GUIA DE LABORATORIOS

LAB-FR-005

LABORATORIO DE BIOQUMICA DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

1. OBJETIVOS

1.1.

Reconocer la importancia de las enzimas como catalizadores de reacciones qumicas.

1.2.

Comparar los tiempos de coagulacin en muestras de leche preparadas bajo diferentes tratamientos.

1.3.

Evidenciar actividad proteoltica entre la enzima renina y la protena de la leche (casena), mediante la determinacin de la fuerza de cuajo.

2. INTRODUCCIN
Las reacciones qumicas se realizan en los seres vivos a gran velocidad, en condiciones muy moderadas de temperatura, pH, presin, etc., gracias a la existencia de catalizadores denominados enzimas. Las enzimas se caracterizan por su notable eficiencia y su extraordinaria especificidad. La gran mayora de las enzimas son protenas, tambin existe ARN con actividad cataltica (ribozimas). Algunas enzimas son protenas simples y otras, protenas conjugadas asociadas con otra molcula no proteica, de pequeo tamao, la coenzima o cofactor. En funcin de su naturaleza se denominan:

1.

Cofactor. Cuando se trata de iones o molculas inorgnicas. (Cofactores).

Algunos cofactores entran a formar parte del sitio activo y son integrantes de la protena enzima (metaloprotenas); otros al parecer, establecen un enlace entre la enzima y el sustrato.

2.

Coenzima. Cuando es una molcula orgnica. Aqu se puede sealar, que

muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas

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por la falta de vitaminas responde ms bien a que no se puede sintetizar una determinada enzima en el que la vitamina es la coenzima.

3. MARCO TERICO
Caractersticas de la accin enzimtica La caracterstica ms sobresaliente de las enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos: 1. Especificidad de sustrato. El sustrato (S) es la molcula sobre la que la enzima ejerce su accin cataltica. 2. Especificidad de accin. Cada reaccin est catalizada por una enzima especfica. La accin enzimtica se caracteriza por la formacin de un complejo que representa el estado de transicin.

Factores que regulan la cintica enzimtica

1.

Efecto del pH. Al comprobar experimentalmente la influencia del pH en la

velocidad de las reacciones enzimticas se obtienen curvas que indican que las enzimas presentan un pH ptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras: El centro activo puede contener aminocidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH. La ionizacin de aminocidos que no estn en el centro activo puede provocar modificaciones en la conformacin de la enzima. El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.

Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estmago, presenta un pH ptimo de 2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH ptimo de 12.

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2.

La temperatura. Influye en la actividad. El punto ptimo representa el mximo de

actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rgidas" y cuando se supera un valor considerable (mayor de 50) la actividad cae bruscamente porque, como protena, la enzima se desnaturaliza.

3.

La concentracin de enzima: Existe una relacin lineal entre la velocidad de la

reaccin y la concentracin de la enzima.

4. La concentracin de sustrato: Para una determinada cantidad de enzima, la velocidad de la reaccin aumenta al aumentar la concentracin de sustrato. Al principio esta relacin es casi lineal, pero luego la curva de la reaccin asume una forma hiperblica, se alcanza una meseta en la cual la velocidad es constante, esto ocurre a concentraciones de sustrato tales que posteriores incrementos no afectan la velocidad aparente. Aqu todas las molculas de enzima estn saturadas de sustrato y por lo tanto existe el complejo [ES].

El sustrato se une a la enzima a travs de numerosas interacciones dbiles como son: puentes de hidrgeno, electrostticas, hidrfobas, etc, en un lugar especfico, el centro activo. Este centro es una pequea porcin de la enzima, constituida por una serie de aminocidos que interaccionan con el sustrato. (Mecanismo de accin). Renina El cuajo natural, llamado renina, es una enzima proteoltica segregada por la mucosa gstrica del cuarto estmago (cuajar) de los terneros, cabritos y corderos antes del destete. Esta secrecin se produce en forma de un precursor inactivo, la pro-renina, que en medio neutro no tiene actividad enzimtica pero que en medio cido se transforma rpidamente en renina activa. El cuajo contiene dos enzimas: la quimiosina, que es el componente principal y la pepsina. Despus del destete, disminuye la produccin de quimiosina y la pepsina pasa a ser el componente mayoritario.

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El cuajo se extrae de los cuajares mantenindolos a remojo en salmuera. Para el uso comercial, se preparan soluciones purificadas de fuerza estandarizada en las que se ajusta el pH, la sal y el color y a las que se aade agentes conservantes.

La actividad proteoltica del cuajo se ejerce sobre la casena, principalmente, y otras protenas. Por lo tanto realiza dos acciones fundamentales. La primera accin es la de provocar la desestabilizacin de las micelas de casena rompiendo las casena k en un punto determinado de su molcula: el enlace peptdico entre el aminocido fenilalanina y su vecino, que es una metionina. Generalmente la fuerza del cuajo se mide por la eficacia al romper este enlace, accin que produce la coagulacin de la leche. En la casena k hay unos 164 enlaces peptdicos que pueden ser atacados, adems de los que hay en las otras fracciones de las micelas. El segundo papel del cuajo es el de hidrolizar estos enlaces siguiendo un orden especfico que es caracterstico de la enzima empleada. Esta accin secundaria sobre las protenas comienza lentamente despus de la coagulacin y contina durante la maduracin del queso. Esta accin, junto con la de las proteasas nativas de la leche, las proteasas de la flora original y las del fermento, contribuye al desarrollo de algunas de las caractersticas de textura y sabor del queso.

Evidencia de actividad enzimtica: coagulacin de la leche La coagulacin cida o lctica suele ser utilizada para la elaboracin de quesos frescos mientras que la enzimtica es la empleada de forma mayoritaria en quesos madurados. Los coagulantes enzimticos utilizados, conocidos comnmente como cuajos, son proteasas cidas que tienen su pH ptimo de actuacin en la zona cida y presentan un origen variado: animal, vegetal o microbiano. La fuerza del cuajo se expresa como una relacin entre una unidad de peso y/o de volumen del cuajo capaz de coagular un nmero de unidades correspondientes de leche en unas condiciones definidas de

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temperatura y de tiempo; siendo estas condiciones consideradas en la presente prctica. Un mtodo ampliamente usado para determinar la actividad enzimtica en el proceso de coagulacin de la leche es el mtodo de Berridge ( Rhone Poulenc Colombia Ltda.,1997) y las modificaciones sugeridas por Rand y Ernstrom (Ernstrom, 1958; Rand et al, 1964). Consiste en tomar el tiempo que tarda en coagular una muestra de 5.0 ml de leche, 0.01 M en cloruro de calcio, al adicionarle 0.5 ml de extracto

enzimtico. Esta determinacin se logra haciendo rotar las muestras en un bao Mara a una temperatura de 37C, a una velocidad de aproximadamente 25 rpm. La lectura del tiempo de coagulacin se hace justo cuando el aspecto de la pelcula interna del frasco con la muestra, cambia de fluido laminar a viscoso y se ve como esta se rompe en pequeos cuajos. Fuerza de cuajo

Se define como la cantidad de leche en mililitros a 37C que es cuajada, por un gramo o mililitro de cuajo en 40 minutos. Este es un parmetro muy importante porque es un indicativo del potencial coagulante de la enzima y se calcula mediante la siguiente ecuacin (Keating, 1986):

F=

L 2400 t

Dnde: L: cantidad de leche, ml. 2400: Tiempo en que normalmente cuaja la leche a 37C con un cuajo estndar, s. t: Tiempo de coagulacin de la muestra, s. 4. EQUIPO
Bao mara 1 vidrio de reloj

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Gradillas Tubos de ensayo largos con tapa 1 beaker de 500 mL 4 balones volumtricos de 100 mL 1 Embudo de vidrio. 1 Pipeta graduada de 5 mL 1 Pipetas graduadas de 10 mL 2 balones volumtricos de 10 mL Pipetas Pasteur Agitadores Cronmetro

5. REACTIVOS Agua destilada Renina comercial Leche

Cloruro de calcio

6. PROCEDIMIENTO 1. Realizar los clculos para preparar 100 mL de solucin enzimtica 0,2 % en peso y 100 mL de leche al 0,01 M en cloruro de calcio. 2. Realizar los clculos para preparar las siguientes diluciones: 100 ml de solucin enzimtica 0,1 % en peso 100 ml se solucin enzimtica 0,05 % en peso 100 ml de solucin enzimtica 0,02 % en peso 100 ml de solucin enzimtica 0,01 % en peso

3. Determinacin de la actividad enzimtica:

a. Monte un bao Mara a una temperatura de 37 C.

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b. Tome 5 tubos de ensayo largos y mrquelos. c. Adicione a cada uno, una muestra de 5,0 ml de leche, 0,01 M en cloruro de calcio. d. Adicione en el primer tubo, 0,5 mL de solucin enzimtica al 0,2%. e. Inmediatamente sumerja el tubo horizontalmente (inicie el cronmetro) y comience a hacerlos rotar a una velocidad de aproximadamente 25 rpm. f. Inmediatamente el aspecto de la pelcula interna del frasco con la muestra, cambie de fluido laminar a viscoso y se vea como sta se rompe en pequeos cuajos. Detenga el cronmetro y tome este tiempo. g. Repita los pasos d. hasta f. para los tubos restantes, pero agregando 0,5 mL de las diluciones enzimticas restantes que tiene preparadas adiferentes concentraciones.

7. DATOS
Tabla 1. Cantidades para la solucin madre y la adecuacin de la leche

Peso enzima (g) Peso cloruro de calcio (g)

Volumen agua (mL) Volumen de leche (mL)

Concentracin (%p/p) Concentracin (M)

Tabla 2. Cantidades para la preparacin de las diluciones

Concentracin dilucin (%p/p)

Volumen solucin madre (mL)

Volumen de agua (mL)

Volumen final

8. CLCULOS
Determine la fuerza de cuajo para cada una de las muestras

9. PREGUNTAS
1. Explique cules son los principales factores que afectan a la actividad enzimtica. 2. Qu es un inhibidor y de cuntos tipos puede ser la accin que realizan? Elaborado por Adriana Osorio, Diana Arroyave, Andrey Escobar

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3. Cul es la diferencia entre cofactor y coenzima. 4. Cmo se define la velocidad de un proceso enzimtico? Qu efecto tiene sobre ella la cantidad de sustrato presente en el medio de reaccin? 5. Cite tres propiedades por las que podamos considerar a los enzimas como catalizadores. Qu es el centro activo?

10. INFORME El informe debe realizarse en formato tipo artculo, de acuerdo a la plantilla anexa.

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