IRMA: Lo que se busca es medir la concentracin del Ag o del Ac para esto se debe formar el complejo Ag-Ac.

Para esto necesitamos de una marca (en Ag o Ac ! que sir"e para seguir la formacin de este complejo # poder cuantificar. La marca no necesariamente distingue entre especies libres # unidas! porque tambi$n "a a estar en especies libres! por eso se requiere del m$todo de separacin. Propiedades de la marca: - %ebe unirse f&cilmente a lo que se quiere marcar (Ag o Ac ! por lo tanto debe ser una metodolog'a f&cil. -(&cil de medir (gracia de las marcas radiacti"as . )*n los en+imoinmunoan&lisis se complica porque la en+ima tiene un sustrato espec'fico. -,o debe interferir con la reaccin Ag-Ac. (%ebe ser inocua . -%ebe ser econmica - ,o t-ica (discusin con radioinmunoan&lisis . .ipos de marca: -Radiacti"a -(luorescente. -Luminiscente. -*n+im&ticas (pero-idasa de r&bano picante # fosfatasa alcalina . *nsa#os inmunom$tricos: concentracin del Ac en e-ceso! en el IRMA adem&s la marca es radiacti"a. *squema: diferencias entre los tipos de ensa#o Inmunoensa#os Ac (unido a fase slida ! ambos con el mismo tipo de Ac Marca Limitante Inmunom$tricos(siste ma de saturacin *n e-ceso( para que pueda capturar toda al muestra presente en el sistema *n un segundo Ac ( se obser"a la formacin de un sand/is0 . *ste Ac marcado tambi$n debe estar en e-ceso! para que pueda formar todos los san/is0 posibles dentro del sistema! por lo tanto

*n el ant'geno (es de competencia

en teor'a deber'amos quedar con algunos "ac'os ( de los dos Ac por lo tanto es importante el la"ado para eliminar la marca que sobre. Ag Mol$cula peque1a 2on dos sitios de ( que no tiene unin a dos Ac posibilidad de que se distintos (son 3 le unan dos Ac a epitopos distintos ! por ep'topos distintos) lo tanto es para mol$culas de gran tama1o. ) Ac son mol$culas gigantes! por lo que se necesita dos epitopos distintos # que no interaccionen entre si. %efiniciones: -Anticuerpo de captura (45 Ac : unido al soporte de fase slida (a un tubo o a placa de 67 posillos que es donde se 0acen los IRMA # debe estar en e-ceso. -Anticuerpo de revelado (35 Ac : es aquel que lle"a la marca (en IRMA es radiacti"a .8 tambi$n est& en e-ceso. 9untos forman el sand/is0! donde se tiene la muestra (mol$cula grande con 3 epitopes para que sean reconocidos por los diferentes Ac . La idea es que ambos Ac sean desarrollados en especies distintas! es decir! uno en ratn por ejemplo! # el otro en conejo para que no 0a#a posibilidad de que interaccionen entre ellos en el sistema. *l Ac de re"elado que queda libre se debe eliminar por la"ados sucesi"os. :e tiene Ac de re"elado! el de captura! el Ag! la cur"a est&ndar! el control de calidad! todo lo que se necesita para lle"ar a cabo el m$todo. :e forma el sand/is0! # quedan especies libres! por lo que se requiere de m;ltiples la"ados! #a no es por decantacin! las mol$culas son m&s grandes por lo que no caen f&cilmente. %iagrama: :e tiene Ac de captura (fijado # en e-ceso porque es sistema de saturacin para captar Ag de la muestra ! se forma el complejo (la idea es que no quede Ag en solucin ! luego se agrega el 35 Ac (de re"elado # se forma el sand/is0.

La marca es directamente proporcional a la concentracin del analito que se est& midiendo. :e obtiene una cur"a con pendiente positi"a. Resumen: -:e pueden llamar ensa#o inmunom$tricos! ensa#o tipo s&nd/ic0 o no competiti"o. - .iene dos Ac en e-ceso (de captura # re"elado . -(orma complejo. -(raccin libre se elimina por la"ados. - 2ur"a dosis respuesta es directamente proporcional. %iferencias entre ensa#os: Marca radiacti"a Ac Reaccin Marca 2ur"a dosis respuesta Inmunoensa#os RIA limitante 2ompetencia *n Ag In"ersamente proporcional a la dosis Inmunom$tricos IRMA *n e-ceso :aturacin *n Ac %irectamente proporcional a la dosis

*n el IRMA la marca es radiacti"a (frecuentemente I 43< # se 0ace en placas! las mismas donde se 0acen los *LI:As! # si en la cur"a en "e+ de tener un 8odo se tiene una en+ima es un *LI:A! por lo tanto el nombre de la t$cnica depende de la marca usada. 2omo en IRMA la marca es radiacti"a se miden las cpm (en contadores especiales para placas ! en *LI:A como 0a# en+ima pegada se le debe agregar sustrato para la en+ima # se genera un color # se mide por colorimetr'a la concentracin del analito. Para generar cur"a dosis respuesta se necesita de est&ndares de concentracin conocida! el sistema requiere de Ac de captura que est& en e-ceso! # se tiene 45 est&ndar de concentracin conocida! se tiene Ac de re"elado. 2omo es el p45 est&ndar de concentracin baja! sobra muc0o Ac) que 0a# que eliminar por la"ados! se mide # se obtiene el 45 punto en la cur"a dosis-respuesta. :i se tiene el 35 punto de concentracin ma#or al anterior se cuantifican m&s s&nd/ic0 # se genera cur"a dosis respuesta con pendiente positi"a. :i se quiere saber la concentracin de una muestra problema se interpola en la cur"a. :olamente se puede informar si la interpolacin cae en +ona de *% 3= # de *% >=! si cae m&s abajo! se dice que la concentracin de la muestra es menor a ese punto! porque cero absoluto no e-iste! porque la sensibilidad del equipo no es suficiente como para decir que no 0a# nada! por lo tanto se informa como menor al ;ltimo punto de la cur"a

est&ndar (la concentracin m&s baja . :i da un "alor ma#or! 0a# dos opciones: a "eces en la cl'nica no se debe saber e-actamente que concentracin 0a#! basta con saber que es un "alor patolgico para comprobar el diagnstico! por lo tanto se informa como ma#or al l'mite superior. *n otros casos si es rele"ante! por lo tanto se requiere diluir. *jemplo: determinacin de 0idro-iprogesterona! se 0ace con RIA! # si da sobre el l'mite ma#or de 43!< ! se informa como a ma#or a 43!< # al cl'nico "a a saber que es anormal m&s all& de eso por lo tanto no se dilu#e. ?tro ejemplo: en ensa#o de fertilidad asistida! se necesita saber si el eje est& funcionando! por lo tanto se requiere saber cuanto est& funcionando. :i est& sobre la cur"a se requiere diluir para saber cuanto fue la respuesta efecti"a del eje. ?tro ejemplo: 0a# Ac anti-tiroglobulina ! si dan sobre el rango solo se informa ma#or que@porque si est&n aumentados significa que 0a# una inflamacin a ni"el de la tiroides. Pero si se requieren saber los Ac antitiroglobulina despu$s del tratamiento se "a a solicitar 0acer la dilucin. *st& estandari+ado con cuales se debe diluir # con cuales no. ?tro ejemplo: la prolactina es una 0ormona que si est& alterada es una 0iperprolactinemia! es importante saber en cuanta concentracin est& para determinar el grado de patolog'a de la paciente. *fecto AooB: aparece cuando 0a# e-ceso de Ag # las concentraciones del analito saturan los sitios de unin disponibles sin formar complejos! se tiene tanta de la muestra que se empie+a a aglomerar! se forma como una pelota! donde lo que est& adentro no tiene acceso a los Ac! por lo que se mide es menos de lo que efecti"amente 0a#. Llega un punto donde 0a# que empe+ar a diluir! pero Ccomo saber cuando se est& frente a efecto AooBD no 0a# manera de saberlo a menos que sea una determinacin acompa1ada con otra! por ejemplo un perfil tiroideo! # uno de los par&metros no concuerda! se puede sospec0ar que se est& frente a un efecto AooB! pero si llega muestra aislada! sin 0istorial cl'nico! ni 0a# 0istorial pre"io del paciente! no se tiene como saber. :i 0a# paciente en tratamiento por una 0ormona que est& mu# ele"ada! la prolactina! por ejemplo! si se sabe que "iene con prolactina alta # en el e-amen est& mu# baja! se debe necesariamente diluir para saber si la baja se debe a tratamiento o a efecto AooB. ?tro ejemplo: paciente de nombre femenino! se le pide testosterona # sali mu# alta! se re"is la fic0a cl'nica # se empe+ a buscar los

errores! # se descubri que era tra"esti! ten'a nombre de mujer! pero en las 0ormonas ten'a rango de "arn. 2ontrol de calidad: :i 0a# otro analito en el suero que tiene reaccin cru+ada (porque comparte los mismos epitopes se tiene como resultado un falso positi"o! que tambi$n "ienen incluidas en el inserto. :i *-isten dos especies que comparten un epitope con la muestra problema! 0a# una reaccin que da un falso negati"o! porque no se tiene sistema! como no se asocia al s&nd/ic0 se elimina en los la"ados! por lo tanto no 0a# marca. Presencia de Ac 0eterof'licos: presencia de muc0os autoanticuerpos que pueden unirse a al Ac en ausencia de analito # se "a a obtener una reaccin falso positi"o! se tiene s&nd/ic0! pero no 0a# analito que se quiere medir. :e da frecuentemente en enfermedades autoinmunes. IRMA se reali+a en placa de 67 pocillos la marca es radiacti"a! se forma s&nd/ic0. Aa# "arios s&nd/ic0 0a# uno donde se tiene Ac de captura el Ag # un 35 Ac que lle"a la marca. .ambi$n se tiene Ag en unido al tubo se une el Ac # se tiene un 35 Ac que lle"a la marca. *n *LI:A se tiene Ac de captura la muestra o el est&ndar! se une! se agrega el 3 Ac con la marca # en todos los pasos 0a# un la"ado. :e agrega el Ac 0a# un la"ado! se agrega el sustrato # 0a# otro la"ado. *n el *LI:A se obtiene un color que es medido por un color'metro. CEu$ pasa si se quiere cuantificar Ag o AcD Aa# Ac que necesitan ser medidos en el laboratorio! como el anti-tiroglobulina o antitiropero-idasa. :e tiene un megasand/ic0 puedo cuantificar Ag o Ac # directamente cuantificar Ac. :e tiene en el pocillo! en la fase solida! en "e+ de tener Ac se tiene el Ag! si se quiere medir Ac anti-tiroglobulina! en el pocillo deben "enir los Ag! es decir! la tiroglobulina (eso "iene de fabrica . %espu$s se tiene un Ac anti-IgF # as' se reconoce el Ac unido. Puede 0aber tambi$n competencia de Ag libre con Ag marcado! pero es una competencia dentro de tipo s&nd/ic0. *jmeplo: Bit para medir cortisol sali"al! se tiene el cortisol sali"al del paciente # el que "iene en el Bit (marcado . :e mide el cortisol sali"al porque este no "iene acompa1ado de prote'nas transportadoras! es decir es biolgicamente acti"o.

2uando "iene el Ac en solucin! puede ser porque es m&s estable as' que en la placa. :e tiene s&nd/ic0! pero 0a# una relacin de competencia # no de saturacin (tanto para IRMA como para *LI:A . Gltima diapo: esta dado para *LI:A! pero es lo mismo que para IRMA. :e tiene el pocillo # se quiere medir el analito en amarillo! por lo que se tiene un ensa#o directo! donde se mide en Ac directamente sobre la muestra ( se tiene solo Ac 45 ! pero no est& unido a ninguna fase solida por lo tanto despu$s que se forma el complejo se debe precipitar para poder medirlo. :e tiene un ensa#o indirecto porque se tiene Ac dirigido contra el Ag que no tiene marca # se tiene 35Ac anti IgFD que reconoce # tiene la marca. 2omo no est& unido a un soporte se debe precipitar. :e tiene un sistema de amplificacin donde la marca esta amplificando la se1al porque tiene 0artos complejos de gliadina-biotinaD! pero es solo para en+imas # no es e-trapolable a la radiacti"idad. :e tiene s&nd/ic0 con captura porque se tiene Ac pegado al pocillo # que permite capturar el s&nd/ic0 que se forma! se tiene Ac 35 que no tiene la marca! es una combinacin entre H Ac! un anti IgF. *nsa#o de competencia: entre AcD *nsa#o m;ltiple: donde un Ac reconoce a uno # no a la otra mol$cula. )Lo importante es que 0a# muc0as combinaciones donde en todo 0a# reaccin Ag-Ac para la formacin del complejo # todo se mide porque e-iste una marca la cual da el nombre a la t$cnica. Los sistemas radioensa#os no se pueden automati+ar! por el uso de marca radiacti"a que contaminar'a todo el sistema. Los inmunoensa#os con marca en+im&tica puede ser automati+ado! en el laboratorio se usa sustrato que genera quimioluminiscencia! por lo tanto lo que se "e es un 0a+ de lu+ directamente proporcional si es inmunometrico o in"ersamente proporcional si es de competencia. Los equipos automati+ados a#udan cuando 0a# un flujo importante de muestra.