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Agrobiologia
ISSN 1517-8498 Junho/2006

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http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/291/5507/1221/F1 Credit: Joe Sutliff

Repblica Federativa do Brasil Luiz Incio Lula da Silva Presidente Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento Roberto Rodrigues Ministro Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Conselho de Administrao Luis Carlos Guedes Pinto Presidente Silvio Crestana Vice-Presidente Alexandre Kalil Pires Cludia Assuno dos Santos Viegas Ernesto Paterniani Hlio Tollini Membros Diretoria Executiva Silvio Crestana Diretor Presidente Jos Geraldo Eugnio de Frana Kepler Euclides Filho Tatiana Deane de Abreu S Diretores Executivos Embrapa Agrobiologia Jos Ivo Baldani Chefe Geral Eduardo Francia Carneiro Campello Chefe Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento Rosngela Straliotto Chefe Adjunto Administrativo

ISSN 1517-8498 Junho/2006

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Centro Nacional de Pesquisa em Agrobiologia Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos 213
Genmica e Protemica

Ktia Regina dos Santos Teixeira Jean Luiz Simes Arajo

Seropdica RJ 2006

Exemplares desta publicao podem ser adquiridas na: Embrapa Agrobiologia BR465 km 7 Caixa Postal 74505 23851-970 Seropdica/RJ, Brasil Telefone: (0xx21) 2682-1500 Fax: (0xx21) 2682-1230 Home page: www.cnpab.embrapa.br e-mail: sac@cnpab.embrapa.br
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Expediente: Revisor e/ou ad hoc: Luc Felicianus Marie Rouws Normalizao Bibliogrfica: Dorimar dos Santos Felix Editorao eletrnica: Marta Maria Gonalves Bahia 1 impresso (2006): 50 exemplares

T266

Teixeira, Ktia Regina dos Santos Genmica e protemica / Jean Luiz Simes Arajo. Seropdica: Embrapa Agrobiologia, 2006. 37 p. (Embrapa Agrobiologia. Documentos, 213). ISSN 1517-8498 1. Genma. 2. Protema. 3. DNA. 4. Cromossoma. 5. cido nuclico. I. Simes-Arajo, Jean Luiz, colab. II. Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa de Agrobiologia (Seropdica, RJ). III. Ttulo. IV. Srie. CDD 572.86
Embrapa 2006

Autores
Ktia Regina dos Santos Teixeira
Biloga, PhD em Biologia Celular e Molecular, Pesquisadora da Embrapa Agrobiologia. BR 465, km 7 Caixa Postal 74505, Cep 23851-970, Seropdica/RJ e-mail: katia@cnpab.embrapa.br

Jean Luiz Simes Arajo

Engenheiro Agrnomo, PhD em Gentica de Plantas, Pesquisador da Embrapa Agrobiologia BR 465, km 7, Caixa Postal 74505, Cep 23851-970, Seropdica/RJ e-mail: jean@cnpab.embrapa.br

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MARGULIES, M.; EGHOLM, M.; ALTMAN, W. E.; ATTIYA, S.; BADER, J. S.; BEMBEN, L. A.; BERKA, J.; BRAVERMAN, M. S.; CHEN, Y. -J.; CHEN, Z.; DEWELL, S. B.; DU, L.; FIERRO, J. M.; GOMES, X. V.; GODWIN, B . C.; HE; W.; HELGESEN, S.; HO, C. H.; IRZYK, G. P.; JANDO, S. C.; ALENQUER, M. L. I.; JARVIE, T. P.; JIRAGE, K. B.; KIM, J. -B.; KNIGHT, J. R.; LANZA, J. R.; LEAMON, J. H.; LEFKOWITZ, S. M.; LEI, M.; LI, J.; LOHMAN, K. L.; LU, H.; MAKHIJANI, V. B.; MCDADE, K. E.; MCKENNA, M. P.; MYERS, E. W.; NICKERSON, E.; NOBILE, J. R.; PLANT, R.; PUC, B. P.; RONAN, M. T.; ROTH, G. T.; SARKIS, G. J.; SIMONS, J. F.; SIMPSON, J. W.; SRINIVASAN, M.; TARTARO, K. R.; TOMASZ, A.; VOGT, K. A.; VOLKMER, G. A.; WANG, S. H.; WANG, Y.; WEINER, M. P.; YU, P.; BEGLEY, R. F.; ROTHBERG, J. M. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature , London, v. 437, n. 7057, p. 376-380, 2005. MAXAM, A. M.; GILBERT, W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. In: GROSSMAN, L.; MOLDAVE, K. (Ed.) Methods in enzymology. New York: Academic, 1980. p. 499-559. MONTI, M.; ORRU, S.; PAGNOZZI, D.; PUCCI, P. Functional Proteomics. Clinica Chimica Acta, Amsterdam, v. 357, p. 140150, 2005. NELSON, D. L.; COX, M. M.; LEHNINGER, A. L. Principles of biochemistry. 3. ed. New York: W. H. Freeman & Company, 2000. 1200 p. PANICKER, R. C.; CHATTOPADHAYA, S.; YAO, S. Q. Advanced analytical tools in proteomics. Analytica Chimica Acta, Amsterdam, v. 556, p. 69-79, 2006. RABILLOUD, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis, Germany, v. 19, p. 758-760, 1998. RAMSTRM, M.; BERGQUIST, J. Miniaturized proteomics and peptidomics using capillary liquid separation and high resolution mass spectrometry. FEBS Letters, Copenhagen, v. 567, p. 9295, 2004.
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Apresentao
A preocupao crescente da sociedade com a preservao e a conservao ambiental tem resultado na busca pelo setor produtivo de tecnologias para a implantao de sistemas de produo agrcola com enfoques ecolgicos, rentveis e socialmente justos. O enfoque agroecolgico do empreendimento agrcola se orienta para o uso responsvel dos recursos naturais (solo, gua, fauna, flora, energia e minerais). Dentro desse cenrio, a Embrapa Agrobiologia orienta sua programao de P&D para o avano de conhecimento e desenvolvimento de solues tecnolgicas para uma agricultura sustentvel. O documento 213/2006 aborda a questo da genmica e Protemica no contexto do avano de conhecimento na rea. O documento foi escrito com a finalidade de fornecer conhecimentos bsicos das facilidades da genmica e protemica hoje disponvel na literatura. O documento procura introduzir o leitor na rea de genmica e discute os diferentes mtodos e estratgias de sequencimento completo de genomas e apresenta os diferentes programas de sequencimaneto no pas. Da mesma forma, faz uma introduo a rea de protemica e discute os mtodos disponveis para o avano de conhecimento da protemica de expresso, funcional e estrutural. O documento est apresentado numa forma bastante amigvel que permitir ao leitor conhecer um pouco da rea sem maiores dificuldades. Jos Ivo Baldani Chefe Geral da Embrapa Agrobiologia

SUMRIO
1. Introduo................................................................................ 2. Introduo a Genmica ......................................................... 2.1. O Sequenciamento de DNA ........................................ 2.2. Sequenciamento automtico de DNA ....................... 2.3. Estratgias para sequenciamento completo de genmas......................................................................... 2.3.1. Sequenciamento hierrquico ........................... 2.3.2. Seqenciamento por fragmentos aleatrios (Shotgun) ........................................................................ 2.4. Pirosseqenciamento: nova alternativa para o seqenciamento rpido de genmas......................... 3. Introduo a Protemica ....................................................... 3.1. Anlise do perfil de protenas expressas atravs de eletroforese bidimensional (2D-GE)..................... 3.2. Espectrometria de massa e sua aplicabilidade na protemica ..................................................................... 3.2.1. Equipamentos de espectrometria de massa e sua aplicao ............................................................. 7 7 8 9 11 12 13 16 20 22 25 28

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4. Consideraes finais.............................................................. 33 5. Referncias Bibliogrficas .................................................... 34

interesse, tem sido lanado no mercado no deve ser o parmetro de escolha da tcnica a ser usada no planejamento de um projeto na rea de protemica. Antes de tudo deve-se ter bom senso e conhecimento do funcionamento bsico de cada um dos tipos de equipamentos disponveis para que o objetivo do estudo seja alcanado. Foi com a finalidade de fornecer um conhecimento bsico das facilidades da genmica e protemica disponvel que este documento foi escrito. Detalhes de variaes das tcnicas e outros avanos devem ser uma busca constante nestas reas devido ao grande volume de informao disponvel e que j foram temas de diversas revises e publicaes tcnico-cientficas.

Genmica e Protemica
Ktia Regina dos Santos Teixeira Jean Luiz Simes-Arajo

1. Introduo
O sufixo OME tem sua origem no latim e significa massa ou grandes quantidades. Neste contexto, a introduo no Brasil nos ltimos 5 anos de equipamentos com capacidade para anlise de um grande nmero de amostras e aplicao de tcnicas avanadas nos estudos de caracterizao de genes e protenas resultou no avano das disciplinas denominadas genmica e protemica, assim como em outras reas emergentes, que tem como base a produo de informaes e processamento de dados em larga escala. A aplicao de tcnicas de seqenciamento de DNA e caracterizao do contedo de protenas e sua identificao tem sido fonte de gerao de informao sobre diversos sistemas biolgicos. A genmica, inicialmente aplicada ao estudo de genmas completos e parciais de diversos microrganismos, plantas e animais (inclusive o genma humano) tem sido uma ferramenta cada vez mais utilizada para a prospeco de genes em comunidades complexas, recebendo portanto a denominao de metagenmica.

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2. Introduo a Genmica
A partir das primeira evidncias em 1944 de que o cido Desoxirribonuclico (DNA) era responsvel pelo armazenamento e transferncia da informao gentica de gerao para gerao, iniciou-se uma verdadeira corrida para determinao da estrutura do DNA. Diversos estudos mostravam que o DNA era uma molcula longa e fina, composto por acar, fsforo e quatro diferentes tipos de bases nitrogenados. Em 1953, WATSON & CRICK determinaram a estrutura do DNA, como uma dupla fita anti-paralela onde resduos de timina (T) se pareiam com adenina (A) e guanina (G) com citosina (C) atravs de ligaes do tipo pontes de hidrognio.
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Diversas outras descobertas importantes, ainda em meados do sculo passado, como a descoberta do RNA mensageiro e a identificao do cdigo gentico, possibilitaram a determinao do fluxo da informao gentica, o que se convencionou chamar-se o Dogma Central da Biologia Molecular. No incio dos anos 70, o isolamento das primeiras enzimas de restrio, bem como o seqenciamento das primeiras molculas de DNA, caracterizou o incio da Era Genmica. O aprimoramento dos mtodos de seqenciamento, o surgimento de diferentes mtodos de clonagem e da reao em Cadeia da Polimerase (PCR), bem como o desenvolvimento do seqenciamento automtico de DNA e a crescente capacidade da anlise de dados, atravs do uso cada vez maior dos computadores, possibilitaram o seqenciamento completo dos primeiros genmas em meados da dcada de 80. Esta reviso visa discutir de forma clara e objetiva os principais aspectos relacionados ao desenvolvimento da Era Genmica com o objetivo de preencher uma lacuna relacionada a deficincia de bibliogrfica em lngua Portuguesa. 2.1. O Seqenciamento de DNA As primeiras seqncias de DNA foram obtidas no incio da dcada de 70, quando as extremidades coesivas do fago , com apenas 12 pares de bases (pb), foram seqenciadas (WU & TAYLOR, 1977). Apesar de diferentes mtodos de seqenciamento terem sido desenvolvidos, o mtodo mais utilizado at hoje o mtodo da terminao de cadeia que utiliza didesoxirribonucleotdeos (ddNTP) (Figura 1), processo aprimorado por SANGER et al. (1977). Este mtodo baseia-se na capacidade da DNA polimerase de utilizar ddNTP 2, 3 como substrato. No entanto, a incorporao do ddNTP na cadeia de DNA que est sendo sintetizada interrompe a reao de polimerizao porque a extremidade 3 do ddNTP no possui um grupo hidrxila necessrio para a formao da ligao fosfodister com o nucleotdeo subseqente da sntese. Dessa forma, a reao de amplificao e o fragmento anteriormente sintetizado fica com o ddNTP no final da cadeia. GILBERT E SANGER, atravs de estudos independentes (SANGER et al., 1977; MAXAM & GILBERT, 1980), utilizaram este princpio para determinar a seqncia do DNA a
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identificao de protenas em banco de dados pblicos ou derivados de projetos de seqenciamento em andamento.

4. Consideraes finais
A facilidade de acesso a equipamentos e tcnicas que permitem a anlise de cidos nuclicos e protenas em larga escala tem sido um marco importante para o avano da cincia com base no volume e velocidade de gerao de dados nos ltimos anos. A tecnologia de seqenciamento automatizado de DNA proporcionou alteraes profundas na natureza das pesquisa realizada em diversos ramos da cincia. A reduo significativa do custo, da complexidade e do tempo necessrio para o seqenciamento de grandes quantidades de DNA, incluindo melhorias na capacidade de seqenciamento de genma de bactrias e eucariotos, proporcionou um grande acmulo de informaes e um impacto significativo na econmica, cincia e cultura. Atualmente, j esto complemente seqnciados o genma humano, de diversas planta e insetos, 920 projetos de seqenciamento do genmas de bactrias esto em andamento e mais de 350 genmas j foram concludos. Alm disso, o surgimento de novas abordagens, que permitem o seqenciamento do genma de uma bactria em alguns dias, certamente, trar substanciais alteraes na maneira de estudar os microrganismo e num futuro prximo, estaremos comparado genmas com a mesma freqncia que hoje comparamos genes. No campo da protemica uma diversidade de tcnicas tem sido desenvolvidas nos ltimos anos, algumas com base no uso de espectrometria de massa e outras com base em tcnicas de imunologia, ensaios enzimticos, bio-imagens e microarranjos (RAMSTRM & BERGQUIST, 2004; ISSAQ et al., 2005; PANICKER et al., 2006). So tantas as opes de equipamentos e estratgias que os pesquisadores devem ser criteriosos no momento de fazer a escolha adequada ao objetivo de seus estudos. A freqncia com que novos equipamentos do tipo espectrometria de massa, resultante de combinaes de mdulos bsicos para prfracionamento, ionizao e separao das molculas de nosso
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sua caracterstica de separar os peptdeos por massa seguido pela fragmentao dos peptdeos em uma cmara de dissociao induzida por coliso (CID Collision induced dissociation) e separao de fragmentos parciais derivados aps a quebra da ligao peptdica (em geral). Neste caso, os cromatrogramas obtidos correspondem a m/z do peptdeo menos uma carga referente ao resduo liberado aps a fragmentao. Para melhor entendimento ver a representao esquemtica apresentada na figura 19.

partir da marcao do ddNTP com radioatividade (32P, 33P, 35S). Durante os ciclos de polimerizao os ddNTP vo sendo incorporados aleatoriamente e no final da reao se obtm um conjunto de fragmentos com tamanhos diferentes sendo o final marcado, nesse caso com radioatividade. A mistura de fragmentos submetida a eletroforese para separao por tamanho (Figura 2A) e a anlise visual do gel posteriormente possibilita a determinao da seqncia de bases. Pela descoberta desse mtodo, Gilbert e Sanger receberam o prmio Nobel de Qumica em 1980. Apesar de ser um mtodo considerado rpido para a poca o custo o seqenciamento ainda era muito alto. Pelo mtodo de Sanger o seqenciamento realizado em quatro reaes independentes, sendo que em cada uma delas adicionado um ddNTP diferente (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) marcado com 32P, 33P, ou 35S. Aps a reao os fragmentos so separados atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida, o gel seco e exposto a um filme de raio X. Aps a revelao do filme de raio X ento realizada a leitura da seqncia, sendo possvel identificar apenas de 200 a 300 pb por gel durante uma corrida longa.

Fragmentao ao acaso dos peptdeos nas ligaes amidas por CID.

Figura 19 Representao da fragmentao de peptdeos e cromatograma gerado a partir dos produtos derivados contendo menos um resduo de aminocidos. A seqncia deduzida com base no valor de m/z total subtrado do m/z dos peptdeos fragmentados. As formas b e y produzidas correspondem a mesma seqncia porm os fragmentos so caracterizados pela presena de ons produzidos a partir do N-terminal ou C-terminal, respectivamente.

Figura 1 - Didesoxirribonucleotdeo (ddNTP), anlogo aos dNTP, utilizado para interromper a sntese de DNA durante a reao de polimerizao.

A anlise de peptdeos em espectrmetros do tipo MS/MS garante, alm da obteno de suas massas, a obteno de informao sobre a sua estrutura primria e, apesar de nem todo espectro ser completo, a obteno da seqncia de pelo menos um peptdeo pode permitir a identificao de uma protena. Os dados gerados a partir de anlise do tipo MS/MS confere uma alta especificidade na
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2.2. Seqenciamento automtico de DNA Com o desenvolvimento do seqenciamento automtico de DNA grande parte das limitaes apresentadas pelo mtodo de Sanger

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foram reduzidas ou eliminadas, principalmente devido aos aprimoramentos dos equipamentos, reagentes qumicos e inovaes pticas, o que permitiu a utilizao de ddNTPs marcados com fluorescncia (Figura 2B). Cada ddNTP fluorescente constitui aproximadamente 1% da mistura de dNTPs, logo a reao de polimerizao produz uma mistura de produtos fluorescentes de vrios tamanhos que pode ser separadas em gel de poliacrilamida. Outra grande vantagem do seqenciamento automtico a utilizao do laser e programas de computadores especficos. Alm disso, cada ddNTP marcado com uma molecular fluorescente, que quando excitada pelo laser, emite fluorescncia em comprimentos de onda diferentes para cada tipo de base associada. Dessa forma, no h necessidade de fazer quatro reaes independentes para cada fragmento DNA a ser seqenciado, como cada ddNTPs emite fluorescncia em um comprimento de onda especfico, os quatro ddNTPs podem ser misturados na mesma reao e o equipamento (seqenciador) detecta o sinal que analisado por programas especficos de bioinformtica resultando na seqncia de DNA (Figura 2B). Uma outra etapa do processo de seqenciamento bastante laboriosa a preparao do gel de poliacrilamida e a eletroforese. No entanto, nos seqenciadores mais modernos a eletroforese ocorre no interior de microcapilares preenchidos com uma matriz linear de poliacrilamida (LPA) que pode ser facilmente substituda, aps cada eletroforese, utilizando gs sob alta presso deixando o equipamento pronto para nova eletroforese, facilitando ainda mais o seqenciamento e aumentando sua velocidade. A medida que os seqenciadores automticos de DNA foram sendo aperfeioados a capacidade de produo de seqncias de DNA foi aumentando cada vez mais havendo necessidade do desenvolvimento de uma plataforma computacional para processamento e anlise dessas informaes o que proporcionou o surgimento de uma rea especifica da informtica, a Bioinformtica.

a capacidade de detectar modificaes, alm de outros parmetros variveis (stios de clivagem, modificaes e inespecificidade enzimtica). Por esta tcnica possvel inferir certas modificaes ps-traducionais tais como processamento de peptdeo sinal, cuja informao presente no gene no recuperada na forma de protena ativa e neste caso a massa deduzida in silico diferente da massa obtida experimentalmente. Os dados resultantes da anlise de fingerprint so simples e permitem a identificao de protenas mesmo com apenas 25% de cobertura, apesar de no permitir inferir a seqncia do peptdeo, sem conhecimento prvio da seqncia de aminocidos deduzida a partir de um gene conhecido (Figura 18).

Figura 18 Cromatograma derivado da anlise de protenas por Fingerprint em MALDI-MS. As figuras A e B apresentam alguns peptdeos, representando a cobertura parcial de duas protenas diferentes. Observem que a massa dos peptdeos correlacionada com as massas de peptdeos disponveis em banco de dados e seqncias candidatas.

Equipamentos de massa tambm permitem a obteno das seqncias de peptdeos com base no mtodo de fragmentao dos peptdeos. Para o seqenciamento de peptdeos o equipamento de massa seqencial (MS/MS, TOF/TOF) o mais adequado devido a
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opostas aos definidos no analisador so adsorvidos enquanto os outros atravessam o campo e alcanam o detector figura 17.

A)

B)

Fragmentos de DNA com ddNTP fluorescente cpias do molde de DNA com seqncia desconhecida

Molde de DNA Migrao do DNA Fragmentos de DNA com ddNTP fluorescente na extremidade so aplicados nos capilares e submetidos a eletroforese

Detector

Feixe de Laser

Fonte de Laser

Figura 17 Esquema do funcionamento do espectrmetro de massas com analisadores do tipo quadruplo.

Autoradiografia do gel aps eletroforese

Seqncia de DNA

Resultado gerado pelo computador aps os fragmentos passarem pelo detector

Espectrmetros de massa (MS) disponveis atualmente para anlise de protenas e peptdeos permitem a aplicao de tcnicas para a identificao de protenas atravs de mapeamento (fingerprint) e seqenciamento de aminocidos, caracterizao de modificaes ps-traducionais e tambm como ferramenta para quantificao da expresso de protenas. A anlise de protenas intactas em MS pouco informativo e menos sensvel que a caracterizao das massas dos peptdeos derivados de sua protelise. A obteno de massa de uma protena intacta no permite a sua identificao por estarem sujeitas a modificaes ps-traducionais e ao grande nmero de protenas que apresentam massas semelhantes. Por outro lado, a fragmentao de protenas isoladas, derivadas de fracionamentos e at mesmo em soluo permite a obteno de um perfil de massas dos peptdeos presentes em sua composio. Este tipo de abordagem denominada fingerprint mais informativo devido a exatido da medida de massa obtida, a cobertura dos peptdeos em domnios estruturais que permitem identificar o tipo e at mesmo a funo da protena e
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Figura 2 - Seqenciamento de DNA atravs do mtodo de Sanger utilizando radioatividade (A) e seqenciamento automtico de DNA (B). Fonte NELSON et al. (2000).

2.3. Estratgias para seqenciamento completo de genmas Apesar do desenvolvimento dos equipamentos para seqenciamento ter possibilitado a diminuio do custo e aumentando sobremaneira a velocidade do processo, o tamanho do fragmento de DNA capaz de ser seqenciado em cada reao, de maneira geral, fica em torno de 400 a 600 bp, um fragmento bem pequeno quando se comparado com o tamanho de um genma completo. No caso de bactria, por exemplo, o genma pode conter entre 106 e 107 pares de bases (Figura 3). Logo o seqenciamento de todo o genma requer muitos milhares de trechos curtos de seqncias que precisam ser gerados. No momento existem duas principais estratgias utilizadas para gerar essas seqncias: o seqenciamento hierrquico e o seqenciamento completo por fragmentos aleatrios (Whole Genome shotgun sequencing). Em ambos os casos, para seqenciar o genma de um organismos, inicialmente necessrio isolar o DNA do organismo de interesse e
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elaborar bibliotecas de DNA genmico, no entanto, a estratgia utilizada para clonagem e o tamanho dos fragmento clonados variam bastante.
Plamdeos vrus bactria fungos plantas algas insetos moluscos Peixe anfbios rpteis pssaros mamferos 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 10 10 10 11

grade com polaridade semelhante aos ons promove desacelerao das molculas de mesmo tamanho que viajam em diferentes velocidades aps a ionizao (Figura 16). Este tipo de equipamento apresenta alta resoluo (10000 a 20000) e o limite de massa varia at a faixa de 8 -10 kDa, neste caso ons de molculas menores como os peptdeos derivados de tripsinizao so mais facilmente analisados.

Figura 3 - Tamanho de alguns genmas em pares de base.

2.3.1. Seqenciamento Hierrquico Essa estratgia geralmente utilizada para o seqenciamento de grandes genmas. Nesse caso, uma das primeira etapas a construo de um mapa fsico do genma para que os fragmentos seqenciados possam ser facilmente montados. Em seguida, grandes regies do DNA genmico, como por exemplo um cromossomo, so cortados em grandes fragmentos e clonados em vetores especficos como BACs, PACs, and YACs. Esse DNA clonado novamente fragmentado em pequenos pedaos entre 1000 a 3000 pares de bases, clonado em vetores adequados e posteriormente submetidos ao seqenciamento. Essas seqncias associadas com o seqenciamento das extremidades dos BACs, PACs, and YACs e o mapa fsico so utilizadas para montagem do genma (Figura 4).

Figura 16 Esquema do funcionamento de espectrmetros de massas com analisadores do tipo TOF e tipo de informao obtida (resoluo).

Analisadores do tipo quadruplo (dois plos carregados positivamente e dois carregados negativamente) funcionam como um filtro de ons de diferentes cargas, geralmente produzidos a partir do tipo de ionizao associada ao equipamento. Equipamentos do tipo quadruplo usam mdulo de ionizao tipo ESI que gera dois tipos de ons (carregados positiva ou negativamente). Durante a passagem dos ons ao longo do quadruplo em presena de uma corrente alternada, ons de cargas

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Genoma
Biblioteca BAC com sobreposio Biblioteca shotgun de cada BAC

Seqncia de DNA do genoma

Figura 4. Etapas para o seqenciamento Hierrquico de Genma

2.3.2. Seqenciamento por fragmentos aleatrios (Shotgun)

Figura 15 Representao da ionizao por de pulverizao de eltrons (ESI). Molculas em soluo so ionizadas ao passar por um capilar metlico submetido a alta voltagem.

As gotculas contendo molculas carregadas so evaporadas em cmara durante fluxo de gs inerte sob presso atmosfrica. 3.2.1. Equipamentos de espectrometria de massa e sua aplicao Os equipamentos de espectrometria utilizados atualmente em estudos de protema utilizam dois tipos de analisadores do tipo m/z (massa/carga): TOF (Time-of-flight) e o Quadruplo. O analisador tipo TOF, pode ser traduzido como tempo de vo, pode ser caracterizado pelo tempo de vo dos ons em uma cmara de vcuo. O valor obtido no cromatograma no quantitativo e reflete a relao de massa e carga do on (m/z). O modo Linear tem capacidade de caracterizar protenas de massa acima de 50 kDa porm com baixssima resoluo. Duas estratgias para melhorar a resoluo da anlise em TOF so a extrao atrasada (DE delayed extraction) e o refletor. Na tcnica de DE, o Laser incide sobre a matriz contendo a amostra e aps a adsoro aplicada a voltagem para promover a dissociao dos ons em direo ao detector no modo Linear. O desenvolvimento de um espelho do tipo refletor foi um avano em relao ao modo Linear, e neste caso uma
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Essa estratgia dispensa a etapa de mapeamento fsico, uma das tarefas mais difceis e demoradas. O genma do organismo fragmentado em pequenos pedaos, por quebra mecnica (sonicao ou nebulizao) e diversas bibliotecas so geradas desses fragmentos aleatrios (Figura 5 e 6). O Tamanho dos fragmentos clonados varia entre 1000 a 4000 pb, podendo chegar a 10.000 pb, as extremidades de um grande nmero de clones so seqenciadas e utilizadas para a montagem do genma completo. Apesar de ser estratgia mais rpida, demanda uma alta capacidade computacional para processamento das seqncias e montagem correta do genma. Esta estratgia tem sido empregada para o seqenciamento de inmeros genmas de procariontes como de bactria, por exemplo Xilela fastidiosa e Gluconacetobacter diazotrophicus (consrcio RIOGENE) dentre outras, e tambm tem sido utilizada para genmas de eucariontes, bem maiores, incluindo o genma humano. Um grande problema para os projetos de seqenciamento genmico a grande quantidade de regies do genma com seqncias repetidas o que, dentre outros problemas, dificulta bastante o trabalho final de bioinformtica para montagem das seqncias. Para suplantar esse problema, mesmo quando se utiliza a estratgia shotgun podem ser utilizadas bibliotecas com grandes fragmentos de DNA para auxiliar a ordenao dos clones e montagem do genma. Alm de diminuir a quantidade de
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seqenciamento das bibliotecas shotgun. No caso de genmas de organismos eucariontes superiores, alm da quantidade de DNA repetitivo ser muito maior, esses problemas so agravados pelo fato dos genes possurem ntrons dificultando ainda mais a montagem e localizao das regies codificantes do genma. Uma alternativa nesse caso seqenciar apenas o Genma Funcional, ou seja, o DNA complementar ao RNA mensageiros ou o cDNA. Nesse caso, o RNA total do organismo extrado, utilizado para sntese de cDNA atravs da enzima transcriptase reversa, o cDNA ento clonado e seqenciado. Essa estratgia foi utilizada no Brasil para o seqenciamento do genma de cana-de-acar, onde foram seqenciados um total de 340.000 ESTs (do Ingls Expressed Sequencing Tags ou Etiquetas de seqncias Expressas). O Brasil tem se destacado no seqenciamento de genmas de diverso organismos atravs de diversos projetos em redes, a nvel nacional e regional, envolvidos nos laboratrios de biologia molecular em mais de 48 instituies de ensino e pesquisa, com a mobilizao de cerca de 240 cientistas de quase todas as regies do pas. Os projetos sero divididos nos setores agrcolas e de sade. Conforme uma breve discusso a seguir.
Genoma Bibliotecas Shotgun

Figura 14 Esquema do processo de ionizao por MALDI.

Peptdeos ou fragmentos de protenas co-cristalizada com uma matriz (derivada de pequenos compostos orgnicos) liberam molcula e partculas ionizadas aps a ao do Laser. A protonao induzida dos peptdeos depende da sua interao com a matriz. Por sua vez o processo de ionizao que utiliza a tcnica de pulverizao de eltrons (ESI) permite que amostras de peptdeos em soluo (dissolvidos em solventes polares e volteis) sejam submetidos a ionizao pela passagem atravs de um capilar sob alta voltagem e presso atmosfrica (Figura 15). Neste caso, o uso de um gs, geralmente N 2, promove a volatilizao do solvente e com base no potencial electrosttico ocorre a dissociao de ons de diferentes cargas. A ionizao atravs da tcnica de pulverizao de eltrons (ESI) em microcapilares, sob presso atmosfrica e alta voltagem, ganhou popularidade devido a facilidade com que ela pode ser aplicada em conjunto com tcnicas de cromatografia e tcnicas de separao eletroforticas em fase lquida (AEBERSOLD & GOODLETT, 2001). Alm disso, a capacidade deste mtodo de ionizao em produzir analitos com mltiplas cargas adequada para seu uso com instrumentos de espectrometria de massas do tipo quadruplo ou outros tipos de analisadores de massa com faixa limitada de m/z (massa/carga).

Seqncia de DNA do Genoma

Figura 5 - Etapas para o seqenciamento de genma por fragmentos aleatrios (Shotgun).

rea de Sade Esquistossomose - Rede Genma do Estado de Minas Gerais, utilizando como modelo o genma expresso do Schistosoma mansoni, parasita responsvel por infeco da esquistossomose, doena que atinge cerca de 200 milhes de indivduos em todo o

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spray ionization - ESI), so considerados mtodos de ionizao suaves em comparao com outros mtodos conhecidos e associados ao processo de anlise por espectrometria de massa. O fator determinante que caracteriza como suave estas formas de ionizao depende das condies especficas utilizadas durante o processo de gerao de ons que no provoca uma significante decomposio qumica e mesmo ligaes fracas do tipo nocovalentes so mantidas (MANN et al., 2001). O mtodo de ionizao por MALDI se utiliza de pulsos de Laser como fonte da energia de ionizao e depende do uso de uma matriz. A mistura de peptdeos derivados de fragmentao enzimtica embebida em uma matriz orgnica (geralmente cyano-4-hydroxycinaminic acid), composta por uma mistura de peptdeos padres (tipo bradykinin e ACTH) com molculas pequenas capazes de absorver energias do tipo UV (ultra-violeta) e IR (infra-vermelho) que se co-cristralizam com os peptdeos da amostra na presena de um doador de prtons (GARBIS et al., 2005). Posteriormente os peptdeos ionizados so liberados a partir dessa matriz aps o bombardeamento com o feixe de laser emitido em uma cmara (Figura 14). A ionizao via MALDI geralmente utilizada com analisadores de massa do tipo tempo de vo (Time-ofFlight - TOF) que so espectrmetros de massa mais simples e robustos que apresentam sensibilidade para uma faixa ampla de massas. Como este mtodo de ionizao produz predominantemente ons carregados com uma nica carga os espectros gerados por MALDI-MS (ou MALDI-TOF) so simples de interpretar.

mundo. Rede coordenada pela Fapemig (Fundao de Amparo Pesquisa de Minas). Leishmaniose - ProGeNe (Programa Genma do Nordeste), para o seqenciamento de Leishmania chagasi, uma das trs espcies responsveis pela leishmaniose visceral, doena que afeta pases de clima quente e temperado no mundo todo. Projeto coordenado pela UFPE (Universidade Federal de Pernambuco). P. brasiliensis (Micose) - Projeto em Rede do Centro-Oeste, para o estudo do genma funcional e diferencial de Paracoccidioides brasiliensis , fungo responsvel por micose endmica, denominada paracoccidioidomicose, de alta prevalncia na Amrica Latina. Rede coordenada pela UnB (Universidade de Braslia). Doena de Chagas - Consrcio entre o Instituto de Biologia Molecular do Paran, Fiocruz (Fundao Oswaldo Cruz) e Universidade de Mogi da Cruzes destinado a desenvolver a genmica funcional do processo de diferenciao celular do Trypanosoma cruzi: seleo e caracterizao de novos genes e anlise de novos alvos quimioterpicos, sob coordenao do IBMP (Instituto de Biologia Molecular do Paran). Setor Agrcola Vassoura de Bruxa - Rede Genmica no Estado da Bahia, para estudos do genma do fungo Crinipellis perniciosa causador da doena 'vassoura de bruxa' nas plantaes de cacau, coordenado pela Unicamp (Universidade Estadual de Campinas). Fixador de Nitrognio - Programa RioGene (Rede Genma do Estado do Rio de Janeiro) destinado ao seqenciamento do genma da bactria fixadora de nitrognio Gluconacetobacter diazotrophicus , coordenado pela UFRJ (Universidade Federal do Rio de Janeiro) com participao da Embrapa Agrobiologia. Fixador de Nitrognio - Programa Genma do Estado do Paran, para estudo do genma estrutural e funcional da bactria endoftica fixadora de nitrognio Herbaspirillum seropedicae, coordenado pela UFPR (Universidade Federal do Paran).

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Fragmentos de DNA
Cultura de E. coli

Extrao do DNA Plasmidial

Reao de Sequeciamento (PCR) Sequeciamento (MegaBace 1000)

Ligao ao Vetor Transformao de E. coli e distribuio em placas de 96 poos

Read

}
alternativa para

Bioinformtica

no gel como alternativa para deteco de protenas de baixa expresso no a soluo, pois tem sido observado ocorrncia de saturao e fuso de spots em relao ao gel padro, indicando limitao da resoluo do gel 2D (INAGAKI & KATSUTA, 2004). Uma alternativa para estes problemas o pr-fracionamento de amostras de protenas para aumentar a resoluo de protema em gel 2D atravs da reduo da complexidade da amostra original. Maiores detalhes sobre estratgias de pr-fracionamento podem ser encontrados na reviso feita por WASINGER & CORTHALS (2002) ou em trabalhos mais recentes. 3.2. Espectrometria protemica de massa e sua aplicabilidade na

Contig

Figura 6 - Estratgia utilizada pelo consorcio RIOGENE para o seqenciamento completo do genma de Gluconacetobacter diazotrophicus

A anlise de peptdeos e protenas por espectrometria de massa (MS Mass spectrometry) se baseia na fragmentao de protenas em molculas menores (peptdeos) antes de sua ionizao e separao por massa molecular (MW). O desenvolvimento de mtodos de ionizao adequados para protenas e peptdeos e sua associao a instrumentos de anlise de massa fizeram com que a tcnica de espectrometria de massa (MS) se tornasse uma tcnica complementar s tcnicas de ressonncia nuclear magntica (NMR nuclear magnetic resonance), cristalografia de Raio X e outras tcnicas clssicas de qumica de protenas aplicadas no estudo de diversos aspectos de sua estrutura e funo. Mtodos de ionizao Na dcada de 80, avanos no estudo de macromolculas por espectrometria de massa foram marcados pelo desenvolvimento de dois processos de ionizao capazes de gerar ons em molculas grandes e no-volteis tais como as protenas e peptdeos, sem causar fragmentao significativa da molcula a ser analisada. Estes processos conhecidos como ionizao por desadsoro da matriz mediada por Laser (MALDI - matrix-assisted laser desorption ionization) e por pulverizao de eltrons em microcapilares sob presso atmosfrica e alta voltagem ( electron
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2.4. Pirosseqenciamento: nova seqenciamento rpido de genmas

Apesar do aumento significativo da velocidade de seqenciamento com a utilizao dos seqenciadores automticos, baseados no mtodo de SANGER et al. (1977), e o desenvolvimento de diferentes estratgicas para o seqenciamento completo do genma, ainda h uma grande quantidade de trabalho, tempo e recursos financeiros para obteno de hesito em um projeto de seqenciamento. Diversos grupos de pesquisa tm realizado esforos para o desenvolvimento de mtodos para a determinao da seqenciamento de DNA. Trs mtodos so bastante promissores: seqenciamento por hibridizao (BAINS & SMITH 1988; DRMANAC et al., 1989; KHRAPKO et al., 1989; SOUTHERN, 1989), seqenciamento por assinatura paralela, baseado na ligao e clivagem do DNA (BRENNER et al., 2000) e o pirosseqenciamento (RONAGHI et al.; 1996, 1998). O pirosseqenciamento uma tcnica baseada na deteco do pirofosfato (PPi) durante a sntese do DNA pela DNA polimerase. Atravs de uma cascata de reaes uma certa quantidade de luz
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IPG strip

visvel gerada de acordo o nmero de nucleotdeos incorporados (Figura 7). Essa cascata iniciada com a reao de polimerizao do DNA e a liberao do PPi como resultado da incorporao no nucleotdeos pela polimerase. O PPi subseqentemente convertido a ATP atravs da ATP sulfurilase, o qual fornece energia para a luciferase oxidar luciferina e gerar luz. Anteriormente esse mtodo no era utilizado para o seqenciamento de genmas em funo da limitao no tamanho das leituras (reads) gerados em torno de 80 a 120 pares de bases (RONAGHI et al., 1998). No entanto, diversos aprimoramentos tecnolgicos possibilitaram a automao da reao e o desenvolvimento de uma equipamento capaz de seqenciar 25 milhes de bases, como uma preciso de 99% ou mais, em apenas 4 horas (AGAH et al., 2004; MARGULIES et al., 2005).

Figura 13 Exemplo do uso de diferentes faixas de gradientes de pH para caracterizao preliminar do protema de uma cultivar de trigo (SKYLAS et al., 2005). Tiras contendo faixas de pH imobilizados do tipo ampla (Broad - pH 310), mdia (mid - pH 47, 58, and 611) e estreita (narrow-range (pH 5.56.7). Protenas foram detectadas com corante fluorescente tipo SYPRO Ruby.

A deteco de protenas bsicas, de alto peso molecular, hidrofbicas ou pouco abundantes tem sido um dos desafios para a anlise de protema atravs de 2D-GE. Diversas estratgias para superar estas limitaes j foram descritas por vrios autores para a deteco de protenas bsicas e hidrofbicas (RABILLOUD, 1998; HOVING et al., 2002; TASTET et al., 2003). No caso de protenas que apresentam baixo nvel de expresso celular, tais como molculas sinalizadoras e protenas regulatrias (ex.: NifA regulador positivo da transcrio de genes nif), a deteco de protenas de grande importncia em estudos que visam caracterizar a expresso diferencial de protenas e seu mecanismo de regulao. Aplicar maior quantidade de protenas
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Figura 7 - Princpio do Pirosseqenciamento. A reao de polimerizao do DNA libera o PPi que convertido a ATP pela ATP sulforilase. O ATP utilizado como fonte de energia para produo de luz pela luciferase (adaptado de RONAGHI, 2001).

O Pirosseqenciamento um mtodo rpido para seqenciamento que no se baseia em eletroforese. No caso do equipamento desenvolvido pela Roche Apllied Science denominado Genome Sequencer 20 System (Figura 8), o seqenciamento pode ser dividido em quatro etapas principais (Figura 9): 1) DNA Genmico isolado e fragmentos com 300 a 800 pares de bases, gerados por
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nebulizao, so ligados a adaptadores e separados em fita simples; 2) os fragmentos ligados so imobilizados em nanoesferas de forma que apenas um fragmento seja ligado a cada esfera; 3) as esferas so capturas por gotculas de uma emulso gua-leo contendo os reagentes para a reao de PCR (emPCR).

Figura 12 Ilustrao da tcnica de 2D-GE para separao de protenas de acordo com seu pI e MW. Figura 8 - Esquema do equipamento para o pirosseqenciamento. O seqenciador consiste de quatro grandes subsistema: a) Cmara de distribuio de Fludos, b) cmara de circulao que inclui lminas de fibra tica contendo poos, c) cmara CCD para captura e montagem das imagens e um computador que fornece ao usurio uma interface para controlar o equipamento (adaptado de MARGULIES et al., 2005).

A reao de PCR ocorre em cada gota, resultando em esferas contendo em torno de 10 milhes de copias de um nico DNA molde; 4) A emulso e quebra, as fitas de DNA desnaturas, e as esferas contendo clones de DNA fita simples so depositados em poos de um lmina de fibra tica. Pequenas esferas contendo as enzimas necessrias para a reao de pirosseqenciamento imobilizadas so depositadas em cada poo (Figura 9). Aps a preparao das esferas a reao de seqenciamento realizada atravs da passagem de uma soluo contendo o tampo de reao e os nucleotdeos (A, T, G, e C) independentemente, com uma
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Apesar do grande potencial de separao desta tcnica, nem todas as protenas presentes em um extrato total podem ser resolvidas devido a sua reduzida taxa de expresso e/ou diferenas extremas em relao a solubilidade. Algumas estratgias podem ser adotadas para resolver algumas limitaes associadas a 2D-GE, uma delas o uso de mltiplos gis em diferentes faixas de pH ou peso molecular para implementar a resoluo da anlise (Figura 13).

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3.1. Anlise do perfil de protenas expressas atravs de eletroforese bidimensional (2D-GE) A eletroforese bidimensional (2D-GE) se tornou uma das tcnicas mais importantes para separao de protenas com alta resoluo para anlise protemica atravs de espectrometria de massa (MS). No entanto, apesar da grande demanda de substituio desta tcnica e inmeros questionamentos sobre sua aplicabilidade em relao a outras tcnicas menos laboriosas para avaliao de grandes volumes de amostras, seu nvel de resoluo e sensibilidade ainda so bastante teis para obter uma viso global da atividade celular (revisado por FEY & LARSEN, 2001). A tcnica de eletroforese bidimensional tem como base a separao de protenas de acordo com seu ponto isoeltrico (pI) e sua massa molecular (MW) em duas etapas de forma a ampliar o poder de resoluo de amostras complexas de protenas (Figura 12). Na primeira etapa a mistura de protena solvel do extrato bruto de uma amostra submetida a eletroforese na ausncia de agentes desnaturantes (SDS, uria, DTT) de modo a favorecer a separao dos polipeptdeos em determinado pH devido ao contedo de cargas positivas e negativas de acordo com propriedade intrnseca de cada molcula. De acordo com seu pI, cada protena apresenta carga lquida igual a zero e portanto tende a precipitar a partir de uma soluo, ou deixa de migrar ao longo de uma matriz de poliacrilamida no caso da eletroforese, ao apresentar nveis de protonao e reduo capazes de neutralizar sua carga. A tcnica de 2D-GE, apesar dos seus mais de 25 anos de aplicao em anlise de protenas, s recentemente recebeu ateno e inovaes que garantem a sua aplicao com altos ndices de reproducibilidade tais como a introduo de gradientes de pH imobilizados em tiras de gel de poliacrilamida (GORG et al., 2000; HANASH, 2000), as quais podem ser adquiridas comercialmente. As condies de eletroforese utilizadas em diversos laboratrios no so fruto de um consenso, e portanto devido a estas variaes dificilmente um gel pode ser comparado ao de outro laboratrio em detalhe.

lavagem do sistema aps a passagem de cada base. A luz gerada capturada e utilizada para gerao do pirograma (Figura 10).

Figura 9 - Preparao das amostras para a reao de pirosseqenciamento, reao de PCR em emulso (emPCR), deposio das esferas contendo o DNA amplificado e deteco da luz (Adaptado de MARGULIES et al., 2005). Ver detalhes no texto.

Figura 10 - Pirograma com os dados brutos obtidos na reao de pirosseqenciamento mostrando a proporo de sinal obtida para a incorporao de um, dois, trs e quatro nucleotdeos. Na parte inferior indicado a ordem dos nucleotdeos e na parte superior a seqncia obtida (Adaptado de RONAGHI, 2001).
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Essa tecnologia tem vantagens na exatido e facilidade de utilizao para diferentes aplicaes. Dispensa a clonagem, construo de biblioteca e seleo de clones, marcao de nucleotdeos, e a eletroforese de DNA. Alm disso, possui alta flexibilidade e suposta alto nvel de automao. Apesar de produzir seqncias com tamanho entre 80 a 120 pares de bases, o que poderia ser um problemas para a montagem do genma, o desenvolvimento de algoritmos matemticos especficos e o grande nmero de seqncias geradas, torna possvel o seqenciamento de um genma bacteriano em poucos dias (MARGULIES et al., 2005). Certamente se para o organismos de interesse j houver algum genma seqenciado ser muito mais fcil a montagem do genma e dessa forma, dada a velocidade do seqenciamento, essa plataforma tecnolgica poder ser muito utilizada para o seqenciamento de genmas microbianos em larga escala e a tipagem baseadas na seqncia do genma.

como ferramenta para a caracterizao estrutural de protenas tcnicas de cristalizao e de anlises por raio X e NMR. Alm disso, estudos in silico utilizando ferramentas de bioinformtica so essenciais para validar estruturas e identificar possveis stios de interaes dessas molculas com seus potenciais ligantes. Desde o final da dcada de 90, a anlise protemica tem sido feita com base em duas etapas principais: separao de protenas e caracterizao por espectrometria de massa (MS) da massa molecular e/ou seqncia de aminocidos dos peptdeos derivados de digesto enzimtica. A separao de protenas pode ser realizada atravs da eletroforese bidimensional (2D-gel electrophoresis ou 2D-GE) ou diferentes tipos de cromatografia (Figura 11). A tcnica de cromatografia lquida (LC liquid chromatography ou CL) uma das mais convencionais e pode ser aplicada em conjunto com equipamentos de espectrometria de massa sem necessidade de processamento entre a etapa de separao e a anlise de espectrometria de massa (LC-MS e LCMS/MS).

3. Introduo a Protemica
O termo protema pode ser traduzido no contedo de protenas presentes em uma amostra (ex.: tecido, rgo, plantas, animais, cultura de clulas) em um determinado ponto ou ciclo de vida. A abordagem em larga escala do estudo de protenas, sua estrutura, localizao, modificao ps-traducional, funo e interao com outras protenas e ligantes denominada Protemica. A Protemica pode ser separada em diversos campos de acordo com o objetivo de estudo: Protemica da expresso, Protemica Funcional, Protemica Estrutural. A Protemica da expresso tem como objetivo caracterizar os nveis de regulao da expresso de protenas em respostas as condies ambientais ou fisiolgicas da clula ou organismo em estudo (MONTI et al., 2005). Protemica funcional visa monitorar e analisar as propriedades espacial e temporal da rede molecular envolvidos em clulas vivas ao longo de um processo ou ciclo celular. Neste caso o foco est associado a atividade protica, complexos multiprotenas e vias sinalizadoras (GODOVAC-ZIMMERMANN & BROWN, 2001; MONTI et al., 2005). Protemica estrutural utiliza
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Figura 11 Esquema da estratgia freqentemente aplicada em estudos de Protema (adaptado de GARBIS et al., 2005).
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