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ESCOLA MUNICIPAL GOVERNADOR ISRAEL PINHEIRO Avenida Luzia Brandão Fraga de Souza, nº 201, Loanda -

ESCOLA MUNICIPAL GOVERNADOR ISRAEL PINHEIRO

Avenida Luzia Brandão Fraga de Souza, nº 201, Loanda - João Monlevade

Minas Gerais - CEP: 35.931-023

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Loanda - João Monlevade Minas Gerais - CEP: 35.931-023 1 CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA Química Clínica

CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA

Química Clínica

Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Escola Municipal Governador Israel Pinheiro para obtenção do título de Técnico em Química.

Supervisor: Fernanda G. Ribeiro Orientador: Prof. Me. Huita do Couto Matozo

João Monlevade/MG

2013

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CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA Laboratório de Análises Clínicas

Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Química Clínica

Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Av. Gustave Peffer n° 751 Bairro: Louis Ensch

Tel.: (31) 9522-8095

E-mail: leandro.yukiroyt@hotmail.com

João Monlevade/MG

2013

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Minas Gerais - CEP: 35.931-023

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Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira

Química Clínica

Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) Área de Concentração: Química

Farmacêutica/Bioquímica Fernanda G. Ribeiro Supervisora de Estágio - RT

Professor Me. Huita do Couto Matozo Orientador de Estágio

Mônica Faria da Silva Parente Diretora da Instituição de Ensino EMIP

Leandro José Dias G. de Oliveira Estagiário de Química

João Monlevade - Fevereiro de 2013

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Oliveira, Leandro José Dias Gonçalves de.

Química Clínica / Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira; Orientador Huita do Couto Matozo; Secretaria Municipal de Saúde e Meio Ambiente: Fernanda G. Ribeiro Rio Piracicaba, 2013. 123 p.

Relatório de Estágio (Técnico Disciplina de Estágio Supervisionado Área de Concentração: Química) Escola EMIP QUÍMICA.

1. Análises Clínicas. 2. Química. 3. Bioquímica. 4. Exames.

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“Há um tempo em que é preciso abandonar as roupas usadas, já que têm a forma do nosso corpo, e esquecer os nossos caminhos, que nos levam sempre aos mesmos lugares. É o tempo da travessia e, se não ousarmos fazê-la, teremos ficado, para sempre, às margens de nós mesmos.”

Fernando Pessoa

AGRADECIMENTOS

“Agradeço a Deus, sempre presente em minha vida.”

“Aos meus familiares e amigos, que juntos torceram pela minha vitória.”

“À minha avó materna Efigênia (in memorian), cuja presença espiritual sempre me ajudou a progredir com afinco nos estudos.”

“Aos meus professores, que me guiaram durante toda minha jornada.”

“Aos colegas de trabalho do laboratório da secretaria de saúde, pela oportunidade que me deram de mostrar meu conhecimento, possibilitando meu desenvolvimento profissional.”

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OLIVEIRA, L. J. D. G. Química Clínica, 2013 123 p. Relatório Técnico Supervisionado de Conclusão do Curso Técnico de Química EMIP Escola Municipal Governador Israel Pinheiro; João Monlevade MG, 2013.

O laboratório do Centro de Saúde Dr. Gentil Alves Costa tem como objetivo a análise de

materiais biológicos (sangue, fezes e urina) cujo estudo visa apresentar laudos sobre a saúde do

paciente. As áreas nas quais os técnicos atuam são: coleta, hematologia, bioquímica,

imunologia, urinálise e parasitologia. As atividades realizadas estão em conformidades com as

recomendações e exigências pelo Conselho Regional de Farmácia e da Vigilância Sanitária

Estadual de Minas Gerais. No laboratório não se pensa apenas nos procedimentos e nos

resultados obtidos, mas também na ética profissional. Há, também, zelo pelos materiais de

trabalho e mais, pelo meio ambiente. No presente relatório constam as atividades desenvolvidas

durante o estágio supervisionado na área de análises clínicas. Apresenta aplicações vistas

durante o curso técnico de química e, também, a programação de estágio. As atividades estão

interligadas, e funcionam harmonicamente desde a entrada do paciente (cadastro) até a entrega

do resultado.

Palavras-Chave: Análises Clínicas; Bioquímica; Química; Exames.

7

Sumário

 

Pág.

1. Introdução

 

10

2. Objetivos

11

2.1. Objetivo Geral

 

11

2.2. Objetivo Específico

11

3. Recursos para o Trabalho Laboratorial

12

3.1.

Materiais, Reagentes e Equipamentos

12

3.1.1. Materiais

 

12

3.1.2. Reagentes Analíticos

13

3.1.3. Equipamentos e Acessórios

15

4. Metodologia Científica

 

16

5. Assepsia e Coleta de Material Biológico

16

5.1. Assepsia

 

16

5.2. Coleta

17

5.2.1. Sangue

17

5.2.2. Urina (de rotina)

21

5.2.3. Fezes

 

21

 

5.2.3.1.

Fezes sem MIF

21

5.2.3.2.

Fezes com MIF

21

6. Hematologia

23

6.1.

Hemograma (Hc)

24

6.1.1. Eritrograma

24

6.1.2. Leucograma

25

6.1.3. Plaquetograma

25

6.2. Elementos do Sangue

29

6.2.1. Eritrócitos (Hemácias/RBC)

29

6.2.2. Hemoglobina (HGB)

31

6.2.3. Hematócrito (HCT)

32

6.2.4. Leucócitos (WBC)

32

6.2.5. Linfócitos (LYN)

32

8

 

6.2.7. Neutrófilos

33

6.2.8. Neutrófilos

34

6.2.9. Mielócitos

34

6.2.10. Metamielócitos

34

6.2.11. Basófilos

35

6.2.12. Bastonetes

35

6.2.13. Segmentados

36

6.2.14. Trombócitos

36

6.3. Preparo de Lâminas

37

6.4. Contagem Diferencial de Células Leucocitárias

40

6.5. Grupos Sanguíneos + Fator Rh (GS + Rh)

43

6.6. Velocidade de Hemossedimentação (VHS)

45

6.7. Coagulograma (COAG)

46

 

6.7.1. Tempo de Protombina (TP)

47

6.7.2. Atividade de Protombina (AP)

47

6.7.3. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

48

6.7.4. Relação Normalizada Internacional (RNI)

48

7. Bioquímica

 

49

7.1. Glicose (GLIC)

52

 

7.1.1. Glicose (GLIC-J)

52

7.1.2. Glicose (GLIC-PP)

54

7.2. Colesterol Total (COL)

54

 

7.2.1.

Frações do Colesterol

56

 

7.2.1.1. HDL

56

7.2.1.2. LDL

58

7.2.1.3. VLDL

59

7.2.1.4. Triglicérides (TRIG)

59

7.3. Uréia (UR)

61

7.4. Ácido Úrico (AUR)

64

7.5. Fosfatase Alcalina (FAL/ALP)

67

7.6 Proteínas Totais (PROT)

69

7.7.

Albumina (ALB)

69

9

7.9.

Mucoproteínas (MUC)

73

7.9.1. Desproteinização

74

7.9.2. Precipitação

75

7.10.3. Colorimetria

76

7.10. Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO)

77

7.11. Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGP)

78

8. Imunologia (Sorologia)

81

8.1.

HIV-1/2

82

8.2.

VDRL

83

8.3. Antiestreptolisina O (ASO/ASLO/AEO)

87

8.4. Proteína C Reativa (PCR)

88

8.5. Fator Reumatoide (FR)

89

 

9. Parasitologia

91

9.1.

Exame Parasitológico de Fezes (EPF)

92

9.1.1. Método de Hoffman-Pons-Janes (HPJ)

92

9.1.2. Pesquisa de Controle de Esquistossomose (PCE) Método Kato-Katz (KK)

94

10. Urinálise

96

10.1. Análise Físico-Química

96

10.2. Análise Bioquímica

98

10.3. Sedimenstoscopia (EAS Elementos Anormais do Sedimento)

99

11. Biossegurança

102

11.1.

Procedimentos Operacionais Padrão (POP)

102

11.2. EPI’s e EPC’s

102

11.3.

Boas Práticas Laboratoriais

103

12. Lavagem de Material, Descarte de Resíduos e Esterilização

103

13. Considerações Finais

104

 

14. Conclusão

105

15. Referências

106

16. Anexos

116

10

1. Introdução

Em cumprimento ao que regulamenta a Lei n° 11.788, de 25/09/2008, o aluno Leandro José Dias Gonçalves de Oliveira, do Curso Técnico de Química, da Escola Municipal Governador Israel Pinheiro EMIP, localizada em João Monlevade, elaborou o seu Trabalho de Conclusão de Curso, referente ao estágio curricular no laboratório do Centro de Saúde Dr. Gentil Alves Costa, Química Clínica, em Rio Piracicaba, MG. Teve-se por base as atividades exercidas rotineiramente em laboratório de análises clínicas, realizado no período de 01/06/12 a 30/11/12, sob orientação da farmacêutica/bioquímica RT, Fernanda Ribeiro.

A análise clínica é o ramo de conhecimento que trabalha com o estudo de alguma substância de forma a coletar dados e apontar diagnósticos a respeito da saúde do paciente. Essas análises ocorrem a partir de um exame feito a pedido de um médico e são entregues em laboratórios próprios para realização desses exames. A hematologia é a subárea especializada em observar os elementos do sangue: hemácias, leucócitos, plaquetas e outras células. A bioquímica é a parte que se encarrega das dosagens de elementos diversos (glicose, colesterol, proteínas etc) utilizando o soro ou o plasma como material. A imunologia é o estudo das características do sistema imunológico, também utilizando o soro. A urinálise é a parte responsável pela observação dos elementos que compõe o sedimento urinário, avaliando possíveis anormalidades. A parasitologia é a parte que trata da observação dos sedimentos fecais visando à detecção de verminoses e outras anormalidades.

Nos procedimentos laboratoriais é fundamental o conhecimento teórico e saber interpretar os resultados encontrados nas dosagens realizadas. Atualmente os processos são semi- automatizados, mas mesmo assim o analista deve ter um conhecimento prévio, para que os serviços sejam executados de maneira correta e eficiente, pois erros de qualquer natureza devem ser evitados.

11

2. Objetivos 2.1. Objetivo Geral Concluir o estágio supervisionado de química demonstrando os conhecimentos obtidos durante o mesmo.

2.2. Objetivo Específico Detalhar minuciosamente todos os procedimentos realizados no laboratório de análises clínicas, de maneira a obter o título de técnico em química pela apresentação deste TCC ao corpo docente da EMIP.

12

3. Recursos para o Trabalho Laboratorial Os procedimentos realizados no laboratório são voltados para a análise de material biológico humano: sangue, fezes e urina. Todo procedimento tem métodos diferenciados, bem como a maneira de execução e interpretação dos mesmos. Os recursos de trabalho são os materiais, reagentes e equipamentos.

3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos 3.1.1. Materiais Agulha 0,70 x 25 mm Agulha 0,80 x 25 mm Balão Volumétrico Bandagem Anticéptica Bandeja Inox Bastão de Vidro Béquer de Vidro Braçadeira de Coleta Canudo de Plástico Coletor de Urina/Fezes Coletor para Perfurocortantes Compressa de Gaze Hidrofílica 7,5x7x7,5 cm Cronômetro Manual Cuba Rim Inox Cubeta para Coagulômetro Detergente Escova para Tubos de Ensaio Esponja Dupla-Face Antibactérias Estande para tubos de Ensaio Frasco conta gotas Funil de Polipropileno Garrote Impressora Matricial Jaleco Branco Lâminas sem Borda Fosca

13

Lápis Dermatográfico Luvas de Procedimento Descartáveis Macropipetadores Micropipetadores de Volume Fixo Micropipetadores de Volumes Variados Papel Filtro Qualitaivo Papel Matricial Branco de 1 via Pêra de Borracha Pincel Retroprojetor Pipeta Graduada Pipeta de Westergreen Placa de Kline Placa para reação imuno-látex Ponteiras para Micropipetadores Proveta de 50,0 mL Seringa de 3,0 mL Seringa de 5,0 mL Seringa de 10,0 mL Seringa de 20,0 mL Suporte para Micropipetadores Suporte de Westergreen Suporte para Micropipetas Monocanais Automáticas e Semiautomáticas Tampa para Tubos de Ensaio Tiras Reagentes de Urinálise Tiras Reagentes de β-hcg Tubo de Cônico Graduado Tubo de Ensaio de Plástico Tubo de Ensaio de Vidro Tubo para Bomba Peristáltica do Analisador Bioquímico BIOPLUS 2000 3.1.2. Reagentes Analíticos Ácido Úrico Água Deionizada Albumina

14

Álcool Ácido de Ziehl Neelsen 3% Anticoagulante Citrato Anticoagulante EDTA Anticoagulante Flureto Anticorpos Monoclonais Murinos para Classificação ABO Soroclone Anti-A Anticorpos Monoclonais Murinos para Classificação ABO Soroclone Anti-B Anticorpos Monoclonais Murinos para Classificação ABO Soroclone Anti-D Antiestreptolisina O Látex Azul de Metileno Colesterol HDL Colesterol Total Controle de Plasma Abnormal Controle de Plasma Normal Corantes Rápidos de Hematologia Creatinina Etanol a 70% Etanol a 99,8% Fator Reumatóide Látex Fosfatase Alcalina Fucsina Fenicada Glicose Hipoclorito de Sódio a 1% HIV - 1/2 Mucoproteínas Óleo de Imersão Proteína C Reativa Látex Proteínas Totais Solução de Calibração HC-Diluent (Contador Hematológico Human Count Plus) Solução de Calibração HC-Lyse (Contador Hematológico Human Count Plus) Solução de Limpeza HC-Cleaner (Contador Hematológico Human Count Plus) Solução de Limpeza para Analisador Bioquímico BioPlus 2000 Soro de Coombs BSA Tempo de Protombina

15

Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada Transaminase Glutâmico Pirúvica Transaminase Glutâmico Oxalacética Triglicerídeos Ureia

3.1.3. Equipamentos Analisador Bioquímico BioPlus 2000 Analisador Hematológico Human Count Plus Banho-Maria Quimis Centríguga Celm Combate Coagulômetro Óptico Monocanal Human Clot Jr. Computador e Impressora Matricial Contador Diferencial de Células Benfer CC 900 Deionizador de Coluna Quimis Estufa de Esterilização e Secagem Odontobrás Geladeira Electrolux Homogeneizador de Sangue Quimis Microscópio Binocular Nikkon Eclipse

16

4. Metodologia Científica

A metodologia (no presente relatório) é a parte da produção do TCC que trata dos

procedimentos e métodos realizados dentro do local de estágio. É de suma importância o detalhamento das atividades, pois facilita o entendimento técnico e prático dos mesmos. De acordo com EITERER (2006), o método científico compreende basicamente um conjunto de

dados iniciais e um sistema de operações ordenadas adequado para a formulação de conclusões,

de acordo com certos objetivos predeterminados. A rotina laboratorial não é leve e, por isso,

demanda uma rigorosa atenção na realização dos procedimentos. A metodologia é aplicada como a maneira de se reproduzir todos os ensaios laboratoriais de maneira correta, eficaz e segura. A elaboração e execução das análises necessitam, para que seus resultados sejam satisfatórios, estarem baseadas em planejamento cuidadoso, reflexões conceituais sólidas e alicerçados em conhecimentos já existentes. Na elaboração do TCC de Química é de grande importância, também, além de demonstrar métodos e etapas de procedimentos, apresentar fórmulas químicas, reações e interações moleculares, bem como os nomes dos reagentes, produtos, e outros agentes participantes, para que haja um enriquecimento do mesmo.

5. Assepsia e Coleta de Material Biológico

5.1. Assepsia Assepsia ou desinfecção é o conjunto de medidas que permitem manter um ser vivo ou meio

inerte de microrganismos. Os antissépticos utilizados no laboratório são o etanol a 70% (que coagulam proteínas e lipídios das membranas dos microrganismos) e o Hipoclorito de Sódio a 1% (que inibem a atividade das proteínas e a síntese de DNA dos microrganismos). Chegando-

se ao laboratório, pega-se uma compressa de gaze, limpa, e umedecida com etanol 70%, e

limpa-se as bancadas, mas sempre em um único sentido (ou vertical ou horizontal), para evitar a recontaminação. A assepsia é feita como demonstrado no grupo de figuras 01 abaixo:

ou horizontal), para evitar a recontaminação. A assepsia é feita como demonstrado no grupo de figuras
ou horizontal), para evitar a recontaminação. A assepsia é feita como demonstrado no grupo de figuras

17

17 Fig.01 – Quatro maneiras de executar assepsia em bancada. A realização desse procedimento é indispensável
17 Fig.01 – Quatro maneiras de executar assepsia em bancada. A realização desse procedimento é indispensável

Fig.01 Quatro maneiras de executar assepsia em bancada.

A realização desse procedimento é indispensável num laboratório de análises clinicas. Segundo SENA, et.al (2011) a principal causa das infecções na área da saúde é a deficiência no processo de assepsia. A assepsia também deve ser feita nas mãos. Deve-se lavá-las bem com sabonete líquido neutro e depois passar álcool 70%.

5.2. Coleta 5.2.1. Sangue A coleta de sangue para análise é realizada por uma auxiliar de enfermagem ou por uma técnica em patologia clínica. Para realizar a coleta, o paciente chega com a solicitação médica dos exames. O pedido médico é mandado ao laboratório, onde o paciente é cadastrado no sistema, e recebe um número de entrada em sua ficha. Feito isso, o sangue é coletado. Os demais materiais (urina e fezes são entregues no próprio laboratório). O paciente se senta, coloca o braço sobre uma braçadeira de coleta revestida por compressa cirúrgica de gaze 45x50

cm;

limpo com álcool a 70% INPM e, em seguida, garroteado. A pessoa que fará a coleta procura sentir onde a veia do paciente está mais superficial, para que evite ter de aprofundar demais a agulha, machucando-o. O bisel (agulha) deve ser injetado com o orifício para cima, para que

facilite a entrada do sangue. Deve-se colocar o sangue colhido nos respectivos tubos com atenção. Feita a coleta, é colocada uma bandagem antisséptica no local da punção. (Informar ao paciente para não dobrar o braço evitando, assim, hematomas.) Após ser coletado, o sangue do paciente é colocado em tubos que contenham ou não anticoagulante; e que anteriormente foram identificados com as iniciais do nome do paciente e o número de cadastro. Quando o tubo possui anticoagulante, deve-se observar a cor da tampa do tubo. A quantidade de sangue colhida depende dos exames solicitados. Quando o sangue é coletado e é colocado nos tubos deve-se adicionar, quando necessário, substâncias denominadas anticoagulantes. Essas substâncias químicas são inibidoras da

é

o

local

da

punção

no

braço

18

coagulação do sangue. Elas iram impedir, obviamente, que o sangue permaneça maior tempo sem coagular em temperatura ambiente. O sangue deve ser colhido em jejum, e quando houver preparos, deverão ser seguidos. O anticoagulante deve ser específico para os exames que se deseja realizar. No laboratório há três anticoagulantes utilizados. O EDTA é o anticoagulante utilizado em sangue que serão utilizados nos exames da área da hematologia (exceto coagulograma). Sua nomenclatura, segundo IUPAC (2001), é ácido etilenodiaminotetracético.

segundo IUPAC (2001), é ácido etilenodiaminotetracético. Fig. 02 – Fórmula estrutural do EDTA. Fonte:

Fig. 02 Fórmula estrutural do EDTA. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/EDTA

Ele forma complexos muito estáveis com diversos íons metálicos. O tubo, de vidro, que receber o anticoagulante EDTA deve ser de tampa roxa. Ele reage através de seus dois radicais ácidos com o cálcio plasmático, formando um quelato, tornado-se insolúvel. O quelato é um composto químico formado por um íon metálico ligado por várias ligações covalentes a uma estrutura heterocíclica de compostos orgânicos. Como no caso da molécula abaixo, pela química de coordenação, irão se juntar aos átomos de oxigênio, os metais que reagirem com o anticoagulante. O EDTA é um líquido de cor alaranjada.

o anticoagulante. O EDTA é um líquido de cor alaranjada. Fig. 03 – Complexo formado pela

Fig. 03 Complexo formado pela ação do EDTA.

Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Titula%C3%A7%C3%A3o_de_complexa%C3%A7%C3%A3o

19

O Fluoreto de Sódio, cuja fórmula química é NaF, é o anticoagulante utilizado apenas para alguns exames bioquímicos. É interessante citar que este anticoagulante também contém uma fração mínima de EDTA. O tubo, de plástico, deve conter uma gota do anticoagulante, e a tampa deve ser de cinza. O fluoreto de sódio possui uma cor azulada.

O Citrato trissódico é o anticoagulante utilizado quando são realizados os exames de

coagulograma, pois envolvem laudos que servem de base para que o médico analise as condições do paciente de ser submetido a cirurgias. O sangue deve ser colhido sem que o garrote esteja muito apertado, e uma gota do anticoagulante deve ser colocada no tubo, de

vidro, somente na hora que o sangue tiver sido colhido, ao contrário dos outros dois, que podem ser colocados no tubo horas antes e até mesmo permanecer neles de um dia para outro.

As tampas dos tubos que contém o sangue para realizar COAG (coagulograma) são de cor azul.

O citrato possui uma coloração azul cintilante. O nome IUPAC dessa substância é trissódio-2-

hidroxipropan-1,2,3-tricarboxilato.

é trissódio-2- hidroxipropan-1,2,3-tricarboxilato. Fig. 04 – Fórmula estrutural do citrato trissódico.

Fig. 04 Fórmula estrutural do citrato trissódico. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Citrato_de_s%C3%B3dio

Os exames que necessitam utilizar o soro sanguíneo não utilizam anticoagulantes. Depois de

colhido o sangue, o mesmo é incubado em banho-maria a 37°C por alguns minutos. Após isso, é centrifugado até que haja separação entre a ‘parte líquida’ e a ‘parte sólida’ do sangue. Várias dosagens bioquímicas e imunológicas são realizadas no soro (obtido a partir do sangue sem anticoagulante) ou no plasma (obtido no sangue com anticoagulantes). A diferença entre soro e plasma é que o soro não contém fibrinogênio, o qual participou da formação do coágulo (fibrina).

Para um maior entendimento e organização das informações sobre os exames, montou-se a seguinte tabela:

20

 

Tabela 01: Diferenciação dos tubos de coleta de sangue

 
 

Exame

Material

Anticoag.

Tampa

Área

Ácido Úrico

 

Soro

- -

 

Bioquímica

Albumina

Soro

- -

 

Bioquímica

Antiestreptolisina O

Soro

- -

 

Hematologia

Atividade de Protombina

Plasma

Citrato

Azul

Hematologia

Colesterol HDL

 

Soro

- -

 

Bioquímica

Colesterol Total

 

Soro

- -

 

Bioquímica

Creatinina

Soro/Plasma*

Fluoreto*

Cinza*

Bioquímica

Fator Reumatóide

 

Soro

-

-

Hematologia

Fosfatase Alcalina

 

Soro

-

-

Bioquímica

Glicose

Soro/Plasma*

Fluoreto*

Cinza*

Bioquímica

Glicose Pós-Prandial

Soro/Plasma*

Fluoreto*

Cinza*

Bioquímica

Grupos Sanguíneos (ABO + Rh)

Sangue não

EDTA

Roxa

Hematologia

centrifugado

com anticoag.

Hemograma

 

Sangue não

EDTA

Roxa

Hematologia

 

centrifugado

com anticoag.

HIV 1/2

Soro

-

 

- Imunologia

Mucoproteínas

 

Soro

-

 

- Bioquímica

Proteína C Reativa

 

Soro

-

 

- Hematologia

Proteínas Totais

 

Soro

-

 

- Bioquímica

RNI

Plasma

Citrato

Azul

Hematologia

Tempo de Protombina

Plasma

Citrato

Azul

Hematologia

Tempo

de

Tromboplastina

Plasma

Citrato

Azul

Hematologia

Parcial Ativada

TGO

Soro

-

-

Bioquímica

TGP

Soro

-

-

Bioquímica

21

Triglicerídeos

Soro

-

-

Bioquímica

Uréia

Soro/Plasma*

Fluoreto*

Cinza*

Bioquímica

VDRL

Soro

-

-

Imunologia

Velocidade

de

Sangue não

EDTA

Roxa

Hematologia

Hemossedimentação

centrifugado

* as informações utilizadas ficam a critério do laboratório, podendo variar de um para outro.

5.2.2. Urina (de rotina)

O paciente deve higienizar os órgãos genitais, utilizando água e sabão. Depois, secá-los com

gaze estéril ou uma toalha seca e bem limpa. A urina deve ser colhida no frasco coletor, logo

pela manhã, pelo menos 12 mL. Porém, o primeiro jato deve ser desprezado, sendo colhido,

para o exame, o jato médio. O frasco deve ser levado em no máximo 30 minutos ao laboratório.

Caso não seja cumprido o prazo, a urina deve estar acondicionada em uma geladeira ou caixa

de isopor com gelo reutilizável, desde que se tome cuidado para que a água do gelo não entre

em contato com a amostra.

5.2.3. Fezes

5.2.3.1. Fezes sem MIF

Deve-se utilizar um frasco coletor seco e limpo. Coletar mais ou menos cinco pazinhas, sendo

que sempre deve-se retirar um pouco de cada extremidade e um pouco do meio da amostra.

Deve ser levada ao laboratório no mesmo dia, identificado com nome, estando previamente

acondicionada em uma geladeira. Não há necessidade de levar grandes quantidades de amostra.

5.2.3.2. Fezes com MIF

O MIF (merthiolate-iodo-formol) é o líquido avermelhado utilizado na conservação das

amostras pedidas para a realização dos exames parasitológicos de fezes. O paciente deve

coletar a amostra em um fraco coletor contendo o MIF, comprado na farmácia, onde recolherá

9 pazinhas de fezes (3 por dia). Deve-se retirar um pedaço de cada extremidade e do meio da

amostra, e ir acondicionando em geladeira, até o dia de entregar ao laboratório, identificado

com nome. (Não precisa haver excesso de amostra)

22

6. Hematologia

A hematologia é a parte dos ensaios laboratoriais voltados para a observação das células

sanguíneas, sua contagem, características e anormalidades. O aparelho que realizam este exame

traz gráficos, curvas de concentração e valores de concentração relacionados a cada célula do sangue. Antes de começar o hemograma, colocam-se os sangues de controle para homogeneizar, já que ficam na geladeira e precisam de algum tempo pra se estabilizar. Quando

se passa o sangue de controle (L-baixo, N-normal e/ou H-alto) e os resultados conferem com o padrão, podem-se iniciar os exames.

conferem com o padrão, podem-se iniciar os exames. Fig. 05 – Sangues de controle hematológico. O

Fig. 05 Sangues de controle hematológico.

O contador hematológico HUMAN COUNT PLUS é o equipamento utilizado para essa

finalidade. O mesmo é mostrado na figura abaixo.

para essa finalidade. O mesmo é mostrado na figura abaixo. Fig. 06 – Contador hematológico HUMAN

Fig. 06 Contador hematológico HUMAN COUNT PLUS. Fonte: http://www.medville.com.br/infiniti/files/produto-arquivo/HumacountPlus.pdf

23

O contador hematológico é semi-automatizado para diagnóstico in vitro. A sua interface permite o envio de resultados para uma impressora matricial acoplada. Ele é capaz de acessar até 60 amostras por hora com exatidão e reprodutibilidade. É capaz de gerar histogramas de hemácias e leucócitos e, ainda, determinar 18 parâmetros utilizando 25µL de sangue, apenas. Esses parâmetros são: WBC, LYM, MID, GRA, LYM%, MID%, GRA%, HGB, RCB, HCT, MCV, RDW, MCH, MCHC, PLT, MPV, PCT e PDW. Após a coleta de sangue, deve-se deixar os tubos com sangue no homogeneizador por alguns minutos. No aparelho, deve ajustar o sexo e o número de cadastro do paciente. Após isso, deve-se mergulhar a agulha de sucção no tubo, para que aspire o sangue e faça a leitura dos parâmetros indicados. Após a sucção do sangue os resultados são visualizados. O analisador de sangue utiliza três reagentes de funcionamento. São eles:

HC-CLEANER solução de limpeza utilizada no contínuo processo de limpeza do sistema fluídico do equipamento. Ele é composto por sulfato de sódio a 0,8% (Na 2 SO 4 ), fosfato de sódio a 0,5% (Na 3 PO 4 ), cloreto de sódio a 0,3% (NaCl), enzimas proteolíticas a 0,8%, corante Sky blue a 0,002% e conservantes a 0,1%.

HC-DILUENT reagente utilizado na calibração e manuseio do equipamento. É uma solução isotônica usada para diluir amostras de sangue total. É composto por sulfato de sódio a 1% (Na 2 SO 4 ), fosfato inorgânico tamponado <0,6%, cloreto de sódio a 0,3% (NaCl) e estabilizantes.

HC-LYSE reagente utilizado na calibração e manuseio do equipamento. É livre de cianeto, usado para preparar sangue lisado para as medidas de leucócitos e hemoglobina. É composto por sais de amônio quartenários a 3,5% e surfactantes

<0,05%.

Como se sabe, a hematologia é a parte das análises clínicas destinada à observação e quantificação dos elementos sanguíneos. No laboratório os exames que se realizam nessa área são: hemograma, grupo sanguíneo, coagulograma e velocidade de hemossedimentação.

24

6.1. Hemograma (HC)

O hemograma é o exame clínico que quantifica as mais variadas células sanguíneas. Quando o

equipamento apresenta flags (erros) ou mostra valores alterados para mais ou para menos, faz-

se a lâmina do paciente. O sangue deve ser homogeneizado bem antes de ser passado no aparelho.

deve ser homogeneizado bem antes de ser passado no aparelho. Fig. 07 – Homogeneizador de sangue.

Fig. 07 Homogeneizador de sangue.

O

plaquetograma.

hemograma

é

dividido

6.1.1. Eritrograma

basicamente

O homogeneizador tem um movimento contínuo, do tipo thundeler-burgger, para frente e para trás, sendo capaz de homogeneizar o sangue de maneira uniforme pelo tempo que for necessário.

em

três

partes:

eritrograma,

leucograma

e

É a parte do hemograma que visa à observação e quantificação das células vermelhas do sangue

(hemácias). De acordo com VIVAS (2010), constitui o estudo das células da série vermelha, revelando tipos essenciais de alterações patológicas. Os parâmetros observados no eritrograma são:

o número de eritrócitos (hemácias) em cada 1,0 µL de sangue;

quantidade de hemoglobina em cada 1,0 dL de sangue;

porcentagem de hematócrito;

tamanho médio dos hematócritos em fL (fenolitros);

quantidade média de hemoglobina em cada hematócrito em pc (picogramas);

concentração média de hemoglobina em 100 mL de eritrócitos em g/dL;

índice de variação do tamanho dos eritrócitos, que é quantificado, quanto à ocorrência, em (+), (++) ou (+++).

25

6.1.2. Leucograma Sendo o estudo das células da série branca, compreende a contagem global e específica dos leucócitos, além do estudo qualitativo. Os parâmetros observados no leucograma são:

o número de leucócitos em cada 1,0 µL de sangue;

quantificação de várias células brancas: linfócito, monócito, neutrófilo (segmentado), eosinófilo, metamielócitos, basófilos e bastonetes (segmentados jovens) etc.

6.1.3. Plaquetograma Determina-se o número de plaquetas em cada 1,0 µL de sangue. Há índices como plaquetócritos, por exemplo, que são apenas diagnosticados por equipamentos muito sofisticados. Depois de homogeneizado, o analista programa o sexo e o número do paciente. Feito isso, coloca o sangue para ser aspirado por uma haste metálica que sai do interior do aparelho. Começa a análise, que dura em torno de 2 minutos para cada amostra. Quando a análise da amostra termina o aparelho mostra uma interface semelhante à mostrada abaixo.

aparelho mostra uma interface semelhante à mostrada abaixo. Fig. 08 – Resultado de hemograma no contador

Fig. 08 Resultado de hemograma no contador hematológico.

26

É baseado nos dados mostrados na tela do aparelho e em alguns cálculos que os técnicos podem

lançar os resultados e tirar conclusões sobre os valores reais e suas alterações (quando houver). De acordo o que mostra a figura, há gráficos com o pico de concentração plasmática de

leucócitos (WBC) e de hemácias (RBC), ao lado esquerdo. Do lado direito há o código do paciente (3584), o sexo (fem (adulto)), a data do exame (04/10/2012) e a hora em que o hemograma foi feito (10:17). Ainda do lado direito, na parte inferior, há as quantificações, as quais estão transcritas na tabela abaixo, para melhor visualização dos valores. À essas quantificações dá-se o nome de parâmetros. Os mesmos foram transcritos para a tabela abaixo para melhor visualização.

Tabela 02: Parâmetros e índices hematimétricos (baseados na figura 08)

WBC

6,94

MCH

28,3

RBC

5,13+

MCHC

38,2+

HGB

14,5

PLT

114-

HCT

37.9

LY%

31,0

MCV

74-

MI%

6,1

RDWc

12,0

GR%

62,9

É sabido que, quando há sinais (+) e/ou (-) no hemograma há alguma anormalidade no parâmetro. Deve-e repetir o hemograma, adicionando um ‘ponto’ ao fim do número do paciente para identificar a repetição. (Ex.: 3584.). Alguns parâmetros podem ser calculados pelo analista; isso possibilita que ele tenha previamente um valor que permite dizer se os resultados mostrados no aparelho estão realmente corretos. Isso é muito útil quando não se tem uma tabela de referências no local no momento. Os valores encontrados para MCV, MCH e MCHC podem ser determinados por cálculos. Deve-se observar que sempre haverá uma margem de erro entre

o aparelho e o cálculo do técnico. Esses parâmetros são chamados de índices hematimétricos.

Cálculo do VCM VCM = (HCT : HEM) x 10

Pela fórmula, o volume corpuscular médio da hemácia é dado pela razão entre o valor de hematócrito e o das hemácias multiplicado por 10. Voltando à tabela, viu-se que o VCM da paciente deu 74-. Pelo cálculo têm-se:

27

VCM = (37,9 : 5,13) x 10 VCM = 73 fL

O valor do cálculo foi bem próximo do valor do equipamento. Como o parâmetro está diminuído, o equipamento mostra o sinal negativo.

Cálculo do HCM HCM = (HGB : HEM) x 10

Pela fórmula, o volume corpuscular médio de hemoglobina é dado pela razão entre o valor de hemoglobina e o das hemácias multiplicado por 10). O valor de HCM da paciente foi 28,2+ pg. Pelo cálculo têm-se:

HCM = (14,5 : HEM) x 10 HCM = 28 pg

O valor foi bem próximo do valor do aparelho, que gera o sinal (+) pelo parâmetro estar aumentado.

Cálculo do MCHC MCHC = (HGB : HCT) x 100

A concentração de hemoglobina corpuscular média da paciente foi 38,2+ g / dL. O valor é dado pela razão entre a quantidade de hemoglobina e a quantidade de hematócrito multiplicada por 100. Pela fórmula, têm-se:

MCHC = (14,5 : 37,9) x 100 MCHC = 38,2 g / dL

O valor encontrado foi igual ao mostrado pelo aparelho. O sinal positivo indica que o valor está aumentado.

Para que se possam comparar valores quando não se dispõe de fórmulas, deve-se ter em mãos uma tabela de referências.

28

Tabela 03: Valores de referência de hemograma para crianças

 
 

Até 1 mês

1 mês a 1 ano

2 a 4 anos

5 a 10 anos

Leucócitos

4300

19300/µL

6000

17500/µL

5500 16000/µL

4500 13500/µL

Eritrócitos

2,7 5,8 milhões/µL

3,1 5,6 milhões/ µL

3,3 5,6 milhões/µL

3,8 5,8 milhões/µL

Hemoglobina

10 18 g/dL

10

14 g/dL

10,5 14,5 g/dL

12

15 g/dL

Hematócrito

27,7 58,4%

27,8 41,4%

29,5 41,3%

34,1 43,8%

MCV

86 120 fL

74

89 fL

74

90 fL

 

6 91 fL

MCH

31 37 pg

25

32 pg

26

32 pg

26 32 pg

MCHC

30,8 36 g/dL

33,8 36 g/dL

33,8 36 g/dL

33,8 36 g/dL

PLT

250 000 500 000 mm³

200 000 500 000 mm³

200 000 500 000 mm³

140 000 400 000 mm³

Metamielócitos

0

193/µL

0

175/µL

0 160/µL

0

135/µL

Bastonetes

129 1158/µL

180

1050/µL

165 960/µL

135 810/µL

Segmentados

1032

13703/µL

1140

5075/µL

1430

5760/µL

1935

7155/µL

Neutrófilos

1161

15054/µL

1320

6300/µL

1595

6680/µL

2070

8100/µL

Eosinófilos

0

772/µL

60

700/µL

55 650/µL

45

450/µL

Basófilos

0

193/µL

0

175/µL

0

160/µL

0

135/µL

Linfócitos

645 12545/µL

3420

11725/µL

2695

9760/µL

1440

5940/µL

Monócitos

86 1544/µL

240

1400/µL

220 1280/µL

180 1080/µL

*fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p.27 portal da educação.

Tabela 04: Valores de referência de hemograma para adolescentes e adultos

 

11 a 15 anos

Homens

Mulheres

Leucócitos

4500 13500/µL

5000 - 10000/µL

5000 - 10000/µL

Eritrócitos

3,9 5,9 milhões/µL

4,5 6,7 milhões/µL

3,9 5,9 milhões/µL

Hemoglobina

12 16 g/dL

13 18 g/dL

12 16 g/dL

Hematócrito

35,6 48,6%

41,5 54,7%

35,6 48,6%

MCV

82

92 fL

82

92 fL

82

92 fL

MCH

27

31 pc

27

31 pc

27

31 pc

MCHC

32,9 36 g/dL

32,9 36 g/dL

32,9 36 g/dL

PLT

150 000 400 000 mm³

150 000 400 000 mm³

150 000 400 000 mm³

29

Metamielócitos

0

135/µL

0

- 100/µL

0

- 100/µL

Bastonetes

135 - 810/µL

150

- 600/µL

150

- 600/µL

Segmentados

1935 -7155

2750

- 6500/µL

2750

- 6500/µL

Neutrófilos

2070

8100/µL

2900

- 7200/µL

2900

- 7200/µL

Eosinófilos

45 - 540/µL

55 - 220/µL

55 - 220/µL

Basófilos

0

- 135/µL

0

- 100/µL

0

- 100/µL

Linfócitos

1440

- 1080/µL

1000

- 3200/µL

1000

- 3200/µL

Monócitos

180 - 1080/µL

200

- 800/µL

200

- 800/µL

*fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p.27 portal da educação.

6.2. Elementos do Sangue Como já foi mencionado, o sangue é basicamente formado por células vermelhas, células brancas e plaquetas. As hemácias são responsáveis pelo transporte de oxigênio para os órgãos e tecidos. Os leucócitos são responsáveis pela defesa imunológica do organismo. As plaquetas são responsáveis pela coagulação do sangue (em outras palavras, pelas cicatrizações e regenerações).

6.2.1. Eritrócitos (Hemácias / RBC) Hemácias são células anucleadas e com formato de disco bicôncavo, com cor variando entre rosada e vermelha, dependendo da concentração de hemoglobina. As células vermelhas, quando não apresentam alterações nem quanto à forma nem quanto à pigmentação recebem o nome de hemácias normocíticas e normocrômicas. Quando estão em quantidade além do normal indica ocorrência de eritrocitose (ou policitemia). Quando estão abaixo do normal caracteriza uma eritroblastemia. As hemácias variam quanto ao tamanho, o que é medido pelo valor de VCM (Volume Corpuscular Médio). Quando a hemácia está muito grande é chamada macrocítica. E, quando está muito pequena, microcítica. As hemácias variam quanto à pigmentação característica. A concentração de hemoglobina é que determina a coloração da hemácia. Essa característica depende do valor de CHCM (Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média). Quando a hemácia está com coloração muito intensa é chamada hipercrômica. Quando sua coloração está muito clara, é chamada hipocrômica. Pode até

30

mesmo serem indícios de uma anemia aguda. Deve-se lembrar de que os valores de VCM e HCM irão variar com a idade do paciente. Abaixo, encontram-se imagens ilustrativas dos eritrócitos em algumas das condições mencionadas acima.

eritrócitos em algumas das condições mencionadas acima. Fig. 09 – Hemácias normocíticas e normocrômicas.

Fig. 09 Hemácias normocíticas e normocrômicas. Fonte: http://heloisagallo.site.med.br/index.asp?PageName=Sangue

http://heloisagallo.site.med.br/index.asp?PageName=Sangue Fig. 10 – Hemácias macrocíticas e hipocrômicas.

Fig. 10 Hemácias macrocíticas e hipocrômicas. Fonte: http://www.icb.usp.br/mol/10-2-sangue2.html

Fonte: http://www.icb.usp.br/mol/10-2-sangue2.html Fig. 11 – Hemácias macrocíticas e hipercômicas.

Fig. 11 Hemácias macrocíticas e hipercômicas. Fonte: http://www.ciencianews.com.br/doencaeritro/Principais%20Alt.%20Morf%20eritr.%20-

%206/althemog.htm

31

6.2.2. Hemoglobina (HGB)

A hemoglobina é uma proteína presente no interior dos eritrócitos e eventualmente ligada a

outras proteínas plasmáticas (quando há destruição dos eritrócitos). É responsável por 97% da

composição da hemácia (desconsiderando a água) e 35% (considerando a água). É o pigmento responsável pela coloração das mesmas, e forma um complexo químico conjugado cuja substância central é a Heme. A Heme tem o ferro (II), Fe 2+ , como átomo principal, em seu centro (cuja carência acarreta à anemia). Está ligado a cadeias peptídicas chamas globinas. Essa substância é mostrada abaixo, na figura 12.

. Essa substância é mostrada abaixo, na figura 12. Fig. 12 – Grupo Heme. Fonte:

Fig. 12 Grupo Heme. Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Heme_b.png

Quando há a união de quatro grupos Heme e quatro cadeias de globina resulta na formação de uma molécula de hemoglobina. Quando o paciente possui a taxa de hemoglobina baixa há grandes de chances de ter adquirido uma anemia, que se torna tanto mais agudo quanto mais

baixo for o nível da proteína, acarretando até mesmo uma leucemia. Conforme citado, quando

há carência de hemoglobina as hemácias se tornam cada vez mais hipocômicas.

É interessante ressaltar que a bilirrubina é o principal produto do metabolismo da Heme na

hemoglobina. Cerca de 80% da bilirrubina são provenientes da destruição de eritrócitos velhos

ou defeituosos.

32 Fig. 13 – Estrutura química da bilirrubina. Fonte: http://www.infoescola.com/bioquimica/bilirrubina/ 6.2.3.

32

Fig. 13 Estrutura química da bilirrubina.

Fonte: http://www.infoescola.com/bioquimica/bilirrubina/

6.2.3. Hematócrito (HCT)

Conforme já mencionado, o hematócrito corresponde à porção sólida do sangue, ou seja,

eritrócitos, leucócitos e trombócitos. Sua quantificação é expressa em porcentagem.

6.2.4*. Leucócitos (WBC) Chamamos de leucócitos todas as células da série branca, aquela responsável pela defesa imunológica do organismo. Quando têm-se valores aumentados de leucócitos há uma leucocitose. Alguns casos do aumento dos leucócitos são: recém-nascidos, puberdade, gravidez, infecções, partos etc. Quando o nível de leucócitos está muito baixo há uma leucopenia. Algumas das causas da leucopenia são: depressão, moléstias parasitárias, alteração na distribuição dos leucócitos etc. Vários são os leucócitos:

6.2.5. Linfócitos (LYN)

São leucócitos que podem ser classificados como grandes ou pequenos. Seu citoplasma não apresenta granulações e, por isso, são chamados de agranulócitos. Seu núcleo ocupa quase toda a porção do citoplasma, e representam cerca de 20 a 30% das células brancas do sangue.

cerca de 20 a 30% das células brancas do sangue. Fig. 14 – Linfócito. Fonte: guia

Fig. 14 Linfócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 162 portal da educação.

33

6.2.6. Monócitos São os maiores leucócitos do sangue. Assim como os linfócitos, são agranulócitos. Possuem citoplasma azul-acinzentado. Seu núcleo é grande e sem segmentação.

azul-acinzentado. Seu núcleo é grande e sem segmentação. Fig. 15 – Monócito. Fonte: guia de interpretação

Fig. 15 Monócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 162 portal da educação.

6.2.7. Neutrófilos São os leucócitos mais numerosos na circulação sanguínea, sendo que correspondem a mais de 60%. Possuem núcleo segmentado e, em seu citoplasma, são observadas pequenas granulações de coloração avermelhada. Ele e os demais leucócitos (salvo linfócitos e monócitos) são granulócitos.

(salvo linfócitos e monócitos) são granulócitos. Fig. 14 – Neutrófilo. Fonte:

Fig. 14 Neutrófilo. Fonte: http://www.infoescola.com/citologia/neutrofilos/

34

6.2.8. Eosinófilos São um pouco maiores que os neutrófilos. Seu núcleo é segmentado e possui granulações no citoplasma, esféricas e de contorno nítido. As granulações são alaranjadas ou avermelhadas.

nítido. As granulações são alaranjadas ou avermelhadas. Fig. 16 – Eosinófilo. Fonte: guia de interpretação de

Fig. 16 Eosinófilo. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 portal da educação.

6.2.9. Mielócitos Possui um núcleo frequentemente excêntrico, onde a cromatina se evidencia; há uma aglomeração de nucléolos.

cromatina se evidencia; há uma aglomeração de nucléolos. Fig. 17 – Mielócito. Fonte: guia de interpretação

Fig. 17 Mielócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 160 portal da educação.

35

6.2.10. Metamielócitos O núcleo possui cromatina disposta em grossos aglomerados. As granulações são maiores e mais visíveis.

aglomerados. As granulações são maiores e mais visíveis. Fig. 18 – Metamielócito. Fonte: guia de interpretação

Fig. 18 Metamielócito. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 160 portal da educação.

6.2.11. Basófilos São os leucócitos mais raros. Apresentam núcleo segmentado e citoplasma com granulações específicas, que se tornam violetas quando coradas.

específicas, que se tornam violetas quando coradas. Fig. 19 – Basófilo. Fonte: guia de interpretação de

Fig. 19 Basófilo. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 portal da educação.

6.2.12. Bastonetes Possui núcleo alongado como uma salsicha ou recurvado. A cromatina é intensamente aglomerada. O citoplasma é roxo e possui finas granulações.

36

36 Fig. 20 – Bastonete. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 – portal

Fig. 20 Bastonete. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 portal da educação.

6.2.13. Segmentados

Parecem ter o núcleo totalmente granulado. Possuem aglomerações grossas e específicas.

granulado. Possuem aglomerações grossas e específicas. Fig. 21 – Segmentado. Fonte: guia de interpretação de

Fig. 21 Segmentado. Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 161 portal da educação.

6.2.14. Trombócitos

São as plaquetas, responsáveis pela coagulação sanguínea. Está presente no sangue que é formado na medula óssea. A sua principal função é a formação de coágulos. Uma pessoa normal tem entre 150.000 e 400.000 plaquetas por milímetro cúbico de sangue. Sua diminuição ou disfunção pode levar a sangramentos, assim como seu aumento pode aumentar o risco de trombose. Trombocitopenia (ou plaquetopenia) é a diminuição do

37

número de plaquetas no sangue. Trombocitose (ou plaquetose) é o aumento do número de plaquetas no sangue.

plaquetose) é o aumento do número de plaquetas no sangue. Fig. 22 – Plaquetas normais (

Fig. 22 Plaquetas normais (pontos pequenos). Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 172 portal da educação.

de exames, vol.lll; p. 172 – portal da educação. Fig. 23 – Plaquetas gigantes (VPM alto)

Fig. 23 Plaquetas gigantes (VPM alto) (pontos pequenos). Fonte: guia de interpretação de exames, vol.lll; p. 172 portal da educação.

6.3. Preparo de Lâminas Quando o aparelho mostra alterações ou quando a clínica do paciente não condiz com o resultado apresentado, faz-se a lâmina, para observações e verificações. A contagem passa, então, a ser manual. Inicialmente homogeneíza-se novamente o sangue do paciente. Em seguida, coloca-se uma gota do sangue sobre uma lâmina previamente limpa com gaze hidrofílica (quanto menor a quantidade de sangue melhor será a visualização). Deve-se iniciar o procedimento para espalhar o sangue sobre a lâmina: o esfregaço. O sangue é “empurrado” sobre a lâmina com o auxílio de uma lâmina mais grossa de bordas chanfradas, a extensora.

38

Deve-se manter a extensora a 45° e realizar o esfregaço rapidamente, conforme ilustrado na figura abaixo:

esfregaço rapidamente, conforme ilustrado na figura abaixo: Fig. 24/25 – Exemplificação da execução do

Fig. 24/25 Exemplificação da execução do esfregaço. Fonte: http://biomedicoscopia.blogspot.com.br/2012/06/um-bom-estiraco-sanguineo.html

Após a confecção do esfregaço escreve-se o código do paciente na parte superior da lâmina utilizando um lápis dermatográfico azul. A lâmina fica secando por alguns minutos, até o momento de ser corada. Os corantes hematológicos, na verdade, recebem o nome de quem os desenvolveu através de pesquisas. Eles são preparados utilizando o metanol como solvente. O procedimento de preparo da lâmina é divido em três partes: fixação, coloração e lavagem. Atualmente mesclou-se a metodologia dos corantes em apenas uma. Esse método é o Leishman (ou May-Grunwald-Giemsa), que é o mesmo utilizado no laboratório onde se procedeu ao estágio. Quando o esfregaço seca as lâminas são colocadas dentro de um frasco com ranhuras internas, contendo soluções denominadas corantes rápidos de hematologia. A lâmina deve ficar no mínimo 40 segundos dentro do corante, para que o mesmo se fixe às células de maneira eficiente. As lâminas são colocadas no corante intitulado rápido 1 (azul), depois são retiradas e colocadas no corante rápido 2 (alaranjado) e, por último, no corante rápido 3 (roxo). Somente após serem retiradas do corante 3 as lâminas são lavadas sob água corrente. Depois são postas para secar em um local apropriado até a hora da observação.

Fig. 26 Corantes hematológicos.

Depois são postas para secar em um local apropriado até a hora da observação. Fig. 26

39

Conforme foi dito, as lâminas coradas são postas para secar antes da observação. Elas são colocadas com inclinação de 45° num suporte apropriado de madeira, conforme ilustra a figura 27, abaixo. Se acontecer de o esfregaço sair errado, a lâmina deve ser desprezada em um recipiente com água e hipoclorito, que fica na bancada.

um recipiente com água e hipoclorito, que fica na bancada. Fig. 27 – Lâminas coradas. Os

Fig. 27 Lâminas coradas.

Os corantes de hematologia são soluções químicas alcoólicas que permitem uma coloração rápida sendo, portanto, chamados de panóticos. Sua composição é dada abaixo.

Rápido 1: é uma solução azulada de trifenilmetano. Também é chamada tritano. Sua nomenclatura oficial é 1,1’,1” – trifenilmetano.

nomenclatura oficial é 1,1’,1” – trifenilmetano. Fig. 28 – Estrutura química do corante rápido 1.

Fig. 28 Estrutura química do corante rápido 1. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Trifenilmetano

40

Rápido 2: é uma solução alaranjada de xanteno. Seu nome IUPAC é 9-H-xanteno, 10-

H-9-oxaantraceno.

. Seu nome IUPAC é 9-H-xanteno, 10- H-9-oxaantraceno. Fig. 29 – Estrutura química do corante rápido

Fig. 29 Estrutura química do corante rápido 2. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Xanteno

Rápido 3: é uma solução roxo-azulada de fenotiazina. É oficialmente conhecida como tiodifenilamina ou dibenzoparatiazina.

conhecida como tiodifenilamina ou dibenzoparatiazina . Fig. 30 – Estrutura química do corante rápido 3.

Fig. 30 Estrutura química do corante rápido 3. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Fenotiazina

Os corantes não podem ficar abertos tempo demais, apenas o necessário, pois são voláteis, mesmo que lentamente. Terminado o procedimento de corar lâmina, e passado pelo menos 01 hora de secagem, pode-se iniciar a fase de contagem das células.

6.4. Contagem Diferencial de Células Leucocitárias Várias das células citadas anteriormente (antigamente contada sobre câmara de Newbauer) atualmente são contadas ao microscópio, e usa-se um contador diferencial de células. No laboratório a contagem diferencial é feita de maneira semiautomática. A contagem global e diferencial, segundo alguns autores, é a principal informação fornecida na análise da série branca e, a mesma deve ser feita com o auxílio de um bom microscópio.

É de grande importância o conhecimento das partes do microscópio e suas funções, pois ele é largamente utilizado durante a rotina de análises em um laboratório.

41

41 Fig. 31 – Microscópio binocular. O microscópio binocular é utilizado tanto na hematologia quanto na

Fig. 31 Microscópio binocular.

O microscópio binocular é utilizado tanto na hematologia quanto na urinálise, mas deve haver um para cada área. Na hematologia ele é utilizado em conjunto com o contador diferencial de células, que lê oito parâmetros de células brancas. A visualização é feita na última objetiva (‘branca’), utilizando óleo de imersão. O óleo facilita a visualização e condensação das células previamente coradas em lâminas. Para chegar à objetiva ‘branca’ deve-se começar na menor (‘vermelha’) e ir localizando o foco em cada uma.

É muito importante saber utilizar o microscópio, pois é uma ferramenta de potencial e indispensável à contagem celular na hematologia. Deve-se conhecer seus elementos e como ajustar o foco de suas lentes para o trabalho. Abaixo, as partes do microscópio binocular óptico.

 

A

Oculares: são os canais por

 

onde observamos as lâminas. São

formados por

6

a

8 lentes

sobrepostas.

 

B

Revólver: peça giratória que

sustenta as lentes chamadas objetivas.

C

Braço: serve de suporte ao

canhão (ou tubo), que sustenta o

revólver.

 

Fig. 32 Partes do microscópio. Fonte:

 

http://dc261.4shared.com/doc/9UBT_sUS/pr

 

eview.html

 
– Partes do microscópio. Fonte:   http://dc261.4shared.com/doc/9UBT_sUS/pr   eview.html  

42

D Charriot: movimenta a lâmina de um lado para o outro, tanto em sentido longitudinal

quanto transversal.

E Parafuso Macrométrico: responsável pelos movimentos verticais da platina, rápidos e

com grande amplitude.

F

Parafuso Micrométrico: responsável pelos movimentos verticais da platina, pequenos e

de

pequena amplitude, permitindo aperfeiçoar o foco.

G

Liga/ Desliga: permite ligar e desligar a luz.

H

Base: dá apoio a todos as partes do microscópio.

I Espelho ou lâmpada: Permite a passagem de luz.

J Condensador: promove uma iluminação uniforme.

K Regulador do Charriot: fuso que permite o deslocamento da lâmina para frente e para

trás, para a direita e para a esquerda.

L Platina: é onde se apoia a lâmina quer será observada.

M Objetivas: são as lentes que se prendem ao revólver. São compostas por 4 a 6 lente sobrepostas.

O maior desafio antes da observação ao microscópio é a focalização das objetivas. Deve-se

iniciar pela objetiva menor e ir para a de maior aumento, sempre após encontrar o foco da

anterior. As objetivas, em ordem crescente de aumento, são:

‘vermelha’ – 4x/0.10 ‘amarela’ – 10x/0.25 ‘azul’ – 40x/0.65 ‘branca’ – 100x/1.25

Quando se atinge a objetiva que aumenta 100 vezes mais, usa-se o óleo de imersão, que facilita e torna mais translúcida a visualização das células. Não é necessário o uso de lamínulas.

Ajustado o foco, deve-se ligar o contador diferencial de células. À medida que as células forem sendo vistas nos campos da lãmina, o analista deve ir apertando o botão do aparelho que

43

corresponde àquela célula. Quando houver sido atingido o total de 100 células contadas o aparelho irá emitir um sinal sonoro, finalizando a contagem.

irá emitir um sinal sonoro, finalizando a contagem. Fig. 33 – Contador diferencial de células BENFER

Fig. 33 Contador diferencial de células BENFER CC900.

O contador diferencial é capaz de realizar a contagem de 8 tipos diferentes de células:

basófilos, eosinófilos, metamielócitos, bastonetes, granulócitos, linfócitos, monócitos e mielócitos. Cada vez que é visualizada uma célula de série branca ao microscópio, deve-se apertar a tecla correspondente à célula o número de vezes que ela aparecer no mesmo campo.

6.5. Grupos Sanguíneos e Fator Rh (GS + Rh) Quando o clínico solicita esse exame, tem o objetivo de identificar qual é o tipo sanguíneo do paciente. O exame de grupo sanguíneo é feito com o sangue não centrifugado, contendo EDTA. Devem-se separar duas lâminas. Primeiramente elas devem ser limpas com gaze hidrofílica. Em seguida deve-se utilizar uma micropipeta com volume 50 µL da amostra de sangue, e dispô-las nas placas conforme a ilustração abaixo.

de sangue, e dispô-las nas placas conforme a ilustração abaixo. Fig. 34 – Preparo de lâmina

Fig. 34 Preparo de lâmina para teste de Gs + Rh.

44

Na figura acima, o poço A representa o grupo sanguíneo A; o poço B representa o grupo sanguíneo B. Já o poço D é o que indicará o fator Rh, ou seja, se o grupo A, B ou AB será (+) ou (). Para realizar o exame basta adicionar uma gota do reagente específico em cada poço. (*os reagentes devem ser acondicionados na geladeira).

(*os reagentes devem ser acondicionados na geladeira). Fig. 35 – Reagentes para determinação de grupo

Fig. 35 Reagentes para determinação de grupo sanguíneo + fator Rh.

Os reagentes para a determinação são antígenos, ou seja, irão aglutinar a amostra de sangue que contiver os mesmos antígenos, revelando assim o grupo sanguíneo. Essas substâncias de determinação são chamadas anticorpos monoclonais murinos. O sistema ABO, segundo os fabricantes dos soroclones murinos, é o mais importante sistema de classificação sanguínea existente. A determinação é feita através da identificação de antígenos na membrana eritrocitária. Quando há aglutinação do poço de sangue pelo reagente usado significa que o paciente tem aquele grupo sanguíneo. Caso não haja aglutinação significa que ele não tem aqueles antígenos. Deve-se pingar 1 gota do reagente A sobre o poço A, 1 gota de B sobre o poço B e 1 gota de D sobre o poço D. Homogeneizar. Se aglutinar em A o paciente é tipo A; se aglutinar em B o paciente é tipo B; se aglutinar em A e B o paciente é tipo AB; caso não haja aglutinação em nenhum dos dois, o pacientes é tipo O. Se houver aglutinação em D o paciente tem fator Rh (+); se não houver aglutinação em D o paciente tem fator Rh (). Quando acontece de o paciente ter fator Rh negativo deve-se realizar a pesquisa do fator D u . O fator D u serve para a confirmação do fator Rh negativo (uma vez que sangues do tipo negativo (-) são raros).

45

Pesquisa de D u Primeiramente, deve-se preparar uma ‘suspensão de hemácias’ a 5%. Para isso, devem-se seguir os seguintes passos:

centrifugar o sangue;

desprezar o plasma;

lavar hemácias com solução salina (cloreto de sódio NaCl 0,9%) 3 vezes;

centrifugar por 5 minutos;

desprezar o sobrenadante;

colocar em um tubo com 1000 µL (1 mL) de salina;

pipetar 50 µL da suspensão de hemácias;

Depois de feita a suspensão:

num tubo, colocar 200 µL da suspensão e adicionar 2 gotas do reagente Anti-D;

incubar em banho-maria a 37°C por 30 minutos;

retirar do banho-maria e adicionar 2 gotas de Soro Coombs;

centrifugar por 5 minutos.

Após essa série de procedimentos deve-se observar o tubo. Se houver aglutinação têm-se D u + e

se não houver aglutinação, D u . Se o fator der negativo comprova o teste de Rh realizado anteriormente.

6.6. Velocidade de Hemossedimentação (VHS)

A hemossedimentação, segundo um dos manuais de hematologia do laboratório, consiste na

medida da velocidade com que as hemácias se sedimentam dentro da pipeta de Westergreen. De acordo com alguns guias de interpretação de exames, a VHS reflete os resultados entre as forças envolvidas no movimento de sedimentação das hemácias e os mecanismos oponentes

exercidos por substâncias plasmáticas, principalmente o fibrinogênio. A presença de processos inflamatórios favorece a hemossedimentação. A técnica consiste em pipetar o sangue do tubo

de ensaio com sangue não centrifugado e previamente homogeneizado. Após a pipetagem (com

pêra de borracha), devem-se limpar as bordas da pipeta e encaixá-la no suporte de Westergreen. A pipeta é graduada em milímetros, e a leitura é feita após 1 hora. Abaixo, um exemplo da realização da VHS (método Westergreen)

46

46 O suporte ao lado, que está com duas pipetas, ainda comporta mais oito amostras para

O suporte ao lado, que está com duas pipetas, ainda comporta mais oito amostras para a realização do exame. Segundo alguns autores a referência da VHS para homens entre 17 e 50 anos é de 1 a 7 mm. Para homens acima de 50 anos é de 2 a 10 mm. No caso das mulheres, de 13 a 50 anos é 3 a 9 mm e para mulheres acima de 50 anos é 5 a 15 mm. A VHS aumenta com o aumento da idade.

Fig. 36 Exame de VHS.

Valores elevados da VHS podem significar infecções bacterianas, hepatites agudas, processos inflamatórios agudos, artrite reumatoide, anemias graves, leucemias, disfunção da tireoide etc. Já valores muito baixos da VHS podem significar lesões hepáticas graves, insuficiência cardíaca, microcitose, hemoglobinopatia, policetemia etc.

6.7. Coagulograma (COAG) O aparelho utilizado no coagulograma é um coagulômetro óptico monocanal para a determinação dos parâmetros da hemostasia (cascata de coagulação) em plasma citratado.

dos parâmetros da hemostasia (cascata de coagulação) em plasma citratado. Fig. 37 – Coagulômetro HUMAN CLOT

Fig. 37 Coagulômetro HUMAN CLOT Jr.

47

O

método utilizado é o coagulométrico (Quick Automatizado). O coagulograma é o conjunto

de

exames que requer a maior precisão e atenção dentro do laboratório, na área de hematologia,

pois seus resultados servirão de parâmetros para avaliação médica em procedimentos pré- operatórios. Os exames de coagulograma irão fornecer dados sobre a hemostasia, ou seja, a capacidade de ‘parar’ o sangramento e iniciar o reparo tecidual, logo, estão relacionados às características fisiológicas de coagulação do sangue. O material utilizado é o plasma citratado, previamente centrifugado. Há quatro exames principais que são solicitados: TP, AP, TTPA e RNI (juntos ou individualmente). Mas há métodos que foram se tornando obsoletos, porém, ainda são utilizados em alguns laboratórios rudimentares, como a Contagem de Plaquetas (Método de Brecher-Cronkite), pois já é fornecida a quantidade no hemograma, Prova do Laço (Método de Rumpel-Leed), o Tempo de Sangria (Método de Duke) e o Tempo de Coagulação (Método de Lee-White).

6.7.1. Tempo de Protombina (TP) / Tempo de Atividade Protombina (TAP)

O tempo de protombina consiste na determinação do tempo (em segundos) de coagulação de

um plasma citratado. Ao plasma descalcificado (retirada de cálcio) é adicionado um excesso de

tromboplastina. Considerando que a protombina se converte em trombina em um tempo uniforme, a recalcificação (promovida pelo reagente de CaCl 2 ) produz a coagulação do plasma.

O valor dado corresponde ao TP. O Tempo de Protombina considerado normal está entre 10 e

14 segundos.

* Importante: a coleta do sangue para exames de COAG deve ser feita no braço levemente

garroteado. Quando se aproximar o fim da coleta deve-se retirar o garrote. O anticoagulante citrato deve ser pingado no tubo (usar tubo de vidro) no momento da coleta e, o sangue da seringa deve ter o final desprezado em local adequado. O material deve ser centrifugado até que o plasma esteja visivelmente separado da parte celular.

6.7.2. Atividade de Protombina (AP)

A atividade de protombina irá medir o percentual de ação da coagulação baseando-se na

concentração de protombina. Valores considerados bons para AP estão entre 70 e 120%.

48

6.7.3. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)

O teste de TTPA consiste na determinação do tempo (em segundos) de coagulação do plasma

citratado após a adição dos reagentes que contém um ativador plasmático (ácido elágico) e fosfolipídeos, que irão atuar como substituintes das plaquetas. Valores considerados bons estão entre 20 e 30 segundos (pessoas sadias) e 24 e 45 segundos (pessoas que utilizam medicação anticoagulante)*. *Há anticoagulantes que são medicamentos, com finalidade de impedir a trombose. Ex.:

Enoxaparina (Clexane), Varfarina (Marevan), Heparina, entre outros.

6.7.4. Relação Normalizada Internacional (RNI)

A RNI é uma derivada do TP. É solicitado, portanto, junto ao TP quando pacientes utilizam

anticoagulantes orais. A RNI é um exame que visa padronizar os resultados do TP, pois pode haver variações inerentes ao método e ao reagente utilizado neste último exame. Pacientes que fazem uso de anticoagulantes orais devem fazer o exame de TP juntamente com a RNI de forma periódica (o ideal é que seja pelo menos mensal). Os valores podem se elevar nas seguintes situações (além do uso dos anticoagulantes): deficiência da vitamina K (em casos de anorexia, má absorção intestinal, destruição da flora bacteriana intestinal por antibióticos), insuficiência hepática, elevações graves do colesterol etc. Os valores podem estar

reduzidos com o uso de drogas de inibem os anticoagulantes (antiácidos, corticoides e diuréticos) ou em pacientes com uma dieta rica em vitamina K. Os valores de RNI ideais variam de acordo com a situação: entre 1,0 e 1,3 (pacientes sadios) e entre 2,0 e 3,0 (pacientes em uso de medicação anticoagulante). Para a realização dos exames TP (TAP), AP, e RNI, colocam-se as cuvetas nas câmaras do fotômetro. Cada uma das cuvetas menores (existem 08) deve conter 25 µL de soro do paciente. Nas cuvetas maiores (existem 02) devem haver 50 µL

de reagente. Ajusta-se o aparelho para análise de TP e programam-se 180 segundos. Coloca-se

a cuveta com amostra no canal de leitura (situado entre as câmaras de reagentes) e, quando o aparelho emitir um sinal sonoro, deve-se despejar o reagente. Deve-se aguardar a leitura dos três exames, que é fornecida simultaneamente.

Tabela 05: Exames TP (TAP), AP e RNI

Amostra

25 µL

Reagente (Formador de Coágulo, CaCl 2 )

50 µL

49

Para a realização do exame TTPA o procedimento é o mesmo, diferindo apenas nos reagentes e suas dosagens.

Tabela 06: Exame TTPA

Amostra

25

µL

Reagente n° 1 (Ativador)

25

µL

Reagente n° 2 (Formador de Coágulo, CaCl 2 )

25

µL

Abaixo, uma síntese dos valores de referência para o coagulograma completo:

TP: 10 14 s

AP: 70 120%

RNI: 1,0 3,0 s (pessoas sadias) / 2,0 3,0 s (uso de anticoagulantes orais)

TTPA: 20 30 s (pessoas sadias) / 24 45 s (uso de anticoagulantes orais)

7. Bioquímica A bioquímica é parte mais extensa e trabalhosa (e mais interessante) das análises clínicas, pois compreende a maior parte dos exames que são realizados em qualquer laboratório. As práticas de bioquímica requerem muita atenção, pois há detalhes que podem por os resultados a desejar caso as etapas não sejam rigorosamente obedecidas. Esta área estuda mais intimamente a química do metabolismo humano através de métodos específicos (os quais estão descritos nas bulas dos reagentes). O foco da bioquímica, então, são as biomoléculas: carboidratos (açúcares), lipídios (óleos e gorduras), ácidos nucleicos (DNA e RNA) e aminoácidos (proteínas).

No laboratório onde se realizou o estágio os exames realizados são: glicose (jejum e pós- prandial), colesterol total e suas frações (HDL e Triglicérides sendo que VLDL e LDL são determinados por cálculos), ureia, ácido úrico, fosfatase alcalina, proteínas totais, albumina, TGO, TGP, creatinina e mucoproteínas. Na análise bioquímica uma coisa é igual para todos os procedimentos: o paciente, em jejum, irá colher o sangue conforme os procedimentos citados anteriormente. Os tubos da bancada são identificados com o número do paciente, mas o tubo que contiver o soro ou plasma deve ser identificado com iniciais do nome e o número. O sangue é pré-aquecido em banho-maria (36-37°C) antes de ser centrifugado.

50

50 Fig. 38 – Sangue sendo colocado em banho. A parte líquida é sempre pipetada e

Fig. 38 Sangue sendo colocado em banho.

A parte líquida é sempre pipetada e separada da parte celular que sedimentou durante a centrifugação, e é colocada em tubos de plástico, identificados, numa estante diferente. Costuma-se dizer que o sangue foi “sorado”.

diferente. Costuma- se dizer que o sangue foi “sorado”. Fig. 39 – Material “sorado” (soro/plasma) Todos

Fig. 39 Material “sorado” (soro/plasma)

Todos os exames bioquímicos são dosados no analisador bioquímico BIOPLUS 2000. Ele é um fotômetro com leitura monocromática e bicromática com banda de 6 a 10 nm (nanômetros) e

51

luz espúria de 0,01% T (transmitância), equipado com leitura de cuveta quadrada e capaz de trabalhar com apenas 32 µL de amostra.

quadrada e capaz de trabalhar com apenas 32 µL de amostra. Fig. 40 – Analisador bioquímico

Fig. 40 Analisador bioquímico BIOPLUS 2000.

Quase todas as dosagens possuem uma amostra chamada ‘branco’, a qual deve ser sempre lida antes da amostra. O branco (B) corresponde a um tubo de ensaio apenas com o reagente. O padrão é usado para o controle de linearidade dos resultados, e tem valores específicos para cada dosagem. O tubo do padrão (P) deve conter apenas padrão + reagente. Já os tubos onde foram utilizados soro ou plasma deverá conter reagente de trabalho + amostra do material. Antes de utilizar o aparelho ele deve aquecer, e inicialmente ser lavado 10 vezes com água deionizada pelo seu sistema de aspiração. Feito isso, ele deve ser reprogramado a cada mudança do tipo de dosagem. É importante dizer que as dosagens bioquímicas, em sua maioria, dependem de aquecimento em banho-maria para serem realizadas.

52

52 Fig. 41 – Banho-maria sendo aquecido. Aquecido o analisador bioquímico e preparadas as amostras, deve-se

Fig. 41 Banho-maria sendo aquecido.

Aquecido o analisador bioquímico e preparadas as amostras, deve-se iniciar a formação das matrizes bioquímicas, que serão dosadas quantitativamente.

7.1. Glicose (GLIC) A Glicose (C 6 H 12 O 6 ) é um importante carboidrato no metabolismo dos seres vivos. Os kits de glicose contém um frasco com o reagente de trabalho e outro com o padrão de calibração, e devem ser acondicionados em geladeiras entre 2°C e 8°C. O reagente n° 1 é aquele que contém as enzimas: é formado por um tampão (pH=7,0) a 36 mmol L -1 , fenol a 10 mmol L -1 , 4- aminoantipirina a 0,03 mmol L -1 , azida sódica a 7,7 mmol L -1 , glicose oxidase > 100,0 mg dL -1 e peroxidase > 700 U L -1 . O reagente n° 2 é o padrão, e é formado por glicose a 100,0 mg dL -1 (5,56 mmol L -1 ) e conservantes.

7.1.1. Glicose em Jejum (GLIC-J) Quando houver pós-prandial deve-se colocar “J” no tubo de glicose em jejum e “PP” ou “POS” no outro tubo. O sangue será colocado em tubos de plástico (com tampa cinza) contendo o anticoagulante fluoreto. A amostra, depois de homogeneizada será centrifugada até que a

53

máxima quantidade de plasma seja separada. Realiza-se a glicemia sempre em duplicata, para

uma maior confiabilidade dos resultados.

Tabela 07: Exame Glicose

 

Método: Enzimático-Colorimétrico GOD-PAP

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 1 (enzimas)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

Reagente n° 2 (padrão)

-

10 µL

-

Amostra

-

-

10 µL

Os tubos devem ser homogeneizados e incubados em banho-maria a 37ºC durante 10 min.

Aparecerá uma coloração estável por 30 minutos.

10 min. Aparecerá uma coloração estável por 30 minutos. Fig. 42 – Exames de glicose sendo

Fig. 42 Exames de glicose sendo realizado.

Nesse teste a glicose é oxidada enzimaticamente pela glicose-oxidase (GOD) de acordo com a

reação:

glicose + O 2 + H 2 O ácido glucônico + H 2 O 2

Na segunda etapa da reação, o peróxido de hidrogênio, em presença da enzima peroxidase

(PAP), reage com a 4-aminoantipirina e fenol, formando um cromógeno vermelho cereja, cuja

intensidade da cor é proporcional à concentração de glicose. Essa coloração é a mesma

54

mostrada na figura acima. Após retirar a glicose do banho, deve-se programar o aparelho para sua dosagem. A cada intervalo entre as leituras das amostras deve-se ‘lavar’ o equipamento, para evitar contaminação da próxima amostra e/ou entupimento da via de sucção. Após a dosagem, o fotômetro imprime os resultados mostrados em seu visor. O limite de referência para a glicose dosada no sangue é 70 110 mg dL -1 . A sua dosagem é um dos exames mais solicitados pelos médicos, e serve para diagnosticar distúrbios nesse açúcar, que leva à hipoglicemia (glicose diminuída) ou hiperglicemia (glicose elevada). Um dos problemas mais frequentes envolvendo os carboidratos é o diabetes mellitus, que pode ser descrito como um grupo de doenças metabólicas capazes de comprometer o sistema vascular e neural, levando órgãos importantes a graves lesões.

7.1.2. Glicose Pós-Prandial (GLIC-PP) A glicose pós-prandial é aquela colhida após a glicose jejum, porém, após a primeira coleta, o paciente deve fazer um lanche reforçado, e ficar em repouso (sentado ou deitado) por 02 horas. Após esse tempo ele retorna para colher o sangue novamente. O sangue é centrifugado e o procedimento é repetido da mesma maneira que no exame de glicemia em jejum.

7.2. Colesterol Total (COL) O colesterol é um dos lipídios encontrados nos tecidos animais, e desempenha funções fisiológicas importantes, como a síntese de ácidos biliares, vitamina D e hormônios. Os kits de colesterol devem ser armazenados em geladeiras, entre 2°C e 8°C. Eles contém o reagente n° 1, que é composto por um tampão (pH=7) a 75 mmol L -1 , fenol a 4,5 mmol L -1 , 4- aminoantipirina a 0,3 mmol L -1 , colesterol oxidase > 200 U L -1 , lipoproteína lípase > 700 U L -1 , peroxidase > 300 U L -1 , azida sódica 14,6 mmol L -1 , estabilizantes e surfactantes. O reagente n° 2 é o padrão, que é formado por colesterol a 200,0 mg dL -1 , estabilizantes e solubilizantes. O paciente tem o sangue coletado (sem anticoagulante), o qual é incubado em banho-maria a 37°C por alguns minutos. Em seguida é levado à centrífuga até que a maior porção do soro se separe do sangue.

55

Tabela 08: Exame Colesterol Total

 

Método: Enzimático-Colorimétrico COD-PAP

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 1 (enzimas)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

Reagente n° 2 (padrão)

-

10 µL

-

Amostra

-

-

10 µL

Os tubos devem ser homogeneizados e incubados em banho-maria a 37°C durante 10 min.

Aparecerá uma coloração estável por 60 minutos, conforme mostrado na figura abaixo.

estável por 60 minutos, conforme mostrado na figura abaixo. Fig. 43 – Exame colesterol total sendo

Fig. 43 Exame colesterol total sendo realizado.

Na primeira fase reacional os ésteres de colesterol são catalisados pela enzima lípase, conforme

a reação:

ésteres de colesterol colesterol + ácidos graxos

Na segunda etapa o catalisador é a enzima colesterol oxidase:

colesterol + O 2 colesterol-3-ona + H 2 O 2

Na última etapa, a enzima peroxidase é a catalisadora, conforme mostrado abaixo:

2 H 2 O 2 + fenol + 4-aminoantipirina cromógeno vermelho cereja + 4 H 2 O

56

A intensidade da coloração é proporcional à concentração de colesterol na amostra. Quando o colesterol total encontra-se < 200 mg dL -1 está ótimo; quando está entre 200 e 239 está no limite tolerável; se for > 240 mg dL -1 está alto. A concentração de colesterol plasmático é influenciada por caracteres hereditários, função endócrina, nutrição e integridade dos órgãos vitais como fígado e rins. O colesterol muito elevado pode levar à obstrução das vias coronárias e outros vasos sanguíneos (aterosclerose), dificultando a circulação do sangue. O colesterol encontra-se aumentado em pacientes com diabetes, cirrose biliar, hipotiroidismo e hiperlipoproteinemias. Encontra-se diminuído em pacientes com hepatites virais, pneumonia, hipertiroidismo, anemia e desnutrição.

*Obs.: O cromógeno avermelhado formado nas reações é devido à presença de uma

2,6-

dicloroquinona-4-cloroimida.

substância

chamada

quinoneimina,

cuja

nomenclatura

sistemática

IUPAC-2001

é

quinoneimina , cuja nomenclatura sistemática IUPAC-2001 é Fig. 44 – Estrutura química da quinoneimina. Fonte:

Fig. 44 Estrutura química da quinoneimina. Fonte: http://chemeo.com/cid/33-757-5

7.2.1. Frações do Colesterol 7.2.1.1. HDL O HDL (High Density Lipoprotein), lipoproteínas de alta densidade, é o chamado bom colesterol. As HDL são pequenas partículas constituídas de cerca de 50% de proteínas, 30% de triglicerídeos e 20% de colesterol. Sua função é a de levar colesterol até o fígado, contribuindo para a diminuição do mesmo na corrente sanguínea ou nas células. Para o ensaio bioquímico das HDL realizam-se duas etapas: a primeira é a precipitação e a segunda é dosagem da lipoproteína. O reagente n° 1 é o padrão, soro liofilizado de HDL. O reagente n° 2 é o precipitante enzimático, composto de tampão a 100 mmol L -1 (pH = 7,0), DSBT a 24 mmol L - 1 , colesterol oxidase < 300 U L -1 , peroxidase < 1000 U L -1 e detergente.

57

Para um tubo de plástico, previamente numerado com o código do paciente, pipetar volumes conforme a tabela abaixo:

Tabela 09: Exame Colesterol HDL precipitação

 

Método: Enzimático

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 2 (enzima)

-

- 250

µL

Amostra

-

- 250

µL

A seguir, agitar manualmente ou em vórtex por 3 minutos até que se forme uma densa espuma

por cima da fase líquida. Levar para centrifugar por 15 minutos. Após isso, pipetar o sobrenadante, tomando cuidado para não dispersar o corpo de fundo. Deve-se utilizar tubos de vidro para a segunda etapa.

Tabela 10: Exame Colesterol HDL dosagem

 

Método: Enzimático

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Sobrenadante

-

-

50 µL

Reagente n° 1 (padrão)

-

50 µL

-

Reagente* (enzima COL)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

* usar o mesmo reagente de determinação do Colesterol Total.

A primeira etapa da reação ocorre em presença da enzima colesterol estrease:

colesterol esterificado + H 2 O Colesterol + ácido graxo

A segunda etapa ocorre em presença da enzima colesterol oxidase:

colesterol esterificado + H 2 O + ½ O 2 colestenona + H 2 O 2

A última etapa ocorre em presença da enzima peroxidase:

2 H 2 O 2 + 4-aminoantipirina + DSBmT * quinoneimina + 4 H 2 O

* DSBmT = N,N’-bis (4-sulfobutil)-m-toluidina

58

Deve-se homogeneizar e levar em banho-maria por 5 minutos, a 37°C. A coloração será estável por 30 minutos.

a 37°C. A coloração será estável por 30 minutos. Na interpretação das HDL para: Mulheres 

Na interpretação das HDL para:

Mulheres

> 65 mg/dL é desejável;

45 65 mg/dL representa médio risco;

< 45 mg/dL representa alto risco;

Homens

> 55 mg/dL é desejável;

35 55 mg/dL representa médio risco;

< 35 mg/dL representa alto risco;

Fig. 45 Exame HDL.

7.2.1.2. LDL É uma fração do colesterol que pode ser determinada via cálculos. As LDL (Low Density Lipoprotein), lipoproteínas de baixa densidade. Representa aproximadamente 50% em massa das lipoproteínas que circulam pelo corpo. O colesterol representa cerca de metade da massa de LDL, sendo a lipoproteína que mais carrega moléculas de colesterol. Também é chamado de mal colesterol. Uma vez que LDL transporta colesterol para as artérias, níveis maiores estão

59

associados com aterosclerose, infarto do miocárdio, ataque cardíaco e doença vascular. O cálculo do LDL é feito através da Fórmula de Friedwald:

do LDL é feito através da Fórmula de Friedwald : e da quinta parte do valor

e

da quinta parte do valor dos triglicérides. Segundo a “American Heart Association”, os valores de

Pela fórmula, as LDL podem ser calculadas pela união dos valores de colesterol total, H DL

referência para LDL são:

< 100 mg/dL está ótimo, sendo que o risco de doença cardíaca é menor.

100

129 está toleravelmente próximo do nível ótimo.

130

189 está limítrofe alto, ou seja, já não é mais tão aceitável.

160

189 está alto.

> 190 está muito alto, sendo que o risco de doença cardíaca é alto.

A atualização de 2004 das recomendações da "American Heart Association", para pessoas com doenças de ateroscleroses é para um nível de LDL menor que 70 md/dL.

7.2.1.3. VLDL As VLDL são as lipoproteínas de muito baixa densidade (Very Low Density Lipoprotein). VLDL também é uma fração do colesterol total, sendo também uma transportadora de lipoproteínas. Os níveis de VLDL têm sido relacionados com taxa aceleradas de aterosclerose e elevação na quantidade de doenças e estados metabólicos. Não é interessante que as taxas de LDL e VLDL sejam elevadas. Segundo o laboratório HERMES PARDINI, a taxa de VLDL não deve exceder a 40 mg/dL. É avaliado a partir da concentração de triglicérides. Ainda pela relação de Friedwald, o cálculo é feito TRIG / 5, ou seja, é a quinta parte do valor das triglicérides.

7.2.1.4. Triglicérides (TRIG) As triglicérides são também uma fração do colesterol total. São provenientes da alimentação e do fígado. Esses lipídios são ésteres de ácidos graxos de glicerol, e representam a maior porção da gordura de nossos corpos. As dosagens desses lipídeos servem para diagnosticar hiperlipidemias, ou seja, presença de níveis elevados ou anormais de lipídeos no sangue. O kit de triglicérides é composto por um reagente e um padrão, que devem ser conservados entre 2 e

60

8°C. O reagente é enzimático, e contém tampão (pH 7,0) a 100 mmol L -1 , 4-clorofenol a 5 mmol L -1 , lípase lipoproteica 2500 U L -1 , glicerol quinase > 1500 U L -1 , peroxidase > 1000 U L -1 , 4-aminoantipirina a 0,9 mmol L -1 , ATP a 1,5 mmol L -1 , glicerol-3-fosfato oxidase > 4000

U L -1 , conservante, ativante e estabilizante. O padrão contém triglicérides a 100 mg dL -1 (1,13

mmol L -1 ) e conservante.

A técnica para dosagem das triglicérides é dada na tabela abaixo:

Tabela 11: Exame Triglicérides

 

Método: Enzimático-Colorimétrico

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 1 (enzimas)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

Reagente n° 2 (padrão)

-

10 µL

-

Amostra

-

-

10 µL

Após a mistura do reagente de trabalho e o soro, deve-se homogeneizar bem e incubar em banho-maria, 37°C, por 10 minutos. A coloração será estável por cerca de 60 minutos.

por 10 minutos. A coloração será estável por cerca de 60 minutos. Fig. 46 – Exame

Fig. 46 Exame triglicérides sendo realizado.

61

A

primeira reação do processo ocorre em presença da enzima lípase:

Triglicérides + H 2 O Glicerol + Ácidos Graxos

A

segunda etapa é dada em presença do catalisador glicerol quinase e íons Mg 2+ do soro.

Glicerol + ATP Glicerol-3-fosfato + ADP

O

conforme a reação abaixo:

produto da segunda etapa irá interagir com O 2 , em presença de oxidase dihidroxiacetanona,

Glicerol-3-fosfato + O 2

+ H 2 O 2

O fosfato formado na terceira etapa reage da seguinte maneira:

2 H 2 O 2 + 4-aminoantipirina + p-clorofenol quinoneimina (cromógeno cereja) + 4 H 2 O

A coloração cereja aparece em presença da enzima peroxidase, cuja intensidade da cor é

proporcional à concentração de triglicérides. Quanto à interpretação dos valores de referência,

tem-se que:

< 150 mg/dL é desejável 150 199 mg/dL é limítrofe 200 499 é elevado > 500 mg/dL é muito elevado

7.3. Ureia (UR)

A ureia é um produto do metabolismo de aminoácidos e proteínas. Gerada no fígado, é a

principal fonte de excreção de nitrogênio do organismo, em sua maior parte na urina.

de nitrogênio do organismo, em sua maior parte na urina. Fig. 47 – Estrutura química da

Fig. 47 Estrutura química da ureia. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Ureia

62

No organismo, o metabolismo das proteínas libera amônia, que é convertida em ureia pelo fígado. Segundo USBERCO et. al (2001), a ureia antes só era obtida a partir da urina, sendo um composto orgânico, mas hoje sabe-se que pode ser encontrada também no sangue. Um aumento da taxa de ureia pode ser observado em dietas ricas em proteínas, insuficiência cardíaca, deficiência renal aguda e hemorragias internas. A diminuição da produção da ureia está relacionada com doenças hepáticas graves, redução do metabolismo de proteínas e dietas com poucas proteínas. Conforme diz SILVA et. al. (2008), a ureia é excretada na urina, embora 40 a 70% seja reabsorvida por difusão nos túbulos renais. O nível de ureia no soro é afetado pela função renal, conteúdo proteico da dieta e teor de catabolismo proteico, estado de hidratação do paciente e presença de sangramento intestinal.

Os reagentes de ureia são um pouco mais complexos, pois há momentos em que se deve prepará-los. O reagente n° 1 é um tampão tris (pH = 7,6) a 100 mmol L -1 , ADP a 0,7 mmol L -1 , α-cetoglutarato 9 mmol L -1 , azida sódica 15,38 mmol L -1 , uréase > 6500 U L -1 e glutamato desidrogenase > 1100 U L -1 . Tris é a abreviação de tris-hidroximetilaminometano, cujo nome

IUPAC é

2-amino-2-hidroximetilpropan-1,3-diol.

cujo nome IUPAC é 2-amino-2-hidroximetilpropan-1,3-diol. Fig. 48 – Fórmula estrutural Tris. Fonte:

Fig. 48 Fórmula estrutural Tris. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Tris

O reagente n° 2 é uma coenzima, também chamada de tampão estoque, de NADH a 0,32 mmol L -1 . O reagente n° 3 é o padrão, a ureia a 70 mg/dL. Há um dado reagente n° 4, que é o oxidante de trabalho. O tampão, que é o reagente n°1, é feito misturando-se 100 mL do reagente n° 2 com 400 mL de H 2 O deionizada. Deve-se homogeneizar e estocar em frasco âmbar; ele será estável por 12 meses se mantido entre 2 e 8°C. O reagente de trabalho, que é o que contém a ureia na concentração adequada para dosagem, é feito misturando-se 1,0 mL do reagente n° 2 com 20 mL do tampão. Deve-se homogeneizar e acondicionar em frasco âmbar;

63

ele será estável por 20 dias (entre 2 e 8°C). O oxidante de trabalho deve ser preparado

adicionando-se o reagente n° 4 em 450 mL de água deionizada. Deve-se homogeneizar e

acondicionar em frasco de plástico escuro; o mesmo será estável por 12 meses (2 a 8°C).

Tabela 12: Exame Ureia parte 1

 

Método: Colorimétrico

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente de Trabalho (Reagentes n° 1 + Reagente n° 2)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

Reagente n° 3 (padrão)

-

10 µL

-

Amostra

-

-

10 µL

Após as misturas das matrizes conforme a tabela 10 deve-se homogeneizar-se o material dos

tubos levemente e incubar em banho-maria, a 37°C, por 5 minutos. Quando o cronômetro

apontar o vencimento dos 5 minutos, deve-se proceder à segunda parte do procedimento:

Tabela 13: Exame Ureia parte 2

Método: Colorimétrico

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 4 (oxidante)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

De acordo com a tabela acima, deve-se acrescentar 1,0 mL do oxidante de trabalho em cada um

dos tubos que estão no banho. Após isso, homogeneizar levemente, e deixar no banho por mais

5 minutos. Aparecerá uma coloração estável por 60 minutos.

no banho por mais 5 minutos. Aparecerá uma coloração estável por 60 minutos. Fig. 49 –

Fig. 49 Oxidante de trabalho.

64

64 Fig. 50 – Exame ureia sendo realizado. A primeira etapa da reação ocorre em presença

Fig. 50 Exame ureia sendo realizado.

A primeira etapa da reação ocorre em presença da enzima urease, que catalisa a hidrólise da

ureia.

(NH 2 ) 2 CO + H 2 O 2 NH 3 + CO 2

Na segunda fase da reação a GLDH (glutamato desidrogenase), na presença de NH 3 e α- cetoglutarato, oxida o NADH para NAD + .

2 NH 3 + 2 NADH + 2 α-cetoglutarato 2 L-glutamato + 2 NAD + + 2 H 2 O

A oxidação de NADH a NAD + , medida pela diminuição de absorbância, é proporcional à

concentração de ureia na amostra. O valor de referência deste produto no soro varia de 15 a 40

mg/dL.

7.4. Ácido Úrico (AUR)

O ácido úrico é o maior produto do metabolismo das purinas (bases nitrogenadas). Segundo

FRAZÃO (2007), o ácido úrico é uma substância formada naturalmente pelo organismo, mas,

quando se encontra elevado pode gerar sintomas como inflamação e dor nas articulações, especialmente dos membros inferiores.

65

De

acordo com os estudos do Dr. DRÁUZIO VARELLA, o depósito de cristais de urato (sais

de

ácido úrico) nas articulações, em geral, provoca surtos dolorosos de artrite aguda nos

membros inferiores, mas pode comprometer qualquer articulação. O kit de ácido úrico contém

o reagente n° 1, um tampão fosfato (pH = 7,5) a 100 mmol L -1 e ácido

dihidroxibenzenosulfônico (DHBS) a 4 mmol L -1 , o reagente n° 2, enzimático, contém um

tampão (pH = 7,5) a 100 mmol L -1 , 4-aminoantipirina a 2 mmol L -1 , azida sódica a 7,69 mmol

L -1 , peroxidase > 18000 U L -1 e uricase > 3000 U L -1 , e o reagente n° 3, padrão, contém ácido

úrico a 6,0 mg/dL.

Tabela 14: Exame Ácido Úrico

 

Método: Enzimático-Colorimétrico UOD-PAP

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente de Trabalho (Reagente n° 1 + Reagente n° 2)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

Reagente n° 3 (padrão)

-

25 µL

-

Amostra

-

-

25 µL

Deve-se misturar 20 partes do reagente n° 1 com 1 parte do reagente n° 2 (ex.: 20 mL + 1 mL).

Ele será estável por 20 dias entre 2 e 8°C (fora do alcance de luz). Após colocar as misturas nos

tubos de ensaio, levar em banho-maria (37°C) por 5 minutos. A coloração será estável por 30

minutos. As reações ocorridas são:

O ácido úrico sendo hidrolisado em presença da enzima uricase (UOD):

Ácido Úrico + 2 H 2 O Alantoína + CO 2 + H 2 O 2

A alantoína, formada na primeira como produto principal da primeira reação, é resultante da

degradação hidrolítica do ácido úrico.

é resultante da degradação hidrolítica do ácido úrico. Fig. 51 – Estrutura química da alantoína. Fonte:

Fig. 51 Estrutura química da alantoína.

Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Alanto%C3%ADna

66

Seu nome IUPAC é 2,5-dioxo-4-imidazolidinilureia (como o nome da ureia segundo a IUPAC é diaminometanal, o nome correto para a alantoína é 2,5-dioxo-4- imidazolidinildiaminometanal). A alantoína é um metabólito gerado pela degradação do ácido úrico por uma enzima chamada rasburicase. Não é tóxica, e é ligeiramente solúvel em água. É uma das outras formas de os seres vivos excretarem nitrogênio.

das outras formas de os seres vivos excretarem nitrogênio. Fig. 52 – Exame ácido úrico sendo

Fig. 52 Exame ácido úrico sendo realizado.

A segunda fase da reação é dada em presença da peroxidase (PAP).

2 H 2 O 2 + DCHBS* + 4-aminoantipirina cromógeno cereja + 4 H 2 O

* DCHBS = ácido 3,5-dicloro-2-hidróxibenzenossulfônico

A intensidade da coloração é diretamente proporcional à concentração de ácido úrico na amostra. Em crianças do sexo feminino valores aceitáveis estão entre 0,5 e 5,0 mg/dL e entre 1,5 e 6,0 mg/dL em crianças do sexo masculino. Em adultos do sexo feminino valores aceitáveis estão entre 1,5 e 6,0 mg/dL e entre 2,5 e 7,0 mg/dL em adultos do sexo masculino.

67

7.5. Fosfatase Alcalina (FAL/ALP)

Fosfatase alcalina é uma enzima presente em quase todos os tecidos do organismo,

especialmente nas membranas nas células dos túbulos renais, ossos, placenta, intestino e fígado.

Sua função está relacionada com o transporte de lipídios no intestino e os processos de

calcificação óssea. Há coisas interessantes de se notar, como: a fosfatase alcalina óssea e a

hepática partilham proteínas estruturais codificadas por um mesmo gene e, a fosfatase

intestinal, só se expressa em indivíduos com grupos sanguíneos O e B. Um kit de fosfatase

alcalina é formado por um tampão dietanolamina (pH = 9,9) a 0,3 mol L -1 e citrato de sódio a

10 mmol L -1 , surfactante e ativador (reagente n° 1), por um substrato, p-NFF (p-

nitrofenilfosfato) a 10 mmol L -1 e azida sódica a 15 mmol L -1 (reagente n° 2), por um reagente

de cor, composto de carbonato de sódio (CaCO 3 ) a 150 mmol L -1 e hidróxido de sódio (NaOH)

a 100 mmol L -1 (reagente n° 3), e por um padrão formado de timolfitaleína a 0,4 mmol L -1 e

solubilizante (reagente n° 4).

*Importante: os reagentes devem ser conservados em temperatura ambiente. Porém, o padrão

e o tampão devem ser colocados em geladeia (2 a 8 °C) após abertos. Todos são muito voláteis

e, portanto, devem estar bem fechados.

O preparo das matrizes para análise no BIOPLUS 2000 é feita conforme a tabela abaixo:

Tabela 15: Exame Fosfatase Alcalina parte 1

 

Método: Timolfitaleína (Roy modificado)

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 1 (tampão)

250 µL

25

µL

250 µL

Reagente n° 2 (substrato)

25 µL

25

µL

25 µL

Reagente n° 4 (padrão)

-

25

µL

-

Incubar em banho-maria, a 37°C, por 2 minutos. Após esse tempo, adicionar 1,0 mL do

reagente n° 3 em todos os tubos, conforme tabela abaixo.

Tabela 16: Exame Fosfatase Alcalina parte 2

 

Método: Timolfitaleína (Roy modificado)

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 3 (reagente de cor)

1,0 mL

1,0 mL

1,0 mL

68

A fosfatase alcalina hidrolisa o p-nitrofenilfosfato, que é incolor, produzindo fosfato e p-

nitrofenol, em pH = 9,0. A velocidade de aparição do ânion p-nitrofenolato (amarelo), a 405 nm, é proporcional à atividade enzimática da amostra. A dietanolamina (DEA), além de regular

o pH da reação, intervém na mesma, atuando como receptor de fosfato liberado pela enzima.

p-NFF + DEA p-nitrofenol + DEA-fosfato

pela enzima. p-NFF + DEA  p-nitrofenol + DEA-fosfato Fig. 53 – Exame fosfatase alcalina sendo

Fig. 53 Exame fosfatase alcalina sendo realizado.

A determinação laboratorial da fosfatase alcalina se aplica muito bem para o diagnóstico de

doenças do fígado e dos ossos. Valores elevados podem ser vistos em casos de cirrose, obstrução biliar, tumor primário do fígado ou ossos e doença de Paget (distúrbios no metabolismo ósseo). Valores muito baixos podem ser causados por hipertireoidismo, desnutrição e hipofosfatemia. Consideram-se valores de referência de 75 a 390 U/L para crianças e adolescentes e 27 a 100 U/L para adultos.

69

7.6. Proteínas Totais (PROT)

As proteínas do sangue são basicamente compostas por frações, a albumina e as globulinas, além de uma pequena porção de fibrinogênio e outras proteínas menores. A dosagem das proteínas totais é utilizada na avaliação do estado nutricional. Aumentos são encontrados em desidratação, doenças hepáticas, neoplasias, hanseníase e outras enfermidades. Valores baixos são vistos em gravidez, cirrose, neoplasias, queimaduras etc. O kit de proteínas totais é composto de um reagente n° 1, biureto : hidróxido de sódio 0,2 mol L -1 , tartarato de potássio e sódio a 32 mmol L -1 , iodeto de potássio 6 mmol L -1 e sulfato de cobre 12 mmol L -1 , e de um reagente n° 2, o padrão, de albumina a 4,0 g dL -1 e azida sódica 15,38 mmol L -1 .

Tabela 17: Exame Proteínas Totais

 

Método: Biureto-Colorimétrico

Tubo Branco

Tubo Padrão

Tubo Teste

Reagente n° 1 (biureto)

2,5 mL

2,5 mL

2,5 mL

Reagente n° 2 (padrão)

-

50 µL

-