PARTE 2 METODOLOGA DIAGNSTICA DE: AVES, CERDOS, PECES, ABEJAS, CONEJOS, FAUNA SILVESTRE, ANIMALES DE LABORATORIO

CAPTULO 4 Metodologa diagnstica y tcnica de necropsia en aves

METODOLOGA DIAGNSTICA Y TCNICA DE NECROPSIA EN AVES Dra. Norma L. Caldern Apodaca Dr. Flix Snchez Godoy Contenido Introduccin Historia clnica Inspeccin clnica Tcnica de necropsias en aves Material y mtodos Examen exterior del animal Posicin del animal Incisin Evisceracin Examen del aparato digestivo Revisin del aparato genital Revisin del aparato urinario rganos hemo-linfticos Encfalo Aparato locomotor Diagnstico clnico presuntivo Seleccin, obtencin y envo de muestras para diagnstico de laboratorio Caractersticas de los estudios de laboratorio Serologa Bacteriologa y micologa Virologa Histopatologa Biologa molecular Integracin de un diagnstico definitivo Literatura citada

INTRODUCCIN El Mdico Veterinario Zootecnista que participa en los sistemas de produccin avcola necesita conocer las acciones para obtener mayor productividad y rentabilidad posibles para el avicultor. Una de estas acciones es reconocer los procesos patolgicos presentes en la parvada la cual se puede realizar por medio del diagnstico. La metodologa de diagnstico en aves es un proceso ordenado en el que se incluyen varios pasos: A) Establecer una historia clnica de la granja. B) Realizar el examen clnico de las parvadas. C) Formular el diagnstico clnico presuntivo. D) Realizar el examen de necropsias. E) Seleccin conservacin y envo de muestras para: F) Confirmar el diagnstico por estudios de laboratorio G) Establecer un diagnstico definitivo. HISTORIA CLNICA La anamnesis consiste en la recopilacin de datos sobre los hechos que antecedieron o estn relacionados con la manifestacin de un proceso patolgico o de improductividad de la parvada. El acopio de estos datos se obtiene mediante un interrogatorio extenso a la persona o personas que presentan el caso. En la historia clnica se registran datos relacionados con la ubicacin de la granja, fin zootcnico, tipo de instalaciones, estirpe de las aves e incubadora de procedencia, condiciones climticas generales de la granja (macro y microclima). INSPECCIN CLNICA El examen clnico tiene la finalidad de determinar la presencia de signos que sugieran la causa del proceso patolgico. Es importante considerar que en la prctica de la medicina aviar, la inspeccin clnica, es por medio de la observacin de grupos y no

por exploracin de individuos en particular. Se debe observar la actitud de la parvada, sonidos extraos, revisin de la cama, equipo, medio ambiente de la caseta (figura 1). Posteriormente se puede realizar la inspeccin clnica de las aves vivas mediante un examen directo (figura 2) en donde se pueden evaluar los siguientes aspectos: Actitud del ave. Desarrollo del ave de acuerdo su fin zootcnico. Estado de hidratacin. Coloracin de cresta y barbillas. Evidencia de dificultad de respiratoria o indicio de diarrea. Condicin corporal y de plumas. Evaluacin del sistema nervioso central y perifrico. TCNICA DE NECROPSIAS EN AVES Este mtodo es til para realizar la necropsia de aves industriales, de corral o de traspatio y puede llevarse a cabo en aves de compaa y ornato tomado en cuenta las posibles diferencias anatmicas. La presentacin de enfermedades en las aves comerciales se puede manifestar por bajos parmetros productivos, signos clnicos o por aumento en la mortalidad. Para el diagnstico de la enfermedad que afecta una parvada se requiere como ya se menciono anteriormente de la historia clnica mediata e inmediata, la necropsia y los estudios de laboratorio llevados a cabo en por lo menos cinco a diez aves enfermas, elegidas por presentar los signos clnicos representativos del padecimiento actual. La necropsia tiene como finalidad observar los cambios macroscpicos en rganos y tejidos que puedan sugerir al agente causal y a travs de ella se toman las muestras de histopatologa, bacteriologa, virologa, serologa, parasitologa y toxicologa con el objeto de integrar un diagnstico final. La eutanasia debe ser lo menos traumatizante posible para no hacer sufrir a las aves, el mtodo empleado en pollitos de menos de dos semanas de edad, es la decapitacin por medio de tijeras o guillotina. En el caso de aves adultas se

recomienda realizar la dislocacin cervical, para lo cual se realiza traccin a nivel de la articulacin atlanto-occipital en un ngulo de 45 y con la otra mano se sujetan las patas y la punta de las alas (figura 3). La necropsia debe de llevarse a cabo de preferencia en aves muertas recientemente, y debe ser llevada en forma sistemtica y es recomendable que se realice en serie, con el objeto de comparar grados de lesiones y frecuencia de ellas. MATERIAL Y MTODOS La necropsia puede ser llevada a cabo no solo en una sala acondicionada especialmente para tal efecto como sucede en un laboratorio de diagnstico. En la granja tambin puede llevarse a cabo siempre y cuando haya manera de evitar la contaminacin del sitio en el que se realiza, colocando los cadveres por ejemplo en una charola o bolsas de material adsorbente con objeto de poder desechar la totalidad de lquidos y material orgnico para ser posteriormente incinerados. MATERIAL Se puede utilizar una charola grande de acero inoxidable o bien realizar la necropsia en una mesa de material que sea lavable y puedan trabajarse y recolectarse los rganos, sobre sta mesa se pueden colocar peridicos o bolsas de alimento los cuales sirven para absorber los lquidos y sangre que se liberen. Son igualmente necesarios jeringas y tubos para tomar muestras de sangre, un par de tijeras para descuartizar aves, unas tijeras de diseccin de punta roma, 2 pinzas unas con dientes y unas sin dientes, hilo resistente para ligar los diferentes segmentos del intestino. Frascos estriles para recolectar muestras para otros laboratorios, frascos con formalina al 10% amortiguado a pH 7.4, portaobjetos. 1. Examen exterior del animal Examinar el aspecto del plumaje y orificios corporales, registrar lesiones o presencia de ectoparsitos.

2.

Posicin del animal

Colocar el ave en decbito-dorsal, despus realizar una incisin en cada uno de los pliegues de las piernas con la finalidad de proceder a la luxacin de las articulaciones coxo-femorales (Figura 4) Estado general Caquexia u obesidad

Cabeza Aumento de volumen: Sndrome de cabeza hinchada Coriza, Pasteurelosis, Sinusitis

Secrecin nasal (coanas): Serosa en irritacin por gases (cama con amoniaco), polvo, principio de enfermedades respiratorias. Coriza, Ornitobacterium

rhinotracheale. Secrecin fibrino-caseosa. Enfermedades respiratorias crnicas o complicadas.

Plumaje Plumas sucias: conglomerado fecal alrededor del ano. Pulorosis, diarrea verde esmeralda. Enf. de Newcastle, cama muy sucia. Plumas arrancadas: picoteo, peleas, canibalismo, presencia de ectoparsitos provocando prurito (piojos). Estado de la Piel

Heridas: Superpoblacin, peleas. Inflamacin heteroflica y/o granuloctica: Infeccin bacteriana de las heridas, ampolla en la quilla por Staphylococcus sp. Aunque las aves no forman propiamente abscesos como los mamferos su aspecto macroscpico es como stos.

Tumores: Hipertrofia de folculos plumosos, enfermedad de Marek.

Vesculas y pstulas alrededor del pico ojos crestas, barbillas por viruela aviar. Inflamacin y necrosis por dermatitis gangrenosa. Aspecto de quemadura ms ausencia de plumas en la quilla, por cama sucia. Deformacin de las escamas de las patas, por presencia de ectoparsitos.

Estado del esqueleto y de los miembros Desviacin de la quilla por raquitismo en pollo de engorda o por osteoporosis en adultos. Luxacin del tendn de Aquiles o tendn gastrognmio, en caso de perosis. Dedos torcidos por Mycoplasmas en pavos. Artritis por mycoplasmas o reovirus, gota articular.

Cresta, Barbillas, Carnculas

Cianosis, por histomoniasis (cabeza negra) en pavos, erisipela, clera aviar, tifoidea aviar, estrs por calor.

Edematosas, Clera aviar crnica.

Estado de las mucosas Bucal, exudado adherente de color blanco por tricomoniasis de las palomas, lceras diftricas amarillo-grisceas en intoxicacin por tricotecenos.

Ocular, sinusal, inflamacin con secrecin serosa o blanquecina en coriza aviar, y en enfermedades respiratorias evolutivas.

Cloacal, inflamada o hemorrgica por diarreas o picoteo.

3. Incisin La piel y el plumaje se humedecen en una solucin jabonosa para evitar la dispersin de plumas y plumones. Con las tijeras de punta roma se introducen en el pico para cortar la articulacin craniomandibular; se corta la piel de la base del pico hasta la

punta del esternn sin daar los rganos adyacentes, se prolonga esta incisin hasta la cloaca y se disecan los planos subcutneos. A. Se ponen en evidencia las masas musculares, msculos pectorales, msculos de muslos y piernas, en donde se pueden encontrar las siguientes lesiones: Edemas subcutneos, en dermatitis gangrenosa, traumatismos, heridas. Heridas y traumatismos asociados a un proceso inflamatorio debido a agentes oportunistas (E. coli, Staphylococcus sp, Pasteurella, Pseudomonas, Clostridias, etc.). Hemorragias, en ENC, Influenza aviar, por septicemias. Ampollas en la punta del esternn debido a percheros, jaulas o pisos en mal estado. Canales o carcasas muy rojas, por congestin en las septicemias por tifoidea aviar, clera aviar, influenza aviar, muerte sbita. Msculos plidos, por deficiencia de vitamina E y Se, o por desrdenes metablicos agnicos en fiebres intensas por septicemias. Msculos atrofiados, por emaciacin en enfermedades crnicas debilitantes como la tuberculosis aviar. B. Exploracin de la cavidad bucal y orofaringe:

Aspecto y color de las mucosas, se pueden encontrar la presencia de material fibrino-necrtico grisceo o blanquecino adherente en la mucosa enrojecida en los casos de Trichomonas de las palomas o gallinas, candidiasis en patos y gallinas de Guinea, lesiones diftricas por Poxvirus en caso de viruela aviar.

Timos, 5 a 7 lbulos muy aparentes en ambos lados del cuello en aves jvenes. La atrofia de los lbulos del timo sugiere el desarrollo de alguna enfermedad inmunosupresora tal como: Gumboro, Marek, Anemia Infecciosa, Reovirus.

Se efecta una incisin para abrir la cavidad abdominal desde el vrtice del esternn hasta arriba de la cloaca y otra incisin siguiendo la trayectoria de la ltima costilla a ambos lados de la lnea media seccionando las articulaciones costocondrales (figura 5). En la cavidad abdominal puede haber presencia de lquido asctico, debido a sndrome asctico o por hepatopatas txicas o virales. Se contina con la incisin abdominal la cual se prolonga hasta la base de los muslos, los msculos pectorales se seccionan con las tijeras de descuartizar aves siguiendo la trayectoria de la ltima costilla la cual se secciona junto con el coracoides y la clavcula; las masas musculares pectorales y los huesos torcicos se levantan y se extraen en su totalidad. Una vez expuestos los rganos de cavidad torcica y abdominal, se procede a observar y describir el aspecto de los rganos. Ausencia de grasa abdominal: en enfermedades crnicas caquxicas como tuberculosis, parasitosis, enfermedades tumorales.

Aspecto general congestionado rojo oscuro: septicemias, choque endotxico, salmonelosis, clera aviar, peritonitis por postura abdominal.

Sacos areos con aspecto de vidrio esmerilado, engrosados y con presencia de fibrina: Mycoplasmosis, Clera aviar, serositis, ERCC, colibacilosis, reovirosis

Sacos areos con moho: por Aspergilosis Sacos areos y serosas con depsito blancuzco de aspecto de talco: uratosis (en gota visceral)

4. Evisceracin Se liga en el extremo anterior del esfago para seccionarlo y separarlo de la orofaringe. Todo los rganos abdominales son retrados haca la cola del ave, la porcin distal del recto es ligada y seccionada para a continuacin colocar el aparato digestivo en una charola, la cloaca se queda en su sitio.

En aves que an presentan bolsa de Fabricio, sta se localiza en la parte dorsal de la cloaca, tiene forma de un pequeo saco con pliegues hacia su interior y es de color blanco cremoso. Para su extraccin de toma la bolsa de un extremo con unas pinzas sin dientes y con unas tijeras de punta roma se secciona el tejido conectivo que la mantiene en su sitio anatmico. La trquea se retira de la cavidad torcica junto con los pulmones y el corazn. Corazn Plido flcido y redondo por miocarditis. Petequias y sufusiones: en septicemias, toxinas, asctis, nefritis, enfermedad de Newcastle, Influenza aviar. Metstasis por enfermedades neoplsicas. Decoloraciones blanquecinas: necrosis por deficiencia de vitamina E y Selenio. A continuacin, la laringe y la trquea son seccionadas longitudinalmente con tijeras de punta roma, hasta los pulmones para examinar el contenido y el aspecto de la mucosa. Mucosa traqueal inflamada caracterizada por mucosa enrojecida, recubierta por moco o lquido sanguinolento, o fibrina amarillenta o material caseoso: causada por bronquitis infecciosa, laringotraqueitis infecciosa aviar, rinotraqueitis del pavo, ERCC. Hemorragias petequiales o equimticas: ENC, Influenza aviar, BI, LTI. Mucosa inflamada ms la presencia de parsitos rojos, padecimiento denominado singamosis. Pulmones

Aspecto de los pulmones rojo obscuros en su totalidad o en algunas porciones. Por congestin, septicemias, toxemias, neumonas, congestin hiposttica.

Presencia de ndulos: en tuberculosis aviar, aspergilosis de los pollitos Depsito de material blancuzco, en uratosis.

5. Se contina con el examen del aparato digestivo. Hgado Color de hojas secas: tifoidea aviar. Hemorragias petequiales y sufusiones: septicemias, toxemias, enterovirosis. reas de color rojo oscuro (congestin) o reas plidas o amarillentas de bordes irregulares Degeneracin) o puntos amarillentos o blancos agrupados, coalescentes o dispersos en un rea (necrosis): clera aviar, colibacilosis, histomoniasis,

salmonelosis, aflatoxicosis, hepatitis por cuerpos de inclusin. Color blanco-amarillento: esteatosis o hgado graso: fisiolgica en pollitos de 1 a 6 das de edad; en intoxicaciones por micotoxinas. Ndulos con material amarillo o blanco de aspecto caseosos: por tuberculosis, coligranulomas. Hipertrofia y palidez diseminada: tumores de enfermedades linfoproliferativas como enfermedad de Marek. Hipertrofia ms coloracin rojo oscuro: hepatitis. Hipertrofia ms ndulos blanquecinos de consistencia firme: leucosis aviar. Hipertrofia ms bordes redondeados y deformes: aflatoxicosis y carcinomas Disminucin de volumen: hepatitis crnicas por micotoxicosis, asctis. El esfago y el buche son incididos longitudinalmente por medio de examinan las mucosas y la ingesta. Mucosa enrojecida (congestin) por la presencia de parsitos como las capilarias. Mucosa con exudado adherente de color grisceo, en candidiosis. Traumatismos o desgarramientos por cuerpos extraos.

Se inciden longitudinalmente el proventrculo y la molleja para examinar la mucosa.

Hemorragias en la mucosa del proventrculo: ENC, Influenza aviar, intoxicacin con sulfonamidas, proventriculitis virales.

Ulceraciones: contaminacin del alimento, por micotoxicosis.

Engrosamiento y erosiones de la cutcula cornea de la molleja: paraquetatosis o hiperqueratosis por deficiencias nutricionales (deficiencia de vitamina A).

El pncreas es disecado del asa duodenal y despus se examina.

Aspecto blanquecino: anemia, hemorragias extensas. Aspecto de jabn: en pancreatitis debidas a la liberacin de sus enzimas (peritonitis asociada).

Hemorragias: por septicemias o toxemias. Se continua con la exploracin del intestino que ser abierto a todo lo largo de todo

su trayecto hasta el recto. El contenido se recolecta para exmenes parasitarios, asimismo se pueden realizar raspados de la mucosa con un portaobjetos en diferentes lugares para hacer un examen microscpico y diagnosticar las diferentes coccidiosis (E. acervulina, en duodeno, Eimeria necatrix, E. maxima, parte intestinal media; Eimeria brunetti, en ileon; E. tenella, en ciego). La toma de muestras para el examen histolgico deber hacerse antes del raspado de la mucosa. Revisin del contenido Presencia de helmintos: cestodos, nematodos. Contenido caseoso de los ciegos: histomoniasis de los pavos, salmonelosis, enfermedad de Newcastle complicada, por ejemplo con E. coli.

Contenido hemorrgico: diversas coccidiosis, enteritis infecciosas, ENC, influenza aviar.

Engrosamiento de la pared: parasitosis severas, enteritis crnicas. Ulceraciones: tricomonas en las palomas, salmonelosis, perforaciones parasitarias. Presencia de ndulos en la pared y las serosas adyacentes: tuberculosis, coligranulomas, leucosis.

6. Revisin del Aparato Genital

Macho Los testculos son internos en las aves, adems su tamao est sujeto a las variaciones estacionales. Ciertas aves como los palmpedos y los avestruces estn provistas de un pene localizado en el pliegue cloacal.

Atrofia testicular: por intoxicacin con furazolidona. Tumores: virus de la leucosis aviar

Hembra En la hembra adulta solo se encuentra el ovario, el oviducto y el tero izquierdos. El racimo ovrico esta sujeto a la influencia hormonal por lo que, en la poca de postura es enorme y presenta numerosos vulos en diferentes estados de maduracin.

Cavidad abdominal amarilla con presencia de exudado inflamatorio en cantidad variable: postura abdominal, infecciones por salmonelosis o colibacilosis, pasteurelosis, tuberculosis.

Huevos deformes: virus de la bronquitis infecciosa, infeccin del tero. Huevos blandos, sin cascarn: coronavirosis de las ponedoras, infeccin del tero, deficiencias de Ca.

Yemas (vulos) hemorrgicos: deficiencia de vitamina A, infecciones ovricas.

7. Revisin del aparato urinario

Los riones se examinan en su sitio. Si van a ser extrados para tomar muestras sta debe realizarse en forma delicada, es decir, con las pinzas sin dientes se toma el paquete vascular se realiza una pequea traccin al mismo tiempo que se corta con tijeras romas el tejido conectivo los nervios y otros vasos sanguneos para que se puedan desprender los lbulos. En las aves el catabolismo de las protenas culmina con la formacin de cido rico, sustancia insoluble la cual es eliminada por los riones cuyo exceso en la sangre, provoca el que esta se precipite en forma de cristales en los tejidos.

Riones amarillentos: nefritis o nefrosis. En estos casos el trayecto de los urteres tiene un color blanquecino debido a los cristales de uratos acumulados.

Congestin (color rojo obscuro): septicemias, nefritis, intoxicaciones, bronquitis infecciosa (BI).

Hipertrofia: virus variantes de la BI, enfermedad de Marek, procesos tumorales, micotoxicosis agudas. Depsitos blanquecinos sobre los riones, serosas de varios rganos y en la luz ureteral: gota visceral en casos de nefritis.

8. rganos Hemo-Linfticos Se revisan los rganos esencialmente responsables de la inmunidad. Timo Est constituido de 5 a 7 pares de lbulos, que se atrofian hasta desaparecer en la vida adulta. Son el origen de la inmunidad de mediacin celular (clulas T). Se revisa su volumen

Atrofia: fisiolgica en el adulto ( a partir de las 23 semanas de edad), patolgica en las aves jvenes (manos de 17 semanas de edad) en casos de enfermedades inmunosupresoras, Gumboro, Marek, reovirosis, anemia infecciosa.

Bazo Hipertrofia: procesos tumorales como leucosis o Marek. Hipertrofia ms color rojo oscuro: septicemias pero sobre todo en las salmonelosis. Hipertrofia ms ndulos blanquecinos o amarillentos con material caseoso: tuberculosis, coligranuloma o por embolias de una gran variedad de bacterias. Hipertrofia ms puntos de necrosis blanquecinas: reovirosis de los patos, colibacilosis, clera aviar crnica. Hipertrofia ms aspecto marmoleado: adenovirosis del pavo, faisan y gallina de Guinea.

Bolsa de Fabricio La bolsa se sita en la superficie dorsal de la cloaca y da origen a la inmunidad de mediacin humoral (clulas B). Hipertrofia: principio de enfermedades inmunosupresivas, como gumboro. Hipertrofia ms hemorragias: Gumboro, enfermedades virales no especficas como reovirosis, herpesvirosis, ENC, anemia infecciosa. Degeneracin ms exudado muco-seroso que puede convertirse en exudado granuloctico en la fase evolutiva de Gumboro. Mdula sea Es necesario seccionar los huesos largos en forma longitudinal para revisar la mdula sea.

Aspecto de gelatina de frambuesa de la mdula sea: en anemias no regenerativas (Anemia infecciosa), en aplasia medular, aflatoxicosis, parasitosis masivas como la coccidiosis o bien infestacin por corucos como los Dermanyssus gallinae y Ornithonyssus sylviarum.

9. Encfalo El encfalo se extrae realizando un corte triangular con las tijeras de punta roma para el caso de aves jvenes (menos de 17 semanas), en el caso de aves adultas (ms de 17 semanas) se utiliza una segueta , iniciando los dos primeros cortes a ambos lados de los cndilos occipitales dirigidos hacia los huesos periorbitales, se realiza un tercer corte para unir los cortes anteriores; una vez hecho el corte se retira la bveda craneana se expone el encfalo y con las tijeras de punta romas se cortan los nervios craneales para poder liberar el encfalo. En el encfalo se pueden encontrar edemas, hematomas, congestin, hipertrofia. El sistema nervioso debe ser sumergido lo ms pronto posible en el lquido fijador utilizado para las preparaciones histolgicas.

Hematomas de la bveda craneal: traumatismos craneales por ejemplo por manejo brutal en la caseta.

Lesiones de reblandecimiento con una consistencia gelatinosa: en casos de edema cerebral, en la encefalomalacia por deficiencia de vitamina E y Selenio.

Hipertrofia de los nervios perifricos: sobre todo los nervios citicos, lombo-sacros y braquiales en la enfermedad de Marek.

Congestin de meninges: enfermedades virales. Hemorragias de tipo petequial: ENC, influenza aviar, septicemias.

10. Aparato Locomotor El examen de las estructuras msculo-tendinosas se realiza despus de haber retirado la piel de piernas y muslos. Desviacin del tendn gastrocnmio: deficiencia de magnesio, colina, cido flico, (perosis), con luxacin del tendn.

Deformacin de la quilla: deficiencias de vitamina D3 y/o calcio (raquitismo). Hipertrofia de las articulaciones costocondrales (aspecto de rosario): raquitismo. Hipertrofia de la placa de crecimiento de los huesos sin osificacin, pero con vascularizacin normal de los vasos metafisiarios: raquitismo

Dedos retrados y encorvados: por deficiencia de vitamina B2 (riboflavina). Necrosis de dedos y de cojinetes plantares: camas hmedas, deficiencia de biotina, micotoxicosis por T2 y ergotamina.

Inflamaciones articulares: reovirosis, micoplasmosis, estafilococosis. Tenosinovitis del corvejn: reovirosis del pato y del pollo. Msculos decolorados y secos: necrosis por deficiencia de vitamina E y Selenio. La necropsia proporciona una orientacin para la seleccin y obtencin de las

muestras necesarias para realizar estudios de laboratorio.

DIAGNSTICO CLNICO PRESUNTIVO Despus de haber obtenido los datos de la historia clnica, de realizar el examen clnico y de hacer una recapitulacin de los hallazgos a la necropsia, se efecta un anlisis de los datos obtenidos el cual termina en la formulacin de un diagnstico presuntivo del tipo de proceso patolgico presente, en la definicin de la probable causa. Este diagnstico debe ser corroborado por lo que se requiere del diagnstico diferencial y de pruebas de laboratorio para poner de manifiesto e identificar a los agentes causales del padecimiento. Un diagnstico diferencial es aquel que incluye otras enfermedades que presenten una semiologa o lesiones similares a las propias del proceso patolgico que supuestamente afecta a la parvada en estudio. El diagnstico clnico presuntivo tiene la utilidad de orientar las pruebas de laboratorio necesarias para la confirmacin del diagnstico as como de establecer acciones inmediatas de tratamiento para el control del proceso patolgico. SELECCIN, OBTENCIN Y ENVO DE MUESTRAS PARA DIAGNSTICO DE LABORATORIO Para la seleccin y obtencin de muestras que se har durante el examen de necropsia, es necesario seguir un plan cuidadoso, en donde se obtengan las muestras y se determine el estudio que se debe realizar as como considerar los alcances y limitaciones del tipo de resultados que se van a obtener (figura 6). Es importante que la muestra obtenida sea representativa del proceso patolgico que aqueja a la parvada, para que la informacin que se obtenga resulte conforme al padecimiento real que predomine en la parvada. I. Estudios bacteriolgicos y micolgicos. Las muestras se deben de obtener de aves recin sacrificadas o con un mximo de 2 horas de muertas, adems deben ser obtenidas y conservadas en condiciones de asepsia utilizando, de ser posible un mechero, as como equipo e instrumental limpios. Para transportarlas a laboratorio, las muestras se pueden colocar en bolsas de

polietileno nuevas, cajas de Petri de plstico o medios de transporte como el medio de Stuart y el mtodo de conservacin adecuado es la refrigeracin a 4 C y que el tiempo en que lleguen al laboratorio de diagnstico no sea superior a las 24 horas.

II.

Muestras para estudios histolgicos. Al igual que en el caso anterior las muestras se deben colectar de aves recin sacrificadas, o un mximo de 2 horas para evitar los cambios posmortem en los tejidos. El manejo de los tejidos debe ser delicado y ser sumergidos en una solucin de formalina al 10% amortiguada a un pH 7.4, pronto posible. Las muestras seleccionadas no deben tener un espesor mayor de 3 mm y el volumen del fijador debe ser diez veces mayor al de la muestra.

III.

Muestras para estudios virolgicos. Se requiere asepsia del mismo modo que para los estudios bacteriolgicos. Los rganos se seleccionan de acuerdo a la enfermedad que se sospeche y los mtodos de conservacin utilizados son la refrigeracin y congelacin dentro de cajas de Petri o frascos estriles.

IV.

Muestras para estudios serolgicos. Se llevan a cabo para la determinacin de ttulo de anticuerpos y evaluacin del estado de inmunidad de las aves. Se toma muestra de sangre a travs de la puncin con una jeringa de 3 o 5 mL y con aguja de 21G de las venas radiales, yugulares o puncin cardiaca, se recomienda obtener 3 a 5 mL de sangre y se deposita inmediatamente en un tubo de ensayo o un popote y se coloca en posicin horizontal hasta que se lleve a cabo la coagulacin. El mtodo de conservacin del suero es la refrigeracin a 4 C.

V.

Muestras para estudios parasitolgicos. Las muestras requeridas pueden ser a partir de heces, cama, raspado de piel, sangre completa y suero. Las muestras de heces o cama se depositan en frascos o en bolsas de polietileno. El mtodo de conservacin es la refrigeracin para las muestras de heces, sangre completa, suero y cama, adems se puede agregar dicromato de potasio al

2.5% utilizando 35 mL del dicromato para 5g de heces. Los ectoparsitos se recolectan manualmente y se depositan en frascos con alcohol al 70%. VI. Muestras para estudios toxicolgicos. Las muestras que se remiten son alimento, material de cama, rganos (especialmente hgado, rin y contenido digestivo). Se sugiere especificar el txico del que se sospecha. CARACTERSTICAS DE LOS ESTUDIOS DE LABORATORIO Los resultados y la interpretacin de los estudios de laboratorio servirn para confirmar o descartar un diagnstico clnico. Para que las pruebas puedan auxiliar al diagnstico avcola de rutina, deben ser sensibles, especficas, repetibles, sencillas, y accesibles. La sensibilidad se refiere a la capacidad de detectar un caso positivo cuando realmente lo sea. La especificidad se refiere a detectar un caso negativo cuando realmente lo es. Repetibilidad se refiere que se debe obtener los mismos resultados en pruebas repetidas de la misma muestra y en diferentes laboratorios. Sencillez, que no se requiera un procedimiento complejo o con gran cantidad de pasos. Accesibilidad, que se puedan llevarse a cabo en cualquier laboratorio. Las diferentes tcnicas de laboratorio dependiendo de su naturaleza persiguen los siguientes propsitos: Aislamiento, identificacin y cuantificacin del agente causal de la enfermedad. La identificacin de las lesiones producidas por el proceso morboso ya sea de tipo estructural o funcional. La medicin de la respuesta inmune del ave hacia el agente. Aislamiento, identificacin y cuantificacin del agente.

SEROLOGA Es posible obtener informacin en cuanto a la respuesta del sistema inmune de las aves a travs del estudio del suero, lo que se busca es determinar los ttulos de

anticuerpos contra agentes infecciosos, vacunales o de campo. La mayora de las pruebas requieren de 5 a 50 microlitos por lo que es suficiente el envo de 1 a 2 mL de suero que se obtiene a partir de 3 a 5 mL de sangre. La calidad del suero enviado al laboratorio es fundamental para la correcta interpretacin de los resultados, ya que la hemlisis o contaminacin pueden llevar a resultados falsos. La sangre debe ser extrada con una jeringa y ser depositada en frascos limpios, no necesariamente estriles, resulta conveniente que los tubos de ensayo sean colocados en posicin horizontal hasta que la sangre coagule y despus desprender el coagulo sin romperlo, el suero es liberado despus de 10 minutos y debe ser tomado con otra jeringa o pipeta Pasteur y depositado en viales, popotes sellados o tubos de microcentrfuga, una alternativa si es que el laboratorio esta cerca es mandar la sangre en la misma jeringa, pero no deben transcurrir mas de dos horas sin procesar las muestras. Independientemente de la prueba utilizada, en la interpretacin de los resultados deben tomarse en cuenta el fin zootcnico, edad, calendario de vacunacin, vas de aplicacin de las vacunas as como las cepas empleadas. Se requiere por lo menos de dos muestras tomadas con 1 o dos semanas de diferencia, ya que un solo muestreo no determina la variacin de los ttulos. Siempre existe la pregunta acerca del ttulo de anticuerpos correcto, ese nmero mgico en realidad no existe pues para cada granja y condiciones particulares es diferente, sin embargo, ms que el nmero debe considerase la variacin de los ttulos. Las principales tcnicas para la determinacin de anticuerpos en clnica de las aves son: a) Inhibicin de la hemoalgutinacin. b) Aglutinacin en placa. c) ELISA. d) Virus suero neutralizacin. e) Precipitacin en gel de agar.

Inhibicin de la hemoaglutinacin La inhibicin de la hemoaglutinacin (HI por sus siglas en ingls) detecta y cuantifica anticuerpos contra agentes hemoaglutinantes tales como los virus de la enfermedad de Newcastle, influenza aviar, bronquitis infecciosa, sndrome de baja postura, y micoplasmas. El principio consiste en que los anticuerpos del suero inhiben al antgeno y evitan la aglutinacin de glbulos rojos de pollo, existen dos variantes de la tcnica en una el suero es constante y el antgeno es utilizado en diluciones y en otra el antgeno es constante y el suero diluido, se emplean generalmente diluciones dobles seriadas de modo que los resultados pueden expresarse como diluciones, es decir el laboratorio reporta 1:2, 1:16, 1:256, por ejemplo, o bien pude reportar como logaritmos 3-6
log2

. Dado que se emplean varios sueros, conviene calcular la media

geomtrica, para tomar en cuenta el factor dilucin y la dispersin de los datos, de este modo el valor obtenido es ms representativo. Aglutinacin en placa Esta prueba consiste en mezclar el suero o sangre completa directamente con el antgeno, se emplea generalmente para micoplasmas y Salmonella. La mezcla produce despus de algunos segundos grumos o precipitados que se ven a simple vista. Esta prueba es muy sencilla y se utiliza como tamiz, para las parvadas, si se encuentran resultados positivos, se procede a la determinacin de anticuerpos mediante diluciones o se busca el aislamiento de agente patgeno. En el mercado existen diferentes antgenos coloreados y sus mezclas. ELISA Esta prueba permite determinar ttulos de anticuerpos, se lleva a cabo en microplaca, la cual generalmente esta sensibilizada con el antgeno, existen diversas variantes de la tcnica (captura, competitiva etc.), lo que se busca es poner de manifiesto la reaccin antgeno anticuerpo mediante un anticuerpos secundario o conjugado que esta marcado con la enzima peroxidasa, a la cual se le proporciona un sustrato con un colorante, de este modo, en la ELISA de captura, el anticuerpo secundario detecta los

anticuerpos del suero y mediante la reaccin enzimtica de una coloracin azul o bien como en la ELISA competitiva no cambia de color porque los anticuerpos del suero han ocupado los sitios con antgeno y el anticuerpo secundario esta dirigido contra otro anticuerpo que se emplea despus del suero. Mediante esta tcnica se detectan anticuerpos contra virus tales como el de la infeccin de bolsa de Fabricio, bronquitis infecciosa, laringotraquetis aviar, enfermedad de Newcastle, influenza aviar, reovirus, neumovirus, anemia infecciosa, bacterias como Salmonella, Pasteurella o micoplasmas. En el mercado existen dos compaas que distribuyen las pruebas de ELISA, ambas son muy buenas, pero debe tomarse en cuenta que cada una tiene sus escalas para la interpretacin de resultados. El laboratorio proporciona el resultado como lecturas de densidad ptica (ya que la intensidad de la coloracin se realiza mediante este mtodo) para cada suero, calcula adems la media geomtrica, el valor mximo y mnimo as como el coeficiente de variacin (que en forma ideal no debe ser mayor de 30%) que nos indica que tan homogneos son lo resultados, adems proporciona una grfica en la cual los valores obtenidos son agrupados en perfiles y la observacin de esta grfica nos da una idea del comportamiento de los anticuerpos. Virus suero neutralizacin Conocida comnmente como VSN o MNT (microvirus neutralizacin) se basa en la propiedad de los virus de producir un efecto citoptico en el cultivo celular y que cuando son mezclados con anticuerpos pierden esa capacidad para infectar es decir son neutralizados. ste prueba es muy til en investigacin y diagnstico y de hecho es utilizada como referencia para estandarizar otra tcnicas. Al igual que en la HI el suero es diluido y la dilucin mas alta en la cual el suero neutraliza una cantidad conocida de virus y por lo tanto no produce efecto citoptico, es el ttulo de anticuerpos, dependiendo del antgeno utilizado puede diferenciar anticuerpos contra cepas especficas o bien cuando se emplea a la inversa y se tienen antisueros conocidos es posible identificar los virus que se aslan en el laboratorio. La

prueba generalmente se lleva a cabo en cultivos celulares de fibroblastos, clulas renales, clulas hepticas y linfoides, puede, sin embargo, llevarse a cabo en embriones de pollo, aunque cada vez se utilizan menos. Esta tcnica se usa comnmente para virus de infeccin de la bolsa de Fabricio, bronquitis infecciosa, reovirus y adenovirus Precipitacin en gel de Agar La reaccin antgeno anticuerpo, puede ser visualizada cuando los anticuerpos y el anfgeno son depositados en una matriz de gel de agar, en la cual tanto anticuerpos como antgeno difunden, esta prueba tambin es conocida como doble difusin y es cualitativa, es decir nicamente proporciona un resultado positivo o negativo a travs de la presencia o ausencia de bandas de precipitacin. Se considera una de las pruebas ms especficas que existen y es muy econmica, aunque requiere cantidades grandes de anfgeno y anticuerpos. Se utiliza comnmente para encefalomielitis aviar, influenza aviar, reovirus y adenovirus. Bacteriologa y micologa Generalmente se remiten al laboratorio secciones de rganos, estos deben ser tomados de aves recin sacrificadas que estn en las primeras fases de enfermedad y deben ser tomados en la forma ms asptica posible. Se envan en bolsas de plstico nuevas o bien en cajas de Petri o frascos estriles en refrigeracin preferentemente por no mas de 24 horas, debe evitarse el congelar la muestra y mezclar diferentes rganos. Generalmente se remiten muestras de pulmn, trquea, hgado, bazo, y en el caso de aislamiento de Salmonella se incluyen adems tonsila cecal, ovario, saco vitelino y vescula biliar. Para el aislamiento de Haemophillus la cabeza y cuello completos se envan envueltos en papel aluminio. En el laboratorio se lleva a cabo una siembra en medios generales como agar sangre y en agar McConkey para enterobacterias, si hay crecimiento de colonias una tincin de Gram y se procede al aislamiento en cultivo puro para separar la bacteria y

poder identificarla mediante pruebas bioqumicas como catalasa, oxidas, citrato, malonato ureasa SIM, LIA y TSI. En toda solicitud de aislamiento bacteriano debe tenerse una peticin precisa y se debe contar con informacin de los tratamientos con antimicrobianos administrados as como el perodo de tratamiento, ya que el hecho de no tener un aislamiento exitoso no implica necesariamente que el agente no esta presente. Algunos laboratorios proporcionan a sus clientes tubos con medios de transporte, en estos casos durante la necropsia se introduce un hisopo estril en lo rganos cuya superficie fue quemada con una esptula caliente, las pinza y tijeras que se utilizan deben ser flameadas con alcohol. Tambin es posible el empleo de hisopos para aislamiento bacteriano a partir de rapados traqueales o cloacales. El hongo que generalmente se busca en el diagnstico es el Aspergillus, el aislamiento se lleva a cabo a partir de tejidos infectados o de hisopos de arrastre que se emplean en las incubadoras, en este caso, todas las esquinas y uniones de paredes y piso son rapadas con el hisopo, lo mismo que los conductos de ventilacin y aspas de las nacedoras. En muchas ocasiones se requieren exmenes bacteriolgicos del agua, en ese caso es mejor ponerse de acuerdo con el laboratorio ya que la preparacin de medios y reactivos lleva un proceso diferente y es muy importante el tiempo que transcurre entre la toma de la muestra y su procesamiento. Los exmenes bacteriolgicos y micolgicos son de mucha utilidad, sobre todo si van acompaados de un antibiograma, el uso indiscriminado y errneo de muchos antimicrobianos ha hecho seleccin de los agentes, de modo que hoy en da el fenmeno de resistencia es comn. Virologa Para este tipo de estudios, las muestras tienen las mismas caractersticas que para estudios bacteriolgicos, pero en este caso si es recomendable la congelacin de la muestra o bien su conservacin en glicerina o PBS. Los rganos son macerados y

pueden ser inoculados en embriones de pollo, cultivos celulares o aves susceptibles. El embrin de pollo es quiz el mtodo mas empleado para el aislamiento de virus de enfermedad de Newcastle, influenza aviar, bronquitis infecciosa y viruela aviar, mientras que se prefiere el cultivo celular para adenovirus, virus de IBF, virus de anemia infecciosa y reovirus. El embrin comercial puede ser empleado para ENC, IA, BI y VA, en el resto de los agente es mejor el empleo de embriones libres de patgenos especficos por el riesgo de la transmisin vertical. Los embriones son inoculados en cavidad alantoidea, membrana corioalantoidea y saco vitelino, en ellos se buscan lesiones como hemorragias (ENC, IA) enanismo y deformidad (BI) o pstulas en la membrana corioalantoidea (VA y LTA) algunos virus pueden ser demostrados por su capacidad de aglutinar glbulos rojos (ENC IA). En la mayora de las ocasiones se requieren de algunos pases antes de obtener un aislamiento, en algunos virus como el de BI se requieren al menos 4 pases lo que hace que un aislamiento de este virus pueda demora hasta 2 semanas La inoculacin de aves susceptibles es uno de los mejores mtodos pues reproduce el cuadro clnico, pero requiere de instalaciones adecuadas y ms tiempo. Algunos virus como el de anemia infecciosa son difciles de aislar, pude requerir de hasta 10 pases en cultivo celular y la inoculacin en aves libres de patgenos especficos demora hasta tres semanas, por lo que en estos casos la demostracin del agente por otras tcnicas es de utilidad. Histopatologa Salvo en casos excepcionales, las lesiones microscpicas no son patognomnicas, sin embargo, en la mayora de las ocasiones pueden orientar un diagnstico, es decir de acuerdo a las lesiones que se observan se puede proponer el resto de los exmenes de laboratorio. La muestra ideal para histopatologa debe tener una parte de tejido sano y una parte de tejido lesionado, un grosor no mayor a 0.5 cm en rganos parenquimatosos y hasta 1 cm en los rganos tubulares, en los cuales la mucosa

nunca debe ser tocada. Las muestras deben ser fijadas en formol al 10 % amortiguado, con una relacin muestra: fijador de 1:10. Despus de la fijacin por 24 horas las muestras son tratadas con diferentes alcoholes e incluidas en bloques de parafina a partir de los cuales se llevan a cabo cortes de 4 micras que son teidos con hematoxilina y eosina. El patlogo emite diagnsticos morfolgicos (nombre de la lesin, ubicacin, curso y grado) y descripcin de las lesiones, as como los probables agentes o condiciones asociadas. Biologa molecular La biologa molecular esta teniendo cada vez mas aceptacin en el diagnstico, en el caso de clnica de las aves es de particular importancia sobre todo en aquellos casos en los que aislar o demostrar el agente es difcil o lleva mucho tiempo. Las tcnicas ms utilizadas son la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingles), reaccin inversa de reaccin en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y los patrones de restriccin (RFLP). PCR La tcnica de PCR consiste en amplificar un segmento del cido nucleico de un agente del cual se ha demostrado previamente solo existe en el en otras palabras, no logra el aislamiento del agente, sino que demuestra que su cido nucleico esta en la muestra. Virus como el de anemia infecciosa del cual ya han mencionado las dificultades de aislamiento pueden ser demostrados en tan solo dos das. Mediante estas tcnicas el proceso de diagnstico se lleva a cabo en tres fases: a) Extraccin de cidos nucleicos b) Reaccin en cadena de la polimerasa c) Visualizacin de los productos amplificados. La extraccin de cidos nucleicos se lleva a cabo a partir de tejidos de los cuales e requieren unos cuantos gramos, lquido alantoideo, sangre e inclusive heces o material de cama. Se emplean soluciones de fenol-cloroformo-alcohol isoamlico que

degradan protenas y lpidos dejando libres el cido nucleico de los tejidos y del agente, posteriormente se precipita con etanol y es lavado a un volumen mnimo (100 microlitros). Una vez con al cido nucleico extrado la reaccin en cadena de la polimerasa consiste en mezclar en un tubo de 200 microlitros al material gentico aislado (que servir de molde para la amplificacin), los iniciadores (que son secuencias de 20 a 25 nucletidos se unen a su sitio homlogo en la cadena de ADN), una enzima la Taq polimerasa (que sintetiza ADN uniendo nucletidos a partir de los iniciadores), nucletidos (que son la unin de un azcar, un fosfato y una base nitrogenada) y agua. A travs del tratamiento trmico se lleva a cabo la reaccin, primero, la muestra es calentada a 94 C por 5 minutos, temperatura en la cual las cadenas de cido nucleico son desnaturalizadas y al separarse dejan expuestos los sitios en los cuales los iniciadores han de unirse para dar inicio a la sntesis de nuevas cadenas de ADN, los iniciadores entre otras propiedades se unen a su sitio homlogo, es decir encuentran la secuencia del agente que se esta buscando si este esta presente. Una vez que se han desnaturalizado las cadenas de ADN se inician 25 a 30 ciclos trmicos de tres pasos, en el primero la muestra se calienta otra vez a 94 C por 30 segundos para que las cadenas se separen, despus, bajando la temperatura entre 55 y 65 C por 30 segundos los iniciadores se alinean a su sitio homologo, en el tercer paso, la muestra es calentada a 72 C por uno o dos minutos, temperatura en la cual la enzima incorpora los nucletidos a la cadena de ADN para formar nuevas cadenas. En el siguiente ciclo de tres pasos, las temperaturas y tiempos se repiten de modo que las cadenas nuevas tambin sirven de molde para formar mas cadenas de ADN. El proceso entonces produce la amplificacin exponencial del fragmento de inters. Al final del proceso, a partir de una sola cadena se pueden producir millones de copias del fragmento amplificado. Por ultimo, la visualizacin de los productos de PCR se lleva a cabo cuando una pequea parte (entre 3 y 5 microlitros) es corrida mediante electroforesis en un gel de agarosa y teida con bromuro de etidio, que en presencia

de luz ultravioleta produce fluorescencia anaranjada. Si en el gel se depositan adems fragmentos de ADN de tamao conocido, es posible saber la longitud de las bandas amplificadas, y as determinar si la prueba ha amplificado el fragmento especfico que se busca. El tamao esperado del fragmento se conoce cuando se eligen la posicin de los iniciadores en la cadena de ADN. RT-PCR La tcnica de PCR amplifica fragmentos de ADN a partir del material gentico aislado pero solo puede hacerlo a partir de ADN, En el caso de los virus ARN se requiere primero sintetizar cadenas de ADN complementarias (ADNc), este proceso es llevado cabo mediante enzimas reverso transcriptasas (o transcriptasas inversas) que toman como molde la secuencia de ARN para sintetizar ADNc el proceso es conocido como RT-PCR. El ADNc as obtenido puede ser amplificado en el PCR como cualquier otro ADN. En general los procesos de extraccin y purificacin del ARN son similares a los empleados para el ADN, existen adems en el mercado soluciones de fenol que extraen el ARN en solo un paso. La tcnica de RT-PCR consume mas tiempo y material, adems de que la probabilidad de degradacin de ARN es mayor, sin embargo una vez que se ha estandarizado la tcnica permite un diagnstico confiable. Los virus aviares que pueden ser identificados mediante esta tcnica incluyen el de la enfermedad de Newcastle, bronquitis infecciosa, influenza aviar e infeccin de la bolsa de Fabricio. RFLP El producto obtenido por PCR, permite generalmente un diagnostico preciso y oportuno, sin embargo, en algunas ocasiones se requiere el diferenciar cepas de un mismo virus, uno de los mejores ejemplos es el virus de la bronquitis infecciosa en el que las cepas variantes complican el diagnstico.

Una de las tcnicas que mayor aplicacin tiene para diferenciar cepas es el polimorfismo de la longitud de fragmentos de restriccin conocida por sus siglas en ingles como RFLP, esta tcnica emplea las enzimas de restriccin y se le conoce tambin como patrones de restriccin. El ADN resultado del PCR puede ser cortado en dos o mas fragmentos mediante las enzimas de restriccin, estas enzimas reconocen secuencias especficas o sitios de corte de manera que una misma enzima puede diferenciar cadenas diferentes de ADN al no cortarlo o bien producir fragmentos de diferentes tamaos que al ser corridos en un gel de agarosa o poliacrilamida migran de diferente manera. Las diferencias se establecen por la

presencia o ausencia de bandas en el gel as como por el tamao de estas. En ocasiones no es posible establecer diferencias pequeas mediante RFLP por lo que se prefiere la secuenciacin, esta tcnica si bien no esta al alcance de la mayora de los laboratorios permite la mejor prueba de que dos cepas son diferentes. INTEGRACIN DE UN DIAGNSTICO DEFINITIVO Para emitir un diagnstico definitivo del proceso patolgico que afecta a las aves de una parvada, se tiene que realizar un anlisis crtico de los resultados de las diferentes pruebas de laboratorio y estos resultados deben ser confrontados con la historia clnica, los signos y los hallazgos a la necropsia. Por tanto, los conocimientos de los aspectos clnicos y zootcnicos de las aves as como los alcances y limitaciones de las pruebas de laboratorio son fundamentales para emitir un diagnstico final. Es necesario mencionar que puede haber participacin de varios agentes infecciosos en un proceso patolgico, por lo cual no es sorprendente realizar el diagnstico de ms de un agente infeccioso dentro de una parvada.

LITERATURA CITADA 1. Chairman HG, Arp LH, Domermuth CH and Pearson JE, editors. A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens. 2nd ed. Pensylvania: American Association of Avian Pathologist, 1989. 2. Riddell C, Editor. Avian histopathology. 2nd ed. American Association of Avian Pathologist, 1996. 3. S. de Aluja A, Constantino CF. Tcnica de necropsia en animales domsticos. Mxico: El Manual Moderno, 2002. 4. Saif YM, Barnes HN, Glisson Jr editors. Diseases of poultry 11th ed. Ames Iowa: Iowa State University Press, 2003.

Figura 1. La inspeccin clnica de las aves se realiza a travs de la observacin de poblaciones: actitud de las aves, apariencia del plumaje, desarrollo corporal, condiciones ambientales dentro de la caseta y calidad de la cama.

Figura 2. Aves de combate que al examen fsico mostraron parlisis y extensin de patas.

Figura 3. Dislocacin cervical en aves mayores a 2 semanas de edad y con menos de 3 Kg de peso corporal.

Figura 4. El cadver se coloca en decbito dorsal y se realiza la luxacin de la articulacin coxo-femoral de ambas piernas.

Figura 5. Abertura de la cavidad, en donde se deben revisar la posicin in situ, tamao, y forma de rganos, presencia de lquidos y hemorragias.

Figura 6. Los cambios macroscpicos observados durante la necropsia son la base para la toma y envi de muestras a los diferentes laboratorios.