ANALISIS IMUNOKIMIA

UNTUK DETEKSI
MIKROBA PATOGEN DAN
SENYAWA RACUN
ANALISIS IMUNOKIMIA
UNTUK DETEKSI
MIKROBA PATOGEN DAN
SENYAWA RACUN
Marlia Singgih Wibowo
Sekolah Farmasi-ITB
Senyawa toksik/racun
Erythroxylon coca
Peyote Cactus
Limbah industri
Opium
Mikroba patogen
Food Poisoning
Analisis senyawa toksik/racun
Analisis fisikokimia : misalnya
kromatografi
Analisis kimia : reaksi
warna/ pengendapan
Analisis Imunokimia
Analisis berdasarkan reaksi spesifik antara
Antigen (Ag) dan Antibodi (Ab)
Analisis kualitatif maupun kuantitatif
Penggunaan senyawa label untuk
visualisasi reaksi
Prinsip Reaksi
Reaksi imunologi di dalam mamalia :
Ag
Ab
Reaksi primer
Reaksi
sekunder
Reaksi tersier
(degranulasi,opsonisasi)
(Fiksasi komplemen,
aglutinasi, presipitasi)
Analisis untuk deteksi antigen >>> antigen
sebagai target >>> antigen : berupa
senyawa aktif atau racun yang dimaksud
Bila analisis ditujukan untuk deteksi
antibodi dari racun yang dimaksud >>>
antigen : merupakan pereaksi di dalam kit
Ab dibentuk berdasarkan
Ag yang menginduksinya
Reaksi spesifik antara Antigen (Ag) dan
Antibodi (Ab)
Antigen (antibody generator)
Imunogenik : Senyawa yang dapat
memicu sistem imun mamalia
Antigenik : senyawa yangdapat bereaksi
spesifik dengan antibodi
Syarat : BM tinggi (>5000), struktur kimia
kompleks. (bila BM rendah dapat
dikonjugasi dengan protein carrier agar
bersifat imunogenik)
Bahan yang dapat dianalisis (sebagai
Antigen) dengan metode imunokimia
Mikroba patogen dan
atau toksin mikroba
Toksin tanaman,
hewan
Protein spesifik atau
senyawa lain yang
berstruktur spesifik
Senyawa obat
(narkotik, psikotropik)
Senyawa pestisida
Contoh obat XTC
Antibodi
Hasil reaksi humoral sel B dalam limpa
mamalia
Spesifik terhadap antigen yang
memicunya
Imunoglobulin : IgA, IgD, IgM, IgE, IgG
Struktur IgM dan IgG
IgM
IgG
Visualisasi Reaksi Ag-Ab
SUBSRAT
PRODUK
(dapat
divisualisasi)
Kompleks
Ag-Ab-Label
Senyawa LABEL
Senyawa yang dikonjugasi pada antigen
atau antibodi untuk dapat mem-visualisasi
reaksi Ag-Ab
Dapat berupa enzim, senyawa
berfluoresensi, radioaktif, dll.
Reaksi amplifikasi dapat dilakukan
sehingga dapat diukur secara fisikokimia
Beberapa contoh label
Enzim : Horse radish peroxidase (HRP),
Alkaline Phosphatase
Senyawa berfluoresensi : Fluorescein,
Umbelliferon, Tetrametil rodhamin
Senyawa Luminescence : Luciferin
Partikel : Tanned erythrocyte, Colloidal,
microsphere , gold, silver
Vesikel : liposom
Karakteristik suatu label
untuk analisis imunokimia
Memiliki aktivitas spesifik
Mudah dideteksi
Tidak berbahaya
Aktivitas spesifik label
berhubungan dengan :
Fraksi pada label yang akan digunakan
untuk deteksi
Derajat amplifikasi
Efisiensi deteksi
Syarat Enzim yang ideal
sebagai label
Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km
rendah)
Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral)
Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi
lanjutan atau dalam penyimpanan
Tersedia dalam keadaan murni (high purity)
Harga murah
Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana
Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang
akan diuji
Contoh enzim sebagai label
Enzim dan
sumber
pH optimum Aktiv.spes
(U/mg, 37 C)
BM
Alkalinfosfatase
(usus sapi)
8-10 1000 100.000
-galaktosidase
(E.coli)
6-8 600 540.000
HRP (lobak) 5-7 4500 40.000
Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin
deaminase, invertase, -laktamase, dll.
Metode analisis imunokimia
berdasarkan labelnya
EIA (Enzyme ImmunoAssay)
ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent
Assay)
RIA (Radio ImmunoAssay)
IFA (ImmunoFluorescence Assay)
LIA (Luminescence ImmunoAssay)
Bahan yang diperlukan dalam reaksi Ag-Ab
dalam analisis imunokimia
Antigen
Antibodi
Media penyangga reaksi
Larutan Dapar pelarut
Larutan Dapar pencuci
Senyawa Label
Substrat
Senyawa penghenti reaksi
Instrumen pendeteksi hasil reaksi
Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya
yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan
kedalam sumur pelat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama
waktu tertentu pula (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang
digunakan), lalu ditambahkan larutan pemblok untuk menghindari
ikatan non-spesifik
Larutan antibodi B(anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat
tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk
dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu
Label (misalnya suatu Enzim) ditambahkan sehinggaakan membentuk
kompleks A-B-C-Enz.
Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan
terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan
penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil
pada saat pengukuran.
Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat
spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan
antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi
Radioimmunoassay
ELISA
Sumber kesalahan dalam analisis
imunokimia
Kesalahan
Random/Acak
(imprecision)
Kesalahan
sistemik
(inaccuracy)
Kesalahan acak
Pipeting : masalah desain pipet itu sendiri, cara
menggunakan dan hal teknis dalam penggunaan
pipet (volume yang dikeluarkan, dll)
Pemisahan padatan dari cairan : proses pembtkn
endapan yang tergantung pada waktu,
kecepatan, suhu, dll, pencucian yang tidak
sempurna, dll.
Kondisi Reaksi Biokimia : konstanta
kesetimbangan antibodi, waktu, suhu
Jumlah radioaktif : untuk proses RIA
Intensitas fluoresensi yang terjadi : untuk proses
IFA
Kesalahan spektrofotometrik
Stabilitas pereaksi
Kesalahan sistem
Kesalahan mempipet : masalah kalibrasi
alat, bentuk pipet, dll
Interferensi dalam reaksi : terjadinya
non-specific binding, inhibisi enzim,
pendaran cahaya, adanya pengaruh
enzim endogen, pengaruh obat lain yang
digunakan , pengaruh senyawa endogen
lainnya (bilirubin, dll)
Efek matriks
Deteksi Morfin dengan ELISA
Morfin adalah senyawa alkaloid
Terdapat di dalam Opium (4-21%)
Opium (Papaver somniferum)
Analisis morfin secara kimia telah banyak
dilakukan (reaksi warna, kromatografi, dll)
Deteksi morfin dalam spesimen biologi
cukup sulit karena kadar yang rendah dan
interferensi matriks yang cukup signifikan
Metode analisis berbasis imnokimia dapat
menjadi solusi yang baik untuk deteksi
morfin dalam cairan biologis
Kendala??
Senyawa morfin merupakan senyawa
kimia ber BM rendah : 375,9 sehingga
tidak dapat berperan sebagai antigen
Peran : hapten
Bagaimana caranya agar dapat
dibuat imunogenik?
Konjugasi dengan suatu protein agar
membentuk kompleks yang ber BM besar
Syarat?
Senyawa tersebut harus memiliki gugus
karbonil atau karboksil yang dapat
bereaksi dengan salah satu gugus fungsi
pada protein
MORFIN
7,8, dehidro-4,5-epoksi-17 metilmorfinan-
3,6-diol HCl trihidrat
C
17
H
19
NO
3
.HCl.3H
2
O
BM = 375,9
Pembentukan gugus karboksil pada morfin
dapat dilakukan dengan mereaksikan
morfin dengan natrium kloroasetat dalam
etanol absolut >>> terbentuk gugus
karboksil : karboksimetilmorfin
Gugus karboksil dari morfin dapat
berikatan dengan gugus amin dari protein
(5,6)-7,8-Didehydro-4,5-epoxy-17-methmorphinan-3,6-diol
Reaksi yang terjadi
R + NaOH R-ONa + H2O
R-ONa + Cl-CH2-COO-Na R-OCH2-COO-Na + NaCl
R-O-CH2-COOH + NaCl
HCl
R =
CH3
CH3
CH2-COO-
Bagaimana membuat antibodi?
1. teknologi hibridoma 2. teknologi rekombinan
Teknik lain untuk produksi
antibodi monoklonal
Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi
cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau
murine
Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat
dan ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi
ke dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.
Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam
bakteri, skrining dengan western blot
Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk
menghasilkan antibodi Fab yang murni
Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan
modifikasi fungsi efektor
Apakah genetic immunization?
Genetic immunization adalah suatu teknik imunisasi
dalam produksi antibodi. Teknik ini melibatkan
pemasukan antigen-coding plasmid DNA ke dalam
hewan mencit. Sel hewan selanjutnya memproduksi
protein dari vektor expression, yang menstimulasi
system immune hewan tsb utk memproduksi antibodi
terhadap protein tersebut.
Genetic immunization lebih baik daripada teknik
traditional. DNA dpt diproduksi lebih cepat, murah dan
flexibel daripada protein. Kualitas antibodinya lebih
superior dalam hal specificity, affinity dan
pengenalannya terhadap native protein
Transgenic mice to produce
targetted protein
Gambar ini (courtesy of R. L. Brinster and R. E. Hammer) menunjukkan
transgenic mouse (kanan) dibandingkan dengan yang normal (kiri). The
giant mouse dikembangkan dari telur fertil yang disuntikkan suatu
molekul recombinant DNA yang mengandung structural gene human
growth hormone , suatu gene promoter yang sangat kuat
Beberapa antibodi monoklonal yang
digunakan untuk human medicine
To suppress the immune system
Muromonab-CD3 (OKT3) and two humanized anti-CD3
monoclonals. Bind to the CD3 molecule on the surface of T cells.
Used to prevent acute rejection of organ, e.g., kidney, transplants.
The humanized versions show promise in inhibiting the autoimmune
destruction of beta cells in Type 1 diabetes mellitus.
Infliximab (Remicade). Binds to tumor necrosis factor-alpha (TNF-
). Shows promise against some inflammatory diseases such as
rheumatoid arthritis. (Side-effect: can convert a latent case of
tuberculosis into active disease.)
Omalizumab (Xolair). Binds to IgE thus preventing IgE from
binding to mast cells. Shows promise against allergic asthma.
Daclizumab (Zenapax). Binds to part of the IL-2 receptor
produced at the surface of activated T cells. Used to prevent acute
rejection of transplanted kidneys. Has also showed promise against
T-cell lymphoma.
Antibodi untuk diagnostik
Pada penelitian kanker (analisis biomarker
senyawa kanker)
Drug monitoring
Serodiagnosis penyakit infeksi
Studi proteomik
Molecular & Cellular Proteomics 5:1638-1646, 2006.
Identification of Protein Expression Signatures
Associated with Helicobacter pylori Infection
and Gastric Adenocarcinoma Using
Recombinant Antibody Microarrays*
Peter Ellmark , Johan Ingvarsson , Anders Carlsson , B. Samuel
Lundin , Christer Wingren and Carl A. K. Borrebaeck
Copyright 2006 American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Ellmark, P. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5: 1638-1646
Two-way hierarchical cluster analysis of the infection signature based on the 17 antibodies that
gave significantly different signals from the comparison of N/Hp+ versus N/Hp-
N/Hp+ (green) represents normal tissue from patients that are positive for H. pylori, whereas
N/Hp (blue) represents normal stomach tissue from H. pylori-negative patients. Capital A or C
indicates that the sample is obtained from the antrum (A) or the corpus (C) from the patients.
The numbers indicate individual patients. Red indicates up-regulation, green represents down-
regulation, and black indicates no change.
Clinical Chemistry, 2002;48:121-130
Antigen Microarrays for Serodiagnosis
of Infectious Diseases
Letizia Mezzasoma
1
, Tito Bacarese-Hamilton
1
, Manlio Di Cristina
1
,
Ruggero Rossi
2
, Francesco Bistoni
2
and Andrea Crisanti1a
2
1
Department of Biology, Imperial College of Science, Technology and Medicine,
London SW7 2AZ, United Kingdom.
2
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Universita degli Studi di Perugia,
Via del Giochetto, 006100 Perugia, Italy.
Colored circles indicate the positions where T. gondii, rubella virus,
CMV, HSV1, and HSV2 antigen preparations were printed in
replicate. The array was designed to contain internal calibration
curves generated by printing increasing amounts of purified human
IgG and IgM. Rabbit myosin was printed as negative control.
The fluorophores Alexa 546 and Alexa 594 were also included in
the array (white circle).