Bioqumica Experimental I Licenciatura em Bioqumica 2 Ano/1 Semestre

Separao e Anlise de componentes celulares por centrifugao diferencial

Turma: PL3 Grupo: 3 Alunos: Alexandre Cirilo, n 41875 Ins Silva, n 41698 Joana Leandro, n 41863 Patrcia Marques, n 42629

ndice

Resumo.......................................................................................................................................... 3 Materiais....................................................................................................................................... 4 Tratamento dos Resultados .......................................................................................................... 5 Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato .................................... 7 Frao mitocondrial Determinao da atividade do succinato: citocromo c oxidorreductase ................................................................................................................................................. 10 Frao lisossomal Determinao da atividade do fosfatase cido ...................................... 13 Distribuio dos marcadores enzimticos estudados ............................................................. 19 Anlise da Frao Nuclear - Isolamento do DNA: ................................................................... 22 Concluso .................................................................................................................................... 25 Bibliografia .................................................................................................................................. 26

Resumo
Nesta atividade laboratorial, foi realizada a separao de fraes celulares (frao nuclear, mitocondrial, microssomal e solvel/citoslica) a partir de um homogenato de fgado de porco. Na preparao deste ltimo foi necessrio recorrer a um homogeneizador de Potter-Elvehjem, por centrifugao diferencial a uma velocidade cada vez maior, sendo, desta forma, possvel separar as vrias fraes celulares do tecido. Aps as centrifugaes sucessivas, obtiveram-se pellets correspondentes frao nuclear, aos mitocndrios pesados e leves e frao solvel/citoslica, as quais, posteriormente foram analisadas atravs do espetrofotmetro de UV-Vis, sendo obtidos os valores de absorvncia. Na determinao da atividade do succinato desidrogenase, de forma a analisar a presena de atividades enzimticas caractersticas da frao mitocondrial, analisou-se, durante alguns minutos, a variao das absorvncias das fraes aps a adio de succinato de sdio e de citocromo c. Na determinao da atividade enzimtica do fosfatase cido, de maneira a comprovar a presena dos lisossomas, mediram-se as absorvncias aps 10 minutos de reao. O mtodo do Biureto foi utilizado de forma a determinar a concentrao proteica em cada uma das fraes, de maneira a determinar as atividades especificas dos enzimas presentes nas mesmas. Por fim, foi realizada uma anlise frao nuclear de forma a isolar e avaliar assim a pureza do DNA. As absorvncias foram medidas em dois comprimentos de onda: 260 e a 280 nm.

Materiais
1. Preparao do homogenato de fgado de rato e centrifugao diferencial Os materiais utlizados nesta fase foram um homogeneizador de PotterElvehjem para romper as membranas celulares e soltar o contedo celular para o meio de isolamento. Utilizou-se, tambm, tubos de centrfuga, papel de filtro e uma supercentrfuga refrigerada. 2. Determinao da actividade do succinato: citocrmo c oxireductase O material usado para esta parte do procedimento um espectrofotmetro UV-Vis e cuvettes de plstico. Estas cuvettes tm uma absorvncia desprezvel no comprimento de onda em que se pretendia trabalhar. 3. Determinao da actividade do fosfatase cido Tal como no procedimento experimental anterior, o material utilizado foi um espectrofotmetro UV-Vis e cuvettes de plstico. 4. Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato Como material foi utilizado o espectrofotmetro UV-Vis e cuvettes de vidro. 5. Anlise da fraco nuclear isolamento do DNA Utilizaram-se cuvettes de quartzo e o espectrofotmetro UV-Vis.

Tratamento dos Resultados

Os componentes subcelulares apresentam diferentes tamanhos e densidades. Estas diferenas so as responsveis pela possibilidade de usar a centrifugao diferencial para separar os diferentes componentes. Embora estes valores (tamanho e densidade) no sejam iguais de clula para clula, possvel estabelecer um intervalo para cada organito.

Fonte: Protocolo experimental: Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial, pgina 5.
Quadro 1: Variaes tpicas no tamanho e na densidade dos componentes subcelulares.

Segundo este quadro, os fragmentos de membrana plasmtica so os primeiros a sedimentar, de seguida os ncleos e como ultimo os mitocndrios. Esta concluso tem como base o tamanho dos organitos, visto que, o meio em que as partculas se encontram tem menor densidade que as partculas. Quanto maior o tamanho das partculas mais rpido estas sedimentam. Na centrifugao, a velocidade e o tempo de centrifugao so os dois fatores importantes para a forma como a separao ocorre.

Fonte: Protocolo experimental: Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial, pgina 4.
Imagem 1 Centrifugao diferencial de um homogenato celular.

Na primeira centrifugao, 1 000 x gav durante 10 minutos, o pellet 1 corresponde frao nuclear, que contm os ncleos e restos de clulas, que sedimentaram em primeiro 5

lugar. Na centrifugao 2, 3 000 x gav durante 10 minutos, o pellet uma frao mitocondrial, composta por mitocndrios, perossixomas e lisossomas. Na centrifugao 3, 10 000 - 15 000 x gav durante 20 minutos, o pellet uma frao microssomal, composta por ribossomas livres, polissomas e pequenas vesiculas provenientes do retculo endoplasmtico e do complexo de golgi. O sobrenadante final, S3, tem a frao solvel ou citoslica composta que contm pequenos organitos e as protenas solveis. No entanto, as partculas de pequenas dimenses, que se encontrem perto do fundo do tubo de centrifuga, sedimentaro ao mesmo tempo que as de maior massa e, as de grandes dimenses podem arrastar partculas de outros tamanhos, dando origem a pellets impuros e heterogneos. Antes de centrifugar, pesou-se o fgado a homogeneizar, para calcular o volume de meio de isolamento que se adicionava: 10 mL de meio de isolamento/ g de fgado m(fgado) = 16,6898 g

Adicionou-se, ento, aproximadamente 166,898 mL de meio de isolamento para as correspondentes g de fgado medidas.

Doseamento de protenas pelo mtodo do biureto com desoxicolato

O mtodo do biureto um dos mtodos mais rpidos e mais utilizados para dosear a quantidade de protenas existente numa determinada amostra, ocorrendo formao de um complexo de cobre com as ligaes peptdicas (complexo de cor violeta). O nmero de ligaes peptdicas que so estabelecidas pode ser quantificado por espetrofotomeria UVVis. Foi utilizada uma curva-padro de forma a determinar o intervalo em que se pode aplicar a lei de Lambert-Beer, para posteriormente se calcular as concentraes das diferentes fraes. Com uma soluo de BSA de concentrao conhecida, prepararam-se dez tubos de ensaio de acordo com o seguinte quadro: Tubo BSA 5mg/mL (mL) H2O (mL) Biureto com desoxicolato (mL) 0 0.00 1.00 2.00 1 0.05 0.95 2.00 2 0.10 0.90 2.00 3 0.20 0.80 2.00 4 0.30 0.70 2.00 5 0.40 0.60 2.00 6 0.50 0.50 2.00 7 0.60 0.40 2.00 8 0.80 0.20 2.00 9 1.00 0.00 2.00

Quadro 2: Curva-padro do doseamento proteico pelo mtodo do biureto com desoxicolato

Aps serem medidas as absorvncias foram obtidos os seguintes resultados: Amostra 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0.033 0.053 0.078 0.120 0.169 0.217 0.261 0.306 0.387 0.469 Ensaios, Abs540 nm 2 0.037 0.058 0.081 0.122 0.175 0.220 0.269 0.310 0.392 0.470 Mdia 3 0.044 0.067 0.092 0.133 0.174 0.224 0.265 0.320 0.394 0.472 0.038 0.059 0.084 0.125 0.173 0.220 0.265 0.312 0.391 0.470 mProtena (mg) 0.00 0.25 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 4.00 5.00

Quadro 3: Valores da Absorvncia medidos para a curva-padro

A partir dos valores obtidos em casa ensaio calculou-se a mdia: Exemplo para a amostra 0: = (=) = (=) = 0.038 7

Procedeu-se da mesma forma para as restantes solues. Calculou-se a massa de protena presente em cada uma das amostras, procedendo-se da seguinte forma: Exemplo para o tubo 1: c= ( =) m = c x V c = 5 mg/mL m = 5 x 0,05 = 0,25 mg

A partir da mdia dos valores das absorvncias registadas e a massa calculada de protena presente em cada tubo, foi possvel traar a reta de calibrao:
0,6

0,5

y = 0,0876x + 0,0406 R = 0,9978

0,4

Abs540nm

0,3

0,2

0,1

0 0 1 2 3 4 5 6

mprotena (mg)
Quadro 4: Curva de calibrao de doseamento de protena pelo mtodo do biureto

A reta obtida do tipo y = mx + b, em que y corresponde ao valor de absorvncia a 540 nm e o x representa a massa de protena.

Clculo da massa de protena presente na frao:

Sendo a reta obtida, do tipo y = mx+b; onde y representa o valor de absorvncia a 540nm e x, a massa de protena (em mg); possvel calcular a massa de protena presente na frao por substituio das variveis pelos valores obtidos experimentalmente.

Exemplificao para a amostra de Homogenato:

y = 0,0876x + 0,0406 0,0876x = y 0,0406 x=

x=

x 0,347 mg

Amostras Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Absorvncia 540nm 1 2 3 0,071 0,076 0,063 0,16 0,067 0,055 0,062 0,074 0,07 0,057 0,234 0,073 0,077 0,087 0,113

Mdia Abs 0,071 0,067 0,07 0,073 0,087

m (mg) [Protena] (mg/mL) 0,347 2,776 0,301 2,408 0,336 1,792 0,37 1,973 0,53 2,826

Quadro 5 Homogenato e fraes com os respectivos valores de absorvncia a 540nm, mdia das absorvncias, massa de protena presente em cada frao (em mg) e concentrao proteca (em mg/ml).

Frao mitocondrial Determinao da atividade do succinato: citocromo c oxidorreductase

Na centrifugao, o pellet obtido para a fraco mitocondrial contm mitocndrios, peroxissomas e alguns lisossomas. Para analisar a existncia de actividade enzimtica do succinato desidrogenase na fraco mitocondrial, considerou-se a cadeia respiratria e o ciclo do cido ctrico, vias metablicas muito importantes. A oxidao do succinato a fumarato, no TCA, catalisada pelo enzima succinato desidrogenase. Este enzima faz parte dos complexos II e III da cadeia transportadora de electres, segundo a reaco global:

Succinato + (cyt c.Fe3+)2 Fumarato + (cyt c.Fe2+)2 + 2 H+

Utiliza-se o KCN para impedir a re-oxidao do citocrmo c a nvel do complexo IV (citocromo oxidase). A determinao da actividade enzimtica a realizar consiste na medio espectrofotomtrica da reduo do citromo c pelo succinato, isto , seguir a reduo do citocromo c pelo aumento da absorvncia a 550 nm ao longo do tempo.

Tabela 2 contedo das cuvettes para a determinao da actividade do succinato

Reagentes Tampo de fosfatos (pH 7,2) 10 mM Soluo de Citrocomo c 1mM Soluo de KCN 0,3 M Amostra Soluo de sucinato 0,5 M

Vreagente (L) 2000 80 7,5 50 40

Vtotal (mL)

2,1775

Observao: Os reagentes foram adicionados segundo esta ordem.

Aps a preparao das cuvettes, mediu-se as absorvncias das amostras a 550 nm. A gua foi utilizada como zero do ensaio.

O aumento da absorvncia ao longo dos 60 segundos demonstra que o enzima succinato desidrogenase est a catalisar a reaco de oxidao do enzima. O Declive da recta traada a partir do grfico da absorvncia em funo permite-nos calcular a velocidade inicial da reao. Observao: Para exemplificar, utiliza-mos os valores do homogenato.
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Absorvncia a 550nm do homogenato ao longo de 60s

0,68 0,66 0,64 Absorvncia 0,62 0,6 0,58 0,56 0,54 0 10 20 30 40 50 60 Tempo (segundos) y = 0,002x + 0,5466 R = 0,9963

Como os valores de absorvncia lidos neste ensaio esto dentro dos limites da lei de LambertBeer, entre 0,1 e 1,5, no foi necessrio diluir as fraces. V0 = 0,002 x 60 = 0,12 UA/min

Pela lei de Lambert-Beer: Em que c a concentrao molar (M), o percurso ptico (cm) e o coeficiente de absoro molar (M-1 cm-1). Neste caso, (citocromo c) = 21 000 M-1 cm-1. (Fonte: Protocolo experimental: Separao e Anlise de Componentes Celulares por Centrifugao Diferencial, pgina 23).

Para calcular volume inicial em mol/min utiliza-se o volume total das cuvettes calculado anteriormente: Volume = 2,1775 mL

Converso de mol/min para nmol/min: 1,243 x 10-8 x 109 = 12,43 nmol/min

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Os tubos de ensaio continham 50 L de cada fraco. Calculo da actividade enzimtica:

Actividade total do enzima corresponde actividade do volume total do homogenato: 41 516,2 U

Amostra

Volumet (mL) Homogenato 167 Pellet 1 20 Pellet 2 16,7 Pellet 3 16,7 Sobrenadante 3 16,2

Abs550/t (min-1) 0,12 0,066 0,084 0,138 0,0006

Actividade (U/mL) 248,6 152,4 169,845 283,07 1,24

Actividade (U) 41516,2 3048 2836,41 4727,34 20,15

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Frao lisossomal Determinao da atividade do fosfatase cido

No processo de centrifugao diferencial, os lisossomas, organitos notoriamente heterogneos em relao ao seu tamanho, co-sedimentam com outros organitos, ficando, deste modo, dispersos por vrias fraes. Nos lisossomas, encontram-se inmeros enzimas envolvidos na degradao de biomolculas, da a sua relativa importncia na organizao celular. Atravs de um enzima especfico, o fosfatase cido, conseguimos determinar a presena dos lisossomas nas amostras recolhidas, recorrendo espetrofotometria de UVVis. Este mesmo enzima responsvel pela hidrlise das ligaes ster de fosfato de forma no especfica. Sendo assim, vrios compostos que possuem grupos fosfato terminais so aptos para serem usados como substrato. Neste trabalho, recorremos ao p-nitrofenilfosfato (pNPP), um substrato artificial, incolor. O pNPP, aquando da hidrlise pelo fosfatase cido, resulta na produo de pnitrofenol (pNP), um composto amarelo, sendo possvel a sua determinao por mtodos espetrofotomtricos, e na libertao de fosfato inorgnico (Pi).

Figura 1 - Reaco do p-nitrofenilfosfato (pPP) a p-nitrofenol (pNP), catalizada pelo fosfatse cido.

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Para o doseamento da atividade do fosfatase cido, adicionaram-se os reagentes apresentados no Quadro 6.

Reagente
Frao (mL) Frao diluda 1/10 em H2O (mL) Desoxicolato de sdio 0,5% (m/v) (mL) Tampo acetato de sdio (pH 5,0) 0,5M (mL) pNPP 10mM (p-nitrofenilfosfato) (mL) NaOH (hidrxido de sdio) (mL)

Tubo Vtotal (mL) A B 0,1 - 0,1 0,2 0,2 4,0 0,2 0,2 0,5 0,5 3,0 3,0

Quadro 6 Contedo das cuvettes para o doseamento da atividade do fosfatase cido.

importante referir que foi, tambm, preparado um tubo controlo, igual aos anteriores mas em que o volume de frao celular substitudo por gua. Aps ter sido efetuada a preparao das amostras segundo o Quadro 6, mediram-se as absorvncias dos vrios tubos a 400 nm, usando o contedo do tubo controlo como branco. Como o tubo de controlo s contm os reagentes, necessrios para a determinao da atividade do fosfatase cido, e gua, o valor de absorvncia obtido nos diferentes tubos corresponde ao valor de absorvncia das amostras, sendo o valor das absorvncias dos reagentes naturalmente excludos.

Tubo A Homogenato B A Pellet 1 B A Pellet 2 B A Pellet 3 B A Sobrenadante 3 B

Quadro 7 Abs400.

Amostra

Abs400 0,521 0,010 0,364 -0,020 0,157 -0,035 0,698 -0,003 0,298 -0,031

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Os valores de absorvncia nulos e negativos no devem ser tidos em conta, sendo desprezados nos clculos. Como era esperado, os valores de absorvncia dos tubos A so superiores aos dos tubos B, devido, certamente, diluio efetuada numa razo 1/10, em gua, pelo que, no espetrofotmetro, o nmero de fotes que colidem com as molculas da amostra menor. Isto resulta, assim, em valores de absorvncia significativamente menores nos tubos B do que os que foram obtidos nos tubos A. No clculo da concentrao das amostras, podemos recorrer Lei de Beer-Lambert, dado que os valores de absorvncia obtidos encontram-se entre 0.1 e 1.5, onde a lei linear, logo, aplicvel.

A=lc

A Absorvncia ; Coeficiente de absoro molar ; l Espessura da cuvette (distncia atravessada pela luz no objecto contendo a amostra); c Concentrao da substncia absorvente.

Desta forma, era esperado um valor superior nas amostras de homogenato, o que foi verificado atravs da observao do Quadro 7, apenas no tubo B. Dado que o pellet 3 apresenta um valor de absorvncia, no tubo A, superior ao do tubo equivalente, no homogenato. Em seguida, supostamente, no pellet 3, seria observvel o segundo maior valor de absorvncia, devido ao facto de se tratar da frao mitocondrial, ou seja, onde se encontram os mitocndrios, lisossomas e peroxissomas. No entanto, s se verifica isto para o tubo B, sendo que o pellet 3 apresenta o maior valor de absorvncia no tubo A. O menor valor de absorvncia, em ambos os tubos (A e B), foi verificado no pellet 2. Principalmente, devido ao facto de ser neste que se encontra a frao mitocondrial pesada, pelo que a maior parte deposita-se no fundo da cuvette, diminuindo, assim, a probabilidade de um foto incidir com uma molcula da amostra, logo, o valor de absorvncia resultante ser menor relativamente aos valores de absorvncia obtidos nas outras amostras. O sobrenadante 3 corresponde frao solvel ou citoslica, isto , a parte solvel da clula, contendo protenas solveis (incluindo um grande nmero de enzimas tais como lipases ou transaminases) e outras molculas de pequenas dimenses. Os valores de absorvncia obtidos para o mesmo, em ambos os tubos (A e B), so relativamente baixos, quando comparados com os outros. Teoricamente, os valores de absorvncia obtidos para o sobrenadante 3 j eram esperados, dado que na frao citoslica no devem existir lisossomas. O pellet 1, por sua vez, corresponde frao nuclear. Portanto, nesta amostra, encontram-se, muito provavelmente, ncleos, contendo o material gentico, e alguns restos

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de clulas que sofreram rutura parcial ou no chegaram a sofrer rutura, e ainda, fragmentos de membrana plasmtica. Exemplificao dos clculos para a amostra de homogenato, no diluda, isto , no tubo A:

= = 0,0521 min-1

Abs400nm = 0,521

U (Unidade enzimtica) Neste caso, determina a quantidade de enzima que catalisa a formao de 1 mole de pNP por minuto (mole/min).

Para calcular a atividade enzimtica em U/mL:

Vreaco =
Atividade (U/mL) = vreaco x Vcuvette

Recorremos Lei de Beer-Lambert:

Abs = lc

Abs = c l

c =

pNP = 21 000 M-1 cm-1

Determinao da concentrao da amostra:

c=

c=

c 2,481x10-5 M

No nosso trabalho, dado que os valores obtidos para as absorvncias no tubo A esto abaixo de 1, podemos consider-los nos clculos, sendo desprezados os do tubo B. No entanto, caso seria preciso recorrer aos valores de absorvncia deste mesmo tubo B, teramos que multiplicar o valor da concentrao obtido por 10, visto que as amostras encontram-se diludas numa razo 1/10.

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Clculo da velocidade de reao:

Vreaco =

Vreaco =

M min-1

Vreaco = 0,0521 x

Vreaco 2,481x10-6 M min-1

Clculo da atividade do fosfatase cido: Atividade (U/mL) = (vreaco x Vcuvette)/(Vfrao na cuvette) Atividade (U/mL) =

de salientar que a molaridade do coeficiente de absoro molar expresso em mol L-1, logo, para converter de mol para mole, necessrio multiplicar por 106. Deste modo, obtm-se:

Atividade (U/mL) =

Atividade (U/mL) 0,09924 U/mL

Clculo da atividade total: Atividadet (U) = Atividade (U/mL) x Vtotal da frao Atividadet (U) = 0,09924 x 167 Atividadet (U) 16,573 U

Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Volumet (mL) 167,0 20,0 16,7 16,7 16,2

Diluio Abs400 0,521 0,364 0,157 0,698 0,298

Abs400/t (min-1) 0,0521 0,0364 0,0157 0,0698 0,0298

Atividade (U/mL) 0,09924 0,06933 0,02990 0,13295 0,05676

Atividade total (U) 16,573 1,3866 0,4994 2,2194 9,1951

Quadro 8: Frao lisossomal - determinao da atividade do fosfatas cido

Os lisossomas tm dimenses semelhantes s dos outros organitos celulares e so heterogneos, obtendo-se, deste modo, pellets heterogneos. Alguns lisossomas que se 17

encontravam perto do fundo do tubo da centrfuga podem ter sido arrastados por molculas de maiores dimenses, sedimentando. A atividade enzimtica permite inferir a quantidade de enzima presente numa dada amostra. Se o valor obtido for bastante elevado, isso traduz-se numa grande quantidade de enzima presente nessa amostra em estudo. Atravs da observao do Quadro 8, verifica-se uma atividade notoriamente elevada no Homogenato e no Pellet 3. Sendo esperado, teoricamente, que tal acontecesse. Dado que se trata da frao mitocondrial no Pellet 3, contendo os lisossomas, mitocndrios e peroxissomas, tal como foi anteriormente explicado. A elevada quantidade de fosfatase cido presente no Pellet 3 deve-se, muito provavelmente, ao facto da maioria dos lisossomas sedimentarem e a quantidade relativa de outros organitos ser menor, isto , existem menos contaminantes.

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Distribuio dos marcadores enzimticos estudados

Clculo da massa da protena:

mprotena = [protena] x Volumet

Exemplificando para o Homogenato: mprotena = 2,481x10-5 x 167,0 mprotena 4,143 x 10-3 mg

Clculo da actividade especfica: Atividade especfica (U/mg) =

Exemplificando para o fosfatase cido no homogenato: Atividade especfica (U/mg) = Atividade especfica (U/mg) 4000 U/mg

Amostra mprotena (mg) Homogenato 4,153 x 10-3 Pellet 1 3,466 x 10-4 Pellet 2 1,248 x 10-4 Pellet 3 5,551 x 10.4 Sobrenadante 3 2,299 x 10-4
Quadro 9: Massa das protenas nas diferentes amostras.

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Amostra Homogenato do fgado de rato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Volumet (mL) 167,0 20,0 16,7 16,7 16,2

[protena] (mg/mL)

Succinato: citocrmo c oxidoreductase Atividade Atividade especfica (U/mL) (U/mg) 248,857 3048 169,875 283,07 1,244 10030511 175879976 5110559,56 8515944,64 87667,17

Atividade do fosfatase cido Atividade Atividad especfica e (U/mL) (U/mg) 0,09924 0,06933 0,02990 0,13295 0,05676 4000 4000,57 900 3999,7 4000

2.481 x 10-5 1.733 x 10-5 7.476 x 10-6 3.324 x 10-5 1.419 x 10-5

Quadro 10: Valores das actividades enzimticas e especficas, volume total e concentrao proteica das diferentes amostras

Os valores de actividade obtidos na tabela acima exemplificada so extremamente improvveis pelo que no podemos concluir nada.

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Comparando os resultados obtidos para cada amostra e para cada marcador enzimtico verifica-se que, na amostra de homogenato, a quantidade de mitocndrios foi muito superior quantidade de lisossomas, dado que a actividade especfica do enzima succinato desidrogenase, para uma menor concentrao proteica, foi muito superior actividade especfica do enzima fosfatase cido. O mesmo se verificou para o sobrenadante 3 e pellet 2. Devido ao explicado anteriormente acerca do pellet 1, pode-se inferir que nesta amostra predominavam os lisossomas em relao aos mitocndrios. Excepto para esta amostra, verifica-se que a actividade do enzima succinato desidrogenase foi superior do fosfatase cido, indicando que nas restantes amostras a quantidade de mitocndrios foi superior de lisossomas. A centrifugao diferencial realizada no teve a eficcia esperada, obtendo-se amostras heterogneas e com alguns contaminantes. A maioria dos contaminantes surgiu no sobrenadante 3, pois, teoricamente, esperava-se que estas amostras no contivessem lisossomas ou mitocndrios. Deste modo, pode-se concluir que na separao dos mitocndrios, os resultados experimentais no correspondem aos previstos, pois no se obteve uma maior percentagem destes nos pellets 2 e 3. Para o caso dos lisossomas, os resultados experimentais corresponderam ao previsto porque, apesar de se ter obtido estes organitos em todas as fraes, verificou-se uma maior quantidade no pellet 3. Apesar de no se ter obtido uma separao total dos lisossomas, houve uma separao parcial, ao contrrio do que se obteve para os mitocndrios. Como referido, a presena de lisossomas noutras fraes pode ter ocorrido por organitos de menores dimenses serem arrastados, durante a centrifugao, pelos de maiores dimenses. Para se fazer uma melhor separao dos componentes celulares, poder-se-ia recorrer a outro tipo de centrifugao ou complementar esta centrifugao com outra para se obter pellets menos heterogneos, explorando-se as diferenas de tamanho e densidade dos componentes celulares.

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Anlise da Frao Nuclear - Isolamento do DNA:

Diluio 1/10 Abs260nm Abs280nm Abs260nm Abs280nm 2,201 1,117 1,132 0,553
Quadro 11 Valores de absorvncia (260nm e 280nm), com e sem diluio.

Com o intuito de calcular a concentrao de DNA, registou-se os valores de absorvncia em dois comprimentos de onda, a 260 nm e 280 nm. A escolha destes comprimentos de onda justifica-se pelo facto de, em primeiro lugar, ser verificado um valor de absorvncia mximo das molculas a 260 nm e, a 280 nm, ser verificado um valor de absorvncia mximo para as protenas, nomeadamente, devido presena de certos aminocidos aromticos, tais como a fenilalanina, a treonina e o triptofano. Para alm disso, as leituras de absorvncia a 280 nm do informao acerca do grau de contaminao do Pellet 1. O recurso diluio 1/10 tem o objectivo de obter valores de absorvncia dentro do intervalo de valores em que a Lei de Beer-Lambert linear, isto , teoricamente aplicvel. Sendo os valores de absorvncia das amostras originais, ou seja, sem diluio, desprezados. Para calcular o grau de purificao do Pellet 1, correspondente frao nuclear na qual se inclui o DNA, recorreu-se aos valores das absorvncias a 260 nm e a 280 nm. Para tal, necessrio obter a razo entre estes mesmos valores, dividindo o valor de absorvncia a 260 nm pelo valor de absorvncia a 280 nm.

Amostra Frao de DNA

[DNA]inicial (mg/mL) 0,566

mDNA (em 20 mL de homogenato) (mg) 11,32

% DNAfigado (m/m) 0,0678 2,047

Quadro 12 Resultados da anlise da frao nuclear.

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Nos clculos seguintes, considerou-se 1 U.A260 correspondente a uma concentrao de DNA de 50 g/mL.

Clculo da concentrao de DNA (na amostra diluda) em mg/mL:

[DNA]inicial (mg/mL) = ?

Sabemos que 1 U.A260 corresponde a uma concentrao de DNA de 50 g/mL.

Logo, vem: 1,132 U.A260 (diluio 1/10) = 50 x 1,132 = 56,6 g/mL = 0,0566 mg/mL. Agora, para obter a concentrao real, multiplicamos pelo facto de diluio: 0,0566 x 10 = 0,566 mg/mL.

[DNA]inicial (mg/mL) = 0,566 mg/mL

Clculo da massa de DNA no homogenato (20mL) em mg:

O Pellet 1, correspondente frao nuclear, foi diluido em 20 mL da soluo tamponada Tris-HCl pH (8,0) 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 100 mM.

[DNA] = 0,566 = 11,32 mg

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Clculo da massa de DNA no fgado:

mfgado = 16,6898 g = 11,32 mg = 0,01132 g

Sabemos que: %(m/m) = x 100 = x 100 = 0,0678 %

Logo, podemos inferir que em cada 100 g, existem 0,0678 g de DNA.

Clculo da razo entre as absorvncias a 260 nm e 280 nm:

2,047

A razo entre as absorvncias foi de aproximadamente 2,047; um valor perto de 2. Deste modo, podemos inferir que a contaminao de protenas foi relativamente reduzida na amostra de DNA, dado que este valor encontra-se muito prximo de 2. No entanto, de salientar que nesta frao existiam restos celulares, consequentes de rupturas parciais ou at que no sofreram ruptura nenhuma e, para alm disso, molculas de RNA que no foram degradas, permanecendo na amostra. Influenciando o grau de pureza do DNA. Para alm disso, aquando da centrifugao, possvel que algumas protenas de menores dimenses que se encontram perto do fundo do tubo da centrfuga podem ter sedimentado. Sendo arrastadas com a frao nuclear, que por sua vez possui molculas de maiores dimenses. Assim sendo, o grau de pureza igualmente afectado. Obtendo-se, deste modo, um Pellet impuro.

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Conclusao
Atravs desta atividade experimental foi possvel realizar a separao de organelos celulares, verificou-se que a centrifugao diferencial consiste numa tcnica rpida e eficiente. O mtodo do biureto um mtodo rpido e bastante utilizado para realizar o doseamento de protenas numa determinada amostra, sendo a sua presena confirmada pela formao de um complexo de cobre, o que confere uma cor violeta amostra. No doseamento da atividade do fosfatase cido, os valores das absorvncias do tubo A foram superiores aos do tubo B devido diluio efetuada, o que diminuiu o nmero de fotes que colidem com as molculas da amostra. Na anlise da frao nuclear, foi obtido uma percentagem de massa total de DNA por massa de fgado de 0.0678%. Dado que amostra est contaminada com molculas de RNA. De forma a aumentar a eficincia da centrifugao, poderamos ter realizado um maior nmero de centrifugaes ou, ento, aps termos suspendido as diferentes fraes, realizarmos novas centrifugaes. = 2.047, podemos deduzir que a

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Bibliografia
NELSON, L. David, COX, M. Michael., Lehninger, Principles of Biochemistry, 5 edio, W, H, Freeman and Company, 2008

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