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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN

CAMPO I

QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

LABORATORIO DE ANÁLISIS III

GRUPO 2502

PROF.: ELIA GRANADOS E. / PABLO HERNÁNDEZ M.

REPORTE : SELECCIÓN DE CONDICIONES ÓPTIMAS PARA LA


SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PARACETAMOL POR
CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA POR HPLC

EQUIPO 1:
GUZMÁN TORRES MIGUEL ANGEL
RODRÍGUEZ HERNÁNDEZ SANDRA PATRICIA
ROJAS NAVA CLAUDIA
SÁNCHEZ FLAVIO GERMAN

26 DE MAYO DEL 2003


INTRODUCCIÓN

La cromatografía es un metodo empleado ampliamente en la separación e identificación y determinación de los


componentes químicos en mezclas complejas. Ningun otro metodo es tan poderoso y con tantas aplicaciones.
La cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Tswett poco después del inicio de este siglo.
Tswett hizo puras soluciones que contenian pigmentos vegetales como clorofilas y xantofilas, atraves de las
columnas de vidrio empacadas en carbonato de calcio dividido finamente. Las especies separadas aparecieron como
bandas coloridas sobre la columna, lo cual explica el nombre que le dio para el método ( del griego cromo, que
significa color y grophein, que significa escribir).
La cromatografía es una técnica la cual los componentes de una mezcla son separados con base en las
velocidades a los cuales son pasados a traves de una fase estacionaria por una fase movil gaseosa o liquida. La
elusión es un proceso por el cual los solutos son lavados a traves de una fase estacionaria por el movimiento de una
fase movil, un eluyente es un disolvente que se usa para llevar los componentes de una mezcla a traves de una fase
estacionaria.
Los metodos cromatograficos son de dos tipos. En la cromatografía de columna la fase estacionaria se
mantiene dentro de un tubo angosto y la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo angosto y la fase movil es
forzada a pasar a traves del tubo bajo presión de la gravedad.
Un cromatograma es una grafica de alguna función de concentración de soluto contra el tiempo o el
volumen de elusión. Es util tanto para análisis cualitativo como cuantitativo. Las posiciones de los picos sobre el eje
de los tiempos se puede emplear para identificar los componentes de la muestra, las areas bajo los picos
proporcionan una medida cuantitativa de cada especie.
La efectividad de una columna cromatografica para la separación de dos solutos depende en parte de las
velocidades relativas a las cuales las dos especies son eludidas. Estas velocidades son determinadas, por las
relaciones de partición de los solutos entre las dos fases.
El tiempo de retencion es el tiempo entre la inyección de una muestra y la aparición del pico del soluto en el
detector de la columna cromatografica.
En mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatograficas se emplean dos terminos, 1)
altura del plato H y 2) numero de platos teóricos N, los dos componentes se relacionan mediante la ecuación: N =
L/H
En la práctica se realizó una cromatografía de fase reversa. En este tipo de cromatografía se utiliza un
empaque enlazado hidrofóbico, usualmente con un grupo funcional octadecilo (C – 18) u octilo (C – 8) y una fase
móvil polar, frecuentemente una fase móvil parcial o totalmente acuosa. Las sustancias polares prefieren la fase
móvil y eluyen primero. Conforme aumenta el carácter de la fase móvil, mayor es su fuerza eluyente.
En la practica se va a separar los componentes de el medicamento paracetamol, este fármaco es importante
ya que el paracetamol (acetaminofén) es un analgésico-antipirético con acción selectiva sobre el Sistema Nervioso
Central (SNC) sin efecto de bloqueo corticoide. Produce analgesia por elevación del umbral al dolor y antipiresis por
medio de la acción sobre el centro hipotalámico termorregulador. El paracetamol se absorbe rápida y completamente
del tracto gastrointestinal. Su efectividad analgésica y antipirética es similar a la del ácido acetilsalicílico, y es poco
probable que produzca muchos de los efectos colaterales asociados con éste y productos que lo contienen.

OBJETIVOS GENERALES
- Conocer el manejo del equipo de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
- Conocer los fundamentos de la cromatografía de Líquidos de Alta Resolución en fase reversa
OBJETIVOS PARTICULARES
- Determinar las condiciones óptimas para llevar a cabo una cuantificación en Cromatografía de
Líquidos de Alta Resolución en fase reversa
a) Determinación de velocidad de flujo óptimo.
b) Determinación del % de agua en la fase móvil
- Llevar a cabo una cuantificación de paracetamol en una muestra farmacéutica por medio de la
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución en Fase reversa
METODOLOGÍA

Preparación de soluciones (fase


movil A, B, C, estandar 1,
estandar 2 y muestra problema

Selección de la
fase movil

Se inyecta la solución B1 y luego la


solución B2 con c/u de las fase movil

85% H2O 75% H2O

Selección del flujo optimo

0.9 1.2
ml/min ml/min

Separación del paracetamol


de la muestra problema bajo
condiciones optimas
RESULTADOS

Las lecturas tomadas para dos diferentes velocidades, así como para diferentes % de agua para el caso de la
velocidad de flujo de 1.2 ml/min, son las siguientes

VEL DE Tiempo de Retención W ÁREA N


FLUJO % de H2O A B A B A B A B
ml/min
1.2 75 2.539 2.88 0.446 0.189
85 2.401 2.747 0.275 0.18

A= Paracetamol
B= Ácido Acetil salicílico

Para poder elegir cual es la velocidad de flujo más adecuada, se calculó la resolución de ambas velocidades: 0.9 y
1.2 ml /min
R = (t2 – t1) . t1 y t2 = Tiempos de retención de los picos 1 y 2
½ (w2 – w3) w1 y w2= anchuras de picos para 1 y 2

Lectura tomada para la velocidad de flujo de 0.9 ml /min

VEL DE Tiempo de Retención W ÁREA N


FLUJO % de H2O A B A B A B A B
ml/min
0.9 75 3.445 4.41 0.264 0.371 28 934 976 10 855 560

A= Paracetamol
B= Ácido Acetil salicílico

MUESTRA PROBLEMA

VEL DE Tiempo de Retención W ÁREA N


FLUJO % de H2O A B A B A B A B
ml/min
0.9 75 3.544 4.818 0.326 0.391 31 924 496 10 702 304

CALCULO DEL FACTOR DE SEPARACIÓN

Mediante la siguiente fórmula se determinó el Factor de separación

Aexterno = F Cinterno
Ainterno Cexterno

Aexterno = área del estandar externo (paracetamol)


Ainterno = área del estándar interno (acido acetil salicílico)

Cinterno= concentración del estándar interno


Cexterno= concentración del estándar externo
Cálculo de concentraciones de los dos estándares
50 mg de
Paracetamol 50 mg de ácido
acetil salicilico

50 ml
50 ml

25ml
.
25ml

CALCULO DE RESOLUCIÓN
Para calcular la resolución en todos los siguientes casos se utilizó la siguiente fórmula:
R = (t2 – t1) . t1 y t2 = Tiempos de retención de los picos 1 y 2
½ (w2 – w3) w1 y w2= anchuras de picos para 1 y 2

Porcentajes de Agua:
85 % de H2O

75% de H2O

Velocidades de Flujo
A 1.2 ml/min

A 0.9 ml/min
En base a estos cálculos de resolución se confirma que la velocidad de flujo para la lectura de la muestra problema sería
0.9 ml/min con un 75% de H2O

Cálculo de paracetamol en la muestra


ANÁLISIS DE RESULTADOS

Para poder determinar las condiciones óptimas, los estándares B2, con diferentes proporciones de agua (75 y 85 %
de H2O) se sometieron a diferentes velocidades. Mediante el análisis visual de los cromatogramas se apreció que existía
mayor separación de los picos para la proporción de agua de 75%; así mismo tomando esta proporción de agua se determinó
por el mismo análisis visual que la velocidad óptima par la cuantificación de paracetamol, es 0.9 ml/min; los picos
estuvieron más separados en este caso que en la velocidad de flujo de 1.2 ml/min.
Posteriormente en el tratamiento de los resultados se calculó la resolución para el estándar B2, primeramente para
las dos proporciones de agua (75 y 85%) de las cuales la proporción de agua de 75% tuvo la mejor resolución. De las dos
velocidades de flujo, la correspondiente a 0.9 ml/min obtuvo la mejor resolución, por lo cual se confirmaron las condiciones
óptimas: 0.9 ml/min con un 75% de H2O.
La resolución es un término para decribir el grado de separación entre dos picos. Este está afectado por la
selectividad (α ), la eficiencia (N) y la capacidad de la columna (k’). La ecuación de resolución describe la relación entre
esos factores e indica como pueden ser manipulados en orden para mejorar la resolución entre dos picos; la ecuación es la
siguiente:
R = 1α - 1 (N1/2) k ‘ .
4 α 1 + k’

Los parámetros que se ven afectados cuando se varia la proporción de la fase movil son el tiempo de retención, y
por lo tanto el factor de retención ( K ′ ), esto se debe a que se esta cambiando la polaridad de la fase movil; y observando
resultados tenemos que, con la fase movil B tenemos mejores tiempos de retención que con la fase movil A, esto es debido
a que en la fase movil B tenemos una mezcla de acetonitrilo/solución acuosa de 25/75 ml respectivamente y en la fase movil
A tenemos una mezcla de acetonitrilo/solución acuosa de 35/65 ml, y con esto se puede notar que la fase movil B es mas
polar que la fase movil A, de lo cual podemos decir que el paracetamol se va a comportar mejor en fases moviles polares.
Sin embargo al incrementar aún más la polaridad de la muestra, se nota un descenso en la resolución del cromatograma a
una proporción 15/85 acetonitrilo/agua, por lo cual se concluye que el paracetamol se comporta en fases móviles
medianamente polares.
Cambiando el flujo de la fase movil, los parámetros que cambiamos también es el tiempo de retención, los
diferentes flujos modifican el tiempo de separación del analito, esto conlleva a encontrar una relación inversa entre el flujo y
el tiempo de retención para la muestra. También cambia el ancho de pico de las bandas, esto se debe a que los solutos que se
tardan menos tiempo en salir tienen anchos de pico reducido, y por lo tanto los que tardan mas tiempo en salir los anchos de
pico son mas grandes, esto se debe a la relación:
N
W = tr
4
comparando los resultados tenemos que el flujo optimo para nuestra muestra fue la de 0.9 ml/min ya que la resolución de
los sistemas era mejor, que con el flujo de 1.2 ml/min.
El cambio de columna no se realizó en la practica, pero en caso de que si se hubiese cambiado alguno de los
factores que se pudieran ver afectados serian la resolución de los sistemas, el grado de separación, el numero de platos
teóricos, la altura. Esto puede variar debido a que en un cambio de columna se puede variar el tamaño de partícula de la cual
esta constituida la columna y por lo tanto se cambia la fase estacionaria, el tamaño de la columna también puede variar.

Las ventajas de utilizar una cromatografía en fase reversa es que podemos separar compuestos no polares o de
mediana polaridad, ya que en esta se utiliza una fase estacionaria no polar y una fase movil polar, teniendo así una buena
separación de estas muestras, ya que si intentáramos separar este tipo de compuestos en una cromatografía de fase normal
no habría separación de tales compuestos, ya que estos compuestos se irían con la fase movil sin interaccionar con la fase
estacionaria, debido a que en la fase normal se utiliza una fase estacionaria polar y una fase movil no polar.
Esta técnica es la que probablemente proporciona la retención y selectividad óptimas cuando los compuestos no
tienen grupos para enlaces de Hidrógeno o tienen un carácter predominantemente alifático o aromático. El método es muy
apropiado para separar solutos con base en el tamaño y estructura de los grupos alquilo. En química clinica se usa
frecuentemente por medio de esta técnica, el análisis cuantitativo de drogas de abuso.
En cuanto a la cuantificación de paracetamol en la muestra, esta fue de 315 mg por tableta (peso de tableta= )
que en porcentaje es de 63.03 %. Este porcentaje es bajo ya que teóricamente cada tableta debe contener 500 mg de
paracetamol; sin embargo debemos considerar que el error puede deberse al errores sistemáticos que puede proceder de la
precisión del método de cuantificación; recordemos que la metodología usada a pesar de ser rápida (en comparación con el
método de curva de calibración) puede adolecer de cierta imprecisión. También el error puede deberse al manejo de las
soluciones y del equipo por parte del operador. Debemos considerar ambos factores, ya que el porcentaje fue bajo en
comparación con el intervalo permitido (95 – 105 % de la sustancia en la muestra).

CONCLUSIONES
Se realizo la separación e identificación de paracetamol en una muestra comercial por cromatografía de líquidos de alta
resolución seleccionando las condiciones instrumentales optimas.

Se prepararon las fases movil Acetonitrilo/disolución acuosa de las cuales se obtuvo una mejor resolución con la fase movil
B. El flujo optimo en el cual se presento la mayor eficacia y resolución fue la de 0.9 ml/min.
A pesar de que el método de relación de áreas es relativamente rápido en comparación con el método de Curva de
Calibración, puede tener menos precisión; sin embargo en casos clínicos donde solo se requiere saber la presencia de una
sustancia, por ejemplo el Antidoping, puede ser de gran utilidad. En la práctica se obtuvo un porcetaje relativamente bajo,
posiblemente debido tanto al manejo de los alumnos como a la relativa falta de precisión del método (Relación de áreas)
para calcular la concentración y posteriormente la cantidad de paracetamol en la muestra.

BIBLIOGRAFÍA

WILLARD, Hobart., Métodos de Análisis Instrumental. Editorial Iberoamericana. 1991. México D.F. p.p. 616-618.

WESTON, Andrea. HPLC and CE. Academic Press. USA 1997


Tesis: Desarrollo y validación del Método por Cromatografía de Alta Resolución para determinación de albendazol en
suspensión. Beatriz Baltasar Montes de Oca. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES Cuautitlan. Cuautitlan Izcalli
Estado de México. 1994.