ELISA: FUNDAMENTOS TIPOS Y APLICACIONES

GUSTAVO PANANA ACUA DIRECTOR TCNICO CENTRO DE DIAGNOSTICO CANTELLA

POR QUE ELISA?

ELISA CONCEPTOS Y FORMATOS DE ENSAYO

El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.

ELISA HOMOGNEO
ELISA HETEROGNEO ELISA DIRECTO ELISA DE CAPTURA ELISA COMPETITIVO ELISA NO COMPETITIVO

METODOLOGA DE ELISA
Diferentes ELISA Deteccin de anticuerpos especficos:

ELISA indirecto ELISA doble sandwich

Deteccin de antgenos:

ELISA directo competitivo ELISA sandwich

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo

Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.

Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido

Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima

Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

Adicin del substrato

Unin del substrato a la enzima

Desarrollo del color

QUE DETECTA?

Deteccin de Protenas o un organismo

Deteccin de una Molcula pequea

ELEMENTOS DE UN ELISA
Pocillos

Microplacas de poliestireno Volumen de 350 uL rea interna de 2.5 cm2 Formato de 96 pocillos

Adsorcin de Antgenos o Anticuerpos

Dilucin del antgeno o anticuerpo en buffer carbonato (pH 9.6) e incubacin 3h 37C Tratamiento a 40-50C con PBS hasta desecacin

ELEMENTOS DE UN ELISA
Solucin de Lavado

Cloruro de Sodio Tween 20 Agua Destilada PBS

Conjugados

-galactosidasa Fosfatasa Alcalina Peroxidasa

SENSIBILIDAD
Depende exclusivamente del valor K (constante de equilibrio

entre la interaccin antgeno-anticuerpo) Con K = 1012M-1 y 1% CV, la deteccin ms baja posible es de 10-14 M Como Incrementamos la sensibilidad? Reducir ruido de fondo, optimizando la union antgeno al pocillo y sesiones de lavado La baja calidad de los pocillos suele dar seales bajas o bajo nivel de unin con el antgeno Incorporando tcnicas indirectas de marcado Aumentando los tiempos de incubacin hasta el punto de equilibrio de la reaccin.

TCNICA: MEIA

APLICACIONES
Enfermedades producidas por parsitos Babesias y tripanosomas Toxocara canis Toxoplasmosis Triquinosis Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias Mycobacterium tuberculosis Brucelas Enterotoxinas Vibrio cholerae Estreptococos Salmonelas Enfermedades producidas por virus Enfermedad de Aujeszky Enfermedad de Newcstle Fiebre aftosa Leucemia felina Peste porcina africana Peste porcina clsica Rinotraqueitis infecciosa Rotavirus Artritis vrica

Hormonas Gonadotropina corinica Progesterona Testosterona Hormonas tiroideas Cuantificacin de inmunoglobulinas IgG IgE IgA Anticuerpos Anti-DNA Factor reumatoide Inmunocomplejos circulantes

EQUIPOS REQUERIDOS

FASES QUE DEBI PASAR EL KIT ANTES DE PODER SER COMERCIALIZADO O EMPLEADO EN EL LABORATORIO
DISEO Y OPTIMIZACIN DEL ENSAYO

VALIDACIN ANALTICA

VALIDACIN CLNICA

VALIDACIN DE ELISA
En el desarrollo de un nuevo kit estos ensayos incluyen: Estudios de estabilidad

De las placas, ltex etc. sensibilizadas De los conjugados De los sustratos.

Anlisis de muestras

En paneles caracterizados En poblaciones al azar Establecer efecto de la matriz e interferencias

no especficas.