Laboratoire dexpertises et danalyses alimentaires

PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE 1 LEAA-REF-MIC-550

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE TABLE DES MATIRES 1. 2. 3. 4. INTRODUCTION ....................................................................................... 4 MATRIEL ET QUIPEMENT DE BASE........................................................... 4 RCEPTION, ENTREPOSAGE ET DCONGLATION DES CHANTILLONS ............ 5 3.3.1 4.3.1 4.3.2 4.3.3 Gnralits .................................................................................. 5 Tous les aliments .......................................................................... 7 Aliments liquides ou semi-liquides ................................................... 8 Regroupement des units danalyse (unit composite) pour la recherche de bactries pathognes (exemple : Salmonella, Listeria monocytogenes, etc.) .................................................................... 8 Viandes en bloc ............................................................................ 8 Poisson entier cru ......................................................................... 8 Mollusques crus ............................................................................ 8 Crustacs non dcortiqus crus ou cuits ........................................... 9 Volaille crue avec peau .................................................................. 9 ufs........................................................................................... 9 Procdure de prlvement pour la recherche des salmonelles sur la coquille et l'intrieur des ufs ............................................... 9 PRLVEMENT ET PESE ........................................................................... 6

4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 4.3.8 4.3.9

4.3.9.1

4.3.9.1.1 Extrieur........................................................................... 9 4.3.9.1.2 Intrieur ........................................................................... 9 4.3.9.2 Procdure de prlvement pour lanalyse de lintrieur de luf seulement ........................................................................... 10

4.3.10 Laits secs................................................................................... 10 4.3.11 Produits chambrs ...................................................................... 10 4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.) et fromages gras.... 10 4.3.13 Produits secs dshydrats (exemples : pices, crales, lgumineuses sches, riz sec)........................................................................... 10 4.3.14 Procdure de prlvement pour la recherche de salmonelles dans les graines de germes (luzerne, radis, etc.) ......................................... 11 4.3.15 Produits trs sals (5 %) ............................................................ 11 4.3.16 Produits trs sucrs (miel, sucreries, sirop drable, etc.) ................. 11 4.3.17 Conserves.................................................................................. 11 4.3.18 Procdure pour la recherche des bactries pathognes la surface des fruits frais entiers (cantaloups, melons, etc.) .................................. 11 4.3.19 couvillons................................................................................. 12 4.3.19.1 couvillon reu dans un tube contenant 10 ml de tampon neutralisant : ....................................................................... 12 4.3.19.2 couvillon reu dans un tube contenant moins de 1 ml de tampon neutralisant: ........................................................................ 12 4.3.20 ponges .................................................................................... 12 5. 6. 7. DILUANTS ..............................................................................................12 BROYAGE ET HOMOGNISATION .............................................................13 DILUTIONS DES CHANTILLONS ...............................................................14

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE 7.1.1 7.1.2 7.2.1 7.2.2 8. 9. Dfinition................................................................................... 14 Procdure .................................................................................. 14 Dfinition................................................................................... 14 Procdure .................................................................................. 15

BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................16 APPROBATION ........................................................................................17

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE

1.

INTRODUCTION

Le prlvement des chantillons effectu dans le but de raliser une analyse microbiologique est une tape trs importante de la chane analytique. Il est primordial de s'assurer de l'intgrit et de la reprsentativit des chantillons. Le prlvement des chantillons peut grandement influencer les rsultats obtenus. La prparation des chantillons pour lanalyse microbiologique comprend plusieurs tapes : la rception des chantillons, le prlvement et la pese, le broyage et lhomognisation et la dilution des chantillons (solution mre et dilutions dcimales suivantes). Les chantillons doivent tre en tout temps minutieusement manipuls en respectant lensemble des rgles dasepsie de manire viter toute contamination. Lensemble des protocoles pour la fabrication des diluants mentionns dans ce document se retrouve dans le document LEAA-REF-MIC-100.

2.
-

MATRIEL ET QUIPEMENT DE BASE

Appareil dilution automatique (ex: Dilumat AES laboratoire) ou balance analytique de porte suffisante avec une prcision de lecture de 0,1 g; Diluants ou bouillons d'enrichissement; Instruments de prlvement (couteaux, fourchettes, spatules, pinces, ciseaux, scalpels, cuillres, etc., striles); Alcool 95 % pour flambage, si ncessaire; Alcool 70 %; Homognisateur de type pristaltique avec des sacs striles de plastique; Pipettes srologiques striles; Rfrigrateurs 1 6 oC; Conglateurs -9 -30 oC; Micropipettes; Tubes 9 ml de peptone-sel 2 %; Bain-marie; Savons et dtergents germicides.

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3.

RCEPTION, ENTREPOSAGE CHANTILLONS

ET

DCONGLATION

DES

3.1

VRIFICATION DES CONDITIONS DE TRANSPORT ET DE LINTGRIT DES

CONTENANTS

Lorsque les dlais de transport ( 36 heures) et que la temprature de conservation ( 6 C) des chantillons sont adquats, vrifier les contenants afin de dtecter tout dfaut physique. Inspecter minutieusement les sacs de plastique, les bouteilles et autres contenants afin de vrifier s'il y a prsence de trous, de fissures ou de perte de liquide. Vrifier si l'eau de la glacire ne s'est pas infiltre dans l'chantillon. S'assurer que les sacs de plastique (type Whirl-pak) sont trs bien rouls et ferms hermtiquement. Vrifier que les chantillons deau ne sont pas congels lors de leur rception au laboratoire. N'importe laquelle des irrgularits cites prcdemment invalide l'chantillon pour lanalyse microbiologique et le client concern doit en tre inform afin de procder un autre prlvement, si ncessaire.

3.2

IDENTIFICATION ET ENREGISTREMENT DES CHANTILLONS

S'assurer que chaque chantillon est tiquet et accompagn d'une demande de service analytique (demande danalyse lectronique Herms ou formulaire procsverbal de prlvement) lui attribuant un numro de laboratoire officiel et renfermant l'ensemble des informations y tant rattaches. Vrifier la correspondance entre la description de l'chantillon sur la demande et la nature des chantillons expdis. Complter la description, particulirement si elle a un impact sur linterprtation des rsultats (exemples : produit cru, cuit, congel, ferment, etc.). Procder la dtermination et lenregistrement des paramtres analytiques.

3.3
3.3.1

ENTREPOSAGE DES CHANTILLONS

GNRALITS

Dans des conditions optimales, on doit toujours analyser les chantillons immdiatement, ou dans le plus court dlai aprs leur rception au laboratoire. moins dindication contraire, les chantillons daliments prissables doivent tre analyss dans un dlai maximal de 36 heures entre le prlvement et lanalyse au laboratoire. Si exceptionnellement l'analyse doit tre reporte, entreposer les chantillons au conglateur, la temprature de la pice, ou au rfrigrateur, selon la nature de lchantillon. L'interprtation des rsultats devra tenir compte de cette priode dentreposage. Pour les Campylobacters thermotolrants et les bactries anarobies strictes, ainsi que pour tout autre microorganisme dont la survie est susceptible d'tre fortement

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compromise par des conditions d'entreposage prolonges ou par une conglation, l'analyse doit tre effectue le plus rapidement possible. Les produits non prissables, les conserves ou les aliments secs doivent tre conservs la temprature de la pice. Les aliments reus congels au laboratoire doivent tre entreposs congels jusqu'au moment de l'analyse. Pour la ralisation des prlvements, les chantillons doivent tre sortis du rfrigrateur pendant un maximum de 15 minutes la temprature de la pice. Lorsque le prlvement est termin, les chantillons sont immdiatement rfrigrs. Par la suite, ils sont conservs pendant une priode dterminer en fonction des besoins. Les chantillons doivent toujours tre classs et conservs dans un endroit propre et l'abri de toute contamination extrieure.

3.4

DCONGLATION DES CHANTILLONS

Les chantillons sont dcongels au rfrigrateur jusquau lendemain.

4.
4.1

PRLVEMENT ET PESE
DFINITIONS

CHANTILLON : Quantit de produit prlev dun lot et soumis des analyses en laboratoire. Un chantillon peut consister en une ou plusieurs units dchantillonnage. UNIT DCHANTILLONNAGE : Portion ou contenant individuel de produit prlev au hasard dans un lot. Une unit dchantillonnage peut correspondre un chantillon. UNIT DANALYSE : La quantit de produit prleve de lunit dchantillonnage pour analyse. UNIT COMPOSITE : Regroupement des units danalyse ou dchantillonnage pour lanalyse.

4.2

MESURES DHYGINE ET DE SALUBRIT

La salle de prlvement (murs et planchers) doit tre propre en tout temps. Les surfaces de travail doivent tre laves et dsinfectes l'aide d'un dtergent germicide. Des contrles de la qualit de l'air et des surfaces de travail doivent tre effectus rgulirement. Les manipulations doivent tre effectues de faon aseptique afin dviter la contamination des produits tudis. La propret des mains et des ongles est primordiale et le personnel n'oubliera pas que les vtements, les cheveux, les mains et l'air expir contiennent ou supportent toujours des microorganismes.

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Le prlvement comprend la pese et lajout du diluant. Lenceinte de scurit biologique (ESB) doit tre utilise pour les chantillons ncessitant une asepsie plus rigoureuse, un environnement strile - comme dans le cas dune conserve - ou lorsque le prlvement est susceptible de produire des arosols infectieux, des concentrations leves ou de grands volumes de matires infectieuses, comme cest le cas avec le lait cru, la moule, un essai daptitude, un aliment dshydrat ou en poudre, etc. Les instruments utiliss pour le prlvement doivent toujours tre striles et ne servir que pour un seul chantillon. Ils doivent tre nettoys et striliss nouveau avant chaque utilisation. Certains instruments (pince, ciseau, etc.) peuvent tre striliss par flambage lalcool 95%.

4.3
4.3.1

PRISE DE L'UNIT D'ANALYSE ET PESE

TOUS LES ALIMENTS

Toute observation anormale constate lors du prlvement dun chantillon (exemples : mauvaise odeur, couleur anormale, prsence de moisissures, etc.) doit tre signale un professionnel. Pour chaque pese, les informations suivantes doivent tre enregistres : le numro de lchantillon, le nom du technicien qui prlve, la date et lheure du prlvement, la quantit dchantillon prleve, le nom et le numro de lot du diluant utilis, la quantit de diluant utilise, le poids total de lchantillon avec le diluant, le facteur de dilution et lidentification de lappareil dilution automatique utilis. L'extrieur des contenants des chantillons doit toujours tre propre avant le prlvement. Si ncessaire, nettoyer et dsinfecter avec de lalcool 70 %. Peser environ 25 g de l'chantillon (au minimum 10 g) dans un sac strile de polythylne pralablement tar. Il est important de prlever 4 ou 5 endroits dans l'chantillon afin d'obtenir un chantillonnage reprsentatif. Lorsque la quantit d'aliment prleve diffre de 25 g, la raison doit tre enregistre et un professionnel doit tre avis, sauf pour le prlvement des pices et assaisonnements pour lesquels lunit danalyse est toujours ralise partir dune pese de dix grammes. Si lchantillon est compos de plusieurs lments, chaque lment sera prlev dans une proportion sensiblement quivalente celle qu'il reprsente; l'unit d'analyse devra comporter des prlvements en surface et en profondeur, dans les mmes proportions que dans l'aliment, sauf lors de spcifications particulires. Lanalyse de certaines portions de lchantillon peut tre ralise sparment, la demande du professionnel (exemple : analyser seulement la garniture dun gteau). Si la totalit de l'chantillon est de moins de 25 g, peser l'chantillon au complet et additionner le diluant requis jusqu lobtention dune dilution 10-1. Le volume total de liquide doit couvrir l'chantillon.

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE 4.3.2 ALIMENTS LIQUIDES OU SEMI-LIQUIDES

Mlanger jusqu homognisation complte et prlever 25 g. 4.3.3 REGROUPEMENT DES UNITS DANALYSE POUR LA RECHERCHE DE BACTRIES
PATHOGNES

La recherche de bactries pathognes telles que Salmonella, Listeria monocytogenes, etc. peut tre faite sur une unit composite, cest--dire le regroupement de deux units danalyse. viter de regrouper des chantillons relatifs aux toxi-infections, aux plaintes de consommateurs et aux saisies. Protocoles : Ne regrouper que des produits de composition et de caractristiques physicochimiques similaires (Exemple : pH). Respecter les numros de lots s'il y a lieu. Peser 25 g de chacun des 2 chantillons dans un mme sac homognisateur de type pristaltique. Ajouter environ 225 ml du diluant appropri et homogniser les 2 prlvements ensemble. Par la suite, complter environ 500 g avec le diluant et homogniser manuellement. Incuber et poursuivre lanalyse. Si le rsultat s'avre positif, il peut tre ncessaire de reprendre l'analyse des 2 chantillons sparment ou de refaire prlever par le client. 4.3.4 VIANDES EN BLOC

Prlever le premier centimtre de surface 4 ou 5 endroits l'aide d'un instrument strile. 4.3.5 POISSON ENTIER CRU Enlever la peau l'aide d'instruments striles et prlever le premier centimtre de surface 4 ou 5 endroits. 4.3.6 MOLLUSQUES CRUS Trier et carter les coquillages morts ou ayant la carapace abme. Les mollusques vivants se ferment compltement et rapidement avec une pression. Dans le cas contraire, ils ne doivent pas tre utiliss pour lanalyse. Les coquilles des mollusques doivent tre laves et brosses l'eau potable courante, principalement au niveau de la zone douverture. viter de rincer lintrieur des coquilles. goutter les mollusques propres et asscher avec un papier absorbant. Utiliser des instruments striles pour ouvrir les coquilles. Rcuprer le liquide et dtacher la chair avec un couteau et des pinces en vitant toute contamination par lextrieur de la coquille. Sil y a prsence de byssus, le couper avec un ciseau strile (flamb lalcool) avant ouverture, mais ne pas larracher. Lanalyse des mollusques prend en compte la chair et leau intervalvaire. Regrouper plusieurs mollusques pour constituer lunit danalyse (5 7 au minimum).

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE 4.3.7 Les mollusques doivent tre homogniss manuellement deux minutes pour viter de perforer le sac de prlvement. CRUSTACS NON DCORTIQUS CRUS OU CUITS

Les crustacs tels que le homard et le crabe sont dcortiqus avec des instruments striles et la chair est prleve 4 ou 5 endroits de l'chantillon (pinces, abdomen, pattes, etc.). Les petites crevettes sont dcortiques et la chair est prleve. Plusieurs crevettes constituent alors lunit danalyse. 4.3.8 VOLAILLE CRUE AVEC PEAU

En gnral, prlever une proportion de peau avec les premiers centimtres du muscle, 4 ou 5 endroits sur la coupe de volaille. 4.3.9 4.3.9.1 UFS Procdure de prlvement pour la recherche des salmonelles sur la coquille et l'intrieur des ufs

Grouper 4 6 ufs par chantillon. Ceux-ci ne doivent prsenter aucune craquelure. 4.3.9.1.1 EXTRIEUR Manipuler les ufs l'aide d'une pince strile. Dposer dlicatement les ufs dans un sac strile contenant 225 ml d'eau peptone tamponne. Laver les coquilles avec le diluant, retirer les ufs un un et les dposer dans un contenant d'alcool 70 %. Incuber l'eau peptone tamponne selon le protocole de la mthode danalyse utilise. 4.3.9.1.2 INTRIEUR Les 4 6 ufs prpars selon la mthode prcdente (4.3.9.1.1) sont immdiatement retirs du bain d'alcool 70 % et dposs sur un papier absorbant pour enlever l'excs d'alcool. Ne pas laisser tremper les ufs dans lalcool. Par la suite, lorsque lalcool est vapor, les ufs sont casss dans un sac strile. Le technicien doit porter une nouvelle paire de gants pour prlever un nouvel chantillon (compos de 4 6 ufs). Bien mlanger les ufs avec lhomognisateur de type pristaltique pendant environ 15 secondes. Pour un chantillon compos de 4 6 ufs, prlever 50 g du mlange et ajouter environ 200 ml deau peptone tamponne prchauffe 35C. Agiter avec lhomognisateur de type pristaltique pendant un minimum de 30 secondes, complter environ 500 g avec le diluant afin dobtenir une dilution 10-1 et agiter manuellement.

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE 4.3.9.2 Procdure de prlvement pour lanalyse de lintrieur de luf seulement

Laver les ufs l'eau et au savon germicide. Mettre les ufs dans lalcool 70 % et les retirer immdiatement pour les dposer sur un papier absorbant pour enlever l'excs d'alcool. Lorsque lalcool est vapor, poursuivre le prlvement tel quindiqu prcdemment (section 4.3.9.1.2). 4.3.10 LAITS EN POUDRE

Mlanger soigneusement le contenu du rcipient ferm en le secouant de faon rpte. Lchantillon (pese et ajout du diluant) doit tre prlev dans une ESB. Laisser tremper lchantillon dans le diluant 30 minutes temprature de la pice avant d'homogniser, afin de revivifier les cellules microbiennes endommages. 4.3.11 PRODUITS CHAMBRS

Les produits chambrs doivent tre entreposs la temprature de la pice jusquau moment de lanalyse. Les diluants utiliss pour les produits chambrs doivent galement tre la temprature de la pice. 4.3.12 PRODUITS GRAS (BEURRE, MARGARINE, SAINDOUX, ETC.) ET FROMAGES GRAS

Utiliser un diluant contenant du citrate de sodium 2 % comme dispersant pour le prlvement des fromages gras et des produits gras tels le beurre, la margarine, le saindoux, etc. Le diluant doit tre pralablement chauff 45 oC pour permettre une mulsion complte du gras avant l'homognisation. Homogniser et prlever dans la phase aqueuse en vitant de prlever du gras. Lorsquelle est consomme, la crote des fromages doit tre prleve en fonction de la proportion quelle reprsente. 4.3.13
SEC, ETC.)

PRODUITS SECS DSHYDRATS (PICES, CRALES, LGUMINEUSES SCHES, RIZ

Mlanger soigneusement lchantillon de produits secs avec un ustensile strile avant de prlever. Un pr-trempage dans le diluant de 30 minutes temprature de la pice est ncessaire avant d'homogniser, afin de revivifier les cellules microbiennes endommages Pour connatre le bouillon nonslectif appropri la recherche de Salmonella spp., se rfrer au Tableau 1 de la mthode MFHPB-20 de Sant Canada (Isolement et identifications des salmonella dans les aliments et les chantillons environnementaux). Par exemple, le bouillon trypticase renfermant 0,5 % de K2SO3 doit tre utilis pour les oignons et lail, tandis que les produits laitiers ( lexception des fromages) doivent tre dilus avec une solution aqueuse de vert brillant. Pour la recherche de Salmonella spp. ou autre pathogne ncessitant une tape de pr-enrichissement, des rapports de dilution (poids/volume) entre les pices ou assaisonnements et le bouillon denrichissement sont recommands (autre que

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10-1). Certaines pices sont bactricides ou bactriostatiques, cest pourquoi une dilution suprieure est ncessaire. Pour connatre les rapports recommands entre les pices et assaisonnements et le bouillon de pr-enrichissement, se rfrer au Tableau III de la mthode MFHPB-20. 4.3.14 PROCDURE DE PRLVEMENT POUR LA RECHERCHE DE SALMONELLES DANS LES (LUZERNE, RADIS, ETC.)

GRAINES GERMES

Peser de faon strile 125 g de graines dans un contenant strile (par exemple, un sac homognisateur pristaltique insr dans un bcher) et ajouter de l'eau dminralise strile jusqu' ce que le niveau dpasse les graines. Recouvrir de faon strile et incuber 30 C pendant trois jours. Le premier volume d'eau ajout sera absorb rapidement. Aprs environ deux heures, ajouter encore de l'eau pour rtablir le niveau et continuer de surveiller le niveau d'eau pendant le reste de la priode d'incubation. Ajouter de leau dminralise strile au besoin. Le processus de germination devrait dbuter aprs trois jours d'incubation, selon la varit de graines: les enveloppes devraient avoir clat et une certaine germination devrait tre apparente. Peser de faon strile 25 g du mlange de graines germes et d'eau et ajouter 225 mL de diluant. Incuber de 18 24 heures 35 C. Poursuivre lanalyse selon la mthode MFHPB-20, partir de ltape de lenrichissement en milieu slectif. 4.3.15 PRODUITS TRS SALS (5 %)

Pour le dnombrement de la microflore gnrale (bactries, levures et moisissures), le diluant utilis doit contenir 5 % de NaCl. Utiliser ce diluant pour la suspension mre et les dilutions dcimales subsquentes. 4.3.16 PRODUITS TRS SUCRS (MIEL, SUCRERIES, SIROP DRABLE, ETC.)

Pour la recherche dune microflore gnrale (bactries, levures et moisissures), lorsquun aliment renferme plus de 25 % de sucre, utiliser un diluant 40 % de sucre (exemple : peptone sel + 40 % dextrose) afin dviter la perte des cellules osmophiles. Utiliser ce diluant pour la suspension mre et les dilutions dcimales subsquentes. Le milieu de culture devra aussi contenir 40 % de sucre (exemple : Sabouraud dextrose agar 40%). 4.3.17 CONSERVES

Se rfrer la mthode LEAA-M-MIC-020. 4.3.18 PROCDURE POUR LA RECHERCHE DES BACTRIES PATHOGNES LA SURFACE DES (CANTALOUPS, MELONS, ETC.)

FRUITS FRAIS ENTIERS

Dposer lchantillon en entier dans un sac strile. Le diluant est dtermin selon la mthode utilise et est prchauff la temprature dincubation de lchantillon.

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Recouvrir entirement lchantillon avec le diluant et incuber la temprature demande par la mthode danalyse. 4.3.19 COUVILLONS

4.3.19.1 couvillon reu dans un tube contenant 10 ml de tampon neutralisant : la rception de lchantillon, il est considr que la dilution est 10-1. Ce tube est utilis pour la prparation des dilutions dcimales subsquentes. 4.3.19.2 couvillon reu dans un tube contenant moins de 1 ml de tampon neutralisant: la rception de lchantillon, il est considr quil ny a pas de facteur de dilution. Procdure : 1. partir dun tube 9 ml de peptone-sel, mettre 1 ml de diluant dans le tube contenant lcouvillon; 2. Mlanger le tube au vortex; 3. Remettre tout le liquide dans le mme tube de dpart de 9 ml; 4. Toujours partir du mme tube de dpart de 9 ml de peptone-sel, rincer lcouvillon une deuxime fois en rptant les tapes 1 3; 5. Le tube ainsi obtenu correspond la dilution 10-1; 6. Utiliser ce tube pour la prparation des dilutions dcimales subsquentes. 4.3.20 PONGES

Ce type de prlvement est considr comme une dilution de 10-1. Le diluant appropri est ajout jusqu' lobtention dun poids de 100 g (dilution 10-2).

5.

DILUANTS

Le choix dun diluant est fonction du microorganisme recherch et de la mthode danalyse ralise. La nature du produit analyser peut galement tre un facteur dterminant dans le choix dun diluant. La mthode danalyse et les normes spcifiques aux produits servent choisir le diluant appropri.

5.1

DILUANT DEMPLOI GNRAL

Le diluant gnral Peptone-Sel semble le plus appropri pour la majorit des aliments lorsque la recherche de salmonelles nest pas requise.

5.2

DILUANT UTILISER POUR LA RECHERCHE DE SALMONELLA SPP.

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Le diluant utilis pour la recherche de Salmonella spp est leau peptone tamponne, sauf pour quelques aliments tels les confiseries, produits laitiers, pices et assaisonnements. Le Tableau 1 de la mthode MFHPPB-20 de Sant Canada indique le bouillon non-slectif appropri au type daliment.

5.3

BOUILLONS DENRICHISSEMENT INITIAUX

Les bouillons denrichissement initiaux doivent toujours tre utiliss la temprature ambiante (jamais rfrigr) sauf pour les mthodes disolement dE.coli O157 (le bouillon Doyle doit tre pralablement chauff 35 C) et disolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. (mthode MFHPB-30; le bouillon LEB doit tre pralablement chauff 30C). Lors du regroupement des units dchantillonnage et pour les units dchantillonnage dun poids suprieur 25 g, les bouillons denrichissement initiaux doivent tre chauffs la temprature dincubation avant de procder la dilution des chantillons, De plus, pour lanalyse des produits gras (beurre, fromage, etc.), le diluant contenant du citrate de sodium 2 % utilis comme dispersant doit pralablement tre chauff 45 C (voir la section 4.3.12). Les bouillons prchauffs doivent tre utiliss dans la journe.

5.4

BOUILLONS DENRICHISSEMENT SECONDAIRES

Pour les bouillons denrichissement secondaire et pour les units dchantillonnage de 25 g ou moins, la temprature du bouillon doit tre la temprature ambiante avant de procder lanalyse.

6.

BROYAGE ET HOMOGNISATION

Il est suggr d'utiliser un homognisateur de type pristaltique plutt qu'un mlangeur de type rotatif pour le broyage des chantillons. Une homognisation complte de l'aliment n'est pas ncessaire. Les microorganismes seront dlogs de l'chantillon par de forts jets de liquide et par crasement de l'aliment. L'aliment devrait normalement tre homognis pour une priode de deux minutes. Il est important dobserver lchantillon aprs lhomognisation pour vrifier lefficacit du broyage. Dans le cas contraire, lhomognisation doit tre recommence. L'homognisateur pristaltique ne doit pas tre utilis pour des produits alimentaires susceptibles d'entraner des perforations du sac (prsence de particules pointues, dures ou sches) moins dutiliser deux sacs striles ou plus afin dempcher la perforation et un dbordement possible de lchantillon. Une homognisation manuelle peut galement tre effectue.

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7.
7.1

DILUTIONS DES CHANTILLONS

SUSPENSION MRE (PREMIRE DILUTION)
DFINITION

7.1.1

Suspension, solution ou mulsion obtenue aprs quune quantit pese (unit danalyse) du produit analyser ait t mlange, avec un homognisateur si ncessaire et en observant des prcautions appropries, avec une quantit neuf fois gale de diluant, sauf exception, en laissant se dposer les particules grossires, sil y en a. 7.1.2 PROCDURE

Prlever laliment de faon reprsentative et le peser tel quindiqu la section 4.3. Ajouter une quantit de diluant gale 9 fois la masse de laliment (gnralement 25 g daliment avec 225 g de diluant). Cette premire dilution correspond la dilution 10-1. Note 1 : Dans certains cas, il peut tre ncessaire dajouter davantage de diluant, notamment en prsence dune suspension mre trop visqueuse ou trop paisse avec la dilution 10-1. Linformation doit tre consigne et un professionnel doit tre avis afin den tenir compte dans la suite des oprations et dans lexpression des rsultats. Note 2 : Sil est souhaitable pour des dnombrements dans certains produits de descendre au-dessous de ce seuil, il est possible de raliser une suspension avec une quantit infrieure de diluant. Par exemple, la mthode MFLP-74 de Sant Canada (Dnombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments) exige la prparation dune dilution selon un rapport 1 :5. Par contre, il est convenu que lensemencement de cette suspension peut entraner des difficults lies au dsquilibre du rapport inoculum/milieu (inhibition de la croissance microbienne par une concentration accrue des composants de laliment).

7.2
7.2.1

DILUTIONS DCIMALES SUBSQUENTES

DFINITION

Suspensions ou solutions obtenues en mlangeant un volume dtermin de la suspension mre avec un volume neuf fois gal de diluant, et en rptant cette opration pour chaque dilution prpare, jusqu lobtention dune gamme de dilutions dcimales appropries pour linoculation des milieux de culture.

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PRPARATION DES CHANTILLONS POUR LANALYSE MICROBIOLOGIQUE 7.2.2 PROCDURE

Transfrer laide dune micropipette 1 ml de la suspension mre dans un tube contenant 9 ml de peptone sel ou du diluant appropri. laide dun agitateur mcanique, mlanger le tube pendant 5 10 secondes afin dobtenir la dilution 10-2. Si ncessaire, rpter ces oprations pour la dilution 10-2 et les dilutions dcimales suivantes afin dobtenir les dilutions 10-3, 10-4, 10-5, etc., jusqu lobtention dune gamme de dilutions dcimales appropries.

7.3

MESURE DU PH DES DILUANTS ET DES BOUILLONS DENRICHISSEMENT

Bien que cela ait t mentionn dans les versions prcdentes de certaines mthodes, lajustement du pH du diluant avec la matrice alimentaire avant lensemencement nest pas recommand pour les mthodes quantitatives, sauf lorsque prcis par le fabricant. Ceci permet au produit dtre valu tel que prsent au consommateur, empchant tout biais (positif ou ngatif) qui en dcoulerait si le pH tait ajust avant lensemencement. Pour les mthodes qualitatives, lajustement du pH du bouillon denrichissement avec la matrice alimentaire doit tre ralis lorsque cela est indiqu dans la mthode utilise.

7.4

DURE DES OPRATIONS

Aprs le broyage ou l'homognisation, la suite de l'analyse (les dilutions et l'ensemencement) doit avoir lieu le plus rapidement possible pour viter une multiplication des microorganismes dans le liquide de dilution enrichi par le produit alimentaire. Lchantillon doit tre ensemenc au maximum 10 minutes aprs la ralisation des dilutions dcimales. L'ensemble des manipulations, de la prparation de la suspension mre jusqu' l'ensemencement sur glose ou bouillon, doit tre effectu dans un dlai maximum de 45 minutes.

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8.

BIBLIOGRAPHIE

LUECHTEFIELD, N.W., WANG, W.-L., BLASER, M.J., & L. RELLER, Evaluation of Transport and Storage Techniques for Isolation of Campylobacter fetus subsp jejuni from Turkey Meat Specimens, J Clin Microbiol. 1981 Mar ;13:438-43 Direction gnrale de la protection de la sant, Sant-Canada, Compendium de mthodes, volume 1 - MFHPB-20; Isolement et identification des Salmonella dans les aliments. Direction gnrale de la protection de la sant, Sant-Canada, Compendium de mthodes, volume 1 - Annexe I et supplment lannexe I. ISO 6887-1: 1999 -Microbiologie des aliments -- Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique -Partie 1: Rgles gnrales pour la prparation de la suspension mre et des dilutions dcimales. ISO 6887-2: 2003 -Microbiologie des aliments -- Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique -Partie 2: Rgles spcifiques pour la prparation des viandes et produits base de viande. ISO 6887-3: 2003 -Microbiologie des aliments -- Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique -Partie 3: Rgles spcifiques pour la prparation des produits de la pche. ISO 6887-4: 2003 -Microbiologie des aliments -- Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique -Partie 4: Rgles spcifiques pour la prparation de produits autres que les produits laitiers, les produits carns et les produits de la pche. ISO 6887-4:2003/Amd 1:2011: Microbiologie des aliments -- Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique -- Partie 4: Rgles spcifiques pour la prparation de produits autres que les produits laitiers, les produits carns et les produits de la pche AMENDEMENT 1. ISO 6887-5: 2010 -Microbiologie des aliments -- Prparation des chantillons, de la suspension mre et des dilutions dcimales en vue de l'examen microbiologique -Partie 5: Rgles spcifiques pour la prparation du lait et des produits laitiers.

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9.

APPROBATION

Franois Bigonnesse, Microbiologiste Service de microbiologie

Genevive Bouchard, charg qualit Service de microbiologie

Pascal Daigle, chef de service Service de microbiologie

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