CREACIN Y MANEJO DE CEPARIO

LUZ ESTHELA PARODI URANGO YIRA STEFANI REYES TAVERA

CEPARIO
Es la coleccin de microorganismos en unas condiciones que permitan que mantenga su viabilidad con el fin de conservarlos en el tiempo y poder utilizarlos posteriormente.
Provenientes de una coleccin conocida nacional o internacionalmente.

Material de referencia
Certificado que especifique las caractersticas genotpicas y fenotpicas.

CEPARIO
Cepas de Referencia: M.O definidos por lo menos a nivel de gnero y especie.

Cepas de reserva: Obtenidas a partir de la reactivacin y resiembra de un cultivo de referencia.

Cepas de trabajo: Subcultivos obtenidos de un cultivo de reserva, destinado al uso como control del trabajo diario Requisitos: Viabilidad: Clulas microbianas capaces de crecer. Cultivos de referencia. Pureza: Debe ser un cultivo puro. Estabilidad: Estabilidad gentica (Genotpica y fenotpicamente)

CEPARIO
Los CR son necesarios para la evaluacin de la calidad de los medios de cultivo y controles de calidad internos durante la ejecucin de los ensayos.
Nmero Gnero Especie

Ensayos y necesidades metodolgicas

Los controles de calidad a los reactivos son necesarios, as como realizar pruebas confirmatorias. Debe documentarse los procedimientos para manejo de estos cultivos de referencia.

PREVENCIONES PARA EL MANEJO Y ALMACENAMIENTO DE LAS CEPAS

Importante: - Prevenir el deterioro de las cepas. - Contaminacin cruzada. - Mutaciones. - Deterioro o alteracin o alteracin de las caractersticas tpicas de las cepas. El crecimiento caracterstico debe documentarse para cada medio en el cual se utiliza como cepa control. Se admiten hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia , para evitar lo anterior. Si la cepa se adquiere por una va diferente a la propia coleccin, debe anotarse como derivada de la cepa de coleccin, ms no el nmero de sta cuando se quiera identificar.

ADQUISIN DE CEPAS DE REFERENCIA

PRIMERA OPCIN ATCC (American Type Culture Collection). SVM (Foundation for the Advacement of Public Environmental Protection). CECT (Coleccin espaola de cultivos tipos). CNMC (Collection Nationale de Cultures de Microorganismos) Institut Pasteur.

SEGUNDA OPCIN
Proveedores comerciales certificados por ISO 9001 que comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas de una coleccin reconocida, generalmente tercer o cuarto repique. Se requiere para la compra, el certificado de orgen donde conste el nmero de repique y el orgen.

RECONSTITUCIN DE CEPAS DE REFERENCIA

Al llegar deben ser registradas, se almacenan de 0-5C hasta su uso, se reconstituyen y se siembran. Se realiza control de viabilidad y pureza y se registra. Registro de cepas de referencia:
Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. Tipo y N de coleccin. N de lote. Control de calidad con la cepa referenciada conforme (S/No) Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable.

CONTROL DE CALIDAD VIABILIDAD Y PUREZA

A diferentes niveles del proceso con el fin de asegurar que las cepas conservan su viabilidad y caractersticas bioqumicas. La frecuencia ser establecida por el laboratorio. De no presentar las caractersticas solicitadas, se deben ejecutar las acciones correctivas establecidas en el procedimiento.

REGISTRO DE CONTROL DE PUREZA Y VIABILIDAD DE LAS CEPAS.

Fecha del control. Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. Tipo y N de coleccin. Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo). Coloracin de Gram. Caractersticas de las colonias en medios selectivos. Pruebas bioqumicas y serolgicas.

CEPAS DE RESERVA
Son preparadas en el laboratorio y conservadas como fuente de preparacin de cultivos de trabajo. Lugar destinado para el almacenamiento, sealado como cepas potencialmente peligrosa y su manejo exclusivo por personal autorizado.

MTODOS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

Obtenidas a partir de cepas de referencia. Liofilizadas Agentes crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiolgica al 10 o 20% P/V. Puede conservarse en refrigeracin o a temperatura ambiente por aos. Congelacin a bajas temperaturas. Agentes crioprotectores: Leche descremada de calidad microbiolgica al 10 o 20% P/V. Glicerol al 10% Caldo BHI con glicerol 20%.

PROCESO DE CONGELACIN
Equipos e insumos: Congelador o cmara de Nitrgeno lquido. T de congelacin: Deseanle a -70 -80C, temperaturas ms altas como -20C no es lo ideal. Envases: Uso criovial o tubo estril. Productos: Se puede conservar en la temperatura de congelacin por aos. Inconveniente: Problemas y prdida de las cepas, la falta de suministro de energa, falta de insumos o avera del equipo.

Con cada subcultivo hay riesgo de prdida de la cepa.

FACTORES QUE AFECTAN LA VIABILIDAD DE LA CEPA

Tipo de cepa: Las bacterias Gram positivas, resisten mejor que las Gram negativas. El cultivo debe estar expuesto a las mejores condiciones posibles antes de ser expuestos a bajas temperaturas. Condiciones necesarias: Edad del cultivo: Puede afectar la supervivencia, cultivos demasiado jvenes o viejos son menos resistentes al shock trmico, idealmente debe ser final de la fase logartmica- inicio de la fase estacionaria (24 horas). Pseudomona a -20C sobrevive 18 meses.

PROCEDIMIENTO CEPAS DE RESERVA

Paso 1: Tubos o crioviales se rotulan. Identificacin de la cepa. Tipo y N de coleccin. N de repique. Fecha de realizacin del cultivo de reserva. Fecha de vencimiento del criovial. N de tubo o criovial.

Paso 2: El desarrollo microbiano obtenido, se inocula aspticamente en el medio lquido sobrenadante que contiene los crioviales. Registro de cepas de reserva. Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo. Tipo y N de coleccin. N de criovial o vial. Fecha de reconstitucin de la cepa de referencia. N de repique. Frasco en uso. Fecha de baja criovial. Ubicacin de almacenamiento. Observaciones.

OJO! En caso de descongelamiento no volver a congelar. Criovial vencido se elimina del cepario y se registra. Cuando se fraccionan alcuotas de crioprotectores, si se usan, congelan y descongelan no deben volver a usarse. Las cepas liofilizadas reconstituidas ya no pueden volverse a usar

CEPAS DE TRABAJO
Son subcultivos de M.Os obtenidos a partir de las cepas de reserva para ser utilizados en los ensayos que lo precisen. Obtencin de las cepas de trabajo Se obtienen de cepas de reservas sobre un medio lquido o slido no selectivo, adecuado, utilizando un asa estril y e incubndolos en condiciones adecuadas Los cultivos de trabajo no pueden ser subcultivados.