DR. Harrizul Rivai, M.S.

Lektor Kepala Kimia Analitik

Universitas Andalas
28/03/2013 Harrizul Rivai 1
Dengan menyebut nama Allah yang
Maha Pemurah lagi Maha Penyayang
Buku Rujukan
28/03/2013 Harrizul Rivai 2
2
1
Buku Rujukan
28/03/2013 Harrizul Rivai 3
3
Metode Analisis Obat
PENGGOLONGAN METODE ANALISIS OBAT
Beberapa metode analisis obat yang biasa digunakan, baik yang
konvensional maupun yang menggunakan instrumen dapat
dikelompokkan sebagai berikut:
1. Metode Analisis Kimia
Gravimetri
Titrasi (volumetri): meliputi titrasi asam basa, pengendapan, pembentukan
komplek, oksidasi-reduksi, nitrimetri
2. Metode Analisis Fisikokimia
Analisis elektrokimia: meliputi polarografi, potensiometri, konduktometri
Spektrofotometri meliputi: spektrofotometri sinar UV-tampak (UV-visibel), sinar
infra merah (IR), serapan atom.
Kromatografi: Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis, Kromatografi Kolom,
Kromatografi Gas
3. Metode Analisis Hayati (Bioassay)

28/03/2013
Harrizul Rivai
4
SPEKTROFOTOMETRI
ULTRAVIOLET DAN VISIBLE
(SPEKTRO UV-VIS)
28/03/2013 Harrizul Rivai 5
Pendahuluan
Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel adalah
teknik analisis yang memanfaatkan sumber
radiasi (sinar) elektomagnetik ultraviolet dekat
(

190 380 nm) dan sinar tampak ( 380 780
nm).

Radiasi ultraviolet jauh (100 190 nm) tidak
dipakai dalam analisis sebab di daerah tersebut
udara juga ikut mengabsorpsi radiasi.

Spektrofotometri Ultraviolet dan Visible dalam
analisis obat digunakan untuk :
Analisis kuantitatif (penentuan kadar)
Karakterisasi (identifikasi) obat,
pengotornya, metabolitnya dan senyawa-
senyawa sejenisnya
28/03/2013 Harrizul Rivai 6
28/03/2013 Harrizul Rivai 7
Pendahuluan
Absorpsi molekular
dalam daerah UV
dan Visible timbul
karena transisi
energi yang
melibatkan elektron
orbital kulit terluar
atau elektron
valensi.
Spektrum dalam media cair
biasanya lebar karena
banyak transisi vibrasional
dan rotasional berdekatan
jaraknya.
Spektrum yang lebih rumit
diperoleh untuk senyawa-
senyawa yang mudah
menguap bila diukur dalam
fase uap, karena struktur
halus vibrasi dan rotasinya
dapat terlihat dengan
mudah.
Lihat spektrum senyawa
1,2,4,5-tetrazine pada
gambar di samping.
28/03/2013 Harrizul Rivai 8
Pendahuluan
Dalam spektrum UV dan Vis, energi foton yang menyebabkan transisi
elektronik terletak dalam rentang 147 630 kJ/mol. Energi ini (E)
dapat dinyatakan sebagai parameter-parameter radiasi
elektromagnetik, yaitu: frekuensi (Hz), panjang gelombang (nm)
dan bilangan gelombang u (cm
-1
).
28/03/2013 Harrizul Rivai 9
Pendahuluan
u

hc
hc
h E = = = A
h = tetapan Planck, c = kecepatan cahaya dalam vakum.
Posisi puncak serapan dinyatakan sebagai:
1. Bilangan gelombang, u (untuk spektrofotometer IR)
2. Panjang gelombang () (untuk spektrofotometer UV dan Vis)
Posisi serapan maksimum suatu puncak disebut
max
.

28/03/2013 Harrizul Rivai 10
Rentang panjang gelombang untuk analisis obat biasanya dibagi dua:
1. Panjang gelombang sinar UV = 200 400 nm
2. Panjang gelombang sinar tampak = 400 800 nm
Di luar batas-batas ini tidak digunakan untuk analisis obat, yaitu:
1. Sinar UV jauh atau UV vakum = 100 200 nm
2. Sinar inframerah dekat = 1 3 m
Kromofor dan auksokrom
Kromofor adalah gugus-gugus yang menyebabkan absorpsi cahaya oleh suatu
molekul obat. Ada dua macam kromofor, yaitu ikatan rangkap terkanjugasi
dan ikatan rangkap terdelokalisasi.
Auksokrom adalah suatu gugus jenuh yang tidak menyerap, tetapi dapat
memodifikasi spektrum serapan bila terikat langsung pada suatu kromofor.
Contoh : -OR , -NR
2
, -SR
Ikatan rangkap terkonjugasi
(1,3-pentadiena)
Ikatan rangkap terdelokalisasi
(sinamaldehida)
Interaksi elektron t, o, n dengan radiasi
elektromagnetik
Ada tiga macam distribusi elektron dalam suatu senyawa
organik, yaitu orbital elektron pi (t), sigma (o) dan
elektron tidak berpasangan (n), seperti pada senyawa
formaldehid berikut:

H orbital elektron o
C O orbital elektron t
H orbital elektron n

Bila molekul tersebut menyerap radiasi elektromagnetik
akan terjadi eksitasi elektron ke tingkat energi lebih
tinggi yang dikenal sebagai orbital elektron anti bonding
(*)
28/03/2013 Harrizul Rivai 11

:

*

*

:

*
.
Eksitasi elektron (o o*) terjadi pada daerah
ultraviolet jauh oleh ikatan tunggal seperti pada alkana

Eksitasi elektron (t t*) diberikan oleh ikatan rangkap
dua dan tiga (alkena dan alkuna) juga di daerah
ultraviolet jauh

Pada gugus karbonil (dimetilketon dan asetaldehida)
akan terjadi eksitasi elektron (n o*) di daerah UV
jauh.
28/03/2013 Harrizul Rivai 12
Hukum Lambert-Beer
28/03/2013 Harrizul Rivai 13
Ada dua hukum yang menghubungkan intensitas cahaya yang mengenai sistem
pengabsorpsi (Io) dengan intensitas cahaya yang diteruskan (I).
1. Hukum Lambert pada konsentrasi (c) tertentu suatu sistem
pengabsorpsi yang homogen, intensitas cahaya yang diteruskan (I)
berkurang secara eksponensial dengan bertambahnya panjang jalan
cahaya (b).
2. Hukum Beer pada panjang jalan tertentu (b), intensitas cahaya yang
diteruskan (I) berkurang secara eksponensial dengan bertambahnya
konsentrasi (c) sistem pengabsorpsi yang homogen.
b
c
28/03/2013 Harrizul Rivai 14
Hukum Lambert-Beer
Gabungan kedua hukum tersebut disebut Hukum Lambert-Beer dan dapat
dirumuskan sebagai berikut:
bc
I
I
c =
0
log
c = absorptivitas molar, yang didefinisikan sebagai absorban larutan 1 molar dalam
sel (kuvet) 1 cm lebarnya.
b = lebar kuvet
c = konsentrasi (mol/L)
Transmitan (T= I/Io) dan persen transmitan (%T = 100(I/Io)) tidak linear
hubungannya dengan konsentrasi (c) dan lebar kuvet (b), dan dapat dihubungkan
dengan absorban sebagai berikut:
bc T
T I
I
A c = = = = ) log(% 2
1
log log
0
28/03/2013 Harrizul Rivai 15
Hukum Lambert-Beer
Contoh Soal:
Hitunglah persen radiasi masuk yang diserap oleh suatu sampel jika serapannya
sebesar (i) 2 dan (ii) 0,1.

Penyelesaian:
(i) (ii)
1 0 log %
0 ) log(%
) log(% 2 2
) log(% 2
1
log log
0
= =
=
=
= = =
anti T
T
T
T
T I
I
A
Jadi radiasi yang diserap = 100 1
= 99%
4 , 79 9 , 1 log %
9 , 1 1 , 0 2 ) log(%
) log(% 2 1 , 0
) log(% 2
1
log log
0
= =
= =
=
= = =
anti T
T
T
T
T I
I
A
Jadi radiasi yang diserap = 100 79,4
= 20,6%
28/03/2013 Harrizul Rivai 16
Macam-macam Rumus Hukum Lambert-Beer
bc A c =
c adalah absorptivitas molar bila c dinyatakan dalam mol/L
kbc A
abc A
=
=
atau a atau k adalah absorptivitas bila c dinyatakan dalam g/L
bc E A
bc A A
cm
cm
% 1
1
% 1
1
atau
=
=
adalah absorptivitas spesifik bila c dinyatakan
dalam g/100 mL (% b/v)
% 1
1
% 1
1
atau
cm cm
E A
BM
A
a
cm
c
= =
10
% 1
1
Contoh, suatu senyawa dengan BM = 100 dan
absorptivitas a = 20 pada panjang gelombang dalam
pelarut tertentu pada pH tertentu dan pada suhu
tertentu, mempunyai absorptivitas spesifik A(1%, 1 cm) =
200 dan absorptivitas molar c = 2.000.
28/03/2013 Harrizul Rivai 17
Latihan
Berapakah konsentrasi larutan obat berikut dalam satuan g/100 mL dan mg/100
mL bila diketahui nilai absortivitas spesifik dan absorbannya?
1. Karbimazol, nilai A(1%, 1 cm) = 557 dan absorbans terukur = 0,557 pada =
291 nm
2. Hidrokortison natrium fosfat, nilai A(1%, 1 cm) = 333 dan absorbans terukur
= 0,666 pada = 248 nm.
3. Isoprenalin, nilai A(1%, 1 cm) = 100 dan absorbans terukur = 0,500 pada =
280 nm
Dalam produk farmasi, konsentrasi dan jumlah biasanya dinyatakan dalam gram
atau mg dan bukan dalam mol sehingga untuk keperluan analisis produk
farmasi, Hukum Lambert-Beer ditulis dalam bentuk sebagai berikut:
b E
A
c bc E A
b A
A
c bc A A
cm
cm
cm
cm
.
atau
.
% 1
1
% 1
1
% 1
1
% 1
1
= =
= =
Monografi Farmakope dan textbook lainnya
sering menyatakan nilai baku A(1%, 1 cm)
untuk suatu obat, yang akan digunakan
dalam proses perhitungannya.
28/03/2013 Harrizul Rivai 18
Validitas Hukum Lambert-Beer
Validitas Hukum Lambert-Beer dipengaruhi oleh beberapa faktor:
1. Radiasi harus monokromatik. Jika radiasi tidak monokromatik, maka
absorbans yang diamati akan lebih rendah daripada nilai batas yang
sesungguhnya untuk radiasi monokromatik.
2. Larutan analit harus homogen, tidak mengalami asosiasi, disosiasi,
fotodegradasi, solvasi, kompleksasi atau adsorpsi dan tidak berfluoresensi.
Jika tidak, maka akan terjadi penyimpangan positif atau negatif dari
Hukum Lambert-Beer.
3. Cahaya sesatan tidak boleh ada, karena akan menyebabkan tidak
berlakunya Hukum Lambert-Beer. Cahaya sesatan adalah radiasi yang
mempunyai panjang gelombang yang berbeda dari panjang gelombang
yang diinginkan.
4. Jenis pelarut yang digunakan harus melarutkan analit dengan mudah dan
tidak boleh menyerap pada panjang gelombang pengukuran analit.

SYARAT PENGGUNAAN HUKUM BEER
1. KONSENTRASI : Hukum Beer baik untuk larutan sampel
yang encer, sebab jika pekat (> 0,01 M), tidak maksimal
mengabsorpsi cahaya pada maks yang digunakan.
Peristiwa ini menyebabkan penyim-pangan kelineran
hubungan antara absorbansi dan konsentrasi.
2. KIMIA : Zat pengabsorpsi tidak boleh berdisosiasi,
bereaksi dengan pelarut menghasilkan produk yang
berbeda dengan zat yang dianalisis

3. CAHAYA : Hukum Beer hanya berlaku untuk sinar
monokromatik (hanya satu macam ).

4. KEJERNIHAN : Larutan sampel harus jernih, karena
kalau tidak jernih intensitas sinar yang diabsorpsi
berkurang dari yang seharusnya.

28/03/2013 Harrizul Rivai 19
HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN DALAM ANALISIS
SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
1. Pembentukan Molekul yang dapat Mengabsorpsi Sinar UV-
VIS :
Pereaksi yang digunakan harus selektif dan sensitif,
reaksinya cepat dan reprodusibel, hasil reaksi stabil dalam
jangka waktu lama.
Analisis golongan Sulfonamida melalui reaksi diazotasi dan
dikopling dengan naftil etilen diamin (NED) membentuk warna.
20 28/03/2013 Harrizul Rivai
Sulfisoksazol
REAKSI DIAZOTASI
REAKSI PENGKOPLINGAN
28/03/2013 Harrizul Rivai 21
SENYAWA BERWARNA
Reaksi diazotasi tersebut akan kelebihan
asam nitrit dan dapat dihilangkan dengan
penambahan asam sulfamat. Jika tidak
dihilangkan, maka senyawa yang sudah
berwarna akan dirusak (dioksidasi) oleh
asam nitrat sehingga kembali menjadi tidak
berwarna. Reaksi penghilangan asam nitrit,
sesuai reaksi berikut :

HNO
2
+ HSO
3
NH
2
N
2
+ H
2
SO
4
+ H
2
O

28/03/2013 Harrizul Rivai 22
2. Waktu Operasional (operating time) :
Cara ini biasanya untuk pengukuran hasil
reaksi atau pembentukan warna, dengan
maksud mengetahui waktu pengukuran yang
memberikan lautan sampel yang stabil atau
selama pengukuran warna sampel tidak
mengalami perubahan.

Abs waktu operasional






waktu, t


28/03/2013 Harrizul Rivai 23
3. Pemilihan Panjang Gelombang :
Dipilih panjang gelombang yang memberikan
absorbansi maksimal, yaitu pada
max
, karena di
daerah tersebut kepekaannya maksimal atau
perubahan absorbansi untuk setiap satuan
konsentrasi adalah yang paling besar.
28/03/2013 Harrizul Rivai 24
1
2
A

A A
Konsentrasi
Konsentrasi
Pada 1
Pada 2
Disekitar
max
, bentuk kurva absorbansi
datar dan pada kondisi tersebut hukum
Beer akan terpenuhi

Jika dilakukan pengukuran ulang maka
kesalahan yang disebabkan oleh penggunaan
ulang panjang gelombang, akan sangat kecil
ketika digunakan
max
.
28/03/2013 Harrizul Rivai 25
4. Pembuatan Kurva Baku.
Mula-mula dibuat seri larutan baku dari zat
yang akan dianalisis dalam berbagai konsentrasi
dan masing-masing diukur absorbansinya pada

max
, kemudian dibuat kurva baku yang
merupakan hubungan antara absorbansi dengan
konsentrasi.

Bila hukum Beer terpenuhi maka diperoleh garis
liner, dimana kemiringan atau slope adalah nilai
a (absortivitas) atau c (absortivitas molar)
Penyimpangan dari garis liner dapat disebabkan
oleh : kekuatan ion yang tinggi, perubahan suhu
saat pengukuran, dan reaksi ikutan yang terjadi
28/03/2013 Harrizul Rivai 26
Plot Hukum Beer untuk Teofillin dalam Pelarut Air
KONSENTRASI TEOFILLIN
( X 10
-5
M)
A pada 272 nm
c pada 272 nm
( X 10
-4
)
2,04
4,08
6,12
8,16
0,209
0,414
0,621
0,827
1,025
1,015
1,015
1,013
28/03/2013 Harrizul Rivai 27
Absorbansi

1,0 -

0,8 - -

0,6 - -

0,4 - -

0,2 - -


! ! ! ! !
0 2 4 6 8 10
Tabel Hasil Pengukuran Absorbansi Teofillin dalam Pelarut Air pada 272 nm
c pada 272 nm = 1,02 X 10
-4

M
-1
Cm
-1
Konsentrasi 10
-4
M
Grafik Hubungan Transmitansi/Absorbansi dengan Persen Kesalahan Relatif
5. Pembacaan Absorbansi Sampel.
Batas terendah dan batas tertinggi nilai
absorbansi atau transmitansi yang diperkenankan
sehingga kesalahan fotometrik dalam pembacaan
A atau T paling kecil sebesar 5% (0,05) adalah
antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% T.
28/03/2013 Harrizul Rivai 28

25 -

20 -

15 -

10 -

5 -

! ! ! !
20 40 60 80 100 % Transmitan
! ! ! ! ! ! ! ! !
1 0,8 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05 0 Absorbansi