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INSITITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Camacho Bravo Dulce Argelia Seccin 5, 5QM2

SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CORMATOGRAFA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA INTRODUCCIN
Cuando se desean separar los componentes de una mezcla compleja generalmente no se logra con una cromatografa unidimensional, ya que con sta no se separaran totalmente los componentes y sera necesario realizar varios cromatogramas; esto se soluciona realizando una cromatografa bidimensional en placa. En esta tcnica, se realiza el cromatograma como en el unidimensional, es decir, se coloca la mezcla a separar sobre la placa, luego de secar, ese borde del papel se sumerge en una mezcla de solventes que contiene componentes acuosos y orgnicos. Adems el papel debe estar en contacto con los vapores del solvente en equilibrio. El solvente moja al papel por capilaridad debido a su naturaleza fibrosa. El componente acuoso del solvente se une a la celulosa del papel y forma con ste una fase estacionaria de tipo gel. El componente orgnico del solvente contina migrando, lo que constituye la fase mvil. Las velocidades de migracin de las distintas sustancias que se quieren separar estn gobernadas por sus solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase mvil no polar. En un solo paso del proceso de separacin cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de particin, una constante de equilibrio definida como:

Por lo tanto, las molculas se separan de acuerdo con sus polaridades, de manera que las no polares se mueven ms rpido que las polares. Luego de que el solvente migr a una distancia adecuada, se retira el cromatograma del solvente y se seca. En caso de ser incoloros, los materiales separados pueden detectarse por caractersticas como su radiactividad, fluorescencia etc. o puede rociarse el cromatograma con una solucin que forme un producto coloreado al reaccionar con la sustancia investigada. Pero a diferencia de la unidimensional en la cromatografa bidimensional la muestra se aplica en una esquina de la placa y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel. Luego de que el cromatograma est completo y el papel se sec, la placa se rota 90 y se realiza una cromatografa paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografa debera incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla en sus componentes.

OBJETIVOS

Separar los aminocidos presentes en jugo de jitomate por cromatografa bidimensional en capa fina. Identificar los aminocidos separados por comparacin de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de aminocidos. Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con la de la unidimensional.

DIAGRAMA DE FLUJO (anexado en la siguiente pgina) RESULTADOS 1.- Representacin esquemtica de los cromatogramas.

Figura 1. Cromatograma unidimensional 1fase

Figura 2. Cromatograma unidimensional 2fase

Figura 3. Cromatograma bidimensional tipo

Figura 4. Cromatograma bidimensional problema

2.- Calculo de los valores de Rf Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las dos fases mviles. Aminocido Frente del soluto 1.5 1.9 4.4 4.5 5.3 5.5 5.6 5.9 6.3 6.7 1 fase mvil Frente del disolvente 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 7.7 2 fase mvil Frente del disolvente 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3

Rf 0.19 0.24 0.57 0.58 0.68 0.71 0.72 0.76 0.81 0.87

Arginina Lisina Glicina Prolina c.glutmico Histidina Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina

Frente del soluto 1 0.7 2 2 2.5 0.8 2.4 4.3 4.1 4.6

Rf 0.13 0.09 0.27 0.27 0.34 0.11 0.32 0.6 0.56 0.63

Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases mviles. No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 fase mvil Frente del disolvente 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 2 fase mvil Frente del disolvente 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 Aminocido correspondiente Arginina Lisina Glicina Prolina Histidina c. glutmico Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina

Frente del soluto 1.6 1.9 3.9 4.3 4.8 5.3 5.6 5.7 6 6.7

Rf 0.2 0.23 0.48 0.53 0.6 0.66 0.7 0.71 0.75 0.83

Frente del soluto 1.7 0.8 1.9 2.1 2.4 2.5 2.7 4.5 4.2 4.9

Rf 0.23 0.11 0.26 0.28 0.32 0.34 0.37 0.62 0.57 0.67

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las dos fases mviles. No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 1 fase mvil Frente del disolvente 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 2 fase mvil Frente del disolvente 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2 7.2

Frente del soluto 1.7 3.6 3.6 5.3 6 6.5 6.6

Rf 0.21 0.45 0.45 0.67 0.75 0.82 0.83

Frente del soluto 0.9 1.8 2.5 2.5 3.3 3.9 4.7

Rf 0.12 0.25 0.34 0.34 0.45 0.54 0.65

Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases mviles. No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 Rf creciente en la 1 fase mvil 0.21 0.45 0.45 0.67 0.75 0.82 0.83 Rf en la 2 fase mvil 0.12 0.25 0.34 0.34 0.45 0.54 0.65 Aminocido correspondiente Lisina Glicina Prolina cido glutmico Treonina Metionina Fenilalanina

DISCUSIN Lo primero que se realiz despus de la parte experimental, es el clculo del Rf en los cromatogramas unidimensionales de ambas fases( Figuras 1 y 2), en los cuales el aminocido es conocido, as que estos valores los tomamos como referencia para determinar de qu aminocido se trata en el cromatograma bidimensional tipo ( Figura 3); al comparar las tablas 1 y 2 nos muestra que algunos valores fueron bastante cercanos y por tanto la identificacin fue sencilla, tenemos por ejemplo los casos de la arginina, lisina, tirosina, metionina etc., pero si observamos el caso de la histidina, los Rf no son muy parecidos, as que este aminocido se determin as por descarte, esto se pudo dar por una mala preparacin del cromatograma al agregar los l de ese aminocido, o incluso un desarrollo no adecuado, pero esta opcin se descarta porque los dems valores no estn tan alejados. Por otra parte, ya con nuestro cromatograma bidimensional tipo establecido pasamos a la identificacin de los aminocidos del jitomate, que fue la fruta que elegimos; en la Tabla 3 podemos observar los valores de Rf obtenidos de las manchas que se desarrollaron de la muestra en ambas fases, al comparar esta tabla con la tabla 2, podemos hacer una identificacin aproximada de los aminocidos, ya que en realidad con estos resultados no podemos decir con certeza los componentes, tal vez para esto es necesario hacer mnimo 2 rplicas de la cromatografa bidimensional o hacer otras pruebas. Entonces se comparan los valores del cromatograma bidimensional tipo y del problema, se observa que en la mayora de los casos los valores son cercanos como por ejemplo el de la lisina que tiene un Rf 1 fase de 0.23 y de 2 fase 0.11 en la tabla tipo y en el problema 1 fase 0.21 y 2 fase 0.12, de hecho son cercanos en todos a excepcin de la Prolina que son los valores ms alejados 1 fase 0.53 y 2 fase 0.28 en la tabla tipo, ahora 1 fase 0.45 y 2 fase 0.34 en la tabla problema; a pesar de esto siguen siendo los valores ms aproximados para prolina. Cabe destacar que los valores de la muestra van a depender del contenido de los aminocidos del jitomate, que a su vez es dependiente de la maduracin del mismo y de la especie, se sabe que durante la maduracin, los aminocidos libres totales permanecen relativamente constantes, pero la concentracin de cido glutmico, que es el predominante en el jitomate maduro aumenta, mientras el cido glutmico disminuye; en cuanto a la serina y treonina stos alcanzan un mximo antes de la completa madurez y los aminocidos restantantes disminuyen. 2 Aunque estos datos no son de tanta utilidad puesto que no cuantificamos concentracin de aminocidos. CONCLUSIONES Separamos los aminocidos del jitomate utilizando las tcnicas de cromatografa unidimensional y cromatografa bidimensional en capa fina, los cuales nos proporcionan los valores de Rf que al compararlos entre s nos permiten la identificacin de los aminocidos. As mismo concluyo que la mejor opcin tanto para la separacin, como la

identificacin es el mtodo de la cromatografa bidimensional ya que tiene una mayor resolucin y confiabilidad al ser desarrollado el mismo cromatograma en ambas fases. PREGUNTAS EXTRA 1.- Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado como problema Aminocido cido glutmico cido asprtico Leucina Lisina Alanina Fenilalanina Treonina Cantidad 314 mg 113 mg 28 mg 27 mg 24 mg 22 mg 21 mg Aminocido Prolina Glicina Metionina Tirosina Serina Cantidad 15mg 17 mg 7 mg 11 mg 26 mg En nuestros resultados experimentales observamos la presencia de los siguientes aminocidos: lisina, glicina, prolina, c. glutmico, treonina, metionina y fenilalanina; todas stas estn presentes en el jitomate segn lo reportado en la literatura, ya sea en mayor proporcin como el cido glutmico, lisina etc. o en menor como la Metionina, entre otros aminocidos que no utilizamos en la prctica.

2.- Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminocido.

Ninhidrina

Aminocido

Aldehdo

3.- Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Si es posible, debido a que sea cual sea la primera, las molculas se separan por su solubilidad de acuerdo a la mezcla de la fase mvil y en la direccin que se desarrolle el cromatograma. 4.- Indique las posibles fuentes de erro de esta tcnica Mala preparacin del cromatograma al colocar las muestras. Al desarrollar la cromatografa es importante la direccin en la que se colocar el cromatograma, sobre todo para no repetir la direccin ya desarrollada, sino no habr una separacin real de los componentes. Preparacin deficiente de las fases mviles.

BIBLIOGRAFIA 1. Voet, D., Voet, J. Bioqumica, 3 edicin, Editorial Mdica Panamericana, 2006; pgs. 150-151. 2. Nuez, F. El cultivo del tomate, Grupo Mundi Prensa, 2005, pgs.. 80-82 3. http://alimentos.org.es/aminoacidos-tomate