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21/11/13

Extraccin de ADN

Objetivo En esta prctica realizaremos la extraccin del ADN de clulas animales poniendo de manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de arrollamiento, que permite el empaquetamiento en el ncleo celular de largusimas cadenas de esta molcula. Tras la extraccin se realizar una tincin especfica del ADN obtenido. Material necesario - Tejido animal (hgado de pollo) - Trozo de tela para filtrar - Pipeta) - Alcohol 96 - Mortero o batidora - Arena (si se usa mortero) - Varilla de vidrio - Solucin de NaCl 2M - Embudo - Probeta - Vaso de precipitados - Detergente tipo lavavajillas

Fundamento El ADN se encuentra en el interior del ncleo celular, disperso y muy replegado, unido a protenas para formar la cromatina. As, para extraerlo ser necesario homogeneizar el tejido y romper las clulas para separar el ncleo, romper tambin la envoltura nuclear para liberar su contenido, luego separar el ADN de las protenas que lo protegen y, por ltimo, precipitarlo para extraerlo de la solucin. Una vez realizado esto, el ADN aparecer como un agregado de fibras blanquecinas que se adhieren a la varilla de vidrio. Por ltimo, se puede situar sobre un porta, teirlo con un colorante bsico y observarlo al microscopio. Procedimiento

1. Triturar en fro la muestra de hgado en el mortero junto con arena o mediante la batidora para homogeneizar el tejido. Este procedimiento tambin rompe muchas clulas liberando su contenido. Parecer ser ms eficaz el empleo de una batidora, con la que se obtiene una mezcla ms homgnea y fcil de filtrar despus.

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3. Aadir unos 50 ml de agua destilada o, en su defecto, agua mineral, y remover suavemente pero mezclando a fondo. 4. Filtrar varias veces el resultado a travs de un pedazo de tela. Un pauelo viejo de algodn va bien. Este filtrado es lento y difcil, pero retendr en el pauelo restos de tejido.

6. Aadir al filtrado resultante un volumen igual de solucin de NaCl 2M ( cmo se prepara?). Esta disolucin tan concentrada tiene varios efectos. En primer lugar provoca un choque osmtico que es capaz de romper algunas membranas no afectadas por el tratamiento anterior. Adems, las cargas positivas de los iones Na+ atraern luego las cargas negativas del ADN mantenindolo en la disolucin.

8. Aadir ahora 1 ml de detergente (tipo Mistol o Woolite) y remover suavemente, mezclando bien pero evitando que se forme espuma. Repetir la mezcla varias veces dejando reposar un minuto cada vez. Si se forma espuma se puede retirar con un esquina de papel de filtro o con un cuentagotas. El detergente completa la rotura de las membranas al disolver y separar los lpidos de las mismas. Tambin interviene en la separacin de las protenas que rodean al ADN. Si es posible volver a filtrar, se obtendr una solucin ms limpia de restos. Con los pasos anteriores hemos conseguido tener el ADN libre en la disolucin acuosa (la cual contendr tambin diversos restos tisulares y celulares en funcin de la bondad del filtrado). A continuacin hay que separar el ADN hacindolo precipitar: 10. Ahora se aaden unos 50 ml de alcohol muy fro, teniendo cuidado de hacerlo ladeando el tubo o vaso de precipitados y dejando resbalar muy lentamente el alcohol por la pared de aquel para formar una capa sobre la solucin anterior. Es muy importante evitar que se mezclen ambas soluciones, pues ser en la interfase donde precipitar el ADN.

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12. El ADN ir apareciendo poco a poco en la interfase agua-alcohol en forma de grumos blancos. Se favorece la precipitacin y recoleccin si se va recogiendo mediante la varilla de vidrio, u otro instrumento similar, introducindola ligeramente bajo la interfase y hacindola girar suavemente mientras se extrae. As se irn pegando en la varilla unas hebras blancas que corresponden a miles de fibras de ADN.

14. Se puede ahora tomar una muestra del ADN recogido, depositarla sobre un porta y teir con azul de metileno durante 1 a 3 minutos. Tras limpiar bien el porta, se observa al microscopio.

16. Otra posibilidad es conservar el ADN obtenido por uno de los siguientes mtodos: - en un frasco bien cerrado con alcohol etlico al 50% o 70%. - dejndolo secar al aire extendido sobre papel de filtro.

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