APNDICE 111. VALIDACiN DE MTODOS ANALTICOS.

RECOMENDACIONES PARA SU PRESENTACiN ANTE LA FEUM

INTRODUCCiN ....................................................................... 2569
PROPUESTA DE MTODOS ANALTICOS ..................................... 2569
l. BASE RACIONAL DEL MTODO .............................................. 2569
2. FUNDAMENTACiN TCNICA ............................................... 2569
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN ANALTICA
DESEADA DE ACUERDO A SU PROPSITO DE USO ................. 2569
4. EVALUACiN DEL MTODO .................................................. 2575
5. ACEPTACiN PARA PUBLiCACiN......................................... 2575
6. ANEXO A ............................................................................. 2576
INTRODUCCiN
Los mtodos analticos utilizados para evaluar la calidad de
los productos farmacuticos, estn sujetos a varios requisitos
de acuerdo con la normatividad vigente, as como, con otros
documentos normativos nacionales e internacionales. La
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM) es el
documento legal instituido por la Ley General de Salud donde
se establecen los mtodos de anlisis y los requisitos
sobre la identidad, pureza, potencia y otras caractersticas de
calidad que garanticen que los frmacos (principios activos),
aditivos, medicamentos (preparados farmacuticos), radio-
frmacos y productos biolgicos sean eficaces y seguros.
Los mtodos analticos de la FEUM no requieren ser validados,
sino nicamente verificar su aplicabilidad al producto, bajo
las condiciones de operacin del laboratorio y en funcin del
propsito analtico deseado.
PROPUESTA DE MTODOS ANALTICOS
Para proponer un mtodo analtico se pueden considerar dos
casos:
Mtodo revisado que pretenda sustituir a un mtodo
publicado por la FEUM, con cambios mayores o menores
ya sea, en las caractersticas o condiciones de operacin,
aspectos instrumentales o reactivos, entre otros.
Mtodo nuevo cuando se trate de un mtodo analtico no
publicado en la FEUM.
El proceso que sigue la FEUM para aceptar un mtodo anal-
tico propuesto comprende las siguientes etapas:
l. Propuesta del mtodo por una organizacin, que incluya
una base racional.
2. Revisin de la fundamentacin tcnica que incluya la
documentacin necesaria, para que la Comisin Permanente
de la FEUM (CPFEUM) pueda tomar la decisin respecto
a la posible aceptacin del mtodo, en funcin de los
resultados de la validacin del mtodo propuesto.
3. Verificacin del mtodo propuesto. A criterio de la
CPFEUM se revisar parcial o totalmente la docmnentacin
de la validacin del mtodo propuesto y se realizar un
estudio colaborativo.
4. Evaluacin del mtodo.
5. Aceptacin para publicacin en consulta pblica, anlisis de
las observaciones realizadas y su publicacin en la FEUM.
1. BASE RACIONAL DEL MTODO
Los mtodos analticos que se propongan por una organiza-
cin para ser incluidos en la FEUM, deben presentarse por
medio de una solicitud dirigida a la Direccin Ejecutiva de la
Validacin de mtodos analticos 2569
CPFEUM, indicando el rea de aplicacin farmacopeica
(mtodos generales de anlisis, preparados farmacuticos,
frmacos, aditivos, radiofrinacos y productos biolgicos) y su
base racional, donde se identifique la necesidad del mtodo,
su factibilidad y en su caso el porqu es preferido sobre el
mtodo farmacopeico. Para los mtodos revisados se debe
proporcionar una comparacin de las limitaciones del mtodo
farmacopeico en uso y las ventajas que ofrece el mtodo
analtico propuesto, por medio del anlisis estadstico
correspondiente.
2. FUNDAMENTACiN TCNICA
En esta etapa, la organizacin debe presentar a la CPFEUM
la documentacin necesaria que describa completamente al
mtodo analtico y su validacin (protocolo e informe), lo
suficientemente detallada, que penl1ita su evaluacin.
La descripcin del mtodo puede incluir, entre otros, ttulo,
fundamento, objetivos, materiales, rectivos, instrumentos,
caractersticas operacionales importantes, instrucciones
especficas, tales como: pruebas de verificacin, preparacin
de las muestras, uso de sustancias de referencia, soluciones,
blancos utilizados; precauciones que deben tomarse en cuenta
y las frmulas explcitas para realizar los clculos requeridos.
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN
ANALTICA DESEADA DE ACUERDO
A SU PROPSITO DE USO
La verificacin es la confirmacin mediante la aportacin de
evidencia de que se han cumplido los requisitos especificados.
La confirmacin puede comprender acciones tales como la
realizacin de ensayos/pruebas y demostraciones.
La CPFEUM llevar a cabo la revisin documental de los
resultados completos de la validacin del mtodo analtico
propuesto, que presente la organizacin solicitante. Depen-
diendo del resultado emitido por la CPFEUM la verificacin
puede ser parcial o total.
Validacin
La validacin de un mtodo es el proceso que establece,
mediante estudios de laboratorio; que las caractersticas de
desempeo del mtodo, satisfacen los requisitos para su
aplicacin analtica.
El proceso de validacin de los mtodos an:alticos puede
comprender pero no est limitado al estudio de las caracte-
rsticas de desempeo que se describen en la Tabla l.
INTRODUCCIN
2570 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, dcima edicin.
Tabla l. Caractersticas de desempeo analtico
recomendadas en la validacin de los mtodos analticos.
Verificacin del sistema
Precisin del sistema
Linealidad del sistema
Especificidad/Selectividad del mtodo
Exactitud del mtodo
Linealidad e intervalo del mtodo
Precisin del mtodo
Lmite de deteccin del mtodo
Lmite de cuantificacin del mtodo
Robustez del mtodo
Tolerancia del mtodo
Los mtodos analticos para fines de validacin se clasifican
en cuatro .categoras, ya que requieren de diferentes esque-
mas de estudio:
Categora I. Mtodos analticos para cuantificar a un compo-
nente especfico en muestras de producto terminado o en
pruebas de estabilidad, ya sea en frmacos, aditivos o prepa-
rados farmacuticos, u otros analitos de inters (conservado-
res, solventes,etc.).
Categora 11. Mtodos analticos para la detenninacin de
impurezas (productos de degradacin, sustancias relacionadas,
ismeros pticos, etc.) en muestras de frmacos, preparados
farmacuticos y aditivos. Estos mtodos pueden incluir
determinaciones cuantitativas o pruebas lmite. En estas
ltimas, el inters es establecer si el analito, excede o no, un
valor lmite. Los mtodos de pureza quedan incluidos en esta
categora.
Categora IlI. Mtodos analticos utilizados en la determi-
nacin de un ana lito en una muestra con el objeto de evaluar
una caracterstica de desempeo del preparado farmacutico
(disolucin en cpsulas, liberacin controlada en tabletas,
entre otras).
Categora IV. Pruebas de identificacin de un analito en
muestras de frmacos, aditivos o preparados farmacuticos,
cuyo propsito es establecer la presencia del analito de inters.
Pudieran presentarse casos de mtodos no clasificables en
alguna de estas categoras, por lo que el usuario debe esta-
blecer con claridad el propsito analtico.
En trminos del estudio de laboratorio, los requisitos mnimos
de las caractersticas de desempeo, deben documentarse
en un protocolo, ejecutarse y, al trmino de ste, elaborar un
informe donde se establezca su validez.
A continuacin se establecen los lineamientos generales para
cada caracterstica de desempeo, en trminos de su definicin,
ejecucin en el laboratorio y del anlisis de los resultados. Es
conveniente que en el protocolo de validacin se considere
el orden de estudio de las caractersticas indicadas en la
Tabla 2.
CARACTERSTICAS DE DESEMPEO
ANALTICO
VERIFICACIN DEL SISTEMA
Si las mediciones son susceptibles a los cambios de las condi-
ciones analticas, stas deben ser controladas adecuadamente o
debe incluirse en el mtodo una nota de precaucin al respecto;
por lo que es conveniente establecer una serie de pruebas de
la verificacin del sistema, que aseguren un correcto funcio-
namiento del mtodo, durante su uso rutinario.
Las pruebas de verificacin del sistema se basan en el
concepto de que: el equipo e instrumentos de medicin, las
operaciones analticas y las muestras que van a ser analizadas
constituyen un sistema integral, que puede ser evaluado
como tal. Las caractersticas que se establecen como repre-
sentativas de la verificacin, dependen del tipo de mtodo a
ser evaluado. stas son importantes especialmente en el caso
de los mtodos cromatogrficos.
Definicin. La verificacin del sistema son pruebas utilizadas
para verificar que el sistema flmciona correctamente, con
base en criterios establecidos previamente.
Esta verificacin permite establecer la confiabilidad del
sistema, antes del procesamiento de las muestras durante el
uso rutinario del mtodo; tambin se le conoce como buen o
correcto funcionamiento del sistema.
Determinacin. En funcin del sistema de medicin, se deben
establecer las caractersticas relacionadas con su funciona-
miento con'ecto, basadas en el tipo de equipo e instrumentacin
utilizado en el mtodo. stas pueden ser definidas en funcin
de una respuesta analtica, como pueden ser sus propiedades,
su variabilidad, su forma, su tiempo de respuesta, indicadores
de separacin, indicadores de eficiencia, respuesta de blancos,
entre otros.
En la fase de desarrollo del mtodo, las caractersticas men-
cionadas anterionnente y sus cliterios de aceptacin deben ser
establecidas; durante la validacin, la verificacin debe
ser nicamente verificada.
Anlisis de datos. Los criterios de aceptacin deben ser
cumplidos.
PRECISIN DEL SISTEMA
El sistema: analista, equipo e instrumentos de medicin,
soluciones de referencia, etc. originan una variabilidad inheren-
te asociada a la respuesta analtica (absorbancia, transmitaneia,
mililitros consumidos, rea del pico, altura del pico, rea
relativa, peso, entre otros), que en general es aditiva a la del
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN ANALTICA DESEADA DE ACUERDO
A SU PROPSITO DE USO
mtodo, por lo que, es importante verificar, que su valor no
sea una fuente importante de la variabilidad.
Definicin. La precisin del sistema es el grado de concor-
dancia relativa de la respuesta analtica. de soluciones de
referencia de concentracin o magnitud conocida.
Determinacin. A partir de tilla sustancia de referencia, el
analista debe preparar por lo menos seis soluciones que repre-
senten al 100% de la cantidad o concentracin del analito en la
muestra, ya sea, por dilucin o por pesadas independientes y
medir la respuesta dentro de una misma corrida analtica.
Anlisis de datos. Calcular el coeficiente de variacin de la
respuesta analtica. Este valor debe cumplir con un criterio
previamente establecido en funcin de la naturaleza de la
respuesta analtica (fsica, qumica o biolgica) o de la categora
del mtodo.
LINEALIDAD DEL SISTEMA
Cuando la relacin entre la concentracin y la respuesta
del analito (o sus transformaciones matemticas) no es lineal
dentro del intervalo de trabajo, dar lugar a inexactitud del
mtodo analtico, por lo que, es conveniente verificarlo bajo
las condiciones del laboratorio.
Definicin. La linealidad del sistema es la verificacin de
que la respuesta analtica y la concentracin del analito
(puede ser una sustancia de referencia) se ajustan al modelo
matemtico, en un intervalo de concentraciones pertinentes a
la aplicacin analtica.
Determinacin. Se debe investigar la relacin concentra-
cin-respuesta en un intervalo que incluya al menos
5 niveles, por triplicado, de la concentracin del analito.
El intervalo debe incluir las concentraciones esperadas del
analito segn la aplicacin analtica del mtodo.
Este concepto generalmente se denomina "curva de calibra-
cin" y es parte esencial de varios mtodos analticos en las
determinaciones cuantitativas del analito.
Anlisis de datos. Estimar los parmetros del modelo basado
en mtodos estadsticos (mnimos cuadrados, mxima vero-
similitud, etc.). Deben establecerse criterios de aceptacin
para definir la calidad de ajuste al modelo, que como mnimo
consideren un efecto significativo del modelo, una magnitud
nHnima del coeficiente de determinacin o una prueba esta-
dstica de falta de ajuste.
ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD DEL MTODO
La especificidad/selectividad permite investigar la influencia
de otros componentes de la muestra en las determinaciones
cualitativas o cuantitativas de un mtodo analtico.
Validacin de mtodos analiticos 2571
En la mayora de los casos, los mtodos cuantitativos que
son especficos/selectivos, son exactos.
Para el caso de mtodos analticos que van a ser utilizados
en estudios de estabilidad, la evaluacin de la selectividad es
obligatoria.
Definicin. La especificidad/selectividad, es la capacidad
de un mtodo analtico para obtener una respuesta debida
nicamente al ana lito de inters y no a otros componentes de
la muestra, que pueden estar presentes (especificidad) o que
se pudieran presentar por efectos ambientales y/o de interac-
cin con los mismos componentes (selectividad) tales como:
impurezas, productos de degradacin o componentes de la
misma muestra.
Determinacin. Para detenninar la especificidad, se debe de-
mostrar que la respuesta analtica se debe nicamente al analito.
Para el caso de especificidad se debe determinar, la respuesta
a componentes como: aditivos, sustancias auxiliares, sustancias
relacionadas estructuralmente al frmaco, etc. Para el caso
de selectividad se debe determinar la respuesta a componentes
como: sustancias de degradacin del frmaco originadas por
la influencia de las condiciones de almacenamiento (tempe-
ratura, humedad, luz, etc.) o por en condiciones extremas
(hidrlisis, oxidacin, etc.).
Anlisis de datos. Se debe presentar evidencia de que la res-
puesta analtica del mtodo sea debida nicamente al analito.
EXACTITUD DEL MTODO
La exactitud del mtodo debe ser determinada a todos los
mtodos de carcter cuantitativo.
Nota: a la exactitud tambin se le relaciona con el concepto
de sesgo de la medicin.
Definicin. La exactitud de un mtodo analtico, es la con-
cordancia absoluta entre el resultado obtenido con el mtodo
y la cantidad verdadera del analito presente en la muestra, a
una cantidad fija.
Determinacin de la exactitud en los mtodos analticos
comprendidos en la categora I (ver Tabla 2).
En el estudio de laboratorio la exactitud, puede determinarse
por la aplicacin del mtodo analtico, a placebos o muestras
adicionadas preparados de manera independiente, al menos
por sextuplicado, obtenidas de acuerdo a un procedimiento
especfico, dichas muestras deben contener todos los
componentes del producto y adems se le debe adicionar la
concentracin del analito que represente el 100 %. Si no
es posible obtener muestras que contengan todos los compo-
nentes del producto, la exactitud puede detenninarse por
comparacin de los resultados obtenidos, aplicando el mtodo
en estudio, con los resultados obtenidos al aplicar un segundo
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN ANALTICA DESEADA DE ACUERDO
A SU PROPSITO DE USO
2572 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, dcima edicin.
mtodo que haya sido bien caracterizado y cuya exactitud ha
sido establecida o definida, con muestras que sean represen-
tativas del 100 % del analito.
Determinacin de la exactitud en los mtodos analticos
comprendidos en la categora II (ver Tabla 2).
En el anlisis cuantitativo de impurezas, la exactitud debe
ser evaluada en muestras, al menos por sextuplicado, del
principio activo (frmaco) o del producto farmacutico a las
que se les han adicionado cantidades conocidas y fijas
de impurezas de acuerdo a la especificacin. Cuando no
es posible obtener muestras de ciertas impurezas o de los
productos de degradacin, los resultados debern ser compa-
rados con los obtenidos por un mtodo independiente.
Anlisis de datos. La exactitud se evala mediante el por-
centaje de recobro (cociente porcentual de la concentracin
recuperada entre la concentracin adicionada) considerando
los resultados del anlisis de las muestras. La diferencia
entre el valor de la media aritmtica del porcentaje de recobro
y el valor verdadero aceptado (lOO %), mide el sesgo del m-
todo. Un mtodo estadstico que demuestre que la magnitud del
sesgo es cero, indica que el mtodo es exacto. En algunas
circunstancias la organizacin puede justificar sesgos dife-
rentes de cero.
El anlisis de datos debe incluir la metodologa estadstica
aplicada y los criterios de aceptacin para la exactitud del
mtodo analtico.
LINEALIDAD E INTERVALO DEL MTODO
Todo mtodo analtico no debe presentar sesgo (error siste-
mtico) dentro del intervalo de cuantificacin, por 10 que es
necesario seleccionar al menos tres niveles de concentracin
(intervalo), que permitan demostrar exactitud y linealidad.
Es necesario que el intervalo incluya los lmites de especifi-
cacin de la aplicacin analtica del mtodo.
Definicin de linealidad. Es la capacidad de un mtodo
analtico para dar resultados que son directamente propor-
cionales a la concentracin del analito (sin sesgo) dentro de
1Ul intervalo dado.
Definicin de intervalo. Es el intervalo comprendido entre
las concentraciones superior e inferior del analito (incluyendo
dichas concentraciones) y para el que se ha demostrado que
el analito es cuantificado con un nivel satisfactorio de precisin,
exactitud y linealidad, cuando se aplica el mtodo analtico.
Determinacin de la linealidad. En el estudio de laboratorio la
linealidad, puede determinarse por la aplicacin del mtodo
analtico, a una muestra (placebo adicionado o muestra
adicionada de ana1ito), obtenida de acuerdo a un procedi-
miento especifico para su preparacin. Dicha muestra debe
ser preparada al menos a tres ni veles de concentracin del
ana1ito por triplicado, para ser analizadas aplicando el mtodo
analtico. Si no es posible obtener muestras que contengan
todos los componentes del producto, la linealidad puede deter-
minarse por comparacin de los resultados obtenidos, aplicando
el mtodo en estudio, con los resultados obtenidos al aplicar un
segundo mtodo, bien caracterizado, en los tres niveles de con-
centracin seleccionados. Para el caso de los mtodos anal-
ticos comprendidos en la categora II, el nivel inferior del
intervalo debe ser establecido a lUla concentracin apropiada.
Como anteriormente se recomend, las concentraciones
seleccionadas para la linealidad, deben ser como mnimo tres
concentraciones y considerar los siguientes intervalos, en
funcin de la aplicacin del mtodo:
Cuantificacin de Ull frmaco: (materia prima o de un pro-
ducto terminado): de 80 % a 120 % del contenido de marbete.
Cuantificacin de una impureza: de 50 % a 120 % de la
especificacin.
Uniformidad de contenido: de 70 % a 130 % de la concen-
tracin declarada en el marbete, a menos que se justifique un
intervalo ms amplio, basado en la naturaleza de la forma
farmacutica (por ejemplo MGA 0021 inhaladores de dosis
medida).
Pruebas de disolucin: mnimo 20 % de la especificacin,
por ejemplo si las especificaciones para un producto de libe-
racin controlada, es de mximo 20 % en una hora y un
mnimo 90 % a las 24 h, el intervalo de linealidad debe
comprender desde un 5 % hasta 110 %, de lo declarado en el
marbete.
Anlisis de datos. Inicialmente es recomendable hacer una
grfica con los resultados obtenidos de la concentracin
adicionada contra la concentracin recuperada del analito
y por medio de su examen visual, determinar una posible
relacin lineal. En caso de existir visualmente una relacin
lineal, llevar a cabo el aj uste por mnimos cuadrados de la
relacin lineal, entre concentracin adicionada (x) y concen-
tracin recuperada (y). Es necesario que el anlisis contemple
la calidad de ajuste al modelo, por medio del coeficiente de
determinacin (/), la desviacin estndar de la regresin
(Sy/.J Y el coeficiente de variacin de regresin (CV
y
), Puede
ser necesario establecer la linealidad basada en una prueba
estadstica de falta de ajuste. El sesgo del mtodo puede ser
evaluado en funcin de pruebas estadsticas relacionadas a la
pendiente (h) y la ordenada al origen (a).
La exactitud se evala mediante el porcentaje de recobro
(cociente porcentual de la concentracin recuperada entre la
concentracin adicionada) considerando los resultados del
anlisis de las muestras. La diferencia entre el valor de la
media aritmtica del porcentaje de recobro y el valor verdadero
aceptado (lOO %), mide el sesgo del mtodo. Un mtodo
estadstico que demuestre que la magnitud del sesgo es cero,
indica que el mtodo es exacto y lineal. En algunas circunstan-
cias la organizacin puede justificar sesgos diferentes de cero.
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN ANALTICA DESEADA DE ACUERDO
A SU PROPSITO DE USO
PRECISIN DEL MTODO
Cuando un mtodo analtico es exacto y lineal, la variabilidad
de un resultado analtico se debe a factores aleatorios, como
la incertidumbre de las mediciones debidas a: la balanza ana-
ltica, material graduado, material volumtrico, instrumento
de medicin de la respuesta analtica, corridas analticas,
analistas, laboratorios, lotes de reactivos, etc. Estos factores
se pueden clasificar en factores aleatorios intramtodo, intra-
laboratorio e interlaboratorio. La precisin intramtodo
se mide en trminos de repetibilidad, la reproducibilidad
intralaboratorio se mide en trminos de la precisin interme-
dia, la reproducibilidad interlaboratorios se mide en trminos
de estudios colaborativos.
Para fines de un estudio de precisin, una corrida analtica es
el anlisis, al menos por triplicado, de una misma muestra de
un producto, utilizando el mtodo analtico, ejecutado por un
mismo analista, bajo las mismas condiciones de anlisis
(mismos reactivos, mismos equipos, mismos instrumentos,
materiales volumtricos, etc.).
E ~ l este captulo no se considera la precisin interlaboratorios.
Definicin. La precisin de un mtodo analtico es el grado
de concordancia relativa entre los resultados obtenidos al
aplicar el mtodo analtico, bajo las mismas condiciones
analticas (repetibilidad) o bajo diferentes condiciones anal-
ticas (reproducibilidad), utilizando una muestra homognea.
La precisin de un mtodo analtico generalmente se expresa
como la desviacin estndar o como el coeficiente de .varia-
cin (desviacin estndar relativa).
Repetibilidad. La repetibilidad se refiere a la variacin de
los resultados de las muestras, al aplicar el mtodo en una
corrida analtica. La repetibilidad es una propiedad crtica
del mtodo analtico porque mide la variacin del mtodo
analtico en la rutina de trabajo.
Determinacin. La repetibilidad se determina a partir de los
resultados obtenidos de la exactitud (porcentaje de recobro)
y de la linealidad del mtodo (porcentaj e de recobro) y de la
relacin de la concentracin adicionada contra la concentra-
cin recuperada.
Anlisis de datos. La repetibilidad se evala:
a) En el caso de la exactitud:
Con el coeficiente de variacin del porcentaje de
recobro del analito.
b) En el caso de la linealidad:
Con el coeficiente de va.riacin del porcentaj e de
recobro del analito, y
Con el coeficiente de variacin de la relacin concen-
u"acin recuperada contra concentracin adicionada.
Validacin de mtodos analticos 2573
La magnitud de la repetibilidad debe satisfacer el criterio de
aceptacin establecido, en funcin de la aplicacin analtica
del mtodo, de la naturaleza del sistema y de la complejidad
del mtodo, entre otras.
REPRODUCIBILIDAD INTRALABORATORIO
(PRECISIN INTERMEDIA)
La precisin intermedia expresa la variacin dentro de un
mismo laboratorio, cuando el mtodo analtico se aplica en
diferentes das y con diferentes analistas (condiciones de
precisin intermedia).
Determinacin. La precisin intermedia de un mtodo analtico
se determina por el anlisis de por 10 menos tres alcuotas
(muestras analticas indicadas en el mtodo), tomadas de una
muestra homognea; para ser analizadas en diferentes das
(mnimo dos) y por diferentes analistas (mnimo dos).
Anlisis de datos. Se evala por medio del coeficiente de
variacin de todos los resultados analticos, el cual debe
cumplir con el criterio de aceptacin establecido.
LMITE DE DETECCIN DEL MTODO
El lmite de deteccin es una caracterstica de desempeo
analtico que debe determinarse cuando un mtodo analtico
se aplica como prueba lmite (ver Tabla 2).
Definicin. El lmite de deteccin (LD) es la cantidad mnima
de ana lito en una muestra que puede ser detectada, pero no
necesariamente cuantificada, bajo las condiciones de aplicacin
del mtodo. As las pruebas lmite solamente indican que la
cantidad del analito es superior o inferior a la concentracin
establecida. El lmite de deteccin se expresa generalmente
como la concentracin indicada en el mtodo analtico (por
ejemplo porcentaje, ppm, partes por billn, mg/g, etc.).
Determinacin para mtodos no instrumentales. El lmite de
deteccin se puede determinar empleando el procedimiento
de linealidad, en el cual es necesario generar una relacin
concentracin vs respuesta analtica, con al menos tres niveles
de concentracin por triplicado, lo que permitir investigar
linealidad, estimar la pendiente (b) Y una medida del error de
la respuesta analtica (se), como lo es la desviacin estndar
de regresin (Sy/x) o la desviacin estndar de la ordenada al
origen (sa ).Tambin una medida del error se obtiene con
el clculo de la desviacin estndar de la respuesta analtica
de al menos cinco blancos o de cinco matrices analticas no
adicionadas de analito (sw.).
Anlisis de datos para mtodos no instrumentales. El l-
mite de deteccin se calcula con la siguiente ecuacin:
LD= 3.3(sJ
b
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN ANALTICA DESEADA DE ACUERDO
A SU PROPSITO DE USO
-- ~ --- --
l'
li
ji
2574 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, dcima edicin.
Es importante establecer la linealidad ya sea basada en el
coeficiente de determinacin o en la prueba de falta de aj uste,
para dar validez al clculo del LD.
Determinacin para mtodos instrumentales. El lmite de
deteccin se puede determinar empleando el procedimiento
basado en "la seal-ruido" o el de linealidad. En el primero,
se evala obteniendo las respuestas analticas de muestras de
concentraciones conocidas del analito y por el estableci-
miento de la respuesta analtica a una concentracin cero del
analito (blanco o matriz analtica sin ana lito ) a la que
comnmente se la llama seal-ruido.
En el procedimiento de linealidad, es necesario generar una
relacin concentracin vs respuesta analtica, con al menos
tres niveles de concentracin por triplicado, lo que permitir
determinar la linealidad, estimar la pendiente (b) y una
medida del error de la respuesta (se), como lo es la desviacin
estndar de la regresin (Sy/x) o la desviacin estndar de la
ordenada al origen (sa). Tambin una medida del error se
obtiene con el clculo de la desviacin estndar de la
respuesta analtica de al menos cinco blancos o de cinco
matrices analticas no adicionadas de analito.
Anlisis de datos para mtodos instrumentales. Por el
procedimiento de la seal-ruido, el LD es la concentracin
cuya respuesta analtica es la inmediatamente superior a tres
veces la seal-ruido.
En el caso de la linealidad, el lmite de deteccin se calcula
con la siguiente ecuacin:
LD = 3.3 (sJ
b
Es importante establecer la linealidad ya sea basada en el
coeficiente de determinacin o en la prueba de falta de ajus-
te, para dar validez al clculo.
En el caso de los mtodos que sern propuestos para ser con-
siderados como un mtodo incluido en la FEUM, casi nunca
es necesario determinar el lmite de deteccin real, ms bien
el lmite de deteccin debe ser menor que la especificacin
del nivel de la impureza.
LMITE DE CUANTIFICACIN DEL MTODO
El lmite de cuantificacin es una caracterstica de desempeo
analtico, que detennina la capacidad cuantitativa del mtodo a
concentraciones bajas del ana lito en la muestra y se debe deter-
minar en los mtodos cuantitativos categora II (ver Tabla 2).
Definicin. El lmite de cuantificacin (LC) es la cantidad
mnima de analito en una muestra que puede ser determinada
con exactitud y precisin aceptable, bajo las condiciones de
aplicacin del mtodo. Las unidades del lmite se expresan
como se indica en el mtodo analtico (por ejemplo porcen-
taje, ppm, partes por billn, mg/g, etc.).
Determinacin para mtodos no instrumentales. Es necesa-
rio generar una relacin concentracin adicionada vs respuesta
analtica, con al menos tres niveles de concentracin por tri-
plicado, lo que permitir investigar la linealidad, estimar la
pendiente (b) Y una medida del error de la respuesta analtica
(se), como lo es la desviacin estndar de la regresin (Sy/x) o
la desviacin estndar de la ordenada al origen (sa). Tambin
una medida del error se obtiene con el clculo de la desviacin
estndar de la respuesta analtica de al menos cinco blancos
o de cinco matrices analticas no adicionadas de ana lito (sw).
Anlisis de datos para mtodos no instrumentales. El
lmite de cuantificacin se calcula con la siguiente ecuacin:
Le = 10 (se)
b
Es importante establecer la linealidad ya sea basada en
el coeficiente de determinacin o en la prueba de falta de
ajuste, para dar validez al clculo del Le.
Determinacin para mtodos instrumentales. El lmite de
cuantificacin se puede determinar empleando el procedi-
miento de la seal-ruido o el de linealidad. En el primero,
se evala obteniendo las respuestas analticas de muestras de
concentraciones conocidas del analito y por el estableci-
miento de la respuesta analtica a una concentracin cero del
analito (blanco o matriz analtica sin analito) a la que
comnmente se llama seal-ruido.
En el procedimiento de linealidad, es necesario generar una
relacin concentracin vs respuesta analtica, con al menos
tres niveles de concentracin por triplicado, lo que permitir
determinar la linealidad, estimar la pendiente (b) y una me-
dida del error de la respuesta (se), como lo es la desviacin
estndar de regresin (Sy/x) o la desviacin estndar de la
ordenada al origen (sa). Tambin una medida del error se
obtiene con el clculo de la desviacin estndar de la
respuesta analtica de al menos cinco blancos o de cinco
matrices analticas no adicionadas de analito (sw')'
Anlisis de datos para mtodos instrumentales. Por el
procedimiento de la seal-ruido, el LC es la concentracin
cuya respuesta analtica es la inmediatamente superior a
10 veces la seal-ruido.
En caso de la linealidad, el lmite de cuantificacin se calcula
con la siguiente ecuacin:
LC=lO (se)
b
Es importante establecer la linealidad ya sea basada en
el coeficiente de determinacin o en la prueba de falta de
ajuste, para dar validez al clculo.
3. VERIFICACiN DE LA APLICACiN ANAlTICA DESEADA DE ACUERDO
A SU PROPSITO DE USO
TOLERANCIA DEL MTODO
Los resultados de los mtodos analticos pueden variar por
una serie de factores relacionados con diferentes condiciones
extemas o no inherentes al mtodo (por ejemplo instrumentos,
marcas de reactivos, proveedores de columnas, corridas analti-
cas, laboratorios, analistas,' lotes de reactivos, etc.), por lo
que es necesario investigar su reproducibilidad.
Definicin. La tolerancia es el grado de reproducibilidad de
los resultados de prueba obtenidos por el anlisis de la misma
muestra, bajo una variedad de condiciones tales como: dife-
rentes laboratorios, analistas, instrumentos, lotes de reactivos,
das, etc.
Determinacin. Se deben establecer aquellos factores ajenos
al mtodo como: diferentes equipos, lotes de reactivos,
columnas, etc., que se puedan presentar al reproducir el mtodo
en otras condiciones. Fijar por lo menos dos condiciones y
analizar una misma muestra por lo menos por triplicado a
cada condicin. Reportar los resultados de las muestras de
las condiciones investigadas.
Anlisis de datos. Calcular la media aritmtica (y), desvia-
cin estndar (s) y coeficiente de variacin (CV) de todos los
resultados de todas las condiciones investigadas. Se debe de
cumplir el criterio establecido en funcin con el coeficiente
de variacin.
ROBUSTEZ DEL MTODO
Los resultados de los mtodos analticos pueden ser afectados
por una serie de factores relacionados con las condiciones
instrumentales o inherentes a ste, (por ejemplo temperatura
de la columna, presin en la columna, velocidad de flujo, pH de
fases, volmenes de solventes orgnicos para una extraccin,
etc.), los cuales se presentan normalmente durante una corrida
analtica, por lo que es necesario investigar su efecto bajo
pequeos cambios deliberados, fijados por el analista; para
asegurar la confiabilidad de los resultados.
La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes, ya que
el primero se refiere a la influencia de factores internos del
mtodo que pudiesen afectar la exactitud del mtodo, mientras
que la tolerancia, se refiere a factores extemos al mtodo, que
puedan impactar en la reproducibilidad de ste.
Definicin. Capacidad del mtodo analtico de mantener su
desempeo al presentarse variaciones pequeas pero delibera-
das, en las caractersticas normales de operacin del mtodo.
Determinacin. Se deben establecer aquellos factores ins-
trumentales (temperatura de la columna, presin en la
columna, velocidad de flujo, etc.) y/o factores no instrumen-
tales (pH de fases, volmenes de solventes orgnicos para
Validacin de mtodos analticos 2575
una extraccin, etc.), que se consideren crticos. Para su
investigacin se pueden presentar los siguientes casos:
a) Investigacin de tres factores como mximo. En
este caso se establecen un nivel inferior y uno supe-
rior respecto del nivel normal de operacin, por
ejemplo si el pH de la fase mvil de la condicin
normal es 5, el nivel superior puede ser 5.2 y el in-
ferior 4.8; los cuales son cambios pequeos pero
deliberados. Por lo que es necesario evaluar por tri-
plicado una misma muestra a cada nivel, incluyen-
do el nivel normal. Esto debe ser realizado para ca-
da uno de los factores a investigar.
b) Investigacin de cuatro a siete factores. Se debe
utilizar un diseo factorial fraccionado (2;1), conoci-
do como diseo Placket Burman. En el Anexo A se
describe su metodologa, as como su anlisis para
establecer ocho corridas experimentales.
Anlisis de datos para el caso de tres factores como
mximo. Calcular la media aritmtica de los tres niveles
(inferior, normal y superior) y la diferencia absoluta porcen-
tual de la media aritmtica de los niveles superior e inferior,
comparada con el nivel normal; estos valores no deben
exceder el criterio establecido, de acuerdo con las siguientes
ecuaciones:
Donde:
Iys - YNI x 100
YN

.fiN
y s = Media aritmtica del nivel superior.
y N = Media aritmtica del nivel normal.
y J = Media aritmtica del nivel inferior.
4. EVALUACiN DEL MTODO
Si la documentacin de la validacin del mtodo presentado es
satisfactoria, la CPFEUM puede verificar parcial o totalmente
la validez del mtodo y adems llevar a cabo un estudio
colaborativo coordinado por la CPFEUM.
5. ACEPTACiN PARA PUBLICACiN
Una vez que la CPFEUM haya dictaminado favorablemente
la aceptacin de la validacin del mtodo analtico, en fimcin
del estudio coJaborativo y de las observaciones recibidas du-
rante la consulta pblica, ste podr ser publicado en la FEillVr.
4. EVALUACiN DEL MTODO
2576 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, dcima edicin.
Tabla 2. Caractersticas de desempeo analtico recomendadas
para la validacin de un mtodo de acuerdo con su categora.
II
Caractersticas de desempeo Categora 1
Cuantitativas Pruebas lmite
Categora III Categora IV
Verificacin del sistema
* *
Precisin del sistema SI SI
Linealidad del sistema SI SI
Especificidad/Selectividad SI SI
Exactitud de mtodo SI SI
Linealidad de mtodo SI SI
Precisin de mtodo SI SI
Lmite de deteccin NO NO
Lmite de cuantificacin NO SI
Tolerancia
* *
Robustez
* *
* Puede ser necesario dependiendo la naturaleza del mtodo.
6. ANEXO A
DISEO DE PLACKET BURMAN PARA ESTUDIOS
DE ROBUSTEZ
Diseo experimental, tambin denominado factorial fraccio-
nado saturado; permite investigar el efecto lineal de 11-1
factores o menos, a partir de n corridas experimentales; don-
de para investigar el efecto de cualquier factor, siempre se
emplean dos niveles (alto y bajo). Estos diseos pueden
ser utilizados en la validacin de mtodos analticos para
investigar la robustez del mtodo a factores, en los cuales la
variacin de los niveles sean de magnitud pequea, pero
deliberada; en trminos de la corrida analtica. Por ejemplo,
supongamos que el pH de la fase mvil (factor), es un factor
a investigar en la robustez del mtodo y, si en la condicin
normal del mtodo, el pH es 5; los posibles niveles a investi-
gar seran 4.8 (nivel bajo) y 5.2 (nivel alto); lo que se podra
considerar como cambios pequeos y deliberados respecto a
5. Tambin sera posible plantear niveles de pH de 4 y 6, los
cuales pueden ser cambios deliberados pero no pequeos a
nivel de la corrida analtica. Otro caso podra ser el porcentaje
de un reactivo (factor) en un mtodo analtico por absorcin
en el intervalo visible; donde ste es necesario para el desa-
rrollo del color y por lo tanto un factor a investigar en la
robustez del mtodo. Si en este mtodo el porcentaje del
reactivo es 2%; los posibles niveles a investigar seran 1.9%
(nivel bajo) y 2.1 % (nivel alto); los cuales se consideraran
como cambios pequeos y deliberados respecto al 2%. Tambin
se podran plantear niveles de 1 % y 3%, que seran cambios
deliberados pero no pequeos a nivel de corrida analtica. Es
importante interpretar el concepto de "cambio pequeo y
6. ANEXO A
* *
NO
*
NO
* *
NO
SI
*
SI
* *
NO
* *
NO
NO SI NO
SI
*
NO
NO
*
NO
* * *
* * *
deliberado en la corrida analtica" por parte del analista que
lleve a cabo el diseo del experimento.
En este texto nicamente se explican los pasos del procedimien-
to del diseo experimental Placket Burman para 8 corridas
analticas, el cual permite investigar la robustez del mtodo
desde 3 factores a 7 factores (para fines prcticos de 3 a 5).
Para un mayor nmero de factores se sugiere consultar cual-
quier libro de diseo de experimentos que incluya este tema.
El procedimiento consiste en los siguientes pasos:
a) Seleccin de los factores a estudiar,
b) Eleccin de los niveles de cada factor,
c) Determinacin de las corridas analticas,
d) Ejecucin de las corridas analticas para generar los re-
sultados,
e) Anlisis de los resultados,
f) Conclusin respecto de la robustez del mtodo analtico.
Seleccin de factores. El analista debe seleccionar entre
3 factores y 5 factores para llevar a cabo el estudio de robus-
tez. Se debe tener evidencia bibliogrfica, experimental, ex-
periencia prctica, entre otras; de que estos factores influyen
de manera importante en la respuesta del mtodo (absorban-
cia, rea bajo la curva, altura de pico, mililitros consumidos,
voltaje, etc.) y por ende en la valoracin, potencia o conteni-
do del ana lito en la muestra. El analista debe asignar a cada
factor cualesquiera de las letras A, B, C, D, E, F o G. Para
asignar los factores a las letras, no es necesario aplicar un
procedimiento en especfico.
Ejemplo: Para el estudio de robustez de un mtodo por cro-
matografa de alta resolucin, se seleccionan los siguientes
factores: pH de la fase mvil (pH), porcentaje de composicin
de un reactivo en la fase mvil (% reactivo), volumen de
inyeccin (volumen), flujo de la fase mvil (flujo) y condi-
ciones del reservoro de la fase mvil, lo que permite esta-
blecer la temperatura de fase mvil. En la siguiente tabla los
factores son asignados a las letras. Las letras no asignadas se
denominan como factor falso. Estos factores en la prctica
son utilizados para estimar el error experimental.
Letra
A
B
C
D
E
F
G
Tabla Al. Factores.
Factor
pH
Factor falso
% de reactivo
Volumen
Factor falso
Flujo
Temperatura de fase mvil
Eleccin de los niveles. Para fijar los niveles de cada factor,
es conveniente utilizar la Tabla A2, en la cual para cada factor
se manejen tres columnas denominadas nivel bajo, nivel
normal y nivel alto. El nivel normal es el valor del factor
reportado y ejecutado en el mtodo analtico, lo que comn-
mente se dice como condiciones normales de operacin. La
seleccin de los niveles bajo (-) y alto (+) deben ser fijados
bajo el concepto de "cmnbios pequeFios y deliberados".
Tambin es posible que por cuestiones experimentales, el
nivel normal del factor pueda ser utilizado como nivel bajo o
alto o se investiguen grandes cambios.
No es necesario incluir aquellas filas asignadas a factores
falsos, como se observa en la Tabla A3.
Determinacin de las corridas. Las corridas analticas son
determinadas auxilindose de la denominada matriz de
tratamientos (Tabla A4).
Letra
A
B
e
D
E
F
G
Tabla A2. Formato para fijar los
niveles de cada factor.
Factor
Nivel
Bajo (-) Normal Alto (+)
Validacin de mtodos analticos 2577
Tabla A3. Eleccin de niveles.
Letra Factor
Nivel
Bajo (-) Normal Alto (+)
A pH 5.8 6 6.2
e % de reactivo 9.5 10 10.5
D Volumen (/lL) 45 SO SS
F Flujo (mLlmin) 0.75 0.80 0.85
G Temperatura Baja Ambiente Ambiente
de fase mvil
Nota: a nivel prctico, la temperatura baja de la fase
mvil se consigue vaciando hielo al reservoro.
Tabla A 4. Matriz de tratamientos.
Corrida
Nivel del factor
analtica
A B C D E F G
+ + + +
2
+ + + +
3
+ + + +
4
+ + + +
S
+ + + +
6
+ + + +
7
+ + + +
8
Ejemplo: Considerando los niveles de los factores y la matriz de
tratamientos, se fijan las condiciones de las ocho corridas anal-
ticas y se establece la matriz para este caso (Ver Tabla AS):
Corrida 1: 6.2 de pH, 9.5 % del reactivo, 55 ~ l de volumen
de inyeccin, 0.85 mL/min de velocidad de flujo
y temperatura ambiente de la fase mvil.
Corrida 2: 6.2 de pH, 9.5 % del reactivo, 45 /lL de volumen
de inyeccin, 0.75 mL/min de velocidad de flujo
y temperatura ambiente de la fase mvil.
Corrida 3: 6.2 de pH, 10.5 % del reactivo, 45 /lL de volu-
men de inyeccin, 0.85 mL/min de velocidad de
flujo y temperatura baja de la fase mvil (hielo
en el reservorio de la fase mvil).
Corrida 4: 5.8 de pH, 10.5 % del reactivo, 55 /lL de volu-
men de inyeccin, 0.75 mL/min de velocidad de
flujo y temperatura ambiente de la fase mvil.
Corrida 5: 6.2 de pH, 10.5 % del reactivo, 55 /lL de volu-
men de inyeccin, 0.75 mL/min de velocidad de
flujo y temperatura baja de la fase mvil (hielo
en el reservorio de la fase mvil).
Corrida 6: 5.8 de pH, 9.5 % del reactivo, 55 /lL de volumen
de inyeccin, 0.85 mL/min de velocidad de flujo
y temperatura baja de la fase mvil (hielo en el
reservorio de la fase mvil).
6. ANEXO A
:1
:!
"
'1
2578 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, dcima edicin.
Corrida 7: 5.8 de pR, 10.5 % del reactivo, 45 )lL de volu-
men de inyeccin, 0.85 mL/min de velocidad de
flujo y temperatura ambiente de la fase mvil.
Corrida 8: 5.8 de pR, 9.5 % del reactivo, 45 )lL de volumen
de inyeccin, 0.75 mL/min de velocidad de flujo
y temperatura baja de la fase mvil (hielo en el
reservorio de la fase mvil).
Corri-
da
A
aoal-
tica pH
6.2
2 6.2
3 6.2
4 5.8
5 6.2
6 5.8
7 5.8
8 5.8
Tabla AS. Corridas analticas.
B C
Fac-
% de
tor
reactivo
falso
09.5
+ 09.5
+ 10.5
+ 10.5
10.5
+ 09.5
10.5
09.5
Nivel del factor
D
Volu-
meo
CI1L)
55
45
45
55
55
55
45
45
E F G
. Tempera-
Factor FluJo t d
f I (LI') ura e
a so ,m mm fase mvil
+
+
+
+
0.85
0.75
0.85
0.75
0.75
0.85
0.85
0.75
Ambiente
Ambiente
Baja
Ambiente
Baja
Baja
Ambiente
Baja
Ejecucin de las corridas y resultados. Un analista debe
ejecutar las ocho corridas analticas bajo un orden previa-
mente establecido, siendo esencial que las corridas sean in-
dependientes. Se debe emplear para todas las corridas la
misma muestra homognea, manteniendo constantes todas
las otras condiciones establecidas en el mtodo (materiales,
equipos, reactivos, soluciones, etc.). Los resultados pueden
ser reportados utilizando el formato mostrado en el ejemplo
de la Tabla A6, donde y es el resultado del contenido, valo-
racin o potencia del analito en la muestra segn el mtodo.
Ejemplo: Los resultados del estudio de robustez del mtodo
analtico de cromatografa de lquidos de alta resolucin se
l. Clculo de los contrastes de cada factor y de los factores
falsos:
C
F
= YI + Y3 + Y6 + Y7 - (Y2 + Y4 + Y
s
+ Ys)
2. Clculo de la suma de cuadrados de cada factor.
La suma de cuadrados de cada factor se calcula con la si-
guiente ecuacin:
SC = C2
C 8
Donde:
C = Cada uno de los factores.
3. Clculo de la suma de cuadrados del error y la media de
cuadrados del error.
La suma de cuadrados del error, se calcula al sumar las SC
de todos los factores falsos.
SC = C2
e 8
informan en la Tabla A 7: Donde:
Tabla A6. Resultados del estudio de robustez.
Corrida
Nivel del factor
analtica
A B C D E F G
Respuesta
1 + + + +
YI
2 + + + +
Y2
3 + + + +
Y3
4 + + + +
Y4
5 + + + +
Ys
6 + + + +
Y6
7 + + + +
Y7
8
Ys
Anlisis de resultados. El anlisis de los resultados con-
siste en:
6. ANEXO A
i = Cada factor falso.
La media de cuadrados del error se calcula con la siguiente
ecuacin:
Donde:
MC = SC
e
e f
f= Nmero de factores falsos.
4. Clculo de la Fea! para cada factor.
Para cada factor se calcula su Fea!, con la siguiente ecuacin:
MCe.
F ---'
cal - MC
e
Validacin de mtodos analticos 2579
Tabla A 7. Resultados de los estudios de robustez del mtodo analtico
por cromatografia de lquidos de alta resolucin.
Nivel del factor
2
3
4
5
6
7
8
A
pH
6.2
6.2
6.2
5.8
6.2
5.8
5.8
5.8
B
Factor
falso
+
+
+
+
e D
% de Volumen
reactivo (eL)
09.5 55
09.5 45
10.5 45
10.5 55
10.5 55
09.5 55
10.5 45
09.5 45
En estc caso SC C = MC c , dado que a cada uno de los
factores le corresponde un solo grado de libertad.
5. toma de decisin respecto al efecto de cada factor.
La toma de decisin respecto al efecto de cada factor, se
basa en la siguiente regla:
Si F cal;;::: F 1. gl e se presenta efccto del factor.
Si F cal < F l. gl e no se presenta efecto del factor.
Ver Tabla 1 Valores crticos de la Distribucin t de Stu-
dent, F de Fisher y Ji Cuadrada, del captulo Estadstica
para ensayos biolgicos.
Ejemplo: Con base en los resultados:
l. Resultados del clculo de los contrastes de cada factor
y de los factores falsos.
CA - (828313 + 745.26 +68l.37 + 842.78) - = 103.09
- (865.82 + 755.62 + 739.54 + 633.47)
C
s
- (745.26 + 681.37 + 865.82 + 755.62) - = 4.15
- (828313 + 842.78 + 739.54 + 633.47)
Cc - (68l.37 + 865.82 + 842.78 + 739.54) - = 167.03
- (828313 + 745.26 + 755.62 + 633.47)
C
D
= (828313 + 865.82 + 842.78 + 755.62) -
= 492.71
(745.26 + 68l.37 + 739.54 + 633.47)
CE
= (745.26 + 842.78 + 755.62 + 739.54) -
= 74.41
(828313 + 681.37 + 865.82 + 633.47)
C
F
= (828313 + 681.37 + 755.62 + 739.54)-
= -82.67
(745.26 + 865.82 + 842.78 + 633.47)
E F G
Y
(mg de analito/g
Factor Flujo Temperatura de
de producto)
falso
+
+
+
+
(mL/min) fase mvil
0.85 Ambiente 828313
0.75 Ambiente 745.26
0.85 Baja 681.37
0.75 Ambiente 865.82
0.75 Baja 842.78
0.85 Baja 755.62
0.85 Ambiente 739.54
0.75 Baja 633.47
C - (828313 + 7A5.26 + 865.82 + 739.54) - =265.51
G - (681.37 + 842.78 + 755.62 + 633.47)
2. Resultados de los clculos de la suma de cuadrados de
cada factor.
1328.44351
se = 167.03
2
= 3487.37761
Ce 8
429.71
2
= 30345.39301
8
se = (-82.67)2 = 854.29111
CI' 8
SC = (265.51) 2 = 8811.94501
Ce 8
3. Resultados del clculo de la suma de cuadrados del
error y la media de cuadrados del error.
sc = 4.15
2
+ 74.1
2
=694.258825
e 8 8
MC
e
= 694.258825 = 347.129413
2
4. Resultados de los clculos de la Fea! para cada factor.
Letra/Factor
A/pH
C/% de reacti vo
D/volumen
Flflujo
G/temperatura de fase mvil
Fcal
MeA/MC
e
= 3.83
MCe/MC
e
= 10.05
MCo/MC
e
= 87.42
MC
F
/MC
e
= 2.46
MCo/MC
e
= 25.39
5. Toma de decisin respecto al efecto de cada factor.
6. ANEXO A
2580 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, dcima edicin.
Factor F
eal Fo.o5 1. 2
Decisin
pH 03.83 No se presenta efecto
% de reactivo 10.05 N o se presenta efecto
Volumen 87.42 Se presenta efecto
Flujo 02.46 No se presenta efecto
Temperatura de
la fase mvil 25.39 18351 Se presenta efecto
Conclusiones. Considerando el anlisis de los resultados,
el mtodo se considera robusto respecto al factor investi-
gado, si la toma de decisin indica que ste no presenta
efect,?; por lo que el mtodo proporcionar resultados
estadsticamente equivalentes, dentro de los niveles inves-
tigados del factor. Por lo tanto, es importante informar el
intervalo de operacin o ej ecucin del factor, donde
se obtendrn resultados similares al aplicar el mtodo ana-
ltico. Si se presenta efecto del factor, el mtodo analtico
no es robsto a dicho factor y, por 10 tanto, es importante
6. ANEXO A
informar que el nivel normal de operaClOn o ejecuclOn
para este factor no puede ser modificado, ya que el mto-
do proporcionar resultados incorrectos.
Ejemplo: Considerando el anlisis de resultados en la
siguiente tabla se informa de la robustez del mtodo a los
factores investigados.
Factor Conclusin
pH El mtodo analtico es robusto en el intervalo
6 0.2.
% de El mtodo analtico es robusto en el intervalo
reactivo 10 % 0.5%.
Volumen El mtodo analtico no es robusto, por lo tanto
el volumen de inyeccin siempre debe ser
75 pL.