La modificacin de un protocolo de extraccin de ADN CTAB para plantas que contienen alta de polisacridos y componentes de polifenoles

Resumen: Un protocolo relativamente rpida , de bajo costo y consistente para la extraccin de ADN a partir de material de la hoja ampliado que contiene grandes cantidades de polifenoles , taninos y polisacridos se describe . Hojas de fresa maduros, que contienen altos niveles de estos componentes secundarios , se usaron como un grupo de estudio . El mtodo implica una extraccin de CTAB modificado , empleando altas concentraciones de sal para eliminar los polisacridos , el uso de polivinilpirrolidona (PVP ) para eliminar los polifenoles , un tratamiento prolongado RNasa y una extraccin con fenol - cloroformo . Los rendimientos medios oscilan entre 20 y los 84 ~ tg / g de tejido hoja madura tanto para octoploid silvestres y cultivadas y especies de Fragaria diploides. Los resultados de 60 plantas fueron examinadas , y fueron consistentemente amplificable en la reaccin de RAPD con tan poco como 0,5 ng de ADN por 25 - ~ reaccin tL . Actualmente, este es el primer procedimiento para el aislamiento de ADN a partir de la fresa madura tejido de la hoja que produce resultados consistentes para una variedad de diferentes especies , tanto octoploide y diploide , y es a la vez estable y amplificable por PCR antes y despus de un almacenamiento prolongado . Este procedimiento puede resultar til para otras especies difciles de la familia de las rosceas .

Introduccin
Extraccin de ADN de plantas de bayas y otras plantas que contienen materiales pegajosos y resinosos ha sido difcil en el pasado ( Webb y Knapp , 1990 ; Varadarajan y Prakash , 1991 ; . De Fang et al , 1992 ; Collins et al , 1992 . ) . En las fresas , al igual que otras plantas de bayas , la presencia de metabolitos secundarios , como los polifenoles , taninos y polisacridos , inhibe la accin enzimtica . Los polisacridos son visualmente evidente en ADN extrado por su viscoso , textura parecida a la goma y hacen que el ADN inmanejable en el pipeteado y inamplificable en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR ) mediante la inhibicin de la actividad de la polimerasa Taq (Fang et al . , 1992 ) . Cuando joven , hoja expansin y disparar material es limitada o la planta no est pasando por elongacin de los brotes activos al momento de la recoleccin , la pureza del ADN se vuelve cada vez ms difcil . ADN obtenido a partir de material ms all de la etapa incipiente ha demostrado ser difcil de extraer y inestable para el almacenamiento a largo plazo ( Lodhi et al . , 1994 ) . Con la madurez , las hojas contienen mayores cantidades de polifenoles , taninos y polisacridos. Hacer frente a este tipo de componentes en las hojas maduras se hace necesaria cuando las hojas jvenes en expansin y los brotes no estn disponibles durante el momento de la recoleccin . Estbamos uniformemente xito en nuestros intentos para amplificar el ADN de la Fragaria por PCR utilizando otros mtodos informados , incluyendo los de Dellaporta et al . ( 1984 ) , Saghai - Maroof et al . ( 1984 ) , Doyle y Doyle ( 1990 ) , LaRoche ( 1992 ) , Oard y Dronavalli ( 1992 ) , Wang et al . ( 1993 ) , Richards et al . ( 1994 ) , y Davis y col . ( 1995 ) . Como resultado , hemos encontrado que es necesario idear un protocolo para la extraccin de ADN a partir de tejido de la hoja completamente desarrollada ampliada que rendimiento de ADN adecuado

para la PCR , especialmente para los RAPDs , y que sera coherente para muchas diferentes especies silvestres y cultivadas de fresas, tanto diploides y octoploid . El protocolo descrito aqu es relativamente rpida y de bajo costo , y proporciona ADN limpia , consistente amplificable en la reaccin en cadena de la polimerasa utilizando la tcnica de RAPD ( William et al . , 1990 ) para todos Fragaria spp . ensayada . Tejido Fragaria y el ADN almacenado durante 21 meses a -20 ~ tambin ha demostrado ser estable y amplificable .

Material y Mtodos
Sesenta plantas de fresa de ambas especies octoploid canadienses silvestres y cultivadas ( 2 n = 56 ) de los cuales F. chiloensis (L. ) DCNE . , F. virginiana DCNE , F. virginiana forma multicipita ( Fern. ) Gatling y Cayouette , F. X ananassa nm . cuneifolia ( Nutt. ) Staudt , y una especie diploide ( 2 n = 14 ) , F. vesca L. , se utilizaron , 5-12 plantas por especies . La modificacin del procedimiento de extraccin de CTAB de Doyle y Doyle ( 1990 ) incluye concentraciones altas NAC1 en el tampn para eliminar los polisacridos ( Lodhi et al . , 1995 ) , y polivinil pirrolidona (PVP ) para eliminar los polifenoles ( Maliyakal , 1992 ) . Se requera un , RNasa tratamiento de una hora extendida para el producto de ADN a ser ARN libre y amplificable por PCR , con un paso de fenol - cloroformo adicional ( Saghai - Maroof et al . , 1984 ) para eliminar cualquier exceso de protenas . Estos pasos proporcionan la clave principal de xito para la recogida de ADN a partir de hojas de fresas maduras. El examen de polimorfismo mediante el uso de cebadores con secuencias arbitrarias ( RAPD ) fue realizado con xito 16 cebadores diferentes tras el examen inicial de aproximadamente 50 cebadores. El 25 ~ reacciones de PCR de volumen tL contenan tampn de PCR reaccin , 2 mM de MgC12 , 0,1 mM de dNTPs , cebador 2,4 mM , 2 unidades de fragmento Stoffel , Me ng de ADN , y se colocaron en un MJ Research Inc. PTC100 termociclador . El ciclo trmico incluye un ciclo a 5 minutos de desnaturalizacin a 94 ~ recocido un minuto a 47 ~ dos minutos de la extensin del cebador a 72 ~ luego 35 ciclos de un minuto cada uno a 94 , 47 y 72 ~ con el mnimo tiempo de rampa. Amplicones de PCR fueron ejecutan en un 1,5 % de 3 - a 4 - ram en gel de agarosa fino para los mejores resultados.

Resultados y Discusin
Concentraciones de ADN se realizaron mediciones de los sesenta muestras , y los rendimientos medios y rangos en ~ tg / g tejido foliar son: PCR se realiz correctamente utilizando cantidades tan pequeas como 0,5 ng en una reaccin de 25 ul . Cuando se aumentaron las cantidades ms all de 5 ng , bandas de ADN se hicieron menos clara . Aunque los metabolitos secundarios no pueden ser removidos por completo, la plantilla de ADN era lo suficientemente puro para permitir la amplificacin por PCR. Adems , tales rendimientos de ADN son lo suficientemente grandes para permitir un mximo de 1,4 x 105 reacciones de PCR o un nmero de aplicaciones de RFLP . Este protocolo de extraccin de ADN es relativamente rpido , ya que no se requiere un largo

ultracentrifugacin , como en algunos otros protocolos de PVP ( Maliyakal , 1992 ) . PVP , un polmero slido que tiene alto peso molecular y es soluble en agua y qumicamente inerte , se muestra para eliminar los polifenoles , manteniendo al mismo tiempo un mayor rendimiento que la polivinilpolipirrolidona ( PVPP ) , un polmero de reticulacin insoluble. PVP forma un complejo con polifenoles a travs de enlaces de hidrgeno , lo que les permite ser separados del ADN , y la reduccin de los niveles de polifenoles en el producto ( Maliyakal , 1992 ) . Aunque la PVPP es til en la mejora de la estabilidad de las enzimas mediante la eliminacin de las impurezas fenlicas ( Sigma Chemical Co. , 1993 ) , que produce significativamente menos ADN de PVP de las hojas totalmente expandidas . La tcnica de la Lodhi et al . ( 1994 ) utilizando PVPP dieron rendimientos muy bajos de ADN , de 2 a 3 ~ TG / g de tejido de la hoja , con hojas completamente expandidas , y la amplificacin por PCR no era consistente y exitoso para todas las especies de fresa . Incluso cuando se examinaron las hojas jvenes en expansin y material de rodaje utilizando este protocolo , los rendimientos reportados por Lodhi et al. (1994) para otras plantas de bayas no se alcanzaron ( 546-1130 ~ tg / g). El mtodo de la Jobes et al . ( 1995 ) utilizando PVP, NaC1 , LIC1 y SDS es mucho tiempo. Hemos sido capaces de obtener resultados equivalentes con la exclusin de la limpieza de SDS y LIC1 , que se utiliza para la eliminacin de ARN y para prevenir ribonuclesidos residuales de actuar como cebadores en la reaccin trmica ( Storts , 1993 ) . Hemos encontrado un tratamiento con RNasa prolongado de i hora fue suficiente para degradar el ARN en pequeos ribonuclesidos que no eran detectables por electroforesis en gel . Ribonuclesidos restantes estaran en muy pequeas cantidades , y que tendran que competir con las grandes cantidades de cebadores aadidos en la reaccin RAPD , haciendo interferencia mediante imprimacin ribonucleoside altamente improbable. Otros protocolos no tuvieron xito en la eliminacin de componentes inhibitorios secundarios en todas las especies estudiadas , incluyendo una tcnica de NaOH ( Wang et al , 1993 . ) , Un protocolo desarrollado para el maz ( Dellaporta et al , 1984 ; . Oard y Dronavalli , 1992 ) , una purificacin CSC1 ( . Richards et al , 1994 ) , la Elu - Quik ( Scheicher y Schuell ) mtodo ( LaRoche , 1992 ) , y varias extracciones CTAB ( Doyle y Doyle , 1990 ; Saghai - Maroof et al , 1984 ; Davis et al , . . 1995 ) ) . Diferencia de todos los dems protocolos mencionados anteriormente , nuestro protocolo relativamente rpido, consistente produjo rendimientos muy aceptables de ADN extrado de tejido de las hojas maduras de todas las especies Fragaria ensayadas. Todo el ADN fue estable y pudo ser amplificado por PCR , que requiere slo 0,5 ng de ADN en 25 - ~ reacciones TL, tanto antes como despus de 21 meses de almacenamiento . Adems , los perfiles de RAPD mostraron ser reproducible para al menos cinco plantas examinadas desde cada ubicacin para cada especie . Esta tcnica tiene el potencial para ser un protocolo eficaz para la extraccin de ADN utilizando tejido de las hojas maduras de las fresas , y tal vez por otras especies de la familia de las rosceas con altos polisacridos y polifenoles, cuando hay suficiente tejido foliar joven no est disponible.