Hidrolases Sintéticas

Hidrolases Sintéticas:
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA
Perspectivas na Clivagem de Moléculas
do DNA
Professor Dr. Ademir Neves

LABINC – Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia
Departamento de Química – UFSC
E-mail: ademir@qmc.ufsc.br
Fone: 0xx/48/3319219; FAX: 0xx/48/3319711
Florianópolis
2003
Genoma humano 23 3 bilhões de pares de bases

cromossoma do DNA
s
~40 000 Genes Simples mutação de
codificados os quais qualquer gene
são transcritos no ou degradação de uma
mRNA antes da síntese proteína pode
da ter sérias consequências
Proteína (em estudo)
Dada a importância de se manter o código genético e a
função específica de
cada proteína específica, a natureza arquitetou de
forma sábia as ligações
fósforo-diéster para juntar os nucleosídeos no DNA e
RNA e as ligações
A meia vida do DNA
peptídicas que acoplam os para a hidrólise
aminoácidos nasdas ligações
proteínas.
fosfo-diéster - 130 000 a 106 anos a 25 oC e pH-neutro
(RNA – 4 a 103 anos).
Ligações peptídicas – meia vida = 7 anos sob as mesmas
O
Cadeia polipeptídica
O P O CH2 Base
O
O-
H O H R
H
N C C
O X C N C
O P O CH2 Base R H O
-
O
O
X = H, DNA H
= OH, RNA O X
Ironicamente, as mesmas propriedades que fazem com que essas

ligações sejam tão úteis nos biopolímeros, também podem ser
problemáticas.
Ex.: 1) mutações no DNA precisam ser identificadas e
reparadas;
2) mRNA precisa ser hidrolisado para que a proteína
codificada não seja sintetizada de forma desnecessária;
3) proteínas precisam ser degradadas nos seus aminoácidos
correspondentes uma vez exercidass as suas funções.
Natureza utiliza enzimas denominadas de

HIDROLASES E/OU NUCLEASES
=> HIDROLASES SINTÉTICAS
Por que desenvolver hidrolases sintéticas – metalonucleases ?
1) Gerar moléculas capazes de clivar o DNA em sítios específicos não

reconhecidos por enzimas de restrição; Possíveis novas drogas.
2) Utilização no sequenciamento do genoma; endonucleases que reconhecem 4,

6 ou 8 seqüências de bases resulta num grande no. de fragmentos – mais
difícil de serem separados. Nas proteínas muitas vezes ocorre o oposto:
peptidases naturais fornecem fragmentos os quais são muito grandes para o
sequenciamento.
3) Utilização na análise conformacional de ácidos nucléicos e proteínas.
4) Elucidação do papel dos íons metálicos nas hidrolases naturais
5) Vantagem em relação a agentes que clivam o DNA através de processos

oxidativos ( geração de radicais e não produzem fragmentos consistentes
com aqueles produzidos pelas hidrolases naturais – 5’-fosfato e 3’-hidroxil).
Estratégia Utilizada - Hidrolase Sintética

(íon metálico no sítio cataliticamente ativo)
Sítios lábeis cis-

orientados Ativar o substrato
e/ou estabilizar o
Reduzir pKa da H2O estado de transição
coordenada
(fornecer nucleófilo Liberar produtos a uma
em pH ≈ neutro) velocidade razoável
L1 L2 L L
ponte
L1 L2
L OH2 L L
M M M M
L1 ponte L2 L L
OH2 OH2
L OH2
OH2 OH
Complexos binucleares Complexos Mononucleares

Complexos Mononucleares
HISMIMI* HISMIMA**
HN N HN N
N NH
CH3 CH3
N N
N N
O CH3OH/3hs
R-NH2 + R'-C R-N=CH-R' CH3OH
R-NH-CH-R'
H 0 C
0
[H2/Pd/C]
* SCARPELLINI, M., NEVES, A., BORTOLUZZI, A. J., et al. J. Chem. Soc.,Dalton Trans., v. 18, 2616-2623, 2001.
** SCARPELLINI, M., NEVES, A., BORTOLUZZI, A. J., et al. Acta Crystallographica Section C, v. C57, 356-358, 2001.
Complexo 1 Complexo 2
Cl Cl
NH
N H NH
N N N
H3C Cu H3C Cu
N Cl N Cl
N N
C6'
C7' C15' C15 C9 C7
C6
N8' C9' N14 N8
C5' C10
C10'
C4' N14' Cl2
C13 C5
C4
C13'
N1' N11
N3' Cu1' N11' Cu1 N1
C2' C12 N3
C12'
Cl1' C2
Cl2' Cl1
Cu(1)-N(1) 1,9596(19)
Cu(1)-N(11) 1,9872(19) Cu(1)-N(11) 1,9540(19)
Cu(1)-N(8) 2,096(2) Cu(1)-N(1) 1,9662(18)
Cu(1)-Cl(2) 2,2882(11) Cu(1)-N(8) 2,0784(17)
Cu(1)-Cl(1) 2,5789(10) Cu(1)-Cl(1) 2,2875(8)
N(8)-C(9) 1,268(3) Cu(1)-Cl(2) 2,9242(11)
Cl(2)-Cu(1)-Cl(1) 103,22(4) Cl(1)-Cu(1)-Cl(2) 100,23(4)
(τ= 0,14) (τ = 0,03)

Titulação potenciométrica
100 100
90 90
80 80
70 70
OH2 OH2 OH2 OH2
60 60
N N N N N N N N
50 50
Cu Cu Cu
%
Cu
%
N OH2 N OH N OH2 N OH
40 40
30 30
20 20
10 10
0
0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
+
-Log[H ] -Log[H ]
+
pKa 8,94 pKa 9,30
LCu – (OH2)2  LCu –(OH2)(OH ) + H +

Hidrolases Sintéticas: Cl
NH
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA N N
H3C Cu
Voltametria Cíclica: Complexo 1 N
N Cl
CH2Cl2
1,5
+
Fc /Fc Cu /Cu
II I
CH3OH
1,0
0,5
250
II II II I
0,0 Cu Cu /Cu Cu
I (µA)
200
-0,5
-1,0 150
-1,5
100
-2,0 I (µA) II
Cu /Cu
I
+
50 Fc /Fc
-2,5
800 600 400 200 0 -200 -400 -600 -800 -1000 -1200 0
E (mV)
-50
-100
CH3OH (pHap = 9)
1000 500 0 -500 -1000 -1500
E (mV)
II II II I
Cu Cu /Cu Cu
150
100 CH2Cl2: -0,676 V vs Fc+/Fc

I (µA)
CH3OH: -0,553/-1,263 V vs Fc+/Fc

50
+
Fc /Fc
-50
CH3OH (pHap = 9): -1,207 V vs Fc+/Fc
1000 500 0 -500 -1000 -1500
E (mV)
NH
H3C Cu
N Cl
N
RPE: complexos de Cu II
sete linhas:
Complexo 1: etanol/H2O g ≅ 4,3 e A// = 82 x 10-4 cm-1
6000
4000 estado triplete

2000 interação entre dois
centros de CuII
Intensidade
-2000 1400
1200
1000
800
transição proibida ∆Ms = 2
-4000 600
400
intensidade
200
-200
-6000 -400
-600
-800
-1000
-1200
transições permitidas
1000 1200 1400 1600 1800 2000
-8000 campo (G)
2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
Campo (G) ∆Ms= ± 1

g1 = 1,950
g// = 2,240
g⊥ = 2,062
Equilíbrio dímero-monômero
A// = 164,5
NH
H3C Cu
N Cl
N
Síntese do complexo binuclear
HN
N N 2+
Cl
Cu CH3
[Cu(CH3CN)4]ClO4 + HISMIMA 1) CH3CN / CH3OH / argônio HO N N H2O / pH 9,3 / NaClO4.H2O N
NH
N
2) O2 / sopropanol
N N OH .(ClO4-)2 H3C Cu
H3C N Cl
Cu N
N N
NH
Cu2C20H32N10O10Cl2. 1/2 CH3CN

(M = 791,04 g.mol-1)
60 C, 31,88(32,12)
50
H, 4,27(4,12)
%T 40
N, 18,89 (18,04)
30
ΛM = 304 Ω-1.cm2. mol-1 em CH3CN (2:1)
20
10 IV (KBr): ν(OH) 3616/3539; ν (NHar)

0 3242; ν (NHsec) 3125; ν (CHar/CHalif)
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
2949-2864; ν (C=N/C=C) 1619-1428;
ν (ClO4) 1091; δ (CHar) 749 em cm-1.
NH
H3C Cu
Magnetoquímica do complexo binuclear sólido N
N Cl
c:/Origin50/simi.opj - Marciela dimero Cu-imina

80000
70000 3,0
B
C
D
60000 E
2,5
χ [ 10 cm /mol ] 50000
-1
J = -13 cm g = 2.0
µ eff (BM)
40000 -6
χ par = 20 % TIP = 1020 x 10 cm /mol
3
2,0
3
θC = -140 K θI = -0.3 K
30000 R = 1.260
-6
20000 µeff (2K) = 1.06 BM

1,5 1
µeff (300K) = 3.04 BM
6 10000
1,0
0
0 50 100 150 200 250 300
Temperature (K)
J = -13 cm-1 Acoplamento antiferro

Dependente:
* Ângulo Cu/ O\Cu
* distância
entre centros de CuII
Reatividade frente a um substrato modelo
• Hidrólise 2,4-BDNPP
NO2
O O-
O2N O P O- NO2
O + catalisador + catalisador + 2,4-dinitrofenilosfato
NO2
NO2
NO2
Complexos
1 e 2
Efeito do pH
7
5,0
6
4,5
5 4,0
kobs (x10 .s )
-1
kobs(x10 .s )
-1
3,5
5
5
3,0
3
2,5
2 2,0
1,5
1
7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0
7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5
pH pH
8,78 ± 0,05 9,38 ± 0,02

(8,94) (9,30)
[Cu(L)(H2O)2]  [Cu(L)(H2O)(OH)]+ + H+
Efeito da concentração do complexo
5 4,0
3,5
4
3,0
kobs (x 10 .s )
-1
3
kobs (x 10 .s )
-1
5
5
5 2,5
4
2 4
kobs (x 10 .s )
3
-1
kobs (x 10 .s )
-1
3
2,0
5
5
2
2
1 1
1
1,5
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 10
3 -1 3 -1
[complexo] (x 10 .mol.L ) [complexo] (x 10 .mol.L )
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 1,0
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
1/2 3 1/2 -1/2
[complexo] (x 10 .mol .L ) 1/2 3 1/2 -1/2
[complexo] (x 10 .mol .L )
k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1) k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1)

(6,67 ± 0,17) x 10-4 (3,07 ± 0,35) x 10-4
Efeito da concentração do complexo
K2
-
LCu + OPO(OR)(OR´) LCu-OPO(OR)(OR´)
k3
-
LCu-OPO(OR)(OR´) OR + 2-OPO2(OR´)
[ LCu ] = (−0,5 + (2 K f [CuT ]) 0,5
d [OR ] ( −0,5 + (2 K f [CuT ]) 0,5
v= = k .[ ]
dt 2K f
k = K 2 .k 3 .[ −OPO(OR)(OR´)]
Complexo Kf (mol-1.L) k (s-1)

1 11,9 x 103 5,7 x 10-6
2 12,8 x 103 4,3 x 10-6
Efeito da concentração do substrato

5 6
5
4
4
v0(x10 .mol.L .s )
v0(x10 .mol.L .s )
-1
-1
3
-1
-1
3
9,00E+008
5,00E+008
9
2 8,00E+008
9
4,50E+008
1/v0(mol .L.s)
7,00E+008
2 4,00E+008
1/v0(mol .L.s)
6,00E+008
-1
3,50E+008
5,00E+008
-1
3,00E+008
4,00E+008
1 3,00E+008
1 2,50E+008
2,00E+008 2,00E+008
100 200 300 400 500 600 700 800 1,50E+008

100 200 300 400 500 600 700 800 900
-1
1/[2,4-BDNPP] (mol .L) 1/[2,4-BDNPP] (mol .L)
-1
0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8
3 -1 3 -1
[2,4-BDNPP] (x10 .mol.L ) [2,4-BDNPP] (x10 .mol.L )
Complexo Vmax(mol.L-1.s-1) KM (mol.L-1) kcat(s-1) Kass(mol-1.L)a taxab
1 16,4x10-9 17,3x10-3 3,28 x10-4 57,8 121

2 7,2x10-9 3,03x10-3 1,40x10-4 330,0 51,9
a
Kass = 1/KM; btaxa = kcat/ke, onde ke = 2,7x10-6 s-1 a 50 0C (hidrólise da reação espontânea)
NH
H3C Cu
Mecanismo Proposto para (1) N
N Cl
HN H
N
N
CH3
2+ Neves, Scarpellini, Hörner
Cu
HO N N Terenzi, Inorg. chem.
N N OH 2003, Submetido
H3C Cu
N N
H NH
(c)
Kf
Cl OH2 2+ OH2 +
H NH H NH H NH
N N N N N N
H3C Cu
H2O
H3C Cu
K1 Cu
H3C N
N Cl N OH2 OH
N N N
(a) (b) (d) O2N
NO2
O
K2
-O P NO2
O
O2N
O
H NH H NH
N N N N
H3C N Cu K3 Cu
H3C N
N O N OH
O O
P O
O- O2N
NO2 P O
O O
NO2 O NO2
NO2 O2N
NO2 NO2
(f) (e)
Micrografia Eletrônica das formas do DNA plasmidial

Hidrolases Sintéticas: OH2
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA NH
N N
H 3C Cu
N
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA N OH2
pelo complexo mononuclear (1) Complexo 1
Neves, Scarpellini, Hörner

Terenzi, Inorg. Chem.
2003, in press
1 2 3 4
0,00 0,375 1,250 3,750 mM de 1
Degradação do DNA Genômico – pH = 8,0
2) 91,56 % da banda de maior peso molecular com: 8,50 % de degradação;

3) 11,99 % da banda de maior peso molecular com: 88,01 % de degradação;
4) 4,13 % da banda de maior peso molecular com: 95,87 % de degradação.
N N
H 3C Cu
N OH2
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA N
Complexo (1)
II circular
I superenovelada
1 2 3 4 5
Degradação do DNA Plasmidial pBSKII – pH = 8,0
1) 0,375 mM do complexo: 87,00 % da forma I e 13,00 % de degradação F II;

2) 0,750 mM do complexo: 86,74 % da forma I e 13,26 %
3) 1,250 mM do complexo: 85,31 % da forma I e 14,65 % “
4) 1,880 mM do complexo: 84,69 % da forma I e 15,31 % “
5) 0,000 mM do complexo:
N N
H 3C Cu
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA
N OH2
N
Complexo 1
II
I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Determinação do mecanismo: Complexo em [1] = 1,88 mM
1) 0 mM do complexo
2) 1,88 mM do complexo
3) 1,22 µM de Ce4+ (é só Ce4+ no DNA)
4) 1,22 µM de Ce4+ + 1,88 mM do complexo.
Seguindo a seqüência, 5,6,7,8 temos DMSO 0,04 M e 9,10, 11, tiouréia 0,04mM.
Não houve nenhuma inibição na degradação ⇒ mecanismo hidrolítico

N N
H 3C Cu
N OH2
N
Reação na ausência de O2: Complexo em [1] = 1,88 mM Complexo 1
- Não houve inibição na degradação
Não houve religação (ver banda 6).

FII Porém, vemos na banda 4 que o
FIII
complexo atua na ligase
FI
1 2 3 4 5 6 7
Religação através da T4DNA ligase - 5’-fosfato e 3’-hidroxil
Banda 1 – Padrão DNA

Banda 2 – DNA cortado com a EcoRI (enzima de restrição da Escherichia coli)
Banda 3 – Adição da T4DNA ligase ( religação)
Banda 4 – T4DNA ligase + Complexo + DNA + EcoRI
Banda 5 – Complexo + DNA
Banda 6 - Complexo + DNA + T4DNA ligase
N N
H 3C Cu
N OH2
N
Complexo 1
pH 7.0 7,5 8,0 8,5 9,3
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
1 = complexo
2 = padrão
Degradação do DNA plasmidial em diferentes pHs a 50 oC, [1] = 1,88 mM, durante 24 h
pHs e Tris Tris Tris Tris CHES

tampões pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0 pH 8,5 pH 9,3
% da 85,53 36,40 26,81 6,96 1,44

forma I
pKa = 8,94
% de
14,67 63,60 73,19 93,04 98,56
degrada-
ção da
forma I
Anaerobic x aerobic plasmid DNA cleavage. Lanes 13, anaerobic
conditions; Lanes 46. aerobic conditions; Lanes 1 and 4, control plasmid
DNA; Lanes 2 and 5, plasmid DNA, 0.1mM Fe(EDTA)2, 10mM DTT;
Lanes 3 and 6, plasmid DNA, 3.75mM complex 1. All samples were
incubated in 100mM CHES buffer pH 9.30 for 4h at 50 °C. Above the
image of the gel is shown a histogram of the quantified plasmid DNA
forms observed in the gel.
10 0
F I
P la s m id D N A %
F II
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5 6
F II
FI
. Kinetic analysis of complex 1 DNA cleavage activity.
Plasmid DNA (pBSKII. 4 mM phosphodiester links) and 2
mM Complex 1 were incubated at pH 9.3 (200 mM CHES).
50 °C for 0, 2, 4, 6, 8 or 24 h (lanes 1 to 6. respectively).
1 2 3 4 5 6
F II
FI
N N
H 3C Cu
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA N
N OH2
Determinação do mecanismo: Cinética em gel-agarose Complexo 1

Complexo em [1] = 2,11 mM, Tampão CHES pH 9,3;
[DNA: pBSKII] em excesso com 2, 6, 10 ligações
fosfato: uma de complexo
y = (y0 – const) exp(-kobsx) + const
1,0 y = (100 – y0)(1- exp(-kobsx))

0,5
kobs’= Vmax’[cat]/(KM + [cat])
0,0
kobs = Vmax[subst]/(KM + [subst])

kobs
-0,5
-1,0 kobs = 0,0016 min-1

-1,5
T1/2 = 384 min
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Tempo (minutos)
Fator catalítico de ~107

His 325
His 323
Fosfatases (hidrolases) e
OH
nucleases catalisam a
His 286
hidrólise de ésteres de fosfato Asp 135
Fe H2O
Zn
de aminoácidos fosforilados e OH
sacarídeos, nucleotídeos, DNA Asn 201
e RNA, envolvendo a quebra da Asp 164

Tir 167
ligação P-O sob condições
fisiológicas em vitro. Estrutura cristalina da
fosfatase ácida púrpura de
Em vivo se propõe: Fe(III)Zn(II).
(STRÄTER, N. et al. Science 1995, 268, 1489)
 Degradação de eritrócitos
 Fonte de radicais hidroxila – degradação óssea
 Liberação de fosfato de compostos organofosforados

Estrutura tridimensional da FeIIIZnII - PAP

Espectros mostrando a interconversão da forma

púrpura (Fe2III, 550 nm) na forma rosa (FeIIIFeII,
505 nm) da UFPAP .

Espectros de EPR em vários valores de pH e gráfico

do % da espécie em baixo pH versus pH para a
forma de valência mista da bsPAP.
Espectros Mössbauer da forma ativa a 185 K

(A) e inativa a 10 K(B) da UFPAP.
• Parâmetros Mössbauer
δ(mm/s) ∆Eq(mm/s)
FeIIFeIII 1.22 2.86
0.52 1.83
FeIIIFeIII 0.46 2.12

0.55 1.65
Mecanismo proposto para as PAPs

na hidrólise de ésteres de fosfato:
(GANI, D., WILKIE, J. Structure and Bonding 1997,
89, 133)
Enz Enz Enz Enz

- 3+
M
2+ 3+
Fe ROPO3H M
2+
Fe -ROH 2+ 3+ + H O 2+ 3+
M Fe 2 M Fe
- H2O
OH -O OH -O -O
H2O O OH
P OH P P OH
RO
O O OH O OH
- H2PO4-
+ H2O
Existem dois mecanismos alternativos propostos por Que e Averill

Mecanismo proposto por Lindqvist e

colaboradores para a hidrólise de ésteres de
fosfato promovida pelas PAPs.
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA N
Cl
Perspectivas na Clivagem hidrolítica do DNA OH N
OH
Complexo binuclear de Fe(III)
Cl
Cl
N
N21
O1'
O
Fe
O2
H2O O
O3W N1' N
N1
O3W'
N Fe Fe
O2'
Fe'
O OH2
N21'
O1
O
N
Cl'
Cl
Complexo 6
pKa = 5.00
[Fe2(BPClNOL)2(H2O)2 ]2+ [Fe2(BPClNOL)2(H2O)(OH)]+
pKa = 7.03
[Fe2(BPClNOL)2(H2O)(OH)]+ [Fe2(BPClNOL)2(OH)2]
pKa = 9.65 -
[Fe2(BPClNOL)2(OH)2] [Fe2(BPClNOL)2(OH)3]
O
H 2O O N
N Fe Fe
O OH2
O
N
Cl
Complexo 6
0 375 µ M
pH 6.1
II Buffer pH 6.1
III 100 I
80 II
plasmid form (%)

I 60 III
pH 8.0 40
II total cleavage (%)
20
III 0
I 0 75 150 250 375
Complex concentration
Buffer pH 8.0
100 I
80 II Degradação do DNA
Plasmidial pBSKII
plasmid form (%)
60 III
40
total cleavage (%)
20
0
0 75 150 250 375 Neves e Terenzi
Complex concentration Inor. Chem.Commun.4 (2001)
388-391.
Cl
O
H 2O O N
N Fe Fe
O OH2
O
Mecanismo Proposto Cl
N
Complexo 6
- O complexo 6 não reage com diésteres de

fosfato devido à configuração-anti das
moléculas de H2O
- O acesso de 1 ao DNA é proposto com base nas

interações eletrostática e hidrofóbica (sais de FeIII não
degradam o DNA)
-A largura (11,7 Å) e profundidade (8,8 Å do sulco maior no

B-DNA dupla-fita pode facilmente acomodar o complexo 1
no qual as duas moléculas de água/OH- estão separadas
por 7,7 Å. Isto também explica a maior atividade
hidrolítica em pH 8 (2 grupos OH-).
Cl
O
H 2O O N
N Fe Fe
O OH2
Mecanismo Proposto O
N
Cl
Complexo 6
Metodologia
Síntese do ligante H2BPBPMP
CH3 N
CH3 CH3 CH3
N
NH
Reimer-Tiemann HCHO 2
NaOH/CHCl3/H2O HCl N
O OH
OH OH O Cl OH O
N
NaBH4
HO
OH
CH3 CH3 N CH3 N
NH
N
N SOCl2
N N N N
N N
OH Cl OH OH OH
N N
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA O
N N
N Fe Zn N
O O N
Novas Hidrolases Sintéticas FeZn OH
H
OH2
C5
Fe(1)-O(20)
C15 1.890(3)
C14 C16 Fe(1)-O(61)
C36
C46
C45 C35 1.967(3)
C11
C13
C31 Fe(1)-O(1)
C2
C34 C30
C41 2.006(3)
C3 C44 C12
C40
C33 C20
Fe(1)-O(71)
C43 N1
N42
N32
C21 C26 2.034(3)
C50 N4 O1
C25 Fe(1)-N(32)
Zn1 Fe1
C51
O71
2.182(4)
C63 C22
C56 O20
O62
O61 C24
Fe(1)-N(1)
N52 C23
O72 C73
2.214(3)
C55
C53 C64 C74 Fe(1)-Zn(1)
C54
3.490(10)
Zn(1)-O(72)
2.030(3)
Hidrolases Sintéticas: N O N
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA N Fe Zn N
O O N
H
Titulação Espectrofotométrica OH OH2
2,5 1,0 1,0
0,8 0,8
pH 4,3-5,6 pH 5,6-7,2
0,6 0,6
2,0
A
A
0,4 0,4
0,2 0,2
0,0 0,0
1,5 300 400 500 600 700 800 300 400 500 600 700 800
nm 1,0 nm
0,8
pH 7,2-10,0
A
0,6
1,0
A
0,4
0,2
0,5 0,0
300 400 500 600 700 800
nm
0,0
300 400 500 600 700 800 900
Titulação espectrofotométrica
nm – espécies em solução
N O N
N Fe Zn N
O O N
H
Distribuição das Espécies a partir da OH OH2
Titulação Espectrofotométrica
N O N N O N
N Fe Zn N N Fe Zn N
O O O N OH N
O
OH OH2 OH OH
pKa = 4,86 pKa = 6,00 pKa = 7,22

III O II
Fe M III O II III O II
pKa1
O O Fe M Fe M
O O O O O O
OH2 OH2 OH OH2
III O II III O II III O II

pKa3 pKa2
Fe M Fe M Fe M
O O OH2
OH H OH OH H OH2 OH OH2
N O N
N Fe Zn N
O O N
Cinética de Hidrólise do 2,4-BDNPP OH
H
OH2
Efeito do pH (pKa cinético)
NO2
O O-
O2N O P O- NO2
2
O + catalisador + catalisador + PO43-
NO2
NO2
NO2
7,00
Neves et al. Inorg. Chem. 2002, 41, 5643
pKa1= 4,63 pKa2 = 7,84
6,00
5,00
pKa1 = 4.86 pKa2 = 7.22
-1
v0(.10 ) mol .L.s
4,00
Potenciométrico
-1
3,00
9
2,00
1,00
Velocidade inicial (vo)
0,00
em função do pH. Solvente
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
água/acetonitrila 50%,
pH tampões MES, HEPES e
CHES 25 mM, LiClO4 0,1 M,
[Complexo] = 4,0.10-5 M e
N O N
N Fe Zn N
O O N
Cinética de Hidrólise em Função da OH
H
OH2
Concentração do 2,4-BDNPP
1,4
6
1,2
5
1 / V0 (x10 ) mol .L.s

-1
V0 (x10 ) mol.L .s
1,0
-1
-1
4
0,8
-8
8
3
0,6
2
0,4
0,2 1
0,0 0
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0 500 1000 1500 2000
3 -1 3 -1
[S] (x10 ) mol.L 1 / [S] (x10 ) mol .L
Velocidade inicial (vo) Vmáx = 2,92.10-8 mol.L-1.s-1

em função da conc. de Km = 8,10.10-3 mol.L-1 kcat
substrato. Solvente = 7,31.10-4 s-1
água/acetonitrila 50%, MÊS 25 (khidrólise espontânea = 1,8.10-7 s-1
mM, LiClO4 0,1 M, [Complexo] kcato /khidrólise espontânea
a 25 C
= 4,0.10-5 M e [substrato] = = 4061
-3 o
Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA N O N
N Fe Zn N
O O N
Mecanismo Proposto OH
H
OH2
III
O II III
O II
H2O / EtOH
Fe Zn Fe Zn
Ac Ac
Ac OH2 OH2
pKa1 = 4.86 (4,63 cinético)
(7,84 cinético)
O O O II
III II pKa2 = 7.22 III II pKa2 = 6.0 III
Fe Zn Fe Zn Fe Zn
OH OH Ac
OH OH OH OH2 OH OH2
PO3-(O-R)2-
H2O/OH
(RO)2PO2-
O2N III
O II O II
III
Fe Zn Fe Zn -
X + OR
R= NO2 X
HO O O O
P OR P
O O OR
OR
2+
CH3 (ClO4-)2
N N
O N
N 3+
2+
Zn Fe
1 H2L1 + 1 ZnII(ClO4)2 + 1 FeIII(ClO4)3 + 3 NaOH → N
OH
O
OH2
Primeiro exemplo de complexo FeIII-OH-ZnII

C17
C11 C12
C53
C13
C54 C16 C19
C52
O3 C47
C56 N4
C55 C15 C14
C18
C26 C46
N5 C51 C45
C36 N1 O1
O4
O2 Fe
Zn
C25 C41
C35 N2 C44
C24
N3
C42
C43
C34 C21
C31 C23
C33 C22
C32
FeIII....ZnII = 3,05 Å – 3,1 Å na enzima

A B C
100
80
60
%
pKa1 pKa2
40
20
0
2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0
+
-Log[H ]
O II pKa1 O O
III III II pKa2 III II
Fe M Fe M Fe M
O O O
OH2 H OH2 OH H OH2 OH H OH
Hidrolases Sintéticas: 46
 Eletroquímica
[FeIIIZnIIL1(OH)(H2O)](ClO4)2
12,0
10,0
H2O
8,0
pH = 4,0 - 6,3
6,0
4,0
2,0
I (µA)
0,0
-2,0
-4,0
-6,0
-8,0
-10,0
600 400 200 0 -200 -400 -600 -800 -1000
E (mV)
(H2O)Fe(OH)Zn(H2O)  (HO)Fe(OH)Zn(H2O)
E1/2 (pH = 4,0) = - 0,06 V vs NHE

pK = 4,7 comparável aos
E1/2 (pH = 6,3) = - 0,18 V vs NHE
pKas cinético e termod.
de 4.66.
FeIII....ZnII = 3.05 Å – 3.1 Å na enzima
2+
CH3 (ClO4-)2 His 325
His 323
OH
His 286
N N Asp 135
Fe H2O
Zn
O N
N 3+ OH
2+
Zn Fe
O Asn 201
OH
N OH2 OH2 Asp 164
Tir 167
2,0
16,0
14,0
B 1,8
1,6
V0 x 10 (mol.L .s )
-1
12,0 1,4 3,0
V0 x 10 (mol.L .s )
-1
-1
10,0 1,2
-1
-8
1,0 2,0
(1 / V 0) x 10
8,0
8
0,8
9
6,0
1,0
0,6
4,0
0,4
2,0 0,0
0,2 0 200 400 600 800 1000
1 / [S]
0,0 0,0
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010
3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 -1
pH [S] (mol.L )
 Efeito isotópico do deutério kH / kD = 0,93

kcat/khidrólise espontânea = 104
Kass = 62.5 mol.L-1
No. de turnovers = 180

Mecanismo Proposto em função dos dados experimetais
N N
O N N
N III II N O
Zn N III II N
Fe
N N Fe Zn
O O N 2,4-dinitrofenolato
O N O OH N
N III II H
Zn BDNPP OH O
Fe O O
O O N P O NO2 P
H O O O
OH OH2 O
O 2N
O 2N NO2
NO2
O 2N
BDNPP
2,4-dinitrofenilfosfato
(monoéster)
O N
N
N Fe Cu
N Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH.
O
O H N Reação de Fenton
OH2
OH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
N
S
Figure X. Cleavage profile of plasmid DNA in the presence of increasing concentrations

of complex 1. Complex 1 concentration (µM) varied from 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5,
and 0 (lanes 1 to 9, respectively). Nicked (N) and supercoiled (S) plasmid DNA are
depicted in the figure. Lane 10, 11, 12, 160 µM complex 1 in the presence of 20%
glycerol (lane 10), 20% DMSO (lane 11) or control buffer (lane 12).
Agradecimentos
Prof. Dr. Hernán Terenzi – Dpto. Bioquímica – Nicholas

UFSC Ademir “Piu”
Prof. Dr. Wilson Ortiz – Dpto. Física – UFSCar Alessandra
Prof. Dr. Antônio S. Mangrich - UFPR Ricardo
Prof. Dr. Valderes Drago – Dpto. Física – UFSC Rosely Peralta
Dra. Marciela Scarpellini (USA) Annellise
Dra. Liane Márcia Rossi”(USA) Rafael
Dr. Adolfo Horn Jr. (UENF – RJ) Patricia
Dr. Mauricio Lanznaster (Detroit – USA) Maurício
Dra. Rosmari Hörner (Santa Maria _UFSM) Ivan
MSc. René Nome – USA – Chicago Renata
Dra. Christine Fernandes – UFRJ

Hidrolases Sintéticas

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Hidrolases Sintéticas:

Perspectivas na Clivagem de Moléculas do DNA

Professor Dr. Ademir Neves

Genoma humano 23 3 bilhões de pares de bases

Ironicamente, as mesmas propriedades que fazem com que essas

Natureza utiliza enzimas denominadas de

Por que desenvolver hidrolases sintéticas – metalonucleases ?

1) Gerar moléculas capazes de clivar o DNA em sítios específicos não

2) Utilização no sequenciamento do genoma; endonucleases que reconhecem 4,

3) Utilização na análise conformacional de ácidos nucléicos e proteínas.

4) Elucidação do papel dos íons metálicos nas hidrolases naturais

5) Vantagem em relação a agentes que clivam o DNA através de processos

Estratégia Utilizada - Hidrolase Sintética

Sítios lábeis cis-

Complexos binucleares Complexos Mononucleares

Cl(2)-Cu(1)-Cl(1) 103,22(4) Cl(1)-Cu(1)-Cl(2) 100,23(4)

(τ= 0,14) (τ = 0,03)

pKa 8,94 pKa 9,30

LCu – (OH2)2  LCu –(OH2)(OH ) + H +

100 CH2Cl2: -0,676 V vs Fc+/Fc

CH3OH: -0,553/-1,263 V vs Fc+/Fc

4000 estado triplete

-8000 campo (G)

2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600

Campo (G) ∆Ms= ± 1

Cu2C20H32N10O10Cl2. 1/2 CH3CN

10 IV (KBr): ν(OH) 3616/3539; ν (NHar)

c:/Origin50/simi.opj - Marciela dimero Cu-imina

20000 µeff (2K) = 1.06 BM

0 50 100 150 200 250 300

J = -13 cm-1 Acoplamento antiferro

Reatividade frente a um substrato modelo

8,78 ± 0,05 9,38 ± 0,02

Efeito da concentração do complexo

k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1) k1/2 (mol-1/2.L1/2.s-1)

Efeito da concentração do complexo

[ LCu ] = (−0,5 + (2 K f [CuT ]) 0,5

d [OR ] ( −0,5 + (2 K f [CuT ]) 0,5

Complexo Kf (mol-1.L) k (s-1)

Efeito da concentração do substrato

100 200 300 400 500 600 700 800 1,50E+008

Complexo Vmax(mol.L-1.s-1) KM (mol.L-1) kcat(s-1) Kass(mol-1.L)a taxab

1 16,4x10-9 17,3x10-3 3,28 x10-4 57,8 121

(a) (b) (d) O2N

Micrografia Eletrônica das formas do DNA plasmidial

pelo complexo mononuclear (1) Complexo 1

Neves, Scarpellini, Hörner

0,00 0,375 1,250 3,750 mM de 1

Degradação do DNA Genômico – pH = 8,0

2) 91,56 % da banda de maior peso molecular com: 8,50 % de degradação;

Degradação do DNA Plasmidial pBSKII – pH = 8,0

1) 0,375 mM do complexo: 87,00 % da forma I e 13,00 % de degradação F II;

Determinação do mecanismo: Complexo em [1] = 1,88 mM

Não houve nenhuma inibição na degradação ⇒ mecanismo hidrolítico

Reação na ausência de O2: Complexo em [1] = 1,88 mM Complexo 1

- Não houve inibição na degradação

Não houve religação (ver banda 6).

Religação através da T4DNA ligase - 5’-fosfato e 3’-hidroxil

Banda 1 – Padrão DNA

pHs e Tris Tris Tris Tris CHES

% da 85,53 36,40 26,81 6,96 1,44

Determinação do mecanismo: Cinética em gel-agarose Complexo 1

1,0 y = (100 – y0)(1- exp(-kobsx))