Capitolul 1

ACIZII NUCLEICI - SUPORTUL MATERIAL AL INFORMAIEI E R E D I T A R E

1. 1. Din istoricul descoperirii acizilor nucleici

Dat fiind importana lor de excepie pentru fenomenul via, macromoleculele de acizi nucleici au polarizat atenia biologilor, chimitilor i chiar a fizicienilor, investigaiile dedicate cunoaterii compoziiei,

a unei matrie pe care s se ordoneze aminoacizii ce intr n componena unei molecule proteice. Pe de alt parte se

impunea ca respectivul suport, s aib i calitatea de a se autoreplica. Presupunerile n conformitate cu care ar fi posibil ca un anumit aminoacid s se autospecifice (s se specifice pe sine) sau c un aminoacid poate specifica pe altul (i n consecin 10

structurii i funciilor lor fiind extrem de numeroase, caracterizate prin tehnici de nalt finee i deosebit putere de rezoluie. Pe la sfritul celui de al doilea deceniu al secolului nostru s-au semnalat primele speculaii referitoare la "tipul" moleculelor responsabile de transmiterea informaiei

aminoacizi din cei 20 existeni i-ar specifica pe ceilali 10), sau c ar exista 20 de

proteine diferite (cte una specific pentru fiecare aminoacid) nu au putut fi demonstrate i argumentate. nenumrate Dimpotriv, argumente s-au care

ereditare. Dar, pn n 1940 nu au fost disponibile date elocvente relative la esena chimic a genelor (unitile ereditare fundamentale). Incepnd cu anul 1941, cercetrile efectuate pe specii ale genului Neurospora au furnizat dovezi concludente

acumulat

infirmau presupunerile menionate. Interesant i faptul c nu important totodat este

exist diferene structurale

pentru concepia n conformitate cu care genele au capacitatea de a controla asamblarea enzimelor. Se puneau, n fapt, bazele conceptului o gen = o enzim. Acumularea continu de date a impus necesitatea acceptrii existenei unui suport,

suficient de marcante ntre aminoacizi. Spre exemplu, valina i izoleucina (aa cum se preciza n volumul 1) difer ntre ele doar prin prezena unui grup metil, adiiona! la izoleucina. Glicina i alanina, pe de alt parte, difer doar printr-o grupare metil.

Ion I. Bara, Ovidiu C.

Z ^ ^ m a r a n d a C. Vntu
constatat c o asemenea afirmaie este

Prin urmare, orice proces de copiere trebuie s se caracterizeze printr-o mare acuratee, pentru a putea deosebi dou molecule att de asemntoare. Mai exact, fiecare molecul de aminoacid ar trebui s fie specificat cu o acuratee extraordinar, erorile neputnd depi 1/103. Dar, conform datelor de

inexact. Dealtfel, chiar denumirea de acizi nucleici este ntructva nejustificat deoarece, contrar primelor preri n conformitate cu care acizii nucleici s-ar gsi doar n nucleul celular (de unde le provine, dealtfel, numele) s-a constatat c sunt prezeni n ntreaga celul, n cantiti variabile i

biochimie, nu se cunosc reacii chimice n care s se poat decela diferena de o singur grup metil ntre dou molecule (altfel identice), cu o acuratee ale crei anse de eroare s fie mai mici de 1/106'. De pild, n experimente efectuate cu aminoacizi s-a constatat c leucina este inserat n lanurile polipeptidice cu o siguran de 99,9%, ceea ce reprezint o eroare la 1000 repetiii experimentale. Prin urmare proteinele nu pot avea calitatea de ereditare. Prin urmare, dac proteinele nu pot fi molecule semantice, purttoare de informaii ereditare, atunci "candidaii" pentru acest rol rmn acizii nucleici. Mult vreme, pe baza rezultatelor obinute prin diverse procedee de extracie, s-a crezut c acizii ribonucleici reprezint principalul constituent nuclear al drojdiilor i al celulelor vegetale, n timp ce acizii dezoxiribonucleici ar fi constituentul principal al celulelor animale. Ulterior s-a molecule

dependente ce starea fiziologic concret a celulei. Frederick Griffith, n 1928, a efectuat celebrul experiment prin care a sesizat

transformarea pneumococilor de tipul R, neviruleni, n pneumococi viruleni de tipul S. Evident, la acea dat nu a fost posibil explicarea fenomenului. Nu se tiau prea multe despre acizii nucleici. Ulterior ns, n 1944 (n plin rzboi), Oswald T. Avery, Colin M. McLeold i Maclyn McCarty au demonstrat, c factorul activ responsabil de acest fenomen este ADN-ul. Cei trei au constatat c dezoxiribonucleaza pancreatic distruge "factorul activ" ("fraciunile

active") dar nu are efecte asupra moleculelor mari sau asupra ARN-ului. Pe de alt parte s-a constatat c proprietile "transformrile"

ale ADN-ului nu sunt afectate de adaosul de enzime proteolitice pancreatic sau de ribonucleaza ce distruge

(ribonucleaza

Acizii nucleici ARN-ul). R. Signer, E. Hammarsten i T.

stabilit, cu exactitate, c toi viruii conin acizi nucleici i, n consecin, a aprut ntrebarea: acetia reprezint materialul lor genetic ? n 1952 au fost iniiate studii detaliate pe virusul (bacteriofagul) T 2 , de ctre A. D. Hershey i M. Chase (de la Cold Spring Harbour). nveliul proteic (capsida) a fost marcat cu 3 5 S i ADN-ul c u 3 2 P . S-a constatat c "infectarea" bacteriei se datoreaz doar ADN-ului, care ptrunde n celul i se autoreplic (n timp ce capsida, supranumit i fantom fagic, rmne n afar). n 1949 se stabilise deja, de ctre Erwin Charg/aff de la Universitatea Columbia din New York, c cele patru nucleotide (din componena acizilor nucleici) nu sunt prezente n cantiti egale i c rata lor variaz, de la specie la specie. Prin urmare, se poate conchide c aceast ordine -ce confer specificitate

Casperson au precizat c greutatea molecular a ADN este mai mare dect greutatea molecular a multor proteine (mai mare de 50. 000 d). Apoi, prin 1950, cu ajutorul microscopiei electronice a fost posibil s se constate ca molecula ADN-ului este extrem de lung i subire, avnd diametrul de numai 20 (lungimea depete mai multe mii de angstromi). Cercetrile au continuat i s-au gsit conexiuni clare ntre prezena ADN-ului i prezena cromosomilor. A. E. Mirsky i H. Ris (de la Institutul Rockfeller din USA i, respectiv, Vendrelys, din Frana), au

constatat c ADN-ul este destul de constant n cadrul unei specii i c este n cantitate dubl n celulele somatice, comparativ cu cele sexuale. Apoi s-a demonstrat c ADNul este metabolic stabil, n sensul c nici nu poate fi sintetizat de novo nici nu poate fi degradat cu rapiditate, aa cum se ntmpl cu ali constitueni celulari. Unele dintre cele mai evidente dovezi ale rolului genetic al ADN-ului au fost furnizate de genele virale. n 1950 a fost posibil obinerea de virui puri i determinarea principalelor lor componente. S-a

genetic - este o ordine semantic. Deci, rata celor patru baze nu este randomic. Mai mult dect att, cantitatea de A este egal cu cea de T (n sensul egalitii numrului de reziduuri) i cea de G este egal cu cea de C. Acest fenomen este cunoscut, n genetica molecular, sub numele de regula lui Charg/aff. Prima difracie a ADN-ului a fost

Ion I. Bra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vntu lar a devenit o molecul. A aprut, astfel, ideea excitant c o caten (din dublul helix de ADN) se poate constitui n matri specific pentru formarea celeilalte catene. Arthur Kornberg, n 1956, a demonstrat c sinteza ADN-ului este posibil n extracte celulare de bacterii. El a precizat c o enzim polimerizatoare, specific, este

efectuat n 1938. Apoi, M. H. F. Wilkins i Rosalind Franklin (n cadrul Colegiului King's din Londra) au obinut fotografii de o foarte bun calitate. Pe baza acestor date, s-a sugerat c structura ADN elicoidal

i c elicea (helixul) este format din dou sau trei catene (oricum mai mult dect o singur caten). n 1952, un grup de

chimiti din laboratorul condus de ctre A. Todd a reuit s demonstreze c nucleotidele din care este format ADN-ul sunt legate, mpreun, n succesiunea 3'-5' sau 5'-3' (deci prin legarea unei nucleotide 5' la

necesar pentru a cataliza legarea "pietrelor de construcie" ale ADN-ului (dATP, dGTP, dCTP i dTTP). Enzima implicat este

ADN-polimeraza l(DNA-polimeraza 1), i reprezint prima enzim pentru care s-a stabilit c este implicat n sinteza polidezoxinucleotidelor. Sinteza se deruleaz

poziia 3' a celeilalte, sau a unei nucleotide 3' la poziia 5' a celeilalte). n 1953, Francis Crick i James D. Watson (dup o tentativ nereuit a lui W. Cochran, Fr. Crick i V. Vand) au elaborat teoria dublului helix, cu cele dou catene complementare (n laboratorul lui Perutz i Kendrew). Cele dou catene sunt legate (mpreun, n dublet) prin cte dou puni de hidrogen ntre A i T i cte trei puni de hidrogen ntre G i C. Pe baza tuturor acestor date a devenit evident c gena este o molecul real, asupra creia pot "gndi", obiectiv, att

astfel.! Enzima catalizeaz legarea precursorilor nucleotidici prin puni fosfodiesterice n poziiile 3' i 5'. Enzima este activ

numai n prezena macromoleculei ADN-ului care servete ca "ordonator" al celor patru nucleotide menionate anterior. ADN-polimeraza 1 recunoate doar

poriunile pentoz-fosfat regulate. Deci ea nu poate determina specificitatea secvenei pe care o asambleaz. ntruct ADN-ul care servete ca matri are anumite raporturi A/T i G/C, produsul sintetizat va avea, de fiecare dat, cele 4 baze n aceleai raporturi ca i matria. Dar, aa cum vom vedea

chim iti i ct i biologii. Deci, obiect predilect de studiu pentru biologia molecu-

Acizii nucleici ulterior, sinteza ADN-ului este un proces deosebit de complex n care sunt "antrenate" multe enzime. n 1958, M. Meselson i F. W. Stahl au separat moleculele ADN rezultate prin (uor), cu
I4

7 N, nucleotidele disponibile

pentru sinteza unui ADN vor fi "uoare". Astfel, ADN-ul sintetizat dup transfer va fi diferit de cel sintetizat anterior. Dac

autoreplicarea ADN-ului implic separarea catenelor, se pot face previziuni asupra

autoreplicarea unei molecule ce a servit ca "MATRI", demonstrnd c, n timpul

densitii moleculelor de ADN prelevate dup diferite perioade de timp de cretere pe mediu uor. Dup numai o generaie, toate moleculele ADN vor conine o caten uoar i una grea - adic vor fi intermediare ntre cele uoare i cele grele (vor fi hibride). Aceste observaii le-au efectuat Meselson i Stahl. Apoi, dac bacteriile sunt meninute n aceleai condiii, dup dou generaii, jumtate dintre molecule vor fi uoare i jumtate estimative. Prin urmare, pe baza unor experimente de acest tip, s-a demonstrat c autoreplicarea ADN este semiconservativ. Aceast hibride conform calculelor,

autoreplicrii, cele dou catene ale "MATRIEI" se separ. Cei doi au utilizat
13 15

N i

C. Investigaiile s-au efectuat pe populaii

15

bacteriene cultivate n medii cu N . Trebuie menionat faptul c bacteriile crescute pe medii cu 1 5 N au ADN-ul mai greu dect cele crescute pe mediu cu
14

N . In consecin, a

fost nevoie s se pun la punct metode de separare a ADN-ului cu

14 13

N de ADN-ul cu

N - adic s se pun la punct metode de

separare a ADN-ului greu de ADN-ul uor. Metoda se bazeaz pe gradientul de densitate n sarea de CsCl 2 . Aplicnd fore centrifuge se constat c soluia n care au fost imersate bacteriile devine mai dens dect

precizare este foarte important ntruct nseamn c nu putem vorbi despre existena macromoleculei de ADN mam i a

citoplasm celular. Dac se reuete s se aleag o densitate corect a soluiei iniiale, moleculele de ADN se vor deplasa spre regiunea central a celulelor centrifugate, unde densitatea este egal cu aceea a soluiei saline. Dac celulele bacteriene coninnd ADN greu sunt transferate pe mediu normal

macromoleculei de ADN fiic, de unde (vom vedea ulterior) rezult c nu putem vorbi despre cromonem mam i cromonem fiic, cromatid mam i cromatid fiic, cromosomi parentali i cromosomi fii

Ion I. Bra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vntu (pentru aceast mrime a unei gene) diferite este de 4 1 5 0 0 - adic o valoare mult mai mare dect numrul genelor diferite care au putut (macroexista n toi cromosomii ce au existat de la apariia vieii pe TERRA. Primele dovezi experimentale ale

etc. Este clar c ADN-ul reprezint "macromolecula vieii", firul vieii care se menine ca atare n succesiunea de generaii. Descoperirea dublei elice

molecula ADN-ului dublu elicoidal) a pus capt controverselor privind identitatea

moleculei semantice, identitatea substanei ereditare -primare. Se mai punea doar

dependenei aminoaciziior de gene, au fost furnizate de cazurile de anemie falciform. In stare homozigot boala este grav. n stare heterozigot este mai puin grav.

problema precizrii modalitii de funcionare a informaiei deinute de ADN, n procesul complex al determinrii (inducerii) "informaiei" din macromolecula proteic. Specificitatea ADN rezid n linearitatea secvenelor celor patru nucleotide ce

Tipul de celule roii - hematii - este deci corelat cu modelul genetic. n homozigoie (ss; s provine de la englezescul sickle = secer), hemoglobina este anormal, caracterizat prin solubilitate diferit fa de cea a hemoglobinei normale, n timp ce heterozigoii (s + ) au 1/2 hemoglobina normal i 1/2 hemoglobina afectat. Tipul norma! de hemoglobina este

alctuiesc o caten. Macromoleculele ADNului pot fi comparate cu propoziii (sau cel puin cuvinte) foarte lungi, alctuite prin combinarea aleatorie a literelor A, G, C i T (n fond este vorba despre cele patru nucleotide sau, altfel spus, cele patru baze azotate din componena nucleotidelor). Dar chiar i numai cu aceste patru litere numrul de secvene potenial neidentice, de ADN, va fi 4" (unde n reprezint numrul de litere din secven) - destul de mare. Deci,

constituit din dou tipuri de lanuri polipeptidice - a i . Fiecare lan polipeptidic are o greutate molecular de aproximativ 16. 100 d. Dou lanuri a i dou lanuri /3 sunt prezente n fiecare molecul, conferindu-i hemoglobinei o greutate molecular de cea 64. 650 d. Lanurile a- i j8 sunt controlate de ctre gene distincte, aa c o singur mutaie va afecta doar unul dintre lanuri (niciodat pe amndou). n 1957, V. M.

potenial, exist un numr infinit de mesaje genetice diferite, redat prin relaia 256 . O gen bacterian conine aproximativ 1500 de baze. Numrul potenial de gene
256

Acizii nucleici Ingram (de la Universitatea Cambridge) a demonstrat c hemoglobina s difer de cea normal, prin schimbarea unui aminoacid n lanul (8 (n poziia 6, acidul glutamic este nlocuit prin valin). Cu excepia acestei schimbri, ntreaga secven aminoacidic este identic n hemoglobina normal i cea mutant. Deci mutaia genei induce o

normal existena unei a doua molecule cu rol de matri, dar a crei specificitate s fie determinat de ADN. Suedezul Casperson i belgianul Brachet au constatat existena a mari cantiti de ADN n citoplasm. A fost simplu s se imagineze funcionarea unei catene ADN ca matri pentru sinteza ARNului. Chimic, ARN-ul este foarte asemntor cu ADN-ul. El reprezint o caten lung, alctuit din nucleotidele A, U, C i G, legate ntre ele prin prin puni fosfodiesterice ntre C 5' de la pentoza unei nucleotide i C 3' de la pentoza nucleotidei

schimbare extrem de specific n molecula de hemoglobina. Studii ulterioare, avnd ca obiectiv stabilirea secvenei aminoacizilor n hemoglobina izolat din alte forme de

anemie, susin aceast afirmaie. Analizele demonstreaz c fiecare tip de anemie se caracterizeaz prin nlocuirea unui singur aminoacid, la un singur locus, n lungul lanului polipeptidic. ADN-ul nu poate fi matria pe care s se ordoneze direct aminoacizii, n procesul sintezei proteice. Argumente pentru acest punct de vedere sunt furnizate de experimente prin care se demonstreaz c sinteza proteic apare n zonele celulare n care ADN-ul este absent. Citoplasm este locul sintezei (separat, prin membrana nuclear, de ADN-ul cromosomial). De aceea este

adiacente. ADN-ul se deosebete de ARN prin dou caracteristici ale grupelor chimice din componena lor - riboza n locul dezo xiribozei i uracilul n locul timinei. In ciuda acestor diferene, polinucleotidele au

capacitatea potenial de a forma dubla elice. Nici grupele hidroxil adiionale, nici grupele metil greite din ti min nu afecteaz capacitatea ADN-ului de a forma structuri dublu helicoidale. In mod normal ARN-ul este monocatenar, fapt pentru care nu are o rat a bazelor complementare (tabel 1).

10 Tabelul 1

Ion I. Bra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vntu

Compoziia n baze a ARN de diferite origini

Sursa de ARN Escherichia coli Proteus vulgaris Euglena sp. Virusul poliomelitei

Proporia celor patru baze Adenin 0. 24 0. 26 0. 22 0. 30 0. 19 Uracil 0. 22 0. 19 0. 21 0. 25 0. 20 Guanin 0. 32 0. 31 0. 30 0. 25 0. 30 Citozin 0. 22 0. 24 0. 27 0. 20 0. 31

Rinichi de obolan

De aceea cantitatea de adenin nu este egal cu cea de uracil i nici cea de citozin cu cea de guanin. Deci, spre deosebire de ADN, ARN-ul are structur monocatenar. De aici decurge i lipsa structurii regulate, structur caracteristic doar ADN-ului.

1.1.2 Ipoteza adaptorului (elaborat de Crick), admitea, la nceput, drept normal ca pe macromolecula ARN-ului s existe

caviti n care "s se potriveasc" cele 20 molecule de aminoacizi. Prin urmare,

cavitile ar fi trebuit s aib forme specifice. Astfel, mol cc ula ARN-ului ar putea

1.1.1 Dogma central a geneticii, stipuleaz c informaia ereditar circul ntr-un singur sens i c, niciodat, ARN-ul nu poate servi drept matri pentru ADN i c proteina nu poate servi ca matri pentru acizii nucleici. Prima afirmaie a suferit deja unele corecii. Dar este o eviden faptul c enorma cantitate de informaie ereditar

"dicta" ordonarea aminoacizilor n cadrul macromoleculei proteice. Dar, cu timpul, ipoteza a nceput s nu mai fie agreat deoarece au aprut o sumedenie de inadvertene, n primul rnd, grupele specifice de pe cele patru baze din ARN (U, C, A, i G) vor interaciona cu grupele hidrosolubile. Grupele specifice (leucin, valin, ale multor aminoacizi prefer

circul n sensul A D N > A R N .

fenilalanin)

interaciunea cu grupri hidrofobe (grupri

Acizii nucleici insolubile n ap). n cel de al doilea rnd, chiar dac ARN-ul ar fi putut s se cuteze, nct s etaleze suprafeele hidrofobe, nu ar exista nici o cale pentru matria de ARN, de a discerne cu acuratee ntre moleculele foarte asemntoare de aminoacizi (cum ar fi glicina i alanina, vaiina i leucina - care difer doar prin prezena unei singure grupe metil). De aceea Crick a emis ipoteza n conformitate cu care, anterior incorporrii n protein, aminoacizii sunt ataai la molecule adaptoare care, n schimb, posed suprafee unice care se pot lega n mod specific la bazele din macromolecula ARN-ului.

necesar ca surs de energie - cataliznd formarea legturilor dintre peptide. Civa ani mai trziu, Zamecnic mpreun cu M. B. Hoagland au precizat c, anterior nglobrii n proteine, aminoacizii sunt legai la ARN t cu ajutorul unei clase de enzime numite aminoacil-sintetaze. ARN t reprezint cea

10% din cantitatea de ARN celular. Aceasta a fost o descoperire cu totul neateptat - exceptnd ipoteza adaptorului, emis de Crick, n conformitate cu care lanuri scurte de ARN aveau bazele cuplabile cu bazele complementare ale macromolecuielor de ARN ce serveau ca matri pentru sinteza proteic.

1.1.3 Sinteza proteinelor n tuburitest. Stabilirea proceselor prin care proteinele sunt sintetizate, impunea obinerea unor extracte celulare, capabile de a asigura toate etapele sintezei. Acest lucru a fost posibil n 1953 cnd, la un spital din Boston, P. C. Z amecnic i colaboratorii si, au folosit ici. 1.1.4 Paradoxul ribosorailor nespecifPeste 85% din ARN-ul celular se

gsete n ribosomi. Cantitatea lui crete n celulele caracterizate prin activitate biosintetic intens (cum ar fi celulele pancreatice, celulele hepatice, bacteriile n faza de

aminoacizi marcai radioactiv, spre a marca cile prin care se sintetizeaz proteinele. S-a propus ca locul din celul n care se sintetizeaz proteinele s fie considerat acela n care exist o mare concentrare de ribosomi. O alt precizare, extrem de important, a fost aceea c ATP (adenozin trifosfatul) este

cretere intens etc. ). ARN r a fost considerat iniial ca matri pentru ordonarea aminoacizilor. Dar, toi ribosomii sunt compui din dou subuniti inegale ca mrime, fiecare coninnd ARN, care se adun sau se separ, n funcie de concentraia ionic. In cel de al doilea rnd,

12

Ion I. Bra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vntu ADN-ul virai. Mai mult, nu numai ARN-ul sintetizat astfel are o componen bazic foarte asemntoare ADN-ului din fagul T4 clar nici nu este asamblat n componente ribosomaie (care, dup cum se tie, se

toate lanurile ARN r din cadrul subunitilor mici, sunt similare ca lungime (au 1. 500 baze la Escherichia coli), n timp ce lanurile ARN-ului din subunitile mari au n jur de 3. 000 baze. n cel de al treilea rnd, compoziia ambelor tipuri de lanuri (att a celor mari, ct i a celor mici) este aproximativ aceeai (bogat n G i C) ia toate bacteriile investigate, la plante i animale n ciuda marii variabiliti n raportul

formeaz doar prin asociere de proteine cu ARN r ). n schimb, ARN-ul fagului T 4 , dup prima ataare la rbosomii deja existeni, se mic n lungul suprafeei lor, pn ce se cupleaz n aa fel nct s fie posibil cuplarea ARN t , cu aminoacidul specific legat la el, la locul unde nodocul (anticodonul) este complementar codonului. ntruct poart informaia de la ADN la locurile cu aglomerri ribosomaie, pentru sinteza proteic, acesta a primit i ARN m (adic poart denumirea de mesager). Primele

AT/GC din ADN S . Deci, toate acestea sunt imposibile dac lanurile de ARN ar fi o colecie de lanuri cu rol de matri "copie" ale unor gene diferite. Adic ar trebui s existe o strns corelaie cu

genomul respectiv. Mai mult, noi ne-am putea atepta ca lungimea lanurilor diferitelor matrie de ARN s fie diferit i corelat cu lungimea produilor polipeptidici.

ARN

observaii relative la aceste fenomene au fost efectuate n anul 1960. Doar 4% din totalul ARN-ului celular este ARN m , a crui mrime prezint variaii

1.1.5 Descoperirea

ARN m .

Celulele

de larg amplitudine n lungime, n funcie de proteina pe care o codific. Deci numai o mic molecul de ARN mesager este a taat, la un moment dat, la un ribosom, care este purtat (glisat) n lungul su. Astfel, o singur macromolecul ARN m poate fi citit simultan de mai muli ribosomi.

infectate cu virusul T4 s-au dovedit a fi un sistem ideal pentru depistarea matriei

adevrate. Urmrind infecia determinat de acest virus, s-a constatat c activitatea

sintetic a celulelor de Escherichia coli, afectate, este stopat, avnd loc doar

producerea de ARN m , pe matria oferit de

Acizii nucleici 1.1.6 Sinteza enzimatic a ARN pe matria ADN. Prima dintre enzimele care transcriu ARN din ADN a fost izolat, independent, de ctre J. Hurwitz, A. ARN-ului ribosomii de din la ADN-ul nuclear Prin

13 ctre

citoplasm.

marcare

radioactiv s-a demonstrat c locul sintezei ARN-ului este nucleul. n decurs de o or dup sintez, acest ARN prsete nucleul.

Stevens i S. B. Weiss. Denumit polimeraz-ARN, aceast enzim funcioneaz

numai n prezena ADN-ului care servete ca matri, pe care se formeaz lanul ARNului, folosindu-se nucleotidele ATP, GTP, CTP i UTP, ca precursori. In bacterii, aceeai enzim realizeaz sinteza pentru fiecare dintre tipurile de ARN (ribosomal, transportor, mesager), folosind secvene de ADN ca matrie. Dovada direct a faptului c ADN-ul ordoneaz corect precursorii nucleotidici, provine din aceea c, n ARN, compoziia bazelor variaz n corelaie cu rata AT/GC din ADN. n aproape toate cazurile, raportul AU/GC din ARN este similar raportului AT/GC din ADN. n timpul transcripiei, numai una dintre catenele ADN-ului este transcris n

1.1.7 Represia i activarea represiei genice. faptul Suscit deosebit de mult interes c unele proteine nregistreaz

fluctuaii cantitative dramatice, n funcie de necesitile celulei. Ca exemplu, n acest sens, poate fi luat j3-gaactozidaza bacterian. n absena lactozei, bacteria Escherichia coli conine mii de astfel de molecule. F. Jacobs i J. Monod au elucidat acest aspect, prin explicarea modalitilor concrete prin care poate fi reglat procesul sintezei proteice. Ei au introdus i explicat noiunile de gen reglatoare, gen promotor, gen operator, gene structurale, represor i corepresor, inducie i retroinhibiie

genetic i enzimatic e t c , - noiuni pe care le vom explica, la rndul nostru, atunci cnd vom aborda procesul autoreglabil al sintezei proteice la procariote.

macromolecula ARN r a .

Acest

lucru este

normal deoarece mesajul purtat de cele dou catene, fiind complementar dar nu identic, poate codifica polipeptide complet diferite. Sinteza ARN-ului se desfoar, ntotdeauna, ntr-o singur direcie (mereu aceeai). Exist argumente clare pentru micarea

1.1.8 Colinearitatea. Este un fenomen genetic deosebit de important. A fost sesizat i demonstrat prin analize ale mutaiilor

14

Ion I. Bra, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vntu Translaia unei macromolecule ARN m ncepe de la un capt i se termin cnd ntregul mesaj ereditar a fost transferat ntro macromolecul proteic. Dar translaia ncepe i sfrete n poziii interne ale

manifeste n proteinele bacteriene. Experimentele au fost efectuate la Stanford, n 1960, de ctre C. Yanofsky i la Cambridge, de ctre Brenner. n 1961, Brenner i Crick au stabilit c grupele de trei spre a specifica

nucleotide sunt folosite aminoacizii.

macromoleculei ARN m . Prin urmare trebuie s existe nite semnale n interiorul ARN m (corespunztoare catenei antisens a ADNului), semnale care s declaneze i, apoi, s stopeze translaia. Cei trei codoni menionai anterior - UAA, UAG i UGA- cunoscui ca nonsens, nu corespund nici unui aminoacid dar servesc drept semnale stop. Mai complicat este problema codonului START. Aminoacidul metionin ncepe toate lanurile polipeptidice dar tripleta AUG, care codific acest aminoacid, codific i metionin din interiorul unui poiipeptid. Codonul AUG, care iniiaz lanul polipeptidic, este precedat de un bloc de nucleotide predilect purinice, care are roiul de a ataa ARN m la ribosomi.

Dar ce codon specific un

anumit aminoacid ?. M. W. Nirenberg i J. H. Mathaei, din Bethesda (Maryland) au observat, n 1961, c polimerizarea nucleotidului U, pentru formarea pol inucleotidului U U U U U U U U . . . . , prin adugare de U la un sistem acelular, conduce la sinteza poiifenilalaninei. Pe aceast cale (prin aceast

metod) s-au identificat toi ceilali codoni. H. G. Khorana (Madison, Wisconsin) a sintetizat AGUAGUAGU e t c , etc. S-a

constatat, prin aceast metodologie, c doar 61 dintre cei 64 de codoni au capacitatea de a codifica aminoacizii (de a specifica locul i numrul fiecruia dintre cei 20 aminoacizi n cadrul unei polipeptide). Ceilali trei codoni, identificai ulterior a fi UAA, UAG i UGA s-au dovedit a avea rolul de terminatori ai sintezei polipeptidei, fiind denumii codoni STOP. Evident (s-a demonstrat tot prin experimente), aa cum exist semnale

1.1.9 Utilitatea enzimelor care secioneaz ADN n fragmente bine definite. Semnalele pentru iniierea i stoparea

sintezei catenelor ARN m sunt codificate n ADN. Acestea sunt mai complicate dect semnalele implicate n declanarea sau

STOP, exist i semnale START, semnale care declaneaz procesul biosintezei.

Acizii nucleici stoparea translaiei i sunt evideniate doar atunci cnd sunt disponibile tehnicile de secveniere. n 1970, Hamilton Smith a izolat prima enzim care taie ADN-ul la o secven nucleotidic foarte specific. Peste puin timp, au fost izolate cteva astfel de enzime, fiecare de la o anumit bacterie. Se cunosc, acum, peste 100

15 de tipuri de

enzime. n general, o asemenea enzim, numit enzim de restricie, recunoate o secven unic de 4 sau 6 nucleotide i astfel taie o macromolecul de ADN peste nc cteva sute sau chiar mii de baze (tabel 2).

Tabelul 2
Secvenele recunoscute de unele enzime de restricie

Specia microbian Escherichia coli KY13 Hemophilus influenzae Rd

Enzim Eco RI Hin dll

5 5

Locusul de recunoatere ' GAA ' GTPy CAPu ' GTT CAA
y

TTC PuAC PyTG AAC TTG GG CC CC GG

Hpal Hemophilus parainfluenzae Hpa II

CC GG

Hemophilus

aegyptius i

Hae III

' GG CC

Existena acestor enzime a schimbat rapid cursul cercetrilor privitoare la ADN, dnd biochimitilor posibilitatea, pentru

dovedit deosebit de eficiente n izolarea de fragmente ADN distincte, din ADN-ul viral a crui lungime varia de la cteva mii, pn la 50. 000 nucleotide.. 1.1.10 Acidul dezoxiribonucleic recom-

prima oar, s experimenteze pe fragmente de ADN bine definite. Aceste procedee s-au

16 binant.

Ion I. Bara, Ovidiu C. Toma, Smaranda C. Vntu Cea mai important consecin, din mozaicul tutunului este infecios, n absena proteinelor. n urma acestor constatri cercetrile s-au intensificat i s-au descoperit i alte virusuri, dintre care

sesizat destul de timpuriu, a posibilitii de a utiliza enzimele de restricie, a fost de S-a

dezvoltarea i obinere a

definitivarea tehnicilor recombinam.

ADN-ului

amintim virusul polioma i cel al gripei, care au ARN-ul ca suport material al

descoperit, spre exemplu, existena enzimei ADN-ligaza. Prin intermediul ei, fragmentele ADN, obinute sub incidena restrictazei (o alt enzim), au fost reunite, randomic. Apoi s-au reunit fragmente provenind din molecule diferite (P. Berg, n 1972). S. Cohen i H. Boyer au reunit cromosomul bacterian cu o piasmid. Acum, n 2-3 zile, este posibil citirea unei secvene de cteva sute de nucleotide.

ereditii. Dovezile n conformitate cu care virusurile cu ARN se replic identic celor cu ADN, au fost furnizate de experimentele efectuate cu virusuri mici, care se multiplic n bacterii i care conin molecule de ARN monocatenare. n 1965, I. Haruna i S. Spiegelman au izolat o repicaz viral - o enzim care catalizeaz formarea de noi molecule de ARN, n prezena precursorilor. Modalitile concrete prin care se formeaz

1.1.11 ARN-ul

poate

funciona

ca

aceste molecule au fost demonstrate abia n 1968, de ctre C. Weissmann i J. August, independent unul de altul. Ei au relevat faptul c are loc implicarea unei molecule ARN dublu catenar, ca intermediar.

material genetic. n 1930 s-a constatat c unele virusuri ale plantelor conin ARN i nu ADN. Abia n 1956, A. Gierer, n

Germania, a demonstrat c ARN-ul purificat