =1
i oznacava valnu duljinu pobudenja j oznacava valnu duljinu pobudenja

( )

( )

EEMDilij - fluorescencija (intenzitet) EEM razrjedene otopine N = broj fluorofora (k = 1 do N) detektirani dio ukupnog intenziteta fluorescencije, STotal(i, j) (/4) intezitet pobudenja, I(i), debljina uzorka, Ldil svaki fluorofor se moze okarakterizirati s:
koncentracijom, Ck koef. molarne apsorpcije, k(i) fluorescencijski kvantni doprinos, k(j) a measure of the efficiency with which absorbed light produces some effect and the quantum yield can be defined by the equation:

broj emitiranih fotona broj apsorbiranih fotona

Here, quantum yield is essentially the emission efficiency of a given fluorochrome.

Fluorescencijska spektroskopija*
UV-Vis (opticka) spektroskopija (neki, ne svi) dijelovi fluorescencijske spektroskopije
spektar pobudenja
fiksirana emisije, snimano pobudenje daje podatke o strukturi apsorpcije
dobivamo koef. molarne apsorpcije, k(i)

spektar emisije
fiksirana pobudenja, snimana emisija
dobivamo fluorescencijski kvantni doprinos, k(j)

zajedno: matrica pobudenja emisije vrijeme zivota fluorescencije

kako se pobudena stanja depopuliraju vremenom
karakterizira molekule dobivamo molekularnu dinamiku i okolinu

*Dobra referenca: J. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, 2nd edition (July 1999)

Fluorescencijska spektroskopija
Problemi u fluorescencijskoj spektroskopiji
relativno sirok spektar bez jasnih vrpci - otezana interpretacija (npr. mjesavine fluorofora) potrebno razviti i primijeniti modele sirenja svjetlosti kako bi dobili kvantitativne informacije zamucenih uzoraka (tj. uzoraka koji rasprsuju i apsorbiraju; npr. tkiva) mora se minimizirati vjerojatnost promjena uzorka zbog procesa mjerenja (npr. preveliki intenzitet svjetlosti photobleaching) komponente instrumentarija ne smiju oneciscavati uzorak (npr. kod fluorescencije stakala) zracenje pobudenja se mora u potpunosti izbaciti iz detekcije
minimizacija zalutalog zracenja ili ce preplaviti signal koji nas zanima

Fluorescencijski spektrometar

1 Lamp housing 2 IR filter 3 Adjustable slits 4 Sample compartment 5 Baffle 6 Filter holders 7 Excitation/emission optics 8 Cuvette holder 9 Emission port shutter 10 PMT detector

In-vivo Fluorescencijski sustav

Nitrogen Laser Pumped Dye Laser Intensified Diode Polychromator Array Gate Pulser

coupling lens excitation fiber(s)

coupling lenses collection fibers

Probe

Controller

Computer

excitation fiber emission collection fiber

quartz shield

Spektar pobudenja: koza

Data 1
60 50 40 30 20 10 0 240
----- Normal Normal ----- Tumor

260

280 300 Wavelength (nm)

320

340

Em @ 345 nm

Tumor

Spektar emisije: koza

2.5 2 1.5 1 0.5 0 400
----- Normal Normal ----- Tumor

Tumor

450

500 550 Wavelength (nm)

600

650

Ex @ 380 nm

Fluorescencijska spektroskopija
Koje tvari fluoresciraju*?
Endogeni fluorofori
amino kiseline strukturni proteini enzimi i ko-emzimi vitamini lipidi porfirini

Egzogeni Fluorofori
fotosensitizeri

opcenito, tvari koje fluoresciraju

aromatske, organske molekule
mnostvo dvostrukih veza
*http://www.engr.wisc.edu/bme/faculty/ramanujam_nimmi/0102_a.pdf

Rasprsenje
Promjena smjera, obicno bez promjene frekvencije zracenja Ovisnost o i prostornoj raspodjeli rasprsenja ovisi o:
velicini cestice prema zracenja razlici indeksa loma izmedu tvari koja rasprsuje i okruzujuceg medija

Elasticno rasprsenje (nema promjene frekvencije rasprsenog zracenja)

Rayleighevo rasprsenje; cestice puno manje od zracenja. Intenzitet rasprsenja pada kao 1/4 (zato je nebo plavo) Mieovo rasprsenje: cestice usporedljive velicine s zracenja

Neelasticno rasprsenje (male promjene frekvencije)

Ramanovo rasprsenje: frekvencija zracenja je pomaknuta u odnosu na frekvenciju pobudenja, no iznos pomaka ne ovisi o frekvenciji pobudenja. Ovaj "Ramanov pomak" je, stoga, intrinzisno svojstvo uzorka

Rasprsenje

Raman spektroskopija
Looks at vibrational transitions within a single electronic state, but by scattering light of the molecule and looking at how the wavelength of the scattered light is changed (shift in energy).
Stokes shift:
small loss in photon energy corresponding to energy lost to vibrational state shift to longer

Anti-stokes shift:
small gain in photon energy corresponding to energy gained by photon from vibrational energy shift to shorter

Raman spektroskopija
Basis of interaction with light is molecular polarizability
Probes the polarizability of a molecule
polarizability is the ease with which the electron cloud around a molecule can be distorted (induced dipole)

Raman requires high purity monochromatic source (laser) Raman requires gratings with large angular dispersion (to resolve small shifts in wavelength) Intensity ~ concentration (so you can use Raman as a quantification tool under certain circumstances) Can produce very information rich spectra Wavelength range: UV to Infrared

Raman Spektrometar
CUVETTE LASER BP FILTER HN FILTER

789nm 25 mW

Resolution: 11 cm-1
CONTROLLER SPECTROGRAPH LN-CCD

Range: 500-2000 cm-1 Integration: 15 min

COMPUTER

Raman spektroskopija

Raman spectrum of natural diamond (type IIa), showing the main Raman active mode at ~1332 cm-1 (Taken using 514.5 nm laser excitation wavelength). The Raman signal intensity is in arbitrary units (a.u.).

Raman spektroskopija
The trouble(s) with Raman information rich spectra can sometimes be difficult to interpret Raman scattering is a very inefficient process
Only 1 in 108 to 10 10 scattered photons is a Raman scattered photon
Often requires long integration times (seconds to minutes) and high powers...

Make sure that you dont damage your sample scattering efficiency decreases with increasing wavelength ~ 1/4 Tradeoffs try in increase efficiency by going to shorter wavelengths signal of interest is tiny, sometimes riding on large fluroescence background can stimulate Raman signal in optical fibers that interferes with signal of interest

Raman spektroskopija

Raman spektroskopija

Typical Raman spectrum obtained from a CVD diamond film, deposited using MWCVD from a 0.5% CH4/H2 gas mixture, 1000 W microwave power, 700C substrate temperature for 6 hours. Raman spectrum taken using 514 nm laser excitation.

Raman spektroskopija
Note: Raman and NIR spectroscopy are complementary techniques (often people will ask which is better).
NIR
requires broadband sources measure of change in dipole moment

Raman
requires high purity monochromatic source (laser) to minimize broadening of features Probes the polarizability if a molecule particularly good for samples containing lots of water Water absorption can swamp NIR absorption signal of interest Water Raman is weak: opportunity to see components dissolved in water matix

Literatura
Anthony (Tony) J. Durkin, Spectroscopy Systems and Spectroscopy Applications www.google.com