Temas de Bacteriologia y Virologia Medica

2006
Universidad de la Repblica | Facultad de Medicina
Sumario
Seccin I. Aspectos generales
Biologa viral Morfologa y estructura bacteriana Fisiologa y metabolismo bacteriano Gentica bacteriana Mtodos de estudio de bacterias y virus. Mtodos diagnsticos Inmunidad contra los agentes infecciosos Interacciones husped-parsito. Flora normal Infecciones de piel y tejidos blandos Infecciones respiratorias Gastroenteritis Infeccin urinaria Bacteriemias, sepsis y endocarditis Infecciones del sistema nervioso central Infecciones de transmisin sexual Infecciones hospitalarias
ISBN 9974-31-194-2
Departamento de Bacteriologa y Virologa Instituto de Higiene
> Temas de
Bacteriologa y Virologa Mdica

> Temas de Bacteriologa y Virologa Mdica
2da edicin corregida
Seccin II. Principales procesos infecciosos
Seccin III. Etiopatogenia microbiolgica
Gnero Staphylococcus Gneros Streptococcus y Enterococcus Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes Principales grupos de bacilos gramnegativos no exigentes Principales grupos de bacilos grampositivos aerobios Bacterias anaerobias Mycobacterias Chlamydia, Mycoplasma y Rickettsia Leptospira Virus respiratorios Retrovirus y VIH Virus de las hepatitis Enterovirus Agentes virales de gastroenteritis. Rotavirus Herpesvirus Agentes de infecciones emergentes, Hantavirus, dengue, BSE Inmunoprolaxis Vacunas Esterilizacin, desinfeccin y antisepsia Principales grupos de antibiticos Principales mecanismos de resistencia antibitica Mtodos de estudio de la sensibilidad antibitica Antivirales
Seccin IV. Control de poblaciones microbianas
Universidad de la Repblica Facultad de Medicina
Departamento de Bacteriologa y Virologa Instituto de Higiene
Sumario
Seccin I. Aspectos generales
Biologa viral Morfologa y estructura bacteriana Fisiologa y metabolismo bacteriano Gentica bacteriana Mtodos de estudio de bacterias y virus. Mtodos diagnsticos Inmunidad contra los agentes infecciosos Interacciones husped-parsito. Flora normal
Seccin II. Principales procesos infecciosos

Infecciones de piel y tejidos blandos Infecciones respiratorias Gastroenteritis Infeccin urinaria Bacteriemias, sepsis y endocarditis Infecciones del sistema nervioso central Infecciones de transmisin sexual Infecciones hospitalarias
Seccin III. Etiopatogenia microbiolgica
Gnero Staphylococcus Gneros Streptococcus y Enterococcus Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes Principales grupos de bacilos gramnegativos no exigentes Principales grupos de bacilos grampositivos aerobios Bacterias anaerobias Mycobacterias Chlamydia, Mycoplasma y Rickettsia Leptospira Virus respiratorios Retrovirus y VIH Virus de las hepatitis Enterovirus Agentes virales de gastroenteritis. Rotavirus Herpesvirus Agentes de infecciones emergentes, Hantavirus, dengue, BSE Inmunoprolaxis Vacunas Esterilizacin, desinfeccin y antisepsia Principales grupos de antibiticos Principales mecanismos de resistencia antibitica Mtodos de estudio de la sensibilidad antibitica Antivirales
Seccin IV. Control de poblaciones microbianas
Universidad de la Repblica Facultad de Medicina
ISBN 9974-31-194-2
TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA
SECCIN
Aspectos generales
1. Biologa viral 2. Morfologa y estructura bacteriana 3. Fisiologa y metabolismo bacteriano 4. Gentica bacteriana 5. Mtodos de estudio de bacterias y virus. Mtodos diagnsticos 6. Mecanismos defensivos del husped contra los agentes infecciosos 7. Interacciones husped parsito. Flora normal
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Biologa viral
Juan R. Arbiza
Introduccin
Hasta fines del siglo XIX se haba avanzado en la etiologa de muchas enfermedades infecciosas, sin embargo, quedaban muchas enfermedades en el hombre, animales y plantas en las cuales no se identificaba un microorganismo causal. En el siglo XX se descubrieron los virus como causantes de enfermedades infecciosas para las cuales no se haba encontrado una bacteria, un hongo o un protozoario como responsable. Fue el desarrollo de nuevas tcnicas como los cultivos celulares, el avance en la microscopa y el advenimiento, a fines del siglo XX, de tcnicas de biologa molecular que han permitido aislar e identificar los virus; adems han permitido un avance extraordinario en el conocimiento molecular de la biologa de los mismos. Sin embargo, los virlogos tienen un doble desafo para el futuro: controlar los virus que ya se conocen, para los cuales no existen frmacos o vacunas efectivas hasta el momento y; aislar, identificar, caracterizar y controlar los virus emergentes o reemergentes (virus de la inmunodeficiencia humana, Ebola, Hantavirus, etc.).
Caractersticas generales
Las primeras caractersticas que diferenciaron a los virus de otros microorganismos fueron: el tamao, estimado por su capacidad de atravesar filtros que retienen a las bacterias y la incapacidad para reproducirse en medios biolgicos inertes como medios de cultivo para bacterias, requiriendo para su propagacin de animales o cultivos celulares. Hoy se sabe que estas caractersticas no alcanzan para diferenciar a los virus de otros agentes biolgicos, dado que existen bacterias cuyo tamao puede ser similar al de los virus ms grandes y algunas bacterias como Chlamydias y Rickettsias, son parsitos intracelulares obligatorios. La organizacin y composicin de las partculas virales ofrecen caractersticas que los diferencia de otros microorganismos. Los virus poseen un solo tipo de cido nucleico de pequeo tamao con respecto a otros agentes biolgicos, rodeado por una cscara o cpside formada por numerosas copias de una protena o de un nmero limitado de ellas. Algunos grupos de virus presentan por fuera de la cpside una envoltura lipdica de origen celular en la que se insertan glicoprotenas. No presentan sistemas enzimticos propios, por lo tanto no son capaces de replicarse por s solos y requieren de clulas animales, vegetales o bacterias para cumplir su ciclo de reproduccin; esto define su parasitismo celular obligatorio. Este tipo de reproduccin particular que tienen los virus, es la caracterstica que justifica su lugar en la escala biolgica. A diferencia de las clulas, en el momento de su multiplicacin,
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los virus no aumentan de tamao para su posterior divisin, por el contrario, ls partcula viral se desintegra y luego se sintetizan cada uno de sus componentes que se renen por ensamblaje. Esta forma de multiplicacin en la cual se producen rplicas del virus progenitor, es conocida con el nombre de replicacin viral y se diferencia del proceso de divisin celular usado por clulas procariotas y eucariotas. Se pueden citar dos definiciones de virus. La primera propuesta por Lwoff (1957): entidad estrictamente celular y potencialmente patognica con una fase infecciosa. Posee un solo tipo de cido nucleico, es incapaz de crecer y reproducirse por fisin binaria y carecen de enzimas para producir energa. La segunda, pertenece a Luria y Darnell (1967): los virus son entidades cuyo genoma se replica dentro de clulas vivas usando su maquinaria de sntesis. Esto determina la formacin de elementos especializados que permiten la transferencia del genoma viral a otras clulas.
VIROIDES
Son virus simples constituidos por cido ribonucleico (ARN) circular de muy bajo peso molecular, sin cpside protectora. Producen enfermedades hasta el momento conocidos exclusivamente en plantas.
PROVIRUS
El genoma viral se puede integrar al genoma celular por un proceso de recombinacin gentica, directamente en los virus cido desoxirribonucleico (ADN) o previa transcripcin inversa en los virus ARN. El genoma viral integrado al celular recibe el nombre de provirus.
PRIONES
Ciertos agentes causantes de afecciones degenerativas del sistema nervioso central del hombre, han sido clasificados como virus no convencionales, dado que no ha sido posible determinar una estructura similar a virus en el material infectante, ni el tipo de cido nucleico de dichos agentes. Son extremadamente resistentes a sustancias que inactivan los virus comunes. Algunos han propuesto que corresponderan a viroides patgenos del hombre. Los priones han sido descritos en los ltimos aos como causantes de muchas enfermedades del sistema nervioso comentadas anteriormente, principalmente el scrapie en el ganado ovino y la encefalopata espongiforme bovina (BSE) o comnmente conocida como sndrome de la vaca loca. En el hombre seran los agentes relacionados con la enfermedad de CreutzfeldJacob y Kuru. Son estructuralmente ms simples que los virus y estn formados solo por protenas. Cuando se descubrieron, pareca que se poda producir una gran revolucin en el conocimiento de la biologa, porque la idea de que una protena pudiera autorreplicarse sera opuesta al dogma central de que la informacin gentica es transmitida desde el cido nucleico a la protena. El hallazgo de los priones y el avance en el conocimiento de su biologa podrn dilucidar muchas enfermedades an sin resolver. Muchas son las investigaciones que se realizan en estos momentos y las hiptesis propuestas para explicar la biologa y permanencia de estas protenas extremadamente resistentes a sustancias que inactivan a los virus comunes.
Morfologa y estructura de los virus

TAMAO Y FORMA
Existe gran variedad de tamao y forma de los virus hasta hoy estudiados. Se puede obser-
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var un tamao entre 28 nm en los virus ms pequeos denominados picornavirus (pico de pequeo) hasta 300 nm en los virus ms grandes que se conocen como son los poxvirus (ver figura 1). La forma tambin es muy variada, pudindose observar formas icosahdricas o helicoidales en virus que no tiene envoltura por fuera de la cpside, hasta formas esfricas, filamentosa o pleomrficas en los virus con envoltura o muy complejos como el virus de la rabia (ver figuras 2 y 6).
ESTRUCTURA
Como ya se mencion la estructura de un virus est basada en su simplicidad, a pesar de esto existe cierta diversidad que es usada para la clasificacin de estos microorganismos. Virus desnudos La estructura de los virus ms simples est compuesta por un solo tipo de cido nucleico (ADN o ARN) rodeado de una cscara proteica que se denomina cpside (del griego capsa que significa caja). De la reunin de las subunidades proteicas codificadas por el genoma viral, que se ensamblan segn principios geomtricos, se forman diferentes tipos de simetras (icosahdrica o helicoidal). (Ver figura 2 y 3b) Esta estructura bsica de cido nucleico y cpside recibe el nombre de nucleocpside y constituye en los virus desnudos la partcula viral completa o virus. Esta se diferencia del trmino virin que es usado para las partculas virales o virus potencialmente infecciosas. Cuando se observa al microscopio electrnico una cpside viral, pueden observarse es-
E. coli Poxvirus
Rhabdovirus
Herpesvirus
Adenovirus
Parvovirus 1000 nm Fig. 1

Figura 1.
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A- Icosahedro desnudo B. Helicoidal desnudo
Figura 2.
C. Icosahedro envuelto
nucleocpside nucleocpside
protmeros (protena) capsmeros (protena)
D. Helicoidal envuelto
cido nucleico espculas (glicoprotenas) envoltorio (protenas y lpidos)
tructuras morfolgicas denominadas capsmeros que resultan de la unin por enlaces de las subunidades proteicas. La forma de distribucin de los capsmeros as como el nmero de ellos depende de cada tipo de virus. Virus envueltos La estructura de las partculas virales de los virus denominados envueltos, est formada adems de la nucleocpside por una envoltura de origen celular que la rodea (ver figuras 2 y 3a). Dicha envoltura se obtiene en el proceso de liberacin por gemacin (brotamiento) como se esquematiza en la figura 4. En sta se insertan glicoprotenas de origen viral que reciben el nombre de espculas o glicoprotenas de superficie y que tienen un papel importante de reconocimiento de receptores especficos de la superficie celular, en el paso inicial de relacin con la clula husped para la multiplicacin viral. cidos nucleicos El cido nucleico que lleva la informacin gentica y que constituye el genoma viral puede tener varias formas. Como ya se mencion, una partcula viral tiene en su estructura un solo tipo de cido nucleico (ADN o ARN), pero la forma de estos puede ser de doble o simple
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Figura 3.
a)
b)
cadena, segmentado o no, circular o lineal, determinando una gran diversidad de utilidad en la taxonoma viral (ver figura 5). En la figura 6 se representa un cuadro con los principales virus animales, con sus diferentes estructuras (con envoltura o sin ella, con simetra helicoidal o icosahdrica) y la composicin del cido nucleico. Estas dos caractersticas se combinan de diferentes maneras para determinar varios grupos de virus.
Multiplicacin viral
Una partcula viral puede encontrarse en dos estados: activa o inactiva. Para demostrar el estado inactivo basta incluir una suspensin de virus en un medio de cultivo y observar que son incapaces de cumplir actividades metablicas necesarias para su multiplicacin. Se deduce de ello, que los virus carecen como ya se mencion anteriormente de maquinaria enzimtica que les permita autorreplicarse, an cuando se les brinde nutrientes que seran adecuados para la propagacin de las bacterias ms exigentes. Pero si una partcula viral es incorporada a clulas vivas sensibles, se comporta en forma activa y por lo tanto tomar el comando de la maquinaria enzimtica de la clula husped, logrando as su replicacin.
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Virion
Figura 4.
Membrana Plasmtica
Protena vrica
Nucleocpside
RNA a) a)
Simple cadena
DNA
Simple cadena
Figura 5.
b)
Doble cadena
b)
Doble cadena
c)
Doble cadena fragmentado
c)
Circular (simple y doble cadena)
La multiplicacin de los virus animales, vegetales y bacterifagos es similar en sus principios pero, cada una de ellas tiene sus particularidades. Esto se basa principalmente en las diferencias entre las clulas que infectan. El desarrollo del conocimiento sobre la multiplicacin de los virus animales ha sido posible por el uso (en el laboratorio) de muchos sistemas de aislamiento de virus en los cuales se puede estudiar el proceso de multiplicacin viral. En un principio fueron animales y huevos embrionados los sistemas ms usados, pero actualmente se han sustituido por cultivos celulares que ha favorecido el conocimiento de las etapas de la multiplicacin viral. Existe gran variedad de cultivos de clulas, cultivos primarios o lneas celulares que pueden ser subcultivadas indefinidamente. Dichas lneas se asemejan mucho a las clulas transformadas debido a su gran potencial de crecimiento y a su aneuploida. Habitualmente se las usa para aislar virus, pero no se recomiendan para la produccin de vacunas virales humanas, dado que los virus propagados en esas lneas pueden adquirir caractersticas genticas oncognicas. Los cultivos primarios resultan de la dispersin de clulas diploides de un tejido, por digestin enzimtica de la sustancia intercelular; tambin son poco recomendadas para la produccin de vacunas, ya que pueden tener virus latentes propios de la especie de la que provienen. Los embriones de gallina y sus anexos siguen siendo muy usados porque ofrecen diferentes
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Figura 6.
tipos celulares a los que se puede llegar por diferentes vas (intraamnitica, intraalantoidea, en saco de yema, etc.).
INFECCIN VIRAL
La infeccin viral puede ser productiva o, en oposicin abortiva. Esta ltima cumple un ciclo incompleto en el que no se forman partculas virales infecciosas. Una infeccin productiva culmina con la generacin de una progenie viral infecciosa; este proceso requiere una serie de pasos o etapas que son diferentes en los distintos tipos de virus. Las etapas fundamentales de la infeccin viral son: adsorcin, penetracin, denudacin, eclipse, replicacin, maduracin y liberacin. Adsorcin Intervienen muchos factores. En principio existe una atraccin por fuerzas inicas. A pH neutro, los virus y las clulas tienen cargas negativas, por lo tanto son necesarios iones positivos;
ENVUELTOS
DESNUDOS
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Figura 7.
a) Fusin
b) Viropexis
Cell
Cell
dicho requerimiento lo cumple los iones de magnesio. Otro factor importante en esta etapa es la interaccin de sitios especficos de la partcula viral con receptores celulares especficos. Esto determina la especificidad de algunos virus para crecer en clulas de origen especfico; por ejemplo: el virus de la poliomielitis solo puede crecer en clulas humanas y de primates. Otros virus presentan estructuras en su superficie que les permiten cumplir con esta etapa de forma muy especializada. Estas son glicoprotenas que reconocen receptores celulares especficos. Hoy se pueden aislar esos elementos como complejos virus y clula. Luego de adsorbidos a una clula, los virus pueden ser recuperados conservando sus caracteres de partcula libre potencialmente infectante. Los poliovirus pueden ser separados de las clulas con soluciones salinas a altas concentraciones o con detergentes; los mixovirus (virus de la gripe) que usan tambin una estructura especializada, se separan de las clulas huspedes por accin de la neuraminidasa. Penetracin La penetracin de los virus una vez adsorbidos, puede realizarse de diferentes maneras, por: viropexis, penetracin o fusin (ver figura 7).
Viropexis
Es un proceso de fagocitosis, en el que se produce una invaginacin de la membrana plasmtica; as el virus queda englobado en una vescula dentro del citoplasma celular. Es el mecanismo ms comn de penetracin de los virus.
Penetracin
En algunos virus, la penetracin acontece por simple cruce de la membrana plasmtica; as la partcula viral queda directamente incluida en el citoplasma.
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Fusin
Otro tipo de penetracin se da por fusin de la envoltura viral con la membrana plasmtica. Tambin en este caso el virus es directamente incorporado al citoplasma. Denudacin y eclipse En esta etapa el virus se desintegra, dejando libre su cido nucleico que comanda su propia replicacin, adems de la sntesis de las protenas necesarias para integrar nuevas partculas. La manera en la que un virus pierde la cpside y su envoltura (si la tiene), es caracterstico de cada grupo viral. En los poliovirus parece existir una integracin con los constituyentes celulares tales como los receptores. En otros virus como los poxvirus y los reovirus el proceso es ms complejo. Los poxvirus pierden parte de su envoltura en las vacuolas fagocticas, mientras que un ARN mensajero (ARNm) es sintetizado por una transcriptasa que termina con la produccin de una enzima nueva que completa la denudacin. Los reovirus penetran en los lisosomas donde las enzimas proteolticas eliminan la cpside y promueven la transcripcin del genoma. Los fenmenos descritos (adsorcin, penetracin y denudacin) finalizan con la desintegracin de las partculas virales, pero no siempre el proceso progresa hasta la replicacin viral. Si interrumpimos el ciclo en esta etapa llamada eclipse, el cido nucleico liberado de sus envolturas puede recobrarse por disrupcin de la clula husped, pero habra perdido su capacidad de infectar (algunos autores opinan que an puede recobrarse intacto). Si el proceso normal contina, comienza la replicacin del cido nucleico y la sntesis de las protenas estructurales y no estructurales necesarias para la produccin de virus. Replicacin del cido nucleico La replicacin es un fenmeno muy heterogneo porque existe mucha variedad de cidos nucleicos de origen viral; se recordar que los hay de ADN y de ARN de una o dos hebras, segmentados o no, etc. Siempre el genoma viral es el elemento capaz de gobernar su autorreplicacin y de trasmitir la informacin estructural y funcional a la progenie resultante de una infeccin. No obstante la diversidad sealada, en la replicacin intervienen elementos comunes que vale la pena destacar tales como la formacin de un ARNm capaz de traducir en el ribosoma celular las protenas codificadas por el genoma viral. Adems, sea cual sea el cido nucleico, siempre se diferencian dos conjuntos de genes, los precoces y los tardos. Los primeros seran los encargados de codificar protenas necesarias para la copia de la molcula de cido nucleico y, los tardos seran los encargados de codificar las protenas estructurales y las protenas para el ensamblaje. La replicacin puede producirse en el ncleo o en el citoplasma de la clula, eso depender del tipo de cido nucleico que constituye el genoma viral. Los virus que contienen ARN se replican en el citoplasma, mientras que los que tienen ADN se replican en el ncleo; excepto el virus de la viruela que, aunque son virus ADN, su replicacin se realiza en el citoplasma. Los virus ADN sintetizan por medio de una polimerasa, ARNm que pasa al citoplasma donde se producir la sntesis proteica; de estas protenas algunas tienen funciones estructurales y formarn los capsmeros que al unirse entre s constituirn la cpside. Otras protenas tendrn funciones enzimticas, de polmeros y se introducirn en el cido nucleico promoviendo la replicacin del ADN viral. El tipo de replicacin es semiconservadora y los intermediarios replicativos, sern lineales o cclicos dependiendo si la molcula de ADN es lineal o cclica respectivamente. Como ejemplo de virus ADN podemos citar al grupo de los herpesvirus, quienes pierden la
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cpside en el citoplasma y penetran al ncleo iniciando la replicacin del cido nucleico. Hay sntesis de ARNm inducidos por el virus, enzimas relacionadas a la sntesis y fragmentacin del ADN. Los pasos biosintticos descritos pueden relacionarse con el desarrollo de cuerpos de inclusin nucleares y la formacin de partculas virales. Los virus ARN tienen un inters especial por la diversidad de formas de replicacin que presentan; esto depende de que el ARN pueda actuar como mensajero, denominado de polaridad positiva. De lo contrario, al ARN que posea la secuencia de bases complementarias a las del ARNm se le denomina de polaridad negativa. Cuando consideramos un ARN con polaridad positiva, ste acta como mensajero entrando en el ribosoma celular e iniciando una traduccin de polimerasas, necesarias para iniciar la replicacin del cido nucleico. Luego actuar la parte tarda del ARN traduciendo protenas para la formacin de la cpside y ensamblaje de la partcula viral. Un ejemplo de este tipo de replicacin son los poliovirus, que tienen como genoma un ARN de hebra nica con cido poliadenlico en un extremo. Dicho cido sirve inicialmente como molcula de ARNm para la sntesis de replicasa de ARN, producindose el intermediario replicativo de ARN, til para la sntesis de molculas de ARN virales de los descendientes. La replicacin del ARN viral es independiente de las sntesis de ADN de la clula husped. Por el contrario, si el ARN es de polaridad negativa, la molcula no tiene funcin mensajera y por lo tanto sintetiza una molcula complementaria a la original con funcin mensajera, que entra al ribosoma. En este grupo de virus aparece un nuevo concepto en la estructura viral porque, para sintetizar una copia se necesita una transcriptasa ARN dependiente que no se encuentra en las clulas. Por consiguiente, en estos virus adems del genoma y las protenas estructurales, son sintetizadas otras protenas que luego sern incorporadas a la partcula viral. Maduracin y liberacin Hay virus cuya nica cubierta es la cpside, virus desnudos, en oposicin a los que poseen envoltura por fuera de la cpside, virus envueltos. Es conveniente considerarlos por separado en esta etapa, que es la finalizacin de la formacin de una progenie viral. Para los virus desnudos, el fenmeno de maduracin consiste en la unin de los capsmeros para formar la cpside y la posterior unin de esta con el genoma. Parece existir una diferencia en la maduracin de este grupo de virus dependiendo si el cido nucleico del genoma es ADN o ARN. Para los primeros, la sntesis del ADN se realiza con anticipacin a la aparicin de los elementos estructurales, mientras que para los segundos, se ha demostrado con aminocidos radioactivos que las cadenas polipeptdicas se renen rpidamente en capsmeros y stos en cpside. Adems se destaca que existe concordancia con la sntesis de la molcula de ARN. La liberacin en este grupo de virus depende mucho del tipo de virus y de las caractersticas de la clula husped. Los poliovirus son liberados rpidamente de las clulas HeLa o HEp-2; dicha liberacin se realiza por rotura de vacuolas superficiales. En los virus ADN que maduran en el ncleo, el tiempo de liberacin es mayor que en el ejemplo anterior, porque la liberacin se produce por autolisis celular. En los virus con envoltura, la maduracin es ms compleja (ver figura 4). Adems de la unin del cido nucleico con la cpside, el virus debe rodearse de la envoltura. Luego de haberse formado la cspide, la partcula se aproxima a la membrana plasmtica y se produce la evaginacin de la membrana y luego el desprendimiento del brote. El brotamiento puede ser explicado por relacin entre las protenas de la membrana plasmtica y la nucleocpsi-
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de. Generalmente, la liberacin de la partcula se produce al finalizar el brotamiento de la membrana celular.

ALTERACIONES CELULARES PRODUCIDAS POR INFECCIN VIRAL
Las clulas pueden responder de diferentes formas ante una infeccin viral: sin alteracin aparente; con efecto citoptico, es decir muerte de la clula por lisis celular e hiperplasia, como en los poxvirus o; solo con hiperplasia, como en la transformacin viral en clulas malignas. Efecto citoptico El efecto citoptico consiste en alteraciones morfolgicas de las clulas, que resultan en la muerte celular. Este efecto es diferente dependiendo el tipo de virus. En cultivos infectados con adenovirus, las clulas se redondean y se agrupan como un racimo de uvas. En cambio, las clulas infectadas con poliovirus tambin se redondean pero se retraen y se lisan liberando muchos virus. El virus sincicial respiratorio, produce fusin de las membranas celulares, originando grandes sincicios. Cuerpos de inclusin Los cuerpos de inclusin son acmulos intracelualres de material nuevo. Algunos se producen por acumulacin de viriones o de subunidades virales no reunidas. Estos cuerpos de inclusin pueden romper la estructura celular o cambiar la funcin y producir la muerte celular. Otros corpsculos pueden desarrollarse en lugares donde existe sntesis viral, pero no tienen viriones detectables; por ejemplo los corpsculos eosinfilos intranucleares en las clulas infectadas por virus del herpes simple. Transformacin celular Algunos virus son productores de tumores o de leucemia. Pueden presentar muchos efectos en las clulas: estimulacin de la sntesis de ADN celular (virus del polioma); alteraciones de la superficie evidenciadas por especificidades antignicas nuevas (distintas de aquellas pertenecientes a las subunidades de los viriones); aberraciones cromosmicas y alteraciones del crecimiento celular. Este cambio de una clula normal a una maligna, ha sido llamado transformacin.
Bibliografa
Davis B, Dulbecco R, Ginsberg H. Microbiologia. San Pablo, Brasil Harper and Row, 3ra ed. 1985. Fields B, Knipe D. Virology. New York. Raven Press,2nd ed.. 1990. Joklik WK, Willett HP , Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiologa. 20 ed. BsAs. Panamericana; 1994.
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Morfologa y estructura bacteriana

M. Prez, M. Mota
Introduccin e importancia del tema

En las ltimas dcadas se han hecho importantes avances en el estudio de la ultraestructura bacteriana, logrndose una identificacin bioqumica de muchas fracciones subcelulares; estos avances han permitido ubicar a las bacterias en el reino Procaryotae. El conocimiento de las diferentes estructuras y composicin ha permitido comprender como muchas bacterias se relacionan con el hombre, ya sea como integrantes de la flora normal o como agresoras para el mismo. El descubrimiento de que muchas estructuras bacterianas bien identificadas son inmungenos importantes, permiti el desarrollo de vacunas que han sido verdaderos avances en la medicina de los ltimos aos. Ejemplo de ello son las vacunas contra microorganismos causantes de meningoencefalitis supurada como Haemophilus influenzae tipo b y Neisseria meningitidis (meningococo) A, B y C. El conocimiento de la composicin bioqumica de las diferentes estructuras bacterianas, junto al conocimiento del metabolismo bacteriano, permite hoy la comprensin del mecanismo de accin de los diferentes antibiticos. Recientemente, los avances de la gentica bacteriana hicieron posible el desarrollo de tcnicas de biologa molecular con aplicaciones a nivel de la investigacin cientfica y el diagnstico. La observacin al microscopio ptico con distintas coloraciones y de los cultivos bacterianos, tienen un rol importante en la identificacin de las bacterias y su ubicacin taxonmica.
Definicin y ubicacin taxonmica

Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisin binaria. La mayora son de vida libre, a excepcin de algunas que son de vida intracelular obligada, como Chlamydias y Rickettsias. Tienen los mecanismos productores de energa y el material gentico necesarios para su desarrollo y crecimiento. Las bacterias integran el reino procariota (pro de primitivo y cariota de ncleo). Todos los organismos vivos se pueden dividir en dos tipos celulares: eucariotas y procariotas. Tienen estructuras en comn como la membrana celular, los ribosomas encargados de la sntesis proteica y el cido desoxirribonucleico (ADN) portador de la informacin gentica.
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Los organismos multicelulares, animales y plantas, estn constituidos por clulas eucariotas (eu de verdadero). Los protistas, los hongos y las algas que se organizan de forma unicelular, multicelular o en colonias (como los protistas), tambin poseen clulas eucariotas. Dentro de este esquema, las bacterias son microorganismos unicelulares procariotas. En este reino, segn criterios evolutivos, diferenciamos el grupo de las eubacterias y el de las arqueobacterias. Este ltimo comprende bacterias sin peptidoglicano como las anaerobias que viven en condiciones cidas calientes, las que viven en condiciones salinas y las que reducen el anhdrido carbnico (CO2) a metano. Por lo tanto stas viven en las profundidades del mar, en las aguas saladas y en las fuentes cidas. Las eubacterias, en cambio, viven en el suelo, el agua y los organismos vivos; entre ellas se encuentran las bacterias de inters mdico, las bacterias verdes fotosintetizadoras, las cianobacterias o algas verdeazules y las bacterias prpuras fotosintetizadoras. A continuacin nos referiremos a las eubacterias simplemente como bacterias. Como caracterstica principal, los procariotas no poseen compartimientos intracelulares delimitados por membranas, por lo que carecen de membrana nuclear, a diferencia de los eucariotas. Tambin es importante destacar que el ADN procariota es circular y cerrado, mientras que el eucariota se organiza en cromosomas individuales y se asocia a protenas de tipo histonas. Las bacterias poseen una pared celular compuesta por peptidoglicano (a excepcin de los Mycoplasmas) mientras que las clulas eucariotas no tienen este tipo de pared (la pared celular de los vegetales es de celulosa). La reproduccin en los eucariotas puede ser tanto sexuada como asexuada, mientras que los procariotas se reproducen por divisin simple (forma asexuada). El tamao de la clula eucariota es mayor que el de la procariota. Los procariotas no poseen citoesqueleto, a diferencia de los eucariotas. Otra diferencia es la presencia de fimbrias o pilis en las bacterias. Los procariotas pueden poseer flagelos, mientras que los de los eucariotas si los poseen, stos tienen una estructura ms compleja. Por ltimo mencionar que mientras las clulas eucariotas se reproducen por mitosis, las clulas procariotas lo hacen por fisin binaria. En dicho proceso la clula crece, se forma un tabique y finalmente se desprenden dos clulas nuevas. En este proceso se produce tambin la replicacin del ADN, de forma que las clulas hijas contienen cada una un duplicado idntico del genoma de la progenitora.
TAMAO
El tamao de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 m, pudiendo llegar en algunos tipos a 10 m. Las bacterias de inters mdico tienen un tamao entre 0.4 y 2 m. Solo son visibles entonces, al microscopio ptico o microscopio electrnico. Para observarlas con el microscopio ptico se usa el objetivo de inmersin (100X), sumergiendo esta lente en una gota de aceite (aceite de inmersin) en el preparado a observar. A modo comparativo, una clula eucariota mide ms de 5 m (un eritrocito tiene un dimetro de 7m), mientras que un reovirus mide menos de 0.1m. Su tamao pequeo determina una relacin entre la superficie y el volumen elevada, con alta tasa metablica.
MORFOLOGA
Microscpica La forma de las bacterias al microscopio est determinada por la rigidez de su pared celular. Bsicamente, se diferencian segn su forma en cocos (esfricas u ovaladas), bacilos (cilndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas ltimas se encuentran: Treponema, Borrelia y Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varan en el nmero de vueltas,
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Figura 2. Morfologa: 1. cocos; 2. diplococo; 3. cocos en cadenas; 4. cocos en racimos; 5. cocos en tetradas; 6. cocobacilos; 7. bacilos; 8. bacilos bordes redondeados; 9. bacilos bordes rectos; 10. bacilos fusiformes; 11, 12. bacilos curvos; 13 al 15. espiroquetas
desde pocas (Borrelia) a muchas (Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras despus de la divisin celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si el plano de divisin es nico, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena (microorganismos del gnero Streptococcus). Si los planos de divisin son muchos, los cocos pueden agruparse en ttradas o en racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras chinas (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio cholerae). La morfologa bacteriana debe ser observada con el microscopio ptico o el microscopio electrnico, dado el tamao pequeo de estos microorganismos. El ms usado en el laboratorio es el microscopio ptico de campo claro, pero existen otros como el microscopio ptico de campo oscuro en los que los organismos aparecen brillantes en fondo oscuro. Este microscopio permite la visualizacin de bacterias difciles de colorear como el Treponema pallidum, agente de la sfilis. Las bacterias pueden observarse sin tincin (examen en fresco) si se las coloca en glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el ndice de refraccin o con tincin usando distintas coloraciones que mejoran su visualizacin ya que son clulas incoloras. Dichas tinciones se basan en la afinidad que presentan los colorantes por las estructuras bacterianas. Los colorantes catinicos por ejemplo, son atrados por los componentes de carga negativa como los cidos nucleicos y los polisacridos. Ejemplo de este tipo son: el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
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El examen en fresco no es el ms usado para observar la morfologa bacteriana porque las bacterias tienen citoplasma incoloro y su ndice de refraccin no difiere mucho del vidrio y del agua. Con esta tcnica se puede verificar la existencia de bacterias y evidenciar su capacidad para moverse. El examen en fresco tambin puede ser usado con tcnicas especiales como la tincin con tinta china que nos permite determinar la presencia de cpsula rodeando la bacteria. Tambin puede usarse en el microscopio de campo oscuro por ejemplo para observar Treponemas o Leptospiras con su movimiento caracterstico. Las coloraciones que se usan para teir los preparados de bacterias, se pueden dividir en: simples, diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo el azul de metileno, nos permiten observar la existencia de bacterias, su morfologa, su agrupacin, la presencia de esporos y la existencia de otros tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo la coloracin de Gram y la de Ziehl Nielseen) adems de lo anterior, permiten la diferenciacin de las bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto segn el microorganismo en cuestin. Las tinciones especiales se usan para objetivar distintas estructuras como la cpsula, el ncleo, los flagelos, los esporos, etc. Antes de la coloracin hay que realizar la preparacin y la fijacin del frotis. La preparacin del frotis consiste en extender homogneamente la muestra (por ejemplo un cultivo bacteriano) o una suspensin de la misma sobre una lmina. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por ejemplo con calor). Con la fijacin del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesin a la lmina y la conservacin de su morfologa. Despus de preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier tipo de coloracin (simple o diferencial). La coloracin de Gram es la ms usada en bacteriologa; debe su nombre a quin la describi en 1884. Es una coloracin diferencial, dado que las bacterias pueden clasificarse segn su respuesta en grampositivas o gramnegativas. Las primeras se tien de color azul violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo. La diferente reaccin de las bacterias a la coloracin de Gram se relaciona con diferencias fundamentales de la envoltura celular de estas dos clases de clulas. En el cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su tiempo de aplicacin y la diferente coloracin que adoptan las bacterias grampositivas y gramnegativas en cada paso de la coloracin de Gram.
Cuadro 1. Tincin de Gram
Solucin Colorante: cristal violeta Mordiente: lugol Decolorante: alcohol acetona Colorante de contraste: safranina Tiempo de aplicacin 30 s 1min 10-15 min 1min Bacterias grampositivas Violeta Violeta Violeta Violeta Bacterias gramnegativas Violeta Violeta Incolora Rosada
Macroscpica La mayora de las bacterias se multiplican rpidamente y son visibles como colonias cuando se las siembra en medios de cultivo slidos adecuados. Requieren una incubacin de aproximadamente 24 horas en una atmsfera que favorezca su desarrollo, a temperatura ptima. Existen excepciones como M. tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a ocho semanas de incubacin.
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Una colonia est constituida por los descendientes de una o unas pocas clulas. Las caractersticas de la colonia tambin dependen de la movilidad de la bacteria. El tamao puede variar desde 0.5 mm (Haemophilus sp. o N. gonorrhoeae) a ms grandes como las enterobacterias. La forma de la colonia puede ser circular (Staphylococcus), irregular o filamentosa (Bacillus). Los bordes pueden ser ondulados (caractersticos de los bacilos largos como Bacillus anthracis), en sierra o dentados (Yersinia pestis) o lisos (por ejemplo Proteus vulgaris o Escherichia coli). La superficie de la colonia tambin es orientadora y puede ser: plana, convexa, mamelonada, umbilicada (S. pneumoniae). En relacin al pigmento que adquieren, ste puede ser: verde (P . aeruginosa), amarillo (S. aureus), grisceo (N. meningitidis). Tambin es diferente el comportamiento frente a la luz: brillante (Streptococcus) u opaca (Staphylococcus). Pueden presentar olores particulares como el frutal de P . aeruginosa o el putrefacto de los anaerobios. Por ltimo hay que destacar la consistencia: mucoide (M), liso (S) o rugoso (R). Las colonias M tienen aspecto acuoso, brillante, propio de las bacterias capsuladas o que forman cubiertas polisacridas como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Los polmeros capsulares pueden ser especficos de grupo y son generalmente antignicos. Entre las bacterias patgenas, las formas capsuladas suelen ser ms virulentas. Por otra parte, las colonias S son de aspecto homogneo, de textura uniforme y son caractersticas de microorganismos de tipo salvaje recientemente aislados de su hbitat natural como las enterobacterias. Las colonias R son de aspecto granulado, en general son cepas mutantes que carecen de protenas o polisacridos de superficie. Las formas R de enterobacterias, por ejemplo, generalmente no son virulentas, en oposicin a la mayor resistencia de las bacterias procedentes de colonias S de tipo salvaje. Un cuarto tipo de colonia es la L y se asocia a la ausencia de la pared celular como resultado de la exposicin a antibiticos; en general estas formas vuelven a sintetizar la pared celular una vez que el frmaco se extrae del medio.
Estructura bacteriana
Las diferentes estructuras bacterianas que observamos (ver figura 2) las podemos dividir, segn sean constantes en las clulas o no, en estructuras permanentes o variables. Dentro de las primeras se destaca: la pared celular, la membrana celular, los ribosomas y el material gentico. Las estructuras variables son: los flagelos, las fimbrias o pilis, la cpsula y los esporos.
Figura 2. Diagrama de la pared bacteriana. Grampositiva a la derecha y gramnegativa a la izquierda
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Estructuras variables, son aquellos que existen en algunas bacterias pero no en todas; un mismo grupo bacteriano o una misma cepa bacteriana las puede presentar o no, dependiendo de las condiciones en donde se desarrolle. Las estructuras variables no resultan esenciales para la vida de la bacteria. Adems podemos clasificar las estructuras bacterianas en internas o citoplsmicas y externas o de la envoltura celular. Dentro de las internas destacamos el material gentico, los ribosomas y los cuerpos de inclusin. La envoltura celular engloba la membrana plasmtica, la pared celular que la recubre, la cpsula y los apndices como fimbrias o pilis y flagelos. Contiene los sitios de transporte para nutrientes, interviene en la relacin husped parsito, es blanco de las reacciones del sistema inmune y puede contener estructuras txicas para el husped.
ESTRUCTURAS INTERNAS O CITOPLASMTICAS
Estn inmersas en el citoplasma, solucin acuosa y viscosa que contiene solutos orgnicos e inorgnicos y elementos especializados como los ribosomas y los cuerpos de inclusin. Material gentico
cido desoxirribonucleico cromosmico
El ADN tanto procariota como eucariota se compone de dos cadenas helicoidales de nucletidos de purina y de pirimidina, unidos entre s por enlaces de hidrgeno, formando una doble hlice segn el modelo de Watson y Crick. Las bacterias no poseen membrana nuclear, nuclolo ni aparato mittico y nunca configuran una masa cromosmica definida. Esto las diferencia de las clulas eucariotas. Aunque no existe un ncleo delimitado, hay una zona nuclear o nucleoide. Su material gentico est constituido por una molcula de ADN circular enrollado sobre s mismo, asociado a protenas bsicas que no constituyen verdaderas histonas.
Plsmidos
Constituyen el material gentico extracromosmico. Estn constituidos por secuencias cortas de ADN circular bicatenario, que pueden existir y replicarse independientemente del ADN cromosmico y son heredados por las clulas hijas. Aunque no son esenciales para la vida de la bacteria, generalmente proveen a sta una ventaja selectiva, por ejemplo: resistencia a los antibiticos, nuevas capacidades metablicas, patognicas (cuando codifican para factores de virulencia como toxinas, etc.) u otras numerosas propiedades. Pueden transferirse de bacteria a bacteria mediante un proceso denominado conjugacin. Ribosomas Libres en el citoplasma, estn compuestos por protenas y cido ribonucleico (ARN); su coeficiente de sedimentacin es de 70S (a diferencia de la clula eucariota que es de 80S) con dos subunidades de 50S y de 30S. Pueden presentarse aislados o como polirribosomas, asociados a ARN mensajero (ARNm) y a ADN cromosmico. Un mismo ARNm puede ser traducido por varios ribosomas simultneamente durante la sntesis proteica. Los ARNm bacterianos difieren en el nmero de protenas para las que codifican. Algunos representan un nico gen (monocistrnicos), otros, la mayora, tienen secuencias que codifican para ms de una protena (policistrnicos). Su funcin es la sntesis proteica y su cantidad aumenta cuando la bacteria crece en medios
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ricos. Su alto contenido de sustancias cidas los hace sensibles a la tincin con colorantes positivos o bsicos como el cristal violeta y el azul de metileno. Cuerpos de inclusin Son grnulos de material orgnico o inorgnico, algunas veces rodeados de membrana. En general funcionan como almacenamiento de compuestos energticos que son usados como fuente de energa (polisacridos, lpidos, polifosfatos). El glucgeno constituye el principal elemento almacenado por las enterobacterias (40% de su peso). Algunas pseudomonas acumulan carbono como cido poli--hidroxibutirato y las micobacterias contienen grnulos de polifosfato. Con frecuencia las inclusiones pueden verse directamente con el microscopio de luz sin tinciones especiales.
ESTRUCTURAS EXTERNAS O DE LA ENVOLTURA CELULAR
Membrana celular Es una estructura vital para la bacteria. Representa una barrera que separa el interior del exterior celular. Consiste en una bicapa lipdica similar a otras membranas biolgicas, compuesta por fosfolpidos anfipticos; no posee esteroles a diferencia de las eucariotas (con la excepcin de los mycoplasmas). La membrana se halla estabilizada por puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas y cationes como el calcio y el magnesio que se combinan con los fosfolpidos cargados negativamente. Insertas en ella se encuentran mltiples protenas transmembrana, que facilitan el transporte de sustancias hidroflicas a travs de sta. Como las bacterias no poseen membranas internas todos los sistemas de fosforilacin, oxidacin y transporte de electrones (citocromos) para la produccin de energa se encuentran a nivel de la membrana celular. Los mesosomas son invaginaciones de la membrana plasmtica que forma vesculas, tbulos o lamelas. Aunque se han investigado durante aos, su funcin exacta an se desconoce; pueden estar involucrados en la formacin de la pared celular durante la divisin celular o en la replicacin del cromosoma y su distribucin a las clulas hijas. Algunos autores consideran que los mesosomas son artefactos generados durante la fijacin qumica de las bacterias para su observacin en el microscopio electrnico. Es necesario realizar ms investigaciones para solucionar esta polmica. La membrana celular cumple la funcin de barrera osmtica, tiene permeabilidad selectiva y permite el ingreso de nutrientes y la salida de desechos por mecanismos de transporte activo y pasivo. En ella se encuentran los sistemas de fosforilacin oxidacin y el transporte de electrones para la produccin de energa; adems tiene las enzimas necesarias para la sntesis de lpidos, de la pared celular (por ejemplo, el bactoprenol), de la cpsula, etc. Finalmente la membrana contiene molculas receptoras especiales que ayudan a las bacterias a detectar y responder a sustancias qumicas del medio externo. Pared celular Ubicada por fuera de la membrana plasmtica, es una estructura vital para las bacterias que la poseen. Los frmacos que bloquean su formacin producen la lisis y muerte de las bacterias susceptibles. Excepto los mycoplasmas todas las bacterias tienen una pared celular que les da forma y las protege de la lisis osmtica. La pared celular de muchos microorganismos patgenos tiene componentes que contribuyen a su patogenicidad. La pared puede proteger a la clula de las sustancias txicas y es el sitio de accin de algunos antibiticos. Despus de que Christian Gram en 1884 desarrollase la tincin que lleva su nombre, se
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comprob que las bacterias podan clasificarse en dos grupos principales, segn su respuesta a esta coloracin. Las bacterias grampositivas se tien de color azul violeta y las gramnegativas adquieren un color rosa o rojo. La diferencia estructural verdadera entre ambos grupos se puso de manifiesto con el desarrollo del microscopio electrnico. La pared de una clula grampositiva est formada por una nica capa homognea de 20 a 80 nm de grosor de peptidoglicano o murena, situada por fuera de la membrana celular. Por el contrario, la pared de la clula gramnegativa es ms compleja; posee una capa de 2 a 7 nm de grosor de peptidoglicano rodeada por una membrana externa. En las microfotografas electrnicas se observa un espacio entre la membrana plasmtica y la externa de las bacterias gramnegativas y, a menudo entre la membrana plasmtica y la pared celular en las grampositivas. Dicho espacio se denomina espacio periplsmico y est ocupado por un gel, el periplasma. El espacio periplsmico de las bacterias gramnegativas contiene muchas protenas que participan en la captacin de nutrientes, por ejemplo enzimas hidrolticas (proteasas, lipasas, fosfatasas, -lactamasas) que convierten las macromolculas en productos ms pequeos que pueden ser metabolizados por la bacteria. El espacio periplsmico contiene tambin enzimas que participan en la sntesis del peptidoglicano y en la modificacin de compuestos txicos que podran lesionar la clula. En especies patgenas, tambin encontramos a ese nivel factores de virulencia como colagenasas, hialuronidasas y proteasas. Es posible que las bacterias grampositivas no tengan un espacio periplsmico visible y secretan enzimas denominadas exoenzimas, que corresponderan a las periplsmicas de las bacterias gramnegativas. El peptidoglicano o murena es un gran polmero compuesto por muchas subunidades idnticas. (Ver figuras 3 Y 4). El polmero contiene dos aminoazcares: N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico; unidos entre s en la posicin 1-4. El esqueleto de este polmero est formado por residuos alternantes de N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico. Una cadena peptdica de cuatro aminocidos D- y L- alternantes est conectada a un grupo carboxilo del cido N-acetilmurmico. Los tetrapptidos de una y otra cadena de peptidoglicano se unen entre s por puentes peptdicos. Existen diferencias en el espesor de esta capa de peptidoglicano. Las bacterias grampositivas tienen una capa gruesa de 0,02 a 0,06m en forma de capas mltiples, mientras que las bacterias gramnegativas y las cido alcohol resistentes tienen una capa fina de peptidoglicano, de 0,01 m aproximadamente. En el momento de la divisin celular se debe formar una nueva pared celular. En la pared de la clula en divisin, enzimas producidas por la misma bacteria (autolisinas), forman como brechas en la vieja pared. (Ver figura 5). Es en esas brechas o aberturas donde se agrega el peptidoglicano de la nueva pared en formacin. A nivel del citoplasma, se forma un precursor o unidad monomrica con uridin-difosfato cido N-acetilmurmico (UDP-N-AcM). Los aminocidos son adheridos secuencialmente al UDP-N-AcM hasta formar una cadena de pentapptidos con dos D-alanina terminales. La segunda etapa en la sntesis de la pared celular se produce en la membrana plasmtica, donde se encuentra el transportador lipdico: bactoprenol. El pentapptido N-acetilmurmico se transfiere desde el UDP al bactoprenol y luego una molcula de N-acetilglucosamina se une al complejo pentapptido N-AcM a travs de este ltimo. El bactoprenol transporta el bloque formado a travs de la membrana plasmtica. Cuando llega al espacio periplsmico estos bloques de disacridos son colocados en las brechas ya formadas y unas enzimas denominadas ligasas unen los monmeros a una cadena de peptigoglicano en crecimiento. El paso final y fundamental para una correcta funcin de
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Figura 3. Estructura del peptidoglicano. Diagrama esquemtico de un segmento de peptidoglicano que muestra las cadenas de polisacridos, cadenas laterales tetrapeptdicas y puentes peptdicos
Figura 4. Entrecruzamientos en el peptidoglucano. Arriba: peptidoglucano de E. coli con enlace directo, tpico de muchas bacterias gramnegativas. Abajo: ppetidoglucano de S. aureus. NAM: N-acetilmurmico; NAG: N-acetilglusamina; Gly: glicina
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la pared es la unin de las cadenas de peptidoglicano entre s. Dicho paso se conoce como transpeptidacin y consiste en la unin de cadenas peptdicas adyacentes, mediante la formacin de una unin peptdica entre una D-alanina de una cadena y una L-lisina o cido diaminopimlico (DAP) de otra cadena. Esta reaccin de entrecruzamiento se hace con la participacin de transpeptidasas tambin denominadas penicilin binding proteins (PBP), ya que son el sitio blanco de accin de la penicilina y otros antibiticos -lactmicos. stos se unen a las PBP impidiendo la transpeptidacin, provocando la lisis osmtica de las bacterias. Esto se producira aparentemente por la semejanza estructural entre la penicilina y el dmero D-ala-ala reconocido por las PBP que hace que en presencia de penicilina, las PBP se confundan y elaboren un complejo penicilina-enzima que resulta letal para la bacteria (en lugar del complejo D-ala-enzima).
Figura 5. Diagrama de la biosntesis del peptidoglucano. PEP , fosfoenolpiruvato; MurNAc y MN, cido N-acetilmurmico; GlcNAc y GN, N-acetilglucosamina; C55, bactoprenol.
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Estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas
La gruesa pared celular de las bacterias grampositivas est constituida principalmente por peptidoglicano. Se cree que sta gruesa capa de peptidoglicano es la determinante de que estas bacterias retengan el cristal violeta de la coloracin de Gram. Sin embargo, estas clulas contienen tambin una gran cantidad de cido teicoico: polisacridos que se unen al cido N-acetilmurmico o a los lpidos de la membrana plasmtica. En este ltimo caso se denomina cido lipoteicoico. Tanto los cidos teicoicos como los lipoteicoicos, tienen la funcin de estabilizar la pared celular. Adems los cidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos microorganismos, porque actan como antgenos de superficie que se unen a receptores especficos en las clulas del husped. La superficie externa del peptidoglicano de las bacterias grampositivas est generalmente cubierta de protenas. Los diferentes grupos de bacterias grampositivas y las diferentes especies difieren en la composicin de sus protenas y de cidos teicoicos; sto es til para la clasificacin serolgica y la identificacin bacteriana.
Estructura de la pared celular de las bacterias gramnegativas
Si observamos la pared de las bacterias gramnegativas al microscopio electrnico podemos observar tres zonas: la membrana plasmtica, el espacio periplsmico que incluye una fina capa de peptigolicano y la membrana externa. Esta ltima, exclusiva de las bacterias gramnegativas, es una bicapa lipdica que difiere de otras membranas por su capa externa, que est constituida por una molcula anfiptica: el lipopolisacrido (LPS) o endotoxina. Adems del LPS, la membrana externa contiene fosfolpidos y protenas que la unen al peptidoglicano. El LPS est constituido por tres partes: el lpido A, el polisacrido central o del core y la cadena lateral O. (Ver figura 6). La regin del lpido A est inmersa en la membrana externa y el resto de la molcula del LPS sobresale de la superficie celular. El core o polisacrido central est unido al lpido A. La cadena O u antgeno O, consiste en unidades repetidas de una subunidad tetrasacrida y es muy variable en su composicin entre las diferentes familias, especies y an dentro de la misma especie de bacterias gramnegativas; en cambio, el polisacrido del core es constante para un mismo gnero bacteriano. El polisacrido O por su variabilidad es usado frecuentemente para la clasificacin serolgica de las bacterias. La mayora de las bacterias sintetizan molculas de LPS con un antgeno O de longitud completa, algunas especies fabrican molculas cortas de antgeno O y otras casi no lo sintetizan. Las formas con poco o ningn antgeno O se conocen como rugosas, en oposicin a las formas lisas productoras de antgeno O de tamao completo. Macroscpicamente se observan como colonias de bordes rugosos (LPS truncado) o colonias lisas (LPS completo). Una de las funciones ms importantes de la membrana externa es servir como barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares, antibiticos y otras sustancias txicas que podran destruir o lesionar la bacteria. La membrana externa es ms permeable que la plasmtica y permite el pasaje de pequeas molculas como glucosa y otros monosacridos. Dicho pasaje se debe a la presencia de porinas, protenas integrales o transmembrana que forman canales estrechos por los cuales pasar molculas menores de 600 a 700 dalton. Molculas mayores como la vitamina B12 pueden atravesar la membrana externa por transportadores especficos. Esta membrana externa previene la prdida de constituyentes como las enzimas periplsmicas. En la figura 7 se esquematiza la estructura de la envoltura de una bacteria grampositiva y de una gramnegativa.
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Figura 6. Estructura del LPS de Salmonella. Abe, abecuosa; Gal, galactosa; Glc, glucosa; GlcN, glucosamina; Hep, h e p t u l o s a ; K D O, 2-ceto-3-desoxioctonato; Man, manosa; NAG, N-acetilglucosamina; P , fosfato; Ra, L-ramnosa.
Fundamento de la coloracin de Gram
Es probable que la diferencia entre las bacterias grampositivas y gramnegativas se deba a la naturaleza fsica de sus paredes celulares. El peptidoglicano no se tie por s mismo, ms bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la prdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloracin las bacterias se tien primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retencin del colorante. En la decoloracin con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; as las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias gramnegativas es muy fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamao. Adems, es posible que le tratamiento con alcohol extraiga suficientes lpidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. Por estos motivos el alcohol elimina ms fcilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gramnegativas.
Funciones de la pared celular
Otorga rigidez y da forma a las bacterias y las protege de la lisis osmtica. Su importancia clnica deriva de su susceptibilidad a la accin de los antibiticos, dado que stos actan
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Figura 7. La estructura de envoltura de un microorganismo grampositivo (izquierda) y un microorganismo gramnegativo (derecha). No se muestran las cpsulas y los apndices ni las protenas de superficie, como la protena M de los etreptococos. Obsrvese la cantidad 20 veces mayor peptidoglicano en el microorganismo grampositivo. La membrana externa de la envoltura del microorganismo gramnegativo muestra molculas de polisacridos del antgeno O cubriendo la capa externa
sobre un blanco que no es propio del hombre y que es vital para la vida bacteriana (poseen toxicidad selectiva). Tambin acta como filtro, impidiendo el ingreso de algunas molculas y permitiendo la entrada de metabolitos imprescindibles y agua. Contiene determinantes patognicos, como el lpido A del LPS y estructuras antignicas que sirven para identificar y clasificar a la bacteria (antgeno O de las enterobacterias o polisacrido C del Streptococcus sp.). Podramos decir entonces, que la pared bacteriana es un gran mosaico de antgenos que son usados en la clasificacin y en la identificacin bacteriana. Tambin antgenos de la pared celular (antgeno O del LPS y protenas de la membrana externa), han sido ensayados como inmungenos en la produccin de vacunas; por ejemplo la vacuna antimeningoccica para el grupo B. La porcin central del LPS o core, que es invariable entre las diferentes bacterias y no es txica, tambin se ha ensayado como inmungeno.
Principales efectos del lipopolisacrido o endotoxina
El LPS es termoestable, resistente incluso a la esterilizacin con autoclave. Su actividad endotxica se asocia al componente lipdico A, liberado cuando la clula se lisa como consecuencia de la fagocitosis o de la accin antibiticos (de ah el nombre de endotoxina). Hoy se sabe que la gravedad del cuadro clnico depende de la cantidad de endotoxina circulante, pudiendo determinar desde un simple cuadro infeccioso con fiebre hasta sepsis, falla multiorgnica y muerte. Pequeas cantidades de endotoxina provocan reacciones de alarma: fiebre, activacin del complemento por la va alternativa, activacin de los macrfagos y estimulacin de linfocitos B. En grandes dosis produce shock e incluso la muerte. Cuatro tipos de clulas constituyen el blanco primario de la endotoxina: los fagocitos
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mononucleares (macrfagos del bazo, de la mdula sea, de los alvolos pulmonares y de la cavidad peritoneal, monocitos de la sangre perifrica y clulas de Kupffer), los neutrfilos, las plaquetas y los linfocitos B. Es probable que stas clulas tengan receptores de endotoxina especficos. La endotoxina tambin acta como pirgeno, por lo tanto causa fiebre cuando se acumula suficiente cantidad de bacterias gramnegativas en los tejidos como para hacer contacto con la circulacin. La fiebre se produce porque la endotoxina induce la liberacin de ciertas protenas conocidas como pirgenos endgenos desde los fagocitos mononucleares. Los mejor conocidos son la interleuquina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF). Las bacterias grampositivas tambin inducen fiebre, pero como carecen de endotoxina, son los componentes de la pared celular los que causan liberacin de la IL-1 y del TNF. La endotoxina activa el complemento por la va alternativa. Esto trae como consecuencia la produccin del complejo de ataque a la membrana, la quimiotaxis de los fagocitos (C5a fundamentalmente) y la opsonizacin (C3b). La activacin del complemento conduce tambin a un aumento de la permeabilidad vascular (mediado por las anafilotoxinas C3a y C5a) y a la liberacin de enzimas lisosmicas desde los neutrfilos (desgranulacin). Todos estos efectos producen la respuesta inflamatoria. La endotoxina activa los macrfagos, es decir los estimula para que aumenten la produccin de enzimas lisosmicas, aceleren la velocidad de la fagocitosis y secreten algunas hidrolasas hacia el medio. La accin de los macrfagos activados incluye la destruccin de ciertas clulas cancerosas, por lo que el estudio de los derivados de endotoxina como potenciales agentes antitumorales es un tema de muchas investigaciones. Cuando se libera la IL-1, la endotoxina induce la divisin de los linfocitos B. Estos maduran a clulas productoras de anticuerpos y aumentan la resistencia a las infecciones por aumento del nivel de anticuerpos. Cuando se administran grandes cantidades de endotoxina, se produce un shock endotxico, con frecuencia letal, que se manifiesta por cada severa de la presin arterial y un fenmeno denominado coagulacin intravascular diseminada (CID), entre otros. El CID es el resultado del depsito de trombos en los vasos de pequeo calibre, con el consiguiente dao en las reas privadas de irrigacin sangunea; el consumo de plaquetas, as como de factores de la coagulacin (II, V y VII) excede la velocidad de produccin la que conduce a hemorragias internas y falla orgnica (fundamentalmente en pulmn, rin e hgado). La endotoxina contribuye a la coagulacin de la sangre de tres formas: activa el factor de Hageman o factor XII de la coagulacin, quien activa la va intrnseca de la coagulacin; provoca la liberacin de grnulos de las plaquetas que estn involucrados en la coagulacin y provoca la liberacin de protenas bsicas de los neutrfilos que estabilizan los cogulos de fibrina. Hoy se cree que los mediadores claves de la hipotensin inducida por la endotoxina son el TNF y la IL-1. Un punto de vista previo sostiene que la cada de la resistencia de los vasos perifricos se debe a la acumulacin de aminas vasoactivas (histamina y quinina). Las bacterias grampositivas no poseen endotoxina, pero pueden producir un cuadro similar al del shock endotxico de las bacterias gramnegativas. Las mismas citoquinas que se liberan ante la presencia del LPS, son liberadas ante la presencia de la pared de las bacterias grampositivas, produciendo los mismos efectos. A la luz de las investigaciones actuales, los fragmentos de peptidoglicano y de cidos teicoicos, juegan un papel semejante al del LPS. Si se inyectan a animales tienen efectos similares a los producidos por la endotoxina de los microorganismos gramnegativos.
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Estructura de la pared celular de las bacterias cido-alcohol resistentes
Nos referiremos como modelo de este grupo al gnero Mycobacterium. Adems del peptidoglicano, la pared celular de las micobacterias tiene muchos glicolpidos como el complejo lipdico arabinogalactano y los cidos miclicos, stos ltimos solo son encontrados en las Mycobacterium y las Corynebacterium spp. Esta gran cantidad de lpidos hace que las bacterias cido alcohol resistentes no se tian o lo hagan mal con la coloracin de Gram. Para teirla, se recurre a coloraciones con fucsina (colorante rojo), con calentamiento del colorante y luego de este procedimiento resisten la decoloracin de una mezcla de alcohol y cido, que constituye la tincin de Ziehl Nielseen. Esta gran cantidad de lpidos de la pared, 10% del total del peso de la micobacteria, la protege de la accin deletrea de los componentes del fagolisoma y, probablemente, sea la razn por la que las micobacterias pueden sobrevivir dentro de los macrfagos. Los componentes de la pared de las micobacterias tambin tienen la capacidad de estimular al sistema inmune, tanto es as que se usa para aumentar la produccin de anticuerpos cuando se inyecta antgenos proteicos, o sea, se usa como adyuvante. El adyuvante de Freund tiene como componente bsico pared de micobacterias. De todo lo expuesto se desprende la importancia del conocimiento de las diferentes paredes celulares de las bacterias (grampositivas, gramnegativas y cido alcohol resistentes) a la hora de estudiar mecanismos de agresin, sensibilidad a los antibiticos, taxonoma, clasificacin bacteriana, identificacin, etc. Cpsula Cuando existe est ubicada por fuera de la pared celular. Las bacterias producen material capsular que, cuando se asocia ntimamente a la superficie celular recibe el nombre de cpsula. Si su adherencia es dbil y de grosor variable, se conoce como limo. Generalmente es de naturaleza polisacrida (a excepcin de la cpsula del Bacillus anthracis que es peptdica). No es una estructura vital para la clula, su prdida no se relaciona con la prdida de viabilidad celular, pero s con cambios de la morfologa colonial y con la prdida de la virulencia bacteriana. La virulencia de algunos patgenos se correlaciona con la presencia de cpsula, como por ejemplo: Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b. La cpsula protege a la bacteria de la fagocitosis, principal mecanismo de defensa que pone en juego el husped ante la presencia de bacterias capsuladas. Una respuesta efectiva para defenderse de este tipo de bacterias implica la produccin de anticuerpos que se unan especficamente a la cpsula facilitando la opsonizacin y la fagocitosis. De su capacidad antignica se desprende el uso de la cpsula para la produccin de diferentes vacunas que estimulan la formacin de anticuerpos especficos. Ejemplos de ellas son las vacunas: anti neumoccica, anti Haemophilus influenzae tipo b y anti meningoccica A, B y C. Las bacterias que producen cpsula forman en los medios slidos colonias acuosas, mucoide (M) o lisas (S), en cambio, las cepas rugosas (R) no producen cpsula. La prdida de la capacidad de formar cpsula por mutacin S a R se correlaciona con la prdida de la virulencia y el aumento de la susceptibilidad a la destruccin por los fagocitos; aunque no afecta la viabilidad. Muchas cepas bacterianas producen cpsula o limo cuando son aisladas en cultivo por primera vez a partir de un husped. Con los reaislamientos sucesivos, dejan de producirla, lo que indicara que la presencia de la cpsula no ofrece ventaja selectiva in
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vitro. Su produccin est regulada genticamente, de forma que las bacterias la presentan cuando es necesaria para la supervivencia dentro del husped. La presencia de cpsulas tambin se puede demostrar por tincin negativa con tinta china. La tinta china no penetra la cpsula pero delimita un contorno refringente alrededor del cuerpo bacteriano en un fondo oscuro. Los antgenos capsulares son muy tiles en la clasificacin e identificacin de diferentes bacterias, por ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, etc. Fimbrias o pilis Son estructuras filamentosas, proteicas, que se diferencian de los flagelos por su dimetro (menor a 8 nm) y por no poseer estructura helicoidal; no cumplen funciones de movilidad. Son estructuras variables, no vitales para las bacterias que las poseen. Los pili comunes cumplen funciones de adherencia a receptores especficos y superficiales, esto es importante en las especies de relevancia clnica porque median la adherencia de muchas bacterias a determinados epitelios, jugando un papel fundamental en la colonizacin. Por ejemplo, las cepas de Neisseria gonorrohoeae patgenas son aquellas que poseen fimbrias que se adhieren especficamente al epitelio uretral del hombre o al epitelio del crvix uterino de la mujer. Las cepas de E. coli capaces de causar infeccin urinaria tienen fimbrias que les permiten adherirse especficamente al epitelio del aparato urinario. Tambin la E. coli enteropatgena (EPEC) tiene fimbrias que le permiten adherirse al epitelio intestinal para luego producir los cambios que determinarn la diarrea. Existen otras estructuras llamadas pilis sexuales que son ms largos y poca cantidad (dos o tres por clula). Estos intervienen en el intercambio gentico entre bacterias, de all su nombre. El apareamiento de dos bacterias y la transferencia de ADN a travs del pili sexual se conoce como conjugacin. Se transfiere material gentico de una clula donadora (que posee un plsmido F que codifica el pili sexual, entre otras cosas) a una receptora. En general el material transferido es un plsmido o una porcin de cromosoma movilizada por un plsmido. Una vez unidas las bacterias los pilis sexuales se retraen, permitiendo que las clulas se unan y pase el ADN de la donadora a la receptora, formndose una verdadera unin (puente) entre las membranas de las clulas para el pasaje del ADN. La clula receptora est estrechamente emparentada con la donadora y posee un receptor especfico para los pilis sexuales. Flagelos y filamentos axiales Los flagelos son filamentos proteicos, helicoidales, delgados y rgidos, de longitud y dimetro uniforme, responsables de la movilidad de la bacteria. Los flagelos son tan delgados que no pueden observarse directamente con un microscopio de campo claro, deben teirse con tcnicas especiales para aumentar su grosor. La estructura detallada de un flagelo puede verse solo con el microscopio electrnico; as es que se ha demostrado que el flagelo bacteriano est compuesto de tres partes: el filamento, el gancho y el cuerpo basal. El primero sobresale de la superficie de la bacteria y se une a ese nivel con el gancho, que est fijo al cuerpo basal. ste ltimo est anclado en la membrana plasmtica y est compuesto por un cilindro y dos o ms juegos de anillos contiguos a la membrana plasmtica, el peptidoglicano y, en las bacterias gramnegativas, a la membrana externa (ver figura 8). El filamento tiene forma de hlice rgida y la bacteria se mueve cuando sta gira, como las hlices de un barco. La direccin de la rotacin flagelar determina la naturaleza del movimiento bacteriano: la rotacin de los flagelos en direccin contraria a las agujas del reloj
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Figura 8. Esquema comparativo de la estructura del flagelo en gramnegativas
permite el movimiento de avance, mientras que la rotacin en el sentido de las agujas del reloj hace que las clulas den vueltas. Los flagelos pueden variar en nmero, desde uno a cientos. Las especies bacterianas difieren por sus modelos de distribucin de flagelos. Las monotricas (trichous: pelo) tienen un solo flagelo que si se sita en un extremo de la bacteria y se denomina polar. Las bacterias anfitricas (amphi: en ambos lados) tienen un flagelo en cada polo bacteriano. En cambio, las lofotricas (lopho: mechn) poseen un grupo o penacho de flagelos en uno o ambos extremos. Por ltimo, en las bacterias peritricas (peri: alrededor), los flagelos se distribuyen uniformemente en toda la superficie bacteriana. Los modelos de distribucin de los flagelos son tiles para identificar a las bacterias. Los flagelos no son necesarios para la vida bacteriana. Su sntesis est regulada por las necesidades nutricionales o el estado energtico y ocurre por la adicin de monmeros de flagelina al extremo distal de los flagelos en crecimiento. La sntesis del filamento es un ejemplo excelente de autoensamblaje, es decir que la informacin necesaria para construir el filamento est en la propia estructura de la subunidad de flagelina; no colaboran enzimas especiales u otros factores. Las bacterias flageladas pueden buscar nutrientes o evitar los txicos siguiendo los gradientes; la funcin flagelar se debe a respuestas quimiotcticas y la energa para el movimiento proviene de una corriente de protones. La movilidad y, por lo tanto, la presencia de flagelos, constituye un factor de virulencia. El antgeno flagelar recibe el nombre de antgeno H. Las bacterias flageladas reaccionan con antisueros especficos para flagelos, provocando una aglutinacin tpica. Las espiroquetas (Treponemas, Leptospiras y Borrelias) se mueven en onda helicoidal; dicho movimiento les permite penetrar en medios viscosos. Estas bacterias tienen filamentos axiales que no se extienden de un polo a otro de la clula, sino que se originan en polos opuestos y se superponen en el centro de la clula, sin presentar conexiones entre s.
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ESPOROS
Algunas bacterias grampositivas pueden formar una estructura especial inactiva de resistencia, denominada endospora o espora. Se desarrollan dentro de clulas bacterianas vegetativas (por eso la denominacin de endospora) de los gneros Bacillus y Clostridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales estresantes como el calor, la desecacin, la radiacin ultravioleta, los cidos y los desinfectantes qumicos. Debido a su resistencia y al hecho de que varias especies de bacterias formadoras de esporas son agentes patgenos peligrosos, las esporas tienen gran importancia en microbiologa alimentaria, industrial y mdica. El conocimiento de estas formas altamente resistentes al calor (pueden sobrevivir a la coccin durante una o ms horas) fue esencial para el desarrollo de mtodos adecuados de esterilizacin para medicamentos, alimentos, medios de cultivo microbiolgicos, etc. En el ambiente las endosporas permiten la supervivencia de las bacterias cuando la humedad o los nutrientes son escasos. Se pueden observar con el microscopio ptico y electrnico. Como las esporas son impermeables a la mayora de los colorantes, se observan como reas incoloras dentro de las clulas coloreadas. Existen adems coloraciones especiales para teir los esporos. La situacin de la espora en la clula madre o esporangio, es caracterstica para una especie bacteriana determinada, siendo esto importante para la identificacin de la bacteria. Las esporas pueden estar en el centro de la bacteria (C. perfringens), prxima a un extremo o subterminal (C. botulinum) o en el extremo, terminales (C. tetani). A veces la espora es tan grande que deforma el esporangio (C. botulinum). Dentro de una clula vegetativa se produce una espora nica, que se diferencia de la clula madre en su morfologa y composicin, en el aumento de la resistencia a los ambientes adversos y en la ausencia de actividad metablica evidente. El proceso incluye la formacin de numerosas cubiertas y la captacin de calcio con sntesis de cido dipicolnico. Al final de la esporulacin queda una partcula deshidratada que contiene ADN genmico. Ese ADN se vuelve resistente a la desecacin, al calor extremo, a la radiacin y al ataque por la mayora de las enzimas y agentes qumicos. Pueden permanecer en esta forma por aos o convertirse nuevamente en la forma vegetativa idntica a la que les dio origen; este proceso recibe el nombre de germinacin de la espora. La germinacin se produce por el calentamiento suave o la presencia de nutrientes determinados; la espora capta agua, se hincha, se desprenden sus cubiertas y se forma la clula vegetativa idntica a la original. El ciclo vital de una bacteria productora de esporos se ilustra en la figura 9. La estructura de la espora es compleja y se distinguen de afuera hacia adentro: el exosporio, capa delicada y delgada; la cubierta, compuesta por muchas capas de protenas, puede ser gruesa; la corteza, constituida por peptidoglicano modificado, con menos enlaces que en la clula vegetativa, puede ocupar la mitad del volumen celular; la pared celular de la espora rodeando al protoplasto y el protoplasto, conteniendo las estructuras celulares normales como ribosomas y un nucleoide. An no se ha determinado por que la espora es tan resistente al calor y otros agentes letales. El 15% del peso seco de la espora consiste en cido dipicolnico que forma complejos con iones de calcio. Quiz el complejo dipicolinato clcico estabilice los cidos nucleicos de las esporas. Recientemente se han descubierto en endosporas, protenas pequeas, solubles en cido que se unen especficamente al ADN, lo saturan y lo protegen del calor, la radiacin, la desecacin y las sustancias qumicas. La deshidratacin del protoplasto parece ser muy importante en la resistencia al calor. La corteza puede eliminar osmticamente el agua del protoplasto y proteger as a la clula del calor y la radiacin. En resumen, la resistencia
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Figura 9. Esquema del proceso de esporulacin
al calor de las endosporas se produce por: estabilizacin del ADN por dipicolinato clcico y protenas solubles en cido, deshidratacin del protoplasto y mayor estabilidad de las protenas celulares en bacterias adaptadas a crecer a temperaturas elevadas, entre otras. La formacin de esporas, esporognesis o esporulacin, comienza cuando cesa el crecimiento debido a una falta de nutrientes. Los cambios que ocurren durante la esporulacin son el resultado del cese de la funcin de ciertos genes vegetativos y de la expresin de nuevos genes. La formacin de esporos se regula negativamente: la clula elabora un represor; a partir de algn componente del medio, que impide la iniciacin de la esporulacin. Cuando este compuesto se agota, se libera la inhibicin y se inicia la esporulacin. El factor especfico que regula la iniciacin de la esporulacin es el trifosfato de guanosina (GTP). La disminucin del pool de GTP es suficiente para iniciar la esporulacin en algunas especies bacterianas estudiadas. La transformacin de esporas inactivas en clulas vegetativas es casi tan compleja como la esporulacin. Se producen tres fases: activacin, germinacin y crecimiento. La primera es un proceso reversible que se produce generalmente por calentamiento o por sustancias qumicas. Una endospora no germinar satisfactoriamente, incluso en un medio rico en nutrientes, si no ha sido activada. En la germinacin termina el estado de reposo de la espora. Es un proceso irreversible desencadenado por la exposicin del esporo activado a algunos nutrientes y otros estimulantes (alanina, otros aminocidos, nuclesidos y glucosa). Se caracteriza por hinchazn de la espora, rotura o absorcin de la cubierta de sta, prdida de la resistencia al calor y otros factores estresantes, prdida de la refractariedad, liberacin de los componentes de la espora y aumento de la actividad metablica. Por ltimo, en el crecimiento, el protoplasto de la espora sintetiza nuevos componentes, emerge a partir de los restos de la cubierta de la espora y se transforma nuevamente en una bacteria activa.
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Bibliografa
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Fisiologa y metabolismo bacteriano

G. Varela, G. Grotiuz
Las bacterias son los organismos ms pequeos que tienen la maquinaria requerida para el crecimiento y la replicacin. Estn compuestas, como las clulas eucariotas, por protenas, polisacridos, lpidos, cidos nucleicos, entre otros. Estas macro-molculas pueden formar parte de estructuras celulares ms complejas, como la pared celular y la membrana plasmtica. El crecimiento bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la clula. Es un proceso complejo que supone la replicacin de todas las estructuras y componentes celulares a partir de nutrientes exgenos. El conocimiento de la fisiologa y del metabolismo bacteriano tiene algunas aplicaciones prcticas. En principio permite conocer el modo de vida y el hbitat de diferentes especies bacterianas. El ser humano actuando como husped, ofrece una variedad de nichos ecolgicos que se diferencian entre s por aspectos fsicos y qumicos (temperatura, concentracin de oxgeno, pH, presin osmtica, etc.), en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas especies bacterianas segn sus requerimientos nutricionales, ambientales y atmosfricos. Adems, permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificacin de los patgenos participantes. Desde un enfoque teraputico, nos permite conocer y entender el modo de accin de algunos antibiticos que bloquean una va metablica o la sntesis de alguna macromolcula esencial para la bacteria. El trmino metabolismo se refiere al conjunto de reacciones qumicas que se producen en la clula y tiene tres funciones especficas. La primera es obtener energa qumica del entorno y almacenarla, para luego usarla en diferentes funciones celulares. La segunda es convertir los nutrientes exgenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la clula bacteriana. Y la tercer funcin es formar y degradar molculas necesarias para cumplir funciones celulares especficas, por ejemplo: movilidad y captacin de nutrientes. El metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas enzimticamente y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la clula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo y resulta en la produccin de nuevo material celular; tambin se denomina biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energa o para convertirlos en unidades precursoras de la biosntesis, se conoce como catabolismo. As, hemos visto dos tipos de transformaciones qumicas que ocurren simultneamente en la bacteria, por lo tanto el metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones.
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Las catablicas resultan en la liberacin de la energa qumica contenida en los nutrientes, mientras que las anablicas la consumen. Por lo tanto, la energa liberada como resultado de las reacciones de oxidacin reduccin del catabolismo, debe ser almacenada y transportada de alguna manera. Una de ellas es como compuestos con uniones fosfato de alta energa; dichos compuestos luego se usan como intermediarios en la conversin de la energa conservada en trabajo til. El compuesto fosfato de alta energa ms importante en los seres vivos es el trifosfato de adenosina (ATP). ste se genera en la clula bacteriana por dos procesos diferentes: fosforilacin a nivel del substrato y fosforilacin oxidativa.
Metabolismo productor de energa

En los seres vivos, la utilizacin de la energa potencial contenida en los nutrientes se produce por reacciones de oxidacin reduccin. Qumicamente la oxidacin esta definida por la prdida de electrones y, la reduccin por la ganancia de los mismos. En bioqumica, estas reacciones frecuentemente incluyen tambin la transferencia de tomos enteros de hidrgeno, por lo tanto se conocen con el nombre de reacciones de deshidrogenacin. En las reacciones de este tipo hay sustancias que ceden electrones (dadoras) y otras que los aceptan (aceptoras). En las bacterias de inters mdico los sistemas de oxidacin reduccin transforman la energa qumica de los nutrientes en una forma biolgicamente til; dichos procesos incluyen la fermentacin y la respiracin. En la primera, tanto la molcula dadora como la aceptora de electrones, son compuestos orgnicos. En cambio, en la respiracin hay un aceptor final exgeno, que cuando es el oxgeno se denomina respiracin aerobia y cuando es un compuesto inorgnico, respiracin anaerobia.
FERMENTACIN
En sta los electrones pasan del dador, un intermediario formado durante la degradacin del substrato, hacia un aceptor constituido por algn otro intermediario orgnico tambin generado durante el catabolismo del substrato inicial. Por lo tanto, este proceso de oxidacin reduccin no requiere el aporte exgeno de un aceptor final de electrones. Aunque hay distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidacin parcial de los tomos de carbono del substrato inicial y liberan, por lo tanto una pequea parte de la energa potencial contenida (Ver figura 1). El rendimiento energtico de este proceso es menor que el de la respiracin. En las bacterias se encuentran las tres vas centrales del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono: la glucoltica o de Embden Meyerhof Parnas, la de pentosa fosfato o shunt de las pentosas y la de Entner-Doudoroff. La va glucoltica que degrada la glucosa se divide en tres etapas principales. La primera es preparativa, con reacciones que no son de oxidacin reduccin, sin liberacin de energa y con formacin de dos intermediarios de tres tomos de carbono cada uno. En la segunda etapa, s ocurren reacciones de oxidacin reduccin con liberacin de energa, formacin de ATP por fosforilacin a nivel del substrato (el ATP se genera en un paso enzimtico especfico) y produccin de dos molculas de piruvato. En la tercer etapa, nuevamente ocurren reacciones de oxidacin reduccin y se generan los productos finales de la fermentacin, que varan segn la bacteria en cuestin. Solo una pequea parte de la energa libre que potencialmente puede derivar de la degradacin de una molcula de glucosa queda disponible por esta va, dado que los productos finales son compuestos en los que el carbono se encuentra todava en estado reducido.
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Figura 1. Rol central del piruvato en las fermentaciones
Por cada molcula de glucosa que entra a esta va, se forman cuatro molculas de ATP y como se consumen dos en la primer etapa, el balance neto es de dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa fermentada. El destino final del metabolito clave, el piruvato, depende de los procesos empleados para la regeneracin del dinucletido de nicotinamida adenina (NAD) a partir del dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADH) y as mantener el equilibrio de oxidacin reduccin. Aunque la va glucoltica es la ms importante en las clulas eucariotas y procariotas, no es la nica. La va de las pentosas es una ruta multifuncional para la degradacin de hexosas, pentosas y otros hidratos de carbono. Para los fermentadores heterolcticos es la principal fuente productora de energa, aunque la mayora de las bacterias usan esta va como fuente de dinucletido de nicotinamida adenina fosfato reducido (NADPH) y de pentosas para la sntesis de nucletidos. La va de Entner-Doudoroff es la ruta principal para la degradacin de la glucosa en las bacterias aerobias estrictas como Neisseria y Pseudomonas. Como sucede en la va de las pentosas, aqu solo se produce una molcula de ATP por molcula de glucosa degradada. El cido pirvico derivado de la glucosa, es un compuesto clave en el metabolismo fermentador de los hidratos de carbono. En su formacin, el NAD es reducido a NADH y ste
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debe oxidarse nuevamente a NAD para alcanzar el equilibrio final de oxidacin reduccin. Las bacterias se diferencian de las clulas eucariotas por la forma en que eliminan el piruvato; en las bacterias la oxidacin incompleta es la regla y se acumula gran cantidad de metabolitos finales de la fermentacin. El estudio y el conocimiento de las fermentaciones bacterianas tiene importancia prctica, porque proporciona productos industriales que son tiles en el laboratorio para identificar las diferentes especies. Entonces, segn los productos finales, tenemos diferentes tipos de fermentacin: alcohlica, homolctica, heterolctica, del cido propinico, cido mixta, de butanodiol y del cido butrico. Fermentacin alcohlica Es el tipo de fermentacin ms antigua que se conoce. Produce etanol a partir de glucosa. Aunque ciertas bacterias producen alcohol, ste es elaborado por otras vas. Fermentacin homolctica Todos los miembros del gnero Streptococcus, Pediococcus y muchas especies de Lactobacillus fermentan la glucosa fundamentalmente a cido lctico con poca acumulacin de otros productos finales. En esta reaccin el piruvato se reduce a cido lctico por accin de la enzima lctico deshidrogenasa, actuando el NADH como dador de electrones. Esto ocurre en la tercer etapa de la va glucoltica. Fermentacin heterolctica En este tipo de fermentacin solo la mitad de la glucosa se convierte en cido lctico, el resto se transforma en una mezcla de anhdrido carbnico (CO2), cido frmico, cido actico, etc. En esta fermentacin se emplea fundamentalmente la va de las pentosas y se produce en las bacterias del gnero Leuconostoc y Lactobacillus. Fermentacin del cido propinico Es caracterstica de algunas bacterias anaerobias como el Propionibacterium (bacilo grampositivo, no esporulado). Este tipo de fermentacin tiene la ventaja de que genera una molcula ms de ATP . Fermentacin cido mixta Es caracterstica de la mayora de las enterobacterias. Bacterias como Shigella, Salmonella y E. coli fermentan las hexosas a travs del piruvato a cido lctico, cido actico, cido succnico y cido frmico. Fermentacin de butanodiol Varias bacterias como Enterobacter, Serratia y Bacillus producen 2,3-butanodiol durante la fermentacin de la glucosa. Este deriva de la condensacin de dos molculas de piruvato en una molcula neutra de acetona que luego es reducida a 2,3-butanodiol. Fermentacin del cido butrico Se ve en bacterias del gnero Clostridium (bacilo grampositivo, anaerobio y esporulado). Si bien hasta ahora nos hemos referido solo a la fermentacin de hidratos de carbono como procedimiento para obtener energa, debemos destacar que otros compuestos orgnicos pueden ser fermentados, por ejemplo: aminocidos (alanina, glicina). En Clostridium proteolticos, la fermentacin de aminocidos ms caracterstica es la reaccin de Stickland.
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Anteriormente hemos discutido el metabolismo de los hidratos de carbono en ausencia de un aceptor externo de electrones y hemos visto que solo una pequea parte de la energa potencial contenida en el substrato es liberada. Esto se debe a que la diferencia entre los potenciales de oxidacin reduccin entre la molcula dadora inicial y la aceptora final es muy pequea. Otras bacterias tienen la capacidad de oxidar completamente el substrato inicial a CO2 por el proceso conocido como respiracin.
RESPIRACIN
Es el proceso por el cual un substrato es oxidado completamente a CO2 y agua, con participacin de una cadena de electrones ubicada en la membrana plasmtica, en la cual el aceptor final es el oxgeno molecular u otro compuesto inorgnico (nitratos, sulfatos, anhidrido carbnico, etc.)anaerobia. Los primeros pasos en la respiracin de la glucosa son idnticos a los de la gluclisis, pero mientras en esta ltima el piruvato es convertido en productos finales de la fermentacin (cido lctico, cido propinico, etc.), en la respiracin es oxidado completamente a CO2 mediante el ciclo de Krebs (ver figura 2). Por cada molcula de piruvato oxidada en este ciclo, se generan tres molculas de CO2. Al igual que en la fermentacin, los electrones generados en el ciclo de Krebs, pasan a coenzimas que tienen NAD. Sin embargo, en la respiracin aerobia, los electrones del NADH son transferidos al oxgeno para regenerar NAD a travs de un sistema transportador, en lugar de cederlos al piruvato.
SISTEMAS TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Y GENERACIN DE TRIFOSFATO DE ADENOSINA
Estos sistemas estn compuestos por transportadores (carriers) de electrones, asociados a la membrana plasmtica y tienen dos funciones bsicas: aceptar electrones de un donador y cederlos a un aceptor y conservar energa liberada durante ese transporte en forma de ATP por fosforilacin oxidativa. Existen varios tipos de enzimas de oxidacin reduccin y protenas transportadoras de electrones, entre los que se destacan las NAD-deshidrogenasas, las flavoprotenas y los citocromos. Las flavoprotenas contienen un derivado de la riboflavina como grupo prosttico que se reduce y se oxida alternativamente. La riboflavina, conocida como vitamina B2, es necesaria como factor de crecimiento por algunas bacterias. Los citocromos son protenas que tienen anillos porfirnicos con hierro y tambin se oxidan y se reducen alternativamente. Hay diferentes tipos de citocromos que se distinguen por sus potenciales de reduccin. Se los designa con letras a, b, c, etc. Tambin estn las quinonas, sustancias liposolubles relacionadas con la vitamina K, que participan en el transporte de electrones. Para entender como se genera el ATP durante el transporte de electrones, debemos recodar su orientacin con respecto a la membrana plasmtica de la clula bacteriana. La cadena est ubicada como ya dijimos en la membrana plasmtica, de tal modo que durante el proceso de transporte hay una separacin fsica entre protones y electrones. Los protones quedan fuera de la clula, mientras que los electrones quedan dentro de sta; en consecuencia se genera un gradiente de pH y un potencial elctrico a travs de la membrana plasmtica, estando el lado externo cido y cargado positivamente y el interno alcalino y cargado negativamente. A pesar de su tamao pequeo, ni los hidrogeniones, ni los hidrxidos atraviesan libremente la membrana; por lo tanto, el equilibrio no puede establecerse espontneamente. Dicho estado energtico de la membrana plasmtica, similar a una batera, puede ser usado por la clula para realizar un trabajo til, por ejemplo, movilidad o sntesis de ATP . Para la sntesis de ATP un componente fundamental del proceso es una ATPasa de membrana; enzima que cataliza
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Figura 2. Ciclo de Krebs
la reaccin reversible entre difosfato de adenosina (ADP) y ATP . Operando en una direccin y usando el gradiente de protones generado durante el transporte, dicha enzima cataliza la formacin de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico. Existe una variedad de agentes qumicos llamados desacopladores que inhiben la sntesis de ATP durante el transporte de electrones sin alterar el propio proceso de transporte. Ejemplos de estos agentes son el dicumarol y el dinitrofenol. Son sustancias liposolubles que impiden la formacin del gradiente de pH y el elctrico, favoreciendo el pasaje de protones a travs de la membrana; de este modo inhiben la sntesis de ATP . La polimixina B (un antibitico) se adhiere especficamente a la superficie externa de la membrana, alterando su estructura y propiedades osmticas. Se produce entonces la prdida de metabolitos y la inhibicin de algunos procesos bioqumicos que tienen lugar a ese nivel, como el transporte de electrones y la sntesis de ATP , entre otros. Otras sustancias, por ejemplo: cianuro o azida de sodio, bloquean el propio sistema de
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transporte y se denominan inhibidores. Tanto los desacopladores como los inhibidores son venenos celulares que actan en clulas eucariotas y procariotas.
BALANCE ENERGTICO DE LA RESPIRACIN
El resultado neto de las reacciones del ciclo de Krebs es la oxidacin completa del piruvato a CO2 con formacin de cuatro molculas de NADH y una de dinucletido de flavinadenina (FADH). El NADH y el FADH pueden ser oxidados nuevamente por el sistema transportador de electrones. Un total de 15 molculas de ATP son sintetizadas en cada vuelta del ciclo,
Figura 3. Gluclisis
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por lo tanto, dado que cada molcula de glucosa rinde dos de piruvato, 30 molculas de ATP son sintetizadas por cada molcula de glucosa que entra al ciclo de Krebs (ver figura 3). Esto, sumado a las seis molculas de la reoxidacin del NADH y las dos del va glucoltica, da un total de 38 molculas de ATP por molcula de glucosa respirada. Adems de sus funciones como mecanismo generador de energa, el ciclo de Krebs sirve como productor de metabolitos claves para la biosntesis. La reduccin del oxgeno forma radicales libres que son muy txicos para la bacteria. Entre los ms importantes se encuentra el superxido. ste es eliminado por las bacterias aerobias y tolerantes del oxgeno, por la enzima superoxidodismutasa que cataliza la formacin de perxido de hidrgeno, tambin txico. El perxido de hidrogeno es degradado por enzimas como catalasa y la peroxidasa, a oxgeno molecular y agua. Estas enzimas estn ausentes en las bacterias anaerobias estrictas, explicando en parte la susceptibilidad que tienen al oxgeno. En las bacterias aerobias obligadas, el oxgeno es el aceptor final de electrones. Sin embargo, las bacterias anaerobias facultativas pueden usar, en ausencia de oxgeno, otros compuestos inorgnicos como aceptores finales de electrones, por ejemplo: nitrato, fumarato, sulfato, etc.
REGULACIN DEL METABOLISMO
Cada reaccin metablica est regulada no solo con respecto a otras reacciones, sino tambin con respecto a la concentracin de nutrientes en el medio. La regulacin se realiza a diferentes niveles: en la actividad enzimtica y en la sntesis de las enzimas. En la primera, regulacin de la actividad enzimtica, se produce: activacin de enzimas alostricas, inhibicin por retroalimentacin, activacin alostrica y cooperatividad. La induccin enzimtica y la represin por productos finales, son mecanismos de regulacin de la sntesis de enzimas. En las bacterias anaerobias facultativas la fermentacin (como nica va de produccin de energa) es bloqueada en presencia de oxgeno, asegurando que el suministro de energa se produzca por respiracin, que consume menos glucosa y acumula menos lactato. En este fenmeno denominado efecto Pasteur, la enzima fosfofructoquinasa es activada o inhibida segn la relacin entre el ATP y el ADP , regulando as el consumo de glucosa. Este es un ejemplo de regulacin de la actividad enzimtica por una enzima alostrica. El ejemplo clsico de regulacin de la sntesis de enzimas lo constituye el opern lactosa. Hay tres enzimas que participan en la utilizacin de la lactosa (-galactosidasa, galactsido permeasa y galactsido transacetilasa), las cuales tienen un promotor nico. En ausencia de lactosa, la transcripcin para estas enzimas est bloqueada por un represor que se une al promotor inhibiendo la accin de la ARNpolimerasa. Cuando se agrega lactosa al medio, sta se une al represor, bloqueando de este modo su unin al promotor y permitiendo la accin de la ARNpolimerasa y la sntesis de las tres enzimas anteriormente mencionadas.
Crecimiento bacteriano
Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de la clula. Las condiciones fsicas y qumicas del medio donde el microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La comprensin de como influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y hace posible disear estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo. Las bacterias como grupo, son extremadamente verstiles y tienen gran capacidad para utilizar una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos inorgnicos simples, a compuestos
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orgnicos ms complejos. Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los cuales la clula no puede crecer y no esenciales, se usan cuando estn presentes pero no son indispensables. Algunos nutrientes son usados solo como precursores de macromolculas celulares, otros solo como fuente de energa sin ser incorporados directamente al material celular y otros cumplen las dos funciones al mismo tiempo. Tambin se pueden clasificar como macro y micronutrientes segn la cantidad requerida.
MACRONUTRIENTES
El carbono es el mayor constituyente de la clula bacteriana, por lo tanto no llama la atencin que requiera ms carbono que cualquier otro nutriente. Segn la forma en que lo usa, existen fundamentalmente dos tipos de bacterias: auttrofas y hetertrofas. Las primeras son capaces de sintetizar todos sus componentes orgnicos a partir de compuestos inorgnicos como el CO2. Como ejemplo de este grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de inters mdico. En cambio, las hetertrofas usan sustancias orgnicas como fuente de carbono. En este grupo se encuentran todas las bacterias de inters mdico. La glucosa, por ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energa. Tambin existen bacterias que pueden usar otras sustancias orgnicas como fuente parcial o exclusiva de carbono. Entre las bacterias ms verstiles se encuentran las del gnero Pseudomonas, muchas de las cuales pueden usar ms de cien compuestos orgnicos. Despus del carbono, el elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno que representa entre el 12 y el 15% del peso seco. Es el constituyente principal de las protenas y los cidos nucleicos. La mayora de las bacterias son capaces de usar el amonio como fuente de nitrgeno, mientras que otras pueden usar los nitratos. La reduccin de nitratos, se puede lograr por dos mecanismos diferentes: reduccin asimiladora, en la cual se reduce por la va del nitrito y reduccin desasimiladora, donde el nitrato sirve como aceptor final de electrones. La primera est bastante extendida entre las bacterias, mientras que la segunda solo es comn en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas. El fsforo es usado para la sntesis de cidos nucleicos y de fosfolpidos. La mayora de las bacterias lo usan en forma inorgnica como fosfato (PO4=). Los fosfatos orgnicos si bien estn distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados deben ser atacados primero por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos liberando el fsforo inorgnico.
MICRONUTRIENTES
Aunque requeridos en cantidades muy pequeas, los micronutrientes son importantes para la nutricin de la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el cobre y el manganeso.
FACTORES DE CRECIMIENTO
Son sustancias que deben ser aportadas preformadas, porque la bacteria que los requieren no pueden sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o ausencia de una va metablica determinada. Estas sustancias incluyen vitaminas del complejo B, aminocidos, purinas y pirimidinas. Las bacterias que no necesitan factores de crecimiento, se denominan prototrficas y, las que s los requieren, auxotrficas para ese factor.
REQUERIMIENTOS ATMOSFRICOS Y AMBIENTALES
Oxgeno Las exigencias de oxgeno de una bacteria en particular, reflejan el tipo de metabolismo pro-
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ductor de energa. Segn su relacin con el oxgeno, existen bacterias: anaerobias obligadas, anaerobias facultativas, aerobias obligadas y microaerfilas. De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las aerotolerantes. Las bacterias anaerobias obligadas estrictas, crecen en ausencia de oxgeno, el cual es muy txico e incluso letal cuando la exposicin es breve. Las segundas (aerotolerantes) tambin crecen solo en ausencia de oxgeno, pero toleran su presencia un poco ms que las anteriores; por ejemplo: Clostridium sp. Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en ausencia de oxgeno. Ejemplo de stas son las bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Las aerobias obligadas, requieren oxgeno para su desarrollo. Dentro de este grupo se encuentran la Pseudomonas. Por ltimo, las microaerfilas crecen mejor con presiones de oxgeno bajas (3 a 5%); las concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento. En las bacterias aerobias, anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima superoxidodismutasa impide la acumulacin del radical superxido; esta enzima est ausente en los anaerobios estrictos. El perxido de hidrgeno formado por la accin de la superoxidodismutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa o peroxidasa, como ya se mencion. En el laboratorio de microbiologa los requerimientos atmosfricos de oxgeno, pueden determinarse cultivando la cepa en caldo tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes, siendo un caldo de enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias de inters mdico. El cido tiogliclico acta como agente reductor que disminuye el potencial redox del medio, generando un gradiente de concentracin de oxgeno a lo largo del tubo. En la superficie del medio, la concentracin es similar a la atmosfrica y va disminuyendo gradualmente hasta que en el fondo del tubo no existe oxgeno disuelto. Las bacterias aerobias estrictas podrn crecer en la superficie del caldo, las microaerfilas crecern en la franja inmediata que est debajo de la superficie. Las anaerobias facultativas crecern en todo el tubo, mientras que las anaerobias lo harn en el fondo del mismo. Anhdrido carbnico Algunas bacterias como Neisseria y la Brucella, tienen muchas enzimas con baja afinidad por el CO2 y requieren una concentracin ms elevada (10%) de la que habitualmente est presente en la atmsfera (0.03%). Estos requerimientos atmosfricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el cultivo de estas bacterias. Potencial de oxidacin reduccin Es un requerimiento fsico del medio de cultivo. ste es un factor crtico para determinar si se desarrollar o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la mayora de los medios de cultivo en contacto con el aire, el potencial de oxidacin reduccin es de +0,2 a +0,4V, a pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son incapaces de crecer a menos que el potencial sea tan bajo como -0,2V. Para establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede eliminar el oxgeno, recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo el tioglicolato de sodio. Temperatura Es uno de los factores ambientales ms importantes que influyen en la proliferacin y mantenimiento de la vitalidad de los microorganismos. Cada bacteria tiene su propia temperatura mnima por debajo de la cual no puede proliferar, temperatura ptima en la cual el crecimiento es mas rpido y temperatura mxima por encima de la cual no puede multiplicarse. As, es
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posible distinguir tres grupos de microorganismos segn el rango de temperatura en el que es posible su multiplicacin: psicrfilas, crecen entre -5 y 30C, temperatura ptimo de 15C; mesfilas, crece entre 10 y 45C, con el ptimo a los 30C y termfilas, que crecen entre 25 y 80C, con el ptimo en 55C. En el laboratorio se puede determinar la temperatura ptima de crecimiento, sembrando el microorganismo en estudio en un medio de cultivo adecuado e incubndolo a diferentes temperaturas, para despus evaluar los rendimientos obtenidos en las distintas condiciones. Si bien la mayora de los microorganismos de inters medico son mesfilos, pueden existir diferencias entre las temperaturas de crecimiento ptimas de los mismos, siendo para la mayora de 35 a 37C. Concentraciones de hidrgeno Cada microorganismo tiene un rango de pH en cual puede crecer y un pH ptimo bien definido. Segn en el pH que se obtenga mayor rendimiento, encontramos microorganismos acidfilos, neutrfilos (la mayora de inters mdico) y alcalfilos, que crecen bien en pH cidos, neutros y alcalinos respectivamente. Para la mayora de las bacterias de inters mdico, el pH ptimo es de 7,2 a 7,6. Sin embargo, hay microorganismos humanos como M. tuberculosis que resisten valores muy bajos de pH. Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus funciones metablicas, suelen modificar el pH del medio, ste puede prepararse con amortiguadores de pH (buffer), los cuales mantiene el pH relativamente constante. Condiciones osmticas y disponibilidad de agua El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de sta es un factor importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus ambientes naturales. Esta disponibilidad no depende solamente del contenido de agua que haya en el ambiente, porque algunas sustancias y superficies pueden absorber molculas de agua y por consiguiente reducir la disponibilidad en el ambiente. Las sales y los azcares disueltos en agua, condicionan la disponibilidad de la misma porque las molculas de agua se asocian y no quedan disponibles para ser usadas por los microorganismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente como actividad acuosa o potencial de agua. Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor cantidad de solutos que en el interior celular, por lo tanto el agua tiende a entrar a la clula por osmosis. Por el contrario, si se encuentran en medios de baja actividad acuosa, el agua tender a salir de la clula, por lo tanto perder agua. As, encontramos microorganismos que pueden crecer en altas concentraciones salinas (halfilos) como las que estn en el agua de mar, en altas concentraciones de azcar (osmfilos) como las que hay en una jalea o en ambientes muy secos (xerfilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las altas concentraciones de solutos en su interior. La concentracin de solutos con actividad osmtica dentro de la clula bacteriana es superior a la concentracin del exterior celular. Con excepcin de las bacterias del gnero Mycoplasma y de las formas lister (L) que no tienen pared celular, la mayora de las bacterias tienen tolerancia osmtica que les permite soportar grandes cambios de osmolaridad. Captacin de nutrientes La concentracin de solutos en el interior de una clula bacteriana es mayor que en el medio
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extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la mayora de los medios de cultivo usados en el laboratorio. La principal barrera para el paso de solutos entre la clula y el medio externo es la membrana celular. Las bacterias estn rodeadas de membranas semipermeables, compuestas por una mezcla compleja de protenas, lpidos y glucoprotenas, que restringen el ingreso de la mayora de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten el transporte de sustancias pequeas a travs de dichas membranas. Las molculas de mayor tamao primero deben ser degradadas a molculas ms pequeas por enzimas (exoenzimas) producidas por la propia bacteria y secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnegativas estas exoenzimas se encuentran fundamentalmente en el espacio periplsmico (espacio virtual ubicado entre la membrana externa y la membrana plasmtica), mientras que en las bacterias grampositivas estn ancladas en la membrana plasmtica. Dichas enzimas son activas sobre: protenas, polisacridos, lpidos y cidos nucleicos, entre otros. Bacterias como S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens, elaboran algunas de estas enzimas que contribuyen a la virulencia, destruyendo los componentes vitales de los tejidos del husped infectado. Pueden ser constitutivas (se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando est presente su substrato). Con excepcin del agua y el amonio que ingresan a la clula por difusin pasiva en respuesta a un gradiente de concentracin a ambos lados de la membrana, el resto de los metabolitos lo hacen por sistemas de transporte ms especficos. Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren consumo de energa. Los primeros son sistemas inespecficos que permiten el ingreso de molculas pequeas (peso molecular menor o igual a seis mil dalton). Las porinas son protenas ubicadas en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de las molculas pequeas e hidroflicas. En la difusin facilitada, una protena asociada a la membrana celular facilita el equilibrio a ambos lados de la misma, actuando en conjunto con una quinasa citoplasmtica dependiente de ATP . Estas protenas de membrana se denominan permeasas y muchas son inducidas por el substrato a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa citoplasmtica, queda atrapada dentro de la clula. La difusin facilitada se parece a la difusin simple, porque el substrato se mueve por un gradiente de concentracin (de mayor a menor), por lo tanto el propio proceso de transporte no requiere energa. La diferencia que tiene con la difusin pasiva, es que est mediada por una protena transportadora, es ms rpida y tiene mayor especificidad de substrato. El transporte activo permite que los solutos ingresen a la clula en contra de un gradiente de concentracin, consumiendo energa metablica. Como ejemplo citaremos al sistema de la -galactsido permeasa, mediante el cual la lactosa (disacrido) es concentrado dentro de una bacteria como E. coli. El transporte de la lactosa se produce por una permeasa especfica (protena M); dicha reaccin implica gasto de energa. La energa se usa para disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte interna de la membrana celular, favoreciendo su rpida liberacin dentro del citoplasma. Si la generacin de energa es bloqueada por el agregado de azida de sodio al sistema, la permeasa cataliza la difusin facilitada de la lactosa, cesando el transporte cuando la concentracin del disacrido sea la misma a ambos lados de la membrana. En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentracin de hierro no permite alcanzar un desarrollo ptimo. Las bacterias han desarrollado varios sistemas para obtener cantidades adecuadas de dicho elemento. Los siderforos son ligandos de bajo peso molecular cuya funcin es suministrar hierro a la clula. Aunque existe una variacin importante en la estructura de
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los distintos tipos de siderforos conocidos, la mayora son de dos tipos: catecoles: la enterobactina es la ms estudiada; e hidroximatos: producidos por algunos hongos. La enterobactina es un poderoso quelante que E. coli produce rpidamente cuando existe dficit de hierro y la secreta al medio externo. Crecimiento de las poblaciones bacterianas El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este paso es importante para proveer de una poblacin de bacterias que puedan ser analizadas mediante pruebas bioqumicas, serolgicas, genticas y de susceptibilidad a los antibiticos. El cultivo es el proceso de propagacin de los microorganismos en el laboratorio, que se obtiene aportando las condiciones ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes. Es necesario conocer cuales son los requisitos bsicos de la bacteria en cuestin para su cultivo en el laboratorio (nutrientes, requerimientos atmosfricos y ambientales), as como los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar. La siembra de un material que contiene bacterias en un medio slido adecuado con la tcnica de aislamiento permite, luego de un perodo adecuado de incubacin, la recuperacin de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. stas pueden ser aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro. El crecimiento se define como el aumento del nmero de bacterias en una poblacin determinada (ver figura 4). Es importante diferenciar entre el crecimiento de una clula individual y el de una poblacin. Dicho crecimiento celular es el resultado del aumento del tamao de la clula, seguido de su divisin. El crecimiento de una poblacin, en cambio, es el resultado del aumento del nmero total de clulas, que puede ser cuantificado directamente (contando el nmero de clulas) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular). El recuento de clulas totales puede determinarse por recuento microscpico en una cmara con reas de volumen conocido, contando las clulas por unidades. Este recuento, considera la totalidad de las clulas presentes en la muestra (viables y no viables). Para realizar un recuento de las clulas viables, es necesario hacer un cultivo en medio slido para contar el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) presentes en un volumen conocido de la
Figura 4. Curva de crecimiento bacteriano
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muestra. Dicha tcnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio apropiado o por siembra incorporada en agar. El crecimiento de las poblaciones bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada ni salida de los componentes del sistema), est limitado por el agotamiento de los nutrientes o bien por la acumulacin de productos txicos del metabolismo. Cuando las bacterias se siembran en el laboratorio en un medio lquido (por ejemplo en un tubo de ensayo), se trata de un sistema cerrado de cultivo. Si se toman muestras a intervalos regulares en diferentes tiempos de incubacin y se realiza un recuento del nmero de clulas viables por mililitro de cultivo, la representacin grfica de los datos (conteo de clulas viables en funcin del tiempo) dar la curva de crecimiento caracterstica que consta de cuatro fases: latencia, exponencial, estacionaria y muerte.
FASE DE LATENCIA
Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco, sufren un cambio en su composicin qumica antes de ser capaces de iniciar la multiplicacin. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de la actividad metablica, casi sin divisin celular, asociado a un incremento de la susceptibilidad a los agentes fsicos y qumicos. Por lo tanto, la mal llamada fase de latencia implica intensa actividad metablica.
FASE EXPONENCIAL
Las clulas se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza intrnseca de la bacteria y por las condiciones del medio. Existe gran aumento del nmero total de clulas viables, que puede ser expresado en forma exponencial. Prximo al final de esta fase, se produce la liberacin de exotoxinas por las bacterias que las producen.
FASE ESTACIONARIA
Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulacin de productos txicos determina el cese del crecimiento. Hay prdida de clulas por muerte, la cual es balanceada por la formacin de nuevas clulas. Cuando esto ocurre, el conteo total de clulas aumenta levemente aunque el de las bacterias viables permanece constante. Hacia el final de esta etapa, puede ocurrir la esporulacin en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de resistencia.
FASE DE MUERTE
Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el nmero de bacterias viables disminuye rpidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento declina. Las caractersticas de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo de las caractersticas propias del microorganismo, del estado metablico del inoculo, del medio de cultivo y de las condiciones de incubacin. Las condiciones fsicas y qumicas del medio donde el microorganismo crece afectan las actividades de stos. La comprensin de cmo influye el ambiente en el crecimiento, nos ayuda a explicar la distribucin de los microorganismos en la naturaleza y hace posible disear mtodos que permitan estudiar y controlar el crecimiento bacteriano. Adems, existen sistemas de cultivo abiertos que son poco usados en el laboratorio de microbiologa clnica. El cultivo continuo (con aporte y salida de nutrientes y requerimientos a una tasa constante), permite mantener a las bacterias en una misma fase de crecimiento
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durante un largo perodo de tiempo (por ejemplo en la fase estacionaria o en la exponencial). Dicha tcnica es interesante por ejemplo para los procesos productivos.
Medios de cultivo
Son una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que permiten el crecimiento de los microorganismos. Deben contener todos los nutrientes necesarios en cantidades apropiadas a los requerimientos de los microorganismos y en condiciones de pH, presin osmtica, oxgeno disuelto, etc., adecuados para el crecimiento. Aunque los diferentes microorganismos tienen distintas propiedades fisiolgicas y requerimientos nutricionales, la composicin qumica de las clulas es constante en todo el mundo vivo. Los medios ms simples estn compuestos por una base mineral se puede suplementar con una fuente de carbono, de energa, de nitrgeno y con algn factor de crecimiento requerido. Los medios deben esterilizarse antes de ser usados. Esta esterilizacin generalmente se realiza con calor hmedo, pero algunos medios con componentes sensibles al calor pueden filtrarse. Existen muchos medios con diferentes utilidades que pueden ser clasificados de la siguiente manera. Segn su consistencia en: lquidos, semislidos y slidos. Los medios slidos son usados para el aislamiento bacteriano, mientras que los lquidos son tiles para el enriquecimiento de una poblacin bacteriana de inters. Segn su composicin: definidos (de composicin qumica conocida, medios simples) y complejos (con agregados de sustancias no definidas, por ejemplo extracto de levadura). Segn la cantidad de nutrientes: pobres (por ejemplo el agar simple) y ricos (por ejemplo el agar sangre). Tambin pueden clasificarse en medios: diferenciales, que permiten diferenciar algunas propiedades distintivas del grupo bacteriano (por ejemplo el uso de lactosa en agar CLED); y selectivos, que permiten el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros (por ejemplo el Mac Conckey para la seleccin de bacterias gramnegativas). Tambin existen los medios especiales para el transporte de muestras o cepas, o aquellos especficos para identificar alguna va metablica determinada.
Bibliografa
Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. editors. Bailey & Scotts. Diagnostic Microbiology. 11th. ed. St. Louis, Missouri. Mosby. 2002. Joklik WK, Willett HP , Amos DB, Wilgert CM. editores, Zinsser Microbiologa. 20 ed. BsAs. Panamericana; 1994.
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Gentica bacteriana
L. Betancor, M. Gadea, K. Flores
Introduccin
Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptacin a diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer sus bases genticas, es decir como est organizada la informacin gentica, como realizan y regulan su expresin y que mecanismos de variacin gnica poseen. La capacidad infecciosa de las bacterias patgenas radica en que poseen la informacin gnica necesaria para colonizar los tejidos del husped, invadirlos y/o producir sustancias txicas que causarn la enfermedad. Por otro lado, el conocimiento del funcionamiento gentico de las bacterias, sumado al hecho de que son de fcil manejo en el laboratorio y que tienen crecimiento rpido, ha permitido usarlas para sintetizar productos tiles a la medicina, tanto para el diagnstico como para la prevencin y tratamiento de algunas enfermedades. Estas posibilidades se han visto incrementadas con el desarrollo de la ingeniera gentica y la disponibilidad de tcnicas de biologa molecular.
Estructura del genoma bacteriano

Toda la informacin gentica esencial para la vida de la bacteria est contenida en una nica molcula de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace covalente. Dicha molcula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen adems ADN extracromosmico, tambin circular y cerrado, denominado ADN plasmdico por estar contenido en los plsmidos. stos, portan informacin gnica para muchas funciones que no son esenciales para la clula en condiciones normales de crecimiento. En trminos bioqumicos la composicin y estructura de los cidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier clula. Conviene recordar brevemente, que los cidos nucleicos son macromolculas compuestas de nucletidos unidos en forma covalente por medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3 y 5 de dos residuos de azcares adyacentes. Esta estructura forma un esqueleto de azcares y fosfatos constante en toda la macromolcula. La variacin entre los nucletidos que constituyen la cadena de cido nucleico, esta dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina (T), citocina (C) y guanina (G) y para el cido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina, el uracilo (U). La A y G se denominan bases pricas o purinas, mientras que T, U, y C se
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denominan bases pirimidnicas o pirimidinas. As, una cadena o hebra de cido nucleico, tendr una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen. El ADN como macromolcula, esta compuesto por dos cadenas nucleotdicas o hebras antiparalelas que se enlazan entre s formando una doble hlice. Los enlaces entre ambas hebras de ADN estn determinados por puentes de hidrgeno entre las purinas de una cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma dos puentes de hidrgeno con la T, mientras que la C forma tres puentes de hidrgeno con la G. Dicho fenmeno se conoce como complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo es para la G (ver figura 1). Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hlice de ADN, en la cual se pueden distinguir pares de nucletidos o pares de bases (pb). Estos pb pueden usarse como unidad de tamao o longitud para las molculas de ADN, de esta manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosmico de Escherichia coli tiene un tamao de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo de 4.200 kilobases (Kb). Todas las clulas deben enfrentarse al problema de como lograr contener en su estructura molculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E. coli, los 4.200 Kb de su genoma implican una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la longitud de la clula. Las bacterias no poseen histonas asociadas a su genoma y en consecuencia no tienen la posibilidad de compactar su ADN en estructuras tipo nucleosomas como las clulas eucariotas. Por lo tanto, deben compactar su ADN de otra manera. Esto se logra porque el ADN circular cerrado es capaz de adoptar una estructura terciaria denominada superenrollamiento, que implica el enrollamiento del eje de la doble hlice sobre si mismo (ver figura 2). Este superenrollamiento se dice que tiene sentido negativo porque tiene el sentido contrario al enrollamiento de una hebra de ADN sobre la otra. Esto supone para la bacteria una fuente de almacenamiento de energa para ser usada en muchos procesos fisiolgicos que la requieren, por ejemplo la separacin de las dos hebras de ADN necesaria para la replicacin y la transcripcin. El cromosoma bacteriano es suficientemente largo como para formar muchos lazos circulares, que como tales pueden superenrollarse formando una serie de dominios topolgicos independientes. Esta organizacin en dominios colabora a la compactacin general del genoma bacteriano e impide que, con la ruptura de una hebra (en cualquier sitio del cromosoma) se pierda el superenrollamiento total, manteniendo la energa almacenada. Las bacterias poseen enzimas (topoisomerasas) capaces de alterar la estructura del ADN, modificando su superenrrollamiento. Estas topoisomerasas actan agregando o eliminando vueltas superhelicoidales y cumplen un rol importante en los procesos de replicacin y transcripcin del ADN. Adems, es interesante mencionar que algunas de las topoisomerasas como la ADNgirasa, son blanco de accin de los antibiticos del grupo de las quinolonas, como el cido nalidxico.
Los plsmidos son ADN extracromosmico

Como ya dijimos, muchas bacterias poseen informacin gnica contenida en molculas de ADN distintas a las del cromosoma bacteriano, denominadas plsmidos. Estos, son molculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicacin independiente del cromosoma. Por esto puede encontrarse ms de una copia del mismo plsmido dentro de la clula bacteriana. En general los plsmidos de mayor tamao se encuentran en una o unas pocas copias, mientras que los ms pequeos pueden estar en hasta cien copias por clula (plsmidos multicopia). Aunque el ADN plasmdico no porta informacin gentica esencial para la vida de la
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Figura 1. Estructura del ADN. Apareamiento de dos hebras de ADN basado en la complementariedad de bases. A (adenina) se aparea con T (timina) por medio de 2 puentes de hidrgeno, mientras que C (citocina) se aparea con G (guanina) por medio de 3 puentes de hidrgeno, formando los llamados pares de bases.

bacteria, s porta genes que le confieren nuevas propiedades fenotpicas y que en algunos casos le son tiles para su adaptacin al crecimiento en determinados ambientes. Muchas bacterias potencialmente patgenas para el hombre, solo son capaces de comportarse como tales cuando portan un plsmido que contiene genes que le permiten expresar molculas de adhesin a los tejidos del husped o sintetizar sustancias txicas para ste. Como ejemplo la toxina tetnica producida por Clostridium tetani, est codificada plasmdicamente. En otros casos, los plsmidos contienen genes que codifican enzimas capaces de degradar algunos antibiticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la accin de los mismos. Por ejemplo la produccin de -lactamasas por cepas Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus y Haemophylus influenzae est codificada plasmdicamente. Los plsmidos pueden clasificarse segn distintos criterios, por ejemplo por su tamao, su nmero de copia o el tipo de genes que contiene (plsmidos de virulencia, plsmidos de resistencia a antibiticos, etc.). Tambin pueden clasificarse en grupos de incompatibilidad;
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Figura 2. Superenrollamiento del ADN. Una molcula de ADN circular relajado puede ser retorcida para formar una molcula superenrrollada negativamente. Esta reaccin es catalizada por una enzima girasa, mientras que la reaccin inversa lo es por una topoisomerasa.

se dice que dos plsmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad si son incapaces de coexistir en la misma bacteria. Muchos plsmidos, en general los de mayor tamao (que pueden portar hasta 50 o 100 genes), suelen ser capaces de transferirse de una bacteria a otra mediante un proceso llamado conjugacin (vase mas adelante). Estos plsmidos de conjugacin codifican todos los factores necesarios para su transferencia. Algunos plsmidos mas pequeos, no conjugativos, pueden ser movilizados, es decir que poseen la secuencia necesaria para permitir su transferencia, pero ellos mismos no codifican las protenas necesarias para ser transferidos. Por ltimo, otros plsmidos no se transfieren en absoluto. La adquisicin de ADN plasmdico por una cepa bacteriana, puede realizarse por medios distintos a la conjugacin como transformacin, la transduccin mediada por fagos o la incorporacin en el cromosoma, como veremos mas adelante.
Genes "saltarines" de las bacterias

Los elementos transponibles son segmentos de ADN capaces de moverse desde una posicin a otra en el genoma. Es decir que pueden transponerse o saltar desde un sitio determinado del genoma, separndose del resto del ADN, hasta otro sitio distinto al cual se integran. Tambin pueden transponerse desde el cromosoma a un plsmido o viceversa o a distintos
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sitios dentro de la misma molcula de ADN. Los elementos transponibles estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, tanto en virus, como en clulas procariotas y eucariotas. Existen dos tipos de elementos transponibles: las secuencias de insercin (elementos IS) y los transposones (Tn). Los elementos IS son segmentos pequeos de ADN, de aproximadamente 1 a 2 Kb que contienen la informacin gentica mnimamente necesaria para la transposicin. Poseen secuencias especficas en ambos extremos del fragmento que consisten en repeticiones invertidas una respecto de la otra. Estas secuencias, son reconocidas especficamente por enzimas codificadas en el mismo elemento IS, denominadas transposasas, responsables de la integracin del elemento al sitio blanco del genoma. Los Tn son segmentos de ADN que adems de portar la informacin necesaria para la transposicin, contienen genes que pueden codificar diferentes propiedades fenotpicas. Dentro de stas se destaca la resistencia a ciertos antibiticos, como es el caso de la resistencia de alto nivel a la gentamicina que tienen algunas cepas de Enterococcus sp. Algunos plsmidos poseen uno o mas Tn que portan determinantes de resistencia a antibiticos; la capacidad de estos elementos para transponerse de un plsmido a otro, proporciona a la bacteria gran flexibilidad para desarrollar resistencia, dado que dichos plsmidos son generalmente conjugativos, por lo que pueden transferirse entre distintas bacterias. La insercin de un elemento transponible puede producir diferentes efectos sobre la expresin de la informacin gnica como impedir la funcionalidad de un gen o activar la expresin de otro.
Replicacin del ADN bacteriano

El genoma completo de una clula, sea procariota o eucariota, debe replicarse con exactitud una vez por cada divisin celular. Por lo tanto, la iniciacin de la replicacin compromete a la clula a una divisin posterior. Si se inicia la replicacin, la divisin consiguiente no debe ocurrir hasta que se haya completado la replicacin y, de hecho el final de la replicacin puede disparar la divisin celular. Las bacterias, a diferencia de las clulas eucariotas, son capaces de replicar su ADN a lo largo de todo su ciclo celular. Se denomina replicn a cada unidad de replicacin del ADN que contiene todos los elementos requeridos para regular este proceso. El cromosoma bacteriano se replica a partir de un nico origen que se mueve linealmente hasta completar la duplicacin total de la molcula, por lo que constituye un replicn. Esto facilita la regulacin que est centrada en la etapa de iniciacin; una vez que la replicacin del cromosoma se inicia en su origen, todo el cromosoma ser duplicado. Los plsmidos, constituyen replicones independientes del cromosoma, generando una replicacin por ciclo celular que se coordina con la replicacin genmica (plsmidos unicopia) o permitir varias replicaciones por ciclo (plsmidos multicopia). El sitio de ADN que se est duplicando, se llama horquilla de replicacin. La replicacin puede ser unidireccional o bidireccional, segn se formen una o dos horquillas en el origen. Generalmente, los cromosomas bacterianos tienen replicacin bidireccional, mientras que algunos plsmidos pueden replicarse unidireccionalmente. En la replicacin unidireccional, una horquilla sale del origen y progresa a lo largo del ADN. En la bidireccional, se forman dos horquillas que se alejan del origen en direcciones opuestas hasta que se encuentran completando la duplicacin. Esto permite a la bacteria duplicar su ADN mas rpido que si
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Figura 3. Replicacin del ADN. El proceso de replicacin del ADN es semiconservativo, ya que cada nueva molcula posee una hebra sintetizada de novo apareada a su complementaria proveniente de la molcula que le dio origen. El poroceso genera dos moleculas de ADN idnticas.
el proceso fuera unidireccional, pudiendo replicar mas de mil pb por segundo. Es importante destacar que, aunque la velocidad de replicacin es muy elevada, la fidelidad de la misma tambin es grande, siendo la frecuencia de mutaciones espontneas del orden de una cada 107 a 1011 pb replicados. La replicacin es semiconservativa porque cada molcula de ADN posee una cadena del ADN original y una nueva. Esto resalta la importancia de la complementariedad de bases en la estructura del ADN (ver figura 3). Las enzimas encargadas de catalizar el proceso de replicacin, se denominan ADN polimerasas. Si bien en E. coli se conocen tres tipos distintos, la responsable de la mayora de los procesos de replicacin es la polimerasa III, mientras que las polimerasas I y II cumplen principalmente funciones de reparacin de rupturas o de errores en las molculas de ADN. Tambin participan otras enzimas, como las helicasas responsables de desenrollar el ADN en el origen o cerca de l, paso indispensable para iniciar la replicacin.
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Figura 4. Colaboracin de protenas en la horquilla de replicacin. La ADN polimerasa III necesita para iniciar la sntesis un cebador o primer que es sintetizado por una ARN polimerasa especial. Algunas protenas desenrrollan la hlice de ADN y otras se unen a los fragmentos de ADN unicatenario para estabilizarlo. Como la polimerasa solo sintetiza ADN en direccin 5 a 3, una de las cadenas se sintetiza en forma discontinua, dejando una serie de fragmentos de ADN y de huecos sin replicar. La ADN polimerasa I rellena los huecos y una enzima ligasa sella los fragmentos entre si.

Esquemticamente, podemos decir que la replicacin consta de tres fases: iniciacin, elongacin y terminacin. La primera se produce desde el origen del replicn donde se forma la o las horquillas de replicacin, gracias a la accin de las helicasas que desenrollan el ADN. De esta forma se constituye una porcin monocatenaria de ADN que estar en condiciones de formar un complejo con protenas de unin al ADN, encargadas de estabilizar la cadena sencilla, evitando la formacin de puentes de hidrgeno. Se sintetiza un corto oligonucletido de ARN con un grupo 3 oxidrilo libre, que actuar como cebador o primer, en el cual la ADN polimerasa agrega los nucletidos. La elongacin consiste en el avance de la horquilla de replicacin, conforme se van agregando nucletidos a la nueva cadena, siguiendo un orden establecido por las reglas de complementariedad de bases (A con T y C con G), entre la cadena molde y la nueva. En esta etapa participa fundamentalmente la ADN polimerasa III. Todas las polimerasas conocidas agregan nucletidos en direccin 5- 3 para el crecimiento de la cadena y requieren una cadena de ADN molde, un cebador y los nucletidos. (Ver figura 4). La terminacin se produce despus de que ambas horquillas de replicacin han atravesado la mitad del cromosoma en direcciones opuestas y se encuentran en la regin terminal del genoma. En esta regin, existen secuencias de ADN que actan como bloqueadores para el avance del las horquillas, por lo tanto se asegura que la replicacin termine en esa pequea porcin del genoma.
Expresin de los genes procariotas

TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN
La expresin gentica de todas las clulas depende de los procesos secuenciales de transcripcin y traduccin que, en conjunto transfieren la informacin contenida en una secuencia de nucletidos de un gen, a una secuencia de aminocidos de una protena. Esto implica que a partir de la dotacin gnica portada por la clula (genotipo), se expresarn un conjunto de caractersticas evidenciables y que constituirn el fenotipo celular. Durante la transcripcin, las reglas del apareamiento de bases son aplicadas por la ARN
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Figura 5. Comparacin entre la expresin de los genes eucariotas y procariotas. Los ARNm procariotas son a menudo polignicos, es decir que contienen informacin para mas de una protena. El extremo 5 se traduce cuando todava se est transcribiendo el extremo 3. Los ARNm eucariotas son monognicos y requieren de modificaciones postranscripcionales antes de atravezar la membrana nuclear y llegar al citoplasma donde son traducidos.

polimerasa para sintetizar un producto complementario a una cadena del ADN usada como molde, que es el ARN. Una de las clases mas importantes de ARN es el llamado mensajero (ARNm), que porta la informacin para la sntesis de protenas. La ARN polimerasa bacteriana, es distinta de la que tienen las clulas eucariotas; de hecho, algunos antibiticos que tienen como sitio blanco de accin la ARN polimerasa (por ejemplo la rifampicina) son efectivos exclusivamente ante clulas procariotas. La ARN polimerasa reconoce un sitio especfico en el ADN, llamado promotor, al cual se une iniciando la transcripcin. Un mismo transcripto, ARNm, puede contener la informacin correspondiente a ms de un gen, por lo tanto se traducir luego en ms de un polipptido. El conjunto de genes que son transcriptos en un nico ARNm y que por tanto se expresan en conjunto se denomina opern. (Ver ms adelante). Los genes procariotas no poseen intrones como los eucariotas, es decir que una vez transcripto el ARNm, ste ser traducido directamente en una secuencia polipeptdica, sin necesidad de realizar ningn procesamiento despus de la transcripcin. Otra diferencia importante con la expresin de los genes eucariotas, es que como las bacterias no tienen un compartimento nuclear definido, los procesos de transcripcin y traduccin estn acoplados. Es decir que mientras se est sintetizando una molcula de ARNm, el ARN naciente puede tomar contacto con los ribosomas e iniciar la sntesis proteica (ver figura 5). sto es una ventaja para la bacteria y constituye una importante causa de su elevada capacidad para adaptarse a diferentes ambientes, porque le permite responder rpidamente a los estmulos sintetizando las protenas necesarias, en el momento adecuado. La traduccin es un proceso por el cual el ARN ribosmico, el ARN de transferencia (ARNt) y muchas protenas ribosomales, realizan la lectura del cdigo gentico. Dicho cdigo est escrito en tripletes de nucletidos o codones portados por el ARNm; de la
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escritura de la secuencia correspondiente de aminocidos, surge el producto polipeptdico. El ribosoma desempea un rol fundamental, reuniendo al ARNm y a los ARNt cargados de aminocidos. La estructura y composicin de los ribosomas procariotas (ARN y protenas), difiere en cierta medida de los ribosomas eucariotas. Tienen menor masa y por lo tanto, menor coeficiente de sedimentacin (la subunidad mayor 50 S y la menor 30 S, ambas suman 70 S). Estas diferencias entre los ribosomas procariotas y eucariotas, igual que otras diferencias en la expresin gnica (polimerasas, topoisomerasas, protenas, mecanismos regulatorios y factores de elongacin), tienen una serie de implicancias. Una de stas es la sensibilidad diferencial de procariotas y eucariotas a toxinas y antibiticos. Por ejemplo los macrlidos, los aminoglucsidos, el cloramfenicol y otros son antibiticos que actan en el ribosoma bacteriano o en el proceso de sntesis proteica; en cambio, algunas toxinas bacterianas como la diftrica, actan selectivamente en la sntesis proteica eucariota. Existen dos sitios en el ribosoma: el aceptor (sitio A), donde los ARNt cargados se asocian en primer lugar y el sitio peptdico (sitio P), donde se sujeta la cadena polipeptdica en crecimiento. En cada adicin de aminocidos, el ARNm avanza un codn y el nuevo aminocido se traslada del sitio A al P , incorporndose a la protena en formacin. Como el cdigo gentico es universal, el significado de los codones es similar al de los eucariotas, aunque cabe mencionar que existen algunas diferencias en los codones que determinan la iniciacin y la terminacin de la traduccin, as como en la preferencia de uso de ciertos codones. Como en los procesos de replicacin y transcripcin, el paso inicial de la traduccin es un importante punto de regulacin.
Regulacin de la expresin gnica de las bacterias

Las bacterias tienen muchos mecanismos para controlar la expresin de sus miles de genes, con cual logran que el producto de un gen determinado, solo se sintetice cuando es necesario y, en lo posible en la cantidad ptima. Esto les confiere una importante capacidad de adaptacin a cualquier cambio de concentracin de nutrientes del medio en que habitan, activndose determinadas vas metablicas solo cuando son necesario. As, las bacterias evitan sintetizar enzimas cuando falta el sustrato correspondiente, pero siempre estn preparadas para fabricarlas cuando aparece dicho sustrato en el entorno. Un importante mecanismo de regulacin desarrollado por las bacterias, se basa en la activacin o desactivacin de la transcripcin de un grupo de genes cuyos productos tienen funciones relacionadas y que estn organizados en una regin del genoma que permite regular su expresin. Esta forma de organizacin gentica se denomina opern y le permite a la clula administrar en forma ptima sus reservas energticas. Un opern consiste en: un promotor, sitio blanco de la regulacin; genes adyacentes que codifican cada una de las enzimas de una va metablica y una secuencia de terminacin de la transcripcin. As, todos los genes constituyentes de un opern son transcriptos de forma coordinada como ARNm policistrnico, es decir multignico. Dicho ARNm es traducido secuencialmente en protenas por los ribosomas. La iniciacin de la transcripcin puede regularse positiva o negativamente. Los genes bajo control negativo se expresan constantemente, excepto que sean inhibidos por una protena represora que evitar la expresin del gen por su unin a una secuencia especfica del ADN,
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denominada operador. Este operador impide que la ARN polimerasa inicie la transcripcin en el promotor. Aquellos genes cuya expresin se encuentra bajo control positivo, no sern transcriptos excepto que est presente una protena activadora que se une a una secuencia especfica del ADN y ayuda a la ARN polimerasa en los pasos iniciales de la transcripcin. Los operones pueden ser inducibles o reprimibles. Se considera inducible, cuando la introduccin de un sustrato en el medio aumenta la expresin de las enzimas necesarias para su metabolismo. stos solo funcionan en presencia de una pequea molcula, el inductor. Por otro lado, en el mecanismo de regulacin por represin, disminuye la sntesis de algunas enzimas cuando existen cantidades suficientes de los productos terminales de la va metablica correspondiente. Esto se denomina represin por producto final; los metabolitos terminales son molculas llamadas correpresores (ver figura 6). Un ejemplo clsico es el opern lactosa (lac), descrito en E. coli. Contiene un conjunto de genes cuyos productos son las enzimas responsables de la degradacin de la lactosa. En ausencia de lactosa en el medio, el opern es reprimido por la unin de una protena represora a la secuencia del operador, esto impide la accin de la ARN polimerasa. La adicin de lactosa al medio anula dicha represin, dado que el propio azcar acta como inductor unindose a

Figura 6. Mecanismos de regulacin de la expresin gnica. a) Induccin: Un gen regulador (reg) codifica para una protena represora en su estado activo que se une al operador (O) bloqueando la unin de la ARN polimerasa al promotor (P). En presencia del inductor, la protena represora es inactivada y el operador se encuentra disponible para el inicio de la transcripcin. b) Represin: El gen regulador codifica para una protena represora en su estado inactivo. En ausencia de la molcula correpresora, ocurre la transcipcin. En presencia del correpresor, la protena represora es activada para su unin al operador, bloqueando de este modo la transcripcin.

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la protena represora e impidiendo que sta contine asociada al operador. Este mecanismo de control negativo, asegura que el opern lac se transcriba solo cuando hay lactosa en el medio. Sin embargo, existe un mecanismo para aumentar al mximo la expresin del opern lac, basada en un mecanismo de control positivo mediado por protenas activadoras. En E. coli existe una protena llamada protena activadora del gen por el catabolito (PAC), que forma un complejo con el monofosfato de adenosina cclico (AMPc) y adquiere la capacidad de unirse a una secuencia especfica del ADN presente en el promotor. La unin del complejo PAC-AMPc al ADN, potencia la unin de la ARN polimerasa al promotor y permite aumentar la frecuencia de iniciacin de la transcripcin. As, no solo se regula la sntesis, sino tambin la cantidad que se sintetiza, segn los requerimientos de las enzimas responsables de la degradacin de la lactosa. Este tipo de mecanismo regulador de la transcripcin, se encuentra en muchas bacterias para diferentes vas metablicas. Tambin existen operones que son regulados en la terminacin de la transcripcin por un mecanismo especial llamado atenuacin qu es caracterstico de las vas biosintticas de aminocidos y se basa en el acoplamiento entre transcripcin y traduccin. Este es el caso del opern triptfano (Trp), en el cual el promotor codifica un pequeo pptido que contiene do Trp en posicin crtica. Cuando hay suficiente cantidad de este aminocido en el medio, el pptido se sintetiza rpidamente a partir del promotor que es transcripto y luego traducido. Esto provoca un cambio en la conformacin del ADN correspondiente al opern, que permite reconocer una seal de terminacin de la transcripcin entre el promotor y los genes estructurales; sitio donde la ARN polimerasa se separa del ADN y termina la transcripcin. Por el contrario, cuando no hay suficiente Trp, el pptido no podr sintetizarse y la ARN polimerasa continuar transcribiendo los genes del opern. As, la clula solo sintetizar el aminocido, cuando no haya suficiente cantidad de ste en el medio para ser usado en las vas biosintticas. No solo en la transcripcin existe regulacin, tambin existen en la traduccin y luego de ella. La velocidad de la traduccin de las diferentes secuencias de ARN transcriptos, puede variar ms de mil veces segn el sitio de unin del ribosoma con el mensajero. Generalmente, el control de la traduccin se basa en la obstruccin del sitio de unin del ribosoma, ya sea por la unin de una protena al ARN ribosmico en ese sitio o por el apareamiento de bases de ste con otro fragmento de ARN. Este es el mecanismo usado para la regulacin de la sntesis de las protenas ribosomales, cuyos genes tambin se encuentran organizados en operones. Por ltimo, existe tambin la regulacin postraduccional que la bacteria usa para inactivar enzimas innecesarias. Si bien existen mecanismos para suprimir la produccin de enzimas cuando no son necesarias, hay que considerar que estas enzimas tienen una vida media relativamente larga y que en algunas ocasiones es ms redituable energticamente inactivar las enzimas de una va biosinttica, que asumir el gasto de ATP correspondiente al funcionamiento de dicha va cuando el producto est disponible en el medio.
Mecanismos de variacin genotpica

Como vimos, las bacterias tienen mecanismos que les permiten cambiar su expresin gnica favoreciendo la sntesis de los productos de ciertos genes y reprimiendo la de otros. Estos mecanismos pueden llamarse de variacin fenotpica, ya que implican una serie de cambios en el fenotipo celular o de la poblacin bacteriana. Tambin existen mecanismos de variacin genotpica, que sern igualmente traducidos en cambios fenotpicos, pero que se basarn en una modificacin de la informacin gentica contenida en la clula.
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Bsicamente, existen dos formas de variacin genotpica en las bacterias. Por un lado, en el genoma se producen cambios debidos a mutaciones y por otro, las bacterias pueden intercambiar material gentico y sufrir recombinacin.
MUTACIONES
Una mutacin es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos que constituyen el genoma de un organismo; sta se produce en condiciones naturales con baja frecuencia y se deben fundamentalmente a errores en los procesos de replicacin del ADN. Adems de las mutaciones espontneas, pueden ocurrir mutaciones inducidas, provocadas por agentes mutagnicos (qumicos, fsicos o biolgicos) que proporcionan una herramienta para introducir cambios en el genoma bacteriano en el laboratorio. La mayora de estos errores o alteraciones introducidos en el genoma, son corregidos por los mecanismos de reparacin del ADN, pero algunos escapan a la correccin y pueden originar cambios heredables que proporcionan una diversidad gentica. Dada la baja frecuencia de mutaciones, solo los microorganismos con alta tasa de crecimiento, pueden alcanzar cifras suficientemente altas como para que sean detectables. Las mutaciones en las bacterias, frecuentemente afectan propiedades fcilmente reconocibles como requerimientos nutricionales, morfologa o resistencia antibitica. Algunas mutaciones pueden conferir al mutante una ventaja frente a la cepa que le dio origen, bajo ciertas condiciones ambientales, de manera que la progenie de dicha clula mutante es capaz de superar el crecimiento de la cepa original y sustituirla. Este es el caso de las mutaciones que confieren resistencia a los antibiticos, en las que el mutante resistente se seleccionar en un ambiente en el que las bacterias estn expuestas al antibitico en cuestin. Este tipo de mutaciones se denominan selectivas. En cambio, frente a una mutacin no selectiva la bacteria no adquiere beneficios en relacin a su progenitor, por ejemplo la prdida de pigmento de las colonias de Serratia marcescens que se observa cuando se cultivan en agar. Las mutaciones puntuales, son aquellas que implican un cambio en una nica base; pueden provocar que se cambie un aminocido por otro en el producto proteico (mutacin por cambio de sentido). Otras veces no se traducen en ningn cambio (mutacin silenciosa), dado que como sabemos existe ms de un codn para cada aminocido. Tambin puede suceder que el codn se convierta en una seal de terminacin (mutacin sin sentido) y en ese caso se traducir una protena incompleta no funcional. Las deleciones y las inserciones producen cambios ms notorios en el ADN, provocando la prdida o la incorporacin de cualquier nmero de pares de bases. Por lo tanto, siempre que ste no sea mltiplo de tres se producirn mutaciones por desplazamiento del marco de lectura, que suele provocar la prdida total del fenotipo. Muchas mutaciones que originan un producto proteico defectuoso, pueden ser suprimidas por un segundo evento de mutacin en otro sitio del genoma (mutaciones supresoras), restaurndose el fenotipo original.
TRANSFERENCIA DE GENES ENTRE BACTERIAS
La recombinacin gentica es el proceso mediante el cual los elementos genticos contenidos en el genoma de diferentes individuos se combina. Esto permite que el individuo origine alguna nueva funcin que pueda dar como resultado una adaptacin a los cambios en el medio ambiente. Este es un evento evolutivo importante y las clulas tienen mecanismos especficos que aseguran que dicha recombinacin se efecte. A diferencia de los eucariotas donde la recombinacin gentica ocurre en asociacin a la reproduccin sexual, en los procariotas
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comprende una serie de mecanismos independientes del evento de reproduccin celular. Estos mecanismos son llamados transformacin, transduccin y conjugacin. La transformacin es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas competentes), son capaces de incorporar ADN exgeno proveniente de otras bacterias, que est libre en el medio. La virulencia del Streptococcus pneumoniae est relacionada con la presencia de una cpsula polisacardica a su alrededor. Las bacterias con cpsula tienen un aspecto liso (S) cuando se cultivan en placas de agar y son capaces de matar a los ratones que son inyectados experimentalmente con una suspensin bacteriana. Las colonias con bordes rugosos (R) de S. pneumoniae, carecen de cpsula y no son letales al infectar ratones. Frederick Griffith en 1928 observ por primera vez la transformacin cuando mezcl bacterias S muertas con bacterias R vivas y encontr que al inyectar la mezcla en ratones, tambin resultaba letal. De esto concluy que las cepas R haban sido transformadas en bacterias S, ahora capaces de fabricar el polisacrido capsular virulento. La capacidad de captar el ADN exgeno, conservarlo en forma estable e interaccionar con l, se denomina competencia. Este fenmeno depende de la presencia de un sistema de captacin de ADN especfico asociado a la membrana. (Ver figura 7). Ejemplos de bacterias con competencia natural son Haemophilus influenzae, Neisseria sp., Streptococcus pneumoniae y ciertas especies de Bacillus. Aunque la mayora de las bacterias no presentan capacidad natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando por distintos medios distorsiones en la membrana celular; por ejemplo con pulsos elctricos (electroporacin) o con cambios osmticos y trmicos. Estos procedimientos son muy usados para introducir experimentalmente ADN extrao, por ejemplo un plsmido, en una bacteria y as transformarla para que adquiera un fenotipo de inters. Las bacterias tambin pueden ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama transfeccin. La transduccin es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de un bacterifago. Existen dos formas de transduccin la especializada y la generalizada. La primera ocurre cuando un fago temperado porta genes bacterianos adquiridos durante un ciclo infeccioso anterior y al infectar una nueva bacteria e integrar su genoma al cromosoma bacteriano, incorporar a ste la informacin gentica correspondiente a la bacteria infectada previamente. La transduccin generalizada se produce por partculas virales defectuosas que se originan como cpsides vacas durante la replicacin viral y que luego incorporan ADN de una bacteria; as, al infectar una nueva bacteria podr introducir en ella dicho material gentico. La conjugacin se basa en el intercambio unidireccional de informacin gentica desde una bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real. (Ver figura 8). Los plsmidos son los elementos genticos que con mayor frecuencia se transmiten de esta forma. La capacidad de conjugacin depende de la presencia en la bacteria de plsmidos conjugativos que contienen los genes necesarios para tal proceso. Un ejemplo muy conocido de plsmido conjugativo es el plsmido F de E. coli que codifica las protenas necesarias para la conjugacin, incluyendo el pili sexual. ste, es una estructura especializada esencial para el contacto entre la bacteria donadora y la receptora. Generalmente, los plsmidos conjugativos solamente causan la transferencia de su propio material gentico pero en ocasiones el plsmido puede integrarse al cromosoma bacteriano y en el momento de conjugar se transferir no solo a s mismo, sino tambin a los genes cromosmicos que se encuentran tras l. Tericamente todo el cromosoma podra ser transferido lo que requerira ms de dos horas, pero la unin entre las bacterias por medio del pili persiste menos tiempo. Las cepas bacterianas con el plsmido
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Figura 7. Modelo para el proceso de transformacin natural. Para la induccin del estado competente se requiere de un factor de competencia (FC). El DNA exgeno bicatenario se une a las clulas competentes en dos pasos diferentes, la unin laxa y la fuerte. Fragmentos de DNA monocatenarios son transportados al interior celular unidos a protenas. Estos complejos DNA-protenas facilitan la recombinacin posterior de los fragmentos exgenos en el cromosoma husped.
F tienen gran capacidad de recombinacin por lo que se denominan cepas hfr por su sigla en ingls (high frecuency of recombination). Debemos recordar que este es un mecanismo muy efectivo para la transferencia de genes de resistencia antibitica.
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Figura 8. Transferencia del plsmido F mediante conjugacin. Una clula F+ es capaz de sintetizar un pili especial (factor F) que le permite iniciar el proceso de conjugacin para transferir el plsmido F a una clula receptora F-.

Aportes de la biologa molecular y la gentica bacteriana a la medicina

Una de las contribuciones ms importantes de la ingeniera gentica de bacterias, es su uso para desarrollar vectores o vehculos que permitan el clonado de cualquier secuencia de ADN. Los vectores ms usados con este fin son los plsmidos bacterianos.
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Clonar implica introducir un fragmento de ADN en un vector. Los vectores de clonacin deben permitir la insercin de un fragmento de ADN extrao y ser capaces de replicarse normalmente dentro de la bacteria. Como vimos, los plsmidos tienen la capacidad de autoreplicarse y son elementos gnicos factibles de ser transferidos entre bacterias e introducidos en una cepa deseada, por lo tanto constituyen buenos vectores de clonacin. Actualmente existen varios tipos de vectores, algunos plasmdicos (como el pBR322 o el pUC) y tambin virales (como el bacterifago lambda) o, los ms modernos llamados csmidos que combinan algunas de las ventajas de los plmidos con las de los fagos. Para clonar un gen cualquiera en un plsmido, es necesario primero cortar el ADN plasmdico y el ADN del cual procede el gen a clonar, para luego ligarlos de la forma deseada. Para esto, se utilizan enzimas de restriccin. Muchas bacterias sintetizan estas enzimas, que son capaces de cortar hebras de ADN (extrao a la propia bacteria), en secuencias nucleotdicas especficas. Por ejemplo, una cepa determinada de E. coli, produce una enzima denominada EcoRI, que reconoce la secuencia GAATTC y la corta (ver figura 9). Despus que EcoRI ha cortado el ADN, quedarn bases sin aparear que estarn disponibles para aparearse con otro fragmento de ADN que tenga las bases complementarias. Si cortamos dos fragmentos de ADN con esta enzima y mezclamos los productos de esa reaccin, se obtendr un producto recombinante por combinacin de los dos ADN originales. Estas enzimas que han sido purificadas hace tiempo y que hoy se producen comercialmente, son usadas para clonar genes en por ejemplo un plsmido bacteriano. De esta manera, es posible incorporar en un plsmido bacteriano un gen eucariota que codifique para una protena determinada que nos interese producir en grandes cantidades, siempre que se conozca su secuencia nucleotdica y se disponga de enzimas de restriccin que sean capaces de cortar especficamente el fragmento que contiene el gen. Una vez obtenido el fragmento de ADN de inters y cortado el plsmido que ser usado como vector con las mismas enzimas
Figura 9. Mecanismo de accin de la endonucleasa EcoRI. La enzima EcoRI reconoce la secuencia GAATTC en el DNA de doble cadena. En ese sitio es capaz de cortar el DNA dejando extremos cohesivos. Esto permite restringir dos molculas de DNA diferentes y luego ligarlas (utilizando una enzima ligasa), para producir una molcula de DNA recombinante.
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de restriccin, estaremos en condiciones de ligar ambos fragmentos de ADN, valindonos de las propiedades de complementariedad de bases del ADN; as se construye el plsmido recombinante. Este plsmido podr ser introducido por transformacin en una cepa bacteriana apropiada y se podr producir la protena de inters en un cultivo bacteriano de E. coli, purificndola luego a partir del cultivo (ver figura 10). Usando estos procedimientos de clonado y expresin de genes, actualmente se producen muchas protenas que son usadas en el tratamiento de algunas enfermedades humanas (por ejemplo la diabetes), al producir hormonas humanas como la insulina, la hormona de crecimiento o el interfern, en bacterias recombinantes obteniendo cantidades suficientes como para su aislamiento y uso teraputico. Adems, la disponibilidad de antibiticos naturales para el tratamiento de las infecciones bacterianas no es infinita, por lo que otra importante rea de investigacin se centra en la aplicacin de la ingeniera gentica a la creacin de nuevos antibiticos. Por manipulacin gentica se intenta producir mutaciones especficas en los genes encargados de la codificacin de protenas con efecto antibitico o producir molculas de antibiticos hbridos, logrados por tcnicas de ADN recombinante. Otra importante aplicacin de la biologa molecular a la medicina, es la produccin de vacunas recombinantes. Este procedimiento se basa en la expresin en bacterias de genes propios de patgenos contra los que se desea vacunar, por ejemplo virus, parsitos u otras bacterias. El procedimiento consiste bsicamente en el clonado de genes que codifican para antgenos de superficie del virus o del parsito contra el que se desea vacunar. Estos antgenos sern expresados en la cepa recombinante y purificados a partir del cultivo de la misma cepa, usndose luego como inmungenos. As, clonando los genes apropiados en los microorganismos adecuados, podrn producirse grandes cantidades del antgeno puro. Este mtodo proporciona la ventaja de que evita trabajar con microorganismos patgenos. El desarrollo de la vacuna contra la hepatitis B representa el primer xito de las vacunas recombinantes. sta, es producida en una levadura que ha sido transformada previamente con un vector recombinante que contiene el gen del antgeno de superficie del virus. Estos mtodos pueden usarse tambin para la produccin de vacunas vivas, es decir vacunas que son administradas con virus o bacterias vivas que han sido manipuladas genticamente para perder su virulencia, pero que mantienen intactas sus propiedades inmunognicas. Adems, estos microorganismos denominados atenuados, pueden usarse como vectores de genes de otros grmenes patgenos para producir vacunas que inmunicen contra ms de una enfermedad infecciosa a la vez. Estos procedimientos son motivo de investigacin en los laboratorios de desarrollo de vacunas en todo el mundo.
Biotecnologa aplicada al diagnstico clnico

Otro uso de la produccin de antgenos a escala industrial en bacterias, es para realizar pruebas diagnsticas que detecten anticuerpos especficos contra antgenos microbianos en el suero de pacientes. En estos casos, interesa clonar en una bacteria de rpido crecimiento como E. coli, el gen que codifica para un antgeno determinado del microorganismo contra el cual se desea detectar la respuesta inmune desarrollada por el paciente. De esta manera, se producir el antgeno proteico en cantidad suficiente como para capturar los anticuerpos en la tcnica elegida para la prueba diagnstica, ya sea por enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunofluorescencia, aglutinacin de partculas de ltex u otras. Un ejemplo de esto, es el reciente desarrollo de una tcnica de ELISA para la deteccin de anticuerpos dirigidos contra
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Figura 10. Clonacin de un fragmento de DNA en un plsmido. Un gen de inters puede ser clonado en un plsmido. Para eso, el DNA plasmdico y el DNA exgeno son tratados con la misma enzima de restriccin y mezclados en presencia de una enzima ligasa. El producto de la ligacin es introducido en una cepa bacteriana por transformacin, y se seleccionan los clones recombinantes por la resistencia al antibitico portada por el plsmido.

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el antgeno del core del virus de hepatitis B, habindose este antgeno clonado y expresado en E. coli. Las bacterias patgenas se comportan como tales porque poseen ciertos genes, tanto en cromosomas como en plsmidos, que le confieren la capacidad de expresar determinadas caractersticas fenotpicas denominadas factores de virulencia o determinantes de patogenicidad. El estudio detallado de la gentica bacteriana, ha permitido identificar algunos de estos genes y hoy somos capaces no solo de identificar a una bacteria como patgena cuando la aislamos produciendo enfermedad, sino tambin cuando encontramos en ella los genes responsables de la expresin de determinantes de patogenicidad. Esto es importante cuando no alcanza con identificar a nivel de especie una cepa bacteriana aislada de una muestra biolgica patolgica, para afirmar que esa bacteria es el agente causal del proceso infeccioso. Este es el caso de las enfermedades diarreicas causadas por ciertas cepas de E. coli. Como sabemos, E. coli es parte de la microflora normal del aparato intestinal del hombre y por supuesto esas bacterias no actan como patgenos en el intestino. Sin embargo, algunas cepas especiales de la misma especie, cuando colonizan el aparato gastrointestinal, a travs de la ingesta de alimentos o agua contaminados, son capaces de multiplicarse y causar un proceso infeccioso que se manifiesta con diarrea. Estas cepas productoras de diarrea, difieren en su carga gentica de las pertenecientes a la flora normal en que poseen genes que codifican para factores de virulencia, por ejemplo pueden ser capaces de producir toxinas cuyo blanco de accin es el enterocito o producir determinadas protenas de membrana externa para adherirse a la mucosa intestinal. Entonces, cuando en una enfermedad diarreica hay que establecer el diagnstico clnico microbiolgico, por ejemplo en un lactante (edad en la que E. coli es el primer agente causal de diarrea), no alcanzar con identificar fenotpicamente como E. coli a una cepa aislada en el coprocultivo, sino que habr que determinar la presencia de ciertos determinantes de patogenicidad para afirmar que se trata de una cepa patgena. Una opcin para esto es identificar la presencia de los genes que codifican para estos determinantes. Para esto se han desarrollado tcnicas de hibridacin por sondas, que se basan en las propiedades de complementariedad de bases del ADN. Una sonda, es un fragmento de ADN complementario a una regin de un gen que nos interesa identificar, la cual ha sido previamente marcada con algn indicador que pueda ser detectado luego de la hibridacin. El marcado puede realizarse incorporando nucletidos radioactivos o biotinilados o marcados con digoxigenina. Si en un cultivo bacteriano interesa saber si posee el gen X, cuya secuencia es conocida, podremos construir una sonda especfica para dicho gen, extraer el ADN del cultivo y mezclarlo con nuestra sonda. Esto se realiza en condiciones que puedan desnaturalizar la estructura de doble cadena de ADN, para permitir que la sonda logre hibridar con su secuencia complementaria. As, podremos evidenciar si nuestro cultivo posee o no el gen buscado, porque de estar presente encontraremos la marca correspondiente a la sonda incorporada en la estructura del ADN. Esta tcnica puede usarse aplicando la sonda directamente sobre una muestra clnica, por ejemplo una seccin tisular y en ese caso se denomina hibridacin in situ. Hoy se disponen de muchas sondas especficas de ADN usadas para el diagnstico de muchas enfermedades bacterianas. La hibridacin por sondas y otros mtodos para detectar un gen en particular, es til para realizar el diagnstico etiolgico de las infecciones producidas por microorganismos cuyo cultivo es dificultoso, ya sea por crecimiento lento como en Mycobacterium sp., o por tener requerimientos especiales de cultivo y aislamiento como Chlamydias sp., Rickettsias sp. o virus. El mayor problema diagnstico usando hibridacin por sondas, es la baja sensibilidad de
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la tcnica, dado que es necesario que en la muestra existan suficientes copias del gen buscado como para que la marca correspondiente a la sonda sea detectada. Generalmente, las tcnicas de hibridacin in situ con sondas no radioactivas, son capaces de detectar ms de 200 copias del gen. Por esto, muchas veces la sensibilidad de la tcnica no es suficiente como para descartar aquellas muestras en las que se obtienen resultados negativos. Uno de los ms interesantes avances en diagnstico clnico, ha sido el desarrollo de un mtodo que permite amplificar el nmero de copias de un determinado fragmento de ADN de inters. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), permite generar millones de copias exactas de un fragmento de ADN a partir de una copia original en dos o tres horas. La PCR se basa en las propiedades de replicacin del ADN la cual puede reproducirse in vitro si se coloca el ADN molde en una mezcla de ADN polimerasa, nucletidos y cebadores especficos (primers) para las regiones del fragmento que se desea amplificar. Esta mezcla, se coloca en condiciones de pH y osmolaridad tales que permitan el funcionamiento adecuado de la polimerasa. Primero se coloca la mezcla a altas temperaturas (94 o 95C) para lograr que el ADN se desnaturalice, es decir que se separen ambas hebras. Luego se somete a temperaturas adecuadas para que los cebadores hibriden con el ADN molde (entre 40 y 55C, segn la secuencia de los cebadores). En una tercera etapa, se coloca a la temperatura adecuada para que la polimerasa de ADN acte catalizando la replicacin. Las polimerasas que se usan para estos fines, deben ser capaces de tolerar las altas temperaturas de desnaturalizacin del ADN, por lo que la enzima utilizada proviene de una bacteria termfila. La polimerasa ms usada en PCR, proviene de Thermus aquaticus (Taq polimerasa) cuya temperatura ptima es 72C. Hoy se usa sta y tambin otras enzimas, producidas en forma recombinante en E. coli. Estos cambios de temperatura se realizan en un termociclador, que es capaz de variar entre rangos muy amplios de temperatura en tiempos muy cortos. Este ciclado de temperaturas, por ejemplo: 94C por un minuto, 45C por un minuto y 72C por un minuto y medio, se repite aproximadamente 30 veces. As, se logra que en cada ciclo se duplique el nmero de
Figura 11. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN molde se desnaturaliza (aprox. 94 ) y los primers se unen en sus secuencias complementarias en los extremos de la regin a amplificar ( aprox. 55, segn la secuencia de los primers). Luego la polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN a partir de cada primer copiando la cadena molde ( a 72). Asi se completa un ciclo, repitiendose el proceso unas 35 veces, amplificando la secuencia de inters en forma exponencial.
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copias de cada una de las hebras del ADN molde, con lo que se logra un crecimiento exponencial (ver figura 11). Este procedimento puede aplicarse directamente a una muestra clnica, para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular, mediante la deteccin de una secuencia especfica en su cido nucleico. Para revelar el resultado del ensayo, la mezcla de reaccin debe ser sometida a electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. En esta, el ADN migra desde el polo negativo al positivo en diferentes grados segn el peso molecular, es decir su tamao en pares de bases. El fragmento a amplificar es por supuesto de tamao conocido, por lo que podr determinarse la presencia del gen buscado en la muestra, porque se habr amplificado en la reaccin y aparecer una Figura 12. Corrida electrofortica banda del tamao correspondiente en el gel (ver en gel de agarosa, para revelar figura 12). una reaccin de PCR. En el carril de Los geles debern ser revelados para que desala derecha se observa un marcador de rrollen una reaccin de color visible que nos ayude peso molecular y en los dos carriles anteriores el producto de la amplifi- a determinar la presencia o ausencia de la banda de cacin del tamao esperado. En el inters. En los geles de agarosa, el revelado se hace primer carril la muestra no contena la generalmente con bromuro de etidio, que es un agensecuencia de inters. te intercalante del ADN, es decir que su molcula se intercala entre las bases del cido nucleico. Este procedimiento colorea el gel porque el bromuro de etidio fluoresce bajo luz ultravioleta; por lo tanto cuando el gel se expone a la luz ultravioleta, se evidenciar o no la banda correspondiente. En los geles de poliacrilamida, el revelado puede realizarse con nitrato de plata. El resultado de la PCR tambin puede evidenciarse, combinado la PCR con una tcnica de hibridacin por sondas. Esto se logra transfiriendo el ADN del gel a una membrana (por ejemplo de nitrocelulosa) y ponerla en contacto con una sonda especfica. En este caso el revelado lo brinda la marca de la sonda. Este procedimiento de transferencia de ADN a una membrana combinado con hibridacin por sondas, se denomina Southern Blott. Aunque hemos centrado el inters de estas tcnicas de deteccin de cidos nucleicos para el diagnstico de las enfermedades infecciosas, tambin son usadas para diagnosticar algunas enfermedades neoplsicas y hereditarias. La aplicacin de la biotecnologa molecular a la medicina, representa un campo de intensa investigacin y vertiginoso desarrollo. La prevencin, el tratamiento y el diagnstico de muchas enfermedades que hasta hace pocos aos resultaba imposible, hoy son una realidad y cada vez la biologa molecular aporta ms conocimientos y tecnologa aplicables a la mejora de la calidad de vida y la salud humana.
Bibliografa
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Mtodos de estudio de bacterias y virus

Mtodos diagnsticos
D. Sandn, G. Algorta
Introduccin
Uno de los propsitos de la microbiologa mdica es trabajar en asociacin con la clnica para brindar un diagnstico y un manejo adecuado de las enfermedades infecciosas, adems de prevenir la diseminacin de la infeccin a otros individuos. Generalmente es importante documentar la presencia de la infeccin, determinar su naturaleza especfica y orientar la teraputica adecuada en forma temprana en el curso de la enfermedad. La buena calidad de este trabajo lleva implcita, entre otras, actividades propias del laboratorio: criterio de seleccin de exmenes a solicitar por los mdicos clnicos; recoleccin, rotulado y transporte de las muestras; evaluacin de las muestras y pruebas de laboratorio; procedimientos que verifican los resultados y el uso apropiado por los mdicos de los resultados para el diagnstico y el tratamiento de las enfermedades infecciosas. Existen muchos mtodos para realizar el diagnstico de las infecciones microbianas en el laboratorio. Estas incluyen examen directo, aislamiento por cultivo, deteccin de antgenos y cidos nucleicos y pruebas serolgicos para detectar la respuesta de anticuerpos del individuo a la infeccin. No existe un nico abordaje que cumpla todos los requerimientos del diagnstico microbiolgico, por lo tanto hay que implementar una combinacin de mtodos. La eleccin de los mismos depender de los diferentes factores que incluyen el conocimiento de las patognesis de los agentes sospechosos, el estado de la enfermedad y la disponibilidad y utilidad de los diferentes mtodos para la infeccin particular.
Estrategia en la eleccin de los mtodos

El laboratorio de microbiologa deber tener a disposicin del clnico todas las pruebas necesarios para el diagnstico y la atencin de los pacientes a servir. Pero no todas las pruebas pueden ser realizadas en el laboratorio, por lo tanto ste deber decidir cules se realizarn all, cules se enviarn a un laboratorio de referencia y cul ser ese laboratorio. Las necesidades de los pacientes dictarn el nmero y la variedad de mtodos que el laboratorio ofrecer. Basado en estudios numricos histricos y predictivos de las pruebas solicitados, el laboratorio puede discontinuar pruebas poco usadas que resultan costosas y de baja calidad. Por otra parte, antes de decidir implementar una nueva prueba diagnstica, sta deber ser seleccionada previamente. El conocimiento de la poblacin influir en esta
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decisin, porque una prueba vara segn su eficiencia para detectar un resultado positivo en relacin con la prevalencia de esa enfermedad en la poblacin. Generalmente las medidas de performance de una prueba incluyen sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo. Inherente a la determinacin de la sensibilidad y la especificidad de una prueba, el gold standard o patrn de oro, es el parmetro con el que se compara la prueba. Esto no siempre es posible de realizar. Existen, por ejemplo, nuevas pruebas de deteccin de antgenos como los ensayos para virus sincicial respiratorio que pueden ser ms sensibles e igual de especficos que el cultivo convencional. En tales circunstancias no debe juzgarse la performance de una prueba contra mtodos standard. Cuando se dan las condiciones para una comparacin con un gold standard, la sensibilidad y la especificidad de un mtodo es independiente de la poblacin de pacientes a analizar. As, los laboratorios no necesitan realizar grandes estudios de evaluacin de nuevas pruebas y usarn evaluaciones que fueron realizadas por microbilogos competentes y respetados que fueron publicados en la literatura cientfica. La eleccin de una prueba deber basarse en la performance publicada y la utilidad detectada por el laboratorio, segn la prevalencia percibida desde el laboratorio de la enfermedad en cuestin. Es conveniente definir en este momento los conceptos de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad de una prueba diagnstica puede tener diferentes definiciones. Puede explicar la habilidad de una prueba para detectar pequeas cantidades de lo analizado (por ejemplo los anticuerpos). Otra definicin de sensibilidad determina que es la habilidad de un mtodo para detectar casos positivos (ausencia de falsos negativos). Tambin puede ser definida como la probabilidad de que una prueba sea positiva cuando la enfermedad est presente o la proporcin de personas con infeccin que reaccionan positivamente en la prueba diagnstica realizada. Por ejemplo, una prueba diagnstica ser ms sensible, cuando detecte mayor nmero de personas infectadas o enfermas. La sensibilidad de una prueba se calcula segn la siguiente frmula: Reactivos positivos x 100 Reactivos positivos + falsos negativos La especificidad de una prueba es la habilidad que tiene para identificar correctamente a todos los negativos (ausencia de falsos positivos). Otra definicin es la probabilidad de que una prueba sea negativa cuando la enfermedad no est presente o la proporcin de personas sin la infeccin o enfermedad que reaccionan como negativas. Por ejemplo, una prueba es ms especfica cuando tiene menos reacciones positivas entre las muestras de personas que no tienen la enfermedad. La especificidad se calcula segn la siguiente frmula: No Reactivos x 100 No Reactivos + Falsos positivos Por otro lado, la eficacia de una prueba es la habilidad general de detectar correctamente todos los positivos y los negativos. Es una combinacin de sensibilidad y especificidad y brinda una idea de la eficacia total de una prueba. Hay que considerar que no es lo mismo aplicar una prueba a una poblacin con alta prevalencia de determinada enfermedad que a otra poblacin con una baja prevalencia de la misma. Es interesante conocer los valores predictivos de estas pruebas. El valor predictivo, es la probabilidad de tener la enfermedad determinada por el resultado de la prueba. Existen dos tipos, el positivo y el negativo. El valor predictivo positivo, es la probabilidad de tener la enfermedad si el resultado de la prueba es positivo y se calcula con la siguiente frmula:
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Reactivos positivos x 100 Reactivos positivos + falsos positivos El valor predictivo negativo, es la probabilidad de no tener la enfermedad si el resultado de la prueba es negativo y se calcula con la frmula: No Reactivos x 100 No Reactivos + falsos negativos Los valores predictivos de las pruebas lo determinan la sensibilidad, la especificidad y la prevalencia de la enfermedad en la poblacin en la que se aplica dicha prueba.
Recoleccin y transporte de las muestras

La utilidad de un procedimiento analtico est directamente influido por la calidad de la muestra. La primera apreciacin a realizar es si la muestra es representativa de la enfermedad que se considera. Por ejemplo, si el paciente tiene una neumona es incorrecto realizar un exudado farngeo para aislar el germen causal, porque las muestras respiratorias altas no son representativas de infecciones del aparato respiratorio inferior; los microorganismos que causan estas infecciones son habitantes normales de la flora nasofaringea. En esta enfermedad, el microorganismo tambin se puede aislar en la sangre del individuo, porque son enfermedades que pueden cursar con bacteriemia; tambin en el lquido pleural si estn presentes. Tampoco es correcto en enfermos con otitis media, buscar el microorganismo causal en el exudado nasal por las mismas razones. Pero en este caso (otitis media), el microorganismo se puede aislar en el lquido del odo medio por puncin de la membrana timpnica. Los materiales provenientes de sitios normalmente estriles, siempre son muestras excelentes cuando se realizan en condiciones adecuadas. Para estudiar las bacteria anaerobias, nunca se deben recoger muestras contaminadas con flora normal, porque generalmente los anaerobios forman parte de la flora normal y su aislamiento en muestras recogidas en contacto con piel o mucosas son imposibles de interpretar. Para la recoleccin de las muestras, el mdico debe considerar que para realizar una buena recoleccin es fundamental la transmisin correcta de las indicaciones, las cuales deben ser racionales. Esto es importante para que el personal que recoge la muestra (enfermeras, tcnicos de laboratorio, etc.), sepan y entiendan lo que deben hacer. En la seleccin de la muestra hay que considerar la representatividad como ya fue mencionado. Adems, siempre hay que preparar el sitio de extraccin de la muestra. Si se realiza por puncin, habr que realizar la desinfeccin correcta de la piel; si es un examen de orina, la limpieza de la regin y recoleccin del chorro medio, etc. Es importante destacar que es frecuente recibir en el laboratorio de microbiologa muestras inadecuadas por diferentes razones. Describiremos algunas de estas solicitudes irracionales. Los hemocultivos se reciben como muestras nicas o ms de tres en 24 horas. Las muestras nicas de sangre dificultan la interpretacin en el laboratorio, porque se aslan microorganismos de la flora normal de piel y no se puede evaluar si stos son por contaminacin de la muestra en el momento de la extraccin o porque dicha bacteria en la causante de la enfermedad del paciente. En la mayora de las situaciones no se necesita realizar tomas seriadas que recargan innecesariamente el trabajo del laboratorio y no aportan datos nuevos de inters. Las muestras de heridas o secreciones respiratorias para estudio bacteriolgico, pueden ser inadecuadas cuando existe predominio de clulas epiteliales sobre la otra poblacin celular y no son representativas del estudio que se pretende. Para el estudio de virus respiratorios, se considera
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que la muestra fue incorrecta si en los aspirados nasofarngeos no se obtuvieron clulas. Otras muestras inadecuados para estudio son: muestras de objetos y superficies inanimados, exudados de lesiones de boca, contenido intestinal, abscesos perirectales, colostoma, exudados de lesiones de decbito y puntas de sondas vesicales o catteres pleurales. A continuacin se mencionan los requisitos necesarios para una correcta recoleccin de las muestras. En principio dicha recoleccin debe realizarse antes del inicio de la antibioticoterapia. Un ejemplo demostrativo es la realizacin de la puncin lumbar en la meningitis aguda supurada. En esta situacin, luego del diagnstico clnico se realiza la puncin lumbar para el diagnstico citoqumico y bacteriolgico; luego y antes de obtener los resultados, se inicia el tratamiento antibitico. Posteriormente, cuando se tienen los resultados, en las mejores de las situaciones se podr adecuar la teraputica o adoptar otras conductas pertinentes. Como los antibiticos no tienen efectos sobre los virus, se puede obtener una muestra para cultivo viral an cuando el tratamiento antibacteriano ya se hubiera iniciado. Tambin es til averiguar si el paciente ha recibido vacunas virales o tratamiento antiviral recientemente. La muestra se dirigir a buscar el microorganismo en el sitio donde est y se buscar que la muestra est exenta de contaminacin externa; para esto es necesario que el tcnico brinde al paciente la instrucciones al respecto. Tambin hay que considerar la etapa de la enfermedad, por ejemplo para aislar Salmonella typhi en la fiebre tifoidea, se podr aislar en una muestra de sangre obtenida en los primeros das de enfermedad, con el pasar del tiempo la posibilidad de recuperacin del germen disminuye y habr que recurrir a otras muestras como materia fecal que tienen menor significacin clnica. Para los virus, las mejores muestras generalmente son las que se obtienen al inicio de la enfermedad (dentro de las primeras 72 horas), cuando el virus se excreta a concentraciones relativamente elevadas y todava no se ha unido a anticuerpos. Despus de transcurridos siete das, habitualmente no vale la pena realizar cultivos virales cuando se trata de huspedes inmunocompetentes. No obstante, en inmunocomprometidos y en infecciones virales persistentes o crnicas, el virus puede aislarse durante perodos prolongados. La muestra deber tener un volumen suficiente para su procesamiento, adems de ser recogida en recipiente rotulado y limpio por fuera. Es imperativo que la muestra se acompae de datos clnicos. El envo debe realizarse rpidamente preservando la muestra de temperaturas extremas y de la desecacin. Para ello se usan medios de transporte. Los hisopos son de diferentes materiales: algodn, alginato, etc. Existe la posibilidad de que algunos sean txicos para algunas especies bacterianas y se desaconseja su uso en algunas muestras. Generalmente los hisopos de algodn son de uso generalizado, considerando que pueden contener cidos grasos no saturados inhibidores de N. gonorrhoeae, por lo que se recomiendan los de alginato de calcio o de dacron para muestras uretrales. A continuacin detallaremos algunos ejemplos de recoleccin y transporte de muestras clnicas. Hisopados conjuntivales: frotar la conjuntiva palpebral con un hisopo estril humedecido con solucin salina estril. Colocar el hisopo en 3 o 4 ml de medio de transporte. Hisopados de lesiones y vesculas cutneas: recolectar la muestra dentro de los tres das de la erupcin de la vescula. Primero, se lava suavemente la superficie de la vescula o la lesin con etanol al 70%, luego se aspira el fluido vesicular con una jeringa de tuberculina y se coloca el aspirado en 3 o 4 ml de medio de transporte. En las lesiones cutneas o vesculas abiertas, frotar con un hisopo y colocarlo en 3 o 4 ml de medio de transporte. El hisopado de las vesculas puede ser colocado en el medio de transporte que ya tiene el fluido vesicular.
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Aspirado nasofarngeo: es la muestra de eleccin para los virus respiratorios. Se introduce una sonda nasogstrica (SNG) por las fosas nasales hasta la rinofaringe y se aspira el moco en un tubo colector especial. El contenido de la SNG se lava con medio de transporte para virus que se recoge en el tubo colector. Hisopados nasales: introducir suavemente un hisopo de algodn seco en la nariz. Dejar el hisopo en la nariz durante algunos segundos para que las secreciones sean absorbidas. Colocar el hisopo dentro de 3 o 4 ml de medio de transporte. Hisopados farngeos: frotar las amgdalas y la faringe con un hisopo de algodn seco. Colocarlo en 3 o 4 ml de medio de transporte. Hisopados rectales: introducir un hisopo de algodn humedecido, 2 o 3 cm dentro del canal anal y realizar movimientos rotatorios. Colocar el hisopo en 3 o 4 ml de medio de transporte. Heces: recolectar 2 o 4 g de la muestra en un recipiente limpio. Orina: recolectar 10 a 15 ml de orina recientemente emitida en un recipiente estril y enviarla directamente al laboratorio. Lquido cefalorraqudeo (LCR): recolectar al menos 0,1 ml de LCR (mejor 2 o 3 ml). Transportarlo al laboratorio inmediatamente. Sangre con anticoagulante (para cultivo viral o inmunofluorescencia): recolectar sangre entera en un tubo que contenga heparina, citrato o EDTA (quelante de calcio) y enviarla directamente al laboratorio. La entrega rpida (2 a 6 horas) al laboratorio es esencial. Suero (para pruebas serolgicas): recolectar la muestra de sangre en un tubo estril que no contenga anticoagulantes. Enviar la muestra al laboratorio (no congelar). Los medios de transporte son diferentes para estudio viral o bacteriano.
Mtodos
El cultivo y la identificacin de los patgenos especficos a partir de los materiales recogidos de los pacientes en los que se sospecha una infeccin es la mejor herramienta diagnstica disponible, aunque no la ms rpida. En algunas situaciones dicho estudio resulta difcil o incluso imposible, por ejemplo en rickettsiosis y en la sfilis. En algunos casos puede ser necesaria la serologa u otros mtodos, ya sea por que no se conocen las condiciones necesarias para su cultivo in vitro o por los riesgos que implica la manipulacin de estos microorganismos. Hoy se dispone de tcnicas para detectar y cuantificar muchos marcadores especficos de enfermedades infecciosas. Por un lado, se usan tcnicas inmunolgicas para cuantificar las inmunoglobulinas especficas o deteccin de antgenos en los tejidos; por otro, la introduccin de la gentica molecular en el laboratorio clnico, ha sido un gran avance al respecto.
MTODOS DIRECTOS
Son aquellos que detectan: al microorganismo por microscopia, al microorganismo por cultivo, a los antgenos del microbio y los cidos nucleicos (reaccin en cadena de la polimerasa). Para la deteccin de antgenos se usan tcnicas inmunolgicas como la inmunofluorescencia (IF), el enzimoinmunoanlisis (EIA) y los test de aglutinacin.
MTODOS INDIRECTOS
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) que desarrolla el husped. Se basan en la deteccin de anticuerpos especficos mediante tcnicas inmunolgicas (EIA, IF, western blot, etc.).
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DIAGNSTICO MICROSCPICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
El microscopio de luz es una de las herramientas ms tiles en el diagnstico bacteriolgico. An hoy con el desarrollo de mtodos ms rpidos (muchos requieren instrumentos sofisticados o caros), la simple visualizacin microscpica de muestras clnicas es todava la forma ms rpida y especfica de orientar el diagnstico clnico. Basta recordar la utilidad del examen en fresco para la visualizacin de algunas bacterias, por ejemplo el examen en fresco con campo oscuro para Treponema y las muestras fijadas y teidas con coloraciones simples o diferenciales, como la coloracin de Gram o de Ziehl Neelsen. Existen distintos tipos de microscopios pticos o de luz. El ms usado en el laboratorio de bacteriologa es el microscopio de campo claro (de luz transmitida), el resto (de campo oscuro, de contraste de fases, de luz ultravioleta) tienen uso ms restringido. El microscopio de luz consta de dos sistemas de lentes convergentes: el objetivo (prximo al objeto de estudio) y el ocular (prximo al ojo del observador). Posee un objetivo de bajo aumento (10X), uno de mediano aumento (40X) y uno de alto aumento (100X o lente de inmersin). Este ltimo es el ms usado en bacteriologa, porque al sumergir el lente en el aceite que recubre el preparado aumenta el poder de resolucin a 0,2 micras, siendo posible observar la mayora de los tipos bacterianos. El microscopio posee adems una fuente de luz (incluida o externa al instrumento), un condensador mvil, un espejo que refleja la luz y un diafragma que permiten regular el paso de la luz concentrando los rayos luminosos sobre el objeto. Por ltimo, tiene una platina para colocar la lmina de estudio y un mecanismo de ajuste para enfocar el sistema de lentes sobre el objeto. Dicho mecanismo consta de un macromtrico (de ajuste grosero) que coloca al objeto prximo al foco y un micromtrico (de enfoque fino) que permite el enfoque del objeto. La microscopia ptica es un mtodo sencillo y rpido que muchas veces orienta al diagnstico etiolgico. Nos informa la cantidad y morfologa bacteriana, adems de la presencia de determinados tipos celulares presentes en el preparado que validan o no la muestra para el anlisis microbiolgico; por ejemplo: las clulas epiteliales en muestra de secreciones respiratorias. El examen microscpico puede realizarse en fresco u obteniendo un frotis fijado y coloreado. El examen en fresco permite apreciar la existencia de bacterias y la presencia de movilidad de las mismas y caractersticas de esta. Esto ltimo muchas veces orienta a la identificacin de una cepa bacteriana o al diagnstico etiolgico. Algunas bacterias como las espiroquetas tienen un dimetro muy pequeo como para ser observadas en un microscopio de luz transmitida, por lo cual se usa el microscopio de campo oscuro que permite distinguir sus propiedades morfolgicas y de movilidad. En este microscopio, la luz pasa a travs de un condensador que proyecta luz transversalmente sobre la muestra, de modo que el haz de luz incide oblicuamente sobre la superficie del microorganismo siendo reflejado. Los rayos desviados son los que penetran en el objetivo y hacen que los cuerpos bacterianos se observen rodeados de un halo brillante. La microscopia de fluorescencia tiene los mismos principios de ptica, las diferencias estn relacionadas con la generacin y transmisin de la luz til para la excitacin de colorantes fluorocromos o de fluorescencia natural de los microorganismos. Algunos producen luz despus de absorber luz ultravioleta; otros lo hacen luego de haber tomado un fluorocromo, por ejemplo las bacterias cido alcohol resistentes. Por ltimo, otros producen luz luego de la unin del antgeno a un anticuerpo conjugado previamente con un colorante fluorescente, este mtodo es muy usado en virologa y ser expuesto con las tcnicas Inmunolgicas; tambin es muy
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usado en el diagnstico de algunas enfermedades bacterianas, poe ejemplo Chlamydia spp. y virus sincicial respiratorio. La microscopia electrnica usa electrones en lugar de luz. Dicho mtodo de estudio es til por ejemplo para el diagnstico de virus causantes de gastroenteritis. Con el microscopio electrnico se puede observar la morfologa de los viriones presentes en las muestras clnicas. La limitacin de este mtodo, adems del costo del microscopio, es que necesita una concentracin elevada de viriones (aproximadamente 109 partculas virales por ml, dependiendo del virus) en la muestra, por lo tanto decimos que es poco sensible. Por esto es una tcnica poco usada, ms an con el desarrollo de tcnicas alternativas de similar utilidad. El microscopio electrnico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos rpidos de muestras de materia fecal de pacientes con diarrea. Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y Calcivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de esta enfermedad. Por ejemplo, Rotavirus posee una forma caracterstica en doble rueda y un tamao distintivo (70 nm de dimetro) y se los encuentra en concentraciones de hasta 1011 partculas virales por gramo de heces. Tambin en otras muestras, como lquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos mediante coloracin negativa. Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja y por tanto no son visibles directamente por el microscopio electrnico, se pueden usar tcnicas que aumentan la visualizacin, por ejemplo la inmunoelectromicroscopia. sta consiste en el agregado de anticuerpos especficos antivirales y la formacin de agregados de partculas que son visibles con mayor facilidad que las partculas solas (ver figura 1).
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS VIABLES
El cultivo es an el gold standard y una herramienta importante de diagnstico. Permite adems, identificar el microorganismo aislado, realizar estudios de sensibilidad a los antibiticos y antivirales y tipificar el microorganismo con fines epidemiolgicos.
Figura 1. Microfotografa electrnica de virus visualizados en heces de pacientes con diarrea. A- Adenovirus. B- Rotavirus.
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Para el microbilogo el problema es decidir cul o cules de los microorganismos aislados en una muestra clnica estn involucrados en la enfermedad en cuestin. Son pocos los microorganismos a los cuales el trmino patgeno puede aplicarse invariablemente, definiendo patgeno aquel microorganismo que siempre que se encuentra estar causando una enfermedad infecciosa. La mayora pueden integrar la flora del husped que es dinmica en su composicin. Por lo tanto, es interesante definir los sitios estriles y los que poseen flora, aunque no existen categoras claras que delimiten entre especies patgenas e inocuas. Las conclusiones se basarn en los criterios establecidos para un buen procesamiento del material. Como regla general, la eleccin de mtodos y medios de cultivo se ajusta a la naturaleza, al origen de la muestra y a los interrogantes que se pretende responder. Por ejemplo para una muestra de pus drenada de un absceso: Cules microorganismos estn presentes como agentes causales? Se supone que cualquier microorganismo presente puede ser el causal y que el tratamiento dirigido hacia l debe resultar beneficioso. La estrategia a seguir debe ser recuperar cualquiera y todos los microorganismos presentes. El mtodo ser utilizar varios medios de cultivo y enriquecimiento. En contraste con este enfoque abierto, algunos cultivos se realizan para determinar si un patgeno particular est presente o no. Por ejemplo en un exudado farngeo: Cules microorganismos estn presentes como agentes causales? S. pyogenes. La estrategia a aplicar debe ser investigar un nico agente tratable y cultivable. Por lo tanto el metodo ser usar medios de cultivo solo para S. pyogenes. De esto se desprende que existe muchos medios de cultivo con diferentes propsitos. Por un lado, existen los medios simples que permiten el desarrollo de microorganismos con gran capacidad metablica, que con pocos nutrientes son capaces de extraer todo lo necesario para multiplicarse. Por el contrario, existen medios complejos que agregan diferentes sustancias necesarias a algunos microorganismos. Los medios de cultivo tambin pueden definirse como determinados, aquellos que tienen su composicin qumicamente definida o aquellos no bien definidos. Para el cultivo pueden usarse medios de cultivo diferenciales que ponen en evidencia alguna caracterstica metablica de algn grupo de bacterias. Tambin pueden usarse medios selectivos que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos, permitiendo el desarrollo particular de otros. Por ltimo, los medios de enriquecimiento son medios lquidos que facilitan el desarrollo de algunos microorganismos inhibiendo la flora asociada y modificando la relacin cuantitativa entre estos. El aislamiento posterior en medios slidos permite la recuperacin de estas bacterias. En el laboratorio de bacteriologa clnica cuando se realizan estos cultivos, hay que considerar su sensibilidad para las diferentes muestras. No es lo mismo el diagnstico de infeccin urinaria por urocultivo (tcnica de sensibilidad alta), que el diagnstico de neumona por cultivo de esputo (tcnica de sensibilidad muy baja). Otro elemento importante a considerar es la valoracin de resultados positivos. El microorganismo aislado de un sitio normalmente estril, es un contaminante?; forma parte de la flora normal de otros sitios en el husped? Un ejemplo interesante es cuando se realiza una nica muestra de hemocultivo y se asla S. epidermidis, ste es un aislamiento en sangre normalmente estril de un microorganismo que normalmente habita la piel del ser humano. Es imperativo en estas situaciones tener ms de una muestra para poder interpretar estos resultados y definir si es una contaminacin accidental o el microorganismo aislado es el responsable de la enfermedad. Las pruebas de identificacin de las bacterias aisladas y los estudios de sensibilidad se describen en los captulos respectivos.
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Cultivos celulares El aislamiento de un virus como tcnica gold standard, permita medir todas las otras pruebas de diagnstico viral; pero hoy con el desarrollo de nuevas tcnicas de biologa molecular, el cultivo ya no es la tcnica ms sensible. Asimismo, el aislamiento de virus tiene elevada sensibilidad y especificidad; pero como solo se amplifica el virus, aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus. El proceso suele ser lento (das a semanas para la identificacin) y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en el tratamiento del paciente. Adems, es un proceso dificultoso y caro. Por otra parte, requiere el uso de sistemas de cultivo adecuados, por ejemplo necesitan muchas lneas celulares para la deteccin ptima de virus. Los cultivos celulares son los biosubstratos ms usados para la propagacin de los virus. Un cultivo celular es obtenido de explantes de rganos o de embriones de animales. Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian por accin de una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspencin de clulas libres as obtenidas, se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o de plstico, donde se adhieren y multiplican formando una capa fina de clulas que se llama monocapa celular. sta crece en un medio de cultivo complejo que contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminacin bacteriana agregando antibiticos adecuados al medio de cultivo. Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc.). Los cultivos celulares se dividen en primarios, diploides y lneas celulares continuas. Los primeros se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces. Las lneas celulares diploides, crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y conservan, por lo menos en un 75%, el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. Las lneas celulares continuas, permiten un nmero finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una lnea continua, esta debe haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Estas lneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas: disponibilidad para todos los investigadores de stocks de clulas idnticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa en botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios. Libre de contaminacin con agentes extraos. Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relacin especfica entre el husped y el virus, que est en relacin con los datos clnicos y el tipo de muestra para inocular. As por ejemplo la lnea celular HEp-2, son clulas heteroploides humanas derivadas del carcinoma larngeo y se recomiendan para virus sincicial respiratorio y Adenovirus. La MRC5, es una lnea diploide fibroblstica de pulmn embrionario humano, que se usa para el aislamiento del Citomegalovirus, el virus sincicial respiratorio, herpesvirus , Echo virus, etc. La MDCK, es una lnea celular diploide de rin canino que se recomienda para el aislamiento del virus Influenza. Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un perodo de hasta 14 das en promedio, esperando la aparicin del efecto citoptico, la toxicidad o la degeneracin celular. El cultivo se observa al microscopio a las 24, 48, 72 horas y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados. El efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos ms o menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por
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la accin del virus en el cultivo celular. As, por ejemplo, el virus sincicial respiratorio forma sincicios o clulas gigantes en HEp-2. Los Adenovirus, forman clulas redondeadas con forma de racimo en HEp-2, dejando reas libres de clulas. Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a tcnicas que ponen en evidencia la presencia de este en el cultivo. Las ms usadas son: hemadsorcin, hemaglutinacin y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver figura 2). Hay virus que durante su multiplicacin intracelular expresan en la membrana de la clula husped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoprotenas capaces de unirse a receptores especficos en la membrana de glbulos rojos de diferentes especies animales. Por lo tanto, si se agregan glbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede evidenciar la infeccin de esas clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la superficie celular. Dicho fenmeno se conoce como hemadsorcin. En la hemaglutinacin, las hemaglutininas pueden evidenciarse en el sobrenadante de los cultivos usando el mismo fundamento que para la hemadsorcin.
MTODOS ALTERNATIVOS
Otros mtodos que pueden usarse en forma alternativa a los cultivos, tienen algunas ventajas y desventajas respecto a stos. La especificidad puede ser imperfecta. Adems, pueden ser incapaces de estudiar el patgeno en cuestin, como lo permite el aislamiento del microorganismo. Por otra parte, pueden ser ms sensibles, permitiendo llegar a un diagnstico con cultivos negativos. Adems se realizan en menos tiempo; son ms rpidos. Inmunoqumicos Estos ensayos se basan en la deteccin de anticuerpos (Ac) especficos que permiten sealar a determinado microorganismo presente en una infeccin. La otra posibilidad es la deteccin de antgenos (Ag) solubles en los materiales a estudiar. Son todas reacciones de tipo antgeno anticuerpo (Ag-Ac). La especificidad de los antisueros de uso corriente en el laboratorio suele ser muy variada. Generalmente, los microorganismos son un mosaico de antgenos expuestos. Segn su especificidad podemos encontrar tres tipos de inmunoglobulinas: policlonales, monoespecficas y monoclonales. Por ejemplo supongamos que dos bacterias A y B son diferentes; que la bacteria A presenta en su superficie tres Ag diferentes y que la bacteria B posee un Ag idntico al de la bacteria A, un Ag propio y nico y, un Ag que reacciona en forma cruzada con A. Un antisuero policlonal contra la bacteria A, la reconocer en todos sus Ag, pero tambin reconocer a B por el Ag idntico al de A y por aquel que tiene reaccin cruzada con A. Si pensamos en un antisuero monoespecfico contra el Ag en que B tiene reaccin cruzada con A, tambin reconocer las dos bacterias, tanto por reconocimiento especfico, como por reaccin cruzada. Por ltimo, un Ac monoclonal solo reconocer a la bacteria A, dado que no hay posibilidades de reaccin cruzada. Es importante destacar que generalmente, todas las pruebas mejoran la especificidad y sensibilidad con los Ac monoclonales, pero su uso debe ser valorado junto a las necesidades, los costos, etc. Aunque existen tcnicas diferentes para la deteccin de Ag o de Ac, todas se basan en diferentes formas de evidenciar una reaccin Ag-Ac. La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue una de las primeras tcnicas en usarse. sta se basa en la carga negativa que presentan los Ag bacterianos en medio alcalino, cuando son sometidos a una corriente elctrica; en cambio, los Ac permanecen neutros. Esta tcnica es poco usada en la actualidad porque es menos sensibles que otras que se desarrollaron posteriormente y de mayor costo econmico.
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Figura 2. Representacin esquemtica de un ensayo de aglutinacin.
Tcnicas muy usadas y de fcil realizacin son las que se basan en aglutinacin de partculas, por ejemplo la aglutinacin de ltex o la coaglutinacin que usa S. aureus y su protena A fijadora de inmunoglobulinas. La prueba de aglutinacin es un mtodo sencillo, de un solo paso. Adems es una tcnica rpida y barata. Los ensayos de aglutinacin dependen de la fijacin inicial de Ac o de los Ag especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clnica, en la que se investiga el Ag o los Ac y las partculas se aglutinan si el Ag o Ac adecuado se encuentra presente. La prueba de aglutinacin ha sido usada para detectar el Ag (el ms importante) de Rotavirus en heces, mostrando buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Tambin se ha usado para detectar Ag de Adenovirus. (Ver figura 2) Las tcnicas de anlisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) que usan Ac unidos a enzimas que catalizan reacciones colorimtricas, son de uso corriente. Los ELISA para la deteccin de Ag se basan en la captura del Ag por Ac especficos unidos a una fase slida, generalmente el pocillo de una microplaca o una esfera de plstico pequea. El Ag viral presente en la muestra clnica se combina con el Ac fijado a la fase slida y el Ag viral se detecta mediante la adicin de otro Ac especfico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. En la reaccin con peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto qumico incoloro, que en su forma oxidada tiene un color caracterstico. Si la enzima es fosfatasa, la desfosforilizacin es la responsable directa de la aparicin del color. En los ltimos aos los EIA indirectos se han aplicado al diagnstico de Ac virales. En esta tcnica los Ag virales se inmovilizan en una fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para sta. Con esta tcnica se pueden procesar muchas muestras en forma rpida y automatizada, sin requerir de un observador experimentado para leer los resultados, dado que estos se leen con espectrofotmetros especialmente diseados. Por lo tanto, dicha tcnica se considera ms objetiva (ver figura 3). Las tcnicas inmunomicroscpicas que usan la fluorescencia (IF), tambin son usadas para la deteccin de Ag o Ac. Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido en el laboratorio clnico. El principio bsico de la IF directa se ilustra en la figura 4. Las muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas en un portaobjetos donde se dejan secar
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Figura 3. Esquema para la deteccin de antgenos por enzimo inmuno ensayo directo
Figura 4. Esquema de inmunofluorescencia indirecta
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y se fijan. Luego se agregan Ac especficos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los Ag virales expresados en las clulas. La reaccin Ag-Ac se observa con el microscopio de fluorescencia por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana. Esta tcnica se puede usar para identificar rpidamente el virus directamente en la muestra (por ejemplo en las clulas del lavado nasal o de un hisopado nasofarngeo) o para confirmar el efecto citoptico observado en cultivos celulares. Esta tcnica se llama IF directa. Adems con el uso de Ac monoclonales especficos para los Ag inmediatos de Citomegalovirus, es posible determinar la presencia de dicho virus en cultivos celulares algunos das antes de que se pueda reconocer el efecto citoptico. Sin embargo, la eficacia de la tcnica depende mucho de la calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnstico certero; adems de la recoleccin y preparacin de la muestra adecuada. Aun as, la tcnica realizada en manos expertas resulta til para identificar algunos virus como los respiratorios, dado que proporciona un diagnstico etiolgico en una jornada de trabajo. Tambin pueden estudiarse muchas muestras simultneamente. El advenimiento de los Ac monoclonales ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Los Ac monoclonales conjugados con isotiocianato de fluorescena pueden usarse para identificar el virus sincicial respiratorio, Influenza A y B, Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros. Tambin permite subtipificar especies virales como por ejemplo el virus herpes simple de tipo 1 y 2. Esta tcnica requiere solo dos a cuatro horas y se le ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con los cultivos celulares para la identificacin del virus herpes simple, 80-95% para el virus sincicial respiratorio y 71% para Influenza A. La tincin con inmunoperoxidasa es similar a la de IF y es la tcnica de eleccin en algunos laboratorios. El procedimiento requiere algunos pasos adicionales, dado que en este caso el Ac monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adicin de un substrato, para evidenciar la reaccin por un cambio de color visible micro y macroscpicamente. La IF indirecta es un mtodo rpido y confiable para la determinacin de Ac en el suero del paciente. El principio de la tcnica se ilustra en la figura 4. Se basa en la unin del Ac presente en el suero del paciente, con los Ag expresados en la superficie y el citoplasma de las clulas infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan clulas no infectadas. Primero se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no infectadas; luego se realiza un lavado con solucin amortiguadora y se agregan Ac contra la inmunoglobulina G humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. ste ltimo es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz ultravioleta y emite una luz de color verde caracterstica. El conjugado se unir a los Ac del paciente si la reaccin es positiva, leyndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparicin de fluorescencia en el citoplasma y la superficie de las clulas infectadas, mientras que las clulas control no fluorescen, generalmente se ven de color rojo. (Ver figura 4). El radioinmunoensayo (RIA) fue originalmente aplicado para identificar el Ag de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y el Ac anti-HBsAg. Estos ensayos tienen buena sensibilidad y especificidad, pero la aparicin del EIA con mayor tiempo de conservacin de los reactivos, costo ms bajo y ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las tcnicas de RIA en la mayora de las situaciones en las que se requiere la deteccin de Ag viral. La tcnica de western blot (WB) tiene muchas aplicaciones en el diagnstico virolgico. Son particularmente tiles para el diagnstico del virus de la inmunodeficiencia humana
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Figura 5. Esquema de Western blott para la deteccin de anticuerpos
(VIH). Dicha tcnica se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa, con el objeto de determinar la presencia de Ac especficos contra cada una de esas protenas. Se realiza esquemticamente en tres pasos. En el primero se realizan cultivos celulares de grandes cantidades de virus que luego son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. Los Ag resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida. A continuacin se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. Por ltimo se coloca el suero del paciente en la membrana de nitrocelulosa y se agregan Ac anti-inmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina); finalmente se agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con un producto final coloreado. Esta tcnica es similar a un EIA, aunque menos sensible pero ms especfica. En la prctica, solamente el tercer paso se realiza en los laboratorios de diagnstico, dado que los equipos comerciales proveen tirillas con los Ag; esto facilita la estandarizacin de las determinaciones. (Ver figura 5) La interpretacin de las pruebas serolgicas que detectan Ac tienen como concepto central, el aumento del ttulo. El ttulo de Ac es la recproca de la mayor dilucin del suero del paciente, en que los Ac son an detectables. Los pacientes con muchos Ac tienen ttulos altos, ya que los Ac sern detectables an en diluciones altas del suero. Los pacientes con respuesta humoral ntegra, aumentarn el ttulo de Ac durante la enfermedad. Por lo tanto, se deben realizar dos extracciones de suero con un intervalo de dos semanas para poder detectar las modificaciones en el ttulo, la cual tiene que ser cuatro veces (dos diluciones) mayor para considerarse significativa. En algunas infecciones sern necesarios perodos de tiempo mayores para evidenciar dichos cambios. Una forma alternativa es la deteccin de inmunoglobulina M (IgM) especfica. Como mtodo directo, la deteccin de Ag es de uso corriente en el laboratorio para el diagnstico de agentes de meningitis, para la deteccin de Ag de S. pyogenes en la faringe y para muchos virus (sicicial respiratorio, Rotavirus, virus de la hepatitis). Como mtodo indirecto para la deteccin de Ac contra el microorganismo se usa en: brucelosis, fiebre tifoidea, infecciones por Chlamydia o Mycoplasma, infecciones virales como hepatitis, VIH, virus herpes y enfermedades eruptivas como sarampin, rubola, paperas y dengue.
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Basados en los cidos nucleicos En los ltimos aos, ha ganado aceptacin en el laboratorio clnico el uso de tcnicas basadas en la deteccin de cidos nucleicos. La combinacin del reconocimiento de fragmentos de cidos nucleicos por medio de sondas y la amplificacin previa continan en desarrollo. Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento de cido desoxirribonucleico (ADN) por medio de endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias extradas se pueden desnaturalizar y marcar con una enzima o con un istopo radioactivo. A estas cadenas marcadas, que tienen una secuencia de ADN conocida se llaman sondas de cidos nucleicos. Hoy se estn produciendo sondas de cidos nucleicos sintticas, y as se obtienen sondas de oligonucletidos de alta especificidad que estn disponibles en el mercado y son las ms usadas en los laboratorios. Hibridacin molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: ADNADN, ARN-ARN y ADN-ARN. Primero tratan las muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los cidos nucleicos. Luego se aade un fragmento de ADN marcado, complementario al ADN viral o bacteriano y se incuba en condiciones que posibiliten la hibridacin. Finalmente la muestra se pasa por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al ADN hibridado, de la no hibridada. Dependiendo de como este marcada la sonda, se detectar la hibridacin. Si est marcada con un istopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma, en la cual la cantidad de radiacin medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de ADN presente en la muestra problema. Tambin se puede realizar la electroforesis del ADN hibridado con la sonda marcada, en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicacin de una placa de rayos X (autoradiografa). Si est marcada con una enzima se detecta por colorimetra. Citomegalovirus, Papilomavirus y virus Epstein-Barr, han sido identificados usando sondas de cidos nucleicos (ver figura 6). La amplificacin de cidos nucleicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es otra tcnica alternativa a los cultivos. Primero se realiza la amplificacin de los
Figura 6. Hibridacin de AND con una sonda marcada
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fragmentos de ADN a hibridar, con la reaccin en cadena de la polimerasa que aumenta notablemente la sensibilidad de las tcnicas de deteccin de ADN. Aunque todava son costosos, estos mtodos de microbiologa molecular, ya tienen su espacio en el laboratorio clnico. Son tiles en la investigacin de algunas bacterias como Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia sp., Mycoplasma. Tambin se usan para la deteccin de genes que le confieren a la bacteria resistencia a algunos antibiticos, por ejemplo la meticilino resistencia de S. aureus y las betalactamasas de N. gonorrhoeae. En virologa han introducido importantes cambios en el diagnstico de enfermedades, tales como la encefalitis herptica y otras enfermedades neurolgicas virales, la infeccin por VIH del recin nacido y la infeccin por Papilomavirus humano. La PCR fue desarrollada por Saiki et al., para aumentar el nmero de molculas de ADN blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una nica molcula de ADN y una sola copia de genes puede ser extrada de mezclas complejas de secuencias genmicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. Esta tcnica consiste, en una amplificacin de secuencias especficas del ADN. Se basa en el uso de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan especficamente con cada una de las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reaccin se produzca se usa una enzima llamada Taq pol (ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la ADN polimerasa consiste en reparar y replicar el ADN. Los deoxinucletidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construccin. El nucletido al cual se una la polimerasa ser complementario al de la base en la posicin correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza as una cadena simple de ADN, complementaria y alineada a cada cebador. Se realiza una serie repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos bsicos: desnaturalizacin a altas temperaturas (95C) del ADN de doble cadena; acoplamiento de los cebadores, la temperatura se desciende a 55 - 72C y elongacin del cebador, aqu se eleva la temperatura a 72C permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos. Mientras tanto se van deplecionando los cebadores y los deoxinucletidos y se van sintetizando nuevas cadenas de ADN. Al final se consiguen miles de copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los cebadores. Los fragmentos de ADN obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida con tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta o hibridacin con una sonda marcada. La combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser el mtodo ms sensible para la deteccin e identificacin de los virus (ver figura 7). En conclusin decimos que para elegir un mtodo diagnstico, adems de la sensibilidad y la especificidad, hay que considerar aspectos operativos de las tcnicas a usar tales como el costo, la complejidad tcnica del ensayo, el volumen necesario y preparacin de la muestra, el tiempo que requiere el proceso y la disponibilidad comercial de los reactivos de calidad reconocida. Adems, se debe considerar el nivel de complejidad del laboratorio y la disponibilidad tecnolgica y de recursos que requiere cada tcnica.
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Figura 7. Esquema de PCR
Bibliografa
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Inmunidad contra los agentes infecciosos

J. Chabalgoity, M. Pereira, A. Rial
Introduccin
A lo largo de su vida, un individuo est expuesto a muchos agentes infecciosos; sin embargo, en la mayora de las situaciones la enfermedad es la excepcin ms que la regla. La mayora de los microorganismos infecciosos no logran ingresar al individuo, gracias a las barreras fsicas y qumicas que ste presenta. La barrera fsica ms importante es la piel; la integridad de sta, junto a la secrecin de mediadores qumicos, evita el ingreso de microorganismos patgenos. Asimismo, las mucosas poseen una serie de atributos (secreciones, flujo ciliar) que dificultan el ingreso de microorganismos por esa va. Adems, la existencia de poblaciones microbianas no patgenas residentes (flora normal), tambin impide la colonizacin de las mucosas por agentes infecciosos. La mayora de los microorganismos que logran evadir estas barreras y producir infeccin, son destruidos en pocas horas por mecanismos no especficos de induccin rpida (inmunidad innata). Sin embargo, si un agente infeccioso es capaz de superar esas primeras lneas de defensa, se activar, en la mayora de los casos, un tipo de respuesta de defensa (inmunidad adaptativa), altamente especializada y especfica. sta lograr, en la mayora de las situaciones, controlar la infeccin y suprimir la enfermedad. Adems, de este proceso resultar la generacin de memoria inmunolgica, que permitir al individuo en el prximo contacto con el mismo agente, responder ms rpida y efectivamente (ver figura 1). La importancia fundamental que tiene el sistema inmune en la sobrevida de los individuos, est evidenciada por las enfermedades que padecen los individuos con alguna disfuncin de este sistema. Por otro lado, la correcta regulacin de la homeostasis del sistema inmune es central, porque la exacerbacin de la respuesta puede provocar enfermedad en el individuo. As, la inmunopatologa es una consecuencia frecuente de la respuesta inmune contra muchos agentes infecciosos. En este captulo describiremos, en trminos generales, las caractersticas centrales de la respuesta inmune innata y adaptativa, analizando las caractersticas fundamentales de la respuesta inmune desarrollada contra distintos microorganismos. La inmunologa como ciencia ha tenido gran desarrollo y existen excelentes libros de texto bsicos en esta materia que deberan ser consultados para un conocimiento ms detallado.
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Figura 1
Inmunidad innata e inmunidad adaptativa

Una respuesta inmune efectiva del husped frente a organismos extraos requiere de la accin coordinada y conjunta del sistema inmune innato y adaptativo. Durante muchos aos se estudi ambas formas de inmunidad como entidades separadas, las cuales actuaban en forma secuencial. Sin embargo, hoy se sabe que ambos mecanismos son dependientes de un nico sistema integrado. La respuesta inmune innata brinda la primer lnea de defensa contra los microorganismos invasores pero adems provee el contexto biolgico y las seales que instruirn al sistema inmune adaptativo para montar su respuesta. As, los eventos ocurridos en el contexto de la inmunidad innata, determinan el perfil del tipo de respuesta adaptativa que se desarrollar contra el agente patgeno. Asimismo la respuesta inmune adaptativa recurre a mecanismos efectores y mediadores caractersticos de la inmunidad innata para eliminar los microorganismos.
INMUNIDAD INNATA
El objetivo de la inmunidad innata es evitar la instalacin del proceso infeccioso; si ste se produce, dicho mecanismo inmunitario logra establecer un ambiente para que se desarrolle una respuesta adaptativa. Los mecanismos efectores de defensa de la inmunidad innata estn compuestos por clulas que cumplen funciones defensivas (fagocitosis, citotoxicidad) y factores solubles (citoquinas y quemoquinas, interferones, complemento) que controlan y destruyen los microorganismos que ingresan. Estos mecanismos si bien son generales y durante mucho tiempo se los consider inespecficos, hoy se sabe que incluyen mecanismos de reconocimiento acoplados a sistemas de sealizacin intracelular, que permiten identificar el tipo de agente patgeno que est ingresando a la clula. Ello permite activar una respuesta rpida y efectiva contra el microorganismo, adems de definir el perfil de respuesta inmune adaptativa que se generar contra el agente patgeno si ste logra sobrepasar la primera lnea de defensa. Los fagocitos poseen receptores que reconocen componentes microbianos El reconocimiento de los microorganismos por el sistema inmune innato, est determinado por receptores conocidos como "Pattern Recognition Receptors" (PRRs) que reconocen patrones moleculares conservados: "Pathogen Associated Molecular Patterns" (PAMP), compartidos por grandes grupos de microorganismos. Como ejemplos de esos patrones aso-
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Figura 2.
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ciados a patogenicidad mencionamos el lipopolisacrido (LPS) en bacterias gramnegativas y los proteoglicanos de la pared de bacterias grampositivas. Existen receptores de superficie en las clulas del sistema inmune innato, que reconocen estos patrones y activan las vas de sealizacin celular que iniciarn una serie de eventos coordinados en la inmunidad innata (ver figura 2). Entre estos receptores se encuentran los llamados "Toll Like Recpetors" (TLRs); son una familia de receptores conservados en trminos evolutivos, altamente especializados en transducir seales. Son esenciales para traducir el reconocimiento de componentes microbianos en activacin del sistema inmune. En la actualidad hay ya descritos 10 TLRs diferentes, que inetractan con una gran cantidad de PAMPS, como LPS (TLR-4), peptidoglicanos (TLR-2), o secuencias de ADN (TLR-9). Esta es adems un rea de gran acrtividad de investigacin en la actualidad. Los macrfagos tisulares residentes tienen un rol crtico en el inicio de la respuesta inmune innata en el tejido. Dichos fagocitos profesionales expresan PRRs, reconocen antgenos extraos como patgenos y desencadenan la respuesta inmune innata mediante la activacin de uno o ms TLRs. La activacin de TLRs en macrfagos tisulares residentes y clulas dendrticas (DCs), induce la liberacin de mediadores inflamatorios (includas las quemoquinas) y modula la expresin de receptores de quemoquinas en las DCs. Los eventos mediados por TLRs son esenciales, tanto para el reclutamiento de DCs a los sitios de entrada de patgenos, como para su posterior migracin a los ndulos linfticos regionales para activar a los linfocitos T vrgenes especficos para el antgeno, iniciando as la respuesta inmune adaptativa. Adems, las quemoquinas liberadas por las clulas tisulares residentes despus de su activacin guiarn a esas clulas T activadas desde el ndulo linftico al sitio de entrada o de replicacin del microorganismo. Por lo tanto, las quemoquinas son un factor central que une eventos de la inmunidad innata y adaptativa. Estas sustancias pueden dividirse en inflamatorias y constitutivas. Las quemoquinas inflamatorias son inducidas o reguladas positivamente por estmulos inflamatorios (LPS, peptidoglicanos, cidos teicoicos, motivos CpG) y son responsables del reclutamiento de clulas inflamatorias. Como ejemplo de stas citamos: interleuquina 8 (IL8), MIP-1, MIP-1, RANTES, exotaxina, protena quimiotctica monoctica 1 (MCP-1) y protena inducible por IFN- (IP-10). Las quemoquinas constitutivas (SLC, ELC, TARC) estn presente solo en mdula sea, timo y rganos linfoides secundarios. Son las responsables del control homeosttico de los leucocitos y de dirigir el encuentro de las clulas que necesitan interaccionar para generar una respuesta inmune: DCs y clulas T y B. En conclusin, la discriminacin de los microorganismos a travs de los TLRs y la posterior produccin de un conjunto de quemoquinas determinadas, podra ser el primer punto en el cual el sistema inmune delimita su respuesta ante agentes patgenos especficos. Por otro lado, demuestra que los microorganismos determinan la naturaleza de la respuesta inmune por la activacin diferencial de TLRs y los patrones de expresin de quemoquinas que determinarn los tipos celulares reclutados. Importancia de la respuesta inmune innata Durante muchos aos se ha acumulado informacin de la importancia de la respuesta inmune adaptativa, evaluando fundamentalmente las enfermedades asociadas a las deficiencias de los componentes de la misma. Se conoce mucho menos sobre la importancia de la respuesta inmune innata, porque las deficiencias de sta son muy raras. Sin embargo, experimentos realizados con animales transgnicos que presentan algn tipo de deficiencia en los componentes de la respuesta innata, sugieren que este tipo de respuesta no es redundante con la inmunidad adaptativa y tiene un rol esencial en la sobrevida de los individuos.
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Figura 3.
INMUNIDAD ADAPTATIVA
Cuando un microorganismo logra evadir los mecanismos de la respuesta inmune innata y en el individuo se acumula una cantidad de antgeno mayor a un umbral determinado, se activarn los mecanismos de la inmunidad adaptativa. Dicho proceso provocar la activacin de las clulas con alta especificidad por el microorganismo en cuestin, y de mecanismos efectores especficos contra el agente patgeno. Esta respuesta demora varios das en activarse y est mediada por linfocitos T y B especficos para el microorganismo, que se activan y proliferan induciendo mecanismos efectores que eliminan el agente infeccioso y generan memoria inmunolgica (ver figura 3). Como ya se mencion, hoy se sabe que la activacin de inmunidad adaptativa y el tipo de respuesta generada, depende de eventos inducidos como consecuencia del proceso de reconocimiento y sealizacin de la inmunidad innata. La respuesta inmune adaptativa se inicia en los ndulos linfticos que drenan el sitio de infeccin, cuando las clulas T naive circulantes encuentran su antgeno especfico. El antgeno es capturado en el tejido por DCs que se activan y se transforman en clulas presentadoras de antgeno (APC) profesionales y lo llevan hacia los ndulos linfticos regionales. Cuando llegan al ndulo, las DCs activadas presentan el antgeno a clulas T naive que se activarn y diferenciarn a clulas efectoras. Estas clulas activadas abandonan el ndulo y migran hacia el sitio de inflamacin dirigidas por citoquinas y quemoquinas; all realizan la actividad efectora de la inmunidad celular o permanecern en el rgano linftico para participar en la inmunidad humoral por activacin de linfocitos B especficos por el antgeno. El tipo de respuesta que se genere estar determinada en gran parte por el ambiente de citoquinas generadas desde la inmunidad innata y durante la presentacin antignica, esto determinar la expansin de clulas T de tipo 1 o 2 (clulas Th1 o Th2). Dependiendo de que tipo de clulas T se expandan, ser el tipo de inmunidad y los mecanismos efectores que se activarn.
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Las DCs representan el tipo de APC ms importante en todo el sistema inmune. Constituyen una poblacin de clulas muy heterognea, habindose identificado muchas subpoblaciones tanto en humanos como en ratn. Sin embargo, todas derivan de un precursor CD34+ de mdula sea. Son clulas con alta capacidad migratoria, que circulan entre la sangre, los tejidos perifricos, la linfa y los rganos linfticos. Las DCs circulan en la sangre como precursores hasta que ingresan a un tejido determinado, en el cual se transforman en DCs inmaduras (iDCs) residentes. Su rol principal en los tejidos y en las mucosas es monitorear los antgenos del microambiente, para despus migrar hacia los ndulos linfticos regionales para presentar los pptidos antignicos procesados a las clulas T. Las DCs, no solo son fundamentales en la generacin de una respuesta inmune, sino que tambin cumplen un rol fundamental en los procesos de regulacin de naturaleza cualitativa de esa respuesta, as como en la induccin de tolerancia inmune ante antgenos inocuos. Por todo esto, es que actualmente se considera que la DC es una clula clave en la regulacin de la homeostasis del sistema inmune.
Respuesta inmune contra microorganismos

Las respuestas inmunes contra los microorganismos, aunque mltiples y variadas, presentan algunas caractersticas generales. La primera es que la defensa efectiva contra los microorganismos est mediada por mecanismos efectores tanto de la inmunidad innata como de la adaptativa. Muchos microorganismos han desarrollado mecanismos que les permiten sobrevivir a la respuesta inmune innata y la proteccin contra ellos requiere la participacin activa de la inmunidad adaptativa. Sin embargo, como se mencion anteriormente, el tipo de respuesta adaptativa est determinada en gran parte por eventos ocurridos durante la respuesta innata. Los agentes infecciosos pueden diferir mucho en sus patrones de invasin y de colonizacin, as como en la inmunogenicidad de sus antgenos. Por lo tanto, una respuesta inmune efectiva contra microorganismos distintos, puede requerir la activacin de distintos tipos de mecanismos efectores tanto en la respuesta inmune innata como en la adaptativa. La supervivencia y la patogenicidad de los microorganismos en el husped estn crticamente influenciadas por su capacidad de evadir o resistir la inmunidad protectora, para lo cual ellos han desarrollado diferentes estrategias. Otra caracterstica en comn es que en muchas infecciones el dao tisular y la enfermedad producida puede ser causada por la propia respuesta inmune del husped contra el patgeno, ms que por el microorganismo en s mismo.
INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS EXTRACELULARES
Las bacterias extracelulares pueden causar enfermedad por dos mecanismos distintos. El primero es la inflamacin que provoca destruccin de los tejidos en el sitio de infeccin. Como ejemplo de esto citamos las infecciones supuradas producidas por Staphylococcus sp. y Streptococcus sp. El segundo mecanismo es la produccin de toxinas con distintos efectos nocivos. La endotoxina de las bacterias gramnegativas es un potente estimulador de la produccin de citoquinas y activador de los macrfagos. Muchas exotoxinas son primariamente citotxicas, pudiendo matar por distintos mecanismos a las clulas a las que se fijan. Otras interfieren con las funciones celulares esenciales, por ejemplo la toxina diftrica inhibe la sntesis proteica bloqueando la funcin del factor de elongacin 2, necesario para la sntesis de todos los polipptidos. Otro ejemplo seran algunas toxinas clostridiales como las producidas por
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Figura 4.
Clostridium perfringens histotxico, que provocan una extensa necrosis de los tejidos, desarrollando gangrena gaseosa. Inmunidad innata Los mecanismos fundamentales de la inmunidad innata operantes contra bacterias extracelulares son la fagocitosis, la respuesta inflamatoria y la activacin del complemento. Los fagocitos pueden unirse a bacterias extracelulares mediante una serie de receptores; dicha interaccin, junto con la sealizacin intracelular realizada por los TLRs, activa los fagocitos incrementando su capacidad fagoctica y microbicida. De ah que la resistencia de las bacterias a la fagocitosis y a la digestin dentro de los macrfagos, es un determinante importante de la patogenicidad y virulencia de las mismas. La activacin de los fagocitos tambin provoca la secrecin de citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNF-a) y las interleuquinas IL-1, IL-6 e IL-8, que inducen la adhesin de neutrfilos y monocitos al endotelio vascular en el sitio de la infeccin, seguida por la migracin, acumulacin local y activacin de las clulas inflamatorias que eliminan las bacterias (ver figura 4). Sin embargo, la produccin de grandes cantidades de citoquinas puede ser perjudicial y de hecho son responsables de algunas manifestaciones clnicas de las infecciones por bacterias extracelulares. El dao de tejidos normales adyacentes es un efecto colateral de estos mecanismos de defensa. La consecuencia ms grave inducida por la secrecin descontrolada de citoquinas, es el shock sptico que puede presentarse con coagulacin intravascular diseminada, falla multiorgnica y muerte, propio de algunas infecciones por bacterias gramnegativas (desencadenado por el LPS) y grampositivas (donde el peptidoglicano y los cidos teicoicos desencadenan efectos similares). La activacin del complemento en ausencia de anticuerpos, tambin tiene un rol importante en la eliminacin de estas bacterias. El peptidoglicano de las paredes celulares de las bacterias grampositivas y el LPS de las paredes celulares gramnegativas, activan la va
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alterna del complemento promoviendo la formacin de C3 convertasa. Las bacterias que expresan manosa en su superficie, pueden unir una lectina (MBL), homloga a C1q, que activa el sistema de complemento por la va de las lectinas. Como resultado de la activacin de este sistema, se genera C3b que opsoniza a las bacterias y mejora su fagocitosis. Adems, la activacin de la cascada del complemento podra terminar en la formacin de un complejo de ataque a membranas que lisa a las bacterias.
Figura 5.
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Inmunidad adaptativa La inmunidad humoral es la principal respuesta especfica protectora contra estas bacterias. Los polisacridos de las paredes celulares y de las cpsulas de estos microorganismos constituyen uno de los componentes ms inmunognicos de las mismas y son el prototipo de antgeno T independiente. Dichos antgenos estimulan a las clulas B que generan una respuesta de inmunoglobulina (Ig) M especfica, aunque tambin pueden generarse otros isotipos de Ig. Probablemente sea la liberacin de citoquinas la que promueva el cambio de isotipos de cadena pesada de la Ig. Los anticuerpos producidos contra los antgenos de superficie (polisacardicos o proteicos) y las toxinas bacterianas, estimulan tres tipos de mecanismos efectores (ver figura 5): 1. Las IgG opsonizan a las bacterias favoreciendo la fagocitosis; stas se unen a los receptores Fc presentes en los monocitos, los macrfagos y los neutrfilos. 2. Las IgG y las IgM neutralizan las toxinas bacterianas impidiendo que se unan a sus clulas blanco, promoviendo su fagocitosis. Por ejemplo, la inmunizacin pasiva con anticuerpos dirigidos contra la toxina tetnica, es un tratamiento que podra salvar la vida del paciente en una infeccin aguda por Clostridium tetani. En la mucosa respiratoria y gastrointestinal, la IgA secretoria tiene un rol importante en la neutralizacin de toxinas y en la prevencin de la colonizacin de dichos tejidos. 3. Tanto la IgG como la IgM activan el sistema del complemento, que conducen a la formacin, en la superficie bacteriana, de un complejo de ataque a la membrana (MAC), cuya funcin ltica es importante slo para eliminar algunos microorganismos. Los individuos con deficiencia en los componentes tardos del complemento (C5 a C9), involucrados en la formacin del MAC, tienen mayor sensibilidad a la infeccin por determinados microorganismos como especies de Neisseria; aunque no a otras infecciones bacterianas. La principal respuesta de las clulas T frente a las bacterias extracelulares, est mediada por los linfocitos T CD4+ que fueron activados por los antgenos bacterianos, presentados por molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II. Estos linfocitos actuaran como clulas T helper secretando citoquinas que estimulan la produccin de anticuerpos especficos y activando las funciones fagocticas y microbicidas de los macrfagos. Algunas toxinas bacterianas (superantgenos) pueden estimular inespecficamente a las clulas T, en consecuencia se liberan grandes cantidades de citoquinas y mediadores inflamatorios que finalizan con la produccin del sndrome de shock txico. Como ejemplos de estos superantgenos mencionamos: la toxina del sndrome del shock txico de S. aureus (TSST) y la exotoxina pirgena de S. pyogenes. La inflamacin aguda y el shock (txico o sptico) son dos consecuencias nocivas de la defensa contra las bacterias extracelulares. Una complicacin tarda de las respuestas inmunes humorales frente a infecciones bacterianas, puede ser debida a la produccin de anticuerpos productores de enfermedad. Son ejemplos conocidos de este fenmeno las enfermedades postestreptocccicas, que pueden darse como secuelas de infecciones producidas por S. pyogenes (fiebre reumtica y glomerulonefritis difusa aguda). Evasin de mecanismos inmunes por bacterias extracelulares La virulencia o patogenicidad de estas bacterias se relaciona con atributos que favorecen la colonizacin e invasin de los tejidos del husped y que les permiten resistir a la accin del sistema inmune. stos incluyen: protenas de superficie bacteriana con propiedades de adhesinas, mecanismos antifagocitarios e inhibicin del complemento o inactivacin de sus productos. Por ejemplo, algunos microorganismos como N. meningitidis, H. influenzae y S.
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pneumoniae, secretan proteasas de IgA (anticuerpo presente en las mucosas que colonizan); S. pyogenes y S. agalactiae, presentan proteasas de C5a. Las cpsulas de muchas bacterias grampositivas y gramnegativas, confieren resistencia a la fagocitosis; adems algunas tienen residuos de cido silico que inhiben la activacin de la va alterna del complemento. Por lo tanto, la produccin de cpsula constituye un mecanismo importante de evasin inmune y las bacterias encapsuladas son ms virulentas que cepas carentes de cpsula. Muchas bacterias que causan meningitis (N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae) son capsuladas. Las cpsulas constituyen un elemento comn y esencial de estas bacterias, que les permite sobrevivir en la sangre. Despus de una fase de bacteriemia en la cual las bacterias evaden la fagocitosis y resisten la accin bactericida del complemento, llegan al espacio subaracnoideo y se multiplican activamente en un ambiente donde los mecanismos de defensa son inefectivos. El husped tiene algunos mecanismos para oponerse al efecto antifagoctico de las cpsulas bacterianas; pero stos slo son efectivos luego del desarrollo de anticuerpos anticapsulares especficos que opsonizan al microorganismo para mejorar la fagocitosis y activan al complemento. En el individuo no inmunizado, mientras se desarrolla una respuesta adecuada de anticuerpos especficos, la bacteria puede multiplicarse en la sangre e invadir las meninges causando una meningitis aguda supurada. Por lo antedicho es que las vacunas desarrolladas contra estos microorganismos tienen antgenos capsulares de la bacteria como componente principal. Otro mecanismo usado por las bacterias para evadir la respuesta inmune adaptativa, es la variacin gentica de antgenos de superficie. Muchas bacterias como Escherichia coli y Neisseria gonorroheae, presentan pili (estructuras implicadas en la adhesin bacteriana a las clulas del husped, constituidos por la protena pilina). En las N. gonorroheae, los genes que codifican la pilina consisten en uno o dos loci de expresin y diez a veinte loci silenciosos, cada uno conteniendo seis secuencias codificantes llamadas minicassettes. La variacin antignica de la protena pilina resulta de una alta tasa de conversin entre loci silenciosos y de expresin. As, es posible crear ms de 106 combinaciones cuyos productos proteicos son antignicamente distintos. Este mecanismo de variacin antignica ayuda a la bacteria a escapar de los anticuerpos especficos, aunque el significado principal para el microorganismo sea seleccionar el pili que mejor se adhiera a las clulas epiteliales del husped.
INMUNIDAD FRENTE A BACTERIAS INTRACELULARES
Algunas bacterias son capaces de sobrevivir y replicarse dentro de clulas del husped. Ciertas bacterias patgenas como Mycobacterium y Listeria monocytogenes, son capaces de sobrevivir y multiplicarse an dentro de los fagocitos. Como estas bacterias estn en un nicho inaccesible a los anticuerpos circulantes, su eliminacin requiere mecanismos inmunes distintos a los ya vistos para las bacterias extracelulares. Inmunidad innata Los mecanismos centrales de la inmunidad innata frente a estas bacterias son la fagocitosis y la accin de clulas natural killer (NK). Sin embargo, las bacterias intracelulares son resistentes a la degradacin dentro de los fagocitos mononucleares. Dicha resistencia contribuye en gran medida a que algunos patgenos intracelulares como M. tuberculosis sean capaces de permanecer por largos perodos en el husped, recidivar luego de curas aparentes y establecer infecciones crnicas de difcil erradicacin. Por otro lado, las bacterias intracelulares inducen la activacin de clulas NK, ya sea
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Figura 6.
directamente o mediante la produccin de citoquinas (especficamente interleuquina 12 o IL-12) derivadas de macrfagos. Las clulas NK activadas secretan interfern (IFN-), que es a su vez un potente activador de los macrfagos, mejorando su capacidad fagoctica y microbicida. Este proceso podr retrasar el crecimiento de la bacteria; sin embargo, la resolucin definitiva de la infeccin requiere de la inmunidad adaptativa. En tal sentido, se considera que las clulas NK son las clulas claves para la contencin de las bacterias intracelulares mientras se desarrolla la inmunidad adaptativa. Inmunidad adaptativa La principal respuesta inmune protectora contra las bacterias intracelulares es la inmunidad mediada por clulas. Muchos antgenos proteicos de estas bacterias estimulan las respuestas de clulas T CD4+ y CD8+ y ambos tipos celulares contribuyen al desarrollo de inmunidad protectora contra las bacterias intracelulares. Una funcin efectora central para eliminar estos microorganismos es mediada por macrfagos activados por citoquinas (particularmente IFN-), derivadas de clulas Th1 activadas (ver figura 6). Por otro lado, las clulas T CD8+ activadas pueden actuar como linfocitos citotxicos sobre clulas infectadas, que presentan antgenos bacterianos en el contexto de MHC clase I. Las diferencias en el tipo de respuesta mediada por clulas T, puede explicar las distintas manifestaciones clnicas que determina la infeccin por un microorganismo en individuos diferentes. En algunas situaciones, esto se ha explicado por el entorno de citoquinas secretadas en el transcurso de la respuesta, que determina la expansin de un grupo de clulas Th1 o Th2, que inducen mecanismos efectores distintos. Mientras una respuesta de tipo 1 favorece la inmunidad celular y determina niveles bajos de anticuerpos, una respuesta de tipo 2 determinar lo contrario (altos ttulos de anticuerpos y baja inmunidad celular). Por otro lado, como ya se mencion, estas bacterias han desarrollado mecanismos que las hacen resistentes a la fagocitosis y que persisten por largos perodos an en individuos con inmunidad celular efectiva. Dicha persistencia genera una estimulacin antignica crnica, que puede conducir a la formacin de colecciones locales de macrfagos activados (granulomas) que rodean los microorganismos impidiendo su diseminacin. La inflamacin granulomatosa es una caracterstica histolgica propia de muchas infecciones producidas por micobacterias y que se asocia con necrosis y fibrosis, conduciendo a lesiones funcionales severas. As, la
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respuesta inmune del husped es la causa principal de la lesin tisular y la enfermedad en muchas infecciones por bacterias intracelulares como las micobacterias. La respuesta inmune montada frente a este tipo de infecciones puede variar entre los individuos, siendo determinante de la progresin de la enfermedad y del pronstico clnico. Evasin de mecanismos inmunes por bacterias intracelulares La mayora de las bacterias se inactivan cuando son fagocitadas por macrfagos y leucocitos polimorfonucleares. Sin embargo, muchos microorganismos han desarrollado estrategias para sobrevivir y replicarse en estas clulas. Algunos usan los mecanismos fagocticos preexistentes para su internalizacin, como Mycobacterium sp. y Legionella pneumophila, que se unen a fragmentos C3b del complemento lo que favorecen su captacin por las clulas fagocticas. Una vez dentro de la vacuola fagoctica, algunos patgenos disuelven la membrana vacuolar y acceden al citoplasma celular rico en nutrientes, evadiendo los mecanismos bactericidas del fagocito; por ejemplo Shigella flexneri, algunas Rocketsias y L. monocytogenes; sta ltima produce una hemolisina (listeriolisina O) que forma poros en la membrana del fagosoma. Otros microorganismos como Mycobacterium y Legionella, son capaces de inhibir la actividad bactericida de los fagocitos impidiendo la fusin del fagolisosoma (impiden la acidificacin del fagosoma) y algunos como Coxiella burnetti, sobreviven a los agentes bactericidas liberados en el fagolisosoma (incluso requieren de factores all presentes como seales que disparan su multiplicacin intracelular). Los principales factores de virulencia bacterianos que permiten resistir la fagocitosis y facilitan la sobrevida intracelular incluyen las cpsulas y la produccin de enzimas que destruyen la membrana vacuolar, que degradan protenas lisosmicas, o que neutralizan los radicales txicos del oxgeno.
INMUNIDAD FRENTE A LOS VIRUS
Los virus son microorganismos intracelulares obligados, que generalmente ingresan a las clulas susceptibles usando como receptores las molculas normales de superficie celular. Por ejemplo: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se absorbe a la clula por medio de una glicoprotena de la envoltura viral (Gp 120) que se une al receptor CD4 de superficie, en este proceso tambin participan como coreceptores otras molculas de superficie celular. Los rinovirus (virus causante del resfro comn) se unen a molculas de adhesin intercelular (ICAM-1) expresadas en las clulas de muchos tejidos como las del epitelio respiratorio. Cuando el virus est dentro de la clula husped, causa lesin celular por diferentes mecanismos. La replicacin viral puede interferir con la sntesis proteica celular y provocar la muerte de la clula por lisis, liberndose muchas partculas virales nuevas (virus citolticos). Otros virus pueden causar infecciones latentes y permanecer quiescentes por largos perodos de tiempo, sin conducir a la muerte inmediata de la clula husped. La inmunidad contra los virus debe ser capaz de actuar en las distintas poblaciones de clulas infectadas (dado que distintos virus infectan distintas clulas). Dicho mecanismo inmunitario opera a dos niveles: previo a la invasin celular, en la etapa inicial de la infeccin y despus de la invasin cuando los virus son inaccesibles a los anticuerpos y fagocitos. Inmunidad innata En primer lugar, la infeccin viral estimula la produccin, por parte de las clulas infectadas, de IFN tipo 1 (que comprende dos grupos serolgicamente distintos, el y el ). El IFN tipo 1 tiene muchas acciones biolgicas. En principio inhibe la replicacin viral estimulando la
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Figura 7.
sntesis de enzimas celulares que interfieren con la replicacin del cido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) viral. Su accin antiviral tambin es ejercida sobre las clulas vecinas no infectadas, que quedan as protegidas de la infeccin. Adems, el INF tipo 1 inhibe la proliferacin celular por induccin de las mismas enzimas mencionadas anteriormente y de otras que actan inhibiendo la sntesis de aminocidos. Tambin aumenta el potencial ltico de las clulas NK cuya funcin principal es matar las clulas infectadas por virus. Por ltimo, modula la expresin de molculas MHC, aumentando la expresin de las molculas MHC clase I e inhibiendo las de clase II. As mejora la eficiencia de los linfocitos T citolticos que reconocen antgenos extraos asociados a molculas MHC de clase I. En segundo lugar, las clulas NK lisan muchas clulas infectadas por virus, constituyendo uno de los mecanismos efectores principales en los estados iniciales de la infeccin viral. (Ver figura 7). Adems del IFN tipo 1, el IFN-, el TNF y la IL-2, aumentan el potencial ltico de estas clulas. Inmunidad adaptativa La inmunidad especfica contra virus est mediada tanto por mecanismos celulares como humorales. En las etapas iniciales de la infeccin, los anticuerpos especficos antivirales son muy importantes. Los dirigidos contra las protenas de envoltura o de las cpsides virales que participan en la adsorcin, impiden la unin con el receptor celular y por lo tanto el ingreso a la clula susceptible; stos son llamados anticuerpos neutralizantes. Adems, opsonizan a
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los virus, mejorando las funciones fagocticas, aunque tambin pueden facilitar la infeccin de aquellas clulas portadoras de receptores Fc. La IgA de las mucosas es importante en la neutralizacin de virus que ingresan al organismo por va respiratoria o digestiva; de hecho la induccin de inmunidad secretoria es una de las bases para el desarrollo de vacunas orales o nasales. Desafortunadamente, la vacuna oral contra la poliomielitis es una de las pocas que lo ha logrado. La activacin del complemento tambin puede participar de la inmunidad mediada por anticuerpos, principalmente lisando virus envueltos y promoviendo la fagocitosis. La inmunidad humoral es un componente importante de la respuesta inmune contra los virus, pero no es suficiente para erradicar muchas infecciones virales. Los anticuerpos tienen efecto protector, slo en las primeras etapas de la infeccin viral; adems, es importante destacar que su capacidad neutralizante in vitro, tiene poca correlacin con la capacidad protectora in vivo y que es difcil transferir inmunidad antiviral a animales no inmunes slo con anticuerpos purificados. Un mecanismo fundamental de la inmunidad especfica contra las infecciones virales establecidas est constituido por los linfocitos T citotxicos, fundamentalmente los linfocitos T CD8+ que reconocen antgenos virales asociados a molculas MHC clase I, sintetizados en el interior de las clulas infectadas. En este momento es importante recordar que las molculas MHC de clase I estn en la superficie de cualquier tipo celular. Para su diferenciacin y activacin, los linfocitos T citotxicos requieren dos tipos de seales; la primera es el reconocimiento especfico del antgeno en la clula blanco en asociacin al MHC clase I y la segunda son citoquinas producidas por las clulas T helper CD4+ que reconocen antgenos virales asociados a MHC clase II. Los linfocitos T citotxicos diferenciados, ejercen su efecto antiviral por tres mecanismos: a) lisis de las clulas infectadas por liberacin de grnulos que contienen, entre otras macromolculas, una protena formadora de poros (perforina o citolisina); b) estimulacin de enzimas intracelulares que degradan los genomas virales; c) secrecin de citoquinas, ms especficamente IFN- y linfotoxina (LT), en menor grado IL-2. Aunque estas clulas producen citoquinas, no lo hacen en cantidades suficientes o en los tipos necesarios para generar la diferenciacin completa de sus precursores en linfocitos T citolticos activos y diferenciados; de ah la necesidad de las citoquinas producidas por las clulas T helper CD 4+ mencionadas anteriormente. En algunas infecciones virales esta respuesta inmune es la causante de la lesin tisular. Por ejemplo, en la infeccin producida por el virus de la hepatitis B, la lesin heptica est mediada principalmente por la respuesta inmune celular generada. De hecho, los individuos con deficiencias en las clulas T, padecen una enfermedad con menor dao heptico, pero con mayor tendencia a la cronicidad y los inmunocompetentes padecen una enfermedad con lesiones hepticas ms severas, pero raramente se produce la enfermedad crnica. Evasin de los mecanismos inmunes por los virus
Variacin antignica
En muchos virus se ha identificado un gran nmero de tipos serolgicamente diferentes. La capacidad viral de variar antignicamente es uno de los mecanismos de evasin ms difundido e ilustrado por muchos virus. En el VIH, por ejemplo, se observa una importante variabilidad gentica, fundamentalmente en los genes env, debida a los errores cometidos por la enzima transcriptasa reversa viral que pueden conducir a cambios de hasta un 30%
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en regiones hipervariables de la Gp 120. Otro ejemplo conocido es el virus Influenza, en el cual la variacin antignica puede ser de dos tipos: menor o deriva antignica, resultado de mutaciones puntuales en genes que codifican para HA y NA; y mayor o cambio antignico, que obedecen a sustituciones o reordenamientos de segmentos enteros de ARN viral que producen un nuevo virus para el que la poblacin general no tiene inmunidad, ocasionando pandemias de gripe.
Supresin de respuesta inmune
Este mecanismo queda ejemplificado por aquellos virus capaces de infectar clulas del sistema inmune, linfocitos o macrfagos, alterando su funcin e inhibiendo la inmunidad adaptativa. Este fenmeno de supresin inmune es visto en infecciones causadas por VIH, virus Epstein Barr, citomegalovirus y virus del sarampin, entre otros. Otros mecanismos de evasin inmune viral incluyen: la expresin limitada de antgenos en las membranas celulares (arenavirus, rabdovirus); la persistencia viral en sitios poco accesibles a la respuesta inmune (papilomavirus, citomegalovirus); la inhibicin de expresin de molculas MHC clase I (adenovirus); etc.
Conclusiones
El sistema inmune permite que los individuos sobrevivan al contacto con diferentes tipos de patgenos. Los mecanismos iniciales de defensa provistos por la inmunidad innata permiten eliminar muchos de los agentes infecciosos y sientan las bases para el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa con alto grado de especificidad por el patgeno que logra quebrar esa primer lnea de defensa. Los mecanismos efectores relevantes para eliminar distintos tipos de microorganismos, varan segn las caractersticas de virulencia y patogenicidad de ste. La resolucin de una infeccin se acompaa de la muerte de la mayora de las clulas efectoras y de la generacin de clulas de memoria. Muchos microorganismos han desarrollado sistemas que le permiten evadir la respuesta inmune. El conocimiento detallado del sistema inmune y de la patogenesis de los agentes infecciosos, nos permite disear alternativas para estimular artificialmente el sistema inmune y as poder responder efectivamente frente a ellos. Las vacunas son el ejemplo ms importante de ello. Los avances en el conocimiento de la inmunobiologa y la patognesis microbiana, permiten un diseo ms racional de estas aproximaciones y puede resultar en el desarrollo de nuevas vacunas contra agentes patgenos que hasta ahora han resultado elusivos.
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M. Torres
Introduccin y definiciones
El cuerpo humano presenta una gran superficie cutnea y mucosa por la que estn en contacto con el medio ambiente. En esta superficie existen diversos sectores con diferentes caractersticas de humedad, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes, en los cuales residen microorganismos La flora humana normal es el conjunto de microorganismos que conviven con el husped en estado normal, sin causarle enfermedad. Su composicin es caracterstica para la especie humana, tanto en el tipo de microorganismos que la componen como en su nmero y distribucin en el organismo. La flora normal coloniza las superficies cutneas y mucosas. Sin embargo, hay que mencionar que en el organismo en condiciones normales existen sitios estriles, como la pleura, las meninges, la cavidad peritoneal, el pericardio, etc. Esto debe ser tenido en consideracin al realizar un estudio microbiolgico. Las tcnicas usadas para obtener una muestra biolgica de un sitio con flora normal, son diferentes a las usadas para sitios estriles. Tambin son diferentes los medios de cultivo que se usarn para sembrar dichas muestras (generalmente requerirn medios que inhiban el crecimiento de la flora normal) y la interpretacin de los cultivos. Por ejemplo, si se aisla un microorganismo del lquido cefalorraqudeo, siempre es anormal si se tomaron las precauciones necesarias para no contaminar la muestra; en cambio, en un exudado farngeo se aislarn diferentes microorganismos, los cuales debern ser valorados cuidadosamente para destacar los que son habitantes normales de ese sitio y los que no. La flora basal es la caracterstica de cada sector del organismo y est constituida por bacterias que siempre estn presentes en dicho sitio. Por ejemplo Staphylococcus epidermidis en la piel y E. coli en el intestino. En cambio, la flora transitoria es variable de un ser humano a otro y est compuesta por bacterias que colonizan en forma intermitente un determinado sector. Esta flora transitoria puede incluir bacterias potencialmente patgenas para el individuo u otras personas que entran en contacto con l. Hay que destacar que la flora transitoria de la piel puede ser eliminada con el lavado de manos.
Importancia de la flora normal

La flora humana normal representa un importante mecanismo de defensa del husped. (Ver cuadro 1). Contribuye al desarrollo de la respuesta inmunolgica, como ha sido demostrado en
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modelos animales que nacen y son criados en condiciones estriles (individuos axnicos). Estos animales presentan un pobre desarrollo de los componentes de su sistema inmunitario. La flora normal, adems, ayuda a evitar la colonizacin de la piel o las mucosas por bacterias que pueden ser patgenas. Generalmente los microorganismos para iniciar la infeccin deben primero colonizar los epitelios. All, seguramente compiten con los integrantes de la flora normal por factores tales como receptores celulares y nutrientes.
Cuadro 1. Importancia de la flora normal
Efectos directos Produccin de bacteriocinas Produccin de metabolitos txicos Reduccin del potencial de xido reduccin Consumo de nutrientes esenciales Competencia por receptores Efectos indirectos Aumento de la produccin de anticuerpos Estmulo de la fagocitosis Aumento de la produccin de interfern Deconjugacin de cidos biliares
FLORA NORMAL DE LA CAVIDAD ORAL
Existen diversos nichos dentro de la cavidad oral y pueden reconocerse diferencias en la composicin si se estudia la flora de los dientes, la lengua, la mucosa yugal o el surco periodontal. La flora oral es de tipo mixto, con asociacin de bacterias aerobias y anaerobias. Las bacterias que se adhieren a la superficie dental en forma permanente, lo hacen por diferentes polmeros de origen bacteriano como dextranos y levanos, sintetizados a partir de hidratos de carbono de la dieta. La cantidad de bacterias anaerobias es mxima en el surco gingival. Los dientes presentan superficies de adherencia que tienen la particularidad de no renovarse peridicamente, como lo hacen los epitelios. Formando parte de esta flora predominan diferentes especies de Streptococcus -hemolticos. A nivel de la placa dentaria se hallan el Streptococcus mutans y el Streptococcus sanguis. El Streptococcus mitis se adhiere tanto a los dientes como a las mucosas y el S. salivarius predomina en la mucosa lingual. El frotis realizado de saliva o hispoados de mucosa oral muestran clulas epiteliales y cocos grampositivos en cadenas. Esto suele verse en muestras de expectoracin mal recogidas e indican contaminacin por flora oral. Entre las bacterias anaerobias grampositivas pueden hallarse Actinomyces sp. en la placa dentaria y algunas especies de Lactobacillus en menor cantidad. La mayora de las gramnegativas son anaerobias como, Bacteroides del grupo melaninogenicus y especies del gnero Fusobacterium. Tambin pueden encontrarse espiroquetas del gnero Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos grampositivos anaerobios pertenecen a los gneros Peptococcus, Peptostreptococcu y Ruminococcus entre otros. Adems pueden aislarse especies de Mycoplasmas y levaduras del gnero Cndida. Como es un complejo ecosistema, existen muchas interrelaciones complejas tambin entre los distintos integrantes. En la placa dentaria, las bacterias se hallan en altas concentraciones, formando colonias microscpicas y ubicndose en estratos.
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La flora de la cavidad oral est involucrada en la patogenia de enfermedades como las caries y la periodontitis. En el desarrollo de la caries dental intervienen no solo las bacterias, sino tambin factores como el pH cido resultante de la descomposicin de hidratos de carbono de la dieta, etc. La periodontitis resulta de la agresin de la flora normal a los tejidos de sostn del diente. Los microorganismos de la boca tambin causan procesos como los abscesos periodontales y de cuello. Los pacientes con vlvulas cardacas enfermas, pueden desarrollar endocarditis bacteriana, en la que estn implicados los Streptococcus -hemolticos. Esta enfermedad generalmente es una infeccin endgena, causada por bacterias de la cavidad oral que pasan al torrente sanguneo por manipulaciones odontolgicas y colonizan las vlvulas cardacas alteradas. La actinomicosis crvico facial es una enfermedad que tiene como agente etiolgico algunas especies de Actinomyces provenientes de la cavidad oral.
FLORA NORMAL DEL APARATO DIGESTIVO
El tubo digestivo alberga un gran nmero de bacterias. Tambin en este nivel se pueden reconocer distintos nichos ecolgicos. La flora normal intestinal contribuye a la sntesis de vitaminas K y de vitaminas del complejo B, adems de ayudar en los procesos digestivos. Tambin compiten con los microorganismos patgenos por los nutrientes y los receptores; y elaboran bacteriocinas. Estmago En condiciones fisiolgicas y sin alimentos, el pH gstrico es extremadamente cido, aproximadamente 2. Con los alimentos ste aumenta aproximndose al pH neutro. La densidad de bacterias en el estmago es relativamente baja y se compone de microorganismos de la flora orofarngea que han sido deglutidos, como los Streptococcus -hemolticos, los Lactobacillus sp., los cocos anaerobios, la Cndida sp. y otros capaces de resistir el medio cido. Intestino delgado En el duodeno se mantiene el pH que limita el crecimiento de microorganismos. El peristaltismo representa un mecanismo importante que mantiene un nmero bajo de bacterias. La bilis tiene propiedades antimicrobianas que inhibe a muchos microorganismos. Otras sustancias, como la lisozima y la inmunoglobulina A (IgA) secretoria, tambin contribuyen a mantener un nmero reducido de bacterias. La cantidad de bacterias aumenta gradualmente hacia el leon. En los sectores distales del intestino delgado, la flora normal se asemeja a la colnica. En el leon terminal se alcanzan concentraciones de 106 a 108 bacterias por ml de contenido intestinal, con predominio de anaerobios. Intestino grueso Las bacterias representan aproximadamente el 40% del peso seco de la materia fecal. El aumento del contenido bacteriano probablemente se explica por: disminucin del peristaltismo, aumento del pH cercano al fisiolgico y disminucin del contenido de agua. Pasando la vlvula ileocecal los microorganismos de la flora normal alcanzan concentraciones de 107 a 109 bacterias por ml, llegando al mximo en el recto con 1011 bacterias por ml. Sin duda, es el mayor y ms complejo ecosistema microbiano del organismo y se estima que en l conviven ms de 500 especies diferentes de bacterias, con predominio de las bacterias
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anaerobias. Estos corresponden en su mayora a los gneros Bacteroides y Fusobacterium entre los bacilos gramnegativos y especies de Peptostreptococcus, Sarcina y Veillonella entre los cocos. Los bacilos grampositivos estn representados por especies de Bifidobacterium, Actinomyces, Bacillus, Lactobacillus y Clostridium. Entre los anaerobios facultativos predominan las enterobacterias, siendo E. coli la que predomina, seguida de especies de Klebsiella, Proteus, Enterobacter y Citrobacter. Entre los cocos grampositivos pueden hallarse especies de Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus. La adquisicin de la flora normal se inicia en el momento del nacimiento; en el recin nacido los microorganismos que inicialmente colonizan el aparato digestivo provienen del perin y de la vagina de la madre. Generalmente se trata de E. coli, Klebsiella sp. y especies de Enterococcus; ms raramente especies de Clostridium. En lactantes alimentados a pecho se aslan Bifidobacterium sp. Con la introduccin de la alimentacin artificial aumenta el nmero y la diversidad de los microorganismos normales del intestino. Al ao de vida la flora digestiva normal es idntica a la del adulto. A continuacin se menciona la importancia que tiene la flora normal del intestino. En primer lugar, es de destacar que determina el desarrollo correcto de la mucosa intestinal; adems interviene en el metabolismo de sustancias como el cido flico, la biotina y las vitaminas B12, K y E. Tambin favorece la produccin de IgA y contribuye a la inmunotolerancia, dado que constituye un importante estmulo antignico. Las bacterias que forman la flora normal del intestino cumplen un rol importante en la constitucin del ciclo enteroheptico de algunos frmacos. Tambin tiene efecto de barrera, porque al ocupar nichos ecolgicos impide el establecimiento de otras bacterias potencialmente patgenas. Este fenmeno se conoce como interferencia bacteriana. Las bacteriocinas son sustancias segregadas por las bacterias normales del intestino; dichos productos son txicos para bacterias de otros gneros distintos a los normales. Por ltimo cabe mencionar que la flora normal del aparato digestivo interviene en infecciones oportunistas o endgenas en circunstancias como: obstrucciones mecnicas y perforacin del aparato digestivo. En este caso, los microorganismos pasan al peritoneo causando una enfermedad grave. La gran diversidad de la flora fecal puede ser fcilmente objetivada realizando un frotis de materia fecal normal, tindolo con coloracin de Gram y observndolo al microscopio. Se observarn muchas bacterias grampositivas y gramnegativas, tanto bacilos como cocos.
FLORA NORMAL DE LA VAGINA
Fue una de las primeras en ser reconocida en 1892 por Dderlein quien describi el patrn biolgico normal que se observa en la mujer en edad genital activa. La composicin de la flora normal depende del contenido estrognico. El estmulo hormonal determina la proliferacin de las clulas epiteliales que aumentan su contenido de glucgeno. Este es utilizado por Lactobacillus spp., siendo el cido lctico el producto final del metabolismo, el cual provoca un descenso importante del pH. La acidez resultante inhibe el crecimiento de muchas bacterias. En la mujer en edad genital activa predominan distintas especies de Lactobacillus, otros bacilos grampositivos y en menor cantidad cocos grampositivos (Streptococcus spp., Enterococcus spp., etc.). Tambin pueden encontrarse algunos Actinomyces, bacilos gramnegativos anaerobios como Bacteroides y distintas especies de enterobacterias. El Streptococcus agalactiae (grupo B) se asla en un porcentaje variable a esta edad, que aunque no suele producir enfermedad en la mujer, su presencia implica riesgo para el recin nacido en el que puede causar una enfermedad severa. Durante la gestacin, a medida que progresa el embarazo, aumenta la densidad de Lacto-
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bacillus y disminuye la de bacilos gramnegativos anaerobios y facultativos; el resultado es un mecanismo que reduce el riesgo de bacteriemia grave durante el parto y el puerperio. Algunas levaduras, como Candida albicans y otras, pueden formar parte de la flora vaginal normal. Estos hongos eventualmente, por alteraciones del ecosistema pueden causar sntomas. En la etapa prepuberal predominan los microorganismos de origen cutneo y perineal: S. epidermidis, Propionibacterium spp. y pueden aislarse levaduras en escaso nmero, al igual que enterobacterias y bacilos gramnegativos anaerobios. En la mujer postmenopusica, gracias al cesar del estmulo hormonal, la flora de la vagina retorna al patrn que tena en la infancia. La flora vaginal protege frente a la infeccin vaginal, especialmente durante el embarazo y suministra la flora normal al recin nacido. El exudado vaginal es el estudio bacteriolgico indicado para el diagnstico de la infeccin genital y comprende el estudio directo y el cultivos de los fluidos vaginales. En la mujer sana en edad genital activa, el examen directo mostrar clulas epiteliales planas acompaadas de Lactobacillus: bacilos grampositivos grandes. En condiciones patolgicas esta imagen se pierde y es reemplazada por la presencia de polimorfonucleares, levaduras con pseudofilamentos, G. Vaginalis, flora de tipo anaerobia, etc.
FLORA NORMAL DEL APARATO RESPIRATORIO
El aparato respiratorio se divide en dos sectores anatmicos: alto y bajo. En el individuo normal nicamente las vas respiratorias altas (fosas nasales y faringe) estn colonizados por flora normal. Los senos paranasales, el odo medio, la trquea, los bronquios pulmonares y la pleura son estriles. En las fosas nasales la estructura anatmica tortuosa generan una corriente de aire turbulenta. Cuando el aire choca contra las mucosas, se calienta y las partculas grandes que ste contiene son retenidas por el mucus y los pelos de las narinas. En sectores ms bajos los microorganismos que ingresan por esta va llegan al tejido linfoide del anillo de Waldeyer. El sistema mucociliar, la capa de moco y los reflejos como la tos, el estornudo y la broncoconstriccin son otros mecanismos de defensa importantes. La mucosa respiratoria tambin es rica en IgA. En el tejido pulmonar existen macrfagos alveolares que contribuyen a la defensa del husped, fagocitando las bacterias y otras partculas. En la faringe la flora normal est compuesta principalmente por Streptococcus -hemolticos. El estudio bacteriolgico de un hisopado faringoamigdalino es habitualmente indicado para diagnosticar faringitis bacteriana. Una vez realizado el cultivo en placas de agar sangre ovina, el bacterilogo debe ser capaz de diferenciar la flora normal, compuesta principalmente por Streptococcus con hemlisis viridans, de potenciales patgenos como Streptococcus -hemolticos. En las fosas nasales se encuentran microorganismos caractersticos de la piel: Staphylococcus epidermidis y especies de Corynebacterium. Alrededor de 20 a 30% de los individuos son portadores nasales sanos de S. aureus, porcentaje aumenta en personas diabticas sometidas a hemodilisis y en el personal de salud. En preescolares es habitual la colonizacin nasal por Streptococcus pneumoniae y especies de Haemophilus. En la faringe se encuentran adems diferentes especies de Lactobacillus, Propionibacterium, Corynebacterium, Moraxella, etc. Los anaerobios superan en diez veces a los aerobios y se aslan
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Peptoestreptococcus spp., Bifidobacterium spp. y Actinomyces spp. Los bacilos gramnegativos que se encuentran, generalmente son Fusobacterium spp. y Bacteroides spp. En las criptas amigdalinas se produce acumulacin de materia orgnica que disminuye el potencial de xido reduccin, por lo tanto el nmero de anaerobios puede ser muy elevado. Algunos individuos albergan S. pneumoniae y Haemophillus influenzae, sin que ello signifique enfermedad. Tambin pueden encontrarse especies no patgenas de Neisseria y Streptococcus -hemolticos no pertenecientes al grupo A. En condiciones normales no existen bacterias ms all de la glotis. La flora orofarngea est implicada en infecciones pulmonares, causadas por la aspiracin de estos microorganismos. Generalmente esto ocurre en pacientes que tienen alterados los reflejos de defensa debido a alteraciones de la conciencia, etc. En las infecciones bronquiales o pulmonares, el estudio de la expectoracin puede resultar til si el paciente logra obtener una buena muestra mediante el esfuerzo de tos. Hay que ser cauteloso en la lectura de esta muestra, porque la misma se contaminar en diferentes grados por la flora oral. Como ya se dijo, si se observa al microscopio, se podr diferenciar una muestra inapropiada formada principalmente por saliva, de una muestra adecuada, compuesta principalmente por leucocitos polimorfonucleares y escasas o ninguna clula epitelial
FLORA NORMAL DE LA PIEL
La piel del ser humano es un extenso y heterogneo territorio con diferencias en su estructura y condiciones ambientales, lo que determina diferencias en la densidad y composicin de su flora normal, segn el rea considerada. La mayora de los microorganismos colonizan el estrato crneo, que es relativamente impermeable. Los mecanismos de defensa que presenta la piel estn representados por: el recambio celular continuo de las capas superficiales del epitelio, el pH bajo debido a metabolitos de las glndulas sebceas y los macrfagos de la piel. Como se mencion, en el personal hospitalario la flora transitoria puede estar integrada por bacterias que potencialmente pueden causar enfermedad a los pacientes. El lavado de manos es la medida profilctica ms importante para evitar la transmisin de infecciones. La composicin de la flora normal, tanto en sus aspectos cualitativos como cuantitativos, puede estar influida por factores climticos, condiciones de higiene, etc. Dentro los microorganismos que constituyen la flora normal de la piel, predominan los grampositivos. La flora basal se compone de Staphylococcus spp. (generalmente S. epidermidis), Micrococcus spp. y Corynebacterium spp. El Propionibacterium acnes es un bacilo grampositivo anaerobio que coloniza las glndulas sebceas. Esta bacteria posee lipasas que degradan los lpidos secretados por esas bacterias. Los metabolitos resultantes son principalmente cidos grasos insaturados con actividad antimicrobiana. La flora transitoria est integrada por S. aureus y en menor cantidad, por bacilos gramnegativos (Enterobacterias, Acinetobacter) en regiones como axilas, ingle y perin. Esta flora cutnea participa en el desarrollo de infecciones cuando se producen soluciones de continuidad en la piel. Muchas infecciones como foliculitis o forunculosis tienen origen en los folculos pilosos o glndulas. Otras infecciones ocasionadas por bacterias de la flora normal, se producen cuando se colocan catteres percutneos u otros dispositivos que implican la ruptura de la barrera cutnea. La flora del conducto auditivo externo es similar a la de la piel. Hay que destacar que a diferencia del anterior, el odo medio es estril. La flora normal de la piel puede objetivase mediante cultivos en medios apropiados.
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FLORA NORMAL DE LA CONJUNTIVA
La conjuntiva ocular carece de flora basal, porque no se producen interacciones estables entre esta mucosa y los microorganismos. El saco conjuntival puede contener algunos microorganismos que proceden de la piel circundante o del contacto mano ojo. La secrecin lacrimal efecta un continuo barrido de las partculas que se depositan en la conjuntiva. Esta secrecin es rica en lizosima, enzima que destruye las bacterias, especialmente las grampositivas. El parpadeo, las pestaas y las cejas contribuyen a evitar el ingreso de partculas al saco conjuntival. Las bacterias que pueden encontrarse son Staphylococcus spp. , Corynebacterium spp., Streptococcus -hemolticos y Bacillus spp. El uso de lentes de contacto se asocia a la colonizacin por bacterias de los gneros Serratia y Pseudomonas. Las bacterias de la conjuntiva pueden causar infecciones graves como lceras de crnea y endoftalmitis. stas, generalmente, estn precedidas por traumatismos de crnea o perforaciones del globo ocular.
FLORA NORMAL DEL APARATO URINARIO
Excepto la uretra anterior, el aparato urinario es estril. La orina contribuye a mantener la va urinaria libre de microorganismos, gracias al arrastre de la orina durante la miccin, al pH cido de la orina y a la alta osmolaridad que presenta. La uretra anterior est colonizada por bacterias provenientes del perin. Dichas bacterias son eliminadas al inicio de la miccin, propiedad que se usa para obtener la muestra por chorro medio para el urocultivo, evitando as la contaminacin. En la mujer, la menor longitud de la uretra y la proximidad de sta con el ano explican, al menos en parte, la mayor incidencia de infeccin urinaria.
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SECCIN
II
Principales procesos infecciosos

8. Infecciones de piel y partes blandas 9. Infecciones respiratorias 10. Gastroenteritis 11. Infeccin urinaria 12. Bacteriemias y sepsis 13. Infecciones del sistema nervioso central 14. Infecciones de transmisin sexual 15. Infecciones hospitalarias
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Infecciones de piel y tejidos blandos

G. Varela
Generalidades
Comprenden un conjunto heterogneo de procesos infecciosos, con o sin respuesta inflamatoria local o sistmica evidente. Est formado por una gran variedad de cuadros clnicos con compromiso, gravedad y evolucin diferentes. El nmero de agentes asociados a estos procesos es importante e incluye fundamentalmente bacterias, tanto de origen endgeno como exgeno, y en menor proporcin virus. Las vas de ingreso de estos agentes a los sectores afectados son: la inoculacin directa (ms frecuente), la va hemtica o linftica, o por contigidad. No resulta fcil hacer una clasificacin de estos procesos basada exclusivamente en su topografa, ya que se trata de situaciones dinmicas y con frecuencia los planos comprometidos son varios, como veremos ms adelante. En este captulo no trataremos infecciones que presentan manifestaciones cutneas como por ejemplo: sfilis, chancro blando, herpes genital, condilomas acuminados (ver captulo 14), lepra. Tampoco veremos las infecciones que cursan con bacteriemia (como endocarditis, meningitis) que pueden presentar lesiones a nivel cutneo. No haremos mencin a enfermedades virales como sarampin, rubola, varicela zster, si bien debemos destacar que las lesiones a nivel cutneo presentes en estas enfermedades pueden servir como puerta de entrada para diferentes agentes bacterianos asociados a infecciones de piel o tejidos blandos propiamente dichas. (Ver captulos 6 y 7) Aproximacin a la definicin de tejidos blandos: son los tejidos, rganos y espacios ubicados entre la piel y los huesos. Incluyen de afuera hacia adentro: piel (epidermis y dermis), tejido celular subcutneo con el panculo adiposo, fascias y aponeurosis, y el tejido muscular (con logias inextensibles en algunos casos). Esta distribucin por sectores tiene variaciones cualitativas y cuantitativas, de acuerdo a la regin anatmica estudiada (pared abdominal, escroto, manos, etc.). La piel constituye casi el 20% del peso corporal de un sujeto adulto. Est compuesta de dos capas: epidermis la ms externa, y la interna denominada dermis. La epidermis est dividida en varios estratos: germinal, espinoso, granuloso y por ltimo el estrato crneo (el ms externo, en contacto directo con el medio ambiente). Por debajo de la epidermis se encuentra la dermis, constituida entre otros, por protenas fibrosas tipo colgeno, fibras elsticas y mucopolisacridos. Es rica en vasos sanguneos y linfticos, glndulas sudorparas y sebceas, fibroblastos, macrfagos y clulas cebadas. Las glndulas anexas (sudorparas y sebceas) y los folculos pilosos se encuentran en esta capa, a pesar de que su origen es ectodrmico.
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La piel est en contacto con el medio ambiente y expuesta a una gran variedad de microorganismos, incluidas las bacterias que integran la flora normal (basal y transitoria). Ofrece innumerables nichos ecolgicos para el desarrollo de distintos microorganismos, debido a la variedad de microambientes con caractersticas fisicoqumicas diferentes que posee (axilas, pliegues inguinales, cuero cabelludo, etc.). Tambin est sometida a cambios estructurales y funcionales relacionados con la edad del sujeto, el estado hormonal, la higiene personal, y a factores exgenos como por ejemplo el clima (temperatura, humedad, etc.).
Imptigo
Se trata de una infeccin superficial de la piel, sobre todo de la epidermis, aunque raramente puede comprometer la dermis y tejidos subcutneos. Se manifiesta inicialmente por la aparicin de vesculas rodeadas por un halo de tipo inflamatorio, que pasan luego a pstulas, y por ltimo a costras. Las lesiones son sumamente pruriginosas, el rascado facilita la diseminacin a otras zonas del cuerpo y a otros individuos susceptibles. La mayora de los casos ocurren en nios de dos a cinco aos, afectando principalmente la cara, con distribucin periorificial (boca, nariz) y tambin las extremidades, sobre todo inferiores, ms expuestas a pequeos traumatismos. Es una enfermedad altamente contagiosa, frecuente en zonas con clima tropical y en nios con higiene personal deficiente. Traumas menores, picaduras de insectos y otras lesiones cutneas actan como factores predisponentes alterando la integridad de la barrera cutnea. Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes (de distintos serotipos M) son los agentes ms frecuentemente asociados a imptigo. En el caso de Streptococcus pyogenes, la colonizacin farngea precede al desarrollo de la enfermedad en dos a tres semanas y es ms frecuente en los meses fros; en cambio en los casos asociados a Staphylococcus aureus la colonizacin previa es sobre todo en el mbito nasal. Son frecuentes los casos debidos a infecciones mixtas
Imptigo por Streptococcus pyogenes
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por S. aureus y S. pyogenes. Streptococcus del grupo C y G se asocian raramente a imptigo y Streptococcus agalactiae (grupo B) se ha recuperado de casos que ocurren en recin nacidos. Algunos casos de imptigo estreptoccico pueden dar como complicacin no supurada una glomerulonefritis difusa aguda. (Ver captulo 17)
DIAGNSTICO ETIOLGICO
El frotis del contenido de las vesculas o pstulas teido por la tcnica de Gram muestra la mayora de las veces cocos grampositivos agrupados en cadenas o racimos. El cultivo en placas de agar sangre ovina al 5% del contenido de las vesculas o pstulas, puede mostrar colonias sospechosas de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes o ambas. Para una descripcin detallada de los procedimientos de laboratorio utilizados en el diagnstico etiolgico, ver captulos 16 y 17.
TRATAMIENTO
Es tpico, aplicando directamente sobre las lesiones antispticos (iodforos u otros), o antibiticos (mupirocina, bacitracina, etc.). En casos de imptigo generalizado o extenso deben administrarse antibiticos por va general, que acten sobre los diferentes agentes etiolgicos potenciales (por ejemplo: cefalosporinas de primera generacin). Debe prestarse especial atencin a las cepas de S. aureus resistentes a meticilina. (Ver captulo 16) El tratamiento con antibiticos por va general no disminuye la incidencia de glomerulonefritis.
IMPTIGO BULLOSO
Es una forma de imptigo producida por cepas de S. aureus pertenecientes habitualmente al fagotipo 71, ocurre sobre todo en recin nacidos y nios pequeos. Es debido a la accin a nivel de la piel de dos exotoxinas exfoliativas (toxina exfoliativa A y B, ver ms adelante sndrome de piel escaldada) producidas por la cepa infectante. Raramente ocurre sobreinfeccin de las lesiones con cepas de Streptococcus. La curacin sin cicatrices es la regla.
Ectima
Es una afeccin cutnea similar al imptigo, aunque el compromiso es ms profundo y la evolucin es ms lenta. Se observa sobre todo en las extremidades inferiores, es frecuente en nios y ancianos. Las lesiones se ulceran y luego se recubren de una costra amarilloverdosa. Generalmente estn rodeadas de una sobreelevacin violcea. Los agentes responsables ms comunes son Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus. El tratamiento es el mismo que para el imptigo. En algunos casos de bacteriemia por Pseudomonas aeruginosa u otros bacilos gramnegativos, pueden aparecer lesiones cutneas denominadas ectima gangrenoso. Son ulceraciones circulares, induradas, indoloras, con una scara central de color negro grisceo caracterstico, rodeadas de un halo eritematoso; son producidas por la necrosis hemorrgica y la reaccin inflamatoria que ocurre en la zona afectada.
Eritrasma
Es una infeccin superficial de la piel, producida por cepas de Corynebacterium minutissimum (bacilos grampositivos, aerobios-anaerobios facultativos, no esporulados, inmviles, catalasa positivos y ampliamente distribuidos en la naturaleza). Se manifiesta por manchas de color pardo rojizo, similares a las producidas por los dermatofitos; son ms frecuentes en hombres
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y personas obesas con diabetes mellitus. Son muy pruriginosas, con escasa descamacin y lenta evolucin. Puede haber perodos asintomticos y pocas de exacerbacin. Las lesiones predominan en la regin gentiocrural. Los macrlidos por va oral son el tratamiento de eleccin.
Foliculitis
Es la inflamacin aguda de causa infecciosa del sector distal (ms superficial) del folculo piloso y de las glndulas apcrinas asociadas. Generalmente existe compromiso de varios folculos al mismo tiempo. Las lesiones son de tipo papular con un punto central sobreelevado y purulento. Tiene distribucin variable, con predominio en la cara y axilas. Puede haber compromiso de los folculos pilosos del conducto auditivo externo. La foliculitis de las pestaas se conoce con el nombre de orzuelo. Una forma particular, denominada sicosis de la barba, se caracteriza por la afectacin crnica de los pelos de la barba. Staphylococcus aureus es el agente etiolgico ms frecuente, aunque se han descrito casos adquiridos en piletas de natacin causados por cepas de Pseudomonas aeruginosa. En pacientes inmunocomprometidos los casos de foliculitis por Pseudomonas aeruginosa pueden evolucionar a cuadros ms graves como el ectima gangrenoso. Otros bacilos gramnegativos pueden asociarse a foliculitis en personas con acn, sobre todo luego del tratamiento con antimicrobianos.
Fornculo
En este caso el proceso inflamatorio es ms profundo que en la folicultis, puede haber compromiso de la grasa subcutnea y de la glndula sebcea asociada. Habitualmente ocurre en un solo folculo, aunque pueden estar comprometidos varios a la vez, como veremos ms adelante a propsito de carbunco por Staphylococcus. Se manifiesta como un ndulo rojo y doloroso, que luego se hace fluctuante y purulento. Eventualmente, puede abrirse al exterior a travs del folculo afectado. Son ms frecuentes en zonas hmedas, calientes y expuestas a roce frecuente, como por ejemplo cuello, cara, axilas, pliegues inguinales y nalgas. Entre los factores predisponentes para el desarrollo de fornculos se destacan: estado de portador nasal de cepas de S. aureus, obesidad, tratamiento prolongado con corticoides, defectos en la serie blanca (neutrfilos), estrs y probablemente diabetes mellitus. Como consecuencia de la manipulacin incorrecta de la lesin puede haber diseminacin hematgena (bacteriemia) con aparicin de focos metastticos (osteomielitis, endocarditis, etc.). Especial cuidado debe tenerse con los fornculos prximos a la nariz y labio superior, por la eventual diseminacin hemtica al seno cavernoso a travs de las venas emisarias facial y angular.
ntrax estafiloccico
Es un proceso ms extenso y grave que compromete simultneamente varios folculos pilosos. Habitualmente ocurre en la regin de la nuca, espalda o muslos, donde la piel es ms gruesa y menos extensible. Aparecen mltiples abscesos separados por tejido conectivo que luego drenan a la superficie a travs de los propios folculos. En ocasiones puede haber bacteriemia con focos metastticos secundarios (endocarditis, osteomielitis, etc.). El agente etiolgico ms frecuente en ambos casos (fornculos y carbunco) es Staphylococcus aureus.
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Carbunco cutneo (pstula maligna). Causado por Bacillus anthracis
TRATAMIENTO
La mayora de los fornculos se curan con medidas locales como aplicacin de calor hmedo para provocar el drenaje espontneo. Puede ser necesario el drenaje quirrgico. En casos con compromiso de capas ms profundas (celulitis) debe agregarse tratamiento con antibiticos adecuados. (Ver captulo 16)
Carbunco cutneo (pstula maligna)

Es causado por cepas de Bacillus anthracis (bacilo grampositivo, esporulado, aerobio) que puede causar infecciones en animales herbvoros y seres humanos. Es una enfermedad profesional, se observa fundamentalmente en personas que tienen contacto estrecho con animales contaminados (veterinarios por ejemplo), o sus productos (clasificadores de lana, esquiladores, etc). Los esporos ingresan por heridas en la piel, luego germinan y las formas vegetativas se multiplican activamente a nivel local. En el sitio de inoculacin aparece una ppula indolora que progresa rpidamente a una lcera rodeada de vesculas y por ltimo a una lesin necrtica de color negro. El carbunco cutneo es la forma ms frecuente de ntrax, y sin tratamiento adecuado tiene una mortalidad cercana al 20%. El diagnstico etiolgico se realiza por el aislamiento e identificacin de Bacillus anthracis a partir de la lesin. Penicilina, doxiciclina o ciprofloxacina se utilizan para el tratamiento de este proceso.
Erisipela (Fuego de San Antonio)

Es un tipo caracterstico de celulitis superficial y recidivante; con participacin de la epidermis, la dermis, el tejido celular subcutneo y compromiso importante de los vasos linfticos. Es comn en nios pequeos y ancianos. Las lesiones son ms frecuentes en los miembros inferiores, aunque se observan algunos casos de erisipela facial, con afectacin del dorso nasal y mejillas. Las probables puertas de entrada a nivel de los miembros inferiores son: heridas
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quirrgicas, lceras, abrasiones, psoriasis, dermatitis o infecciones fngicas. Como factores predisponentes locales se destacan entre otros: alteraciones en el retorno venoso y linftico; a nivel general el alcoholismo, el sndrome nefrtico, la diabetes mellitus y alteraciones de la sensibilidad tctil protoptica. La infeccin puede extenderse en profundidad y comprometer fascias musculares (fascitis necrotizante). El agente etiolgico ms frecuente es Streptococcus pyogenes, raramente se asocia a infeccin por Streptococcus del grupo C o G. Streptococcus agalactiae (grupo B) se ha recuperado en casos de erisipela en recin nacidos. El estudio bacteriolgico (directo y cultivo) tiene poca aplicacin en esta enfermedad, ya que la tasa de recuperacin, an estudiando los bordes de la lesin con o sin instilacin previa de suero fisiolgico estril, es baja. La bacteriemia ocurre en menos del 10% de los casos y a partir de la faringe solo se recuperan cepas de Streptococcus en aproximadamente el 20% de los casos.
TRATAMIENTO
Se realiza con penicilina G o macrlidos en pacientes alrgicos.
Procesos por accin de exotoxinas a nivel cutneo (producidas localmente o en un foco alejado)
SNDROME DE PIEL ESCALDADA (SPE)
Se debe a la infeccin por cepas de S. pyogenes productoras de exotoxinas exfoliativas A y B, termoestable y termolbil respectivamente, con actividad serinproteasa, que digieren las uniones estrechas intercelulares (desmosomas) del estrato granuloso. No se produce citlisis y no hay respuesta inflamatoria. Ocurre en nios pequeos, y es raro en adultos. La riqueza relativa de GM4, receptor conocido para las toxinas exofilativas, en los nios pequeos explicara en parte este hecho. La infeccin o colonizacin por la cepa toxignica ocurre sobre todo a nivel del cordn umbilical. Tratamiento Consiste en medidas generales de sostn (recordar algunas de las funciones conocidas de la piel: termorregulacin, balance hidroelectroltico, barrera defensiva, etc.). Existen formas incompletas de SPE, causadas tambin por cepas de S. aureus productoras de toxinas exfoliativas. El compromiso cutneo es menor con una erupcin eritematosa generalizada (escarlatina estafiloccica).
ESCARLATINA
Es un exantema eritematoso difuso que comienza en el tronco y luego se extiende a los miembros. Respeta la zona perioral, plantas y palmas. Es causada por cepas lisognicas de S. pyogenes (tambin, aunque ms raramente, por cepas del grupo C o G) productoras de exotoxinas pirgenas estreptoccicas, tambin conocidas como toxinas eritrognicas (Spe). La infeccin ocurre frecuentemente a nivel farngeo y puede ser asintomtica. Hasta el momento se han descrito siete toxinas inmunolgicamente diferentes (A-J menos D, E, I). Pertenecen al grupo 1 de toxinas bacterianas y pueden actuar como superantgenos. (Ver ms adelante sndrome de shock txico). Las cepas de Streptococcus pyogenes asociadas a cuadros invasivos graves y rpidamente letales, con manifestaciones de sndrome de shock txico producen freceuntemente SpeA.
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SNDROME DE SHOCK TXICO (SST)
Es una enfermedad sistmica, con compromiso cutneo, causada por la infeccin con cepas de Staphylococcus aureus productoras de TSST-1 (toxina del sndrome de shock txico-1). Se trata de una exotoxina proteica, termoestable e integra junto a otras toxinas bacterianas (toxinas estreptoccicas pirognicas, enterotoxinas estafiloccicas) el grupo I, conocidas tambin como superantgenos. Estas molculas tienen la capacidad de estimular en forma inespecfica a los macrfagos (clulas presentadoras de antgenos, con el receptor CMH II) y linfocitos T, con liberacin excesiva de citoquinas (IL-2, FNT, etc.) responsables en parte de las manifestaciones sistmicas observadas en este sndrome. La colonizacin o infeccin con estas cepas toxignicas puede ocurrir a nivel de la vagina (uso de tampones hiperabsorbentes) o de heridas (accidentales o quirrgicas). Las manifestaciones cutneas (aparte de las de la herida y el conjunto de manifestaciones sistmicas) son: exantema generalizado de tipo escarlatiniforme, y en los casos de SST causados por cepas de Streptococcus pyogenes puede observarse descamacin severa de la piel de palmas y plantas.
VERRUGAS COMUNES
Plantares, planas, son causadas por la infeccin localizada de la epidermis con ciertos tipos de Papillomavirus (4, 63, 26, 27, 29, 41, 57, 65, entre otros). Los virus se replican en las clulas del estrato escamoso, estimulando la proliferacin celular con engrosamiento de la capa basal, espinosa y granulosa. La curacin es espontnea, aunque puede haber recidivas. La trasmisin es por contacto directo.
MOLUSCO CONTAGIOSO
Son lesiones bien delimitadas, blanquecinas, a veces agrupadas y con umbilicacin central causadas por Poxvirus (Molluscum contagiosum); trasmitido por contacto directo o a travs de fomites. Es frecuente en nios y en adultos sexualmente activos (promiscuos). En pacientes con SIDA se observa una forma generalizada con compromiso de zonas extensas de piel.
CELULITIS
Es un proceso inflamatorio agudo y difuso que compromete tejidos ms profundos (celular subcutneo) con manifestaciones clnicas locales (dolor, rubor, calor, edema) y sistmicas (decaimiento general, fiebre, etc.). Puede afectar distintos sectores del cuerpo (cabeza, tronco, miembros) dando diferentes cuadros clnicos. Es una enfermedad grave, con tendencia a la diseminacin local o general por va linftica o hemtica. En algunos casos, la valoracin quirrgica es fundamental para establecer el grado de compromiso y la vitalidad de los tejidos afectados. Los agentes responsables pueden alcanzar el sitio de infeccin por diferentes vas: directamente a travs de soluciones de continuidad en la barrera cutnea (ciruga, picaduras, heridas, etc.); por contigidad (a partir de un foco infeccioso contiguo o prximo); y menos frecuentemente por va hematgena (a partir de un foco infeccioso distante). Agentes etiolgicos Bacterias aerobias o aerobias-anaerobias facultativas (Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes) son las especies bacterianas ms frecuentemente asociadas a casos de celulitis. Streptococcus del grupo C y G tambin producen estos cuadros. Streptococcus grupo B se ha recuperado de casos de celulitis en recin nacidos. Haemophilus influenzae (bacilo gramnegativo pleomrfico, exigente desde el punto de vista nutricional, no esporulado, encapsulado), es responsable de algunos casos de celulitis facial en nios pequeos (menores de cinco aos)
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no vacunados. La evolucin es rpida, la bacteriemia es frecuente y muchos de estos nios presentan manifestaciones clnicas de otros focos infecciosos (meningitis). Streptococcus pneumoniae (coco grampositivo, lanceolado, encapsulado, catalasa negativo, no esporulado) y bacterias anaerobias que integran la flora oral, tambin se asocian con casos de celulitis facial en nios pequeos. En algunos casos la etiologa es mixta o polimicrobiana. Varias de las enzimas, toxinas y otras estructuras bacterianas, se vinculan con la patogenia de estos procesos. Proteinasas, hialuronidasa, estafiloquinasa, toxinas citolticas (alfa, beta, gama, delta, etc), cpsula y estreptolisinas entre otras, se relacionan con el dao celular, tisular y la diseminacin de la poblacin bacteriana. En los captulos correspondientes a los agentes, estos y otros atributos de virulencia conocidos se tratan en detalle, as como sus mecanismos de resistencia a los antimicrobianos. Otros agentes menos frecuentes Erysipelothrix rhusiopathiae, bacilo grampositivo, anaerobio facultativo, ampliamente distribuido en la naturaleza, es responsable de casos de celulitis de manos en personas que manipulan peces de agua salada, carne de aves, carne vacuna y cueros. Puede haber bacteriemia y endocarditis. Aeromonas hidrophyla, bacilo gramnegativo, ubicuo, con metabolismo de tipo fermentativo, vinculado a casos de celulitis en personas con abrasiones cutneas mnimas y contacto prolongado con agua dulce. Serratia, Proteus, y otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae, pueden producir celulitis en sujetos inmunocomprometidos. Diagnstico etiolgico Se puede intentar recuperar el o los agentes involucrados por cultivo de diferentes muestras representativas del proceso (aspirado de borde de la lesin, biopsia, etc.) o a partir de hemocultivos. Sin embargo, el rendimiento microbiolgico es bajo, aproximadamente se obtienen resultados positivos en el 20% a 30% de los casos estudiados.
CELULITIS CON NECROSIS TISULAR
Lo caracterstico en estos casos es la gran destruccin de tejidos, la rpida evolucin y el pronstico ms grave; sumado a la necesidad urgente de realizar distintos tratamientos quirrgicos. Se conocen tambin con el nombre de gangrenas infecciosas (para diferenciarlas de las de origen vascular), afectan tejido subcutneo, piel suprayacente y en ocasiones hay compromiso de fascias (fascitis necrotizante) y tejido muscular (miositis). Segn el sector comprometido de forma predominante y los agentes bacterianos participantes, definiremos algunos procesos: celulitis anaerobia por bacterias del gnero Clostridium, celulitis por otras bacterias anaerobias, fascitis estreptoccica necrotizante, celulitis necrotizante sinrgica progresiva.
CELULITIS ANAEROBIA POR CLOSTRIDIUM
Generalmente no hay compromiso de la fascia ni del msculo. Comienza de forma insidiosa y luego evoluciona rpidamente. Est causada habitualmente por cepas de Clostridium perfringens (bacilo grampositivo, esporulado, anaerobio aerotolerante, ubicuo e integrante de la flora intestinal de los seres humanos). El agente ingresa a travs de heridas (accidentales, quirrgicas, etc.) contaminadas con esporos bacterianos. La presencia de cuerpos extraos y tejidos desvitalizados en la profundidad de la herida crea un ambiente adecuado para la germinacin y posterior multiplicacin de las formas vegetativas. (Ver captulos 3 y 21) Las manifestaciones locales incluyen: edema, rubor y dolor moderados. No hay un cuadro txico importante. Debido a la produccin de gas puede haber crepitacin en la regin afectada.
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Celulitis por Clostridium perfringens luego de una fractura expuesta de miembro superior.
La tincin con la coloracin de Gram del pus que drena por la herida puede mostrar la presencia de bacilos grampositivos caractersticos (relativamente cortos y de bordes rectos). La exploracin quirrgica es fundamental para descartar el compromiso muscular y de las fascias subyacentes. Tratamiento Limpieza quirrgica con debridamiento y drenaje, y administracin de antimicrobianos adecuados.
CELULITIS POR OTRAS BACTERIAS ANAEROBIAS
Clnicamente es similar a la anterior, sin embargo las cepas responsables son bacterias anaerobias no esporuladas (cocos grampositivos, bacilos gramnegativos) pertenecientes a diferentes gneros. En muchos casos la infeccin es polimicrobiana y con participacin de bacterias aerobias y anaerobias facultativas (Staphylococcus, Streptococcus, Enterobacteriaceae). El pronstico es bueno si el diagnstico y el tratamiento adecuado son precoces.
FASCITIS ESTREPTOCCICA NECROTIZANTE
Incluye dos entidades segn los agentes infecciosos responsables: a) Tipo I: se trata de una infeccin mixta, en la que participan por lo menos una especie anaerobia (bacilos gramnegativo o cocos grampositivos) y una o ms cepas aerobias (Streptococcus, bacilos gramnegativos: Pseudomonas y otros); b) Tipo II: es el cuadro conocido como gangrena estreptoccica y el agente etiolgico ms frecuente es Streptococcus pyogenes, solo o en combinacin con S. aureus. Se trata de procesos agudos que aparecen luego de intervenciones quirrgicas, sobre todo a nivel abdominal o cercanas al recto (perirrectales). Las producidas por Streptococcus pyogenes tambin pueden ocurrir luego de traumatismos banales. El sector afectado est rojo, caliente
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Celulitis de brazo causada por Streptococcus agalactiae
y doloroso; la piel suprayacente adquiere un color gris azulado y luego aparecen vesculas de contenido serosanguinolento. Con el tiempo se transforma en una scara negra y como consecuencia de la destruccin de los nervios perifricos, la zona puede perder sensibilidad. En las formas mixtas puede haber crepitacin y un olor ftido caracterstico. Los sntomas y signos generales incluyen: fiebre, malestar general, decaimiento, acompaados habitualmente de leucocitosis. El diagnstico se realiza por exploracin quirrgica con valoracin del estado de la fascia que se presenta necrtica, con resistencia disminuida y se diseca fcilmente. La tincin del exudado puede revelar la presencia de cocos, bacilos grampositivos y negativos. El tratamiento es quirrgico. Tratamiento mdico: antimicrobianos adecuados por va intravenosa (teniendo en cuenta para la eleccin, entre otros factores: agentes participantes, sus posibles mecanismos de resistencia, produccin de exotoxinas con accin local o a distancia). Existe una forma especial de fascitis necrotizante que afecta los genitales masculinos, denominada gangrena de Fournier. El proceso puede comprometer: escroto, perin, pene y pared abdominal. Algunos casos de fascitis necrotizante causados por Streptococcus pyogenes pueden asociarse con un cuadro sistmico sumamente grave, denominado sndrome de shock txico estreptoccico, con manifestaciones similares al producido por cepas de S. aureus productoras de TSST-1. Las cepas de Streptococcus pyogenes aisladas con mayor frecuencia en estos casos pertenecen a los serotipos M1 y M3, y son productoras de exotoxinas pirgenas de tipo A o B.
CELULITIS NECROTIZANTE SINRGICA PROGRESIVA
En este caso no hay compromiso de la fascia, y suele aparecer luego de intervenciones quirrgicas, abdominales o torcicas. Se conoce tambin como gangrena de Meleney. Se trata de un proceso infeccioso polimicrobiano, que aparece en la proximidad de la sutura y luego de varios das. Hay dolor intenso, con rubor y edema. Ms tarde en la lesin se pueden reconocer tres sectores ms o menos definidos: uno central, gangrenoso de color verdoso con aspecto
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de cuero seco, un sector intermedio de color violeta y muy doloroso, y otro externo de color rojo intenso. La evolucin es ms lenta que en los casos anteriores.
MIOSITIS INFECCIOSA
Se trata de procesos inflamatorios agudos, fundamentalmente de etiologa bacteriana (aunque hay casos asociados a virus) y poco frecuentes. Los agentes infecciosos pueden alcanzar el msculo a travs de diferentes vas: por inoculacin directa (heridas penetrantes); por contigidad a partir de procesos cercanos; por va sangunea desde focos infecciosos alejados. Las entidades ms importantes son: piomiositis, mionecrosis por clostridios y mionecrosis no producida por clostridios.
PIOMIOSITIS
Infeccin aguda del msculo esqueltico (sin compromiso inicial de la piel y de otras partes blandas o hueso adyacente), causada generalmente por cepas de S. aureus. Clnicamente se manifiesta por dolor localizado, tumefaccin y a veces se asocia impotencia funcional, con o sin fiebre.
MIONECROSIS POR CLOSTRIDIOS
Se trata de un proceso agudo que compromete msculos esquelticos, sumamente txico, de progresin rpida y potencialmente fatal. Es causado principalmente por cepas de Clostridium perfringens. La mionecrosis por clostridios se observa en situaciones que tienen en comn la presencia de lesiones musculares extensas (con gran destruccin tisular y compromiso del aporte sanguneo) y contaminacin con esporos de C. perfringens o de otros clostridios histotxicos; como sucede luego de fracturas expuestas, heridas de ciruga abdominal, inyecciones intramusculares con suspensiones que contienen sustancias vasoconstrictoras, heridas de guerra, etc. Tambin se describen casos en los cuales la herida no es evidente, denominados mionecrosis espontnea no traumtica, en los cuales los agentes responsables (Clostridium septicum u otros) llegan por va hemtica a partir del intestino. En este caso existen factores predisponentes a nivel intestinal (cncer de colon, infarto intestinomesentrico, etc.). El sntoma inicial es el dolor, aparece dos a tres das luego del traumatismo y es sumamente intenso. En la zona afectada puede haber crepitacin debido a la acumulacin de gas (en logias inextensibles esta acumulacin compromete an ms el aporte sanguneo), sin embargo puede estar enmascarada por el edema importante. Se acompaa de manifestaciones generales de toxemia (taquicardia, sudoracin profusa, hipotensin, etc.). Por la herida drena un lquido serosanguinolento de olor ftido. En la exploracin quirrgica (obligatoria) se comprueba que los msculos afectados no se contraen, estn plidos y friables, no sangran al corte, y han perdido su elasticidad. El estudio microscpico de frotis hechos a partir del lquido o de muestras de tejido pueden mostrar bacilos grampositivos caratersticos y pocos polimorfonucleares. Varias enzimas y toxinas bacterianas (alfatoxina o lecitinasa, beta, epsilon y tita entre otras), seran responsables de la gran destruccin tisular y disminucin de la respuesta celular inflamatoria a nivel de la zona afectada; tambin de algunas manifestaciones generales tardas como ictericia y hemoglobinuria por lisis txica de los glbulos rojos. (Ver captulo 21) El diagnstico rpido es muy importante y se basa en los elementos clnicos y los resultados de la exploracin quirrgica, complementados por el estudio microscpico directo (frotis teidos por la tcnica de Gram) de muestras de lquido o partes de tejido.
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Tratamiento Es fundamental el debridamiento quirrgico completo, extirpando todos los msculos afectados, llegando incluso a la amputacin cuando el proceso compromete miembros; y la administracin de antimicrobianos adecuados para disminuir la carga bacteriana y la produccin de toxinas. Se puede utilizar la cmara hiperbrica como terapia coadyuvante. Una forma particular de mionecrosis por clostridios es la que ocurre en el msculo uterino. Es una infeccin grave, que se produce generalmente por maniobras abortivas realizadas en condiciones precarias, tambin puede presentarse tras un aborto o parto espontneo. Se produce por la irrupcin brusca en el torrente circulatorio de la alfatoxina (hidrolisa la lecitina de las membranas celulares) de C. perfringens desde la cavidad uterina, este pasaje est favorecido por el aumento de la irrigacin del tero grvido. La toxina causa la hemlisis que lleva a la trada sintomtica de Mondor: hemoglobinemia, ictericia y hemoglobinuria, con estado general grave e insuficiencia renal aguda.
MIONECROSIS NO PRODUCIDA POR CLOSTRIDIOS
En estos procesos los agentes etiolgicos son los siguientes: cocos grampositivos anaerobios, bacilos gramnegativos anaerobios, muchas veces asociados a S. aureus o S. pyogenes.
Glosario
Exantema: erupciones de la piel. Pueden ser de dos tipos, a) escarlatiniforme con micromaculoppulas, speras, sin espacios de piel sana; b) morbiliforme, micromaculoppulas ms suaves, separadas por sectores de piel sana. Eritema: enrojecimiento de la piel, limitado o difuso que desaparece con la aplicacin de presin. Mculas: modificaciones del color normal de la piel, no se palpan. Ppulas: Elevaciones pequeas, hemisfricas, menores de un centmetro, slidas y circunscriptas. Vesculas: elevaciones localizadas, de entre uno y cinco milmetros, con contenido lquido. Ampollas: elevaciones localizadas, de mayor tamao que las vesculas, con contenido seroso o seropurulento. Pueden estar tensas o flcidas. Pstulas: pequeas elevaciones de contenido purulento. Costras: masas secas de suero, pus o sangre mezcladas con restos celulares y bacterias. Aparecen luego de pstulas, vesculas o ampollas. scaras: formadas por tejido necrosado.
Bibliografa
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Infecciones respiratorias
M. Macedo, S. Mateos
Las infecciones respiratorias (IR) son afecciones muy frecuentes. Constituyen una importante causa de morbilidad y mortalidad en todas las edades.
Clasificacin
Segn la localizacin encontramos las IR altas, que son las que afectan al tracto respiratorio superior, y las IR bajas, es decir las que afectan al tracto respiratorio inferior. De acuerdo a la etiologa podemos hacer dos tipos de clasificaciones: a) por un lado se distinguen las infecciones bacterianas, virales, parasitarias y fngicas; b) por otro lado es clsico diferenciarlas en especficas, es decir aquellas infecciones que son causadas por un agente en particular, como la tos convulsa o tos ferina o coqueluche (causada por Bordetella pertussis), la tuberculosis (causada por Mycobacterium tuberculosis), la difteria (Corynebacterium diphteriae), e inespecficas que son ampliamente las ms frecuentes. a) Segn la etiologa Bacterianas, virales, parasitarias. Especficas, inespecficas. b) Segn la localizacin: Altas. Bajas. Nos referiremos, en este captulo, exclusivamente a las infecciones bacterianas y virales clsicamente denominadas inespecficas.
Infecciones respiratorias altas

Son las infecciones que afectan la nasofaringe, orofaringe, laringe, trquea, odo y senos paranasales. Debe recordarse que la mucosa del tracto respiratorio superior es continua por lo que una infeccin en cualquiera de sus sectores puede propagarse hacia sus sectores inferiores.
RESFRO COMN (RINITIS)
Es la inflamacin de la mucosa nasal. Es una infeccin sumamente frecuente, y es la manifestacin ms frecuente de infeccin del tracto respiratorio superior causada por muchos virus
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diferentes. A pesar de su elevada frecuencia, no existe teraputica ni medidas preventivas especficas para la mayora de sus agentes etiolgicos. Etiologa Salvo raras excepciones, los agentes etiolgicos son virus. Los virus ms frecuentemente involucrados son Rinovirus, Coronavirus, Parainfluenza y Adenovirus; menos frecuentemente Virus Respiratorio Sincicial (VRS) y Enterovirus. Dependiendo de las series estudiadas, las proporciones de cada virus varan, pero en general Rinovirus son los agentes ms frecuentes. Debido a dificultades diagnsticas, probablemente la frecuencia de Coronavirus est subestimada pero se sabe que tiene un rol importante en la etiologa del resfro comn. En cuanto a Adenovirus, algunos tipos (1, 2, 5, 6) se asocian a cuadros inespecficos como el resfro comn, mientras que otros tienen tendencia a causar cuadros ms especficos (ej.: 3 y 7- fiebre faringoconjuntival; 8 - queratoconjuntivitis). Influenza virus afecta la mucosa nasal en el curso de infecciones que afectan simultneamente otros sectores del tracto respiratorio, incluso el tracto inferior. Sin embargo, las reinfecciones con un mismo tipo de virus Influenza pueden manifestarse como resfro comn sin fiebre y permiten al virus diseminarse rpidamente entre personas susceptibles. Epidemiologa La va de ingreso es respiratoria. Los virus se diseminan por contacto directo con secreciones infectadas, mano a mano o a travs de fomites, y posteriormente son inoculados en la mucosa nasal o conjuntival; la inoculacin en la mucosa oral es una ruta menos efectiva. Esta va de diseminacin es la ms frecuente para la mayora de los virus respiratorios, y explica la alta tasa de ataque en contactos familiares. Por aerosoles: ha sido documentada esta forma de transmisin para Influenza virus, pero se presume que puede ocurrir tambin con Rinovirus y Enterovirus. El resfro comn suele ocurrir con mayor frecuencia en los meses fros del ao, pero cada virus tiene su propia incidencia estacional (figura 1). Rinovirus predomina en otoo y primavera; VRS aumenta a mitad del invierno; Coronavirus aumenta al final del invierno y primavera. Esto sugiere un fenmeno de interferencia entre los distintos virus que an no es claro. En cuanto al rol del clima y la temperatura, se cree que por un lado las bajas temperaturas aumentan el hacinamiento de personas en espacios cerrados favoreciendo la diseminacin; por otro lado, los cambios en la humedad ambiental relativa alteran la viabilidad viral, por ejemplo Rinovirus tiene mayor viabilidad cuando la humedad es de 40% a 50%, mientras que Influenza y Parainfluenza virus persisten viables en aerosoles habiendo baja humedad ambiental relativa.
Figura 1. Distribucin estacional de los virus respiratorios
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Patogenia El perodo de incubacin es de uno a cuatro das. La replicacin viral se produce en las clulas ciliadas del epitelio nasal y la nasofaringe. La viremia no es frecuente, salvo para Enterovirus. La eliminacin del virus aumenta al tercer o cuarto da de infeccin y suele desaparecer al quinto; en nios el perodo de eliminacin puede ser ms prolongado. La infeccin es limitada por los mecanismos locales de inmunidad. Los sntomas, que suelen hacerse ms prominentes luego del quinto da de enfermedad y desaparecer hacia el dcimo da, se deben a edema e hiperemia de la mucosa y destruccin de clulas epiteliales. Manifestaciones clnicas Dependiendo del agente etiolgico, el contacto previo con el mismo agente o agentes antignicamente relacionados y el estado inmunolgico del husped, la presentacin clnica es variable. El espectro de signos y sntomas comprende aumento de las secreciones mucosas con corrimiento nasal u obstruccin nasal, edema inflamatorio de la mucosa, estornudos, odinofagia, congestin conjuntival. Puede haber sntomas sistmicos: fiebre (siempre de bajo grado), mialgias, cefaleas, tos seca, afona, etc. Diagnstico etiolgico Debido a la diversidad de agentes que pueden causar rinitis (recordar que estos agentes poseen ms de un tipo antignico, algunos incluso, como Rinovirus, poseen cientos) y a la levedad del proceso, el diagnstico etiolgico es engorroso y costoso. Si se desea realizarlo con fines epidemiolgicos, la muestra que se prefiere es el aspirado nasofarngeo (ANF) fundamentalmente en nios pequeos, pero el hisopado nasofarngeo es una alternativa aceptable, y es la muestra ms utilizada en adultos. El cultivo es el mtodo directo de eleccin para todos los virus respiratorios. Los mtodos directos rpidos (inmunofluorescencia) son en general menos sensibles que el cultivo; muestran mayor utilidad para VRS que para otros virus. La serologa solo sirve con fines epidemiolgicos, ya que el diagnstico es retrospectivo y se requieren sueros pareados para su correcta interpretacin. Tratamiento Es una infeccin leve y autolimitada que no requiere tratamiento especfico, adems de que no se dispone de frmacos antivirales para la mayora de estos virus. Los antivirales antivirus Influenza se reservan para personas de riesgo de enfermedad grave durante los perodos de epidemias. El tratamiento es, por lo tanto, sintomtico. Es importante recordar que en el curso de la infeccin, y muy frecuentemente en etapa de resolucin, las caractersticas del corrimiento nasal van cambiando debido a la acumulacin de clulas muertas y otros detritus. Esto no debe hacer pensar en una infeccin bacteriana sobreagregada o en la agravacin del cuadro, por lo que no tendr efecto ningn otro tipo de tratamiento, especialmente el uso de antibiticos. Prevencin La principal medida es limitar el contacto con personas infectadas. Se dispone de vacunas para algunos de estos virus, ej.: Influenza y Adenovirus, por lo tanto previenen una mnima cantidad de casos. La posibilidad de obtener una vacuna que proteja contra Rinovirus es muy remota debido a la gran cantidad de serotipos de este virus y a que no se ha demostrado inmunidad cruzada entre ellos.
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FARINGITIS Y AMIGDALITIS
Es una infeccin frecuente, tanto en nios como en adultos. Etiologa La mayora de las faringoamigdalitis son virales, pero, a diferencia de lo que ocurre con la rinitis, tambin puede ser de etiologa bacteriana y es especialmente importante diferenciar unas de las otras. Faringitis viral Los agentes virales ms frecuentes as como los sndromes clnicos a los que se asocian, se muestran en el siguiente cuadro. La afeccin farngea puede ser primaria o presentarse en el curso de otra infeccin respiratoria o sistmica.
Causas virales de faringitis Virus Rinovirus Coronavirus Adenovirus Herpes simplex virus (types 1 y 2) Parainfluenza virus (types 14) Influenza virus (types A and B) Coxsackievirus A (types 2, 46, 8, 10) Epstein-Barr virus Cytomegalovirus VIH-1 Sndrome/Enfermedad Resfro comn Resfro comn Fiebre faringoconjuntival Gingivitis, estomatitis, faringitis Resfro comn, laringitis Influenza Herpangina Mononucleosis infecciosa Mononucleosis infecciosa Primoinfeccin VIH Estimated Importance* 20 5 5 4 2 2 <1 <1 <1 <1
Copyright 2000, 1995, 1990, 1985, 1979 by Churchill Livingstone
La epidemiologa, profilaxis y tratamiento de las faringitis virales merecen las mismas consideraciones realizadas para el resfro comn. Fiebre faringoconjuntival: la presentacin clnica de la faringitis producida por Adenovirus generalmente es ms severa que la asociada al resfro comn. Se acompaa de malestar general, mialgias, cefaleas, chuchos de fro, mareos, fiebre alta, odinofagia y exudado farngeo purulento indistinguible del observado en las faringitis bacterianas. Una caracterstica distintiva, si est presente, es la conjuntivitis que afecta a un tercio de los casos. Es de tipo folicular y bilateral. Faringitis herptica: la infeccin primaria por Herpes simplex puede presentarse como una faringitis aguda. Los casos leves son indiferenciables de las otras etiologas. En los casos severos la presencia de inflamacin y exudado purulento puede hacer pensar en una faringitis bacteriana. Las vesculas y las lceras planas de paladar son hallazgos caractersticos. Herpangina: es un tipo infrecuente de faringitis causada por el virus Coxsackie y se diferencia por la presencia de pequeas vesculas en paladar blando, la vula y pilares anteriores de faringe. Las lesiones se abren para convertirse en pequeas lceras blancas. Se observa principalmente en nios, en quienes puede manifestarse como una enfermedad febril severa.
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Mononucleosis infecciosa: se asocia a infeccin por Citomegalovirus y en un 50% de los casos se presenta con odinofagia, fiebre alta, adenopatas perifricas en todos los territorios, fatiga, esplenomegalia. Faringitis bacteriana Streptococcus pyogenes (Streptococcus betahemoltico del grupo A) es el principal agente bacteriano de faringitis. Otros estreptococos beta-hemolticos agentes de faringitis son los de los grupos C, G y F de Lancefield. La faringitis estreptocccicas debe ser diferenciada de las de otra causa ya que puede tener complicaciones supurativas y no supurativas. Otras bacterias que causan faringitis con menor frecuencia: Arcanobacterium hemolyticus, Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium ulcerans, Micoplasma pneumoniae.
Epidemiologa
Estas infecciones ocurren durante todo el ao pero tienen su pico de incidencia en otoo y primavera. El grupo etario ms afectado y el de mayor riesgo de complicaciones es el de 5 a 15 aos. La trasmisin se produce por va respiratoria por contacto estrecho persona a persona.
Manifestaciones clnicas
El perodo de incubacin es de dos a cuatro das. El cuadro ms caracterstico est dado por la instalacin abrupta de odinofagia acompaada de fiebre, cefalea y malestar general. En nios son frecuentes las nuseas, vmitos y dolor abdominal. Los signos ms destacados son edema, enrojecimiento e hiperplasia linfoide a nivel de la faringe posterior, hiperplasia amigdalina, exudado amigdalino blanco grisceo, adenomegalias cervicales dolorosas. Si bien esta signosintomatologa es sugestiva de faringitis bacteriana, tambin puede deberse a causas virales, y por este motivo nunca puede realizarse el diagnstico etiolgico nicamente sobre la base del cuadro clnico. Por otra parte, un cuadro respiratorio alto que carezca de estas manifestaciones raramente corresponder a una faringitis bacteriana. La infeccin farngea aguda es de resolucin espontnea; la fiebre desaparece en tres a cinco das y el resto de los sntomas y signos suele resolverse en el plazo de una semana. Como veremos entonces, el nico motivo por el cual se justifica el tratamiento antibitico es la prevencin de las complicaciones. En los casos en que la cepa de S. pyogenes que causa una faringitis u otra infeccin produce toxinas eritrognicas, puede producirse escarlatina. Se trata de un eritema difuso y puntiforme que se acompaa de enantema caracterstico que afecta el paladar y la lengua.
Complicaciones
Hoy en da son poco frecuentes debido al advenimiento de la antibioticoterapia. a) Complicaciones supuradas. A nivel local, pueden producirse abscesos o flemones periamigdalinos, abscesos retrofarngeos. Por extensin directa del germen: otitis media, sinusitis, mastoiditis, linfadenitis cervical supurada. Otras complicaciones supuradas, como infecciones del sistema nervioso central, son extremadamente raras. b) Complicaciones no supuradas (secuelas postestreptoccicas): fiebre reumtica y glomerulonefritis.
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FIEBRE REUMTICA (FR)
Es una enfermedad que se caracteriza por lesiones inflamatorias no supurativas que afectan fundamentalmente al corazn, las articulaciones, el tejido subcutneo y el sistema nervioso central. Su presentacin clnica es muy variable dependiendo del grado de afeccin de cada rgano. El espectro de manifestaciones incluye: carditis, poliartritis, corea, ndulos subcutneos y eritema marginal (signos mayores). Otras manifestaciones menores y menos especficas incluyen fiebre, artralgias, etc. Puede ser autolimitada, pero tambin es posible que ocurra dao cardaco severo con insuficiencia cardaca y lesiones articulares que causen incapacidad. Las personas que han sufrido un episodio de FR son especialmente susceptibles tras nuevas infecciones por S. pyogenes. Este germen ha sido claramente establecido como el agente de esta afeccin, aunque el mecanismo por el cual la bacteria induce la enfermedad no se conoce con exactitud. Ms recientemente, se ha descubierto que algunos estreptococos betahemolticos del grupo Cy G tienen potencial para desencadenar una respuesta autoinmune que puede originar FR. As mismo, se han descrito aislamientos de S. dysgalactiae subespecie equisimilis (que habitualmente son de grupo C o G) portadores del antgeno A de Lancefield. De modo que esta complicacin que tradicionalmente se consideraba causada exclusivamente por S. Pyogenes, es posiblemente causada tambin por otros estreptococos agentes de faringitis. Las teoras ms aceptadas son: 1) injuria tisular debida a los efectos txicos de productos estreptoccicos, en particular de las estreptolisinas S y O; 2) depsito de complejos antgenoanticuerpo a nivel de los tejidos daados; 3) procesos autoinmunes inducidos por la similaridad entre antgenos estreptoccicos y antgenos de tejidos humanos (mmica molecular); esta ltima es sobre la que se ha hecho mayor nfasis. No todas las cepas de S. pyogenes tienen igual capacidad reumatognica. Algunos tipos M se asocian fuertemente con el posterior desarrollo de FR. Por otra parte, las infecciones cutneas por este germen no causan FR. Esto podra explicarse por la falta de reumatogenicidad de las cepas que causan piodermia, o podra indicar que es necesario el sitio farngeo, abundante en tejido linfoide, para generar los trastornos inmunes probablemente responsables de la enfermedad.
GLOMERULONEFRITIS (GN)
Es una enfermedad inflamatoria del glomrulo renal que sigue a las infecciones farngeas o cutneas causadas por cepas pertenecientes a un limitado nmero de serotipos de S. pyogenes, llamadas cepas nefritognicas. Se manifiesta por edema, hipertensin arterial, hematuria y proteinuria. A diferencia de la FR, S. pyogenes no es el nico agente capaz de causar GN, sino que otras infecciones tambin pueden originarla. La causa de la lesin renal no es clara, pero tambin en este caso se aboga por la hiptesis del dao autoinmune. Se han descrito similaridades antignicas entre constituyentes bacterianos y el tejido renal humano, y se han encontrado inmunocomplejos depositados en ndulos subepiteliales. Diagnstico etiolgico El principal objetivo, como hemos dicho, es diferenciar las infecciones causados por virus de aquellas causadas por S. pyogenes; eventualmente, frente a fuertes sospechas clinicoepidemiolgicas, puede ser necesario identificar causas bacterianas especficas (ej.: difteria, gonococcia) para las cuales existe tratamiento. El gold standard para el diagnstico de faringitis bacteriana es el exudado farngeo. Nos enfocaremos en la investigacin de S. pyogenes. De todos modos, el diseo del estudio tal como lo describiremos permite la deteccin de otros Streptococcus y Aracanobacterium. La toma de muestra se realiza mediante hisopado de las amgdalas; no es necesario utilizar medios de transporte, ya que S. pyogenes es altamente resistente a la deseca-
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cin y puede permanecer viable hasta por 72 horas en hisopo seco. La muestra se siembra en un medio rico, habitualmente agar sangre. Es til puncionar el agar con el asa ya que la accin de la estreptolisina O se detecta mejor en condiciones de baja concentracin de oxgeno y se visualiza como un aumento de la zona de hemlisis en el sitio de puncin. Tras 24 a 48 horas de incubacin a 37C, se busca macroscpicamente la presencia de colonias betahemolticas sugestivas de S. pyogenes. Para proseguir el estudio correctamente se debe realizar un aislamiento de la o las colonia/s sospechosa/s, ya que evidentemente no se encontrarn en cultivo puro sino en un cultivo polimicrobiano en el que habitualmente predominarn bacterias de la flora oral, especialmente colonias alfahemolticas propias de Streptococcus spp. del grupo viridans. Una vez obtenido el germen de inters en cultivo puro, se realizar tincin de Gram para verificar que se trata de un coco grampositivo. Luego se proceder a su caracterizacin bioqumica. En primer lugar corresponde realizar una prueba de catalasa que deber ser negativa, ya que se trata de una bacteria de la familia Streptococcaceae. Para orientarnos a la especie, la tabla 1 muestra las pruebas ms tiles y el resultado esperado.
Tabla 1.
1. Susceptibilidad a la bacitracina* 2. Prueba de PYR 3. Susceptibilidad a Trimetoprim-sulfametoxazol** 4. Prueba de CAMP S + R +
* Prueba de baja sensibilidad si se utiliza aisladamente. ** Streptococcus del grupo A y del grupo B son intrnsecamente resistentes a este antibitico, a diferencia de otros Streptococcus. PYR: Pyrrolidonyl arylamidasa.
Finalmente se puede realizar determinacin de los antgenos carbohidratos de la pared celular, que en general se realiza mediante aglutinacin con ltex o pruebas de coaglutinacin. Tiene la ventaja de ser una prueba rpida que se puede realizar con un escaso nmero de colonias, pero su desventaja es el costo. Una alternativa al exudado farngeo son las pruebas rpidas de deteccin de antgeno de Streptococcus del grupo A. Se realizan directamente a partir de la muestra de hisopado farngeo. Estos mtodos no dependen del cultivo del microorganismo y por lo tanto permiten obtener un resultado en pocos minutos. Debido a esta notable ventaja su uso se encuentra ampliamente difundido a pesar de que su costo es ms elevado que el cultivo. Aunque existen variaciones de procedimiento de acuerdo a cada producto comercial, el mtodo consiste en: 1) extraccin del carbohidrato grupo A especfico mediante la incubacin del hisopo en cido o por tratamiento enzimtico; 2) deteccin del antgeno extrado, para lo cual la mayora de los sistemas comerciales utilizan aglutinacin con ltex o enzimoinmunoensayo; tambin se ha utilizado la tecnologa de ADN. Entre sus desventajas, si bien su especificidad es muy buena, en general superior al 95%, su sensibilidad es un poco menor (entre 68% y 95%). Por este motivo, la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas (IDSA) recomienda utilizarlo como mtodo de screening e interpretarlo de la siguiente manera:
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Test rpido positivo negativo Grupo de riesgo (grupo de alto VPP) Grupo de bajo riesgo (grupo de alto VPN) Considerar al paciente portador de S. pyogenes y no realizar pruebas adicionales. Realizar exudado farngeo. No realizar estudios adicionales
VPP: valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo
Serodiagnstico Los individuos que cursan infecciones por S. pyogenes desarrollan anticuerpos contra diferentes antgenos de la bacteria. Los ms comunes son: antiestreptolisina O (AELO), anti DNAsa B, antiestreptoquinasa y antihialuronidasa. Los anticuerpos AELO pueden utilizarse para realizar el diagnstico restrospectivo de una infeccin por S. pyogenes. Estos anticuerpos no son tiles en el diagnstico de la faringitis aguda, ya que su elevacin comienza a observarse luego de la resolucin, incluso espontnea, de esta infeccin. En cambio, la seroconversin en el ttulo de AELO contribuye a aclarar el diagnstico en pacientes con cuadros sugestivos de secuelas postestreptoccicas, en los cuales el antecedente de faringitis no es evidente. Estudio de susceptibilidad antibitica Hasta la fecha, S. pyogenes se mantiene uniformemente sensible a la penicilina. Por este motivo, no es necesario realizar sistemticamente estudios de susceptibilidad en los aislamientos clnicos a menos que se decida realizar tratamiento con macrlidos, en cuyo caso debe testearse la susceptibilidad in vitro ya que el germen muestra un comportamiento variable frente a estos antibiticos. Tratamiento Debido a que el objetivo principal es prevenir las complicaciones supuradas y las secuelas no supuradas, el grupo antibitico de primera eleccin es el de las penicilinas (penicilina G sdica, penicilina benzatnica, ampicilina, amoxicilina), ya que ha demostrado prevenir efectivamente la FR. En los pacientes alrgicos a penicilina, se opta por eritromicina u otros macrlidos. El tratamiento con estos antibiticos (salvo con azitromicina) debe tener una duracin de 10 das, an cuando el paciente ya no presente sntomas, como es habitual. Otras alternativas eficaces incluyen cafalosporinas de primera y segunda generacin. Sin embargo, no son convenientes debido a su costo y a que, al ser de mayor espectro antimicrobiano, afectan la flora normal y favorecen la seleccin de resistencia.
LARINGOTRAQUEOBRONQUITIS AGUDA (CRUP)
Es una infeccin viral alta y baja vinculada con la edad, que produce una inflamacin en el rea subgltica que conduce a un cuadro clnico caracterizado por disnea y estridor inspiratorio caracterstico. Crup deriva del vocablo escocs ruop, que significa gritar con voz chillona. Incidencia Enfermedad frecuente de la primera infancia, representa el 15% de todas las IRA en los nios. La incidencia mxima se observa durante el segundo ao de vida y la mayor parte de los casos se produce entre los tres meses y los tres aos de edad. Predomina en el sexo masculino.
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Etiologa El virus Parainfluenza 1 es la causa ms frecuente, el tipo 3 suele ser el segundo en frecuencia. Los brotes epidmicos causados por virus Influenza A y B pueden determinar un porcentaje significativo. Solo en un 5% de los casos puede ser causado por VRS. Las infecciones por Adenovirus pocas veces se asocian con crup, aunque la laringitis suele ser una manifestacin habitual en las infecciones producidas por estos virus. Las manifestaciones ms caracteristicas de la enfermedad fueron asociadas al virus Parainfluenza 2, sin embargo el porcentaje total de casos de crup provocado por ste es menor que el asociado a los tipos 1 y 3. Este fenmeno se debe a que los virus tipo 2 son menos frecuentes en la comunidad y los brotes epidmicos provocados por este virus son poco frecuentes. De todos los agentes mencionados, solo Parainfleunza tipo1 y el virus Influenza A se asocian con epidemias. En la era prevacunal el sarampin se asociaba con un crup severo y complicado. Epidemiologa Los patrones epidemiolgicos reflejan principalmente los patrones estacionales. El virus Parainfluenza 1 tiene su mxima incidencia durante el otoo y parecera provocar brotes epidmicos ao por medio. Lo brotes en invierno o principios de la primavera se asocian ms frecuentemente a Influenza A o B. Manifestaciones clnicas Inicialmente la infeccin viral compromete el tracto respiratorio superior, conductos nasales, nasofaringe, posteriormente se propaga por la va canalicular descendente para afectar todos los niveles del aparato respiratorio. Los signos clsicos de estridor, disfona y tos perruna resultan principalmente de la inflamacin de laringe y trquea, sin embargo en la mayora de los pacientes se objetiva un compromiso pulmonar. La obstruccin y por ende la inflamacin son mximas a nivel subgltico, este rea representa la porcin menos distensible de la va area, dado que est rodeado por cartlago cricoides con un estrecho anillo anterior y lmina cuadrangular posterior ms ancha, anillo de sello. Estos hechos se agravan en los nios pequeos dado que en ellos las paredes de la va area son relativamente distensibles, es probable que los factores anatmicos contribuyan a la mayor gravedad de este cuadro en nios preescolares. El dimetro de la laringe y la glotis es relativamente pequeo y la inflamacin de las mucosas determina mayor grado de obstruccin. La resistencia de la va area es un parmetro sumamente sensible, incluso a cambios poco marcados del dimetro de la va. La resistencia al flujo areo est inversamente relacionada con la cuarta potencia del radio del la va. La membrana mucosa tambin se encuentra relativamente ms laxa, as como ms vascularizada, y el anillo cartilaginoso es menos rgido, la obstruccin nasal y el llanto pueden agravar el estrechamiento dinmico de la va area del nio. La enfermedad se manifiesta durante el anochecer generalmente luego de una tos leve de varios das de duracin, acompaada o no de odinofagia y rinorrea serosa. Los nios infectados por Influenza y Parainfluenza suelen tener fiebre de entre 38 y 40; en la infeccin por VRS la fiebre suele ser ms baja. La instalacin del crup puede estar anunciada por la presencia de disfona y una profundizacin de la tos, habitualmente seca con un tono metlico (perruno). Aparecen polipnea, tirajes altos, estridor larngeo inspiratorio, roncus y sibilancias. Una caracterstica distintiva es su curso fluctuante. El cuadro puede mejorar o agravarse clnicamente en el curso de una hora. La mayora de las veces dura entre tres y cuatro das, aunque la tos puede persistir. El diagnstico es clnico, el asilamiento viral se discutir ms adelante, si bin no es recomendable realizar procedimientos invasivos para no alterar al nio y agravar el cuadro.
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Tratamiento Es sintomtico. Siendo una enfermedad de etiologa viral, los antibiticos no tienen efecto alguno.
EPIGLOTITIS
Es una infeccin grave de la laringe supragltica que resulta en edema epigltico con la consiguiente obstruccin larngea. A diferencia de la laringitis, suele ocurrir en nios mayores de dos aos; tambin puede ocurrir en adultos. Su etiologa es bacteriana. Etiologa Su principal causal es Haemophilus influenzae tipo b. Desde que se utiliza la vacuna contra este germen, han disminuido dramticamente las infecciones invasivas que produce, dentro de las cuales se encuentra la epiglotitis. Son causas menos frecuentes: Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus, S. aureus, H. influenzae no encapsulado, H. parainfluenzae. Manifestaciones clnicas La sintomatologa es de instalacin brusca. Se presenta con odinofagia, fiebre elevada, disfagia y dificultad respiratoria por obstruccin de la va area que domina el cuadro y causa estridor. El nio se presenta con aspecto txico. Cuando se asocia bacteriemia el cuadro es de muy mal pronstico. En el adulto la presentacin es menos brusca pero igualmente severa. Diagnstico etiolgico El germen puede aislarse de muestras de secreciones respiratorias del sector supragltico y de hemocultivos en caso de bacteriemia. Tratamiento Es una emergencia peditrica. Adems del tratamiento de soporte para eliminar la obstruccin, se requiere tratamiento antibitico. Profilaxis La principal medida profilctica es la vacunacin anti-Haemophilus influenzae tipo b. Frente a los casos de enfermedad confirmada, se adiministra rifampicina durante cuatro das a: 1) todos los contactos familiares cuando hay nios menores de cuatro aos en el hogar; 2) compaeros de escuela y maestros del caso ndice; 3) el paciente antes de otorgar el alta hospitalaria para prevenir la reintroduccin del germen en el hogar.
OTITIS MEDIA AGUDA (OMA)
Es la inflamacin aguda del odo medio. Es una de las enfermedades ms prevalentes en la infancia. Es uno de los principales motivos de prescripcin de antibiticos en atencin primaria. Epidemiologa La OMA es una enfermedad de lactantes y nios pequeos, la mxima incidencia se produce entre los 6 y los 18 meses de edad. A los tres aos la mayora de los nios han sufrido al menos un episodio, y hasta la mitad han sufrido una OMA recidivante (tres o ms episodios). Entre los factores que influyen en la frecuencia de OMA se incluyen la alergia a antgenos y
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polulantes, exposicin a humo de cigarrillo, lactancia natural, estacin del ao, concurrencia a guarderas, pobreza, hacinamiento, mala higiene. Etiologa La microbiologa de la OMA se ha documentado por cultivo del lquido del odo medio obtenido mediante aspiracin con aguja. Streptococcus pneumoniae (aislado con mayor frecuencia en todos los grupos etarios) seguido por Haemophilus influenzae no tipo b, son responsables de por lo menos el 90% de las OMA. Moraxella catarrhalis es el tercer agente en frecuencia, dando cuenta del 3% al 20% de las infecciones. Otros agentes menos frecuentes: H. influenzae tipo b, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae, bacilos gramnegativos. Rol de los virus respiratorios (VRS, Rinovirus, Adenovirus, Enterovirus, Influenza virus, Parainfluenza virus): pueden inducir o prolongar la infeccin por alterar los mecanismos celulares de defensa. Patogenia Para comprender la patogenia de la OMA hay que tener en cuenta que la enfermedad afecta a un sistema constituido por partes contiguas: orificios nasales, nasofaringe, trompa de Eustaquio, odo medio, antro y celdas areas de la mastoides. El odo medio recuerda a una caja aplanada, la pared lateral comprende la membrana timpnica y la pared interna incluye las ventanas oval y redonda. Las celdas areas mastoides estn detrs y el orificio de la trompa de Eustaquio se encuentra en la porcin superior de la pared frontal. La trompa de Eustaquio conecta el odo medio con la nasofaringe posterior y su tercio lateral est situado en el hueso y es abierto. En el lactante, la trompa es ms corta y proporcionalmente ms ancha que en el nio mayor; las porciones seas y cartilaginosas forman una lnea relativamente recta, mientras que en el nio mayor forman un ngulo ms agudo. Estas diferencias pueden predisponer a la enfermedad precoz y repetida en algunos lactantes. La trompa de Eustaquio desempea al menos tres funciones importantes respecto al odo medio: proteccin del odo frente a las secreciones nasofarngeas, drenaje hacia la nasofaringe de las secreciones producidas por el odo medio y ventilacin para igualar las presiones del aire dentro del odo medio. La disfuncin de la trompa debido a factores anatmicos o fisiolgicos parece ser el factor ms importante en la patogenia de esta infeccin. La secuencia ms probable de eventos en la mayora de los episodios comprende una anomala previa (debido por lo general a una IRA alta viral) que da lugar a la congestin de la mucosa respiratoria y la consecuente obstruccin de la mucosa tubrica que ocasiona la obstruccin de la porcin ms estrecha de la trompa o istmo; la obstruccin provoca una presin negativa en el interior del odo medio, con formacin de derrame. Las secreciones del odo medio se acumulan en consecuencia, si despus de producirse la obstruccin tubrica existen bacterias patgenas en el odo medio que colonizan la nasofaringe, los microorganismos se multiplican y producen una infeccin supurada aguda. Manifestaciones clnicas La enfermedad se presenta con otalgia, hipoacusia, fiebre, anorexia, vmitos, diarrea. Cuando ocurre perforacin de la membrana timpnica se observa otorrea. Posibles complicaciones de esta infeccin Otorrea purulenta crnica, mastoiditis aguda, bacteriemia, prdida de audicin.
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Diagntico etiolgico El diagnstico etiolgico de la OMA plantea un problema, ya que el nico procedimiento adecuado es la timpanocentesis (la obtencin de fluido del odo medio mediante la puncin de la membrana timpnica). Debido a que es un procedimiento agresivo, no se justifica realizarlo en todos los casos. Por este motivo, la mayora de las veces el tratamiento antimicrobiano es emprico. Para conocer la epidemiologa local en cuanto a la etiologa y la susceptibilidad antibitica de los agentes etiolgicos, es necesario realizar estudios peridicamente y en base a ellos ir adecuando la teraputica adecuada. Tratamiento La implementacin de tratamiento antibitico en la OMA es motivo de discrepancias. Por un lado puede ser una enfermedad benigna de resolucin espontnea sin tratamiento. Por otro lado puede evolucionar a complicaciones severas. Con el fin de disminuir la prescripcin antibitica en aquellos casos en que no sea necesario, en algunos pases como Holanda se ha adoptado el criterio de observar a los nios con OMA, siempre que sean mayores de dos aos y muestren un buen estado general. En caso de que la sintomatologa persista o se agrave en el curso de las siguientes 24 hs a 48 hs, entonces se comienza el tratamiento. Sin embargo, en muchos otros pases se mantiene la prctica de administrar siempre antibiticos, como es el caso de nuestro pas. Como ya hemos dicho, la eleccin de los antibiticos apropiados se realiza en cada medio teniendo en cuenta la susceptibilidad local de los grmenes. Mientras que S. pneumoniae presenta en el mundo un creciente grado de resistencia a penicilina, un estudio realizado en nuestro pas en los aos 1999 y 2000, mostr que la mayora de las cepas de este germen son susceptibles a ese antibitico, y las que no lo son suelen presentar resistencia intermedia y raramente absoluta. Igualmente la incidencia de resistencia a eritromicina es muy escasa. Por el contrario, se observa casi un 20% de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol. Algo similar ocurre con H. influenzae; la produccin de betalactamasas por cepas locales es reducida, al igual que en el resto de Amrica Latina, mientras que tiende a aumentar en el resto del mundo. En este mismo estudio, la susceptibilidad a azitromicina fue de 100%, y algunas cepas mostraron resistencia a Trimetoprim, pero en escasa proporcin. De acuerdo a estas consideraciones, las recomendaciones para el tratamiento antibitico de la OMA son las siguientes: El tratamiento de eleccin es amoxicilina a altas dosis (90 mg/kg/da) por la posibilidad de cepas de S. pneumoniae de sensibilidad intermedia. En ese caso, esta dosis es suficiente para alcanzar concentraciones del antibitico en odo medio superiores a la CIM del microorganismo. Como tratamientos alternativos, frente a no respuesta al tratamiento, puede plantearse amoxicilina-clavulnico o cefalosporinas de segunda o tercera generacin, por la posibilidad de H. influenzae productor de betalactamasas. Los macrlidos tambin constituyen una alternativa en pacientes alrgicos a penicilina. De optarse por macrlidos es de preferencia la claritromicina, ya que alcanza mejores concentraciones en el fluido del odo medio que azitromicina, que se concentra preferentemente en el espacio intracelular. Trimetoprim: como hemos visto, en nuestro pas as como en otras partes del mundo, la resistencia aumenta gradualmente por lo que no debe utilizarse de primera eleccin. Finalmente, se encuentra en estudio un nuevo antibitico, la telitromicina perteneciente a la familia de los macrlidos, que parece tener buena actividad frente a bacterias grampositivas multirresistentes.
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Inmunoprofilaxis Se han desarrollado diversas vacunas contra S. pneumoniae. En el mercado mundial existen dos vacunas: una conjugada heptavalente, que es efectiva en nios menores de dos aos, comprende serogrupos de la mayora de las cepas productoras de OMA y disminuye la portacin nasofarngea, pero no est disponible en Uruguay; otra 23-valente polisacardica, que por no ser conjugada no es efectiva en nios menores de dos aos y no disminuye la portacin nasofarngea del germen, por lo que mantiene la posibilidad de infeccin del odo medio. Se est estudiando en la regin la posibilidad de elaborar una vacuna conjugada que contenga los serotipos ms prevalentes. Por otro lado, debido a que las infecciones virales pueden contribuir al desarrollo y mantenimiento de la OMA, la vacunacin contra el virus Influenza puede disminuir la posibilidad de OMA.
OTITIS MEDIA CON DERRAME (OMD)
Es la presencia de derrame en el odo medio sin signos y sntomas agudos de infeccin. Anteriormente se crea que no se trataba de una patologa infecciosa. No obstante, en los ltimos 20 aos varios estudios han identificado la presencia de bacterias en el fluido de odo medio de nios con OMD. Los agentes ms frecuentemente encontrados son los mismos que en OMA. En el manejo de esta patologa, que todava plantea problemas y discrepancias, se incluye el tratamiento antibitico para los mismos agentes que en OMA.
OTITIS EXTERNA
Es la infeccin del conducto auditivo externo. Debido a la anatoma de este sector del odo, se trata de una infeccin localizada de piel que presenta como factores de riesgo la humedad, el calor y la maceracin. Sus principales agentes son Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. El diagnstico etiolgico puede realizarse con mayor facilidad que en la OMA, ya que consiste en el cultivo del exudado del conducto auditivo externo, pero debe tenerse en cuenta que este es un sitio normalmente contaminado con flora de la piel, por lo que su interpretacin debe realizarse con precaucin. El tratamiento consiste en la aplicacin tpica local de antibiticos durante una semana. Entre los agentes farmacolgicos disponibles para uso local y de acuerdo a la etiologa, puede optarse por: macrlidos, fluorquinolonas, aminoglucsidos, cido fusdico, bacitracina, cloranfenicol, etc.
SINUSITIS AGUDA
Es la inflamacin de la mucosa de los senos paranasales de menos de cuatro semanas de evolucin. Es una afeccin frecuente en nios y adultos. Etiologa Ms del 70% de los casos de sinusitis aguda adquirida en la comunidad se deben a los mismos agentes que causan OMA: S. pneumoniae, H. influenzae no encapsulado y M. catarrhalis. Otros agentes bacterianos que pueden causarla son S. pyogenes y otros Streptococcus, S. aureus y con mucho menor frecuencia anaerobios. Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae parecen contribuir escasamente. Los virus estn involucrados en una minora de los casos. En sinusitis nosocomial secundaria a trauma craneal o intubacin nasotraqueal participan otros agentes y muy frecuentemente es polimicrobiana. Participan bacilos gramnegativos (P . aerugionosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Enterobacter spp, otros), S. aureus y anaerobios.
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Manifestaciones clnicas Son variables segn la edad. Los sntomas ms comnmente observados son tos y corrimiento nasal, pero puede acompaarse de fiebre, cefaleas frontales que aumentan con la posicin declive, dolor a nivel de los senos, odinofagia, halitosis. Diagnstico etiolgico Al igual que para la otitis media, la obtencin de una muestra adecuada para estudio bacteriolgico requiere de procedimientos invasivos, la aspiracin sinusal, que por lo tanto se realiza nicamente en casos seleccionados. La prctica de realizar cultivos de nasofaringe en pacientes con sinusitis, presumiendo que las secreciones obtenidas representan a las sinusales, no es recomendada. Numerosos estudios han demostrado que los grmenes recuperados a partir de estas muestras no corresponden a los presentes en los aspirados sinusales. Tratamiento Los antibiticos son el pilar fundamental del tratamiento de la sinusitis aguda. Debe tenerse en cuenta que el diagnstico clnico de sinusitis aguda es en ocasiones difcil de realizar, y como hemos visto, el diagnstico microbiolgico se realiza en una minora de casos. Para evitar el uso innecesario y excesivo de antibiticos, el mdico debe tener en cuenta la probabilidad de que el paciente padezca una sinusitis aguda para decidir cules pacientes sern tratados. El siguiente esquema ilustra una gua til.
Por lo general, salvo en los casos en que se realiz aspiracin sinusal, se realiza en forma emprica. El tratamiento inicial recomendado es amoxicilina durante 10 das, y frente a respuesta parcial continuar 10 das adicionales. Frente a no respuesta al tratamiento, los antibiticos de segunda lnea son amoxicilina-clavulnico, cefalosporinas de segunda generacin, macrlidos. En adultos, las fluorquinolonas tambin son una opcin.
SINUSITIS SUBAGUDA Y CRNICA
La sinusitis subaguda es aquella en la que la sintomatologa persiste por ms de un mes pero menos de tres, y la crnica es la que persiste por ms de tres meses. En estos tipos evolutivos de infeccin cumple un rol muy importante el origen odontognico, por lo que se comprende que los grmenes anaerobios cobran relevancia: Bacteroides, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Veillonella. Es frecuente que sean polimicrobianas. Los grmenes aerobios ms frecuentemente
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encontrados son: Streptococcus del grupo viridans y H. influenzae no encapsulado. La presentacin clnica se diferencia de la sinusitis aguda en que los sntomas son menos intensos. Pueden predominar sntomas ms generales e infespecficos como fatiga, irritabilidad y malestar general sobre los sntomas locales. Puede requerir drenaje quirrgico pero el tratamiento antibitico es igualmente importante. Los mismos frmacos que en la sinusitis aguda, suelen ser efectivos en la sinusitis subaguda y crnica.
Infecciones respiratorias agudas bajas (IRAB)

BRONQUITIS AGUDA (BA)
Es un trastorno inflamatorio traqueobronquial que suele asociarse con una infeccin respiratoria generalizada. Se presenta sobre todo durante los meses invernales. Este cuadro es de etiologa viral en la gran mayora de los casos siendo los agentes implicados con mayor frecuencia Rinovirus, Coronavirus, Influenza, Adenovirus. Otras causas menos frecuentes no virales son Mycoplasma pneumoniae y C. pneumoniae. Patogenia No se ha investigado la patogenia de la BA para todos los agentes causales. Durante la infeccin, la mucosa traqueobronquial se encuentra hipermica y edematosa, las secreciones bronquiales son importantes. La destruccin del epitelio respiratorio puede ser extensa en algunas infecciones como por Influenza y ser mnima en otras, como los resfros por Rinovirus. Es probable que la gravedad de la enfermedad aumente por exposicin al humo del cigarrillo y contaminantes ambientales. Algunos estudios epidemiolgicos apoyan la idea de que las infecciones bronquiales agudas recidivantes desempearan un papel en el desarrollo de la enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC), al provocar junto con el cigarillo dao permanente. Manifestaciones clnicas Se presenta con tos inicialmente seca, luego productiva, con expectoracin inicialmente mucosa que con los das se hace mucopurulenta. Puede haber roncus. A la auscultacin pleuropulmonar puede haber estertores secos (roncus, gemidos o sibilancias), estertores subcrepitantes. No hay signos de consolidacin pleuropulmonar. Los adultos pueden presentar fiebre en la BA causada por Influenza, Adenovirus y M. pneumoniae, no es frecuente cuando se asocia a Coronavirus y Rinovirus. Tratamiento No existe tratamiento especfico, la mayora de los pacientes se recuperan sin incidentes. El tratamiento es sintomtico con antitermoanalgsicos, ambiente hmedo (si bien no existen pruebas de que esto abrevie el curso de la enfermedad, mejora los sntomas). La tos irritativa y paroxstica puede causar molestias considerables y dificultar el sueo. Aunque la supresin de la tos puede aumentar el perodo de estado y favorecer la sobreinfeccin bacteriana secundaria, el empleo prudente y supervisado de antitusgenos (como la codena) puede aliviar los sntomas. No deben utilizarse anihistamnicos porque desecan las secreciones y los expectorantes son ineficaces. Los antibiticos no abrevian la duracin de la enfermedad ni disminuyen la incidencia de las complicaciones bacterianas, por lo cual no deben usarse en el tratamiento inicial de la BA. El hecho de que a veces los pacientes con episodios reci-
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divantes mejoren con este tratamiento, sugiere que existe algo de participacin bacteriana secundaria en estos pacientes.
BRONQUIOLITIS
Es una enfermedad viral del tracto respiratorio inferior que aparece en los dos primeros aos de vida. Epidemiologa y etiologa La bronquiolitis muestra un patrn estacional definido con un aumento anual de casos en invierno hasta comienzos de la primavera, este patrn refleja la actividad de su agente principal, el VRS. Es una enfermedad frecuente durante el primer ao de vida con una tasa de ataque entre los 2 y 10 meses de vida. Es ms frecuente en varones con una relacin 1.5 a 1. Son factores de riesgo para esta enfermedad la edad, especialmente en los primeros meses de vida, madre adolecente, hacinamiento, el nmero de hermanos. Segn datos del Centro Hospitalario Pereira Rossell los ingresos hospitalarios por bronquiolitis representan el 34% en los meses de invierno, del 41% que representan en conjunto todas las IRAB. En 1999, con la finalidad de mejorar la calidad de la atencin hospitalaria de los nios con IRAB y la eficiencia del uso de los recursos asistenciales, se implement una estrategia que se denomin Plan de invierno. La misma se bas en la utilizacin de pautas de atencin, diagnstico y tratamiento. En esa oportunidad se estudiaron 226 nios con bronquiolitis obtenindose diagnstico etiolgico en el 71.6% de ellos, siendo el VRS el agente aislado con mayor frecuencia (81%) coincidiendo con los datos internacionales. El segundo agente identificado fue Influenza (6%). Fisiopatologa La patologa de la bronquiolitis se concentra en el epitelio respiratorio. El virus se replica inicialmente en el epitelio de tracto respiratorio superior, pero en el lactante pequeo suele extenderse con rapidez hasta la va area inferior. La inflamacin temprana progresa rpidamente a la necrosis y luego se desprende. Como la resistencia al flujo areo se relaciona inversamente con el cubo del radio, esta inflamacin y el edema hacen que las luces pequeas de los lactantes sean particularmente vulnerables a la obstruccin. Los tapones de material necrtico pueden obstruir total o parcialmente las pequeas vas areas. La constriccin del msculo liso no parece ser importante en la obstruccin, razn por la cual no parecen mejorar con beta2 agonistas. En zonas perifricas a los sitios de obstruccin parcial el aire queda atrapado por un mecanismo valvular. Este hecho determina hiperinsuflacin. En zonas con obstruccin total se producen zonas de atelectasias. Una respuesta inmune anormal puede contribuir en la patogenia de la bronquiolitis y a la hiperreactividad posterior de las vas areas como se observa en algunos nios, fundamentalmente en aquellos que requirieron internacin. Algunos autores sugirieron que la IgE, la histamina y una respuesta celular anormal, desempean ciertos papeles en el desarrollo de la enfermedad. Los lactantes con IRAB por VRS presentaban IgE contra VRS e histamina en las secreciones nasofarngeas con mayor frecuencia y en ttulos ms elevados que lactantes que tenan sibilancias por otras causas. La cantidad de IgE e histamina se correlacion con la severidad del cuadro clnico. Otros mediadores se encontraron vinculados en la patogenia como el leucotrieno C4. Estos estudios sugieren que las sibilancias en un lactante con una IRAB en especial por VRS, pueden ser el resultado de una supresin alterada de la respuesta inmune celular o pueden ser aumentadas por ella. Entonces puede seguir una produccin exagerada de IgE y otras respuestas celulares que evocan los mediadores de la inflamacin de la va area y el broncoespasmo. Estos hallazgos
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tambin ayudan a explicar la tasa elevada de hiperreactividad persistente de la va area y los episodios recidivantes de broncoespasmo en los nios que han tenido bronquiolitis. Manifestaciones clnicas Al inicio tos, rinitis serosa. Prodromo de uno a siete das, es comn la fiebre, habitualmente leve, el compromiso del tracto respiratorio inferior aparece en dos a tres das con polipnea, irritabilidad, somnolencia, tos sibilante, emetizante, cianosante, aleteo nasal, quejido inspiratorio (obstruccin). A la auscultacin, sibilancias y se observan tirajes. Algunas de las complicaciones pueden ser agudas, como apnea, sobretodo en recin nacidos, hipoxemia grave, paro hipxico. Dentro de las crnicas, un 75% de los pacientes que han requerido internacin presentarn episodios recidivantes de broncoespasmo.
NEUMONIA AGUDA
La neumonia es una enfermedad inflamatoria del parnquima pulmonar de etiologa infecciosa, puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parsitos. Es una enfermedad frecuente. La frecuencia relativa de cada agente etiolgico vara de acuerdo a muchos factores, tales como la edad del paciente, la existencia de enfermedades asociadas y el contexto en que se adquiere la infeccin (comunidad, hospital, residencia de ancianos), entre otros. As mismo estos factores influyen en la clnica, la radiografa, la seleccin del tratamiento, la evolucin, las complicaciones y el pronstico de la enfermedad. Se caracteriza por fiebre, sintomatologa respiratoria variable y la aparicin de infiltrados en la radiologa. Por lo tanto esta entidad es de diagnstico clnico, radiolgico y evolutivo. En las edades extremas de la vida su incidencia es mayor que en el resto de la poblacin y es en estos pacientes en quienes tiene consecuencias ms graves. Representa un problema relevante en salud pblica, tanto en sus aspectos sociales como econmicos: elevada morbimortalidad, altas tasas de hospitalizacin, estada hospitalaria prolongada, costos elevados. Ante la dificultad diagnstica para establecer una etiologa en la mayora de los casos, en las ltimas dcadas se han utilizado clasificaciones en base a las caractersticas clnicas y al tipo de poblacin afectada. Segn las pautas propuestas por la Asociacin Americana de Trax (ATS - 2000) se distinguen tres grupos. 1. Neumonia aguda comunitaria (NAC): en este grupo deben diferenciarse las poblaciones segn edad (nios y mayores de 65 aos), comorbilidad como insuficiencia cardaca congestiva (ICC), EPOC; y factores modificadores de la enfermedad, entendiendo por tales aquellas condiciones que incrementan el riesgo de infecciones por patgenos especficos (S. pneumoniae resistente a penicilina, bacilos gramnegativos, Pseudomonas). 2. Neumonia aguda intrahospitalaria: se considera aquella producida en pacientes ingresados luego de 72 hs o en pacientes que luego del egreso nosocomial inician los sntomas hasta el sptimo da del alta. 3. Neumonia en inmunodeprimidos: un subgrupo especial comprende los pacientes con SIDA, en tratamiento quimioterpico u otra inmunodepresin, en donde los agentes responsables del proceso son diferentes. Etiologa Nos centraremos brevemente en los microorganimos responsables de la NAC. La distribucin y frecuencia de los agentes son muy diversas, segn el lugar donde se realiza el estudio y la metodologa diagnstica empleada; pese a ello en la mayora de las series se mantiene a S. pneumoniae como la primera causa, seguido en frecuencia por H. influenzae, Mycoplasma
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Figura 2. Se observan las partculas aerolizadas en el estornudo
pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Moraxella catarrhalis y virus Influenza A. Ms del 90% de las NAC son producidas por estos agentes. Legionella no se haba encontrado en nuestro pas como agente de neumona hasta el ao 2002 en que se confirm el primer caso. Desde entonces se han diagnosticado casos con muy escasa frecuencia. Los virus respiratorios son los agentes etiolgicos ms importantes durante los primeros aos de vida. A M. pneumoniae le corresponde el papel etiolgico predominante en las neumonas de los nios en edad escolar y adolescentes. H. influenzae tipo b tambin ha sido responsable antiguamente de neumonas bacterianas en los nios, actualmente se identifican muy pocos casos gracias al empleo en el esquema nacional de vacunacin de la vacuna antes mencionada. Staphylococcus aureus representa entre el 2% y 5% de los casos, adquiere importancia en ancianos y como complicacin poco frecuente luego de una gripe. Un problema de gran actualidad es la emergencia de Staphylococcus aureus meticilino-resistente comunitario (CA-SAMR) portador de leucocidina de Panton-Valentin (PVL) que causa neumonas necrotizantes graves incluso en personas sanas sin enfermedades de base. Este problema que se observaba en otras partes del mundo desde haca ya algunos aos, se present de forma inesperada en nuestro pas, siendo un problema sanitario muy meditico por haber causado cierto nmero de muertes, por neumonas y tambin a partir de infecciones de piel y partes blandas, en personas jvenes previamente sanas. Los bacilos gramnegativos representan entre 5% y 10%, son agentes particularmente importantes en residentes en hogares de ancianos y alcoholistas. Patogenia En ausencia de enfermedad los mecanismos de defensa pulmonares normales mantienen estriles las vas areas infraglticas. En este punto debemos recordar que los pacientes fumadores y bronquticos crnicos suelen estar colonizados por flora orofarngea por debajo de la glotis. El desarrollo de una neumonia implica un defecto en las defensas del husped, la virulencia del agente patgeno o de un inculo microbiano importante. La va de llegada de los microorganismos al parnquima pulmonar es por va canalicular descendente por microaspiraciones o a travs de material aerozolizado, por ejemplo por un estornudo (virus respiratorios, Mycobacterium tuberculosis) (ver figura 2) Para que los microorganismos alcancen el parnquima pulmonar deben sortear una serie de barreras anatmicas y mecnicas, el sistema inmune humoral y celular y la actividad fagoctica. La mucosa nasal contiene epitelio cilndrico ciliado y clulas productoras de moco
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que forman una barrera de defensa. En la orofaringe, adems del aparato mucociliar que arrastra en forma mecnica los microorganismos y los elimina por medio de la deglucin; representan mecanismos de defensa el eflujo de saliva, el pH, la produccin local de complemento y la IgA secretoria. La adherencia de los grmenes a las superficies epiteliales de las vas areas superiores es un paso esencial en la colonizacin y posterior infeccin. Los microorganismos poseen mecanismos de adhesin, ya sean virus (como la hemaglutinina de influenza) o bacterias (pilis, adhesinas, exotoxinas, enzimas proteolticas que degradan IgA, etc). La tos y el reflejo epigltico contribuyen para que la mayor parte de las partculas grandes no alcancen las vas areas centrales. A nivel de trquea y vas areas de conduccin los microorganismos se encuentran con la segunda lnea de barrera mucociliar, donde quedan atrapados. Si superan estos sectores alcanzan las vas areas terminales y alvolos, donde no hay aparato mucociliar. Otros mecanismos defensivos son el lquido de revestimiento alveolar que contiene surfactante, fibronectina, IgG, complemento. Tambin existen cidos grasos libres, lisozima, protenas fijadoras de hierro que pueden ser altamente microbicidas. Las clulas fagocticas estn constituidas por los macrfagos alveolares. Cuando los grmenes superan estos mecanismos defensivos y la capacidad de los macrfagos para fagocitarlos, estos se convierten en mediadores de la respuesta inflamatoria y producen factores quimiotcticos (IL1, IL6, TNF, IL8, C5, LT4) para los neutrfilos en el sitio de infeccin. La presencia de IgG especfica estimula la activacin de la va clsica del complemento, fundamental en la respuesta antibacteriana. La inmunidad mediada por clulas representa un papel fundamental en las infecciones intracelulares (virus, Mycoplasmas, Chlamydias, Legionella, Mycobacterium). Algunos factores interfieren en estos mecanismos y hay que tenerlos en cuenta para entender la patogenia de esta infeccin. Por ejemplo: las alteraciones en el nivel de vigilia (intoxicacin alcohlica, convulsiones, frmacos depresores del sistema nervioso central, stroke, etc.) pueden comprometer el cierre epigltico y conducir a la aspiracin del contenido de la orofaringe. El humo del cigarrillo altera la funcin mucociliar y la actividad macrofgica. Las IRA altas virales, destruyen el epitelio respiratorio y alteran la quimiotaxis de los neutrfilos. El alcoholismo, adems del trastorno de vigilia, disminuye el reflejo tusgeno, predispone a la colonizacin por bacilos gramnegativos, disminuye la movilizacin de neutrfilos, disminuye la secrecin de IgA. Las manipulaciones sobre la va digestiva y respiratoria tambin alteran los mecanismos de defensa: intubacin orotraqueal, colocacin de sonda nasogstrica, fibroscopias. Otros factores que alteran los mecanismos de defensa locales son el edema alveolar en la ICC, hipoxemia, acidosis, desnutricin, uremia, la edad (por inmadurez del sistema inmune en los lactantes o por envejecimiento en los mayores de 65 aos), alteraciones en la produccin de inmunoglobulinas (leucemia mieloide crnica, mieloma mltiple, sndrome nefrtico, etc.), trastornos subyacentes del aparato respiratorio (EPOC, bronquiectasias, fibrosis qustica), compresiones extrnsecas (adenopatas, tumores broncopulmonares). En muchos casos no se logra identificar ninguno de los factores predisponentes mencionados, pero no olvidemos el rol fundamental de los factores de virulencia de los distintos microorganismos para agredir al husped, destacando en particular S. pneumoniae (ver captulo 17). Manifestaciones clnicas Como hemos mencionado, desde el punto de vista clnico se ha diferenciado clsicamente entre neumonia tpica o bacteriana habitual, y atpica. Pese a que en la actualidad se pone en duda la especificidad global de los signos y sntomas con respecto a la etiologa determinada, se considera til mantener los citados subgrupos con fines didcticos. La neumonia tpica, causada habitualmente por S. pneumoniae, H. influenzae, bacilos gramnegativos, S. aureus,
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Figura 3.
Figura 4.
se caracteriza por su comienzo brusco, aunque puede estar precedida de un cuadro catarral. Presenta chuchos de fro, fiebre alta (ausente en ancianos) y tos seca inicial, que luego se hace productiva con expectoracin mucopurulenta o herrumbrosa. Se puede acompaar de dolor tipo puntada de lado y aleteo nasal. Al examen fsico se presenta con aspecto txico, polipneico, febril, sudoroso y con signos de condensacin parenquimatosa (vibraciones disminudas, matidez, estertores crepitantes). En la radiologa de trax se observa un opacidad inhomognea con broncograma areo y afecta a uno o varios segmentos pulmonares, pudiendo ocupar todo un lbulo (ver figura 3). El trmino neumonia atpica se utiliz para designar aquellos cuadros que cursaban con signos clnicos diferentes a las neumonias causadas por bacterias y que no respondan al tratamiento antibitico. Inicialmente se pens que nicamente obedecan a una etiologa viral, pero luego se comprob que podan ser causadas por M. pneumoniae y Chlamydia pneumoniae. Suele iniciarse de modo insidioso con cefalea, astenia, escasa afectacin del estado general, tos seca persistente y muy molesta o con escasa expectoracin mucosa. Fiebre sin chuchos de fro, dolor torcico retroesternal que aumenta con la tos. Son frecuentes los sntomas extrarrespiratorios
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como nuseas, vmitos, exantema cutneo, artromialgias, rinorrea, disfona, odinofagia. La auscultacin pulmonar revela la presencia de crepitantes finos, aunque puede ser normal. En la radiografa se observa un patrn intersticial, con opacidad de tipo reticulonodular. Los lbulos inferiores son los que se afectan ms frecuentemente (ver figura 4). Una mencin especial merece la neumonia en ancianos, es tres a cinco veces ms frecuente y de mayor mortalidad (cercana al 30%), siendo la primer causa infecciosa de mortalidad en este grupo etario. Los agentes implicados con mayor frecuencia son S. pneumoniae, H. influenzae, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, virus Influnza A y B, y en los ltimos aos se ha reconocido al VRS como un agente de importancia creciente en este grupo etario. La presentacin clnica es ms solapada y la sintomatologa menos especfica. En ocasiones se presentan con una taquicardia inexplicable y trastornos en el nivel de vigilia sin fiebre. La radiologa puede presentarse con una opacidad ms tenue que dificulte el diagnstico. La curacin y la resolucin radiolgica son ms lentas, el pronstico depender del retardo en el inicio del tratamiento, de la etiologa y la presencia de comorbilidades. Diagnstico etiolgico El laboratorio de microbiologa juega un papel esencial en el diagnstico etiolgico de neumonia. La etiologa polimicrobiana es frecuente cuando las neumonias son de origen aspirativo, con predominancia de anaerobios o mixtas. Tambin es frecuente en las neumonias intrahospitalarias, especialmente en las asociadas a ventilacin mecnica. La capacidad del laboratorio de obtener un diagnstico microbiolgico depende de varios factores. a) Del tipo de muestra: las obtenidas por procedimientos invasivos (lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, lavado bronquial y aspirado endotraqueal) son mejores que la expectoracin, contaminada con flora bucal y no siempre representativa de la infeccin pulmonar. b) De la calidad de la muestra: que provenga realmente del tracto respiratorio inferior con escasa contaminacin con flora bucal, lo que es especialmente importante en la expectoracin. c) Del agente etiolgico: las neumonias causadas por bacterias aerbicas presentan mayor porcentaje de confirmacin que aquellas producidas por bacterias fastidiosas o que no se desarrollan en medios de cultivo convencionales y que requieren mtodos serolgicos para el diagnstico (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila). d) Del transporte rpido y oportuno al laboratorio: una muestra de expectoracin debe ser sembrada en los medios de cultivos adecuados idealmente antes de dos horas de obtenida, de lo contrario deben utilizarse medios de transporte adecuados. e) De la capacidad del laboratorio para reconocer una buena muestra y de establecer criterios de rechazo cuando la calidad no es aceptable. Es importante tener presente que entre 30% y 50% de las NAC persisten sin diagnstico etiolgico incluso cuando se efectan esfuerzos en utilizar medios de cultivo adecuados e implementacin de extensos protocolos serolgicos y de tcnicas de biologa molecular; procedimientos con los que no cuentan en general los laboratorios de diagnstico. Esto es especialmente importante en neumonias neumoccicas, en las que algunas series informan hasta un 45% de cultivos de expectoracin negativos. Muestras de origen respiratorio Son expectoracin espontnea o inducida, secrecin traqueal, lavado broncoalveolar (LBA),
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cepillado bronquial, lavado bronquial, aspirado endotraqueal, puncin transtraqueal, tejido pulmonar. La tincin de Gram contina siendo uno de los exmenes rpidos de mayor utilidad y bajo costo, ya que permite una aproximacin diagnstica para el inicio de la terapia adecuada, considerando que Streptococcus pneumoniae es el agente etiolgico ms frecuente en neumonias adquiridas en la comunidad, y que este agente presenta una morfologa caracterstica en la tincin de Gram. Se debe tener siempre presente que la muestra de expectoracin puede estar contaminada con flora bucal, por lo que el informe de la calidad de la muestra es esencial para una adecuada interpretacin. Segn los criterios de la calidad propuestos por Murray y Washington, quienes establecieron criterios de calidad segn la proporcin de clulas inflamatorias (leucocitos polimorfonuclares > 25 por campo de menor aumento) en relacin a las clulas epiteliales (contaminacin por saliva <10), el laboratorio debe rechazar las muestras de mala calidad, ya que los resultados del cultivo no aportan al diagnstico. Estudios posteriores han demostrado que en el caso de muestras de mala calidad, muy rara vez la solicitud de un nuevo especimen consigue superar la calidad del primero, por lo que no se justifica la solicitud de una segunda muestra. Es necesario considerar tambin que la predominancia marcada de un tipo morfolgico especial de bacterias, permite una mejor aproximacin diagnstica: abundante cantidad de diplococos grampositivos sugiere fuertemente la presencia de S. pneumoniae, la predominancia de cocobacilos gramnegativos sugiere Haemophilus influenzae, la presencia de diplococos gramnegativos sugiere Moraxella catarrhalis. El cultivo aerobio en agar sangre con atmsfera de CO2, permite la recuperacin de bacterias aerobias como S. pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis, S. aureus, K. pneumoniae y P . aeruginosa. Si la tincin de Gram no muestra predominancia de un tipo bacteriano, pero se observa abundante cantidad de clulas inflamatorias, debe sospecharse la presencia de bacterias fastidiosas o de agentes virales. Algunos laboratorios de microbiologa tienen diseados protocolos de cultivo expandidos cuando esta situacin ocurre, incluyendo cultivos virales. A partir de las especies bacterianas identificadas en el cultivo se realizan estudios de susceptibilidad a los antimicrobianos en uso. (Ver captulo 35) El cultivo para Mycoplasma pneumoniae requiere la inoculacin de la muestra en un agar y caldo especial (SP-4) suplementado con anfotericina y colistina y una incubacin al menos de 7 a 15 das. La observacin de las colonias sospechosas debe realizarse por inmunofluorescencia u otras tcnicas de tinciones especficas con anticuerpos marcados. Los cultivos en lneas celulares para bacterias nutricionalmente exigentes, si bien se consideran los mtodos de referencia para bacterias deficitarias tales como Chlamydia pneumoniae (bacteria gramnegativa intracelular obligada), la recuperacin de esta bacteria en cultivos celulares es extremadamente baja y son altamente laboriosas, por lo que no estn disponibles en los laboratorios de microbiologa clnica. Las bacterias anaerbicas pueden ser causa de hasta un 10% de las neumonias adquiridas en la comunidad, sin embargo la obtencin de la muestra dificulta la confirmacin etiolgica. El cultivo para anaerobios se reserva para cuando la sospecha de neumonia por aspiracin es alta y existen los medios para realizar una puncin transtraqueal o una puncin pulmonar, ya que estas son las muestras aceptables para el cultivo anaerbico. La broncoscopia con cepillo protegido ha mostrado ser til para el estudio de anaerobios, sin embargo requiere un transporte rpido al laboratorio. Hemocultivos Se deben solicitar cada vez que exista sospecha de neumonia adquirida en la comunidad, ya que S. pneumoniae es el principal agente etiolgico y entre un 15% y 25% de las neumonias
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neumoccicas cursan con bacteremia. Adems tiene implicancias en el pronstico, dado que las neumonias con bacteremia tienen mayor mortalidad, especialmente en pacientes ancianos. Los mtodos de deteccin de anticuerpos y de antgenos, as como la amplificacin gentica, no se consideran mtodos de referencia y, en el caso de los que emplean la biologa molecular, son de alto costo. Por esta razn deben reservarse para el diagnstico de los siguientes agentes: Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae y virus respiratorios. Para Legionella pneumophila se realiza la deteccin de antgeno urinario por enzimoinmunoanlisis (EIA). Tiene una especificidad cercana al 100% y una sensibilidad del 80% cuando se obtiene precozmente (dentro de la primera semana de la enfermedad), despus disminuye progresivamente. Se ha descrito tambin un test de ltex para deteccin de antgeno directamente en muestras respiratorias, pero la deteccin de antgeno urinario por EIA es ms sensible. La deteccin de anticuerpos en suero se utiliza para detectar IgG mediante inmunofluorescencia indirecta. Para Chlamydia pneumoniae se detectan anticuerpos en suero. Los mtodos ms utilizados son la microinmunofluorescencia (MIF), que se considera el mtodo serolgico de referencia y el enzimoinmunoanlisis. Sin embargo, tanto la deteccin de anticuerpos IgG como IgM presentan el inconveniente de que se elevan tardamente en el curso de la enfermedad (tres semanas para IgM y seis a ocho semanas para IgG), por lo que la sensibilidad no es alta. Se debe considerar tambin que los ttulos persisten elevados durante largo tiempo (6 a 12 meses para IgM), lo que sumado a que un 60% de la poblacin adulta posee ttulos detectables de IgG sin estar cursando una infeccin activa, deja a la serologa como una herramienta de utilidad epidemiolgica ms que clnica, si bien es el mtodo ms frecuentemente implementado en los laboratorios de microbiologa clnica. En general, se consideran positivos ttulos de IgG > o = 1:20 y ttulos de IgM > o = 1:64. Las tcnicas de biologa molecular actualmente son los mtodos ms promisorios para el diagnstico de neumonia por C. pneumoniae. La principal dificultad para evaluar la eficacia de la amplificacin gentica por PCR es la ausencia de un mtodo de referencia contra el cual validar esta tcnica. Adems, no existe disponibilidad de sistemas comerciales que permitan una mejor reproducibilidad. Los estudios muestran que PCR detecta entre un 10% y 20% ms de casos que el cultivo y un 20% menos que la serologa, sin embargo si se consideran los resultados del PCR y el cultivo en conjunto, se detectan menos casos que con serologa sola. Para Mycoplasma pneumoniae se detectan las aglutininas fras. Los ttulos mayores de 1: 64 han sido asociados con infeccin por M. pneumoniae. Sin embargo, no son especficas ni sensibles: solo un 50% de los pacientes con neumonia por esta bacteria presentan este test positivo. Se han descrito falsos positivos para enfermedades linfoproliferativas, mononucleosis infecciosa, Influenza, sfilis, infeccin por Adenovirus y por L. pneumophila. La deteccin de anticuerpos en suero se considera el principal mtodo de diagnstico utilizado por los laboratorios clnicos. Actualmente el enzimoinmunoanlisis es el mtodo de eleccin y est disponible como test rpido (ensayos tipo tarjeta). La sensibilidad para la deteccin de IgM es de 80% despus de la primera semana de la infeccin, sin embargo la IgM puede persistir elevada hasta cuatro aos. Con respecto a las tcnicas de biologa molecular, la PCR parece ser un mtodo promisorio para el diagnstico de neumonia por Mycoplasma, especialmente en nios, a partir de una muestra nasofarngea. Tendra la ventaja sobre la serologa de que es ms precoz, pero no ha mostrado mejor sensibilidad que la serologa, si bien es un mtodo altamente especfico. Para el diagnstico de la neumonia viral remitimos al lector al captulo de infecciones respiratorias.
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Tratamiento El tratamiento de las neumonias bacterianas debe ser precoz y orientado a la etiologa probable, pero dado que esto rara vez se conoce con certeza, es habitual iniciarlo en forma emprica segn la frecuencia de los agentes mencionados, y en base a la epidemiologa de la resistencia antibitica local. Los antibiticos ms usados son los betalactmicos, son antibiticos bactericidas. Penicilina G: es activa contra la mayor parte de cepas de S. pneumoniae de nuestro medio, por lo que exceptuando las infecciones del sistema nervioso central, la gran mayora de las enfermedades neumoccicas pueden ser tratadas con penicilina. Cuando S. pneumoniae es de sensibilidad intermedia (CIM entre 0,1 y 2 mg/l) la dosis de penicilina debe ser mayor (150.000 a 250.000 UI/Kg/da) o administrarse cefotaxime o ceftriaxona. Como S. pneumoniae es la causa ms frecuente de la NAC tpica, la penicilina sigue siendo el antibitico de eleccin en ellas. Los factores de riesgo que hacen sospechar sensibilidad disminuida de S. pneumoniae son: edad mayor de 65 aos, inmunodepresin, haber recibido betalactmicos en los tres ltimos meses, vivir en casa de salud, mal medio socioeconmico, abuso de alcohol. Aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina): son igualmente activas contra S. pneumoniae sensible y de sensibilidad intermedia. Para la administracin oral se prefiere amoxicilina que se absorbe mejor. Muchas cepas de Staphylococcus spp., H. influenzae, K. pneumoniae, E. coli, M. catarrhalis (productoras de betalactamasa) actualmente son resistentes a aminopenicilinas, por lo que no se recomienda su uso emprico cuando se sospecha que la infeccin est causada por esos grmenes. La asociacin con un inhibidor de la betalactamasa (cido clavulnico o sulbactam) recupera la actividad de las aminopenicilinas frente a la mayora de las cepas citadas. Las cefalosporinas de tercera generacin son las cefalosporinas con mayor actividad contra bacilos gramnegativos. Ceftriaxona y cefotaxime son las ms activas contra cocos grampositivos, con excepcin de Enterococcus spp. y Listeria monocytogenes. Ceftazidime tiene actividad antipseudomona pero es poco activa contra S. aureus y otros cocos. Los macrlidos (eritromicina, claritromicina, azitromicina), estn indicados cuando hay sospecha de NAC por grmenes atpicos. Por no alcanzar concentraciones sricas suficientes, los macrlidos no deben usarse si hay sospecha de bacteriemia, ni tampoco en pacientes con enfermedad moderadamente severa o grave.
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Gastroenteritis
M. Amorn, F. Schelotto, M. Gadea
Definicin y ubicacin del tema

Nos referiremos en este captulo a las bacterias y virus que son causa de diarrea. Como concepto, la diarrea implica un aumento de la frecuencia y una disminucin en la consistencia de las deposiciones. En nios menores de 2 aos, la OMS define la diarrea como la produccin de 3 o ms deposiciones lquidas o semilquidas en 12 horas, o de al menos una con sangre, mucus o pus. Tiene habitualmente un origen infeccioso, bacteriano, viral o parasitario. Este hecho no es a menudo reconocido por la poblacin, las madres o aun los mdicos: se adjudica el origen de la diarrea al calor, a intolerancia para algn alimento, a txicos qumicos en brotes de toxiinfeccin alimentaria, etc. Involucra muchas veces alteraciones funcionales o inflamatorias a nivel intestinal, con frecuente repercusin gstrica, configurando una gastroenteritis. Estas afecciones tienen habitualmente un origen exgeno, con excepcin de algunas formas de diarrea postantibioticoterapia. Incluso aquellas formas de diarrea causadas por E. coli son debidas a cepas de esa especie que no forman parte de la flora normal. Los patgenos que ingresan al tracto digestivo encuentran un conjunto de obstculos para la colonizacin intestinal que incluyen la acidez gstrica, la motilidad peristltica, la flora normal y su efecto de interferencia, la integridad estructural y funcional de la mucosa, la actividad de IgA secretoria luminal, los fagocitos parietales, etc. La posibilidad de sortear estas defensas y provocar enfermedad depende de los atributos patognicos microbianos o de condiciones orgnicas del husped que lo colocan en situacin de desventaja. La diarrea infecciosa es una enfermedad de curso agudo, o persistente si dura 14 das o ms. En trminos generales es una entidad frecuente y habitualmente benigna: la letalidad es baja y se presenta sobre todo en pacientes debilitados (nios, desnutridos, inmunodeprimidos), pero la mortalidad tiene significacin debido a la elevada morbilidad. Epidemiolgicamente, tienen especial inters la diarrea en el nio y el lactante, por su potencial gravedad, y las llamadas toxiinfecciones alimentarias, que pueden dar lugar a brotes extensos. En la actualidad, es importante prestar atencin a las diarreas en los pacientes VIH +, en los tratados intensamente con antibiticos, y mantener vigilancia sobre el clera. Los microorganismos causales en las distintas situaciones son muchas veces los mismos, por lo cual los trataremos ms adelante en conjunto. Presentamos, s, los agentes etiolgicos ms frecuentes en cada proceso (cuadro 1), y una mencin, a propsito de cada germen, de cual es su importancia relativa en cada situacin. La diarrea infantil es una enfermedad endmica, espordica o epidmica, donde la trans-
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misin de los grmenes es fecal-oral por contacto interhumano, fomites, o a travs del agua y alimentos. Las toxiinfecciones alimentarias (ej.: salmonelosis a partir de mayonesa) son brotes que ocurren cuando dos o ms personas que compartieron un alimento desarrollan, en un plazo que es habitualmente menor de 72 horas, enfermedad gastrointestinal o neurolgica por presencia en el alimento de microorganismos o sus toxinas. En pacientes VIH + y en los tratados con antibiticos, los grmenes responsables pueden tener el mismo origen que en las situaciones antevistas, o pueden ser de transmisin sexual o de fuente endgena.
Cuadro 1. Agentes etiolgicos bacterianos y virales ms frecuentes en cada proceso

Enfermedad diarreica infantil Escherichia coli EPEC EIEC ETEC STEC o VTEC Rotavirus A Campylobacter C. jejuni Shigella S. flexneri S. sonnei Otras Salmonella S. typhimurium S. enteritidis Toxiinfeccin alimentaria Salmonella S. enteritidis Otras Staphylococcus aureus Otros E. coli C. perfringens Campylobacter Shigella Enterobacter sakazakii Diarrea en pacientes con VIH(+) 1. Agentes habituales de diarrea: en nios, igual que en HIV(-); en adultos Shigella, Salmonella Campylobacter 2. CMV y Mycobacterium avium-intracellulare 3. Patgenos de transmisin sexual Diarrea post-antibioticoterapia Clostridium difficile
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Figura 1. Mortalidad infantil por diarrea
Diarrea infantil. Importancia

Las enfermedades diarreicas constituyen en el mundo subdesarrollado, y en concreto en la mayora de los pases de Amrica del Sur y Central, la causa ms frecuente de enfermedad infantil despus de las infecciones respiratorias. Se calcula que se producen mundialmente cerca de 1000 millones de casos por ao, y se estima que cerca de 5 millones de nios mueren anualmente, la mayora antes de los 2 aos de edad. En nuestro pas, en el marco del Programa de Control de Enfermedades Diarreicas apoyado por OPS, los programas locales de educacin, prevencin y rehidratacin oral contribuyeron en los aos 80 a reducir la morbilidad y la mortalidad por esta causa, que era de 3,6 por 1000 nacidos vivos en 1975. Un descenso adicional se produjo tras la campaa de prevencin del clera (1991-92), si bien los efectos de la misma se han atenuado actualmente. En la figura 1 se observa la evolucin descendente de la tasa nacional de mortalidad infantil por diarrea (muertes en menores de 1 ao por 1000 nacidos vivos). Casi todos los decesos se producen en el perodo postneonatal (28 das-1 ao), y la tasa es actualmente menor de 0,5 y prxima a 0,25. Las tasas globales ocultan sin embargo importantes desigualdades y problemas. La morbilidad y la mortalidad son mayores en los sectores de poblacin ms desprotegidos (bajo nivel socioeconmico y cultural, zonas urbanas marginales y algunas de frontera). La incidencia de diarrea en menores de un ao es promedialmente menor que un episodio por nio por ao, en el conjunto del pas, pero mostr ser cercano a cinco en un estudio realizado con nuestra participacin en un barrio perifrico de Montevideo. El riesgo de enfermedad depende de factores ambientales (es especialmente elevado en grupos poblacionales pobres, sin provisin segura de agua potable, sin saneamiento, y con escasa informacin y educacin para la salud referida a higiene personal y alimentaria, regulacin familiar y promocin de la lactancia materna) y de factores individuales dependientes de aquellos: la inmadurez e inexperiencia inmunolgica del lactante, la falla frecuente de aporte de leche materna que constituye el alimento ms completo durante los seis primeros meses de vida, y la desnutricin que se acenta con la enfermedad creando un crculo vicioso. Los factores desencadenantes estn representados por los diferentes microorganismos y parsitos que describiremos. Es una afeccin estacional. El 63% de los casos denunciados al MSP en los ltimos aos corresponde al perodo diciembre-marzo. Las internaciones son todava frecuentes ms tarde en el ao. La mortalidad se asocia actualmente a los casos que evolucionan sin cuidados de rehidratacin y realimentacin, a las diarreas invasivas con repercusin sistmica o localizaciones extrain-
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testinales, y a los procesos persistentes que ocurren en especial en lactantes procedentes de medio socioeconmico muy carenciado, con dficit nutricional previo y severa repercusin vinculada a la enfermedad.
TIPOS. ETIOLOGA
La enfermedad diarreica aguda se considera de tipo coleriforme (parecida al clera) cuando cursa con heces lquidas, en general abundantes, sin sangre, mucus o pus. No se acompaa en general de fiebre, y los agentes causales que se localizan en el intestino delgado no provocan accin patgena ni reaccin inflamatoria morfolgicamente ostensible. No se observan leucocitos en las materias fecales. Los agentes causales en el nio son habitualmente E. coli enteropatgeno o enterotoxignico, Rotavirus, Cryptosporidium u otros microorganismos. Hablamos de diarrea de tipo invasivo o disenteriforme cuando se presenta con materias lquidas o semilquidas acompaadas de la emisin de sangre, mucus o pus, y presencia de leucocitos en la observacin microscpica, en especial cuando es causada por Shigella. Se puede asociar con fiebre, alteraciones morfolgicas e inflamatorias a nivel del colon, y extensin extraentrica de entidad y frecuencia variables. Los microorganismos responsables son Shigella, Campylobacter, Salmonella, E. coli enteroinvasor, Yersinia enterocolitica o parsitos de diverso tipo. La persistencia de la diarrea no parece vincularse con grupos especiales de agentes patgenos, ni con situaciones de multiparasitismo, sino con factores defensivos, constitucionales o ambientales de otro tipo. La diarrea intrahospitalaria no est asociada en especial a patgenos invasivos o especialmente agresivos, sino a condiciones de manejo de los pacientes que favorecen la infeccin cruzada y la persistencia de los grmenes en el mbito nosocomial. Puede ser causada por bacterias de distinto tipo, virus o parsitos. Cuando son bacterias las responsables, pueden sin embargo poseer particular resistencia a los antibiticos seleccionada por su exposicin reiterada a los mismos. En las diarreas infantiles agudas o persistentes, de modo similar que en pases desarrollados, predomina actualmente Rotavirus. El agente patgeno bacteriano ms frecuentemente identificado es E. coli patgeno entrico, en especial de los grupos enteropatgenos O111, O119 y O55, que predominaron localmente en los ltimos 30 aos. En diarreas con sangre, Shigella es el patgeno ms frecuentemente aislado. En los pases pobres, an cercanos, los patgenos bacterianos o parasitarios son predominantes.
Toxiinfeccin alimentaria
Ya hemos definido el concepto. Se presenta habitualmente como brotes de gastroenteritis de origen comn, donde el alimento y sus caractersticas operan como factor determinante sobre la relacin husped-germen. No es siempre sencillo deslindar esta forma epidemiolgica de las gastroenteritis llamadas espordicas, o de los brotes producidos por transmisin fecaloral, de persona a persona, en especial porque algunos de los patgenos involucrados pueden difundir de uno u otro modo. El concepto de toxiinfeccin alimentaria es ms restringido que el de enfermedad infecciosa de origen alimentario, que puede incluir patologas tan diversas como la tuberculosis de origen bovino, la listeriosis, la brucelosis, la fiebre Q, estreptococias, encefalitis espongiforme bovina y enfermedad de Creuzfeld-Jacob humana. Otras veces el mismo germen de origen alimentario puede provocar (ej.: Enterobacter sakazakii) enfermedad digestiva o en localizaciones extraintestinales: meningitis, sepsis. Las toxiinfecciones alimentarias son as llamadas porque pueden presentarse como procesos infecciosos intestinales donde intervienen toxinas de sntesis y accin local (enterotoxinas de E. coli o de C. perfringens).
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Alternativamente pueden presentarse como infecciones (virales, por ej.) sin intervencin de toxinas, o como verdaderas intoxicaciones, donde las toxinas estn preformadas en el alimento (S. aureus). No consideraremos expresamente en este captulo los procesos provocados por la ingestin de toxinas de protozoarios dinoflagelados concentradas en moluscos (marea roja); tampoco nos referiremos a la enfermedad provocada por micotoxinas o por giardias u otros parsitos. El alimento que da origen a la toxiinfeccin puede ser simple vector que provee proteccin o permite la supervivencia de los patgenos que contiene (puede ser el caso de Campylobacter, Shigella, virus, Vibrio), o puede operar tambin como sustrato de multiplicacin de los mismos, como sucede con los agentes etiolgicos ms frecuentes: Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Clostridium botulinum. La toxiinfeccin alimentaria es la causa ms frecuente de enfermedad transmitida por alimentos, contra la opinin habitual, no informada, que jerarquiza la incidencia de los txicos qumicos. Es habitualmente benigna y autolimitada. Sin embargo, su estudio es importante por varias razones: a) la alta morbilidad, desconocida con precisin en nuestro pas, aunque algunos brotes recientes la han confirmado; b) la letalidad elevada del botulismo, y la gravedad de las gastroenteritis en los nios pequeos (los brotes suelen afectar a personas de diversa edad y condicin previa de salud); c) la luz que arroja sobre la higiene en la produccin y manejo de los alimentos, con las implicancias econmicas que esto tiene en un pas donde ellos representan buena parte de las exportaciones. El principal factor de riesgo de toxiinfeccin consiste, en nuestro medio, en el calentamiento inadecuado o insuficiente del alimento (coccin o tratamiento trmico previo tipo pasteurizacin, por ej.). Si este factor de riesgo se tiene en cuenta y se elimina, la mayor parte de los brotes se previenen. En nuestro pas, las toxiinfecciones alimentarias ms frecuentes son: a) las salmonelosis, con perodo de incubacin habitualmente mayor de 10 horas, por consumo de mayonesa no pasterizada y no acidificada, o de derivados crnicos mal cocidos; y b) las toxiinfecciones estafiloccicas, con vmitos y gran malestar que aparecen en menos de 6 horas, por consumo de derivados lcteos no pasterizados, en los cuales el germen ha proliferado y producido su toxina termoestable. Ambos tipos de proceso son prevenibles con temperatura adecuada de preparacin de los alimentos, y lo son tambin la mayora de los otros procesos posibles, incluyendo el botulismo, pues aunque C. botulinum es una bacteria esporulada y resistente, la toxina botulnica es proteica y termolbil. La actual promocin del consumo de alimentos naturales no tratados, no desinfectados, no cocidos, y de alimentos precocidos localmente o importados sin controles rigurosos, colide con la prevencin planteada, inclusive en el marco de la difusin latinoamericana del clera. Otras fuentes de riesgo importantes son la temperatura inadecuada de mantenimiento de los alimentos (la refrigeracin detiene la proliferacin microbiana), el origen inseguro de los mismos (animales infectados, por ej.), la falta de higiene de manipuladores y equipos, entre otros. El cuadro 2 esquematiza los tipos de toxiinfeccin alimentaria que es posible diferenciar en funcin del tiempo de incubacin, presencia o no de fiebre, vmitos y clicos, tipo de diarrea, sntomas neurolgicos y otros.
Diarrea en el paciente VIH +

En este grupo de personas la diarrea forma parte de un conjunto de afecciones digestivas, que se presentan con frecuencia a nivel esofgico, gstrico, hepatobiliar e intestinal. Son comunes las diarreas abundantes con dolor abdominal y prdida de peso. Se asocian en general con alteraciones observables de la mucosa intestinal, que en la mayora de los casos estn
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Cuadro 2. Tipos de toxiinfeccin alimentaria

Grmenes Tiempo de incubacin 10-72 h Vmitos Clicos Diarrea Fiebre Sntomas neurolgicos (-)
Salmonella, Shigella, Campylobacter, EIEC, Y. enterocolitica, V. parahemolyticus V. cholerae, ETEC
Disenteriforme
6-72 h
(+)
Lquida V.C. ++
(-)
S. aureus, B. cereus C. perfringens B. cereus VTEC o STEC C. botulinum
<6h 6-16 h 72-120 h 6-36 h
++ (-) +
+ + + -
+ + c/sangre (+ -)
(-) -
(-) (+ -) ++
relacionadas con patgenos reconocidos, aunque a veces se interpretan como vinculadas a la misma infeccin por el VIH. Los grmenes involucrados son de tres tipos: a) agentes habituales de diarrea como Rotavirus y E. Coli enteropatgena (en nios); Salmonella, Shigella y Campylobacter entre las bacterias, o parsitos como Cryptosporidium, Giardia Lamblia y otros; b) Citomegalovirus y Mycobacterium avium-intracellulare, presentes en lesiones identificables por biopsia a nivel del delgado o del colon; c) patgenos colorrectales transferibles por va sexual: Neisseria gonorrhoeae, Herpes Simplex, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, agentes de lesiones ulceradas en el intestino distal. En el paciente VIH + estas infecciones dan lugar a procesos severos, persistentes o recurrentes, y con frecuencia invasivos, originando bacteriemias y localizaciones secundarias de Salmonella, Campylobacter, Neisseria y otros. No contamos en el pas con estudios sistemticos, etiolgicos y epidemiolgicos, sobre diarrea en pacientes VIH +, como se han realizado sobre la poblacin peditrica.
Diarrea en el paciente tratado con antibiticos

El tratamiento con antibiticos no est indicado como rutina en el paciente con diarrea, donde lo fundamental es la reposicin hidroelectroltica y la realimentacin. Contribuye s a la recuperacin en el enfermo de clera, en diarreas invasivas como las producidas por Shigella y a veces por Campylobacter, y en situaciones donde la evolucin clnica hace temer una infeccin sistmica (ej.: salmonelosis en el lactante o en el paciente VIH +). Se ha culpado incluso a la antibioticoterapia por la prolongacin de la excrecin fecal de Salmonella tras la infeccin clnica, o por la complicacin con sndrome hemoltico urmico de la infeccin intestinal por E. coli verotxico. En estos casos, la eliminacin de la flora normal parece ser la causa del efecto indeseable de los frmacos. El tratamiento antibitico instituido por otras causas (infeccin respiratoria, urogenital, postquirrgica, etc.) puede dar lugar a alteracin de la flora intestinal e instalacin de una enterocolitis seudomembranosa que puede resultar una complicacin fatal. Clindamicina, ampicilina, cefalosporinas y varios otros antibiticos pueden originar esta enfermedad, independientemente de la dosis, va o duracin del tratamiento. En dcadas pasadas se atribua a
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S. aureus la responsabilidad por esta afeccin, pero estudios realizados durante la dcada del 70 culminaron en la demostracin de que el agente causal es habitualmente Clostridium difficile, y que el tratamiento con vancomicina o metronidazol puede contribuir a controlarla.
Agentes de gastroenteritis
Entre los agentes que se han identificado como causa de diarrea, encontramos bacterias, virus y parsitos. Nosotros pondremos nfasis en los primeros, aunque no podemos olvidar que existe un porcentaje no despreciable de casos que son debidos a parsitos de organizacin ms compleja. Entre los agentes bacterianos ms frecuentemente aislados como causa de gastroenteritis podemos distinguir dos grandes grupos: los bacilos gramnegativos y las bacterias grampositivas, dentro de las cuales encontramos formas cocoides, como el gnero Staphylococcus y formas bacilares, como el gnero Clostridium. Dentro del primer grupo hallamos los gneros y especies que causan ms frecuentemente enteritis, como E. coli enteropatgena (EPEC), Campylobacter spp., el gnero Shigella, Salmonella, E. coli enterotoxignica (ETEC), etc. Otras aisladas menos frecuentemente son: E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterohemorrgica, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Aeromonas spp., etc. En el segundo grupo destacamos a Staphylococcus aureus por un lado, y por otro a Clostridium perfringens y Clostridium botulinum, grmenes anaerobios que en situaciones particulares ocasionan cuadros de toxiinfeccin alimentaria.
Cuadro 3.
Familia Enterobacteriaceae Gnero Salmonella Shigella Escherichia Yersinia Vibrionaceae Vibrio Aeromonas Plesiomonas Campylobacteriaceae Campylobacter
Cuadro 4.
Enterobacteriaceae Bacilos Facultativos Fermentan la glucosa Oxidasa negativos Mviles peritricos o inmviles Vibrio Forma de coma Facultativos Fermentan la glucosa Oxidasa positivos Mviles por flagelo polar Campylobacter Forma de alas de gaviota o espirilos Microaerfilos y capnfilos No fermentadores Oxidasa positivos Mviles por flagelo polar
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SHIGELLA
Las caractersticas de estas bacterias y su patogenia ya han sido descritas (ver captulo 4). Su reservorio es el ser humano. Se localizan fundamentalmente a nivel del colon, y provocan diarrea disenteriforme, con presencia caracterstica de abundantes leucocitos en el frotis de materias fecales. Son los principales agentes de diarrea con sangre (20% a 25% de los casos en nios), y sus infecciones mejoran con el tratamiento antibitico. La especie prevalente, S. flexneri, es actualmente resistente a ampicilina y cotrimoxazol, por lo cual el tratamiento de las shigelosis se hace con otros antimicrobianos como la ceftriaxona en nios o las quinolonas en adultos.
ESCHERICHIA COLI
El trmino EPEC fue usado por primera vez por Neter y col. en 1955. Es la primera clase descrita de E. coli causante de diarrea, y la ms frecuente en nuestro pas, en especial en lactantes. Se han descrito brotes en servicios de recin nacidos. Pertenecen a 10 a 15 serogrupos caractersticos, de los cuales los ms comunes localmente son O111, O119 y O55. Fue menospreciado como agente de diarrea cuando se descubrieron las cepas enterotoxignicas, pero nuevos estudios confirmaron que se trata de una clase patognica definida y diferente que interacta con las clulas eucariotas del epitelio intestinal por medio de puentes proteicos con estructura similar a jeringas de inyeccin, que forman parte del sistema de secrecin bacteriano tipo III. Se ha confirmado en varias cepas locales, de los serogrupos prevalentes, la presencia del plasmidio de virulencia EAF caracterstico, de 60 Mda, el patrn tpico de adherencia localizada sobre clulas Hep-2 de cultivo, y la presencia (por PCR) de los genes de virulencia bfp (pili) y eae (intimina). Cuando un lactante est cursando una diarrea asociada a esta clase de E. coli, casi todas las colonias identificables en materias fecales pertenecen a la cepa involucrada: se anula la diversidad habitual de serotipos. Algo diferente ocurre con ETEC, y sobre todo con VTEC, que son eliminados en combinacin con cepas de la flora normal, en proporcin variable segn el momento evolutivo del proceso. Buena parte de los cultivos de EPEC aislados en el Hospital Peditrico presentan resistencia a mltiples antimicrobianos. ETEC. Son agentes muy comunes de diarrea en lactantes de pases pobres, y de diarrea del viajero, as llamada porque afecta a habitantes de pases desarrollados que se trasladan a zonas carenciadas. Tienen especial significacin patognica las cepas productoras de LT y ST, o de ST solo. Las bacterias que forman nicamente LT se recuperan con frecuencia similar en lactantes sanos y enfermos. En nuestro pas, ETEC se asla con menor frecuencia que EPEC, pero mayor que otras clases de E. coli patgeno entrico. Sus determinantes patognicos (fimbrias y toxinas) estn codificadas en plsmidos transferibles por lo que se encuentran en diversos serogrupos y serotipos de E. coli. EIEC. En nuestro medio hemos aislado pocos cultivos de EIEC de serogrupo O29 y O124. VTEC. Algunos serogrupos de E. coli como 026, 0111, O157, O145 y otros, tienen en comn con Shigella dysenteriae tipo I la produccin de sustancias proteicas de accin local y sistmica. Son llamados STEC, VTEC o EHEC. La infeccin por STEC puede ser asintomtica, o puede traducirse en diarrea lquida, diarrea con sangre por colitis hemorrgica, sndrome hemoltico urmico (SUH) o prpura trombtico trombopnico. Los grmenes ingresan al organismo por va digestiva, y colonizan el intestino grueso. La dosis infectante es pequea (<1000) como la de Shigella, y la transmisin puede ser interhumana por va fecal-oral, o tener como vehculo el agua o alimentos: carne bovina
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mal cocida u otras, leche, jugos, etc. El perodo de incubacin puede ser hasta de siete das. La colitis hemorrgica producida por VTEC (que precede muchas veces al SUH) se acompaa de escaso componente inflamatorio y habitualmente no presenta fiebre o emisin de leucocitos fecales como otras diarreas invasivas. No estn claros los factores que facilitan su eventual progresin a SUH. Se han mencionado el genotipo microbiano, el uso de antiperistlticos y la densidad y tipo de receptores fosfolipdicos Gb3 que abundan en las clulas endoteliales del intestino, en el tejido renal y en el encfalo. El tratamiento antibitico ha sido presentado reiteradamente como causa predisponente, y es discutida su efectividad para controlar la infeccin, por lo cual debe evaluarse cuidadosamente su aplicacin. El sndrome hemoltico urmico es una afeccin presente en todo el mundo que se define por la trada: insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. Es endmico en el Ro de la Plata, en especial en Argentina, donde se producen en promedio 10 casos anuales por cada 100.000 nios menores de 5 aos. En nuestro pas la cifra se aproxima a 4 (10-14 casos anuales). Ocurre en especial en nios menores de cinco aos, en quienes constituye la principal causa de falla renal aguda. El promedio de edad constatado en Uruguay es de 11 meses aproximadamente. Los casos se presentan en general desde la primavera hasta el otoo. La infeccin por VTEC es una zoonosis, aunque existe transmisin importante interhumana. En Uruguay no hemos constatado, como en otros pases, epidemias de origen alimentario. El SUH se manifiesta en especial en nios del interior del pas, aunque no de zona rural, y no particularmente carenciados o desnutridos. Como antecedente patolgico inmediato presentan en general diarrea, habitualmente con sangre. El comienzo de la enfermedad es usualmente brusco, con instalacin sbita de inquietud, palidez intensa y oliguria, en general sin fiebre. Se observan con frecuencia petequias, pero raramente sangrado franco extradigestivo. Puede haber hipertensin, alteraciones hepticas o cardacas, y manifestaciones neurolgicas (somnolencia, irritabilidad, ataxia, convulsiones, coma), que son graves en 1/5 a 1/3 de los casos, y se interpretan como secundarias a las alteraciones hidroelectrolticas, la hipertensin y la microangiopata enceflica. La mitad de los pacientes necesitan dilisis. La letalidad resultante es menor de 5%, pero se pueden presentar secuelas significativas. Al menos 2 de cada 100 pacientes progresan a la insuficiencia renal extrema, que requiere dilisis crnica.
SALMONELLA
En el lactante Salmonella produce diarrea lquida o diarrea de tipo disenteriforme, con o sin presencia de sangre en materias fecales. La patogenia de estas infecciones ha sido discutida en el captulo 4. Hemos contribuido a estudiar en nios hospitalizados un conjunto de casos de diarrea con sangre por coinfeccin con Salmonella y Campylobacter jejuni. Salmonella es localmente el agente principal de toxiinfeccin alimentaria. La conservacin de los alimentos a temperaturas inadecuadas favorece la proliferacin de los grmenes indeseables. La dosis infectante es en general alta para el adulto (105-107), y menor en el nio, en especial el lactante. El perodo de incubacin de la enfermedad es de 8 a 48 horas. El paciente presenta nuseas, vmitos, fiebre, diarrea y clicos abdominales. La duracin habitual de la enfermedad es de uno a cuatro das, pero se puede prolongar. El hallazgo del germen en heces y en el alimento confirma la etiologa.
YERSINIA ENTEROCOLITICA
Es un bacilo gramnegativo de la familia Enterobacteriaceae, causante de diarrea aguda y diarrea
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persistente. En nuestro pas no se investiga en la rutina clnica, y son escasos los aislamientos clnicamente significativos, obtenidos en programas de investigacin. La mayor parte de las cepas utilizan tardamente la lactosa y desdoblan la urea, apareciendo en placas de aislamiento sobre agar Mac Conkey como colonias dbilmente rosadas y con olor ligeramente amoniacal, visibles en 24 horas slo por cultivo a 25-28C, no a 37C.
CAMPYLOBACTER
Es un gnero de bacilos gramnegativos exigentes, microaerfilos, de forma curva semejante a una gaviota, o de aspecto espirilar, muy mviles y capaces de atravesar filtros de pequeo poro. La especie C. jejuni es la responsable de ms del 95% de los casos de diarrea por Campylobacter. Es agente comn de diarrea aguda comunitaria (EPEC, Rotavirus, Campylobacter, etc.). En nios hospitalizados es la causa ms frecuente de diarrea con sangre, despus de Shigella. Las infecciones por este germen predominan en verano, pero se siguen observando en otoo y ya iniciados los fros. C. jejuni es habitualmente sensible a macrlidos y quinolonas, y resistente a betalactmicos y otros antibiticos, propiedad que se utiliza para su cultivo selectivo.
VIBRIONACEAE
La familia Vibrionaceae (nombre derivado de su movilidad como vibrando) incluye varios gneros. El ms relevante en relacin con gastroenteritis es el gnero Vibrio.
V. CHOLERAE
Fue descrito por Koch en 1883 como agente del clera. Pocos aos despus, en 1886, se produca en Uruguay una epidemia que tuvo origen en habitantes de Buenos Aires, infectados a su vez por viajeros procedentes de Europa. Las fuentes comunes de infeccin en Montevideo fueron los depsitos de agua del actual Hospital Pasteur y de un cuartel del Buceo, y los estudios microbiolgicos fueron realizados en el laboratorio que luego sirvi de base al Instituto de Higiene Experimental, inaugurado en 1896. En regiones de Amrica que han desarrollado buen acceso de los pacientes a atencin primaria y rehidratacin, la letalidad de la enfermedad no pasa del 1%. En Nigeria, en cambio, la letalidad ha superado el 10%. La fuente principal de los brotes sigue siendo el suministro de agua contaminada. La dosis infectante para la persona normal es habitualmente alta (104-108). Es impensable que no haya llegado en algn momento a Uruguay, en los ltimos aos, un viajero enfermo o portador de V. cholerae (hay 10 a 40 infectados asintomticos por cada enfermo, y la excrecin fecal puede prolongarse por tiempos variables). Lo que ha ocurrido probablemente es que las condiciones y medidas de salud pblica locales han impedido su difusin a travs del agua, alimentos, o de persona a persona. Cuando el germen ingresa en una regin virgen de infeccin, todos los grupos etreos son igualmente afectados. En zonas endmicas, la incidencia es mxima en nios mayores de dos aos, sin inmunidad adquirida activa o pasivamente (transplancentaria, lactancia). De acuerdo a los bajos niveles sricos prevalentes de anticuerpos vibriocidas, y al tipo sanguneo predominante en nuestra poblacin (tipo O, 46%, el ms susceptible), los uruguayos son potencialmente vulnerables a la infeccin con V. cholerae. Desde 1991 hemos incorporado en la rutina de estudio coprobacteriolgico en el Departamento de Bacteriologa y Virologa la investigacin de Vibrio en TCBS. Tras cientos de estudios, no hemos aislado en ningn paciente la cepa epidmica. De un lactante hospitalizado con diarrea se recuper V. cholerae no O1, no toxignico. Otras especies, como V. parahemolyticus o V. fluvialis, que producen gastroenteritis por ingestin de agua contaminada o productos del mar, no han sido investigadas en forma
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cuidadosa en nuestro medio. Las cepas de V. cholerae prevalentes en Amrica pertenecen al biotipo El Tor. Este difiere del clsico en algunas propiedades bioqumicas (VP), capacidad de hemaglutinacin, hemlisis, sensibilidad a bacterifagos y a Polimixina B en disco de 50 g. Este biotipo presenta a su vez variantes. Como las cepas comunes de la sptima pandemia, V. cholerae El Tor que circula en Sudamrica es no hemoltica. El reservorio de V. cholerae es humano. La sobrevida del germen en el ambiente (agua, alimentos, suelo) es variable, pero en general corta: horas o pocos das. Hay sin embargo evidencias de que ciertas cepas de V. cholerae O1 biotipo El Tor pueden persistir en un reservorio ambiental. Desde 1973 se ha informado sobre casos espordicos de clera en la costa del Golfo de Mxico, asociados con la ingestin de mariscos crudos o cocidos incompletamente. En octubre de 1992 se observaron en la India casos de clera que no eran producidos por V. cholerae O1, sino por el serogrupo O:139. Se disemin en forma epidmica en los alrededores de Bangladesh produciendo en pocos meses cientos de miles de casos que afectaron fundamentalmente a menores de 15 aos. El agua es su vehculo principal de transmisin. La patognesis es similar a la de la enfermedad producida por V. cholerae O1. El germen es igualmente toxignico. Un hecho llamativo es que V. cholerae O:139 puede expresar un polisacrido capsular anlogo al descripto en otros Vibrio O1. Clnicamente, se ha visto que a diferencia de V. cholerae O1, puede causar infeccin extraintestinal en pacientes inmunocomprometidos. La metodologa para aislarlo es idntica a la que se utiliza para V. cholerae O1. Para identificacin debe tenerse en cuenta que no es sensible al compuesto vibriosttico O129. La exposicin a V. cholerae O1 protege contra la reinfeccin, pero no previene la enfermedad por V. cholerae O139, lo cual debe tenerse en cuenta para la eventual inmunizacin activa. El perodo de incubacin del clera es de 12 a 72 hs, dependiendo de la dosis infectante y de factores personales y microbianos. Tienen mayor riesgo de enfermar las personas con hipoclorhidria gstrica. El sitio primario de infeccin es el intestino delgado. La prdida de fluidos es mxima a nivel del yeyuno. La infeccin es tpica, no invasiva y no inflamatoria. (Ver captulo 4) Los signos prominentes de la enfermedad son la diarrea lquida abundante (agua de arroz) y la deshidratacin, a veces acompaadas de dolores clicos y vmitos. Sin tratamiento antimicrobiano, la diarrea persiste cuatro a seis das. La muerte puede sobrevenir por hipoglicemia, disbalance hidroelectroltico extra e intracelular que afecta la funcin celular, hipoperfusin de rganos crticos, insuficiencia renal, arritmias y shock.
AEROMONAS HYDROPHILA. A. CAVIAE
Son bacterias gramnegativas, oxidasa positivas, pertenecientes a la familia Vibrionaceae, que normalmente se encuentran en el medio acutico. Han sido incriminadas como causa de diarrea principalmente en nios, pero tambin en adultos. La evidencia en tal sentido es todava incompleta. Se han descrito tres formas clnicas de diarrea asociada a A. hydrophila: a) gastroenteritis leve, consistente en deposiciones lquidas, fiebre baja y vmitos ocasionales; b) diarrea disenteriforme; c) diarrea prolongada con una duracin mayor de dos semanas. Se piensa que se trasmite por ingestin de agua contaminada y se ha comprobado que puede sobrevivir en agua para consumo humano con niveles standard de clorinacin.
PLESIOMONAS SHIGELLOIDES
Es otro microorganismo acutico gramnegativo de la familia Vibrionaceae que puede causar diarrea de modo similar a Aeromonas, a travs del agua o de alimentos marinos.
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STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Es flora transitoria de la piel y en especial de las fosas nasales. Tambin puede encontrarse en nmero reducido en el colon y la vagina. Prcticamente todas las personas son portadoras de este germen en uno u otro momento de su vida. Es causa de gran variedad de infecciones, incluyendo lesiones de piel de diverso tipo y entidad. Como causa de toxiinfeccin alimentaria, la fuente de contaminacin por S. aureus suele ser un manipulador de alimentos que elimina gran cantidad de grmenes enterotoxignicos a partir de la nariz o de lesiones cutneas activas. Raramente el germen tiene origen bovino. En el alimento contaminado, que no recibe coccin o tratamiento trmico adecuado, y que se mantiene a temperaturas intermedias, sin refrigeracin, la bacteria prolifera y sintetiza protenas txicas. Se necesita habitualmente ms de 105 bacterias por gramo de alimento para que se forme una concentracin de enterotoxina (es suficiente <1 g/g) capaz de producir enfermedad. S. aureus tolera altas concentraciones de sal y otros solutos, y sus enterotoxinas (no el germen) pueden resistir 100C durante 15 a 30 minutos, por lo cual no son adecuadamente destruidas por coccin o pasteurizacin una vez producidas. Las cremas, quesos, o pasteles preparados con ingredientes no pasteurizados, o las carnes, jamn y pollo pueden ser vehculo de enfermedad. La toxiinfeccin alimentaria estafiloccica y todos sus sntomas son provocados por la enterotoxina ingerida con el alimento. Las bacterias, si estn presentes, transitan el tubo digestivo y son excretadas. El perodo de incubacin es corto (una a seis horas); la enfermedad comienza bruscamente con intensas nuseas, clicos, vmitos y, generalmente, diarrea con postracin; no se presenta habitualmente fiebre; los sntomas ceden en uno a dos das; raramente se produce la muerte en personas con otras enfermedades de base. Las toxinas de S. aureus que provocan este cuadro no parecen ajustarse al concepto comn de enterotoxinas como sustancias exotxicas bacterianas de accin local sobre la secrecin y absorcin de agua y electrolitos a nivel intestinal. Se interpreta que su actividad deriva de: a) el estmulo de terminaciones vagales a nivel de la mucosa gstrica, con violento efecto emtico; b) su accin sistmica como superantgenos, protenas que no son digeridas y procesadas por las clulas presentadoras, sino que forman directamente puentes entre las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad y los receptores de las clulas T. El resultado es el estmulo inespecfico de grandes cantidades de clulas T y macrfagos, con produccin abundante de IL2 y otras citoquinas, cuyo efecto, al ser inoculadas por va parenteral, es muy similar al observado en estas toxiinfecciones. Por este efecto, por su secuencia aminoacdica y por la similitud de los genes que las codifican, las enterotoxinas estafiloccicas, que son producidas habitualmente por S. aureus de tipo fgico III, se parecen a las toxinas pirognicas de Streptococcus pyogenes y a la toxina del shock txico. Son un conjunto de siete protenas muy parecidas (SEA, B, C1, C2, C3, D y E), de las cuales la ms frecuente es la enterotoxina A. Los genes responsables de su produccin son cromosmicos, plasmdicos, o incorporados por bacterifagos.
BACILLUS CEREUS
Es un bacilo grampositivo, catalasa positivo, aerobio estricto, esporulado. Es mvil por flagelos peritricos. Produce lecitinasa y betahemlisis sobre agar sangre ovina. Est presente ampliamente en el ambiente, el suelo, las plantas, etc. Los esporos que contaminan los alimentos resisten la ebullicin y pueden luego germinar. Origina dos tipos de enfermedad de fuente alimentaria: a) afeccin emtica, breve, muy similar a la causada por S. aureus, compuesta por nuseas, vmitos y dolores clicos acompaados de diarrea en algunos enfermos. El perodo de incubacin promedio es de dos horas, y el alimento de origen es en general el arroz cocido y no bien refrigerado que ha sustentado la germinacin de los esporos, la proliferacin
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bacteriana, y la sntesis de toxina preformada. Se trata de una toxina proteica, termoestable, de molcula pequea (PM 5000); b) sndrome diarreico, muy parecido al producido por Clostridium perfringens. Se produce a partir de carnes, vegetales, lcteos y otros alimentos. El perodo de incubacin es de 6 a 24 horas, y se presenta con diarrea, clicos, a veces vmitos y raramente fiebre. Dura de uno a dos das y es causado por una enterotoxina lbil, de liberacin intestinal, que activa el sistema adenil ciclasa - AMP cclico, como las toxinas LT de E. coli y CT de V. cholerae.
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
Es un bacilo grampositivo esporulado, anaerobio obligado, pero poseedor de cierto grado de aerotolerancia. El responsable de toxiinfeccin alimentaria es en general el tipo A. Est presente normalmente en materias fecales humanas, animales, y en el suelo, y a partir de este reservorio puede contaminar los alimentos. Para que se produzca la enfermedad, se requieren habitualmente ms de 106 microorganismos por gramo. Esto ocurre cuando el alimento contaminado (carnes, pollo) recibe una coccin insuficiente, que destruye las formas vegetativas pero libera el oxgeno, reduce el potencial redox y permite la germinacin de los esporos sobrevivientes. La proliferacin de C. perfringens se produce durante el enfriamiento lento de volmenes importantes del producto para consumo de muchas personas, o su mantenimiento a temperaturas intermedias. C. perfringens tipo A produce, adems de la exotoxina que permite caracterizarlo, una enterotoxina termolbil, que acta en el epitelio ileal promoviendo la hipersecrecin de agua y electrolitos e inhibiendo la absorcin de glucosa. Se ha descrito tambin produccin de enterotoxina por algunas cepas del tipo D. La enterotoxina no se forma en el alimento sino en el intestino, cuando grandes cantidades de bacterias esporulan tras sufrir el estrs cido del estmago. No es, sin embargo, una protena vinculada estructuralmente a los esporos, y puede ser excepcionalmente producida en situaciones en que la bacteria no esporula: en pacientes aosos o debilitados y hospitalizados, la modificacin de la flora intestinal por el uso de antibiticos puede dar lugar a diarrea por proliferacin bacteriana y formacin de toxina en el colon. C. perfringens posee una cpsula polisacardica que no tiene relevancia en la patogenia de la enfermedad intestinal, pero que presenta diversidad antignica y permite clasificar las cepas con fines epidemiolgicos. Ocasionalmente, en nios desnutridos, C. perfringens puede producir invasin y ulceracin de la mucosa, con riesgo de vida. En su forma habitual, la toxiinfeccim alimentaria por C. perfringens se desencadena 8 a 18 horas despus de la ingestin del alimento. Cursa tpicamente con diarrea lquida y clicos severos, a veces nuseas, y raramente vmitos o fiebre. La enfermedad es habitualmente corta (24 hs) y benigna.
CLOSTRIDIUM DIFFICILE
Es tambin un bacilo esporulado que sobrevive en forma prolongada y est ampliamente distribuido en la naturaleza. Forma parte de la flora normal del 90% de los lactantes, pero de menos de 5% de los adultos sanos. En mayores de 60 aos, la proporcin de colonizados es alta, y tambin lo es en pacientes hospitalizados: el germen est presente en 10% a 30% de los mismos, y es recuperable con frecuencia del ambiente y utensilios. La enfermedad producida por C. difficile es una gastroenteritis caracterizada por proliferacin microbiana intraluminal, produccin de toxinas y dao mucoso significativo sin invasin. Ocurre casi exclusivamente tras antibioticoterapia y alteracin de la flora normal. La mayora de las cepas produce una o dos toxinas antignicamente diferentes: toxina A y toxina B. Son
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exotoxinas de alto peso molecular formadas durante la fase logartmica de crecimiento. Los genes que codifican su produccin estn vinculados y prximos en el cromosoma bacteriano. Ambas tienen un efecto citotxico que se debe a la alteracin de los microfilamentos de actina del citoesqueleto celular. Las modificaciones en el intercambio de fluido y solutos derivan al parecer del dao citotxico, por mecanismos que son todava objeto de estudio. La toxina B es 1000 veces ms potente que la A en cultivos celulares de laboratorio, pero la segunda parece ser la principal responsable de los efectos en vivo. El efecto de C. difficile puede ser mnimo, o puede implicar una diarrea severa y prolongada, con clicos, fiebre alta y leucocitosis. Las complicaciones derivan principalmente del disbalance hidroelectroltico y las prdidas proteicas que generan hipoalbuminemia. Puede producirse megacolon y perforacin intestinal. La lesin tpica observable es la formacin de seudomembranas, que pueden confluir y desprenderse. Se originan en zonas de ulceracin mucosa con cambios inflamatorios de la lmina propia, y acumulacin de fibrina, mucina, clulas inflamatorias y epiteliales descamadas, sin inclusin de bacterias ni invasin parietal.
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
El botulismo es una intoxicacin, ms que una toxiinfeccin. Es un tipo diferente de enfermedad de origen alimentario, poco frecuente en el pas, cuyas manifestaciones no son predominantemente digestivas, sino neurolgicas. La exotoxina botulnica, responsable del proceso, es una macromolcula proteica muy activa: la dosis letal 50 LD50 para el ratn es <0.01 ng. Es producida por las bacterias en forma de complejo proteico, cuyos componentes no txicos contribuyen a proteger la toxina del cido y proteasas gstricas. En su forma activa, tras clivaje proteoltico en el tubo digestivo, es una toxina de tipo A-B, compuesta por una cadena B, pesada (100 kDa), de fijacin, y una unidad A, liviana (50 kDa), con actividad enzimtica. Cuando es ingerida, la toxina es absorbida a nivel gstrico, ingresa a la sangre y se fija sobre receptores glicoproteicos o glicolipdicos de las terminaciones perifricas de las neuronas motoras. La cadena A es internalizada, y su regin amino terminal opera como endopeptidasa zincdependiente que altera las sinaptobrevinas que integran la pared de las vesculas sinpticas, interfiriendo con la liberacin de acetilcolina. Su estructura y modo de accin son similares a los de la toxina tetnica, pero su sitio de actividad es distinto, dando lugar a parlisis flcida, y no espstica como esta. C. botulinum es un bacilo grampositivo, anaerobio estricto, mvil, con flagelos peritricos, productor de esporos ovales y subterminales. Existen siete serotipos conocidos (A-E) de exotoxina botulnica. Una misma cepa puede producir ms de un tipo. El tipo C no es patgeno para el ser humano. Los tipos E, F y G pueden ser producidos por otras especies de Clostridium: C. argentinense (llamado tambin C. botulinum G); C. baratii; C. butyricum. La exotoxina G es codificada por un plasmidio; los tipos C y D son producidos por conversin fgica. Se asume que los genes de los serotipos A, B, E y F estn presentes en el cromosoma bacteriano. Algunas cepas de C. botulinum producen adems toxinas C2 o C3, de significado discutible. C. botulinum es habitante normal del suelo, el polvo y los mares, pero no del tracto digestivo del hombre. Los esporos, en especial los de cultivos productores de toxinas A y B, pueden resistir temperaturas superiores a 110C durante varios minutos. Son precisamente los cultivos productores de toxinas tipo A y B los ms frecuentes causantes de contaminacin alimentaria y de enfermedad a nivel mundial. La fuente principal de enfermedad son las conservas caseras o defectuosas de carne y condimentos vegetales. Las cepas productoras de toxina tipo B se aslan en general de carne de cerdo. Las productoras de protena tipo E contaminan sobre todo conservas de pescado. En las conservas bien preparadas, el tratamiento trmico adecuado,
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el bajo pH y el agregado de NaCl o nitritos son factores que sumados, multiplican su accin protectora. En productos mal conservados en cambio (conservas ahumadas, enlatados mal esterilizados por calor, etc.), los esporos pueden sobrevivir, para germinar y proliferar luego al amparo de condiciones de anaerobiosis, y producir toxina que es liberada con lisis bacteriana. El proceso requiere habitualmente 2 a 14 das. Los alimentos contaminados a niveles de peligro tienen muchas veces sabor o aspecto anormal: rancidez, putrefaccin, gas, hinchazn de latas. Si se consumen sin cocinar, la toxina presente en ellos no es destruida (las toxinas botulnicas son termolbiles, alterables por el calor). Todas las cepas de C. botulinum son sacarolticas y lipolticas. Es variable en cambio su capacidad proteoltica. Se clasifican como tipo I cuando son proteolticas y productoras de toxina A, B o F; de tipo II cuando son no proteolticas, y productoras de toxinas B, E o F. Las cepas del grupo III son metablicamente diferentes, y producen toxinas C o D. Los alimentos contaminados con cepas no proteolticas pueden no mostrarse ostensiblemente alterados, como s ocurre para los que contienen cepas de tipo I. Excepcionalmente, C. botulinum puede infectar heridas profundas, con restos necrticos y dficit de irrigacin, y ser all origen de toxina y de enfermedad. El botulismo del lactante es otra forma rara que ocurre por la ingestin de esporos con la miel u otro vehculo, proliferacin y colonizacin intestinal, produccin local de toxina y absorcin lenta a nivel del colon. Los sntomas de botulismo aparecen 4 a 36 horas despus de la ingesta del alimento contaminado. La rapidez de instalacin y la intensidad del cuadro dependen de la cantidad de toxina ingerida. Las primeras manifestaciones son digestivas: vmitos, sed, constipacin o diarrea (esta ltima solo en 15% de los casos). La enfermedad neuromuscular debuta con diplopa, y luego disfagia y disartria; ms tarde aparece debilidad muscular perifrica y parlisis flcida progresiva. La muerte puede sobrevenir por paro respiratorio, neumopata secundaria o paro cardaco por hipoxia. Con buen manejo y tratamiento, la letalidad se sita en 10% a 15%. Una vez fijada la toxina a la terminacin nerviosa, la intervencin externa con antitoxina no tiene efecto sobre esta interaccin. Algo de regeneracin nerviosa es obtenible, pero los pacientes que sobreviven a un episodio de botulismo presentan con frecuencia dao neurolgico irreversible.
Mecanismos patognicos de los agentes etiolgicos bacterianos de diarrea

Se pueden distinguir en suma cinco tipos patognicos de agentes bacterianos de diarrea. 1. Bacterias que poseen la capacidad de adherir a la mucosa y producir toxinas. V. cholerae y ETEC afectan al intestino delgado en su sector proximal. Las toxinas son producidas en la luz de este y alteran la capacidad funcional del enterocito. VTEC produce en el colon citotoxinas, cuyo efecto principal se expresa en los endotelios vasculares o a nivel sistmico. 2. Bacterias que causan diarrea por disolucin del borde en cepillo de la mucosa intestinal, alteracin del citoesqueleto celular y de los intercambios de agua y solutos. (EPEC a nivel del delgado; VTEC en el colon). 3. Bacterias que causan diarrea con invasin de la mucosa y proliferacin dentro de la clula intestinal. Es caracterstico de Shigella y EIEC. Ambas invaden el enterocito del intestino delgado distal y del colon, donde se multiplican y alteran el funcionamiento de las clulas causando su muerte. 4. Bacterias que modifican la superficie de los enterocitos, invaden con traslocacin de la
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mucosa, proliferacin en la lmina propia y acumulacin a veces en los ganglios linfticos. Pertenecen a este grupo las especies de Salmonella no tifodicas, Campylobacter y Yersinia enterocolitica. 5. Bacterias que forman toxinas durante su multiplicacin libre en el exterior o en la luz intestinal. La produccin de toxinas no est asociada a la adherencia de los grmenes a la mucosa. S. aureus, C. perfringens y otros.
Virus
ROTAVIRUS
El gnero est incluido en la familia Reoviridae. Causan infeccin intestinal en varias especies (hombre, simios, equinos, porcinos, caninos, bovinos, ovinos y aves). Su existencia e importancia se evidenci en 1973, cuando por primera vez se visualizaron por el microscopio electrnico (ME) en muestras de tejido duodenal de un nio con diarrea. Los Rotavirus son localmente, por frecuencia, los principales agentes causales de diarrea infantil, seguidos por E. coli. En muchos pases desarrollados son su principal agente etiolgico. Los casos predominan en las estaciones mas fras en los pases industrializados, mientras que en los pases subdesarrollados como el nuestro las infecciones ocurren durante todo el ao.
ADENOVIRUS ENTRICOS
Tambin llamados Adenovirus atpicos, los serotipos 4O y 41 pueden causar, con menor frecuencia, una enfermedad clnica importante parecida a la gastroenteritis provocada por Rotavirus. En contraste con los Adenovirus convencionales, se requieren tcnicas muy especiales para poder cultivarlos.
VIRUS PEQUEOS
Son virus de 27 a 40 nm, relacionados entre s, que causan gastroenteritis epidmica familiar, comunitaria, o de fuente alimentaria. Incluye los agentes Norwalk, Montgomery County, Hawai, etc. Son virus que clnicamente causan diarrea o enfermedad de vmitos en invierno, y que fueron identificados por ME, ya que no ha sido posible cultivarlos en histocultivos. No han sido investigados en nuestro medio.
OTROS VIRUS
Astrovirus, Calicivirus y Coronavirus han sido implicados como causa infrecuente de gastroenteritis.
Mtodos de estudio. Diagnstico

El diagnstico y manejo de las gastroenteritis infantiles es fundamentalmente clnico. Solo en ciertas ocasiones se hace necesario saber la etiologa: a) con fines de tratamiento antibitico, como es el caso de una diarrea con sangre, o para descartar el clera en situacin de riesgo especfico; b) con fines epidemiolgicos, para conocer que cepas estn circulando en un momento dado, la probable fuente de infeccin y las vas de trasmisin, permitiendo as implementar medidas de control que eviten su diseminacin. El estudio etiolgico requiere mtodos diferentes para la identificacin de agentes bacterianos, virales o parasitarios. Nos referiremos a los primeros.
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Recoleccin de la muestra: las materias fecales se recogen, en el caso de lactantes, con un paal de nylon. Utilizando una esptula o cucharita de plstico se trasladan en cantidad suficiente (no menos de 10g) a un frasco estril de boca ancha por un lado, y por otro, con un hisopo, se introducen en un tubo que contiene un medio de transporte de Cary-Blair para preservacin de los grmenes ms lbiles (Shigella, Campylobacter). La muestra debe procesarse de inmediato, o refrigerarse por no ms de 12 horas. Una vez remitida al laboratorio, lo primero a realizar es una tincin de Gram para reconocer eventualmente espirilos o gaviotas (Campylobacter) y para identificar y cuantificar leucocitos fecales. La tincin con azul de metileno facilita la observacin de leucocitos fecales, expresin de presencia de un agente invasor. Si se desea investigar verotoxinas libres en heces, se realiza suspensin de las mismas en buffer PBS, centrifugacin, filtrado estril e inoculacin sobre cultivos celulares. El paso siguiente es la realizacin del cultivo de las materias fecales. Para ello se usan distintos medios. a) Medios slidos, que tienen por finalidad inhibir el desarrollo de la flora fecal normal y favorecer y distinguir el desarrollo de grmenes patgenos. Son los llamados medios selectivos y diferenciales: Agar Mac Conkey lactosa, Mac Conkey sorbitol, SS (medio especial con lactosa para aislamiento de Salmonella y Shigella), TCBS con sacarosa para Vibrio, agar Skirrow u otros para Campylobacter. Estos medios contienen sustancias inhibitorias (cristal violeta, sales biliares, citratos, antibiticos en Skirrow, etc.), y habitualmente un indicador de pH que producir un viraje de color si las colonias que desarrollan degradan el carbohidrato que contiene el medio. El agar Skirrow es un medio rico, con sangre. b) Medios lquidos de enriquecimiento: son caldos que actan tambin estimulando el crecimiento de un germen e inhibiendo el de otros que pueden estar presentes en grandes cantidades. Los ms utilizados son el caldo tetrationato (especial para Salmonella), el caldo selenito (para cultivo de Salmonella y algunas cepas de Shigella), el agua peptonada alcalina para desarrollo de V. cholerae, el PSB (peptona, sorbitol y bilis) para crecimiento en fro de Y. enterocolitica. Existen, pero no se usan comnmente, medios de enriquecimiento para Campylobacter, para VTEC y otros. La mayora de los bacilos gramnegativos enteropatgenos no tiene requerimientos atmosfricos especiales, salvo Campylobacter que requiere condiciones microaerfilas que deben proversele en jarra apropiada. En general precisan para crecer temperatura de 37C. Campylobacter crece bien a 42C, lo que facilita la seleccin. Yersinia debe cultivarse por debajo de 28C en agar Mac Conkey u otro, y a 4C para enriquecimiento en PSB. El tiempo de incubacin de las placas es en general de 24 hs (48 para Campylobacter). Las colonias observables en ellas se subcultivan y se estudia su metabolismo para avanzar en su identificacin. Las colonias lactosapositivas (rojas en agar Mac Conkey) se siembran en agar inclinado, citrato y lisina como posibles E. coli. Las colonias lactosanegativas (que pueden ser Salmonella, Shigella, Yersinia u otras bacterias no enteropatgenas) se cultivan en TSI y agar fenilalanina. Las colonias amarillas, sacarosapositivas en TCBS pueden pertenecer al gnero Vibrio; se subcultivan para realizar prueba de oxidasas y otros ensayos que lo confirmen. En agar de Skirrow u otros, Campylobacter jejuni o coli desarrolla como gotas de agua extendidas a lo largo de la estra; el Gram y la movilidad en fresco orientan a su caracterizacin. La identificacin confirmatoria se realiza en todos los casos por pruebas metablicas y bioqumicas complementarias (oxidasas, OF, utilizacin de azcares y aminocidos, investigacin de productos finales diversos, etc.), y eventualmente por reacciones antgeno-anticuerpo
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de aglutinacin que enfrentan las suspensiones bacterianas con antisueros especficos para permitir la caracterizacin antignica O, H y K. Los caldos de enriquecimiento se cultivan por tiempos variables segn el germen a investigar (1 y 3 das para Salmonella; 21 das a 4C para Yersinia, por ej.). Se realizan reaislamientos en placas de agar selectivo y diferencial, como para la siembra primaria, y las colonias resultantes se estudian de la misma manera. Pueden ser necesarios ensayos especiales ms complicados. a) Inoculacin de cultivos celulares para investigar citotoxinas o enterotoxinas en caldos de cultivo (filtrado) de ciertos tipos de E. coli: ETEC, VTEC. b) Inoculacin de animales: ratn lactante para investigar ST de E. coli; conjuntiva de cobayo o conejo para confirmacin de EIEC. c) Pruebas de ELISA o aglutinacin de ltex para investigacin de enterotoxinas de E. coli o de V. Cholerae. d) Tcnicas de PCR o hibridacin con sondas de ADN para identificacin especfica de cidos nucleicos bacterianos en materias fecales tratadas o en cultivos realizados a partir de las mismas. El diagnstico de las gastroenteritis virales se basa en la deteccin del virus o sus componentes (protenas o ADN) en muestras de materias fecales. El microscopio electrnico es muy importante para el diagnstico viral, pero requiere mucho tiempo de observacin, es poco sensible, a menos que se combine con tcnicas inmunolgicas (inmunoelectromicroscopa), y no se encuentra disponible en todos los laboratorios por su costo. Los cultivos celulares constituyen un mtodo laborioso, y la mayor parte de los agentes que producen gastroenteritis crecen mal en los mismos. El anlisis para la deteccin de antgenos virales es el mtodo diagnstico ms utilizado. Se usan tcnicas de ELISA. Son mtodos sencillos, rpidos y sensibles. Debido a que no cuentan con una especificidad del 100%, las muestras positivas se deben confirmar mediante otro ELISA denominado de bloqueo. La aglutinacin de ltex es una tcnica de menor sensibilidad y especificidad que el ELISA, pero es un mtodo rpido y prctico. La PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) estudia el ARN viral en materias fecales tratadas. Permite detectar los genes de Rotavirus y distinguir sus caractersticas y sus variantes para el estudio de la epidemiologa molecular de estas infecciones. Es un mtodo de alta sensibilidad y especificidad, pero no se practica en los laboratorios de anlisis clnicos. Lo mismo debemos decir de muchas de las tcnicas de estudio copromicrobiolgico mencionadas ms arriba. La investigacin de un brote de toxiinfeccin alimentaria requiere la puesta en juego de un conjunto de procedimientos ordenados. 1. Obtencin de datos personales, informacin clnica de cada uno de los afectados, alimentos involucrados, etc. (Ver cuadro 5). 2. Envo rpido al laboratorio (Bromatologa, IMM) de un mnimo de 50g de los alimentos sospechosos (segn tasas de ataque); refrigerados y en recipientes estriles. 3. Envo rpido a Laboratorio de Microbiologa Mdica (Ej.: Divisin Laboratorios, MSP ,o Instituto de Higiene) de 5g de heces o vmitos de los pacientes; refrigerados, en frasco estril, y con medio de transporte si es posible. Para la orientacin del estudio microbiolgico hacia los agentes etiolgicos probables y la correcta eleccin de las tcnicas de laboratorio, se requiere contar con datos sobre la enfermedad (sntomas, perodo de incubacin, duracin, etc.), y sobre los alimentos sospechosos, causas posibles de su contaminacin, proporcin de personas afectadas que estuvieron expuestas, etc. El cuadro 6 presenta un esquema de la intervencin del laboratorio en la investigacin de un brote. Los procedimientos centrales son habitualmente los siguientes.
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Cuadro 5. Toxiinfeccin alimentaria. Estudio de un brote

Informacin mdica Datos personales Fecha, lugar, etc. Sntomas: incubacin; descripcin, duracin Informacin de los alimentos Tipo Origen; preparacin; conservacin Tasas de ataques Manipuladores Informacin de laboratorio Alimento Personas afectadas; ambiente, utensilios; manipuladores Resumen Fecha, lugar, circunstancias. Personas afectadas, clnica. Comida involucrada, causas. Germen responsable
Cuadro 6. Toxiinfeccin alimentaria. Diagnstico de laboratorio Orientacin clnico epidemiolgica tipo y aspecto del alimento sospechoso frotis del alimento y material clnico 1. Cultivo del microorganismo responsable En materias fecales. En vmitos. En alimentos: homogenizacin previa; cualitativo o cuantitativo. 2. Investigacin de toxinas En alimentos En materiales clnicos: MF, sangre Enterotoxina estafilocccica Toxinas botulnicas toxina de C. perfringens 3. Antgenos virales en heces: ELISA, ltex 4. Investigacin de grmenes en ambiente, utensilios. Portadores
1. La realizacin de cultivos a partir de alimentos, heces o vmitos, utilizando medios especiales (de enriquecimiento, selectivos y diferenciales) y frecuentemente tcnicas cuantitativas. 2. La bsqueda de toxinas en materiales clnicos o en alimentos. El diagnstico clnico presuntivo de toxiinfeccin alimentaria por S. aureus se basa en la identificacin de un grupo de casos con instalacin brusca de sntomas predominantemente digestivos altos y corto perodo de incubacin, asociados a la ingestin de un alimento sospechoso. El hallazgo de S. aureus en gran nmero en los alimentos, heces o vmitos sirve como indicacin de enfermedad estafiloccica. Puede utilizarse medio selectivo y diferencial de Baird Parker, con yema de huevo y telurito de potasio, donde se aprecian colonias negras con borde en tapa de refresco, halo de precipitacin por lecitinasa y contorno iridiscente
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por produccin de lipasa. S. aureus son cocos grampositivos, catalasa positivos, coagulasa positivos, y productores de termonucleasa detectable sobre agar DNA azul de toluidina. La confirmacin se realiza por la deteccin de enterotoxina en el alimento, o de la produccin de enterotoxina por el germen cultivado en abundancia. La investigacin de enterotoxinas se realiza por reaccin de precipitacin antgeno-anticuerpo con antitoxinas en lmina, por ELISA sandwich polivalente comercial, o por RPLA (aglutinacin pasiva reversa de ltex). La confirmacin de la enfermedad por B. cereus se realiza mediante la deteccin de grandes cantidades de microorganismos: >105 bacterias por gramo, en el alimento, en las heces, o en ambos. Se utiliza agar selectivo y diferencial MYP , con manitol, yema de huevo y polimixina, que inhibe bacterias gramnegativas. B. cereus es manitol negativo y gran productor de lecitinasa. La enterotoxina de la forma diarreica es detectable en alimentos o filtrados de cultivos por RPLA. Para afirmar que la causa de toxiinfecin alimentaria es C. perfringens deben cumplirse uno o ms de estos criterios: a) aislamiento del mismo subtipo capsular en el alimento sospechoso y en las heces de la persona enferma, o en la mayora de las personas enfermas; b) presencia de >106 grmenes por gramo de alimento, o un promedio de >106 esporos por gramo de materia fecal. Los cultivos se realizan en anaerobiosis sobre agar TSC (triptona sulfito cicloserina) con posterior identificacin de las colonias negras sospechosas. Es confirmatoria la deteccin de toxina en el alimento, con tcnica de hemlisis radial cuantitativa controlada por neutralizacin con antitoxina. La enterotoxina de C. perfringens es detectable en cultivos o en materias fecales por RPLA. El diagnstico de botulismo es clnico, epidemiolgico y de laboratorio. El ltimo se hace de la siguiente forma. a) Evidenciando la toxina en el suero, heces, vmitos o extracto de tejidos si el paciente ha fallecido. Se demuestra su accin patgena por inyeccin intraperitoneal en el ratn, confirmando por calentamiento la termosensibilidad del producto txico, y su neutralizacin con antitoxina en la prueba del ratn protegido. Las pruebas sirven si el paciente no ha recibido ya antitoxina. b) Demostrando la presencia de toxina en el alimento sospechoso homogeneizado y tratado con tripsina, y aislando a partir de l el germen causal. Se destruyen las formas vegetativas con alcohol o calor, se realiza cultivo anaerobio en caldo de enriquecimiento, aislamiento en agar hgado yema de huevo, y seleccin en caldo de colonias que deben ser identificadas por su morfologa, sus actividades enzimticas y su produccin de toxina. El diagnstico de colitis pseudomembranosa por Clostridium difficile se realiza por endoscopa en pacientes con clnica compatible y antecedentes de tratamiento con antibiticos. El aislamiento del germen a partir de materias fecales se realiza en agar cicloserina cefoxitina fructosa yema de huevo, y es positivo en 95% de los enfermos. Las citotoxinas son detectables por inoculacin sobre cultivos celulares, o por ELISA. En pacientes VIH + pueden ser necesarias la endoscopia e incluso la biopsia para confirmar la infeccin intestinal con Mycobacterias o Citomegalovirus cuando la etiologa no puede ser determinada por estudios sobre materias fecales.
Tratamiento
Se basa fundamentalmente en medidas de sostn, tanto en lo que se refiere a los bacterias como a los virus, con el fin de evitar o corregir la deshidratacin y la desnutricin, que ge-
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neralmente ocurren en los ms pequeos debido a la prdida de lquidos y tambin a la mala alimentacin a que son sometidos estos nios en el curso de una gastroenteritis. Requiere especial cuidado la realimentacin de nios con diarrea persistente y alteraciones importantes en su funcionalidad digestiva. Debe quedar claro que el tratamiento con antibiticos est limitado a casos especficos de diarrea con sangre, donde se acorta el tiempo de excrecin del germen y los das de enfermedad, a situaciones de invasin bacteriana sistmica, y tambin a aquellos casos donde se confirma clera. Las cepas epidmicas de V. cholerae siguen siendo sensibles a la tetraciclina, que es el antimicrobiano indicado. Como alternativa puede usarse furazolidona u otros. Metronidazol o vancomicina son los antibiticos de eleccin para la enterocolitis por C. difficile. La terapia debe mantenerse 7 a 14 das, pero an as las recurrencias no son raras. En el botulismo, el cuidado intenso de sostn y el apoyo respiratorio son primordiales para reducir la letalidad. El tratamiento antitxico especfico del paciente con diagnstico primario debe ser precoz, para remover de la circulacin la toxina no fijada todava. Se usa antitoxina polivalente de comienzo, y monovalente una vez confirmado y tipificado el agente causal.
Prevencin
Teniendo en cuenta las altas tasas de morbilidad que presenta la diarrea aguda en la poblacin, los altos costos de atencin institucional y la existencia de posibilidades reales de lograr un control efectivo, las gastroenteritis deben ser consideradas prioritarias dentro de los programas de salud. Para ello existe una gran cantidad de medidas posibles, desde facilitar el acceso a la asistencia primaria de la salud y a la terapia de rehidratacin oral, promover la lactancia materna y la preparacin higinica de los alimentos infantiles, ensear a la comunidad y al personal de salud el cumplimiento estricto de las precauciones universales para el control de la diseminacin de infecciones, como el lavado de manos y los mtodos de barrera (guantes y uso de tnica), y algo fundamental como es mejorar las condiciones sanitarias del medio ambiente (recoleccin de la basura, saneamiento, suministro de agua potable intradomiciliaria, etc.). En la toxiinfeccin alimentaria es limitado el conocimiento de la realidad epidemiolgica nacional. El informe y estudio sistemtico de los brotes es fundamental para conocer los microorganismos prevalentes y los alimentos de mayor riesgo. En tanto estos datos no se manejen, se gastarn a ciegas importantes montos en estudios de inspeccin y anlisis de alimentos posiblemente irrelevantes. Al hablar de la importancia de esta entidad mencionamos los principales factores que contribuyen a limitar su difusin, y jerarquizamos la necesidad de adecuada coccin de los alimentos, y conservacin de los mismos por refrigeracin. Los cuidados de higiene en la manipulacin, preparacin y envasado de los alimentos, y el alejamiento temporal de manipuladores enfermos tiene ms importancia que la bsqueda obsesiva de portadores asintomticos. La preservacin de intereses econmicos no debe interferir con la necesidad de explorar y operar cuidadosamente sobre la realidad para contar con fuentes seguras de alimentos de origen vegetal o animal. La prevencin de la diarrea infantil mediante inmunizacin activa es una meta difcil de lograr, por la multiplicidad de microorganismos involucrados (virales, bacterianos y parasitarios), por la inmadurez inmunolgica de los lactantes que constituyen la poblacin objetivo, y por la necesidad de presentar preparados inmunizantes utilizables por va oral, que resistan el trnsito gstrico y que despierten una buena respuesta inmune celular y humoral (IgA) a nivel local, intestinal, en lo posible acompaada de un componente sistmico, como ocurre en la infeccin natural.
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En desarrollo pleno, la poblacin linfocitaria intestinal es la ms numerosa del organismo. La pared entrica presenta estructuras de captacin y presentacin de antgenos y sistemas celulares de respuesta a los mismos que resultan en expresin a nivel local, a nivel sistmico (recordar vacunas antipolio), y en la superficie de otras mucosas por migracin de clulas inmunocompetentes (inmunizacin por va entrica contra Adenovirus respiratorios). En inmunidad antibacteriana importan no solo las respuestas antitxicas o antiadhesinas, sino tambin las dirigidas contra los antgenos de pared y los flagelos, que parecen jugar un papel a tener en cuenta en la infeccin natural (ej. por V. cholerae), aunque en algunos casos esos componentes de los grmenes no contribuyan en forma relevante a la patogenicidad microbiana. Las vacunas por va oral con grmenes inactivados han resultado en general poco inmunognicas. Se han ensayado diversas cepas atenuadas de Shigella, de EPEC y de Salmonella. Los cultivos aroA de Salmonella (ej. S. enteritidis) pueden servir, por construccin gentica de laboratorio, como transportadores y presentadores de antgenos correspondientes a otros patgenos. Se estn ensayando en este momento para la prevencin de la infeccin en aves. Para la prevencin del clera, la vacuna tradicional de grmenes muertos no es efectiva, y no se recomienda su uso. Estn en uso a nivel de prueba de campo dos tipos distintos de vacunas: a) vacuna inactivada que contiene bacterias completas y componente B de la toxina agregado como sustancia inmunizante y como adyuvante; es un producto seguro, pero la eficacia es limitada, parece tener cierto efecto protector contra las infecciones por ETEC; b) vacuna viva atenuada, preparada por modificacin gentica, que contiene la mayor parte de los antgenos bacterianos, incluyendo la porcin B de su toxina CT, pero no su sector A, activo. Es crtico el cuidado de la inocuidad de estas cepas. Ambos tipos de vacuna anticolrica son inefectivos para las infecciones por V. cholerae O139. Se abre todo un nuevo perodo de investigacin en el tema. El toxoide botulnico es medicacin preventiva obligatoria para trabajadores de laboratorio que manejen este germen o sus toxinas, en estudios bsicos o de toxiinfecciones alimentarias. Para Rotavirus se han hecho ensayos con vacunas atenuadas para el hombre, de origen animal: bovino y simiano. Han demostrado ser seguras e inmunognicas, pero de eficacia limitada. Algunas atenan los sntomas, ms que disminuir las tasas de infeccin. Estn en estudio cepas neonatales atenuadas, procedentes de recin nacidos infectados pero no enfermos. La proteccin conferida por una cepa atenuada es alta para la infeccin homotpica, pero la inmunidad heterotpica es menor; esto ha llevado a ensayar la construccin de vacunas polivalentes por reordenacin gentica de virus animales o humanos, de grmenes atenuados transportadores de antgenos de Rotavirus, y de vacunas no vivas, preparadas con protenas virales de distintos tipos, para uso parenteral u oral. El desarrollo futuro requiere tener en cuenta no solo el contenido antignico viral, sino su presentacin, dosis, vas y formas de modulacin de los distintos tipos de respuesta inmune. En lo que respecta en general a las vacunas contra la gastroenteritis, existe controversia a nivel de salud pblica en el mundo, ya que el ensayo y uso de preparados no bien eficaces puede crear un falso sentido de seguridad en la comunidad, y desviar recursos de las medidas prioritarias de mejora de las condiciones higinicas, ambientales y sociales. Ejemplo: la provisin de agua potable abundante y de saneamiento son las medidas de salud pblica ms efectivas para controlar la difusin del clera. La inversin de tiempo y dinero en la bsqueda de vacunas no debe interferir con el desarrollo prioritario de los recursos mencionados.
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Prctico de gastroenteritis
CASO 1. Lactante de siete meses, sexo masculino, sin antecedentes patolgicos personales ni familiares a destacar. Procedente de un medio socioeconmico deficitario. Mal alimentado. Comienza hace 48 hs con deposiciones lquidas, 10 a 12 por da, agregando en la evolucin deposiciones con sangre. Consulta en una policlnica perifrica, donde le indican agua de arroz y t. Agrega a las 24 hs vmitos, rechazo del alimento y depresin neuropsquica. Al ingreso en la emergencia instala movimientos tonicoclnicos de los cuatro miembros, con revulsin ocular, que dura cinco minutos. Al examen fsico se comprueban signos de deshidratacin por lo cual se comienza el tratamiento de reposicin. PRCTICO. Se observarn placas de agar Mac Conkey y de SS sembradas con heces del paciente, en las cuales se observan abundantes colonias lactosanegativas. Se realizar a partir de ellas siembra con punta en medios de TSI, FA y otros. DISCUSIN. Se hablar de cuando est indicada o no la realizacin de un coprocultivo. Toma de la muestra y transporte. Mtodos de estudio. Medios de cultivo utilizados. Interpretacin de resultados. PREGUNTAS Cules pueden ser los grmenes involucrados en este caso? Qu factores de virulencia estn involucrados en la infeccin? Cul sera la mejor forma de terapia en esta situacin? Fue correcta la que se realiz? Usara antibiticos en este caso? Cules son los factores que tendra en cuenta para la prevencin de la diarrea infecciosa?
CASO 2. Lactante de cinco meses, sexo femenino, procedente de un medio socioeconmico deficitario, alimentado artificialmente. Cursa desde hace unos das un cuadro respiratorio caracterizado por rinitis serosa y tos seca. Comienza hace 24 hs con rechazo del alimento, fiebre y vmitos abundantes. Agrega en las ltimas horas deposiciones lquidas (5 a 6 en 12hs). Debido a que las deposiciones aumentan en cantidad y frecuencia la madre consulta, constatndose en la puerta de emergencia signos de deshidratacin. PRCTICO. En las placas de agar Mac Conkey y SS no se observa crecimiento alguno. PREGUNTAS Por qu cree usted que no hubo crecimiento en las placas? Estaba justificada ac la realizacin de un coprocultivo? Cules pueden ser los grmenes involucrados en este caso? Si a usted le interesara epidemiolgicamente pedir un diagnstico, qu otros mtodos de estudio empleara para buscar el germen responsable?
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CASO 3. Paciente de nueve meses, sexo femenino, procedente del interior, de medio socioeconmico aceptable. Bien alimentado. Presenta desde hace 15 das fiebre, dificultad para alimentarse y rinitis serosa. Hace dos das comienza con deposiciones lquidas, cinco a seis por da, sin elementos anormales. Consulta la madre, y se le indica sales de rehidratacin oral (SRO) luego de cada deposicin. Contina igual, agregando hace 24 horas deposiciones con estras de sangre. Antes de la consulta, sufre un episodio convulsivo de tres a cuatro minutos de duracin. La madre relata que desde hace varias horas no orina, y que lo nota muy plido. Al examen fsico: deprimido, febril. Palidez cutaneomucosa. Sin signos de deshidratacin. Paal sin deposiciones ni orina. Con el diagnstico presuntivo de sndrome hemoltico urmico se interna en Cuidados Intensivos, donde se recogen materias que se envan al Departamento de Bacteriologa y Virologa del Instituto de Higiene. PRCTICO. Se observan placas sembradas de agar Mac Conkey y SS. De colonias lactosa positivas se inocularn tubos de Agar Infusin, citrato y lisina. Se mostrar verotoxicidad de las materias fecales. Fotos de PCR. DISCUSIN. Se hablar de las posibles etiologas del SHU, su patogenia, epidemiologa, y pasos a seguir en el diagnstico.
CASO 4. Paciente de 3O aos con antecedentes patolgicos de gastritis. Regresa de un viaje por Centroamrica. Comienza a las 48 hs con deposiciones lquidas abundantes, acuosas, de color amarillento parduzco. Concomitantemente, decaimiento y dolor abdominal. Todo cursa en apirexia. Agrega vmitos y contina con deposiciones que cada vez son ms frecuentes y ms abundantes. Se queja de calambres. Es trasladado a la emergencia donde se constatan signos de deshidratacin y acidosis metablica. Se comienza el tratamiento en base a fluidos por va intravenosa y va oral con SRO, requirindose en primera instancia dos litros de suero y electrolitos. Se recogen materias para un coprocultivo. Se trata adems con antibiticos, y evoluciona satisfactoriamente. En el cultivo crece V. cholerae. PRCTICO. Observacin de colonias de Vibrio en agar TCBS (medio selectivo, y diferencial que contiene tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa). Prueba de la Oxidasa. Sensibilidad al compuesto O/129 en disco. Comportamiento en medio de TSI (sacarosa positivo). PREGUNTAS Es importante aqu la realizacin de un coprocultivo?, por qu? Todas las cepas de V. cholerae son capaces de causar clera? Cmo se trasmite? y cules son las medidas que usted y la comunidad deben tomar para prevenirlo?
CASO 5. A.S., 25 aos, sexo femenino, residente de Montevideo, regresa de un viaje con sus compaeros de estudio a una ciudad del interior. A las 48 horas de haber ingerido milanesas con ensalada rusa en un restaurante de la zona, comienza con sensacin nau-
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seosa y vmitos, agregando a las pocas horas clicos abdominales y deposiciones lquidas abundantes, al igual que la mayora de sus compaeros. Al examen fsico: paciente intensamente dolorida, con fiebre de 38 C axilar. Abdomen: dolor a la palpacin en zona periumbilical y en fosa ilaca derecha. No presenta defensa ni contractura. Se realiz tratamiento en base a fluidos por va intravenosa y electrolitos. El coprocultivo muestra a las 24 hs el desarrollo de bacterias lactosa negativas H2S positivas, que estudiadas revelan ser Salmonella enteritidis. PRCTICO. Observaremos en medios de Mac Conkey y en SS las colonias sospechosas. Se realizar la siembra de esas colonias en TSI y fenilalanina, como paso inicial de identificacin. PREGUNTAS Cul cree usted que fue la causa de la infeccin por Salmonella? Cul es el mecanismo patognico del germen como productor de gastroenteritis? Conoce otros mtodos de estudio, que puedan complementar los ya vistos? Qu medidas pueden tomarse para evitar este tipo de infecciones?
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Infeccin urinaria
M. Torres, A. Mattera
Generalidades
Se considera infeccin urinaria a la presencia de bacterias en sectores normalmente estriles del aparato urinario, con la consiguiente respuesta inflamatoria. Las infecciones urinarias (IU) constituyen una patologa muy frecuente, de elevada morbilidad, en muchos pacientes son recurrentes o pueden determinar complicaciones graves como sepsis o secuelas importantes, como dao renal. Desde el punto de vista anatmico, cabe recordar la divisin del tracto urinario en dos sectores, alto (riones, pelvis renales y urteres) y bajo (vejiga y uretra).
Definiciones
Bacteriuria: presencia de bacterias en la orina. Bacteriuria sintomtica o asintomtica: segn se acompae o no de sntomas vinculados al aparato urinario. Bacteriuria significativa: nmero de bacterias por mililitro de orina que se corresponde estadsticamente con una infeccin urinaria. En los aos 50, Kass defini el recuento de 100.000 o ms colonias por ml de orina (105 ufc/ml) como criterio de bacteriuria significativa, o sea indicadora de IU verdadera. Este criterio fue establecido comparando el nmero de bacterias por ml de orina en muestras obtenidas por puncin suprapbica (PSP) y chorro medio en mujeres con pieloniefritis sintomtica. Con el correr del tiempo, otros autores han propuesto niveles menores para el diagnstico de bacteriuria significativa, en ciertas poblaciones de pacientes sintomticos, por ejemplo 103 ufc/ml y 102 ufc/ml. Bajos recuentos bacterianos podran deberse tambin a IU por cocos grampositivos, diuresis forzada, antimicrobianos suministrados previamente, contaminacin de la muestra, o muestras tomadas muy al inicio de la enfermedad. Es importante recordar que tambin se observan recuentos bajos en IU adquiridas por va hematgena.
Epidemiologa
La prevalencia de IU vara con el sexo y la edad. En recin nacidos y lactantes son ms comunes en varones y suelen asociarse a anomalas congnitas. Ya en edad escolar predominan en mujeres, lo cual se mantiene durante la edad adulta. Algunas condiciones como el embarazo
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y la diabetes, se asocian a una mayor incidencia. En la vejez, las tasas de IU son mayores en mujeres pero se observa un aumento de los casos en hombres, asociado a enfermedades tales como pobre vaciamiento vesical debido a prolapso uterino o uropata obstructiva por enfermedad prosttica.
Flora del tracto urinario

Como se mencion en el correspondiente captulo, el tracto urinario es estril, salvo el sector distal de la uretra, que se encuentra colonizado por bacterias procedentes de piel y perineo adyacentes (Corynebacterium spp, Lactobacillus spp, S. epidermidis, enterobacterias, etc.).
Agentes etiolgicos
En la gran mayora de los casos, se trata de infecciones monomicrobianas y predominan los bacilos gramnegativos. Los agentes pueden variar segn la edad, sexo y patologa subyacente. El agente ms frecuente es Escherichia coli. En las infecciones de pacientes ambulatorios predomina E. coli, seguido de Klebsiella spp., Proteus spp. y otros bacilos gramnegativos y cocos grampositivos, como S. saprophyticus, Enterococcus spp. y Streptococcus agalactiae. Proteus spp. suele asociarse a anomalas de la va urinaria, especialmente litiasis. Ms raramente Haemophilus influenzae se asla de infecciones comunitarias. En infecciones hospitalarias, pacientes con enfermedad urolgica subyacente o portadores de sondas, la frecuencia relativa de E. coli disminuye y se aslan Pseudomonas spp., otros bacilos gramnegativos no fermentadores, enterobacterias como Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp. y levaduras. Suele tratarse adems de cepas ms resistentes a los antibiticos. Infecciones por S. aureus o Salmonella spp. indican generalmente infeccin renal metstasica en el curso de una bacteriemia. Cabe recordar que Mycobacterium tuberculosis tambin puede producir infeccin renal por va hematgena. Las IU polimicrobianas son excepcionales y se observan en sondados o pacientes con fstulas que comunican la va urinaria con intestino o vagina. Adenovirus tipo 11 causa cistitis hemorrgia epidmica, especialmente en nios varones. Chlamydia trachomatis produce uretritis que ser tratada en otro captulo. El papel de otros agentes (Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum) ha sido postulado, pero no del todo aclarado.
Patogenia
En la gran mayora de los casos, la IU es causada por microorganismos del tubo digestivo del propio paciente, que alcanzan el tracto urinario por la va ascendente. Ms raramente lo hacen por va hematgena, en el curso de una bacteriemia a partir de un foco a distancia. Una vez en la va urinaria deben ser capaces de adherirse y multiplicarse. Como en otros casos, que se desarrolle o no IU depende de los mecanismos de defensa del husped y los atributos patognicos del germen. Los mecanismos de defensa del tracto urinario son los que se enumeran a continuacin. 1. El libre flujo de orina, el vaciamiento vesical peridico, determina un lavado por arrastre que impide que grmenes con escasa afinidad por el urotelio lo colonicen. El flujo urinario comprometido de forma mecnica o funcional es la condicin predisponente ms comn en pacientes con infeccin urinaria. Esta obstruccin puede deberse a clculos, hipertrofia prosttica, etc.
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2. Normalmente, la vlvula vesicoureteral previene el reflujo de orina de la vejiga hacia sectores ms altos. Alteraciones funcionales o anatmicas de esta determinan un mayor riesgo, que se observa especialmente en la infancia. 3. La protena de Tamm Horsfall, presente en la orina, contiene numerosos residuos de manosa que inhiben competitivamente la adherencia mediada por los pili manosasensibles. 4. La mucosa intacta es tambin una efectiva barrera frente a la colonizacin. Algunas bacterias como S. saprophyticus requieren la presencia de fibras de colgeno que se exponen en la superficie luego de microtraumatismos (durante las relaciones sexuales), lo que explicara la presencia de este agente en IU en mujeres en edad genital activa. 5. Ciertas caractersticas de la orina normal como la elevada osmolaridad, el contenido de urea y el pH cido, inhiben el crecimiento bacteriano. 6. El pH cido de la vagina, determinado por la flora normal en la mujer y la actividad antimicrobiana de las secreciones prostticas en el hombre contribuyen tambin a dificultar la colonizacin perineal por potenciales patgenos. Adems de los pacientes con obstruccin al flujo de orina, se encuentran predispuestos: a) Los diabticos con descontrol metablico, la glucosuria favorece el desarrollo bacteriano. b) Embarazadas, ya que durante esa etapa existe un mayor riesgo de infeccin urinaria debido a factores mecnicos (disminucin de la capacidad vesical provocada por la expansin del tero, la presencia de hidrourter, la disminucin de la peristalsis y atona ureteral) y tambin factores hormonales que determinan cambios (metaplasia de clulas del uroepitelio, aumento del tamao renal y disminucin de la capacidad de concentrar). Eventualmente, la presencia de glucosuria, en pacientes con diabetes gestacional contribuye tambin a un mayor riesgo. Adems la asociacin de bacteriuria (sintomtica o no) con parto prematuro y bajo peso al nacer, ha sido fehacientemente demostrada, por ello se recomienda la deteccin sistemtica de la bacteriuria, como rutina de embarazo. c) Nios portadores de reflujo vesicoureteral y otras anomalas. Se estima que hasta un 50% de los nios con IU tienen reflujo. d) Pacientes con vejiga neurgena en los que el incorrecto vaciado determina orina residual vesical que se coloniza fcilmente.
Mecanismos de virulencia
Las cepas de E. coli uropatgenas (UPEC) suelen diferir de otras cepas de E. coli que integran la flora fecal y no se encuentran como agentes de IU (no uropatgenas). Cepas de UPEC demuestran una mayor capacidad de adherencia a clulas del epitelio vaginal y urinario, resistencia al poder bactericida del suero, produccin de hemolisina, y mayor produccin de antgeno capsular (antgeno K). Pertenecen adems a un limitado nmero de serogrupos (O1,O2, O4, O6, O7, O8, O9, O11, O18, O22, O25, O62 Y O75) . La adherencia es importante no solo en la infectividad, sino que ciertas cepas exhiben una mayor capacidad de producir IU altas. La adhesin est mediada por ligandos especficos que se unen a receptores del husped. Esos ligandos son pequeas protenas localizadas en los pili. Pili tipo 1: presente en muchas enterobacterias, se une a residuos mansidos presentes en las clulas del husped. Esa unin puede ser inhibida competitivamente por la manosa, por lo que
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se denominan manosa sensibles. Se cree que no son las adhesinas ms importantes. Fimbrias P: no se inhibe su unin por manosa, por lo que se denominan manosa resitentes. Son expresadas por el 90% de las cepas que causan infecciones altas. Anticuerpos anti fimbrias P impiden el desarrollo de pielonefritis en modelos animales. Otras adhesinas manosarresistentes como adhesinas X, han sido identificadas. La adhesin mediante fimbrias probablemente tambin est presente en infecciones causadas por Klebsiella spp. o S. saprophyticus. Una vez que la bacteria logra adherirse intervienen otros factores. La hemolisina, presente en cepas UPEC, sera importante en el dao celular y en lograr que exista hierro disponible para la bacteria. La aerobactina es un siderforo, protena que proporciona hierro a la bacteria. El antgeno K, como en otros casos, su cpsula inhibe la fagocitosis. La endotoxina o LPS contribuye a la inflamacin a nivel renal y a las manifestaciones sistmicas en pacientes spticos. La ureasa, producida por Proteus spp., es una enzima que desdobla la urea presente en la orina en amonio y dixido de carbono, determinando una elevacin del pH urinario. El medio ms alcalino da como resultado la precipitacin de sales de calcio y magnesio y la formacin de clculos, que a su vez sirven como reservorio de bacterias. Tambin producen ureasa aunque en menor cantidad, Klebsiella spp. y S. saprophyticus. Las cepas aisladas de pacientes con IU y patologa urolgica subyacente suelen exhibir menos atributos de virulencia.
Clsicamente la presencia de fiebre y dolor en una o ambas fosas lumbares se considera indicadora de pielonefritis, en tanto la disuria y la polaquiuria seran propias de la cisititis. Debido a diferencias teraputicas y pronsticas de las infecciones altas y bajas, se han hecho numerosos esfuerzos en intentar localizar la altura de la infeccin sin que ninguna tcnica fuera lo suficientemente prctica para su uso rutinario. Si bien los signos y sntomas pueden sugerir la localizacin de la infeccin (alta o baja), no son especficos. Es bueno entonces recordar que las manifestaciones clnicas no siempre permiten establecer un diagnstico preciso de localizacin. En base a la presencia o ausencia de condiciones subyacentes que favorezcan la infeccin es clsico clasificar a las IU en complicadas y no complicadas. Cistitis aguda: ocurre principalmente en mujeres jvenes sin patologa subyacente. Se manifiesta por ardor miccional, disuria, polaquiuria, eventualmente hematuria y dolor suprapbico. El diagnstico diferencial se debe establecer con otras causas de disuria (vaginitis y uretritis). Se estima que entre 10% y 35% de las pacientes con este cuadro clnico presentan adems infeccin renal oculta. Pielonefritis aguda no complicada: caractersticamente los pacientes se presentan con dolor en fosas lumbares, asociado a sntomas sistmicos como fiebre, vmitos, etc., pudiendo o no presentar sntomas concomitantes de cistitis. El cuadro clnico puede ser de gravedad variable, incluyendo sepsis y shock sptico. IU complicadas: en este grupo se consideran todas las infecciones en pacientes de sexo masculino y las de mujeres con factores predisponentes. Suelen presentarse de manera menos tpica, las complicaciones y las fallas teraputicas son ms frecuentes. Sndrome uretral agudo: definido como el que se presenta en mujeres jvenes que tienen disuria y piuria con urocultivos con recuentos menores a 105 ufc/ml. Este sndrome puede deberse a uretrocistitis (por E.coli, etc.) o a otras causas (vaginitis, infeccin por N. gonorrhoeae, C. trachomatis o herpes genital). De acuerdo a Stam y cols. en estas pacientes, recuentos tan bajos como 102 ufc/ml son significativos. Prostatitis: la prostatitis aguda se presenta con fiebre y dolor perineal y lumbar y dolor a la
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palpacin prosttica. Usualmente es debida a E.coli o ms raramente a N. gonorrhoeae en jvenes. La prostatitis crnica se manifiesta con sntomas menos precisos o por bacteriuria recurrente. Para el tratamiento se requieren drogas que alcancen buena concentracin en el tejido prosttico (trimetoprim-sulfa, quinolonas fluoradas) por perodos prolongados. IU en el paciente sondado: luego de colocada la sonda, la probabilidad de desarrollar bacteriuria aumenta con los das de permanencia. Habitualmente el paciente est asintomtico. Sin embargo, la bacteriuria asociada a sonda vesical constituye una causa muy importante de infeccin hospitalaria y bacteriemia por gramnegativos. Los grmenes ingresan a la va urinaria en el momento de la insercin de la sonda, por va periuretral o bien contaminando el sistema de drenaje. Por ello, las medidas de prevencin ms importantes son extremar las medidas de antisepsia al colocar la sonda, preferiblemente por personal bien entrenado, maximizar la higiene del rea perineal y del meato uretral y mantener el sistema colector cerrado.
Diagnstico de laboratorio
Pruebas de tamizaje: son pruebas rpidas, que permiten una orientacin inicial; es conveniente realizarlas en orina de chorro medio. Estearasas leucocitarias: son enzimas presentes en leucocitos, indican piuria, en general asociada a infeccin urinaria, pero que tambin pueden obedecer a otras causas. Un resultado positivo se correlaciona con la presencia de ms de 10 leucocitos por campo. Pueden presentar falsos positivos debido a albuminuria, cido ascrbico, detergentes, o bien inflamacin de otra causa o contaminacin con secreciones vaginales. Los falsos negativos se deben a la presencia de menos de 10 piocitos por campo y demoras en el procesamiento (luego de 3 horas 35% pasan a ser negativos) Prueba de nitritos: presentes en la orina por la reduccin de nitratos a nitritos ocasionada por bacterias nitratorreductasa positvas (Enterobacteriaceae). Falsos positivos pueden ser debidos a demoras en el transporte, sobrecrecimiento bacteriano, ciertas drogas, etc.; falsos negativos se ven en infecciones causadas por Enterococcus spp. y otros grmenes nitratorreductasa negativos, y en pacientes con dieta con escasos nitratos. La realizacin simultnea de estos dos test (disponibles en tiras reactivas comerciales) tiene una sensibilidad y especificidad elevadas si se los compara con recuentos de 105 colonias por ml de orina, pero la sensibilidad es menor para recuentos ms bajos.
UROCULTIVO
Es el cultivo de la orina, que debe ser obtenida en condiciones especiales para evitar la contaminacin con flora de la uretra distal y el perineo. El mtodo elegido para la toma de la muestra depender del paciente. Como en todo estudio microbiolgico se deben recordar ciertas premisas bsicas. La muestra debe provenir del sitio de infeccin. Se debe evitar la contaminacin con flora normal adyacente. Recoger la muestra previo a la administracin de antimicrobianos. Adjuntar boleta con datos del paciente, datos clnicos y forma de obtencin. No enviar muestras en colectores, mal tapadas, sucias o derramadas.
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OBTENCIN DE LA MUESTRA
Para urocultivo se prefiere utilizar como contenedor un frasco estril, boca ancha, tapa de rosca, correctamente rotulado. a) Chorro medio: es un mtodo no invasivo que consiste en recoger la porcin media del chorro de orina emitida en forma espontnea, descartando la porcin inicial para eliminar la flora. Es preferible la primera orina de la maana o al menos tres horas de retencin (orina preincubada). Se debe indicar al paciente lavar la zona genital con abundante agua y jabn, enjuagarse con abundante agua, comenzar a orinar descartando el primer chorro, sin detener la miccin recoger nicamente la parte media del chorro de orina en el frasco sin tocar la piel, cerrar bien el frasco, rotularlo. Si el procedimiento no se realiza correctamente, la orina se contaminar y el examen deber repetirse. Los cultivos de orina polimicrobianos suelen indicar contaminacin. Significan una prdida, ya que aumentan los costos de la atencin mdica y retrasan la teraputica. La cooperacin del paciente mejora los resultados, para ello se le deben brindar instrucciones por escrito, en forma clara y sencilla, especialmente para pacientes ambulatorios. Esto evita el uso de tcnicas de recoleccin invasivas, disminuye las repeticiones y mejora el tiempo de devolucin del resultado. Los servicios con porcentajes elevados de repeticin de urocultivos deben revisar su tcnica de recoleccin. En algunos pacientes se presentan dificultades. En lactantes y nios sin control de esfnteres se debe esperar a que el nio orine, (recoleccin al acecho), a veces son necesarias dos muestras. De todos modos, la muestra obtenida mediante bolsas colectoras se desaconseja debido a que se contamina con facilidad. En embarazadas: en el ltimo trimestre por el aumento de la altura uterina y la mayor frecuencia de la miccin son frecuentes estudios contaminados. En pacientes ancianos, que no colaboran o que tienen patologa de cadera, etc. b) Puncin suprapbica: constituye el patrn de oro, ya que se obtiene la muestra directamente de la vejiga, es relativamente sencilla en lactantes menores de un ao. Realizada por un mdico entrenado presenta escasas complicaciones. Especialmente indicada en nios graves, urocultivos anteriores no concluyentes, diarrea, vulvitis, etc. La desventaja es que se trata de un mtodo invasivo. Las ventajas son que permite documentar infecciones con bajo recuento bacteriano e infecciones por anaerobios (muy raras). c) Cateterizacin vesical: la colocacin de sonda vesical con el nico fin de obtener una muestra para urocultivo se desaconseja, debido al riesgo de infeccin ascendente iatrognica. Debe reservarse para indicaciones puntuales y ser realizada por personal bien entrenado. d) Puncin de sonda vesical: en pacientes sondados se puede obtener orina pinzando la sonda y luego puncionando con jeringa y aguja por encima, previa desinfeccin de la sonda. Debido a que los pacientes sondados a permanencia desarrollan invariablemente colonizacin de la sonda y bacteriuria, estos urocultivos son de muy escaso valor. e) Diagnstico de tuberculosis: la tuberculosis renal es paucibacilar, por lo que se requieren cinco muestras de orina de chorro medio, recogidas en das sucesivos, con volumen no menor a 50 ml, que ser concentrado mediante centrifugacin. Luego se realizarn coloraciones y siembra en medios adecuados.
TRANSPORTE Y CONSERVACIN DE LA MUESTRA
Como en todos los casos, es preferible enviar la muestra al laboratorio de inmediato, dentro de las dos horas, de lo contrario mantenerla refrigerada (4C a 8 C) no ms de 24 horas, para no alterar el recuento bacteriano.
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PROCESAMIENTO INICIAL
La interpretacin del urocultivo por chorro medio implica un resultado cuantitativo, por lo que es elemental sembrar un volumen conocido de orina. Esto se logra mediante el uso de ansas bacteriolgicas calibradas que cargan un volumen conocido; por ejemplo 10 o 100 microlitros. El nmero de colonias obtenidas (unidades formadoras de colonias) es luego multiplicado por el nmero de veces que el inculo entra en 1 ml. Medios de cultivo empleados: deben permitir el desarrollo de los patgenos ms frecuentes. Se usan en general agar sangre ovina (medio no selectivo, permite apreciar caractersticas coloniales, determinar la hemlisis, etc.) en combinacin con agar Mac Conkey lactosa (selectivo y diferencial para bacilos gramnegativos no exigentes). Tambin agar CLED (agar cistena lactosa, deficiente en electrolitos) es un medio diferencial que inhibe el hauch de Proteus spp. Las placas son incubadas en atmsfera aerobia y examinadas a las 24 y 48 horas.
INTERPRETACIN DEL UROCULTIVO
Para el caso de pacientes con sntomas es suficiente con una muestra por chorro medio para la interpretacin del estudio, y es por ello que se considera imprescindible contar con el dato clnico. Pueden requerirse muestras repetidas para el diagnstico de pacientes asintomticos. La especificidad aumenta al repetir la muestra.
N de cultivos 1 muestra 2 muestras 3 muestras Especificidad 85% 95% 100%
Es fundamental saber como se recolect la muestra (chorro medio, puncin suprapbica, puncin de sonda vesical, etc.), si el paciente tena o no sntomas, el volumen sembrado y si se aisla un probable patgeno urinario o un contaminante. Recuento de bacterias por volumen de orina: se considera en la orina obtenida por chorro medio; en la orina de puncin vesical todo recuento es significativo. Si se siembran 100 microlitros (ansa 0,1 ml), se multiplica por 10 (cada colonia representa 10 colonias/ml). Si se usa un ansa de 10 microlitros (0.01 ml) cada colonia representa 100 por ml de orina.
Recuento > 10 ufc/ml, 1 o 2 probables patgenos > 103 ufc/ml 1 probable patgeno Tres o ms organismos > 102 ufc/ml probable patgeno (1 o ms grmenes)
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Dato clnico Sintomtico Sintomtico Sexo masculino
Muestra Chorro medio, sonda vesical Chorro medio, sonda vesical Chorro medio, sonda vesical Puncin suprapbica, nefrostoma, cistoscopia
Conducta Identificacin Antibiograma Identificacin Antibiograma Ninguno, repetir Identificacin Antibiograma
Tabla adaptada de: Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology
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Principios generales de teraputica antimicrobiana

El tratamiento antimicrobiano de las infecciones urinarias se basa en los siguientes principios. Las drogas a utilizar deben alcanzar buena concentracin en orina. En la infeccin urinaria no complicada, el xito teraputico se correlaciona con la concentracin inhibitoria alcanzada en orina, ms que en plasma. Algunas drogas son solamente bacteriostticas o activas exclusivamente en el tracto urinario. Las ms empleadas son quinolonas, algunos betalactmicos, trimetoprim sulfa, nitrofurantona y aminoglucsidos. El tratamiento emprico es en general necesario, hasta obtener el resultado del urocultivo. (habitualmente 48 horas). Se deben elegir drogas cuyo espectro cubra los posibles agentes etiolgicos, con menores efectos txicos, con menor costo y con mnimo efecto sobre la flora normal. Adems se deben conocer datos epidemiolgicos de sensibilidad y resistencia a nivel local. La duracin del tratamiento en la cisititis actualmente se acepta debe ser no menor a tres das. Planes teraputicos de menor duracin tienen una tasa inaceptable de recada. De acuerdo a la gravedad del cuadro clnico, la pielonefritis puede requerir hospitalizacin o ser tratada en forma ambulatoria. La duracin no debe ser menor a 14 das. Es imprescindible realizar urocultivo. Bacteriuria asintomtica: existe evidencia de que el tratamiento es necesario en embarazadas, nios y pacientes con neutropenia o trasplante renal. Para adultos fuera del embarazo, especialmente los sondados, no hay evidencia de que el tratamiento de la bacteriuria asintomtica sea beneficioso.
Bibliografa
Kunin CM. Urinary Tract Infections: Detection, Prevention and Management. 5th. Edition. 1997. Williams & Wilkins Isenberg H. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 1992. American Society for Microbiology Press Koneman E. Diagnstico Microbiolgico, Atlas Color y Texto 5ta. ed. 1999 Editorial Medica Panamericana. Weissfeld A. Cumitech 2B: Laboratory Diagnosis of Urinary Tract Infections. 1998. ASM Press.
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Bacteriemias y sepsis. Endocarditis

M. Macedo, G. Algorta, M. Vola, L. Pardo
Definiciones
Clsicamente se ha definido como sepsis a la respuesta inflamatoria sistmica frente a una infeccin. En los ltimos aos, a medida que se ha ido dilucidando la patogenia de esta entidad, han surgido nuevos trminos para describir sus diferentes estados, lo que ha resultado en denominaciones confusas que es preciso aclarar para comprender cuando nos encontramos frente a un paciente con sepsis. Bacteriemia: simplemente implica la presencia de bacterias en la sangre, independientemente de su magnitud, persistencia o respuesta que provoca en el husped. Se encuentran tres patrones diferentes: 1) transitoria, la que ocurre luego de la manipulacin de tejidos infectados (abscesos, fornculos, celulitis), instrumentacin sobre superficies mucosas infectadas (extraccin dentaria, cistoscopia, cateterizacin ureteral, aborto aspirativo) y ciruga de sitios contaminados; 2) intermitente, debida a abscesos intraabdominales o viscerales no drenados, osteomielitis, artritis, meningitis, neumonia; 3) continua, es la caracterstica principal de la endocarditis bacteriana y otras infecciones endovasculares. Tambin se observa en las primeras semanas de la fiebre tifoidea y brucelosis. Otro patrn se observa en pacientes que estn recibiendo antibiticos por va sistmica, para los cuales el microorganismo infectante es sensible (breakthough bacteriemia): cuando ocurre en etapas tempranas de la teraputica se debe generalmente a concentraciones inadecuadas del antibitico, y cuando ocurre ms tardamente se debe habitualmente a inadecuado drenaje del foco infeccioso o deterioro de las defensas del husped. Sndrome de respuesta inflamatoria sistmica (SIRS): es un sndrome que se define por la presencia de por lo menos dos de las siguientes manifestaciones: 1) fiebre mayor a 38C o hipotermia menor a 36C; 2) frecuencia cardaca mayor a 90 cpm; 3) frecuencia respiratoria mayor a 20 rpm, o pCO2 menor a 32 mm de Hg; leucocitosis mayor a 12.000 o menor a 4.000/mm3; o ms de 10% de formas inmaduras. Este sndrome pude obedecer a causas infecciosas o no infecciosas (traumas, quemaduras, etc.). Sepsis: es un SIRS que responde a una infeccin; por lo tanto, SIRS es una entidad amplia que incluye a la sepsis. Los pacientes con sepsis renen los cuatro criterios de SIRS; esta forma de identificar clnicamente a los pacientes con sepsis es bastante sensible, sin embargo es muy poco especfica. La comprobacin de bacteriemia en un paciente con SIRS sella el diagnstico de sepsis.
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Shock sptico: es la situacin de sepsis asociada a hipotensin, pese a una adecuada reposicin de fluidos. Septicemia: es un trmino que ha cado en desuso pero que algunos autores todava utilizan, refirindose a un sndrome severo asociado con evidencia de infeccin aguda y falla orgnica relacionada con la liberacin de mediadores del tipo de las citoquinas en la circulacin. Estas definiciones surgidas de un consenso en el ao 1991, son discutidas por varios investigadores, quienes consideraban que estos trminos son demasiado amplios y poco especficos para la gran heterogeneidad de pacientes que son clasificados de acuerdo a las mismas. Dichos autores sugieren una revisin planteando que el principal defecto radica en que las definiciones describen sndromes clnicos ms que procesos fisiopatolgicos y que por ese motivo las estrategias teraputicas no tienen el mismo efecto en todos los pacientes clasificados dentro de una misma definicin.
Importancia
La sepsis es una de las principales causas de muerte en unidades de cuidado intensivo; la mortalidad vara entre 20% y 90%, dependiendo de factores como los siguientes. Tratamiento antibitico instituido. Microorganismo responsable: se atribuye mayor mortalidad a la sepsis causada por Enterococcus, bacterias gramnegativas y hongos. Edad: los pacientes mayores de 40 aos son los de mayor riesgo. Foco infeccioso primario: es mayor cuando el foco es respiratorio; le siguen en orden decreciente de mortalidad el origen cutneo, abdominal, desconocido y urinario. Entorno en el que se adquiere la infeccin: la de origen nosocomial conlleva mayor mortalidad que la comunitaria. Magnitud de la bacteriemia. Naturaleza de la bacteriemia: la bacteriemia polimicrobiana es muy poco frecuente pero mucho ms grave que la monomicrobiana. Presencia de enfermedades subyacentes y su severidad. Complicaciones de la sepsis: principalmente shock y su severidad. Sin duda, el reconocimiento temprano y su tratamiento antes de llegar a la etapa de shock, es de fundamental importancia para reducir la mortalidad. El diagnstico de laboratorio de sepsis plantea una serie de problemas que se discutirn posteriormente.
Etiopatogenia
La sepsis puede tener origen en infecciones bacterianas, virales, fngicas y parasitarias. En la era preantibitica, los microorgansimos gramposistivos eran los principales responsables. En el inicio de la era antibitica comenzaron a observarse bacteriemias por gramnegativos que incluso superaron en nmero a las causadas por grampositivos. En los ltimos tiempos asistimos a la reemergencia de grmenes grampositivos como importantes agentes de sepsis. El cambio fundamental que se observ en la dcada de los 90 es el aumento dramtico en la incidencia de Staphylococcus coagulasa negativos como agentes significativos de bacteriemia; esto ha generado dificultades en la interpretacin de los hallazgos de laboratorio, ya que la mayora de ellos contina representando contaminaciones ms que
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bacteriemias verdaderas. Los principales agentes de bacteriemia encontrados entre los aos 1992 y 1993 en Estados Unidos son: S. aureus, E. coli, Staphylococcus coagulasa negativos, K. pneumoniae, Enterococcus spp., P . aeruginosa, S. pneumoniae, Streptococcus del grupo viridans y E. cloacae. En trminos generales, las condiciones que predisponen a bacteriemia y fungemia incluyen: Edad extrema: los recin nacidos prematuros presentan especial riesgo. Enfermedades subyacentes, principalmente neoplasias hematolgicas y no hematolgicas, diabetes, insuficiencia renal en etapa de dilisis, cirrosis heptica, sndromes de inmunodeficiencia y condiciones que alteran la barrera cutnea (quemaduras graves, lceras por decbito). Procedimientos invasivos como la colocacin de catteres, sobre todo vasculares, ciruga de cualquier tipo, pero sobre todo del tracto digestivo y genitourinario, endoscopia gastrointestinal o genitourinaria. Medicacin: frmacos inmunosupresores (corticoides, citotxicos); tratamiento con antibiticos excesivo o inadecuado. Aunque es imposible predecir clnicamente el tipo de germen que causa la sepsis, el conocimiento de factores favorecedores puede orientar a microorgansimos de particular importancia. Por ejemplo: en pacientes esplenectomizados son frecuentes por grmenes encapsulados (S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis); en cirrticos son frecuentes enterobacterias, vibrios, grmenes encapsulados; en diabticos se ve Pseudomonas spp., S. aureus, Candida spp.; en alcohlicos predominan Klebsiella pneumoniae, S. pneumoniae; en neutropnicos son comunes enterobacterias, S. aureus, Pseudomonas spp., Candida spp.; en pacientes tratados crnicamente con esteroides se observan Mycobacterium spp., hongos, Herpesvirus. Mediadores de la respuesta inflamatoria: la respuesta sistmica del organismo a una agresin como la infeccin involucra una complicada cascada de eventos que culminan en compromiso hemodinmico y dao orgnico. La inflamacin localizada representa un intento del organismo de contener estos mecanismos ofensivos. Cuando la respuesta inflamatoria ya no puede ser contenida y los mecanismos de regulacin se ven superados pueden tener lugar complicaciones sistmicas como la sepsis. Las toxinas bacterianas tienen un rol preponderante en el desarrollo de sepsis. En las bacterias gramnegativas el lipopolisacrido (LPS), que se localiza en la membrana externa de la pared celular, tiene actividad endotoxina y es el componente vinculado a la sepsis por estas bacterias. El LPS posee tres constituyentes: antgeno O, core polisacrido y un fosfolpido en base a glucosamina llamado lpido A; este ltimo posee la principal actividad txica del complejo LPS. Cuando las bacterias gramnegativas invaden el torrente sanguneo y ocurre su destruccin, el LPS es liberado y se une a una protena fijadora de LPS (LBP). El complejo LPS-LBP adhiere a un receptor de macrfagos unido a la membrana denominado CD14. Este mecanismo dispara la liberacin de una cascada de mediadores inflamatorios farmacolgicamente activos por parte de las clulas del husped. Se cree que los ms importantes dentro de estos mediadores son el factor de necrosis tumoral alfa (alfa-TNF) y la interleuquina-1 (IL-1), pero tambin estn involucrados el factor de activacin plaquetaria, leucotrienos, otras interleuquinas y varias molculas de adhesin celular. Las cascadas del complemento y la coagulacin son afectadas por la endotoxina a travs de la activacin del factor Hageman (factor XII). El resultado final de la activacin de los mediadores de la sepsis es el compromiso hemodinmico y la falla orgnica. El alfa-TNF y las interleuquinas afectan el metabolismo
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del cido araquidnico resultando en la produccin de leucotrienos, tromboxano A2 y prostaglandinas que aumentan la permeabilidad vascular y provocan vasodilatacin. Adems se cree que el TNF es un buen depresor miocrdico. El xido ntrico es liberado por macrfagos y clulas endoteliales, cuya produccin es inducida por la endotoxina, siendo un potente vasodilatador. Los neutrfilos estimulados liberan enzimas y radicales de oxgeno que aumentan el compromiso vascular y tisular. La agregacin plaquetaria y la activacin de las cascadas de la coagulacin y el complemento conducen a la coagulacin intravascular diseminada. Los cidos teicoicos de la pared celular grampositiva tienen la propiedad de unirse a la LBP e inducir sepsis. Algunas exotoxinas tambin pueden desencadenar una respuesta inflamatoria sistmica, por ejemplo la toxina del shock txico por S. aureus.
Diagnstico de bacteriemia
El diagnstico de laboratorio de bacteriemia se realiza mediante hemocultivo. Se denomina hemocultivo a la cantidad de sangre que se extrae de un nico sitio de venopuncin; este volumen de sangre se inocula en uno o ms frascos de cultivo y constituye una muestra. Existen muchos mtodos de hemocultivo, desde el mtodo manual convencional, hasta modernos mtodos automatizados que son los ms utilizados hoy en da. En todos ellos se deben tener en cuenta una serie de condiciones estandarizadas que permiten obtener resultados interpretables.
PROCEDIMIENTO DE RECOLECCIN Y TRANSPORTE
Siempre que sea posible, la sangre para hemocultivo debe ser extrada por puncin de vena perifrica y no a travs de catteres vasculares. Antes de realizar la venopuncin se debe realizar la correcta antisepsia de la piel y la desinfeccin de los tapones de los frascos de hemocultivo. La venopuncin puede realizarse de varias maneras, pero se desaconseja la extraccin directa en el frasco de cultivo, ya que el efecto de vaco puede provocar la aspiracin de un volumen mayor del deseado, y adems existe riesgo de reflujo del caldo de cultivo hacia la vena del paciente. Aunque es discutido, en general se recomienda no cambiar la aguja para inocular el frasco de hemocultivo, ya que no se ha demostrado que disminuya el porcentaje de contaminaciones y aumenta el riesgo de accidentes laborales. Las muestras deben enviarse al laboratorio lo antes posible. Pueden permanecer a temperatura ambiente por cortos perodos de tiempo; nunca se deben refrigerar.
NMERO DE CULTIVOS
Con volmenes de sangre apropiados, dos o tres muestras de hemocultivo son suficientes para detectar la mayora de los episodios de bacteriemia (ms del 95%). En endocarditis con dos muestras se obtiene el germen en un 98% de las situaciones, si el paciente no ha recibido antibiticos. Este nmero de hemocultivos es adecuado para distinguir entre contaminantes y bacteriemias verdaderas, y se ha demostrado que un nmero mayor no tiene mejor rendimiento en este sentido, ya que habitualmente el 3% al 5% de los hemocultivos se contaminan. La obtencin rutinaria de ms de tres hemocultivos es costosa, aumenta innecesariamente el trabajo y contribuye a la anemia en los pacientes hospitalizados.
TIEMPO E INTERVALO DE LA TOMA DE MUESTRAS
Cuando la bacteriemia es intermitente, el episodio bacterimico precede en 30 a 90 minutos
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al pico febril. Por este motivo, idealmente la sangre debera recolectarse durante la hora previa al ascenso de temperatura esperado. En la prctica esto es muy difcil de prever y en general no se considera el ascenso de la temperatura. En cuanto al intervalo, no se han demostrado diferencias de rendimiento entre la toma de muestras separadas por perodos arbitrarios de tiempo y las realizadas simultneamente. Debido a que los hemocultivos deben realizarse siempre que sea posible antes de iniciar la teraputica antibitica, ya que en muchos casos los sistemas automatizados ms nuevos pueden detectar desarrollo bacteriano en pocas horas, parece ms conveniente realizar dos a tres tomas en la primer hora, para evitar el retraso diagnstico y teraputico y adecuarlo a las condiciones clnicas y logsticas. Existen recomendaciones especficas para algunas situaciones particulares: frente a la sospecha de endocarditis infecciosa se deben obtener 3 hemocultivos en las primeras 24 hs de evaluacin; si a las 24 hs estos son negativos se obtendrn 2 ms. Si el paciente ha recibido antibiticos las dos semanas previas, se recomienda realizar dos muestras de hemocultivo por da durante tres das. Ante un cuadro de fiebre de origen desconocido se obtendrn 2 hemocultivos inicialmente; a las 24 a 36 hs se realizarn 2 o ms inmediatamente antes del ascenso trmico esperado, realizando 4 muestras en 48 horas.
VOLUMEN DE SANGRE POR FRASCO
Es una variable crtica en relacin al rendimiento de la recuperacin microbiana, especialmente en pacientes adultos en quienes la bacteriemia es generalmente de escasa magnitud (tpicamente <10 ufc/ml y frecuentemente <1 ufc/ml), aunque tambin en nios, los que habitualmente presentan bacteriemias >5 ufc/ml y muchas veces >100 ufc/ml. En adultos, cada mililitro de sangre adicional aumenta la recuperacin microbiana en un 3% a 5%. Los volmenes de sangre recomendados para cada muestra de hemocultivos son 20 a 30 ml en adultos, siendo 10 ml el lmite inferior aceptado; en nios 1 a 5 ml son suficientes, y volmenes mayores no son recomendados debido a la menor volemia que poseen.
RELACIN SANGRE-CALDO DE CULTIVO
Respetando los volmenes de sangre recomendados, se considera apropiado una relacin sangre/caldo entre 1:5 y 1:10. Diluciones mayores o menores disminuyen la posibilidad de recuperacin de bacterias, las primeras por excesiva dilucin de los microorganismos y las segundas por insuficiente dilucin de factores inhibidores naturales y agentes antibacterianos presentes en la sangre.
MEDIOS DE CULTIVO Y ANTICOAGULANTE
El medio de cultivo utilizado deber soportar el desarrollo de la mayora de los microorganismos potencialmente involucrados en cuadros clnicos bacterimicos. En general la mayora de los medios disponibles comercialmente tienen esta propiedad. Se usa frecuentemente polyanethol sulfonato de sodio (PSP) a una concentracin de 0.023% al 0.03%, como anticoagulante que posee adems actividad anticomplementaria, antifagoctica e interfiere con la accin de algunos antimicrobianos. Su accin antibacteriana sobre algunos microorganismos es inhibida por el agregado en el medio de gelatina al 1.2%.
DURACIN DE LA INCUBACIN
Cuando se utilizan mtodos manuales se recomienda incubar por siete das. Con los mtodos automatizados, la mayora de los microorganismos clnicamente importantes se recuperan en las primeras 48 a 72 hs y generalmente no existen diferencias de rendimiento entre 5 y 7 das
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de incubacin. Situaciones especiales requerirn tiempos mayores de incubacin. Adems, en general los grmenes cuyo desarrollo se detecta despus del 5 da son finalmente considerados contaminantes, y aunque no lo fueran, un hallazgo tan tardo no afectar en gran medida la evolucin del paciente.
Sistemas de hemocultivo Manuales Mtodo Convencional Indicador de desarrollo Turbidez Hemlisis Presencia de colonias en el caldo (sedimento o superficie) Produccin de gas Turbidez Hemlisis Presencia de colonias en el caldo o medio slido Produccin de gas Desarrollo en medio slido Produccin de gas Mecanismo de deteccin Observacin macroscpica Subcultivos ciegos
Bifsico
Observacin macroscpica
Lisis-centrifugacin Isolator. Wampole Manomtrico
Observacin macroscpica Observacin macroscpica (desplazamiento de lquido en el reservorio) Subcultivos ciegos Radiomtrico Colorimtrico Colorimtrico
Automatizados
BACTEC radiomtrico BACTEC colorimtrico
Produccin de CO2+ Produccin de CO2 Produccin de CO2
Automatizados Monitorizacin continua
BacT/Alert
BACTEC 9000 DIFCO ESP BioMerieux vital
Produccin de CO2 Produccin o consumo de gas Produccin de CO2
Fluoromtrico Transductor de presin Fluoromtrico
Procesamiento: existen diferentes mtodos. a) Mtodos manuales: los frascos deben ser examinados con una frecuencia diaria o mayor en busca de evidencia macroscpica de desarrollo. La realizacin de tincin de Gram o subcultivos a las 6 a 18 hs de incubacin es til para la deteccin temprana de microorganismos. Los hemocultivos que no muestren evidencias de desarrollo en 48 a 72 hs deben ser subcultivados por lo menos en aerobiosis. Los subcultivos a ciegas o terminales son de limitado valor, particularmente cuando la tincin de Gram no revela la presencia de microorganismos. b) Mtodos automatizados: no requieren la realizacin de subcultivos hasta que el sistema no indica desarrollo. Para cualquier sistema, la seleccin de medios para subcultivo debe basarse en la morfologa encontrada por tincin de Gram. El valor de incubar un set de
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placas en anaerobiosis cuando el Gram revela un morfotipo nico en ambas botellas una aerobia y otra anaerobia de la misma muestra es discutido. No existen procedimientos estandarizados para la identificacin de microorganismos directamente del caldo de hemocultivo. Sin embargo, algunos de ellos se han realizado exitosamente, por ejemplo: solubilidad en bilis, hidrlisis de PYR, DNAsa y pruebas de tipificacin por aglutinacin con partculas de ltex. As mismo, el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) no tiene estipulado pruebas directas de sensibilidad antibitica del caldo, pero algunos investigadores han establecido pautas con resultados variables dependiendo del agente microbiano, el antibitico testado y el mtodo utilizado. La identificacin y determinacin de sensibilidad antibitica por tcnicas de hibridacin o amplificacin de ADN a partir de hemocultivos es posible pero poco prctica y costosa.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Los microorganismos aislados de hemocultivos se pueden clasificar en tres categoras: los que casi siempre (>90%) representan una verdadera bacteriemia, como es el caso de S. aureus, S. pyogenes, E. coli, otras enterobacterias, P . aeruginosa, S. pneumoniae, C. albicans; los que raramente representan verdadera bacteriemia (<5%), por ejemplo Corynebacterium spp., Bacillus spp., Propionibacterium acnes; los de difcil interpretacin, como Streptococcus viridans, Enterococcus y Staphylococcus coagulasa negativo. Para estos casos se han desarrollado diversas estrategias que ayudan a su interpretacin, de las cuales la nica de valor es el hallazgo de un mismo germen en ms de una muestra de hemocultivo; esto implica, como mnimo, la identificacin de hasta el nivel de especie y la determinacin del patrn de susceptibilidad antibitica del germen encontrado en cada frasco de hemocultivo. En cambio, no se debe atribuir significado al aislamiento de un germen en ms de un frasco en una misma muestra de hemocultivo; en este caso la positividad corresponde a un nico hemocultivo, lo que para el caso de este grupo de grmenes, sugiere fuertemente que se trate de un contaminante. Se trata tambin de un contaminante cuando hay una nica muestra de la serie con desarrollo polimicrobiano o cuando el microorganismo aislado del hemocultivo es diferente del aislado en el sitio primario de infeccin, as como cuando el diagnstico clnico de sepsis no se ha mantenido en la evolucin del paciente.
CONDICIONES ESPECIALES (MICROORGANISMOS QUE REQUIEREN MEDIDAS ESPECIALES PARA SU DESARROLLO Y DETECCIN)
En algunas ocasiones debe considerarse la posibilidad de bacterias exigentes e inusuales como causa de bacteriemia, sobre todo en casos de endocarditis con hemocultivos convencionales repetidamente negativos, en casos de fiebre de origen desconocido o en infecciones focales con sospecha de sepsis en las cuales el patgeno no se ha identificado mediante los mtodos habituales. Algunas bacterias de inters dentro de este grupo son: Brucella spp., Campylobacter spp., bacterias del grupo HACEK (Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens y Kingella kingae), Legionella spp., Mycoplasma spp., variantes nutricionales de Streptococcus, bacterias con pared celular deficitaria, Francisella tularensis, Leptospira spp, Bartonella spp. Para algunas de ellas existen mtodos automatizados comerciales; para otras se requieren condiciones particulares de incubacin o perodos de incubacin ms prolongados. Bacterias anaerobias El espectro de bacterias anaerobias asociado a bacteriemias es estrecho. Bacteroides cons-
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Germen Brucella spp.
Mtodos disponibles Procedimientos recomendados Mtodo manual bifsico de castaeda: los frascos tienen atmsfera con 5% a 10% de CO2; se examinan macroscpicamente cada 48 hs; se incuban 30 das antes de considerarlos negativos. Otros mtodos: BACT/ALERT, lisis-centrifugacin, radiomtricos, etc. No hay mtodo ni recomendaciones especficas para su aislamiento. Se ha aislado en algunos mtodos comerciales (BACTEC, Septic-Check, lisis-centrifugacin), solo en aerobiosis, pero no se ha determinado el mtodo mas sensible. Probablemente lo mejor sea utilizar medios suplementados y realizar subcultivos. No hay mtodo especfico para su recuperacin. Se requiere medios de cultivo especiales, incubacin prolongada (2 a 4 semanas) y subcultivos terminales. Son muy pocos los casos documentados de bacteriemia por esta bacteria. Se cree que los medios de hemocultivo convencionales permiten su desarrollo pero requiere subcultivos en medios suplementados. Puede desarrollar en los medios convencionales con agregado de gelatina para neutralizar el efecto inhibitorio del SPS. Desarrollan en los medios de hemocultivo convencionales pero requieren suplemento de piridoxal-HCl en los medios de subcultivo. Raramente aislados de sangre. Los medios osmticamente estabilizados mediante el agregado de sacarosa o manitol permiten su desarrollo, pero debido a que estos medios tambin son beneficiosos para el desarrollo de algunas bacterias con su pared celular intacta, la recuperacin de un microorganismo no necesariamente significa que este se encontraba presente en la sangre como una variante de pared celular deficitaria. La sangre es una buena muestra para el diagnstico de tularemia por que la bacteria solo est presente en la sangre durante la fase aguda. Para su recuperacin puede utilizarse un medio suplementado con cistena o el sistema radiomtrico BACTEC. En cualquier caso se requiere una incubacin de por lo menos 14 das y subcultivos a ciegas en medio enriquecido cada 3 a 5 das. Solo puede recuperarse de la sangre durante la primer semana de la enfermedad. Deben utilizarse medios con suero de conejo o albmina. Se deben incubar en oscuridad, en forma aerobia y a 28C a 29 C por 4 a 6 semanas. Se debe realizar examen en microscopio de campo oscuro o de contraste de fase semanalmente. Se pueden aislar por mtodos de lisis-centrifugacin.
Campylobacter spp.
HACEK
Legionella spp.
Mycoplasma spp. Variantes nutricionales de Streptococcus Bacterias con pared celular deficitaria
Francisella tularensis
Leptospira spp.
Bartonella spp.
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tituye el gnero ms frecuentemente encontrado (45% a 75%), siendo B. fragilis la especie predominante; le siguen en frecuencia los gneros Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Clostridium, Propionibacterium y Peptostreptococcus. A partir de los aos 70 ha disminuido el porcentaje de aislamientos de bacterias anaerobias en hemocultivos, lo cual llev a cuestionar la necesidad de inocular rutinariamente frascos en anaerobiosis y a proponer, en cambio, la inoculacin de un segundo frasco en aerobiosis, por muestra de hemocultivo. Incluso algunos investigadores han sugerido que no es importante el reconocimiento microbiolgico de estos grmenes, puesto que es posible reconocer estas infecciones clnicamente y tratarlas adecuadamente. Sin embargo, discontinuar los hemocultivos anaerobios no se recomienda por varios motivos; en algunos lugares el porcentaje de bacteriemias por anaerobios permanece elevado, la inoculacin en anaerobiosis puede mejorar la recuperacin de algunos microorganismos que no son anaerobios estrictos (ej: Streptococcus spp.) y, finalmente el uso de ms de un frasco por muestra de hemocultivo, asegura que se obtendr un volumen adecuado de sangre para estudio. Mycobacterium La realizacin de hemocultivos para aislamiento de este gnero se restringe a los pacientes portadores de VIH, particularmente cuando se encuentran en etapa SIDA, pero tambin se han encontrado especies de Mycobacterium en pacientes con otras condiciones inmunosupresoras (neoplasias, terapia crnica con corticoides o citotxicos, diabetes, etc.). La mayora de las infecciones diseminadas por esta bacterias se deben al complejo Mycobacterium avium y a M. tuberculosis, aunque ocasionalmente se ha aislado M. fortuitum, M. chelonei y M. genavense. Desde el inicio de la epidemia de VIH se han ensayado una serie de sistemas de hemocultivos para el aislamiento de estas bacterias. Los mtodos de lisis-centrifugacin fueron de gran utilidad durante mucho tiempo y an se continan usando, aunque actualmente existen sistemas automatizados (BACTEC) ms sencillos y de menor riesgo para el operador que tienen similar rendimiento. El tiempo de deteccin de desarrollo vara entre 3 y 24 das para cualquiera de estos mtodos, y la variable ms importante en la recuperacin del germen parece ser su concentracin en la sangre. Virus No se ha definido con claridad el nmero, volumen e intervalo de obtencin de hemocultivos por virus. El agente que se busca aislar con mayor frecuencia es Citomegalovirus, debido a que la viremia se considera el parmetro de mayor correlacin con infeccin clnicamente significativa en rganos slidos y en receptores de trasplantes de mdula sea. Hongos Existe gran variedad de mtodos para su recuperacin a partir de sangre. En la prctica la mayora de los sistemas aerobios de hemocultivos son aptos para el desarrollo de Candida spp. Para otros hongos se recomienda el mtodo de lisis-centrifugacin. Los hemocultivos para hongos deben incubarse a 22C a 30C por un perodo de por lo menos 4 semanas antes de considerarlos negativos.
EVALUACIN DE LA SEPSIS A PARTIR DE CATTERES INTRAVASCULARES
Muchos mtodos han sido propuestos para determinar en qu medida un catter intravascular puede ser el origen de un episodio de bacteriemia o fungemia. Se destacan: microscopia directa, cultivos de la piel del sitio de entrada del catter, cultivos semicuantitativos de la
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punta del catter, caldos de cultivo cuantitativos, hemocultivos de sangre perifrica y cultivos cuantitativos de sangre extrada a travs del catter. El mtodo ms utilizado es el de Maki, que consiste en cultivar la punta del catter hacindolo rodar sobre la superficie de una placa de agar. Aunque los criterios varan segn los autores, se considera que el desarrollo de 5 ufc/ml es evidencia de contaminacin a nivel del catter.
CONTROL DE CALIDAD
Todos los laboratorios clnicos deben mantener medidas de control de calidad especficas en relacin a los hemocultivos, as como para cualquier procedimiento. Dentro de los aspectos ms importantes que se deben controlar se encuentran los siguientes. Recoleccin de las muestras: en lo que se refiere a medidas de asepsia, obtencin de adecuados volmenes de sangre, obtencin de adecuado nmero de muestras de hemocultivo por paciente. Contaminantes: el mximo porcentaje de hemocultivos contaminados que se acepta es 3%. Si un laboratorio excede esta cifra deber tomar medidas para detectar y corregir los procedimientos que influyen en ello. Hemocultivos positivos: el anlisis peridico del porcentaje de hemocultivos positivos en un laboratorio es un indicador del funcionamiento del sistema utilizado. Tambin contribuye a detectar sobreutilizacin de este recurso paraclnico cuando el porcentaje de positividad es muy bajo.
Tratamiento de la sepsis
Los pilares bsicos en el tratamiento del paciente sptico estn dados por las medidas de soporte cardiorrespiratorio y el tratamiento antibitico precoz. Los antibiticos deben ser elegidos en base al potencial foco infeccioso primario, los datos epidemiolgicos y los factores del husped. Se recomienda el uso de agentes antimicrobianos de amplio espectro hasta tanto se halla realizado el diagnstico microbiolgico. Bajo estas condiciones, se aboga a favor de la teraputica combinada a fin de proveer tratamiento eficaz tanto para los grmenes gramnegativos como para los grampositivos, prevenir la seleccin de cepas resistentes frente a un antibitico y, en muchos casos, aumentar la actividad de los antibiticos mediante el mecanismo de sinergia. La combinacin ms utilizada en el tratamiento inicial y en ausencia de sospecha de germen es la de un aminoglucsido y cefalosporina de tercera generacin. Si se cree que la causa sea Pseudomonas aeruginosa u otro bacilo gramnegativo resistente a los antibiticos anteriores, es una buena opcin combinar un aminoglucsido con un carbapenem. Frente a la sospecha de grampositivos debe considerarse el uso de vancomicina. Una vez que el microorganismo ha sido identificado y estudiado, la teraputica antibacteriana debe ajustarse y en general debe ser de espectro ms reducido.
ENDOCARDITIS INFECCIOSA
La endocarditis infecciosa (EI) se define como la infeccin de la superficie endocrdica del corazn (1), como el trmino mismo lo sugiere; aunque en la prctica mdica habitualmente pensamos en la infeccin de las vlvulas cardacas. Es as que adems de presentarse en dichas estructuras puede presentarse en comunicaciones arteriovenosas, conducto arteriosos permeable, etc.
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La importancia del tema no radica en su frecuencia de presentacin, ya que es de baja incidencia, sino en su alta morbimortalidad, en su heterognea presentacin clnica, en las dificultades diagnsticas y en su necesidad de aplicar un emprico y precoz tratamiento antibitico.
EPIDEMIOLOGA
Es una infeccin de baja incidencia, aunque muchos autores coinciden que es difcil de determinar, al parecer no ha tenido cambios respecto al total de pacientes en los ltimos 30 aos. Sin embargo el espectro clnico de la enfermedad ha cambiando debido a que la poblacin anciana, inmunodeprimida y sometida a maniobras invasivas est en aumento por el avance de nuevas tecnologas mdicas. Se presenta con mayor frecuencia en pacientes adultos, mayores de 50 aos, siendo rara en la infancia; ahora se ha visto un aumento en los jvenes por asociarse al uso de drogas intravenosas. Es algo ms frecuente en el hombre. La vlvula mitral es la ms afectada de forma aislada (sin estar afectada otra vlvula), seguida por la artica; se pueden ver en forma combinada; la vlvula tricspide solo excepcionlmente se ve afectada como veremos ms adelante. La tasa de mortalidad que se situaba cercana al 100% en la era preantibitica, hoy es considerada menor pero difcil de determinar, variable segn el tipo de paciente y el microorganismo implicado. Algunos autores hablan de una mortalidad del 40% aproximadamente.
FACTORES DE RIESGO
Pueden entenderse con facilidad luego de comprendida la etiopatogenia de la EI; es as que son factores de riesgo todas aquellas situaciones en que exista o generen dao endocrdico o que aumenten la probabilidad de bacteriemias. Esta afeccin se observa con mayor frecuencia en pacientes ancianos, inmunodeprimidos, con cateterizacin endovenosa, pacientes que se le realiza maniobras invasivas, adictos a drogas intravenosas, etc. A nivel cardiovascular: la alteracin valvular degenerativa (como es la calcificacin, la enfermedad aterosclertica, etc.) ha sustituido la valvulopata reumtica, tan frecuente en el pasado, como uno de los principales factores de riesgo. Tambin se ve con frecuencia en pacientes portadores de vlvulas protsicas, vlvula artica bicspide, enfermedades congnitas cardacas, portadores de marcapasos o desfibriladores, prolapso de la vlvula mitral, etc. El haber tenido una EI es un importante factor de riesgo para la misma.
CLASIFICACIN
Clsicamente la EI se clasific en aguda, subaguda y crnica basndose en el tiempo en que llevaba al paciente a la muerte. Afortunadamente como mencionbamos luego de la terapia antimicrobiana la mayora de los casos no evolucionan a la muerte, por lo que esta clasificacin quedo un poco en el pasado; prefirindose actualmente una basada en la etiopatogenia. Clasificacin "vieja" aguda: evolucin fulminante, la muerte se produce en menos de 6 semanas. Se asocia fundamentalmente a grmenes ms agresivos como S. aureus. subaguda: la muerte se produce entre las 6 semanas y 3 meses. Es la que hoy asociamos a Steptococcus del grupo viridans.
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crnica: la muerte se produce luego de los 3 meses. En general stas dos ltimas se consideran juntas. Nueva clasificacin y agentes etiolgicos En lneas generales son los cocos gram positivos los principales agentes responsables de la EI, siendo muy raro los anaerobios. Los estreptococos y los estafilococos representan alrededor del 80-90% de las EI. Existe un grupo de EI que en series internacionales es de alrededor del 5%, en donde no se halla el germen mediante tcnicas microbiolgicas convencionales, son las llamadas EI con cultivos negativos. Esto puede deberse a varios factores en los que se encuentra: el uso de antibiticos previo a la toma de la muestra, EI causada por microorganismos tales como hongos, virus, especies de crecimiento lento como el grupo HACEK, riquetsias, etc., ser de etiologa no infecciosa o no se este el diagnstico, etc. sobre vlvula nativa: se presenta en pacientes con vlvulas cardacas aparentemente sanas o no. Los grmenes implicados con mayor frecuencia son los Steptococcus del grupo viridans (S. sanguis, S. mutans, S. mitis) y Staphylococcus aureus, ste ltimo asociado a enfermedad de curso ms agudo, de mayor mortalidad y con vlvula clnicamente sana. Con menor frecuencia enterococos y otros estreptococos, bacilos gram negativos aerobios (como Salmonella), hongos, etc. Cabe destacar la EI causada por Steptococcus bovis (estreptococo del grupo D) en pacientes adultos ya que se asocia frecuentemente a patologa del tracto digestivo, especialmente diverticulosis y carcinoma de colon. La misma se explicara dichas afecciones son capaces de producir bacteriemias transitorias. Algunas series muestran un 5% del total de las EI son causadas por este germen. sobre vlvula protsica: estas se dividen en precoz y tarda, con diferencias etiopatognicas. Al parecer no existen diferencias entre las biolgicas y las mecnicas. Precoz: hasta el ao de la sustitucin valvular, segn algunos autores podran ser 2 meses, el agente ms frecuente es Staphylococcus epidermidis y otros coagulasa negativos, mas alejadamente se encuentran los bacilos gram negativos y los hongos. S. epidermidis produce sobre el material protsico un biofilm, estructura compleja en donde las bacterias interaccionan entre ellas dificultando la llegada de antibiticos y donde mantienen una baja actividad metablica. En general no basta con el tratamiento antibitico para su eliminacin, por lo que muchas veces requiere la exresis del material protsico. stos grmenes se plantean son adquiridos durante el acto operatorio, por lo que corresponderan a grmenes intrahospitalarios. Tarda: luego del ao los grmenes planteados se asemejan a los encontrados en la EI sobre vlvula nativa. sobre marcapasos y desfibriladores: son en general causados por Staphylococcus epidermidis u otros estafilococos coagulasa negativos, por lo que al igual que en el caso anterior puede requerirse la exresis del mismo. nosocomial: es aquella que se presenta a partir de las 72 hrs de hospitalizacin o en un ingreso anterior a las 8 semanas donde se realizaron maniobras invasivas. Las ms frecuentemente asociadas son la cateterizacin intravenosa y las maniobras genitourinarias. El agente con mayor frecuencia es Staphylococcus aureus, seguido por otras especies. fngica: su incidencia a aumentado en los ltimos aos debido a que es ms frecuente en pacientes inmunodeprimidos, con cateterizacin intravenosa, alimentados de forma parenteral, con tratamientos antibiticos prolongados, vlvulas protsicas, etc. Los hongos
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con mayor frecuencia aislados son especies de Candida sp. y Aspergillus sp., ste ltimo asociado a ciruga cardaca. en pacientes adictos a las drogas intravenosas (ADIV): se produce clsicamente sobre cavidades cardacas derechas (vlvula tricspide 70%) y por grmenes provenientes de la piel como Staphylococcus aureus (60-70%), seguido alejadamente por estafilococos coagulasa negativos, estreptococos del grupo viridans, Pseudomonas aeuruginosa, Candida sp. etc. Por ciertas caractersticas de la enfermedad (presentarse en cavidades derechas) y del paciente, su diagnstico muchas veces no es sencillo, pero al parecer la evolucin seria ms benevolente que en pacientes no ADIV. La razn por la cual se ve mayormente afectada la vlvula tricspide se desconoce, aunque se cree que pueda deberse al bombardeo de impurezas contenidas en las drogas injectadas, pero existen otras hiptesis. Cabe mencionar otros agentes como Coxiella burnetti, agente de fiebre Q que causa una EI crnica. El papel de los virus como agente de EI no est aclarado an.
PATOGENIA
La patogenia de la EI es compleja y multifactorial; y quizs aun, no bien aclarada. Los dos sucesos principales pueden ser resumidos en: una superficie endovascular alterada (los microorganismos son incapaces de adherirse al endotelio sano) y una bacteriemia. Al parecer todo comenzara con ciertas alteraciones que generan turbulencias de sangre (u otro tipo de estrs local) lo que produce dao endotelial con exposicin de protenas de matriz extracelular, depsitos de plaquetas y fibrina formndose una vegetacin estril, etapa llamada ENDOCARDITIS TROMBOTICA ABACTERIANA (ETAB). Para el caso de S. aureus este proceso sera algo diferente, ya que la virulencia tal de este germen permite adherirse a un endotelio fsicamente sano, pero sin dejar de estar alterado: ya que expresa molculas de adhesin. Esto se ve en endotelios con inflamacin local como en la patologa arteriosclertica. La lesin previa del endotelio valvular es un prerrequisito para la colonizacin bacteriana en casi todos los modelos animales y probablemente en el hombre, aunque esto no indique una lesin clnicamente evidente previa. Luego ciertas bacterias pueden alcanzar la vegetacin o el endotelio daado a travs de una bacteriemia transitoria, adherirse y colonizarla. As la capacidad de ciertos microorganismos para adherirse a la ETAB es un paso crucial en el desarrollo de EI. Dicha adherencia esta mediada por numerosas molculas de la superficie bacteriana capaces de adherirse a las protenas de matriz extracelular presentes tanto en estreptococos como en estafilococos, llamadas colectivamente: microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs). Para uno de los agentes mas frecuentes de EI, como es Streptococcus mutans perteneciente al grupo viridans, se describe un polisacrido extracelular complejo, el dextrn o glucoclix, implicado a su vez en la etiopatogenia de las caries. Tambin se describe en Streptococcus del grupo viridans, una adhesina de superficie llamada FimA; experimentalmente se comprob que Streptococcus mutantes deficientes de la misma tenan una virulencia mucho menor en el desarrollo de EI experimental. La superficie vuelve a cubrirse con plaquetas y fibrina generando un medio propicio para la multiplicacin bacteriana, escondido del sistema inmune. Al parecer ciertas cepas bacterianas tienen mayor capacidad de agregacin plaquetaria, siendo stas las que causan con mayor frecuencia EI, como son Streptococcus y Staphylococcus. As la vegetacin aumenta de
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tamao con mayor proliferacin bacteriana y mayor depsito fibirino-plaquetario, las bacterias quedan en la profundidad de la vegetacin donde la infiltracin linfocitaria es mnima. Esto provoca recuentos bacterianos muy elevados, en torno a 1010 UFC/ gr de tejido. A nivel inmunolgico se produce una importante estimulacin del sistema inmune humoral y celular, lo que explica la esplenomegalia, la hipergamaglobulinemia, el ttulo elevado de complejos inmunes circulantes, etc.
MANIFESTACIONES CLNICAS
Son muy variadas y creemos exceden el propsito de este texto. Pueden ser comprendidas como parte de 3 grandes procesos propios de la patogenia de la EI: El proceso infeccioso sobre la vlvula cardaca, conlleva al deterioro del aparato valvular (perforacin, ruptura de cuerdas tendinosas, absceso del anillo valvular, etc.) por lo que puede detectarse un nuevo soplo, insuficiencia cardiaca, alteraciones en la conduccin elctrica (arritmias), etc. Fenmenos emblicos a casi cualquier rgano; con mayor frecuencia a nivel renal, esplnica, cerebral (stroke) y coronario. Las lesiones de Janewey (placas hemorrgicas, indoloras, en palmas y plantas) y los ndulos de Osler (ndulos eritematosos dolorosos, habitualmente en las yemas de los dedos), es discutido por algunos autores si corresponden a fenmenos emblicos o lesiones por inmunocomplejos, la presencia de bacterias en cultivo de dichas lesiones, nos orienta ms a lo primero. Fenmenos inmunolgicos por la bacteriemia constante y el estmulo constante del sistema inmune: fiebre (hallazgo frecuente), glomerulonefritis por inmunocomplejos, esplenomegalia (tambin por fenmenos emblicos), vasculitis (petequias, hemorragias en astilla, etc.), manchas de Roth (oculares), artralgias y mialgias, etc.
ASPECTOS DIAGNSTICOS
Por la heterogeneidad de las manifestaciones clnicas el diagnstico de EI es complejo y requiere alto grado de sospecha clnica. Para el mismo se establecen dos tipos de criterios (criterios de Durack): Patolgicos: el cultivo y la histologa de la vegetacin o de embolias. Clnicos: criterios mayores: donde se encuentran los hemocultivos positivos y la evidencia de afectacin endocrdica; criterios menores: fiebre, fenmenos emblicos e inmunolgicos, entre otros. La EI produce caractersticamente una bacteriemia continua, aunque de baja cuanta (menor a 100 UFC/mm3, las bacteriemias por estreptococos pueden ser del orden de 1-10 UFC/mm3), por lo que el hemocultivo juega un rol fundamental en el diagnstico, sin olvidar que al recuperar el germen podemos luego realizar un tratamiento antibitico especfico. Las diferentes consideraciones a cerca del hemocultivo son iguales a las descritas para sepsis, en el inicio de este captulo.
ASPECTOS TERAPUTICOS
La antibioticoterapia es la base del tratamiento como cabra de esperar, aunque en ciertas circunstancias se requieren tratamientos quirrgicos. El uso de anticoagulantes, tentador por aspectos de la patogenia, resulta controvertido y asociado a complicaciones hemorrgicas graves, por lo que en general se desaconseja su uso. El uso de antibiticos en la EI tiene caractersticas particulares ya que estamos frente a una
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infeccin en donde los microorganismos se encuentran escondidos bajo una red de fibrina y plaquetas, existe una alta concentracin de bacterias (109 1010 UFC/gr) y se encuentran en un estado de actividad metablica reducido. Recordemos para esto ltimo que la gran mayora de antibiticos actan en clulas metablicamente activas ya que interfieren en la sntesis de la pared, de protenas, etc. Por estas razones frente a un germen aislado de un paciente con EI, se realiza estudio de la sensibilidad antibitica de tipo cuantitativo, donde se establece la CIM (concentracin inhibitoria mnima). Es as que se utilizan antibiticos bactericidas, por va intravenosa, a dosis altas, de forma prolongada (alrededor de 4 semanas) y la mayora de planes teraputicos incluyen dos antibiticos con actividad sinrgica. Los antibiticos ms usados son los betalactmicos asociados a un aminoglucsido, pero en definitiva deben ajustarse empricamente al tipo de EI y a la epidemiologa local.
Bibliografa
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Infecciones del sistema nervioso central

M. Prez
Entendemos por meningitis aguda supurada la inflamacin de las leptomeninges del encfalo y de la mdula, que origina una sintomatologa caracterstica (sndrome menngeo: sndrome de irritacin menngea sumado a un sndrome de hipertensin endocraneana), con lquido cefalorraqudeo (LCR) purulento. Se acompaa de compromiso funcional y lesional del sistema nervioso central (SNC). Por tanto la denominacin correcta es: meningoencefalitis aguda supurada (MEAS). La etiologa de la MEAS es bacteriana, los microorganismos involucrados varan segn la franja etrea que se examine. (Cuadro 1) Los grmenes ms frecuentes son Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae tipo b y Steptococcus pneumoniae. Quedan excludas bacterias como Mycobacterium tuberculosis que determina una meningoencefalitis subaguda a lquido cefaloraqudeo claro. Hemos hecho mencin a una de las formas clsicas de comenzar a ordenar las meningoencefalitis segn el aspecto del LCR. Si es turbio orienta a las meningoencefalitis agudas supuradas bacterianas. El LCR claro orienta a meningoencefalitis bacteriana tuberculosa o meningitis virales.
Importancia del tema

La MEAS es una enfermedad que importa mucho a la salud pblica, no por su frecuencia, ya que se puede considerar como una enfermedad poco comn, sino por su gravedad y porque es una verdadera emergencia mdica; una persona que padece esta enfermedad puede fallecer en horas. En nuestro pas segn datos del MSP , desde los aos 1979 a 2002 las tasas por 100.000 habitantes oscilan desde 3.27 a 5 en todo el pas. Las personas que sobreviven a esta enfermedad frecuentemente quedan con secuelas neurolgicas a largo plazo, que se manifiestan como crisis convulsivas, alteraciones motoras, retraso mental, deterioro de la visin o ceguera, trastornos del lenguaje o, lo ms frecuente, una prdida de audicin que puede ser de moderada a profunda. Si tenemos en cuenta que los ms frecuentemente afectados son los nios menores de dos aos, la gravedad del dao neurolgico es aun mayor, ya que afecta a un cerebro en desarrollo. Se comprende el inters que mueve a muchos investigadores por mejorar todos los aspectos que tiendan a disminuir la morbimortalidad por esta enfermedad. Sin duda un gran avance ha sido el tratamiento antibitico que descendi la mortalidad de un 97% de la era preantibitica a cifras de un 10% a 30% para el caso de nuestro pas actualmente, variando segn el agente bacteriano involucrado y la edad. Pero sin duda son tambin grandes los esfuerzos en los ltimos aos por mejorar los aspectos del diagnstico
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clnico y paraclnico, sobre todo en el diagnstico microbiolgico. Por supuesto se ha puesto especial nfasis en lograr mejores teraputicas antimicrobianas y otras que coadyuven a disminuir la frecuencia de las secuelas. Pero tampoco ha sido menor el inters en lo que tiene que ver con la prevencin, en especial el desarrollo de vacunas. Al desarrollar el tema veremos como todos los avances que se han logrado en el diagnstico, tratamiento y prevencin de esta enfermedad han sido fruto de la interrelacin de la microbiologa clnica y bsica. Es por esto que hemos seleccionado el tema MEAS como un modelo de enfermedad causada por un grupo de bacterias que tienen en comn su gran poder invasor y es un excelente ejemplo para mostrar como todos los aspectos de la investigacin clnica y microbilgica se pueden interrelacionar con un fin comn. En trminos generales podemos decir que las bacterias que causan MEAS se adquieren por va respiratoria a travs de las gotitas de Pflugge y las secreciones respiratorias, colonizan la orofaringe, atraviesan luego la barrera mucosa y pasan a la sangre, donde se multiplican rpidamente para franquear finalmente la barrera hematoenceflica, llegando as al LCR en el espacio subaracnoideo. En este momento desencadenan un proceso inflamatorio a nivel de las meninges y el encfalo, responsable de la enfermedad y sus complicaciones. Estas bacterias las podemos clasificar claramente dentro del grupo de bacterias que tienen como uno de los principales atributos de virulencia para causar enfermedad, la invasividad. Como ya dijimos, son muchas las bacterias que pueden determinar esta enfermedad, (cuadro 1), aunque las que con mayor frecuencia la determinan son Neisseria meningitidis, un diplococo gramnegativo, Haemophilus influenzae, un bacilo gramnegativo pleomrfico y Streptococcus pneumoniae, un diploococo grampositivo. La interrogante que se ha planteado a muchos investigadores es, que atributos de virulencia tienen en comn estas bacterias, tan diferentes entre s, que les permite causar una enfermedad casi idntica, salvo alguna diferencia que puede haber en la presentacin clnica, como es el caso de la meningitis meningoccica. Para poder comprender la fisiopatologa de esta enfermedad es necesario hacer una revisin de las principales caractersticas de las bacterias que la causan y de la ultraestructura de las bacterias grampositivas y negativas. En el cuadro 1 se han resumido las caractersticas principales de los micoorganismos. Otros detalles se podrn consultar en los captulos correspondientes. El cuadro 2 y la figura 6 del captulo 2 resumen las principales caractersticas de la pared de las bacterias grampositivas y negativas. Se seala la ubicacin de los lipopolisacridos y protenas de membrana externa de las gramnegativas y la pared de las grampositivas con la disposicin de los cidos teicoicos. Las bacterias que causan MEAS poseen cpsula. Todas estas estructuras juegan un papel importante en la patogenia de esa enfermedad.
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Cuadro 1.
Neonatos 0 a 2 meses Microorganismos ms frecuentes Streptococcus agalactiae coco grampositivo catalasanegativo -hemoltico CAMP positivo bacilos gramnegativos no exigentes oxidasanegativos
Enterobacterias: Escherichia coli k1 Enterobacter spp. Citrobacter spp. Klebsiella spp. Salmonella spp. Leisteria monocitogenes
Bacilo grampositivo exigente -hemoltico Test CAMP positivo
Menos frecuentes a esta Haemphilus influenzae tipo b edad Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae 2 meses a 5 aos Neisseria meningitidis Gnero Neisseria Diplococo gramnegativo (granos de caf) Encapsulados Aerobios estrictos Exigentes Oxidasa positivos Oxidan maltosa y glucosa 10 serogrupos capsulares B, C y A los ms frecuentes Gnero Haemophilus Bacilo gramnegativo pleomrfico Encapsulado Exigentes Anaerobio facultativo Requiere factores de crecimiento V y X 6 serotipos capsulares: tipo b responsable de la mayora de las enfermedades severas Gnero Streptococcus diplococos grampositivos (lanceolados) Encapsulados Exigente Anaerobio facultativo Alfahemoltico Optoquina sensible 83 serotipos capsulares
Haemphilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Nios mayores de 5 aos y adultos
Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae
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La va ms comn de llegada de las bacterias a las meninges se inicia con la colonizacin respiratoria alta, seguida de bacteriemia, para finalmente atravesar la barrera hematoencefica. La llegada de las bacterias por vecindad a travs de un foco infeccioso cercano a las meninges, como puede ser una otitis media, es menos frecuente. Para el caso de los recin nacidos (neonatos de 0 a 30 das de vida) las bacterias se adquieren en el canal de parto. El feto, hasta tanto no se rompa la integridad de las membranas que lo protegen en la cavidad uterina, est en un ambiente estril. Una vez rotas las membranas, el recin nacido se coloniza por diferentes bacterias, las cuales se pueden comportar como patgenas por las propias condiciones inmunitarias del recin nacido que tiene un sistema inmunolgico inmaduro. Si bien es una situacin poco frecuente, las bacterias luego de colonizar las mucosas las pueden atravesar y por una bacteriemia llegar a las meninges y al encfalo. En el recin nacido esta bacteriemia motiva casi siempre adems de la enfermedad neurolgica, una sepsis con afectacin de otros parnquimas. Haemophilus influenzae tipo b, Streptococcus pneunomiae y Neisseria meningitidis grupo B y C, son los que en nuestro pas ms frecuentemente causan enfermedad en forma endmica. La mayora de los casos se presentan en invierno y primavera y parecen vincularse con el descenso de la humedad relativa y el aire fro que facilitan la erosin de la mucosa rinofarngea, disminuyendo las defensas locales a este nivel. El ambiente familiar es el de mayor riesgo de adquirir la enfermedad, muy especialmente si median condiciones de mala ventilacin y hacinamiento. Segn los datos del MSP en el perodo 1999-2002 el orden de frecuencia de las bacterias ms comunes en menores de 5 aos fue: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influenza, etc. En el cuadro 2 se describen los grmenes aislados en el periodo 19992002 y el porcentaje de meningitis denunciadas como supuradas sin germen identificado.
Cuadro 2.
N. meningitidis serogrupo C N. meningitidis serogrupo B 1999 24 29 2000 15 38 44 36 N. meningitidis serogrupo W 135 N. meningitidis sin seroagrupar N. meningitidis otros Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b Otros grmenes identificados Casos Sin germen / Con germen y % 3 2 59 2 7 80/206 (31 %) 3 3 35 2 5 54/155 (35%) 63* 2 7 65/178 (37%) 29 1 10 62/138 (45%) 2001 6 2002 0 -
Fuente: MSP Divisin Epidemiologia - Uruguay * Fallecieron 24 pacientes; 17 eran mayores de 40 aos.
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Uruguay fue el primer pas de Latinoamrica que incorpor la vacuna anti Haemophilus influenzae tipo b en forma universal. A partir de setiembre de 1994, se comenz a vacunar a toda la poblacin infantil del pas menor de 4 aos, con la vacuna anti-Haemophilus influenzae tipo b conjugada. Segn datos aportados por la Divisin Epidemiolgica del MSP , desde setiembre 1994 a la semana 30 del ao 1995 (ltima de julio) se registraron 3 casos de MEAS a Haemophilus influenzae tipo B, en nios no vacunados o incompletamente vacunados. El nmero de casos en aos anteriores en perodos similares fue de hasta 10 o ms veces mas alto. A pocos meses de iniciada la vacunacin se pudo observan un rpido impacto en la reduccin de casos en meningitis. Si comparamos con los casos ocurridos en el perodo 1999-2002, vemos que la reduccin dramtica de casos se mantiene aunque se presentan casos en nios, lamentablemente no inmunizados. Estos resultados se han visto en muchos pases del mundo al incorporar esta vacuna. Casos de MEAS por Haemophilus influenzae:
Casos la semana epidemiolgica 30 1992 31 1993 1994 1995 28 37 3 Casos todo el ao 1999 2 2000 2001 2002 2 2 1
1996 0 Fuente: MSP Divisin Epidemiologa - Uruguay
Clsicamente se dice que Neisseria meningitidis A Y C son capaces de causar epidemias. Con los estudios epidemiolgicos de los ltimos aos se ha podido determinar que tambin existieron verdaderas epidemias por el grupo B en Cuba y en San Pablo (Brasil). En nuestro pas en la dcada del 90 se registr un aumento del nmero de casos de MEAS por Neisseria meningitidis grupo C, que pas a predominar sobre el grupo B. En el ao 1996 esa situacin de hiperendemia, junto a un aumento de la mortalidad por esta enfermedad (tasa de meningitis supurada 11.9/100.000, tasa de MEAS por Neisseria meningitidis grupo C de 3,1/ 100.000) determin que el MSP impulsara una campaa de vacunacin gratuita no obligatoria con vacuna polisacardica A-C a la poblacin entre 2 y 19 aos. Se vacun alrededor del 90% de esa franja etrea. En 1999 se decidi aplicar nuevamente la misma vacuna. En los ltimos 4 anos se observ una disminucin muy marcada de casos de EIM por N. meningitidis grupo C que se puede atribuir en parte a la vacunacin iniciada en 1996.1
En julio 2001 se detectaron algunos eventos que alertaron sobre la posibilidad de un cambio en la evolucin de la EIM por N. meningitidis grupo B: aumento del nmero de casos, desplazamiento de las edades de los pacientes afectados hacia la franja de mayores de 5 aos, brote epidmico en una pequea ciudad (Santa Luca, Canelones) con una tasa de 30/100.000 habitantes y fallecimiento de pacientes predominantemente mayores de 5 aos. Estos cambios epidemiolgicos sealaban la posibilidad de pasaje de la forma endmica a la forma epidmica de la enfermedad. A esto se agreg el predominio de una determinada cepa (B: 4,7: P1.15,19) sobre una mezcla de cepas de N. meningitidis grupo B. Estos datos epidemiolgicos y microbiolgicos determinaron la decisin de inmunizar con la vacuna antimeningocccica B-C preparada con la cepa B: 4,7: P1.15,19 en el Instituto Finlay. La campaa gratuita no obligatoria se dirigi a la poblacin de 4 a 19
Fuente: MSP Vigilancia Epidemiolgica CL 2000. Informe Situacin de las meningitis supuradas en el Uruguay 13 enero 2002
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aos de todo el pas, comenzando por el departamento de Canelones, luego Montevideo y el resto del pas.2
Fisiopatologa
Han sido empleados por muchos autores, modelos experimentales con animales para intentar aclarar como es que los microorganismos llegan al husped y lo colonizan; como es que pueden sobrevivir a los mecanismos de defensa del husped, invaden el SNC e inducen una respuesta inflamatoria en el espacio subaracnoideo que contribuye a explicar la mayora de los eventos fisiopatolgicos que ocurren como consecuencia de la infeccin. Podemos resumir as, los pasos que siguen los microorganismos hasta determinar la enfermedad. 1. Fijacin a las clulas epiteliales de la mucosa nasofarngea y orofarngea. 2. Transgresin de la barrera mucosa. 3. Sobrevida en el torrente sanguneo (evitando las clulas fagocticas y la actividad bacterioltica). 4. Ingreso en el LCR. 5. Produccin de patologa en las meninges y encfalo. Analizaremos los puntos que se conocen de estos sucesivos pasos. El primer paso crtico en la iniciacin de MEAS es la colonizacin nasofarngea por un nuevo microorganismo. La cpsula que estos poseen parece jugar un rol fundamental en la colonizacin nasofarngea para el caso de H. influenzae y S. pneumoniae, ya que la adquisicin de anticuerpos contra el antgeno capsular, ya sea por sucesivas exposiciones o por reaccin cruzada con integrantes de la flora normal, como ocurre en los primeros aos de la vida, ejerce una accin protectora. A esto se atribuye lo excepcional de la enfermedad por H. influenzae despus de los cuatro aos. Adems hay trabajos que sugieren que estos anticuerpos podran interferir con la colonizacin. Para el caso de S. pneumoniae, si bien no est aclarado el problema, parece ser que la situacin es similar. La cpsula est tambin involucrada en la colonizacin, ya que la ausencia de anticuerpos especficos contra los serotipos que causan la enfermedad invasiva, como neumonias y MEAS, es decisiva en la determinacin de la colonizacin. Se ha demostrado en modelos animales y en cultivos celulares que H. influenzae puede expresar fenotpicamente la presencia de fimbrias, segn las condiciones de desarrollo. Estas fimbrias estn relacionadas con la adhesin al epitelio nasofarngeo. N. meningitidis coloniza la nasofaringe utilizando pilis, que encuentran a ese nivel receptores especficos en la superficie de las clulas de la mucosa. Tambin se ha demostrado que una vez fijados all, atraviesan la barrera mucosa porque son transportados a travs del epitelio por vacuolas fagocticas. Un mecanismo de defensa local de que dispone el organismo para defenderse de la colonizacin es la produccin de anticuerpos IgA a nivel de las secreciones mucosas. Estos pueden inhibir la adhesin de los microorganismos, pero por otra parte tambin es conocido que muchas de estas bacterias patgenas producen IgA proteasas que inactivan a los anticuerpos IgA. Una vez que la bacteria lleg a la sangre debe sobrevivir a las defensas del husped, esto es posible tambin por poseer cpsula. La cpsula les permite resistir la actividad bactericida del complemento, ya que impide que se active su va clsica; adems la cpsula inhibe la fagocitosis por los neutrfilos. Estos hechos permiten que se desarrolle una bacteriemia importante, y esto es imprescindible para que posteriormente ocurra la invasin de las meninges y el encfalo.
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Rev. Med. Uruguay 2002;18:83-88.
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El husped tiene mecanismos para oponerse a este efecto antifagoctico de la cpsula. El antgeno capsular de S. pneumoniae y los LPS de las bacterias gramnegativas activan la va alternativa del complemento, activando a C3 que determina la fijacin de C3b a la superficie celular bacteriana, activando finalmente la va final comn del complemento (C5, C6, C7, C8 y C9), complejo de ataque de la membrana que determina la lisis celular. Pero adems estos eventos facilitan la opsonizacin, la fagocitosis y ayudan a eliminar las bacterias del torrente sanguneo. Se ha demostrado que pacientes con dficit de la va alternativa del complemento y del complejo de ataque de la membrana, estn ms predispuestos a infecciones graves por S. pneumoniae y N. meningitidis. El mecanismo ms efectivo para eliminar las bacterias de la sangre y as evitar la enfermedad es la presencia de anticuerpos especficos anticapsulares, esto explicara por que esta enfermedad es ms rara en los adultos y nios mayores de cinco aos, en quienes se detectan anticuerpos (en especial es muy claro para H. influenzae). Esto explicara tambin por que, en pocas de epidemias por N. meningitidis, en que un 80% de la poblacin expuesta est colonizada en su nasofaringe, son muy pocos de estos los que enferman. Los anticuerpos anticapsulares opsonizan la bacteria y permiten que esta sea ingerida por los fagocitos polimorfonucleares y macrfagos. Parecera que el factor determinante para que ocurra invasin de las meninges est ligado al grado de bacteiremia, si esta es importante ocurre invasin menngea. An no se sabe exactamente el sitio anatmico por donde hacen su ingreso las bacterias desde la sangre al espacio subaracnoideo (espacio que queda entre la aracnoides y la piamadre). Estas hojas menngeas cubren el encfalo y entre ellas circula el LCR. Hay estudios que avalan que lo hacen a travs de los plexos coroideos, en donde se produce un proceso inflamatorio y donde el flujo sanguneo es mayor. Por otra parte tambin se ha demostrado la presencia de receptores especficos para los patgenos menngeos a nivel de los capilares de plexos coroideos y ventrculos cerebrales. Si las bacterias han sorteado los mecanismos de defensa del organismo y llegan al espacio subaracnoideo, comienza all una activa multiplicacin. Esto ocurre ya que estas bacterias capsuladas se encuentran con un ambiente en donde nuevamente los mecanismos defensivos son inefectivos. En primer lugar la concentracin de protenas del complemento es muy baja, aunque exista un intenso proceso inflamatorio. Incluso se ha demostrado que los propios leucocitos producen proteasas que inactivan el complemento. En segundo lugar esto motiva que la opsonizacin y la fagocitosis sean inefectivas. En los pacientes con MEAS se produce un aumento de las inmunoglobulinas en el LCR, pero este es menor comparado con el que ocurre simultneamente en el suero, y no se establece una concentracin adecuada hasta etapas avanzadas de la enfermedad. Tambin ocurre un aumento de los leucocitos neutrfilos en el espacio subaracnoideo (ESA), al parecer favorecido por la presencia de sustancias quimiotcticas, como C5a. Para llegar los leucocitos circulantes en sangre perifrica al ESA deben atravesar la barrera hematoenceflica (BHE). La BHE est constituida por endotelio capilar, las clulas de la astrogla y las clulas ependimales. La BHE separa el SNC del compartimento intravascular, y es fundamental para mantener su homeostasis. Se ha demostrado que existen receptores que intervienen en la adhesin de los polimorfonucleares (selectinas e integrinas), tanto en el endotelio capilar como en la astrogla y clulas ependimales. Estos receptores son activados por los productos bacterianos (LPS, cidos teicoicos y peptidoglicn). Los leucocitos atraviesan las uniones intercelulares endoteliales evadiendo as los lmites de los capilares, liberando simultneamente productos proteolticos, lisozimas y radicales txicos de O2. De la activa multiplicacin bacteriana en el ESA resultan dos fenmenos muy impor-
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tantes en la fisiopatologa de la MEAS. Por un lado la lisis de las bacterias libera a nivel local estructuras bacterianas como LPS en el caso de las bacterias gramnegativas y fragmentos de peptidoglicn y cidos teicoicos para el caso de cocos grampositivos. Estos productos bacterianos desencadenan una intensa respuesta inflamatoria local y a su vez tambin atraen al ESA fagocitos (neutrfilos y macrfagos) que infructuosamente tratan de fagocitar las bacterias. Por otro lado, las bacterias en activa multiplicacin pueden pasar desde el SNC a la sangre, as como tambin pasar los productos bacterianos que resultan de la lisis bacteriana. Podemos imaginar a los patgenos menngeos y sus productos entrando y saliendo del LCR permanentemente. Los fragmentos de pptidoglican y cidos teiciocos (los denominados actualmente superantgenos) de las bacterias grampositivas, y los LPS de las bacterias gramnegativas, inducen una vigorosa respuesta inflamatoria que a su vez est producida por los denominados mediadores de la inflamacin. Estos mediadores son liberados ante la llegada de las bacterias y sus productos por los neutrfilos, los macrfagos locales, clulas del SNC como astrocitos, clula de la microgla, clulas ependimales y clulas endoteliales. Los mediadores involucrados son IL1 y , IL6, IL8, el factor de necrosis tumoral (FNT), factor activador de plaquetas, prostaglandinas, metabolitos del cido araquidnico. Estos mediadores o citoquinas liberadas promueven la activacin de receptores de adhesin de las clulas de los endotelios vasculares del SNC que atraen leucocitos a esas zonas, que como ya se dijo liberan productos proteolticos. Tambin aumenta la formacin de vesculas de pinocitosis en las clulas endoteliales. Todo esto determina una injuria del endotelio vascular, instalndose as un aumento de la permeabilidad de la BHE. Todos estos cambios se han podido comprobar en modelos animales y se han podido investigar en lactantes y nios con MEAS. La inoculacin de cualquiera de los productos bacterianos mencionados directamente al LCR de animales produce una inflamacin menngea y un aumento de la permeabilidad de la BHE. La BHE normalmente protege al SNC, impidiendo la entrada de grandes molculas y material particulado. Estos cambios morfolgicos del endotelio vascular se correlacionan funcionalmente con el pasaje de albmina y otras protenas de bajo y alto peso molecular a travs de la BHE hacia el espacio subaracnoideo. El papel exacto que juegan los leucocitos en el aumento de la permeabilidad de la BHE, no est an aclarado, pero se sabe que el LPS y la pared bacteriana de las bacterias grampositivas, son importantes en su determinacin. Tambin la IL1 aumenta la permeabilidad de la BHE y potencia su accin en presencia del FNT. Todos estos eventos fisiopatolgicos culminan en la determinacin de edema cerebral con el consiguiente aumento de la presin intracraneana; este tiene bsicamente tres componentes: edema vasognico, edema citotxico y edema intersticial, elementos que analizaremos inmediatamente. El edema vasognico se debe al aumento de la permeabilidad de la BHE. El edema citotxico es producto de la alteracin que sufren las clulas del SNC por factores txicos liberados por los neutrfilos, los mediadores de la inflamacin (FNT) y los productos bacterianos. El edema intersticial se produce porque la circulacin del LCR se ve dificultada por el aumento de la viscosidad del mismo, por el exudado de leucocitos polimorfonucleares y el aumento de protenas, esto sumado al proceso inflamatorio de las meninges y los ventrculos, determina una dificultad no solo en la circulacin del LCR sino en su reabsorcin en los plexos coroideos. Se ha demostrado en modelos animales que la infeccin menngea, ya sea por S. pneumoniae o por H. inflluenzae tipo b, aumenta el contenido de agua cerebral, la presin del LCR, y la concentracin de lactato. Tambin en la MEAS se altera el flujo sanguneo cerebral, pudindose demostrar que en etapas tempranas hay zonas hipoperfundidas como la corteza cerebral y el hipotlamo.
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En suma, la respuesta inflamatoria que pone en marcha el organismo con el intento de defenderse de la multiplicacin bacteriana determina una serie de alteraciones fisiolgicas que son agresivas para el propio SNC, y son las que en definitiva motivan las alteraciones agudas y eventualmente la muerte; son las responsables de las secuelas neurolgicas en los pacientes que sobreviven. Podemos resumir los eventos que ocurren en la MEAS de la siguiente manera: el aumento de la permeabilidad de la BHE que determina edema vasognico con mayor volumen de sangre intracraneano, el edema celular citotxico que implica aumento del volumen celular y el edema intersticial, son todos factores que aumentan el contenido del SNC que est alojado en una cavidad inextensible como es el el crneo, derivando todo esto en un aumento de la presin intracraneana (PIC). Este aumento de la PIC es una de las causas de la disminucin de la perfusin cerebral e hipoxemia, con un cambio al metabolismo anaerbico marcado por las concentraciones crecientes de lactato y decrecientes de glucosa en el LCR. La intensa inflamacin y la hipertensin intracraneana pueden anular la autorregulacin vascular a nivel del SNC, dejando el flujo sanguneo cerebral dependiendo nicamente de la presin arterial sistmica. Adems la vasculitis y los fenmenos trombticos que ocurren por la alteracin del endotelio vascular, la activacin del factor activador de plaquetas y la activacin de la cascada de la coagulacin, por liberacin por parte de las clulas endoteliales de un factor con actividad procoagulante, pueden producir arteritis que determinan infartos isqumicos locales. La interaccin de estos procesos puede culminar con una lesin neuronal y cerebral irreversible, focal o difusa. Es indudable que la respuesta inflamatoria contribuye en gran medida en la determinacin de las complicaciones y las secuelas de esta enfermedad. Diversos grupos de investigadores intentan identificar moduladores de esta respuesta inflamatoria para mejorar el pronstico de los pacientes. Se han evaluado diversos antiinflamatorios no esteroideos en modelos animales experimentales, tales como la indometacina. Otros frmacos como la pentoxifilina que interfiere con la Il l y el FNT tambin se han ensayado. La investigacin en este sentido contina, y es amplia la lista de frmacos, como los antioxidantes, que se estn estudiando. Dentro de los antiinflamatorios esteroideos el ms extensamente estudiado y aplicado en el tratamiento de MEAS en nios es la dexametasona, que ha demostrado disminuir el flujo de protenas como albmina hacia el LCR y favorece su circulacin. En modelos animales se evidenci que disminuye el edema cerebral, la PIC, la concentracin de prostaglandina E2, la concentracin de lactato en LCR y la actividad del FNT. La administracin de dexametasona parece ser ms til si se administra en las primeras horas de la enfermedad, cuando el nmero de bacterias es mayor, y antes de administrar el antibitico que determinar bacteriolisis (30 minutos antes de la primera dosis de antibiticos). Se ha aplicado dexametasona en ensayos clnicos tratando a lactantes y nios con MEAS. El tratamiento con este frmaco result beneficioso, comprobndose que disminuye los mediadores de la inflamacin y modula la inflamacin menngea. Los pacientes tratados con dexametasona y antibiticos presentaron en esos ensayos mejor pronstico inmediato y a largo plazo. El tratamiento con dexametasona no demostr modificar la tasa de mortalidad por MEAS. Todos estos hallazgos fueron significativos cuando se evaluaron las MEAS por H. influenzae tipo b en nios. No hay opinin unnime en cuanto a su utilidad en MEAS por otros grmenes y en pacientes adultos. Se est investigando la aplicacin de anticuerpos monoclonales contra FNT, Il-1 o factor agregante plaquetario.
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Diagnstico
CLNICO
La trada tpica la constituyen: sndrome febril, sndrome de hipertensin endocraneana y sndrome de irritacin menngea. Pueden presentar sndrome purprico (petequias en la piel por vasculitis sistmica) progresiva o no, que puede culminar en el shock endotxico, el denominado prpura fulminante. A todo paciente en que se sospeche una MEAS se le realizar una puncin lumbar para extraer LCR controlando rigurosamente las medidas de asepsia.
PARACLNICO
Estudio citoqumico del LCR: hay elementos del examen citoqumico que nos orientan a que estamos frente a una MEAS. Primero el aspecto del lquido, si es turbio o purulento; luego si la citologa muestra aumento del nmero de polimorfonucleares, si la glucosa est disminuida y las protenas aumentadas. Estudio microbiolgico del LCR: para que se pueda obtener un buen resultado del estudio microbiolgico es imprescindible que se recuerde que todas las bacterias involucradas en la MEAS son exigentes. La muestra debe ser transportada rpidamente al laboratorio para que se la siembre en medios de cultivo que le proporcionen los nutrientes necesarios, a una temperatura adecuada de 37C y en una atmsfera enriquecida con CO2, que favorece el desarrollo de cualquiera de los microorganismos involucrados. Habitualmente se siembran medios como agar sangre o agar chocolate con factores de crecimiento. Lo primero que el laboratorio puede informar es el examen directo con coloracin de Gram. Es de gran valor por ser un examen rpido, especfico y sensible, si es realizado por una persona con experiencia. Su informacin se obtiene rpidamente. Si se observan diplococos grampositivos nos orienta a que el germen pueda ser S. pneumoniae; si se observan bacilos gramnegativos pleomrficos puede tratarse de H. influenzae; si se observan diplococos gramnegativos en granos de caf intra y extra leucocitarios, puede tratarse de N. meningitidis. De gran utilidad tambin es la deteccin de antgenos capsulares en el LCR. La primer tcnica usada para la deteccin de antgenos bacterianos fue la contrainmunoelectroforesis, actualmente ha sido reemplazada por tcnicas ms sensibles y simples de realizar, como las de aglutinacin de ltex y coaglutinacin. El principio de estas tcnicas es la adhesin de anticuerpos especficos para antgenos bacterianos (a partculas de ltex o a clulas bacterianas de Staphylococcus aureus, respectivamente). Al enfrentarse al antgeno, si est soluble en el LCR aparece una aglutinacin visible al ojo humano. La utilizacin de estos sistemas de deteccin de antgenos es til para confirmar e identificar rpidamente en menos de dos horas lo que se ha observado al Gram, as como tambin es til el diagnstico presuntivo del agente etiolgico en aquellos pacientes que han sido tratados previamente con antibiticos, en los que el examen directo es negativo. La deteccin de antgenos no sustituye el examen directo y el cultivo, ya que estas tcnicas no son 100% sensibles y especficas. Tienen la ventaja de su rapidez, que es til al clnico para una orientacin rpida del agente etiolgico involucrado. Solo el cultivo permite estudiar la sensibilidad antibitica, si es necesario, en la bacteria aislada y permite su tipificacin en base a sus diferentes antgenos capsulares o de protenas de membrana externa, como en el caso de N. meningitidis. La tipificacin exacta de las bacterias aisladas en cada ao en un pas es fundamental para los estudios epidemiolgicos que permitirn entre otras cosas, planificar eventualmente planes de vacunacin. A las bacterias que desarrollan en los medios de cultivo se las estudia con los mtodos habituales de identificacin: Gram, deteccin de enzimas, pruebas bioqumicas, requerimien-
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tos nutricionales e identificacin serolgica de los antgenos que permiten clasificarlas en diferentes serogrupos o serotipos. Para el caso de N. meningitidis, no se realizan pruebas para estudiar su sensibilidad a los antibiticos porque an en nuestra regin se mantiene sensible a la penicilina y sus derivados. Haemophilus influenzae tipo b ha desarrollado resistencia a ampicilina, que en nuestro medio (datos aportados por el Laboratorio de Bacteriologa del Centro Hospitalario Pereira Rossell) se ubica en un 6%, y al cloranfenicol en un 5% de las cepas aisladas. Por eso es que se debe realizar ante toda cepa que se asle de LCR un antibiograma por el mtodo de difusin en agar en medios especiales para esta bacteria, adems de la deteccin de lactamasas que es uno de los mecanismos ms importantes por los que esta bacteria es resistente a los antibiticos lactmicos, como la ampicilina. Se han detectado en los ltimos aos cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina, que es el antibitico de eleccin para tratar la mayora de las infecciones neumoccicas. Se han identificado cepas resistentes a penicilina en prcticamente todo el mundo. Esta resistencia se puede clasificar de acuerdo a la concentracin inhibitoria mnima en: resistencia intermedia (entre 0,1 y 1 g/ml) y resistencia elevada > 2 g/ml. La mayora de las cepas con susceptibilidad disminuida a penicilina en nuestro medio tienen resistencia intermedia a la penicilna: Hortal y col3, en 2002, publicaron la susceptibilidad de 105 cepas aisladas de MEAS en nios entre los aos 1994-2002, 94 fueron susceptibles (CIM < 0,1 g/ml), 9 tenan susceptibilidad intermedia (CIM 0,1-1 g/ml)y 2 eran resistentes (CIM > 2 g/ml). Pero tambin se debe realizar la concentracin inhibitoria mnima (CIM) a todas las cepas aisladas de procesos invasivos graves (a aquellas que se han demostrado resistentes al testarlo con el disco de oxacilina), para poder determinar el grado de resistencia. Se debe realizar adems la determinacin de la CIM para cefotaxime o ceftriaxona. Las cepas que muestran una alta resistencia a la penicilina (mayor de 2 g/ml) son frecuentemente resistentes a otros antibiticos como cefriaxona, pero son sensibles a vancomicina.
Tratamiento
Este se adeca segn la edad del paciente y los agentes involucrados; a modo de ejemplo podemos ver las recomendaciones de autores internacionales que hemos resumido en el cuadro 3. En los neonatos y hasta los tres meses se puede utilizar una cefalosporina de tercera generacin que es til para tratar los tres grmenes ms frecuentes e inclusive las enterobacterias, con el agregado de ampicilina, a la que son sensibles S. agalactiae y L. monocytogenes. Algo similar ocurre en los pacientes mayores de 50 aos segn este protocolo. Entre los 18 y 50 aos se utiliza penicilina, que sigue siendo el antibitico de eleccin, pudindose utilizar alternativamente una cefaslosporina de tercera generacin.
Prevencin
Sin duda el avance ms importante en la prevencin de la MEAS ha sido el desarrollo de vacunas contra algunos de los agentes que ms frecuentemente la causan. En el cuadro 4 se detallan las vacunas existentes que ya han sido utilizadas en nios y adultos. La estructura bacteriana utilizada para preparar las vacunas es el polisacrido capsular.
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Cuadro 3. Tratamiento emprico de la MEAS

Grupo etario Neonatos (< 1 mes) Tratamiento emprico Ampicilina y aminoglucsido Microorganismos probables S. agalactiae L. monocytogenes Enterobacterias, E. coli Los mismos del grupo 1 y 3 Haemophilus influenzae tipo b N. meningitidis S. pneumoniae Cefotaxime o ceftriaxona o ampicilina si es sensible Tratamiento a eleccin Ampicilina + AG Ampicilina + AG Cefotaxime + AG
1 mes a 3 meses Lactantes y nios menores 5 aos
Ampicilina y cefotaxime o ceftriaxona Cefotaxime o ceftriaxona
Mayores 5 aos a 50 aos
Cefotaxime o ceftriaxona penicilina o ampicilina Ampicilina y ceftriaxona N. meningitidis S. pneumoniae L. monocytogenes Enterobacterias
>50 aos
Cuadro 4
Vacuna Anti-Haemophilus tipo b Composicin Polisacrido capsular conjugado a protena (toxoide diftrico o tetnico) Polisacrido capsular purificado Polisacrido capsular purificado Polisacrido capsular purificado Polisacrido capsular purificado de los grupos enumerados Protenas mayores de membrana externa Protenas mayores de membrana externa de grupo B y polisacrido capsular C Polisacrido capsular de 23 cepas que causan ms frecuentemente enfermedad invasiva A cualquier edad a partir de los 2 aos Aplicacin Nios menores de 4 aos (desde los 2 meses) A cualquier edad a partir de los 2 aos A cualquier edad a partir de los 2 aos A cualquier edad a partir de los 2 aos A cualquier edad a partir de los 2 aos
Anti Neisseria meningitidis Grupo A Grupo C Bivalente. Grupos: A-C Cuatrivalente. Grupos: A, C, Y, W135 Grupo B Grupos: B-C
Anti neumoccicas. Vacuna 23 valente
En el caso de Haemophilus influenzae tipo b se ha logrado conjugar con protenas logrando as una vacuna inmunognica en nios menores de dos aos, los ms afectados por esta enfermedad.
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Para el caso de Streptococcus pneumoniae existen en uso vacunas capsulares. Desde el ao 2001 en Estados Unidos se est utilizando extensamente una vacuna conjugada polisacridos-protenas a partir de los dos meses de vida. Los estudios de efectividad previos a su utilizacin rutinaria y los posteriores muestran un impacto muy importante en la enfermedad invasiva por neumococo. Esta vacuna (Prevnar Wyeth/Lederle) contiene los 7 serotipos que con mayor frecuencia causan enfermedad neumocccica invasiva en Estados Unidos. En nuestro pas los serotipos que con mayor frecuencia causan este tipo de enfermedad son: 14, 5, 1, 7F, 3, 6B, 19 A, 23F, 19 F, 6 A, 18 C y 9 V. Los 14, 5 y 1 son responsables de alrededor del 70 % de los casos en nuestro pas. Esta vacuna heptavalente actualmente disponible carece de los serotipos 5 y 1, por lo que su cobertura para las cepas de en nuestro pas alcanza solo el 53 %. Se espera que otras vacunas 9 u 11 valentes o vacunas preparadas con protenas neumocccicas tal vez permitan sortear este problema. Las vacunas antimeningocccicas preparadas con polisacridos capsulares bivalentes o tetravalentes son utilizadas desde hace aos fundamentalmente para el control de epidemias. Hoy est disponible una vacuna de polisacrido C conjugada que ya est siendo aplicada en Inglaterra en nios a partir de los dos meses, se espera que el impacto en la EIM por N. meningitidis serogrupo C ser tan importante como el de las vacunas conjugadas de Haemophilus influenzae tipo b y la heptavalente neemococcica . Las vacunas anti-meningoccicas son preparadas con polisacrido capsular excepto para el caso del Grupo B, ya que el polisacrido capsular de ese grupo es escasamente inmunognico. Se han desarrollado vacunas con protenas de membrana externa purificadas, o junto a polisacrido capsular de otro grupo como el C. Estas vacunas estn siendo ya utilizadas en nios y adultos jvenes; existen publicaciones que evalan su eficacia e inmunogenicidad en distintas franjas etreas.
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Infecciones de transmisin sexual

L. Anzalone, A. Mattera
Concepto y generalidades
El trmino infecciones de transmisin sexual (ITS) incluye aquel conjunto de infecciones que se pueden expresar clnicamente con distinta sintomatologa, que tienen diferentes agentes etiolgicos y que las rene el hecho epidemiolgico de adquirirse por va sexual, sin ser esta la nica va de transmisin. Las ITS involucran principalmente la esfera genital, existiendo la posibilidad para algunos de los agentes participantes, de generar infecciones diseminadas lesionando numerosos rganos. Dentro de estos agentes podramos realizar una diferenciacin de aquellos que no utilizan la va sexual como principal va de transmisin, generando sndromes infecciosos en la esfera extragenital como es el caso de la hepatitis B, A, C, y bacterias como Shigella spp., Salmonella spp., etc., denominndolas infecciones sexualmente transmisibles, un trmino ms amplio. Las primeras ITS que se descubrieron fueron la sfilis y la gonorrea, en principio sin ser reconocidas como tales. Existe evidencia histrica no concluyente acerca del origen de la sfilis, por lo cual se duda si se introdujo en el viejo mundo por la tripulacin de Cristbal Coln, o si la misma era una una enfermedad antigua que se extendi por Europa debido a la urbanizacin. No se puede afirmar que Treponema pallidum fuese el agente de la pandemia conocida como Gran Pox, que asol Asia y Europa luego del regreso de Coln de Amrica; no obstante ello las primeras descripciones de la enfermedad datan de esa poca, reconocindose su forma de transmisin poco despus. La gonorrea ya es referida en el antiguo testamento, siendo Galeno quien le diera el nombre. En 1879 Neisser descubre el agente etiolgico. Ambas datan entonces, de la era preantibitica. La evolucin del tiempo ha llevado a que se sumaran a estas dos clsicas infecciones, una larga lista con variados agentes involucrados, encontrndose actualmente ms de 25 agentes con 50 sndromes a los que se les reconoce un carcter de transmisin sexual. Una clasificacin en base a su aparicin define como de primera generacin a la sfilis, gonorrea y chancro blando; de segunda generacin (1970) a las producidas por C. trachomatis, Mycoplasma spp. y Herpesvirus genital; de tercera generacin a las producidas por Papilomavirus humano, virus de la hepatitis y virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Las ITS constituyen un grupo de enfermedades infecciosas muy frecuentes, siendo su distribucin no uniforme en el mundo, variando la incidencia de los diferentes patgenos dependiendo del rea geogrfica, del nivel socioeconmico, hbitos sexuales, etc. La importancia de dichas infecciones no radica solamente en s mismas, sino tambin en los efectos
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deletreos que pueden ocasionar, como la infertilidad femenina secundaria y las infecciones neonatales graves. Desde el momento en que se reconocen los virus como agentes de algunas de dichas infecciones, ponindose de manifiesto el potencial oncognico de algunos de ellos, como ser Papilomavirus humano, y la evolutividad inexorable hacia la muerte de los pacientes con sndrome de inmunodeficiencia adquirido por VIH, se reconoce una revaloracin del impacto que las mismas tienen en la poblacin mundial y la importancia de su prevencin, diagnstico y tratamiento. Para una correcta prevencin debemos realizar una tarea informativa y educativa. Existen factores que dificultan el diagnstico y tratamiento as como tambin su control, entre ellos se destacan: la clnica, en ocasiones inespecfica y poco demostrativa; la variedad de sndromes que puede determinar un solo agente etiolgico; la no despreciable frecuencia de infecciones mixtas; las infecciones asintomticas (ms frecuentes en la mujer). El creciente ndice de cepas resistentes a los antimicrobianos junto con la necesidad de tratamiento de la pareja y el frecuente abandono del tratamiento, completan un panorama difcil para su control. Estas infecciones pueden ser clasificadas para su estudio de diversas maneras: por los agentes involucrados (bacterias, virus, parsitos y hongos) o en base a los sndromes que estos provocan. Debemos obtener una correcta historia y examen clnico jerarquizando el interrogatorio epidemiolgico del paciente, y de esta forma lograr un correcto diagnstico clnico y orientar adecuadamente los pasos a seguir para obtener el diagnstico microbiolgico y tratar en forma adecuada al paciente y sus contactos.
Epidemiologa y control
Dentro de los parmetros que afectan la transmisin de las ITS se encuentran los factores de riesgo, entendiendo por tales aquellos que poseen influencia causal en la adquisicin de las mismas. Dentro de estos se encuentran: a) el comportamiento sexual - nmero de parejas sexuales, cambio de parejas, prostitucin, hbitos sexuales (el sexo anal facilita la difusin, el sexo oral y la homosexualidad femenina resultan menos eficaces); b) contracepcin - los mtodos de barrera dificultan el contagio, el DIU (dispositivo intrauterino) facilita la infeccin genital ascendente, los anticonceptivos orales (ACO) facilitan el cambio en el comportamiento sexual y el riesgo de exposicin; c) otras ITS con lesiones ulceradas contribuyen a la transmisin. Entre los principales marcadores de riesgo se consideran: a) la edad, siendo la adolescencia y la ectopa cervical de las mujeres jvenes factores favorecedores; b) el sexo: son ms frecuentes en el hombre; c) drogadiccin; d) niveles socioeconmico y cultural bajos.
Transmisin
Dado que la eficacia de la transmisin de ITS no es de un 100%, es necesario un nivel mnimo de actividad sexual y cambios de parejas sexuales, que propague la infeccin. Sin estas condiciones la tasa de curacin superara al ndice de aparicin de nuevas infecciones y la prevalencia llegara a cero. Se plantea la existencia de un ncleo central de poblacin con elevada incidencia de ITS y factores de riesgo, que actuara como reservorio. La poblacin restante se infectara al entrar en contacto en forma transitoria en este ncleo. Las infecciones persistentes como el VIH, herpes genital, etc., no siguen ese esquema de propagacin,
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existiendo un incremento paulatino de la poblacin infectada. Los portadores asintomticos cumplen un rol fundamental en la difusin de muchas ITS, por lo cual su deteccin es muy importante para cortar la transmisin. Para comprender un poco ms la transmisin de la ITS se ha propuesto una frmula que representa todos los parmetros involucrados en ella. Ro = Beta.c.D Ro: tasa de reproductividad de la infeccin-diseminacin Beta: tasa de infectividad c: nmero de parejas sexuales D: duracin de la infectividad Para que una epidemia ocurra Ro tendr que ser mayor que 1. Algunos parmetros varan en los distintos agentes.
Control
Se basa en la educacin y prevencin de salud, la educacin mdica, los programas de deteccin, el diagnstico y el tratamiento precoz, la notificacin de las parejas sexuales, entre otras. Los principales fines del control de las ITS son: evitar la infeccin y sus consecuencias, interrumpir la propagacin y disminuir la epidemia por VIH basado en la relacin de colaboracin de diferentes agentes con este virus. Esto se logra con educacin y promocin de salud, acompaadas de tcnicas de sexo ms seguro, una correcta vigilancia epidemiolgica con programas de deteccin precoz, la notificacin obligatoria, el diagnstico y tratamiento precoces, al igual que el tratamiento de los contactos sexuales. Adems de lo antes mencionado se deben incluir las 4 C: Consentimiento informado del paciente. Consejera: tcnicas de prcticas sexuales seguras con menor riesgo (sexo sin penetracin, uso de preservativos), informacin sobre ITS y sugerencia de realizacin de la prueba serolgica anti VIH. Contactos: a travs de entrevistas se conocen las conductas sexuales del paciente y sus contactos sexuales Condones: correcto uso y evaluacin de sus caractersticas (validez, envase en buen estado, cmara de aire, utilizacin de lubricantes acuosos, su uso durante toda la relacin).
Principales sndromes y sus agentes causales

URETRITIS
Se define como el sndrome caracterizado por aparicin de corrimiento uretral, en general mucopurulento, con disuria o prurito en el meato urinario, como respuesta de la uretra a una inflamacin de cualquier etiologa. Las causas de este sndrome en general son infecciosas y de transmisin sexual, existiendo, sin embargo, tambin otras: qumicas, microtraumatismos, hipersecrecin glandular que puede dar lugar a dificultades diagnsticas. En base a su evolucin se pueden clasificar en aguda, persistente o recurrente. En base a su etiologa en gonoccica, postgonoccica, no gonoccica (C. trachomatis, U. urealyticum, Trichomonas vaginalis, Herpes, etc.) y de etiologa desconocida. La incidencia de las diferentes etiologas variar en nuestro medio de acuerdo al nivel
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sociocultural, existiendo predominio en poblacin de bajos recursos de uretritis gonoccica. Es importante resaltar la frecuente asociacin de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (20%).
URETRITIS GONOCCICA
Es causada por Neisseria gonorrhoeae. Destacamos que es una bacteria extremadamente exigente, tanto desde el punto de vista nutricional como atmosfrico, y en su labilidad frente al ambiente, caractersticas fundamentales a tener en cuenta para su diagnstico. Patogenia N. gonorrhoeae posee variados mecanismos de patogenicidad que enumeramos a continuacin. Pilis (adherencia, pili 4) Protenas de membrana externa: Prot I - endocitosis dirigida por el parsito, resistencia al suero (Por A y Por B); Prot II - adherencia a clulas y entre bacterias (Opa); Prot III - resistencia al suero. Lipooligosacrido Receptores de hierro IgA proteasas El primer paso en la infeccin es la colonizacin de la mucosa constituda por clulas epiteliales cilndricas, dada la respuesta inflamatoria, de inmediato las bacterias toman contacto con los polimorfonucleares (PMN). Se desconoce el mecanismo por el cual una fraccin de las bacterias es eliminada y otra queda viable dentro de los PMN. N. gonorrhoeae se adhiere a las clulas epiteliales por los pili tipo 4 e induce la fagocitosis mediante el reordenamiento de filamentos de actina. Las protenas de membrana externa denominadas Por A y Por B tendran el rol de disparar la fagocitosis (endocitosis mediada por el parsito mediante cambio de potencial de la membrana celular, en la que contribuira Opa). Luego transita hasta la superficie basolateral por donde sale al espacio subepitelial, donde se genera una importante respuesta inflamatoria celular. La infeccin determina una respuesta no protectora, lo que podra deberse a la presencia de antgenos hipervariables (por recombinacin, variacin de fase o cambio de bases repetidas). El lipooligosacrido probablemente sea el responsable de la mayora de los sntomas de la gonorrea, dado que desencadena la respuesta inflamatoria liberando localmente mediadores como FNT , posee actividad endotxica, contribuye a la prdida ciliar, a la muerte de las clulas mucosas, as como tambin contribuye a la patogenia de la infeccin contrarrestando la actividad bactericida del suero. N. gonorrhoeae genera anticuerpos bloqueadores que no permiten el contacto de sus antgenos de superficie con los anticuerpos del husped. Existen adems protenas de membrana externa que actuaran como receptores de los siderforos de otras bacterias para la captacin de hierro, as como tambin captaran hierro utilizando protenas humanas de unin al hierro, como son la lactoferrina y la transferrina. Estos factores, junto a factores del husped tales como presencia de IgA secretoria mucosa y complemento, determinarn que la infeccin pueda ser localizada (presencia de PII) o diseminada (PI, PIII, dficit de complemento, etc.); siendo esta ltima forma de rara aparicin (3%). Clnica Luego de un perodo de incubacin de dos a siete das aparece secrecin mucopurulenta con disuria, que evoluciona a la resolucin en seis meses, pero con elevada incidencia de
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complicaciones y de portadores asintomticos prolongados. La prevalencia de estos ltimos es del orden del 1%, siendo fundamentales en la transmisin de la infeccin. Sus cepas corresponden generalmente a los auxotipos AXU. Existen localizaciones extragenitales como en oftalmia del adulto, faringitis, proctitis en homosexuales, etc., que aparecern de acuerdo a los hbitos sexuales del paciente. Tratamiento Clsicamente se realizaba con penicilina cristalina o ampicilina asociada a probenecid. Actualmente, por la existencia en nuestro medio de 60% de cepas resistentes a penicilina por produccin de -lactamasas (codificadas en plsmidos llamados asitico, africano y toronto, de diferente peso molecular), se prefiere antibiticos como ciprofloxacina (500 mg v.o.), cefixime (400 mg v.o.), ceftriaxona (250 mg i.m.), espectinomicina (250 mg i.m.), como tratamiento de dosis nica, a no ser que se determine que la cepa no posee resistencia a penicilina. Epidemiologa Destacamos que la transmisin de N. gonorrhoeae por nico contacto es del 30% de una mujer infectada al hombre, y del 60% a la inversa. Dentro de los infectados el porcentaje de evolucin hacia una uretritis tpica, atpica o asintomtica, es variable.
URETRITIS NO GONOCCICA
Este sndrome es producto de infecciones por diferentes patgenos como Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Herpes genital, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, etc., de los cuales por frecuencia destacaremos los dos primeros. Etiologa
C. trachomatis
Es una bacteria de pequeo tamao con dos formas en su ciclo de multiplicacin, el cuerpo elemental infectivo extracelular de 300 nm de tamao, y el cuerpo reticular no infectivo intracelular de 1.000 nm. Posee una estructura de pared similar a las bacterias gramnegativas, que contiene antgenos tiles para su diagnstico. Son parsitos intracelulares estrictos que necesitan clulas huspedes para su multiplicacin. Pertenece a la familia Chlamydiaceae, junto con C. psittaci y C. pneumoniae, dos especies causantes de otras patologas. Se clasifica en diferentes serotipos antignicos segn sus protenas de membrana. Los que se denominan de la D a la K son los causantes de uretritis y cervicitis; los L1, L2 y L3 del linfogranuloma venreo (otra rara patologa de transmisin sexual).
PATOGENIA
Posee una protena de membrana que favorece la endocitosis por la clula husped (endocitosis dirigida por el parsito), son internalizadas en endosomas acidificados, luego de lo cual se produce la fusin de los mismos, y tambin se produce un reordenamiento a nivel del citoesqueleto celular que los transporta a nivel perinuclear. Se diferencian en cuerpos reticulados en el citoplasma. Se multiplican y luego nuevamente se diferencian en cuerpos elementales que se liberan al exterior por lisis celular. Otras protenas, llamadas protenas de shock trmico, juegan un rol en la estimulacin inflamatoria, siendo las causantes de mayor lesin y secuelas en el proceso.
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U. urealyticum
Es una bacteria pequea de 300 nm, sin pared celular, muy exigente nutricionalmente (esteroles, etc.), lo que dificulta su cultivo. Pertenece al gnero Ureaplasma integrante de la familia Mycoplasmaceae.
PATOGENIA
El mecanismo de patogenicidad de esta bacteria est en estudio; la presencia de una protena de membrana, junto con la lesin por productos metablicos, jugaran un rol en el mismo.
CLNICA
La uretritis no gonoccica se caracteriza por la presencia de una secrecin mucopurulenta o serosa, clara, matinal, en general sin ardor miccional, con un perodo de incubacin de 4 a 15 das. Pueden presentarse infecciones asintomticas, complicaciones como prostatitis, epididimitis y localizaciones extragenitales, principalmente en el caso de C. trachomatis.
TRATAMIENTO
Se realiza con antibiticos que tengan buena concentracin intracelular durante un perodo de siete das, dado el ciclo de multiplicacin de los grmenes involucrados. Los regmenes recomendados presentan ms del 95% de eficacia y erradicacin microbiolgica, dentro de estos se encuentra el uso de macrlidos de ltima generacin, como azitromicina (1g v.o. en nica dosis), roxitromicina (150 mg c/12 hs durante 7 das), tetraciclinas como la doxiciclina (100 mg c/12 hs durante 7 das).
URETRITIS POSTGONOCCICA
Se denomina uretritis postgonoccica a aquellas que observamos luego del tratamiento con antibiticos que cubren exclusivamente a N. gonorrhoeae. Es generalmente causada por C. trachomatis y U. urealyticum, siendo producto de una infeccin originalmente mixta por N. gonorrhoeae y alguno de estos grmenes. La teraputica es similar a la mencionada anteriormente.
URETRITIS RECURRENTE O PERSISTENTE
Se observa postratamiento de uretritis no gonoccica, fundamentalmente cuando en un inicio no se evidenci germen causal alguno (uretritis de origen desconocido), tambin en casos de uretritis por Ureaplasmas resistentes a tetraciclinas (10%). Se debe plantear la posibilidad de encontrarnos frente a una prostatitis. El tratamiento se realiza repitiendo el inicial pero durante 15 a 21 das; si el cuadro persiste debe investigarse prostatitis o infeccin por Trichomonas. Diagnstico de uretritis Se debe realizar un exudado uretral o, en su defecto, la recoleccin del chorro inicial de orina (15ml), ambos con una retencin previa de orina de 4 horas. El estudio consta de un examen directo con coloracin de Gram de la secrecin uretral, preferentemente realizado con asa bacteriolgica. Valoraremos la presencia de uretritis microscpica definida por la observacin de ms de 4 PMN por campo microscpico (1.000 aumentos) o 5 PMN por campo del sedimento de la orina recogida. Esta coloracin tambin permite la observacin de Neisseria gonorrhoeae (diplococos gramnegativos intrapolimorfonucleares) con una sensibilidad de 95% a 98% y una especificidad de 95%. El hisopado debe sembrarse en medio de cultivo para N. gonorrhoeae (medio de Tha-
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yer-Martin) con incubacin en 5% a 10% de CO2. La investigacin de C. trachomatis se realizar buscando sus antgenos (protenas de membrana o lipopolisacridos) por tcnica de inmunofluorescencia directa y ELISA, respectivamente. U. urealyticum se cultiva en medios especficos comerciales que permiten su identificacin en 24 a 48 horas. La presencia de Trichomonas se determina por centrifugado del primer chorro de orina matinal, observando su movilidad en el sedimento. Esta tcnica es poco sensible, con muchos falsos negativos. Tratamiento sindromtico de uretritis En la actualidad, basados en directivas de la OMS, el manejo de las uretritis puede realizarse en forma global, no discriminando los diferentes agentes etiolgicos. Esto se fundamenta en varios puntos: la dificultad para contar con un laboratorio bacteriolgico de nivel disponible en las diferentes regiones, la asociacin de grmenes ya vista, la baja sensibilidad de muchas tcnicas utilizadas (C. trachomatis 80% a 90%) y el elevado costo de las mismas. En nuestro pas, de acuerdo con nuestras condiciones sanitarias, debe realizarse el diagnstico microbiolgico del agente, realizar la denuncia obligatoria en caso de as requerirse y adems, en vista al diagnstico epidemiolgico de situacin, poder tener datos que nos orienten sobre la prevalencia y la incidencia de cada agente.
CERVICITIS
Al ser el crvix un rgano que responde a los cambios hormonales, sus caractersticas varan con la edad, embarazo, toma de ACO, etc. Estos cambios afectan su anatoma y su susceptibilidad a la infeccin por patgenos cervicales. La cervicitis mucopurulenta es el equivalente de la uretritis masculina, y ocupa un lugar importante en las infecciones de transmisin sexual en la mujer. Su diagnstico y tratamiento no solo importan para el control de las ITS, sino tambin para prevenir complicaciones frecuentes como enfermedad inflamatoria plvica (EIP), parto prematuro, infeccin puerperal y neonatal y neoplasia cervical. Etiologa Los grmenes ms frecuentemente involucrados en infecciones del endocrvix son C. trachomatis, N. gonorrhoeae, plantendose tambin como probable patgeno Mycoplasma hominis. Dentro de las etiologas raras se encuentran el Herpes genital y Trichomonas vaginalis, afectando esta ltima principalmente al exocrvix. Debemos destacar que gran parte de las cervicitis son de carcter inflamatorio, no infeccioso, dado por agresin del pH vaginal, displasias, etc. Clnica El diagnstico clnico de cervicitis mucopurulenta se establece por la presencia de un exudado mucopurulento endocervical, acompaado por edema y eritema de la mucosa, la cual sangra fcilmente al tacto. Diagnstico Se realiza por un exudado endocervical previa limpieza del exocrvix con torunda. Este estudio comienza con un examen directo con coloracin de Gram de la secrecin, en el cual se visualiza la presencia de PMN, tomando como criterio de cervicitis microscpica la existencia de ms de 20 PMN por campo microscpico de 1.000 aumentos. Tambin podemos observar la presencia de N. gonorrhoeae (diplococos gramnegativos intracelulares), contando esta tcnica con un 40% a 60% de sensibilidad y 95% de especificidad. Los cultivos se realizarn
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en medio Thayer-Martin. C. trachomatis se detectar por inmunofluorescencia y ELISA. La presencia de Mycoplasma se detectar utilizando medios de cultivo complejos. El diagnstico de cervicitis es de gran valor en mujeres con flujo vaginal asociado, con el fin de evitar las frecuentes complicaciones que aquella conlleva. Tratamiento El tratamiento especfico etiolgico se realiza igual que en las uretritis.
Enfermedad inflamatoria plvica (EIP)
CONCEPTO
Este trmino comprende las infecciones que afectan los diferentes rganos pelvianos (salpingitis, endometritis, peritonitis plvica).
ETIOLOGA
Dentro de los agentes causantes de EIP se encuentran patgenos de transmisin sexual como C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. hominis, solos o asociados, y otros integrantes normales de la flora vaginal como E. coli, Streptococcus spp., anaerobios como Bacteroides spp. y Peptostreptococcus spp., en general asociados. La incidencia de los diferentes agentes es variable de un pas a otro; en el nuestro no existen estudios que revelen la misma, por lo cual nos basaremos para su teraputica en esquemas extrapolados de realidades internacionales.
PATOGENIA
Segn el origen de los microorganismos involucrados se dividen en exgenos (en su mayora de transmisin sexual) y endgenos (flora vaginal). La va de diseminacin es la ascendente desde el crvix (complicacin de cervicitis) o la vagina. Existen factores de riesgo para que este sndrome ocurra: la cervicitis por N. gonorrhoeae o C. trachomatis, mltiples parejas sexuales, uso de DIU y la edad (los jvenes constituyen el principal grupo de riesgo).
CLNICA
El diagnstico clnico muchas veces es dificultoso por presentar sintomatologa inespecfica. Con el fin de estandarizar el diagnstico se manejan criterios primarios (abdomen inferior doloroso, movilizacin dolorosa del cervix, dolor de anexos) y criterios secundarios (fiebre de 39C), leucocitosis mayor de 10.000, VES mayor de 15mm/hora, aislamiento de N. gonorrhoeae o C. trachomatis en el crvix). El diagnstico se realiza con la presencia de los tres primarios ms alguno de los secundarios.
DIAGNSTICO
MICROBIOLGICO
Se realiza con muestra de lquido peritoneal por laparoscopia o laparotoma; en su defecto, aunque no ideal, tambin por culdocentesis. Se realizan cultivos para N. gonorrhoeae, grmenes aerobios y anaerobios; bsqueda de antgenos para C. trachomatis (ELISA, IF) y cultivo para Mycoplasma. Los cultivos de endocrvix no son representativos de infeccin tubrica, pero orientan en la etiologa y representan una alternativa en caso de carecer de laparoscopia. La utilizacin de PCR en el diagnstico de C. trachomatis ha determinado un aumento de la sensibilidad de este, pudiendo ser aplicado tambin en el diagnstico de los cuadros anteriores (cervicitis, uretritis).
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TRATAMIENTO
El diagnstico y tratamiento precoz es fundamental para evitar secuelas severas como la infertilidad por obstruccin tubrica, el embarazo ectpico, etc. La teraputica est orientada a cubrir todos los agentes posiblemente involucrados, existiendo diferentes pautas para pacientes ambulatorias o internadas. Existen distintos regmenes teraputicos que se pueden utilizar, en general combinan cefalosporinas de primera a tercera generacin o ampicilina/ sulbactam, en combinacin con doxiciclina o macrlidos, pudiendo en ocasiones asociarse tambin metronidazol.
VAGINITIS Y VAGINOSIS
Dentro de las infecciones vaginales destacamos que la nica que constituye ITS es la vaginitis por Trichomonas vaginalis. El flujo vaginal constituye uno de los motivos de consulta mas frecuente de las mujeres en edad reproductiva. Entendemos por flujo al aumento permanente de los trasudados y exudados de causa fisiolgica o patolgica, que se objetivan por la paciente o por el examinador. El flujo fisiolgico es producto de los cambios hormonales del ciclo, y contiene escasa cantidad de leucocitos. La leucorrea puede deberse a infeccin vaginal o cervical. Denominamos vaginitis a la infeccin vaginal con respuesta inflamatoria caracterizada por la presencia de polimorfonucleares en el extendido teido con tincin de Gram. Dentro de los agentes ms frecuentes se encuentra Candida albicans (levadura que integra la flora vaginal normal). Trichomonas vaginalis (protozoario flagelado), tambin es un agente causal, pero menos frecuente. El flujo causado por Candida sp. es de color blanquecino, grumoso (leche cortada), no oloroso, se manifiesta en conjunto con prurito vaginal y tiene pH cido. Puede presentarse conjuntamente con la flora habitual (lactobacilos). El flujo por Trichomonas vaginalis es de color amarillo verdoso, puede ocasionar prurito, presenta olor a aminas voltiles, producto del metabolismo de las bacterias anaerobias asociadas; Determina pH vaginal alcalino y disminucin o ausencia de la flora vaginal, con presencia de flora mixta anaerobia asociada. La vaginosis bacteriana constituye una entidad caracterizada por un cambio en la microecologa de la vagina caracterizada por la disminucin o ausencia de lactobacilos con presencia de Gardnerella vaginalis (cocobacilo Gram negativo) asociada a bacterias anaerobias como Mobiluncus sp., Peptococcus sp. y Bacteroides sp. Se diferencia de la vaginitis en la ausencia de respuesta inflamatoria, o sea en la ausencia de polimorfonucleares. El flujo de la vaginosis es oloroso por la liberacin de aminas voltiles, no ocasiona prurito, se acompaa de pH vaginal alcalino y se caracteriza por la presencia de flora bacterina mixta dispuesta en la periferia de las clulas epiteliales, formando las clulas gua o clue cells. La caractersticas clnicas del flujo son orientadoras, pero debe saberse que en la mayora de los casos, la clnica no condice con los hallazgos microbiolgicos, por lo cual es indispensable el estudio microbiolgico para confirmacin del diagnstico. Diagnstico Se basa en la realizacin de un exudado vaginal. El mismo se estudia con un examen en fresco de flujo extrado del fondo de saco vaginal para observar la movilidad de Trichomonas vaginalis, un examen directo con coloracin de Gram de las paredes vaginales para observacin de levaduras en gemacin o pseudofilamentos que orienten a Candida spp., presencia de clulas
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gua que orienten a G. vaginalis o cocos grampositivos en cadenas que indiquen la existencia de Streptococcus -hemoltico grupo B, otro agente de vaginitis y cervicitis. Se valora tambin el endocrvix en busca de cervicitis asociada. Los cultivos se realizan en agar sangre humana para deteccin del desarrollo de G. vaginalis, Candida spp. y Streptococcus -hemoltico grupo B, necesitando la primera de cuatro a cinco das de incubacin. Tratamiento Ser especfico etiolgico. Para T. vaginalis se utiliza metronidazol en dosis nica de 2 g v.o. o 250mg c/8 hs durante 7 das. En Candida spp. se utilizan vulos de miconazol o nistatina, asociados a ketoconazol o fluconazol v.o. en caso de candidiasis a repeticin. La vaginosis se trata con metronidazol 500 mg c/12 hs durante 7 das. Dado que tanto la vaginosis bacteriana como la vaginitis por Candida spp. no son infecciones de transmisin sexual, no se debe realizar tratamiento a la pareja.
LCERAS GENITALES
Concepto y definicin Las lceras genitales son lesiones que se caracterizan por la prdida de continuidad en el epitelio, en el que se observa una necrosis previa. La lesin inicial puede ser una ppula, pstula o vescula. Constituyen un motivo de consulta frecuente, lo cual plantea la necesidad de una orientacin diagnstica etiolgica adecuada. Las lceras que aparecen en los genitales no son exclusivamente de transmisin sexual, existiendo otras etiologas como traumatismos, reacciones a medicamentos, alergia, lesiones qumicas o evolucin de una infeccin previa no ulcerativa (balanitis). Las etiologas infecciosas de transmisin sexual de estas lesiones son variadas y, dependiendo de la regin considerada, su frecuencia relativa tambin vara. En nuestro medio el herpes genital ( Herpes simplex tipo II y en ocasiones I ) y la sfilis (Treponema pallidum) son los procesos ms frecuentes. El chancroide (Haemophilus ducreii), el linfogranuloma venreo (C. trachomatis L1, L2, L3) y el granuloma inguinal (Calymatobacterium), son muy poco frecuentes. Las manifestaciones clnicas de cada patologa son orientadoras, pero por su asociacin y muchas veces por la presentacin poco especfica, el diagnstico microbiolgico resulta fundamental. Dada la importancia de la sfilis y el herpes genital, nos referiremos exclusivamente a estas.
SFILIS
Es una infeccin sistmica de evolucin crnica producida por Treponema pallidum. Esta bacteria forma parte del gnero Treponema, familia Spirochaetaceae; es una bacteria larga, de forma helicoidal, que se visualiza en microscopio con campo oscuro. Su estructura consta de un citoplasma cilndrico rodeado de una membrana citoplasmtica y una pared celular. Presenta seis filamentos axiales unidos tres a cada uno de los extremos, orientados hacia el centro y superpuestos a ese nivel sin unirse; por fuera de estos se encuentra la membrana externa. Esta bacteria se incurva formando 4 a 14 espirales, y posee un movimiento en sacacorchos. Su multiplicacin se produce por divisin binaria con un tiempo de duplicacin de 30 horas, es anaerobia estricta, y hasta ahora no ha podido ser cultivada. Se plantea la existencia de una capa de slime mucopolisacrido, sintetizada a partir del cido hialurnico de los tejidos del husped que le permite evadir la respuesta inmune. Patogenia. Historia natural de la infeccin Esta enfermedad presenta un perodo de incubacin de 9 a 90 das con una media de 21 das,
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seguido de una lesin primaria o chancro con linfadenopata regional y un perodo secundario bacterimico asociado a lesiones maculopapulares y linfadenopatas generalizadas. Posteriormente existe un perodo de latencia de varios aos y, finalmente, un 30% a 50% de los casos no tratados presentan un perodo terciario caracterizado por destruccin mucocutnea, lesiones parenquimatosas, aortitis y enfermedades del sistema nervioso central. T. pallidum se une a las clulas en la puerta de entrada dando una lesin primaria y se disemina por la sangre. La lesin primaria se produce por la enzima mucopolisacaridasa que degrada el espacio intercelular del endotelio capilar, generando una endarteritis obliterante con necrosis y ulceracin. El husped responde con un infiltrado linfocitario y de clulas plasmticas. La mayor parte del dao se debera a inmunocomplejos, que determinaran la respuesta inflamatoria lesiva. Inmunidad humoral Se estimula precozmente y se mantiene con las lesiones del secundarismo. Anticuerpos inespecficos o reaginas Se forman frente a lpidos de los tejidos destrudos por T. pallidum que actan como haptenos al unirse con la espiroqueta. No son especficos, pero se producen en la totalidad de los infectados. Aparecen una a tres semanas despus del chancro y su ttulo aumenta hasta un mximo en el perodo secundario. En el perodo terciario se encuentran en un 90% de los pacientes. La presencia de estos anticuerpos indica lesin activa, pudiendo existir falsos positivos que debern confirmarse con tcnicas de deteccin de anticuerpos especficos. Las reaginas descienden con el tratamiento, utilizndose como control del mismo. Anticuerpos especficos Aparecen inmediatamente despus de las reaginas y persisten toda la vida si el paciente no es tratado o lo es tardamente. La negativizacin postratamiento es muy lenta, pudiendo demorar aos, por lo cual no resultan tiles como control teraputico sino como confirmacin diagnstica en un paciente con reaginas positivas. Estos anticuerpos pueden ser del tipo IgG o IgM. Estos ltimos se encuentran en la sfilis primaria o en la sfilis congnita. Inmunidad celular Se encuentra deprimida en la primoinfeccin y el perodo secundario, recuperndose postratamiento. Clnica Se puede dividir en dos etapas: la llamada sfilis precoz, hasta los dos aos postinfeccin, y la sfilis tarda, a partir de los dos aos. La primera se caracteriza por curarse fcilmente, ser contagiosa por transmisin sexual y por va trasplacentaria. La sfilis tarda presenta lesiones crnicas, difciles de curar y, en general, no se transmite por contagio sexual.
SFILIS PRECOZ
Presenta un primer perodo llamado de incubacin de tres a cuatro semanas, donde existe bacteriemia treponmica. Le sigue un perodo primario donde aparece el chancro de inoculacin. Se trata de una lesin ulcerada con base edematosa indurada, indolora, en general nica, con localizacin genital y oral y duracin entre cuatro y seis semanas. Esta lesin desaparece luego de este perodo, independientemente de la realizacin de un tratamiento. Es de gran utilidad para el diagnstico, sin embargo, sus caractersticas no siempre son tpicas
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y se plantean problemas de diagnstico diferencial. En este perodo tambin se presentan adenopatas regionales concomitantes con el chancro. Aparecen una semana despus que este, son indoloras y bilaterales. Completa esta etapa la bacteriemia treponmica causante de astenia y cefaleas. Este perodo primario puede no existir cuando el contagio es postransfusin, cuando el chancro no es visible, o cuando es decapitado por el uso de antibiticos a dosis insuficientes. El perodo secundario se caracteriza por manifestaciones generales tales como hepatoesplenomegalia, cefaleas, poliadenopatas y manifestaciones cutaneomucosas como la rosola (exantema), condilomas planos (placas en mesetas de ingles y axilas), siflides (lesiones planas en plantas y palmas). Luego del perodo secundario aparece el perodo de latencia precoz, que se caracteriza por la desaparicin espontnea de las manifestaciones del perodo anterior.
SFILIS TARDA
Se caracteriza por la aparicin de lesiones cutaneomucosas, llamadas gomas (ndulos de piel que se ulceran), lesiones seas (periostetis), lesiones cardiovasculares (aortitis) y lesiones neurolgicas como tabes dorsal y meningitis meningovascular (ms frecuentes en VIH +). Diagnstico directo Trepoinvestigacin: consiste en un raspado de lesiones del chancro primario o la rosola, con observacin de treponemas en microscopio con campo oscuro. PCR: deteccin por tcnicas de amplificacin gentica del genoma treponmico. Diagnstico indirecto Investigacin de reaginas: estas tcnicas se utilizan para exmenes de screening en poblacin y para control de tratamiento. Destacamos que las reaginas se positivizan luego de una a tres semanas del inicio del chancro, dato importante para la indicacin de este examen. Las tcnicas utilizadas son cualicuantitativas con reacciones de antgeno-anticuerpo evidenciadas por floculacin (VDRL) o por aglutinacin de partculas (carbn activado, RPR). Estos anticuerpos deben cuantificarse, ya que su ttulo nos orientar frente a un falso positivo o a un ttulo residual. Investigacin de anticuerpos treponmicos: son tcnicas confirmatorias y de diagnstico en etapas latente o terciaria, pudindose utilizar tambin en la sfilis precoz, ya que se positivizan (principalmente el FTA absorbido) antes que las reaginas. Las ms utilizadas son el FTA absorbido y el TPHA. El FTA es una tcnica de inmunofluorescencia indirecta que utiliza como antgeno a Treponema pallidum liofilizado: puede detectar IgG o IgM. La presencia de anticuerpos contra antgenos comunes del T. pallidum y Treponema saprfitos determina la existencia de falsos positivos por esta tcnica. La absorcin previa del suero problema con treponema no patgeno (cepa Reiter), elimina este problema y la convierte en una tcnica ms especfica. TPHA o tcnica de inhibicin de la hemaglutinacin de T. pallidum est adaptada a microplacas, es de ms fcil realizacin y presenta resultados comparables con la anterior. Tratamiento Sfilis menor de un ao: penicilina benzatnica 2.400.000 UI i.m. Alrgicos a la penicilina: tetraciclinas 500 mg c/6 hs 15 das o eritromicina 500 mg c/6 hs 15 das.
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Sifilis mayor a un ao: penicilina benzatnica 2.400.000 UI i.m. por semana durante tres semanas.
HERPES GENITAL
Es una de las ITS de etiologa viral ms frecuente, con aumento de su incidencia en los ltimos tiempos. La imposibilidad de su erradicacin por tratarse de una infeccin persistente con frecuentes recidivas y el riesgo de contagio fetal en el canal de parto, justifican su importancia y la preocupacin por su control. El agente Herpes Virus simplex tipo II y tipo I (agente del herpes labial) pertenece a la familia Herpesviridae y a la subfamilia Alphaherpesvirinae; es un virus que contiene ADN, siendo su estructura y caractersticas generales tratadas en el captulo correspondiente. Nosotros realizaremos un resumen de la patogenia, clnica y tratamiento de esta infeccin. Patogenia Presenta cinco fases: infeccin primaria mucocutnea, infeccin ganglionar aguda, latencia, reactivacin e infeccin recurrente. La infeccin se inicia con la exposicin al virus, la inoculacin con participacin de clulas epiteliales, la replicacin viral con lisis celular, la rpida respuesta inflamatoria y la posterior diseminacin del virus por nervios sensitivos o autnomos hasta los ganglios regionales (sacros). Tambin se puede diseminar por contigidad, extendindose las lesiones cutneas. En los ganglios se produce una etapa de latencia que persiste toda la vida, con reactivaciones por estmulos de piel (sol, traumatismos, qumicos) y centrales (coito, menstruacin, estrs, infecciones). Clnica Se plantean dos situaciones: 1) la infeccin asintomtica en la que no existe lesin ni antecedentes de la misma, solo estn presentes los anticuerpos contra el virus; 2) la infeccin sintomtica que se clasifica en: a) primoinfeccin herptica con lesiones de piel, sin antecedentes del mismo tipo y sin anticuerpos contra el virus, y b) infeccin inicial no primaria donde existen lesiones actuales sin antecedentes de las mismas, pero con anticuerpos positivos por primoinfeccin asintomtica anterior. Las lesiones se caracterizan por mltiples vesculas dolorosas seguidas de ulceracin y adenopatas inguinales de 10 das aproximadamente de evolucin, pudindose acompaar de fiebre y cefaleas, principalmente en las primoinfecciones. Diagnstico Mtodos directos: estos mtodos, en general, no estn a disposicin en los laboratorios clnicos. El clsico es el de aislamiento del virus en cultivos celulares, tomando muestras del lquido vesicular de la lesin. Otros mtodos ms rpidos son la inmunofluorescencia directa para antgenos virales y PCR para herpes. Mtodos indirectos: los mtodos indirectos de deteccin de anticuerpos son de poco valor para el diagnstico de la infeccin recidivante. En el caso de una primoinfeccin se puede detectar un aumento del ttulo de IgG. La IgM puede ser de utilidad en el diagnstico de infeccin herptica neonatal.
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Tratamiento Se manejan una gran variedad de drogas antivirales, entre las cuales por frecuencia destacamos el aciclovir y el valaciclovir, como ya manifestamos en el captulo de Herpesvirus. El tratamiento acorta los sntomas, principalmente en inmunodeprimidos y en primoinfecciones, pero no logra la eliminacin del virus. Se administra en general localmente en la lesin y tambin por va oral (200 mg c/5 hs durante 10 das), destacamos que el tratamiento de mayor eficacia es el que se realiza por va oral.
VERRUGAS GENITALES - CONDILOMAS ACUMINADOS
Son formaciones verrugosas, vegetantes, de tamao variable, que se localizan en la regin genital y perianal, cuya etiologa es viral: Papilomavirus humano (HPV), un subgrupo de la familia Papovaviridae. Papilomavirus humano es una de las causas ms frecuentes de ITS, tanto en hombres como en mujeres en todo el mundo. An su prevalencia e incidencia persisten desconocidas a pesar de que en Estados Unidos se estima una incidencia anual de 1 a 5,5 millones y una prevalencia de 20 millones. Dicho virus se ha detectado en una amplia variedad de animales as como en humanos, siendo especficos para cada hospedero. Son virus de cpside icosahdrica con 72 capsmeros y un ADN circular de doble cadena. El genoma consiste en una nica molcula de ADN doble circular que contiene dos protenas de la cpside, L1 y L2 . El marco abierto de lectura que contiene las secuencias para codificar protenas ocupa una de las cadenas. El genoma se divide funcionalmente en tres sectores: regin reguladora no codificante; regin temprana E1, E2, E4, E5, E6, y E7, que tienen que ver con la replicacin viral y con la oncognesis; regin que codifica para las protenas de la cpside. La infeccin se produce por contacto piel con piel, o piel con mucosa. En principio la forma ms importante de contagio es por va sexual, no descartndose la va por fomites. El potencial oncognico del virus radicara en principio en que es un virus ADN, cuyo genoma se integra al genoma de las clulas eucariotas del estrato basal del epitelio, produciendo una infeccin productiva o de lo contrario quedando latente y produciendo una infeccin persistente. De ah la importancia de las zonas tempranas E6 y E7 que codificaran para protenas multifuncin que se uniran a las protenas celulares p53 y pRB, alterando sus funciones, alterando la regulacin del ciclo celular, llevando a la clula a la transformacin y malignizacin. La infeccin se expresa clnicamente en cuatro localizaciones: piel, mucosa genital, mucosa larngea (recin nacidos) y mucosa oral. No se ha podido propagar los virus en cultivos celulares, por lo cual se conoca muy poco de los mismos. Gracias a las tcnicas genticas de hibridacin se han podido detectar 60 genotipos, y luego con el advenimiento de tcnicas como la reaccin en cadena de la polimerasa, se han llegado a detectar alrededor de 200 tipos diferentes en base a las diferencias genmicas, habiendo ms de 85 genotipos bien caracterizados. Dado que se asocian con lesiones precursoras del cncer de cuello uterino y con cncer de cuello uterino invasor, se han agrupado en grupos de bajo y alto riesgo (de acuerdo al potencial oncognico). Los tipos de bajo riesgo seran 6, 11, 42, 43 y 44; los tipos de alto riesgo seran 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y 70. Dentro de los de alto riesgo existen algunos tipos que se asocian ms frecuentemente con lesiones precursoras (lesiones intraepiteliales escamosas) que con cncer, algunos autores se refieren a ellos como de riesgo intermedio. Se asocia a una variedad de condiciones clnicas, que van desde lesiones inocuas cutneas
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como pueden ser las verrugas, hasta el cncer. La relacin entre HPV y cncer de cuello uterino fue puesta de manifiesto a principio de los aos 80 por Harold zur Hausen, sabiendo desde entonces que su asociacin era ms fuerte an que la del tabaco con el cncer de pulmn. Actualmente se sabe que 99% de los cnceres escamosos de cuello uterino vienen determinados por HPV, est presente en un 89% de las pacientes menores de 40 aos con adenocarcima de cuello uterino y en un 43% de las mujers mayores de 60 aos con igual diagnstico. Clnica Infeccin asintomtica: piel y mucosas sanas, diagnstico por hiludacin del ADN viral o PCR. Lesin: aparecen masas carnosas y vegetantes en forma de crestas localizadas en zonas hmedas genitales, pudiendo aparecer como papilas ssiles. Aumenta su tamao con el embarazo y la disminucin de la inmunidad celular (VIH +). Infeccin subclnica: no existe lesin macroscpica, el diagnstico se plantea por colposcopia con cido actico al 3% y penescopia con el mismo mtodo y posterior biopsia de los sectores afectados. Diagnstico Es clnico en las formas lesionales. Las formas subclnicas presentan dificultades. La citologa, la biopsia y la colposcopia ayudan, pero muchas veces son poco especficas. El diagnstico especfico se realiza por mtodos de hibridacin del ADN viral o PCR, diferenciando luego mediante sondas marcadas o con enzimas de restriccin los distintos genotipos virales. Por no realizarse de rutina, dado su costo elevado, los mtodos histolgicos son los ms utilizados, llevando a un sobrediagnstico de esta infeccin. Tratamiento Segn pautas recientes (CDC) esta infeccin no debe tratarse por ser una infeccin viral persistente. Los tratamientos se realizarn en aquellos pacientes con lesin evidente, siempre que generen problemas estticos o funcionales. Los pacientes subclnicos y asintomticos debern ser controlados (con colpocitologas en el caso de mujeres) con el fin de detectar precozmente posibles displasias. Las lesiones verrugosas se tratan con mtodos citotxicos como resina de podofilina en solucin alcohlica (10% a 40%) con aplicaciones de 2 a 4 horas 1 o 2 veces por semana (98% con alta recidiva), estando contraindicada en embarazadas o para condilomas cervicales o intrauretrales. Otros mtodos son los quirrgicos, como el curetaje, la electrocoagulacin en lesiones de gran tamao y crioterapia de eleccin en cualquier localizacin. Infecciones generalizadas: SIDA El sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es el ltimo estadio de la infeccin por el VIH, un retrovirus ARN que posee caractersticamente, una enzima transcriptasa reversa (ADN polimerasa, ARN dependiente). Las alteraciones progresivas que resultan de esta infeccin son producto de la destruccin de la poblacin de linfocitos CD4 cooperadores, que altera la respuesta inmune celular y humoral del organismo. Tal alteracin inmunitaria conlleva a la muerte por infecciones oportunistas (Cytomegalovirus, P . carini, etc.) o por neoplasias como el sarcoma de Kaposi, que por otra parte son poco frecuentes en la poblacin en general. La evolucin natural de la infeccin consta de varios estadios: uno inicial de infeccin asintomtica con respuesta inmune normal; un estadio de linfadenopatas generalizadas
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con ligera depleccin inmunitaria; un tercer estadio que presenta el denominado complejo relacionado con el SIDA (ARC), con dficit en la hipersensibilidad retardada, linfadenopatas generalizadas durante ms de tres meses, fatiga y sudores nocturnos persistentes, y una depleccin significativa de la inmunidad (<400 CD4/mm3); y la etapa final o SIDA que presenta una depleccin severa de la inmunidad, infecciones oportunistas, neoplasias y posible encefalitis. Este perodo est definido por la aparicin de determinadas infecciones y neoplasias y un valor reducido de CD4 (<200 CD4/mm3), junto con la documentacin del virus o sus anticuerpos. Patogenia El inicio de la infeccin se produce una vez que el virus ingresa al organismo y se une por medio de una glupoprotena, GP120, al receptor CD4 que se encuentra entre otras clulas en los linfocitos T4 cooperadores. La glucoprotena GP41 acta como anclaje, facilitando la aproximacin y unin a la clula husped. El virus ingresa a la clula, libera su ARN ms la enzima transcriptasa reversa. Se produce la transcripcin del ARN en ADN que se integra al ADN de la clula, inicindose una fase de latencia aparente, ya que existe duplicacin del genoma viral. Esta fase, junto con la de reactivacin, es regulada por genes vricos utilizando mecanismos de retroalimentacin positiva y negativa en conjunto con estmulos externos como sobreinfecciones, etc. Diagnstico Para comprender la metodologa diagnstica se deben conocer las estructuras antignicas del virus que determinan respuestas de anticuerpos (ver Captulo 26). Los anticuerpos anti glucoprotenas de envoltura GP120 y GP41, y protenas de cpside P24, son los ms relevantes para la confirmacin diagnstica. En el transcurso de la infeccin se observa una evolucin y cambio de la presencia en sangre de los antgenos virales y los anticuerpos IgG e IgM especficos. La secuencia de tcnicas aplicadas para el diagnstico consiste en tcnicas de screening como ELISA, hemaglutinacin y aglutinacin de partculas de ltex, muy sensibles pero no tan especficas, y tcnicas de confirmacin como inmunofluorescencia indirecta y Western-Blot, con mayor especificidad. Estas tcnicas han evolucionado a lo largo de los aos mejorando la sensibilidad, especificidad y acortando el perodo ventana a tan slo 15 o 20 das. La tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica directa alterna-
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tiva al cultivo, con buena sensibilidad y especificidad. Es de gran utilidad en el diagnstico de infeccin neonatal. La bsqueda de antgeno P24 en sangre es una tcnica directa ms precoz que la bsqueda de anticuerpos, pero presenta una sensibilidad de 50%. Epidemiologa Las vas de transmisin de este virus, adems de la sexual, son la va parenteral, que es la ms efectiva, y la va vertical (madre/hijo). No se transmite por fomites o insectos vectores. La infeccin vertical del recin nacido se produce en un 10% a 35% a partir de las madres infectadas, antes del inicio del uso de las medidas preventivas correpondientes. La leche materna tambin es un vehculo de transmisin por lo que no est indicado el amamantamiento. Existe una interaccin entre la infeccin por VIH y otras ITS. Las lceras genitales favorecen la infeccin por VIH; la infeccin por VIH a su vez afecta a la sfilis generando una progresin hacia la neurosfilis. El herpes genital se presenta con mayor severidad y con elevada recurrencia, al igual que la infeccin por Papilomavirus. La prevencin de esta infeccin se basa, al igual que la de otras ITS, en el desarrollo de programas de educacin de la poblacin, consejera de hbitos sexuales, utilizacin de preservativos, control de sangre transfundida y disminucin de los ndices de drogadiccin en la comunidad, entre otras. Dentro de este grupo de infecciones generalizadas se encuentran las producidas por virus de hepatitis B y C, Citomegalovirus, etc., que no sern tratados en este captulo.
Bibliografa
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Infecciones hospitalarias
M. Macedo, J. Blanco
La infeccin hospitalaria (IH) o nosocomial es la que se adquiere en el hospital u otro servicio de salud, es decir que no estaba presente ni en perodo de incubacin cuando el paciente ingres a dicho centro. Como regla general se establece un plazo de 48-72 horas luego del ingreso hospitalario para establecer que la infeccin ha sido adquirida en ese centro de salud; este plazo considera el perodo de incubacin de las IH ms frecuentes, pero existen infecciones, como por ejemplo las transmisibles por sangre (hepatitis B, VIH, etc.) que pueden haberse adquirido en el hospital y aparecer luego del alta hospitalaria, y que deben ser consideradas sin embargo como IH. Por ello, es importante conocer el perodo de incubacin del agente en causa para reconocer si la infeccin fue adquirida en el hospital o en la comunidad. En 1847 K.Ignaz Semmelwieis, mdico hngaro radicado en Viena, advirti por primera vez la transmisin intrahospitalaria de infecciones puerperales. Observ que estas infecciones se desarrollaban preferentemente en purperas que haban sido examinadas por estudiantes de medicina que haban realizado necropsias y cuyas manos estaban, por lo tanto, impregnadas de restos cadavricos, qu luego supo eran agentes infecciosos. Instituyendo el lavado de manos con una solucin de hipoclorito de calcio logr disminuir notablemente el nmero de infecciones y su consecuente mortalidad. Semmelwieis realiz as, en esta oportunidad, dos importantes aportes al conocimiento de la patologa infecciosa: la transmisin intrahospitalaria exgena de infecciones (infecciones cruzadas) y la importancia del lavado de manos. Si bien existen y se reconocen desde hace casi 2 siglos, la tendencia temporal es el aumento de casos de IH, y esto se debe en gran medida a los avances tecnolgicos: grandes nosocomios donde se practican procedimientos invasivos como ciruga, transfusiones, asistencia respiratoria mecnica, teraputica intravenosa, cateterizacin urinaria. Tambin es un factor contribuyente el aumento de la sobrevida en los hospitales de individuos particularmente susceptibles: recin nacidos prematuros, inmunodeprimidos, quemados. Muchas son los factores que contribuyen a la patologa infecciosa hospitalaria: Los que dependen del microorganismo: patogenicidad de las especies, virulencia de las cepas, resistencia antimicrobiana. Los que dependen de la susceptibilidad del paciente: edad, sexo, enfermedades subyacentes, estado inmunolgico. El medio ambiente: planta fsica, personal hospitalario, rgimen de visitas. Tratamientos instituidos: inmunodepresores, antimicrobianos, tcnicas invasivas.
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Es oportuno aclarar que no todas las IH son prevenibles; se estima que por lo menos la mitad se producira a pesar de la aplicacin de estrictas medidas de prevencin.
Epidemiologa
La mayora de las IH son de carcter endmico, es decir que se presentan de forma esperada tanto en sus caractersticas como en frecuencia. Ocasionalmente aparecen brotes o epidemias que se localizan en reas especficas del hospital y estn causadas por microorganismos particulares o con resistencia antimicrobiana inusual. La incidencia es difcil de establecer porque estar en gran parte determinada por las caractersticas del nosocomio (estructura edilicia, tamao, nmero de camas y servicios, tipos de servicios) y las medidas de control aplicadas. En general varan entre 2 y 25% de los pacientes admitidos, correspondiendo las tasas ms altas en servicios como los de oncologa, transplantes, CTI, ciruga, y las ms bajas a los servicios mdicos, obstetricia y pediatra. Los agentes etiolgicos de las IH incluyen bacterias, virus, hongos y parsitos, en ese orden de frecuencia. Entre la larga lista de reconocidos agentes de IH se encuentran:
BACTERIAS Acinetobacter Burkholderia cepacia VIRUS Heptitis A, B, C, TTV VIH OTROS Candida spp. Priones: Enfermedad de CreutzfeldtJakob Aspergillus spp.
Clostridium difficile/Clostridium sordellii Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus: SAMS, SAMR hospitalario, SAMR comunitario, GISA
Influenza Virus respiratorio sincicial Parvovirus
Varicella Fiebres hemorrgicas Norovirus SAMS: S.aureus meticilino-sensible; SAMR: S.aureus meticilino-resistente ; GISA : S.aureus con resistencia intermedia a glicopptidos; ERV: Enterococcus vancomicino-resistente.
Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Enterococcus spp., incluyendo ERV y multi-resistentes Enterobacterias multi-resistentes Legionella pneumophila
Rubola SARS Rotavirus
Ecologa y transmisin
Las IH pueden ser exgenas, lo que se denomina infeccin cruzada, o endgenas, es decir las que son causadas por agentes de la propia flora del paciente. A veces es difcil determinar si la infeccin es exgena o endgena Para que ocurra la infeccin exgena debe existir: un reservorio del agente infeccioso (lugar donde se mantiene el microorganismo con capacidad de replicacin), una fuente (sitio desde el cual el paciente adquiere el agente infeccioso), un mecanismo de transmisin (me-
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canismo por el cual el paciente adquiere la infeccin) y una puerta de entrada. El reservorio y la fuente pueden coincidir o ser elementos diferentes. Las puertas de entrada al organismo del paciente pueden ser: la orofaringe y el tracto respiratorio, el ojo, la piel y las mucosas, la uretra, el tracto genital, el tracto digestivo. Es frecuente que el acceso est dado por instrumentos invasivos que alteran las defensas del husped y constituyen reservorios para la persistencia y multiplicacin de los microorganismos.
RESERVORIOS Y FUENTES
Humanos Pacientes: estn colonizados o infectados por microorganismos que son diseminados principalmente por contacto a travs del personal de salud (infeccin cruzada). La flora de estos pacientes tiende a cambiar rpidamente a favor de microorganismos inusuales en la comunidad y de mayor resistencia a los antibiticos. Personal de salud: en general el reservorio ms importante es la piel, donde portan su flora normal, y mucho menos frecuente es que porten y diseminen patgenos nosocomiales. Los microorganismos mejor reconocidos son S.aureus a partir de portacin nasal y EBHA a partir de faringe, recto y vagina. Los trabajadores con infecciones respiratorias altas sintomticas y erupciones cutneas parecen tener riesgo aumentado de transmisin. Es de destacar que la flora hospitalaria se caracteriza por tener perfiles de multi-resistencia a los antibiticos y por estar alterada la flora basal de los pacientes por el uso de antimicrobianos. No humanos Reservorios y fuentes ambientales: sistemas de ventilacin (Aspergillus spp., Legionella), agua (P .aeruginosa, Alcalgenes, Ralstonia picketti, etc.), las paredes y pisos no son reservorios habituales a menos que acumulen suciedad suficiente como para albergar microorganismos en gran cantidad. Dispositivos mdicos: algunos se contaminan durante su uso y otros durante su manufacturizacin. La mayora de las contaminaciones ocurren cuando los dispositivos permanecen hmedos, por ej. por procedimientos de desinfeccin que no son adecuados. Los patgenos involucrados son muchos e incluyen micobacterias atpicas que colonizan vlvulas cardacas protsicas y el agente de Creutzfeld-Jacob que coloniza electrodos implantables. Soluciones: algunos agentes muestran considerable tropismo por ciertos fluidos. Por ej.: soluciones de dextrosa colonizadas por bacterias que pueden fijar nitrgeno atmosfrico (ej.: Enterobacter); soluciones que contienen lpidos pueden ser colonizadas por muchos microorganismos pero sobre todo S.epidermidis y Malassezia; desinfectantes, como el cloruro de benzalconio y los iodforos que se contaminan con Burkholderia cepacia. Los fluidos intravenosos en las unidades de cuidados intensivos pueden contener P .aeruginosa y S.maltophilia.
MODOS DE TRANSMISIN
Contacto Es la forma ms comn. Puede darse contacto a travs de la piel (de aqu la importancia del lavado de manos) o a travs de grandes gotas respiratorias que pueden viajar unos pocos metros. Ej.: B.pertussis, N.meningitidis, EBHA, Adenovirus y Parainfluenza.
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Fecal-oral
En el hospital raramente se adquieren las infecciones entricas comunes (salmonelosis, shigellosis), pero si grmenes que colonizan el intestino: Enterobacter spp., Serratia, E.coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., C.difficile, Rotavirus. Frecuentemente se transmiten a travs de las manos de los trabajadores, y la contaminacin de fomites amplia la distribucin de los grmenes.
A travs de vectores
Principalmente actan como vectores de la flora hospitalaria los trabajadores de la salud. Es rara la transmisin a travs de vectores artrpodos.
Va area
Se refiere a la diseminacin de microorganismo por va de pequeas gotitas que pueden permanecer en el aire por largos perodos de tiempo. Esta forma de transmisin puede darse: de paciente a paciente, por va respiratoria: sarampin, varicela, tuberculosis; a partir del aire ambiental: esporos fngicos, Legionella.
Va sangunea
Este modo de transmisin afecta a los pacientes, a travs de transfusiones de sangre y derivados, a pesar de que ha disminuido notablemente desde que se realiza screening de la sangre donada para los principales agentes transmitidos por esta va. Tambin afecta a los trabajadores de la salud, en quienes representa un riesgo por accidentes. Ej.: HIV, HBV, CMV, HCV, bacterias, parsitos.
Epidemiologa de infecciones nosocomiales especficas

Las infecciones ms frecuentes son las urinarias, seguidas de las respiratorias bajas, las de herida quirrgica y las bacteriemias.
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Infeccin Urinaria
Agentes - BGN fermentadores - Enterococcus spp. (incluyendo ERV) -P .aeruginosa
Factores de riesgo Instrumentacin sobre el tracto urinario, sobre todo cateterizacin, y dentro de este factor importa:
Secuelas Aumento de la hospitalizacin en un promedio de 1 a 8 das. Aumento en el uso de antimicrobianos, con las consecuencias econmicas y ecolgicas; es de destacar que muchas veces se trata de colonizaciones y no de infecciones Alta mortalidad. Aumenta la hospitalizacin en un promedio de 7 das
el tiempo (aumento del riesgo 1-5% por cada da), sexo - Menos frecuentes: femenino, insuficiencia renal, otros BGN fermen- diabetes, colonizacin de la bolsa colectora. tadores (Acinetobacter) El uso de antibiticos disminuye el riesgo para cateterizaciones de corto plazo pero lo aumenta luego del 6 da. - Ventilacin mecnica - Aspiracin - Depresin del nivel de conciencia - Enfermedad pulmonar crnica - Ciruga torcica o abdominal - Frmacos que disminuyen la acidez gstrica - Mucho ms frecuente en cirugas de sitios contaminados o infectados. - Obesidad - Diabetes
Neumonia - BGN fermentadores y no fermentadores - S.pneumoniae - Virus respiratorios - Legionella - Aspergillus Heridas quirrgicas En cirugas limpias: - S.aureus - Staphylococcus spp. Coagulasa negativos en implantes.
Aumento de la hospitalizacin de 5 a 24 das
- Infeccin en otros sitios (ej.: En cirugas abdomi- tracto urinario) nales y plvicas: - Ausencia de profilaxis antibitica en cirugas no limpias - BGN aerobios - Anaerobios - Discutido el papel de los drenajes - Infecciones de heridas quirrgicas, neumonas e infecciones urinarias - Catteres endovasculares - Inmunodepresin
Bacteriemias
- S.aureus - Staphylococcus spp. Coagulasa negativos - E.coli y otras Enterobacterias -P .aeruginosa - Candida albicans
Alta mortalidad. Aumento de la hospitalizacin de 14 a 30 das
ETIOLOGA
Desde la primera descripcin de Semmelweis, que involucraba infecciones por Streptococcus pyogenes, hemos asistido a la circulacin cclica de diferentes patgenos en los centros de salud. A principios del siglo XX, los cocos Gram positivos continuaban siendo los principales
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agentes, especialmente Streptococcus spp. y S.aureus. Controlados estos agentes con las medidas adecuadas y el uso de antibiticos contra grmenes Gram positivos, se observ la emergencia, a partir de 1970, de los bacilos Gram negativos, cobrando importancia las Enterobacterias yP .aeruginosa. A finales de la dcada del 80 y principios de la del 90, el uso de varias clases diferentes de antimicrobianos efectivos contra Gram negativos fue una solucin transitoria para combatir a estos grmenes, y se presenci nuevamente la emergencia de los cocos Gram positivos a la cabeza de las IH, pero esta vez con el problema adicional de la resistencia antibitica: SAMR, GISA y EVR. Hoy en da, aproximadamente un tercio de las IH es causada por S.aureus, Staphylococcus coagulasa negativos y enterococos, mientras que otro tercio aproximadamente es causado por E.coli, P .aeruginosa, Enterobacter spp. y K.pneumoniae. Como ya se ha sealado, con mucha frecuencia estos grmenes muestran multi-resistencia. Son habituales Enterobacterias con beta-lactamasas de espectro expandido (BLEE), Pseudomonas spp. multi-resistentes, incluyendo resistencia a carbapenems, y las resistencias ya mencionadas en cocos Gram positivos. Otra particularidad de la etiologa de las IH es que pueden estar causadas por grmenes oportunistas, es decir de baja virulencia que normalmente no causan infeccin en individuos inmunocompetentes o en la comunidad. El caso ms notorio es el de Acinetobacter spp., un bacilo Gram negativo con muy pocos atributos de virulencia conocidos pero que puede ser resistente frente a todos los antibiticos activos contra grmenes Gram negativos. De esta manera, un agente que suele ser inofensivo fuera del hospital, puede causar la muerte en pacientes hospitalizados. La especie ms frecuente es A.baumanii, y es agente de infecciones respiratorias en pacientes ventilados, infecciones urinarias en pacientes con sonda vesical, infecciones de piel y heridas. Un captulo aparte merecen los virus, importantes agentes de IH cuya importancia se suele sub-valorar debido a las dificultades diagnsticas. Al observar la lista de agentes virales que pueden estar involucrados y sus reservorios y vas de transmisin (en general reservorios humanos y transmisin area), se comprende que estas infecciones son frecuentes. Frente a la dificultad teraputica de las infecciones virales, se puede en cambio reducir estas infecciones con profilaxis adecuada; respecto a este punto, en los ltimos aos se insiste con la vacunacin frente a Influenza virus en el personal de salud para evitar el contagio a los pacientes.
CONTROL Y PREVENCIN DE LAS IH
El control de las infecciones es una disciplina formal en EEUU desde 1950 y surgi principalmente en respuesta a epidemias graves de infeccin estafilocccica nosocomial. Dio lugar a la Epidemiologa Hospitalaria, como programa de monitoreo de rendimiento: originalmente se entenda esta disciplina como la aplicacin de mtodos epidemiolgicos a las IH; actualmente se ha ampliado a otras reas de la salud. El objetivo primario es prevenir la adquisicin de IH y reducirlas. Tambin le compete a los programas de control las infecciones transmitidas a los trabajadores de la salud. El control de las IH comienza por el buen funcionamiento de un Comit de infecciones y la aplicacin de un programa adecuado a las caractersticas del centro. El control de infecciones involucra a todos los trabajadores del centro de salud. Un programa exitoso refleja un hospital bien dirigido. Especficamente debe ser capaz de iniciar cualquier accin necesaria para reducir el riesgo de IH. Estas medidas incluyen desde la decisin de realizar tomas para estudio microbiolgicos o retirar de sus lugares de trabajo al personal portador de enfermedades infecto-contagiosas
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hasta cerrar salas para detener una epidemia. Adems debe tomar parte en decisiones tales como restriccin de horarios de visitas en respuesta a brotes de enfermedades altamente contagiosas, actividades de construccin en el hospital, planificacin de sistemas de informacin, relacin con los medios de prensa, etc. JCAHO (Joint Commission on Accreditation of Health Care Organization) recomienda que las autoridades del programa de control de infecciones sean establecidas claramente por estatuto. Es preferible que el programa sea dirigido por un trabajador de la salud con entrenamiento especfico en control de infecciones y epidemiologa hospitalaria. La mayor eficiencia se obtiene cuando se organiza un comit representado por un amplio espectro de departamentos del
hospital.
El Comit siempre debe contar con los siguientes integrantes: Un representante administrativo. Un representante de cada servicio principal del hospital. Laboratorio de Microbiologa. Departamento de enfermera. Ingeniera. Proveedura. Servicios ambientales. Farmacia. Servicio de salud de los empleados. Departamento de nutricin. Otros de acuerdo a la situacin local.
Funciones del programa de epidemiologa hospitalaria 1. VIGILANCIA: Determinar tasas endmicas para detectar epidemias. Vigilancia basada en datos de laboratorio. Como ya se ha dicho, aunque la vigilancia se lleve a cabo segn los estndares ms estrictos, no siempre es posible traducir sus resultados en actividades efectivas de control; se mostr que las neumonas eran las IH con consecuencias ms graves para los pacientes, pero estas infecciones son las menos pasibles de vigilancia intensiva y medidas de control. As mismo, los pacientes de mayor riesgo generalmente presentan patologas de base que limitan las posibilidades de medidas agresivas de control. 2. INVESTIGACIN DE EPIDEMIAS: Requiere aplicar definiciones significativas de las infecciones, identificarlas y cuantificarlas, y clasificarlas en forma apropiada en base a los factores de riesgo. Requiere asimismo que los agentes etiolgicos en causa sean caracterizados al nivel ms especfico posible (idealmente el genmico) para poder determinar si se trata de una nica clona responsable o ms de una. 3. EDUCACIN: Siendo uno de los pilares ms efectivos, es uno de los aspectos en los que ms se fracasa. Es importante Instruir sobre: reas de control, lavado de manos, esterilizacin y desinfeccin, enfermedades transmisibles. 4. SALUD DE LOS EMPLEADOS: Profilaxis post-exposicin. Vacunacin anti-Hepatitis B e Influenza virus. 5. REVISIN DEL USO DE ATB: Monitorizar el uso de antibiticos y los perfiles de susceptibilidad y correlacionarlos con los agentes utilizados. 6. DESARROLLO DE DISPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE CONTROL 7. EVALUACIN DE CALIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS DE CONTROL
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8. EVALUACIN DE NUEVOS PRODUCTOS A SER INTRODUCIDOS EN EL CENTRO: Se debe ser escptico a la hora de evaluar nuevos dispositivos mdicos costosos que a veces son promovidos agresivamente con el fin de controlar las infecciones. Histricamente, la mayora de estos productos han aumentado los gastos del hospital rindiendo poco beneficio a la reduccin de las IH. Las medidas preventivas consisten en actuar a nivel de la fuente, el reservorio, la transmisin y el husped susceptible. Es sin lugar a dudas a nivel de la transmisin donde se acta con mayor efectividad. A este respecto, volvemos a insistir sobre la importancia del lavado de manos como una medida primordial. Otra medida para prevenir la transmisin son los sistemas de aislamiento: Las antiguas recomendaciones del Centres for Diseases Control and Prevention (CDC) establecan dos estrategias generales: 1. Aislamiento por categoras: basado en los modos de transmisin: a) Estricto, para enfermedades diseminadas tanto por contacto como por pequeas gotitas respiratorias (ej.: viruela). b) De contacto. c) Respiratorio. d) Para tuberculosis. e) Precauciones entricas. f) De drenajes. g) Precauciones para sangre y fluidos: considerado en las precauciones universales. 2. Aislamiento especfico: basado en el modo de transmisin conocido o sospechado de enfermedades especficas lo que permite tomar medidas de aislamiento concretas para cada enfermedad. Asilamiento de sustancias corporales (ASC): es un sistema alternativo que busca superar algunos inconvenientes de los sistemas previos. Se basa principalmente en el uso de guantes por parte del personal que tiene contacto con sustancias potencialmente contaminadas y con membranas mucosas o piel no intacta de los pacientes. El lavado de manos contina recomendndose luego de quitarse los guantes. Agrega precauciones sobre el uso de batas si es probable el ensuciamiento de la ropa y de antiparras si es posible que se salpique la cara. Ventajas: Los guantes proveen una barrera, que adems brinda un margen de seguridad cuando se comete la negligencia de omitir el lavado de manos. Sustituye la mayora de los sistemas tradicionales que bsicamente consisten en medidas de barrera (excluye los patgenos de transmisin area). Es ms fcil monitorizar el cumplimiento del uso de guantes que el del lavado de manos. Si se aplica correctamente, incorpora la mayora de las medidas previstas en las precauciones universales. Desventajas: Los guantes pueden dar un falso sentido de seguridad y resultar en menor lavado de manos. Omisin del cambio de guantes entre pacientes que puede resultar ms grave que el no lavado de manos cuando no se usan guantes, ya que algunos patgenos sobreviven ms tiempo en estos que en la piel. Precauciones universales: Son obligatorias segn OSHA (Ocuppational Safety and Health Administration): Fueron originalmente diseadas para aplicar las antiguas recomendaciones de CDC sobre precauciones para sangre y fluidos, pero estas recomendaciones se han ampliado para incluir la piel y superficies mucosas intactas as como muchos otros fluidos adems de la sangre: pleural, pericrdico, LCR, y cualquier otro fluido visiblemente contaminado con sangre.
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Actualmente el CDC recomienda precauciones estndar y tres categoras de precauciones de transmisin para ciertos patgenos de importancia epidemiolgica. 1. Precauciones estndar: se aplica a todos los pacientes y es la estrategia primaria para un control exitoso de la IH. Sintetiza las consideraciones de las precauciones universales y el ASC. Se aplican a la sangre, todos los fluidos corporales, secreciones y excreciones, piel no intacta y membranas mucosas con independencia de los resultados de pruebas de laboratorio, disminuyendo por tanto el riesgo de infecciones de fuentes tanto conocidas como no conocidas. 2. Precauciones para la transmisin por va area: usado para agentes que son fcilmente dispersables y transmisibles por pequeas gotitas respiratorias (5m de dimetro). Ej.: tuberculosis, varicela, sarampin. 3. Precauciones para la transmisin por grandes partculas: estas son transportadas generalmente por cortas distancias. Ej.: H.influenzae, N.meningitidis, C.diphtheriae, B.pertussis, Y.pestis, M.pneumoniae, S.pyogenes, Adenovirus, Influenzavirus, Parvovirus B19, rubola. 4. Precauciones de contacto: para reducir el riesgo de contacto directo o a travs de fomites. Ej.: bacterias con mltiple resistencia, algunos patgenos entricos (C.difficile, ECEH, rotavirus, HAV, Shigella), patgenos virales en nios (VRS, parainfluenza, enterovirus, etc.), agentes de conjuntivitis viral, fiebres hemorrgicas, patgenos de la piel altamente contagiosos.
PAPEL DE LA MICROBIOLOGA EN LA VIGILANCIA Y EL CONTROL
Una relacin formal y fluida entre el comit de infecciones y el laboratorio de microbiologa es esencial ya que los datos microbiolgicos constituyen el eje central de muchas actividades de vigilancia y control. La vigilancia basada en el laboratorio permite controlar la diseminacin de microorganismos nosocomiales en el momento ms temprano posible, dado que permite confirmar las infecciones clnicamente sospechadas y brinda datos sobre las caractersticas del patgeno, en especial, su sensibilidad antibitica. El laboratorio debe desarrollar polticas y procedimientos de acuerdo a necesidades especficas de este comit. Por ej.: debe realizar reportes inmediatos de aislamientos de inters para el programa de control de infecciones, como bacterias responsables de brotes epidmicos o con resistencia inusual a antibiticos; establecer mtodos de screening para determinadas infecciones en caso de sospecha dentro del hospital; en caso de epidemias, realizar sistemas de tipificacin que no son de uso rutinario; guardar cepas de inters epidemiolgicos (SAMR, enterococos resistentes a vancomicina) en caso de que se necesite su caracterizacin ms sofisticada ms adelante. El director del laboratorio debe asegurarse de contar con suficientes recursos tcnicos y humanos en caso de que un problema infeccioso no esperado supere la capacidad del laboratorio. La resistencia a los antibiticos que se usan empricamente es uno de los problemas ms graves de las IH, por eso muchos laboratorios utilizan mtodos especiales en caso de emergencia de estas cepas para poder detectarlas con prontitud. Ante la eventualidad de una brote, el microbilogo del hospital debe ser capaz de sugerir mtodos para identificar cepas con patrones de resistencia o requerimientos metablicos especficos.
AVANCES EN TCNICAS MICROBIOLGICAS TILES DESDE EL PUNTO DE VISTA EPIDEMIOLGICO
Introduccin de tcnicas rpidas y sensibles de diagnstico viral, ya que antes esto se basaba en datos clnicos.
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Nuevas tcnicas de biologa molecular que sustituyen o complementan las tradicionales (antibiograma, biotipificacin, fagotipificacin) como por ej. PFGE, RAPD, ribotipificacin.
Bibliografa
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SECCIN
III
Etiopatogenia microbiolgica
16. Gnero Staphylococcus 17. Gnero Streptococcus y Enterococcus 18. Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes 19. Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos no exigentes 20. Principales grupos de bacilos grampositivos aerobios 21. Bacterias anaerobias 22. Mycobacterias 23. Chlamydia, Rickettsia y Mycoplasma 24. Leptospira 25. Virus respiratorios 26. Retrovirus y VIH 27. Virus de las hepatitis 28. Enterovirus 29. Agentes virales de gastroenteritis 30. Herpesvirus 31. Agentes de infecciones emergentes. Hantavirus, dengue, BSE
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Pgina 257
16
Gnero Staphylococcus
V. Seija
Resea histrica
Los cocos se asociaron por primera vez a enfermedades humanas cuando fueron observados en materiales purulentos provenientes de abscesos humanos. En 1880 el cirujano escocs Sir Alexander Ogston demostr que cocos agrupados en forma de racimo eran la causa de ciertos abscesos pigenos en humanos. Louis Pasteur arrib a una conclusin similar al mismo tiempo, pero en Pars. En el ao 1882, Ogston llamo a estos cocos Staphylococcus, derivando el nombre de los trminos griegos staphile (racimo de uvas) y kokkus (frutilla). Morfolgicamente, Ogston propuso este trmino de manera de poder diferenciarlos de los estreptococos, formadores de cadenas. Ogston demostr que la inyeccin a ratones de pus conteniendo estos cocos produca los mismos sntomas observados en el humano. Tambin observ que si calentaba el pus y lo trataba con fenol, la enfermedad se prevena.
Introduccin
Staphylococcus aureus se destaca como un importante patgeno humano, produce infecciones tanto en la comunidad como a nivel hospitalario. En la comunidad, las infecciones por S. aureus son a menudo agudas, piognicas y superficiales, aunque tambin puede producir, con menor frecuencia, infecciones profundas como osteomielitis, neumona y endocarditis aguda. A nivel nosocomial S. aureus es un importante agente de infecciones de herida quirrgica, de prtesis y otras. Tambin S. aureus es causa de una serie de infecciones producidas por toxinas como el sndrome del shock txico, la intoxicacin alimentaria y el sndrome de piel escaldada. Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de piel pero produce infecciones crecientes de piel y anexos, colonizando cuerpos extraos y tambin es causa de infecciones profundas en huspedes inmunocomprometidos. Staphylococcus saprophyticus es causa de infeccin urinaria baja en la mujer joven.
Taxonoma
Los miembros del gnero Staphylococcus y Micrococcus son catalasa positivos y hasta hace poco formaban parte de la familia Micrococacceae junto a los gneros Planococcus y Stomacoccus. Estudios genticos han demostrado que Staphylococcus y Micrococcus no estn relacionados.
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Tentativamente el gnero Staphylococcus se coloc dentro de la familia Bacillaceae junto a otros gneros, Bacillus, Gamella, Listeria, Planococcus, etc. Los estafilococos son cocos Gram positivos, catalasa positivos y el diamino cido en el peptidoglicano es la L-lisina. El gnero Staphylococcus posee alrededor de 30 especies, de las cuales destacaremos S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis.
Hbitat
Staphylococcus epidermidis es integrante de la flora normal de la superficie corporal donde sobrevive gracias a sus lipasas, mientras S .aureus se encuentra habitualmente a nivel de la nasofaringe y de zonas hmedas como pliegues inguinales y axilas. A nivel del vestbulo nasal anterior la adherencia parece estar mediada por el contenido en cidos teicoicos. Se estima que el ndice de portacin nasal en los adultos es de alrededor del 20-30%. Expresado longitudinalmente, cerca del 30% de la poblacin puede ser portador permanente, el 50% portador intermitente y el 20% no es colonizado. Algunas poblaciones pueden tener una tasa de colonizacin mayor como el personal de salud, los pacientes en hemodilisis, diabticos, adictos a drogas intravenosas, etc. A pesar que S. aureus posee numerosos factores de virulencia, puede convivir con el husped humano formando parte de su flora normal sin causar ningn dao. Existen ocasiones en que este equilibrio se puede romper. Desde las narinas, los portadores pueden transferir bacterias a diferentes sectores de la piel, aunque habitualmente existe resistencia a la colonizacin de la piel intacta. Sin embargo, un traumatismo (muchas veces desapercibido) puede dar una puerta de entrada al microorganismo. En caso de infeccin, por tanto, S. aureus puede ser muchas veces de origen endgeno.
Morfologa microscpica
Como ya hemos dicho se trata de cocos Gram positivos que poseen tendencia a agruparse en racimos. Tienen una forma esfrica y un dimetro de alrededor de una micra.
Morfologa macroscpica
Para apreciarla debemos contar con un aislamiento de la cepa a estudiar en una placa de Petri. El aislamiento nos permitir observar las caractersticas de las colonias. En medios no selectivos, S. aureus presenta colonias de 1 a 3 mm de dimetro, lisas, levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas y generalmente pigmentadas con un color que puede ir desde el crema al amarillo. La produccin de pigmento se ve favorecida si se incuban los cultivos por 24 a 48 horas adicionales a temperatura ambiente. Cuando crecen en agar sangre ovina se puede observar una zona de -hemlisis alrededor de las colonias. S. epidermidis presenta colonias generalmente de menor tamao y estas no presentan pigmentacin.
Metabolismo
En cuanto a su forma de obtener energa es tanto a travs de la fermentacin como de la respiracin. En cuanto a los requerimientos de cultivo, son no exigentes desde el punto de vista nutricional, creciendo en medios pobres y simples. En su relacin con el oxigeno son aerobios-anaerobios facultativos.
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Resistencia a agentes fsicos y qumicos

Es muy resistente a las condiciones ambientales normales. Es capaz de sobrevivir hasta tres meses en un cultivo a temperatura ambiente. Muere expuesto a temperaturas mayores de 60 C por una hora. En cuanto a los agentes qumicos, es sensible a la mayora de los desinfectantes y antispticos, que lo matan en pocos minutos.
Staphylococcus aureus
Ya hemos comentado las caractersticas comunes del gnero Staphylococcus y ahora analizaremos las que distinguen al patgeno ms importante dentro de este gnero. Desde el punto de vista estructural S. aureus comparte las caractersticas de los grmenes Gram positivos y agrega algunas caractersticas distintivas. La pared celular esta compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano. Se trata de un polmero polisacrido compuesto por cadenas con uniones de tipo (1-4) no ramificadas, que contienen subunidades alternantes de cido N-acetil murmico y N-acetil glucosamina. Las cadenas laterales de pentapptidos se hallan conectadas al residuo de cido murmico y tienen unin cruzada por un puente pentaglicina fijado a la L-lisina de una cadena y la Dalanina de la otra cadena. El polmero polisacrido bsico se halla tambin en muchos otros microorganismos, mientras la cadena de unin cruzada de pentaglicina parece ser especfica de S. aureus. Tiene como funcin mantener la rigidez de la pared bacteriana y su resistencia osmtica. En la patogenia coadyuvara al desencadenamiento de la inflamacin por activacin del complemento, es capaz de atraer leucocitos polimorfonucleares (PMN), estimula la produccin de anticuerpos opsonizantes y tiene actividad similar a las endotoxinas de Gram negativos. El otro componente mayor de la pared son los cidos teicoicos, que constituyen alrededor del 40% del peso de la pared. Estos cidos son polmeros de glicerol o ribitol fosfato, azcares y algunas veces, D-alanina. Estn unidos en forma covalente al peptidoglicano. Cuando estn unidos a la membrana citoplasmtica se les llama cidos lipoteicoicos. S. aureus posee predominantemente cidos de ribitol fosfato, mientras que en los estafilococos coagulasa negativos estos son de glicerol fosfato. La presencia de cpsula es variable pero es importante a nivel patognico, ya que tiene propiedades antifagocticas. Las cepas de S. aureus que poseen cpsula son ms virulentas en modelos animales. No es claro que la cpsula de S. aureus juegue un papel importante en la adherencia. Lo que si se conoce es que la adherencia de este germen a la vlvulas cardacas y cuerpos extraos esta mediada, en parte, por receptores de fibronectina en su superficie. La fibronectina es una glicoprotena importante en varias funciones de adherencia. Las cepas de S. aureus, que muestran grandes cantidades de receptores para la fibronectina, parecen ser ms invasivas y ms hbiles para adherirse. Adems S. aureus puede presentar en su superficie receptores para el colgeno. La pared celular de S. aureus posee una protena caracterstica llamada protena A. Esta tiene la habilidad de unirse a la porcin Fc de las molculas de inmunoglobulina G (IgG), y por tanto funciona como factor de virulencia, ya que interfiere con la opsonizacin y la ingestin de los microorganismos por los PMN, activando el complemento y dando lugar a reacciones de hipersensibilidad inmediata y tarda. Esta protena es inmunognica y se hallan anticuerpos contra ella en sujetos con infecciones graves por S. aureus.
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DETERMINANTES DE PATOGENICIDAD
Cualquier enfermedad infecciosa es el resultado de la interaccin entre el microorganismo causal y el husped. Primero analizaremos los factores de patogenicidad con que cuenta S. aureus. Estos pueden ser divididos en tres grupos (tabla 1): a) Componentes de la pared celular: ya fueron discutidos en la seccin anterior. b) Enzimas: Catalasa: podra funcionar inactivando algunos sistemas de ingestin de los PMN. Coagulasas: tanto la coagulasa libre como el llamado clumping factor actan cubriendo a la clula de fibrina y por tanto hacindola ms resistente a la opsonizacin y fagocitosis. Estafiloquinasas: degradan la fibrina y contribuyen a la invasin de tejidos vecinos. Hialuronidasa: hidroliza la matriz intracelular de mucopolisacridos de los tejidos y por tanto contribuye a la diseminacin a tejidos adyacentes. Lipasas: las cepas de S. aureus productoras de forunculosis crnica son potentes productoras de lipasas que ayudan al microorganismo a diseminarse por los tejidos cutneo y subcutneo. Fosfolipasa C: esta enzima esta asociada con cepas recuperadas de pacientes con distrs respiratorio del adulto y coagulacin intravascular diseminada (eventos que ocurren durante la sepsis). Aparentemente los tejidos afectados por esta enzima se vuelven ms susceptibles al dao y destruccin por componentes bioactivos del complemento y sus productos durante su activacin. S. aureus produce adems, toda una serie de enzimas como las DNAsas, proteasas y fosfatasas que colaboran en el proceso infeccioso y en la produccin de lesiones. c) Toxinas: S. aureus puede producir toxinas de accin general como las hemolticas (, , y ) y la leucocidina, y tambin toxinas especializadas como las exfoliatinas, toxina del shock txico y enterotoxinas. Las hemolisinas son importantes toxinas citolticas sobre una variedad de clulas. hemolisina o toxina: tiene efecto letal sobre una variedad de membranas celulares eucariotas, incluyendo la de PMN humanos, as como tambin la de eritrocitos de diferentes especies animales. Es dermonecrtica si se inyecta en forma subcutnea y es letal para animales si se administra en forma intravenosa. Es responsable de la zona de hemlisis observada alrededor de las colonias de S. aureus. hemolisina: es una esfingomielinasa activa sobre diferentes clulas: leucocitos, eritrocitos, fibroblastos. y hemolisinas: se encuentran en algunas cepas de S. aureus y lisan una variedad de clulas diferentes. Leucocidina: es una exotoxina con efecto txico directo sobre las membranas de los PMN humanos, causando degranulacin del citoplasma, hinchamiento celular y lisis. El modo de accin de esta toxina comprende la formacin de poros que alteran la permeabilidad celular para el potasio y otros cationes. Una inyeccin de esta toxina en modelos animales produce una disminucin severa del nmero de leucocitos. Exfoliatinas o toxinas epidermolticas: son producidas por algunas cepas de S. aureus y consisten en dos protenas, bioqumica e inmunolgicamente diferentes, pero con funciones biolgicas similares. La exfoliatina A es un producto de genes cromosmicos, termoestable y es inactivada por el EDTA, mientras la exfoliatina B es de origen plasmdico, es inactivada por el calor y estable frente al EDTA. Ambas tienen actividad proteoltica, actan como superantgenos y disuelven la matriz mucopolisacrida de
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Tabla 1. Determinantes de patogenicidad de S. aureus

Determinante de patogenicidad Componentes de la pared celular Peptidoglicano cidos teicoicos Protena A Cpsula mucoide Enzimas Coagulasa Estafiloquinasas Hialuronidasa Lipasas Toxinas Hemolisinas Leucocidina Toxina exfoliatina Toxina del shock txico Enterotoxinas Rotura de la membrana celular Alteracin de la permeabilidad celular de fagocitos Epidermlisis Shock Intoxicacin alimentaria Formacin de absceso Destruccin del coagulo Invasin hstica Colonizacin Propiedades Activacin del complemento Antifagoctica Antifagoctica Adherencia
la epidermis, resultando en la separacin intraepitelial de las uniones en el estrato granuloso. Las cepas productoras de una o ambas protenas son responsables del sndrome de piel escaldada (ver ms adelante). Enterotoxinas: se trata de molculas termoestables responsables de la intoxicacin alimentaria producida por algunas cepas S. aureus. El modo de accin de estas toxinas no es an conocido pero se sabe que aumentan el peristaltismo (ver ms adelante). Toxina del shock txico (TSST-1): Es tambin denominada como enterotoxina F. Esta implicada en la patogenia del sndrome del shock txico. Aunque su rol es poco claro tiene una gran cantidad de actividades biolgicas. En modelos animales potencia la actividad letal de pequeas cantidades de endotoxina. Estos tres tipos de toxinas antes mencionadas (enterotoxinas, exfoliatinas y TSST-1) actan como superantgeno, lo que significa que pueden activar linfocitos T directamente (alta afinidad por el complejo de histocompatibilidad tipo II), sin la mediacin de clulas presentadoras de antgeno, resultando en la liberacin de citoquinas. Esto puede determinar importantes efectos sistmicos como fiebre, hipotensin, lesiones en piel, shock, fallo multiorgnico y muerte.
FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED
Las infecciones causadas por S. aureus, no solo dependen de los factores de agresin que este microorganismo posee, sino tambin de alteraciones en los mecanismos de defensa del husped. Dentro de los factores predisponentes del husped tenemos: Defectos de quimiotaxis leucocitaria congnitos o adquiridos (diabetes mellitus, artritis reumatoidea). Defectos de opsonizacin por anticuerpos (hipogamaglobulinemia). Defectos en la muerte intracelular luego de la fagocitosis (enfermedad granulomatosa crnica).
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Heridas de piel (quemaduras, incisiones quirrgicas, eczema). Presencia de cuerpos extraos (suturas, vas venosas, prtesis). Infecciones por otros agentes, particularmente virus (influenza). Enfermedades crnicas como alcoholismo, falla renal crnica, enfermedades malignas, etc.
PATOGENIA
S. aureus produce infecciones de dos maneras: 1. En forma directa, por invasin y posterior destruccin tisular local (proceso supurado), o luego de haberse diseminado por va sangunea. 2. A travs de efectos de toxinas. La tabla 2 muestra los tipos de infeccin que produce S. aureus y la tabla 3 muestra la secuencia de eventos asociados a infecciones serias causadas por S. aureus.
INFECCIONES POR INVASIN
Este tipo de infecciones puede estar producido tanto por cepas de S. aureus residentes como no residentes. El primer paso de la infeccin es la adherencia y colonizacin de las clulas del husped. Se describen tres tipos de adherencia. Por un lado, la adherencia a las clulas de la mucosa nasal mediada por los cidos teicoicos y tambin es importante la adherencia a la mucina de la mucosa nasofarngea. Por otro, la adherencia a piel traumatizada o pequeas disrupciones de piel, as como tambin a objetos extraos y estructuras subendoteliales. Esta adherencia envuelve muchas protenas de la matriz extracelular como fibronectina, fibringeno, elastina, colgeno y otras. Estas protenas interaccionan con diferentes receptores de S. aureus, antes mencionados. Por ltimo, la adherencia de S. aureus a las clulas endoteliales durante los eventos de sepsis es un proceso complejo donde estn involucradas la fibronectina, el fibringeno y la laminina. Una vez los microorganismos atravesaron la barrera cutaneomucosa, llegan al tejido subcutneo o submucoso y se diseminan rpidamente, formando abscesos. Esta es la lesin tpica producida por este microorganismo. Los mecanismos de la invasin son poco conocidos pero a este nivel se desencadena la respuesta inflamatoria del husped que contribuye a la formacin de los abscesos. La respuesta defensiva ms importante por parte del husped son los PMN. Algunas veces el germen puede seguir invadiendo, buscando reas ms profundas y avasculares. Una vez se encuentran alrededor o dentro de los huesos, o protegidos dentro de cogulos, los microorganismos se hacen bastante resistentes al ataque y erradicacin por los mecanismos defensivos del husped. Slo la mayor intensidad de los factores bacterianos junto al fracaso de los mecanismos defensivos del husped puede llevar a que las bacterias puedan llegar a la corriente sangunea, diseminarse y producir focos de infeccin a distancia llamados abscesos metastsicos. Los eventos que llevan a la sepsis y muerte an no son del todo conocidos. Aparentemente los cidos teicoicos y el peptidoglicano podran actuar como la endotoxina de los bacilos Gram negativos. Adems de infecciones de piel y partes blandas, S. aureus puede producir infecciones invasivas como neumona, osteomielitis, bursitis, artritis y otras.
INFECCIONES POR ACCIN DE TOXINAS
Estas infecciones estn causadas por la liberacin al medio de sustancias txicas, que pueden ejercer su accin a cierta distancia del foco infeccioso.
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Tabla 2. Infecciones producidas por S. aureus.

Invasin directa Superficial Piodermas, incluyendo imptigo y paroniquia Infecciones de piel y tejidos blandos, fornculos, celulitis, linfangitis, linfadenitis, etc. Profunda Artritis sptica Osteomielitis Piomiositis Diseminacin por va sangunea Bacteriemia con o sin shock o falla multiorgnica Formacin de abscesos metastsicos (cerebro, pulmn, hgado, bazo, retroperitoneo, rin, tracto genital, etc.) Enfermedades mediadas por toxinas Sndrome de piel escaldada Intoxicacin alimentaria Sndrome del shock txico
Tabla 3. Secuencia de eventos patognicos en infecciones serias causadas por S. aureus

Colonizacin, portador, produccin de toxina Rotura de barrera cutaneomucosa Invasin Celulitis, linfangitis Formacin de absceso Eventual invasin de la sangre Bacteriemia Sndrome de sepsis Componentes de la pared Toxina del shock txico Rol de los mediadores disparados Complicaciones Muerte Abscesos supurados metastsicos, endocarditis, etc. Shock sptico o falla multiorgnica
1. Sndrome de piel escaldada: se debe a la produccin de la toxina exfoliativa en un foco, que luego pasa al torrente sanguneo, pudiendo diseminarse hasta regiones alejadas del foco donde no es posible aislar ningn germen. Esta toxina produce la formacin de ampollas y la subsiguiente descamacin de lminas epidrmicas, que puede estar localizada en una regin o estar diseminada por todo el cuerpo. Se presenta con mayor frecuencia en recin nacidos y nios pequeos. 2. Sndrome del shock txico: es un cuadro grave que en el pasado se ha observado asociado a la utilizacin de tampones vaginales por parte de mujeres jvenes. El microorganismo prolifera en el tampn contaminado y produce la toxina del shock txico. El cuadro clnico esta caracterizado por fiebre, hipotensin, exantema cutneo en manos y pies,
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grados variables de vmitos, diarrea, falla renal, cefalea y conjuntivitis. Evoluciona al shock grave en 48 horas. Tambin se asocia a heridas traumticas o quirrgicas. 3. Intoxicaciones alimentarias: se producen por la contaminacin de alimentos, que suelen ser de elevado contenido en protenas e hidratos de carbono como pasteles, helados y salsas, y con pH superior a 5, que permitirn un rpido crecimiento bacteriano. La mala refrigeracin y conservacin hacen que el microorganismo prolifere, y si es una cepa productora de enterotoxina termoestable, la libera en cantidad suficiente como para producir intoxicacin. El tiempo de incubacin es corto (1 a 6 horas) y los sntomas son vmitos y diarrea de hasta 2 das de duracin, en general sin fiebre, siendo normalmente de rpida recuperacin. Este proceso slo requiere hidratacin y no necesita de tratamiento antibitico.
RESPUESTA DEL HUSPED
La integridad de la barrera cutnea y un sistema fagoctico intacto son los principales mecanismos de defensa contra las infecciones estafiloccicas. La primera lnea de defensa luego de atravesar las barrera cutnea son los PMN y el sistema monocito-macrfago. La movilizacin de las clulas fagocticas hacia el sitio de crecimiento bacteriano requiere la elaboracin de seales microbianas y especficas del husped. El reconocimiento de S. aureus por los fagocitos est mediado por sus receptores para el fragmento Fc de la IgG, por sus receptores para la subunidad C3b del complemento, y posiblemente por otros receptores del complemento. Para ser fagocitado, por tanto, S. aureus debe estar recubierto por C3b o IgG, proceso que se llama opsonizacin. En cepas con cpsula se necesitan anticuerpos anticpsula para la opsonizacin. La protena A tiene, como ya vimos, una importante funcin antifagoctica. Luego de ser fagocitados, la mayora de los estafilococos intracelulares son destruidos rpidamente y degradados dentro de la vacuola fagoctica, pero puede demostrarse la sobrevida de una minora, lo que podra explicar el ndice de recurrencia de algunas infecciones por S. aureus. Durante la infeccin estafiloccica se producen algunos anticuerpos contra distintos antgenos de la pared celular, as como contra varias toxinas. En la actualidad ninguno ha logrado inducir una proteccin completa contra la infeccin por S. aureus.
CUADROS CLNICOS
La lesin caracterstica producida por S. aureus es el absceso, este se puede presentar a nivel de la piel como fornculo. Esta lesin es blanda, eritematosa y caliente. A las 24-48 horas desarrolla una pstula central blanca. Dentro, el material purulento es cremoso, amarillento, y frecuentemente tiene un centro constituido generalmente por un folculo piloso que es el sitio donde la infeccin se inici. Este tipo de infeccin tambin puede aparecer alrededor de cuerpos extraos y entonces el inculo necesario para producir infeccin es ms bajo y la llegada de antibiticos es menor.
RESISTENCIA ANTIBITICA
S. aureus puede poseer resistencia para diferentes antimicrobianos. En general los estafilococos aislados de infecciones comunitarias, hasta hace poco tiempo, no posean muchos genes de resistencia salvo por la produccin de penicilinasa. Sin embargo, actualmente asistimos a la emergencia de cepas comunitarias resistentes a meticilina u oxacilina (ver ms adelante). En cuanto a los aislamientos de origen nosocomial, un elevado porcentaje de los mismos tienen varios determinantes de resistencia y fundamentalmente resistencia a meticilina, asociada a resistencia a aminoglucsidos, macrlidos y quinolonas.
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Resistencia a -lactmicos Existen variados mecanismos que median resistencia a -lactmicos. La produccin de lactamasa inactiva ciertos -lactmicos por medio de la hidrlisis del anillo -lactmico. Estas enzimas atacan a la penicilina G, ampicilinas, carboxipenicilinas y ureidopenicilinas. El producto de hidrlisis carece de actividad antibacteriana. Ms del 90% de los aislamientos de S. aureus produce este tipo de enzimas, tambin llamadas penicilinasas. Parte de la enzima que se produce es excretada al medio externo y parte permanece adherida a la membrana celular. Se han reconocido cuatro variantes de -lactamasa llamadas A, B, C y D. En la mayora de los aislamientos esta enzima es codificada por plsmidos, pero tambin se puede encontrar a nivel cromosmico como parte de un elemento transponible. Por otro lado tenemos la resistencia a meticilina u oxacilina. sta consiste en la produccin de una nueva protena fijadora de penicilina (penicillin-binding protein) PBP , llamada PBP2a o PBP2, no presente en las cepas sensibles. Esta nueva PBP tiene una afinidad disminuida por la mayora de los -lactmicos y cefalosporinas. Se trata de una transpeptidasa, la cual se encarga de la sntesis de la pared cuando las otras PBPs estn inactivas por estar ligadas al beta lactmico. Esta nueva PBP est codificada por un gen llamado mecA que esta presente en el cromosoma de todas las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina. Presumiblemente la regin mec se origino en estafilococos coagulasa negativos y luego se transfiri a S. aureus. Cuando una cepa es resistente a meticilina significa que la cepa es resistente a todos los antibiticos -lactmicos (penicilinas, cefalosporinas y carbapenems). Resistencia a glicopptidos La resistencia a glicopptidos en estafilococos se ha descrito en aislamientos clnicos de estafilococos coagulasa negativos como S. haemolyticus y en los ltimos aos se comenzaron a describir aislamientos de S. aureus con sensibilidad disminuida y tambin resistentes a los glicopptidos. Se necesitan todava ms estudios para establecer el exacto mecanismo molecular de resistencia a glicopptidos. No se han aislado cepas con este tipo de resistencia en nuestro pas. Resistencia a macrlidos En S. aureus la resistencia a la eritromicina tiene dos fenotipos. El primero es conferido por una modificacin del rRNA blanco por enzimas constitutivas o inducibles que metilan un residuo especfico en el rRNA. Este evento resulta en una disminucin de la unin a la eritromicina, a otros macrlidos y a las lincosaminas. Los genes que codifican esta resistencia se encuentran tanto en plsmidos como en el cromosoma. El segundo fenotipo abarca una resistencia inducible a macrlidos. Se trata de un gen localizado en un plsmido que codifica una bomba de eflujo ATP-dependiente. Resistencia a aminoglucsidos En S. aureus la resistencia a aminoglucsidos puede ser consecuencia de uno de tres posibles eventos. 1. Una mutacin cromosmica que codifica una alteracin del sitio de accin en el ribosoma. 2. Transporte inefectivo, lo que produce una resistencia de bajo nivel. 3. La produccin de enzimas modificadoras, el cual es el mecanismo ms comnmente
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encontrado. Estas se pueden codificar a nivel de transposones localizados en plsmidos o en el cromosoma. Resistencia a quinolonas La resistencia a las quinolonas es debida a una actividad disminuida de la girasa, mediada por mutaciones puntuales localizadas en el gen gyrA cromosmico, el gen estructural de la subunidad A de la DNA girasa. Una mutacin puntual en otro gen, el norA lleva a la disminucin de la acumulacin de la droga dentro de la clula. Adems las mutaciones en el gen grlA cromosmico, confieren una resistencia de bajo nivel a las fluoroquinolonas.
PERFILES DE RESISTENCIA
En nuestro pas se pueden describir, en forma esquemtica, la circulacin de tres perfiles de resistencia. Uno esta constituido por cepas de S. aureus sensibles a meticilina u oxacilina, que en ms del 90% de los casos son productoras de penicilinasa y, a veces, pueden tener determinantes de resistencia a macrlidos. El segundo perfil esta constituido por cepas resistentes a meticilina u oxacilina sin resistencia acompaante a otros grupo de antibiticos salvo, a veces, resistencia a macrlidos. Este perfil se le denomina S. aureus meticilino-resistente perfil comunitario (SACOMR), ya que se empez a detectar principalmente en cepas de origen comunitario aunque actualmente ya se detecta a nivel hospitalario. El tercer perfil esta constituido por cepas multirresistentes que poseen resistencia a meticilina, asociada a resistencia a aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos, donde prcticamente la nica opcin teraputica es la vancomicina. Este tipo de cepas se asla mayoritariamente de infecciones de origen nosocomial.
Staphylococcus epidermidis
El grupo de estafilococos coagulasa negativos est constituido por un gran numero de especies. En la tabla 4 se pueden ver las especies relacionadas con patologa humana. S. epidermidis es una de las especies que ms frecuentemente se asla. Comparte las caractersticas del gnero con respecto a la morfologa y fisiologa. En relacin a la estructura, a nivel de la pared celular, a diferencia de S. aureus, los puentes de pentaglicina del peptidoglicano no estn presentes y se sustituyen algunas molculas de glicina por L-serina. Con respecto a la patogenicidad, S. epidermidis es capaz de producir macromolculas de superficie y extracelulares, que inician y luego aumentan la adhesin bacteriana a la superficie plstica de cuerpos extraos. La adherencia inicial de S. epidermidis parece estar mediada por una adhesina polisacrida llamada PS/A y otras protenas de superficie. La PS/A se trata de un polmero de galactosa-arabinosa de alto peso molecular. Los anticuerpos dirigidos contra PS/A bloquean la adherencia de S. epidermidis. Luego de la adherencia inicial, hay otra fase llamada de adherencia intracelular que es mediada por un polisacrido llamado PIA y una protena extracelular. Esto permite la formacin de varias capas de clulas bacterianas adheridas entre si que forman el llamado slime o biofilm. Este slime sirve para proteger a los microorganismos de los agentes antimicrobianos y de las clulas fagocticas. En general, es necesaria la remocin del cuerpo extrao para lograr la cura de la infeccin. El slime parece tener otras actividades biolgicas, dentro de las cuales se cuentan la inhibicin de la proliferacin de linfocitos T y un efecto adverso sobre la opsonizacin y fagocitosis. Las infecciones causadas por S. epidermidis se relacionan con la colonizacin de cuerpos extraos, especialmente en el paciente hospitalizado. En el caso de la colonizacin de catteres
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Tabla 4.
Especies de Staphylococcus coagulasa negativos relacionadas con infecciones humanas S. epidermidis* S. xylosus S. saprophyticus* S. cohnii S. capitis S. simulans S. warneri S. auricularis S. haemolyticus S. lugdunensis S. hominis S. schleiferi S. saccharolyticus S. pasteuri S. caprae *Especies que ms frecuentemente se aslan en infecciones humanas
intravenosos, puede aparecer flebitis y fiebre, y eventualmente se produce una bacteriemia y sepsis. La colonizacin de vlvulas cardacas protsicas puede producir endocarditis precoces y tardas. Estas infecciones conducen, en casos graves, a la retirada de la vlvula contaminada. La utilizacin de otros dispositivos como prtesis osteoarticulares, catteres peritoneales y derivaciones de lquido cefalorraqudeo, tambin pueden ser susceptibles a contaminacin por S. epidermidis. Ya que la mayora de estos cuadros se producen dentro del mbito hospitalario, las cepas de S. epidermidis aisladas frecuentemente son resistentes a meticilina. Estas cepas, adems, pueden presentar los mismos genes de resistencia ya comentados para S. aureus. La mayora de las veces que aislamos S. epidermidis de una muestra clnica en el laboratorio de microbiologa, este constituye un contaminante. Esta especie, al ser flora normal de piel, muchas veces contamina las muestras en el momento de la toma, creando dificultades para interpretar los resultados de los cultivos. Es el contaminante ms importante en muestras de hemocultivo, lquidos biolgicos o exudados de herida, donde su aislamiento debe ser interpretado con precaucin, teniendo en cuenta las condiciones de extraccin de la muestra y la condicin clnica del paciente.
Staphylococcus saprophyticus
Presenta caractersticas similares a S. epidermidis pero es resistente a la novobiocina y la composicin de los cidos teicoicos es de fosfato de ribitol. Se encuentra ampliamente distribuido siendo causante de hasta el 20% de las infecciones urinarias extrahospitalarias en mujeres jvenes, causan afecciones del tracto urinario bajo sin alteraciones estructurales. No presenta problemas de resistencia antibitica.
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
Adems de los datos clnicos y epidemiolgicos, fundamentales para la orientacin diagnstica, es preciso confirmarlo con el diagnstico microbiolgico. Toma de muestras Se realizar de la forma habitual, en procesos generalizados con posibilidad de bacteriemia se realizarn hemocultivos. En el caso de procesos supurados se realizar la toma de la muestra con aguja y jeringa, siempre que sea posible. Los estafilococos son bastante resistentes a las condiciones ambientales adversas pero de todas maneras es necesario tomar precauciones en el transporte y conservacin de la muestra.
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Examen directo En el caso de procesos supurados, el examen directo de la muestra con tincin de Gram nos permitir observar los cocos Gram positivos agrupados en racimos, junto a un gran nmero de leucocitos polimorfonucleares. Cultivo En cuanto a los requerimientos atmosfricos el gnero Staphylococcus es aerobio-anaerobio facultativo, por tanto su crecimiento en caldo tioglicolato se har en toda la extensin del tubo. Desde el punto de vista nutricional es no exigente, por lo tanto crece tanto en medios de cultivo pobres, como el agar simple, como en medios ricos, como el agar sangre ovina.
Identificacin
PRUEBAS BIOQUMICAS
Las pruebas o ensayos bioqumicos son aquellas reacciones que ponen en evidencia la existencia de una enzima o pasos metablicos determinados, y que muchas veces nos permiten llegar a la identificacin a nivel de especie. Ahora enumeraremos las pruebas bioqumicas necesarias para la identificacin de los estafilococos.
PRUEBA DE LA CATALASA
Objetivo: separar Staphylococcus y Micrococcus (catalasa positivos) de los gneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa negativos). Fundamento: la enzima catalasa descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno bajo la frmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto txico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azcares. Procedimiento: se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiere una porcin de colonia sobre el H2O2 realizndose una emulsin. En lo posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre, ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados. Esta prueba tambin puede realizarse a partir de un cultivo en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2 dentro del mismo. Interpretacin de resultados: el desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva. Para diferenciar Staphylococcus de Micrococcus se realizan distintas pruebas bioqumicas que se mencionan en la tabla 5. La lisostafina es una endopeptidasa que cliva los puentes de pentaglicina presentes en la pared de lo estafilococos, por eso el gnero Staphylococcus es sensible a su accin. Dentro del gnero Staphylococcus existen tres especies que se consideran de mayor imTabla 5
Caracteres G. Staphylococcus G. Micrococcus Lisostafina S R Sensibilidad a bacitracina R S (disco 0,04 U) Utilizacin de + glucosa anaerobia +, reaccin positiva; -, reaccin negativa; S, sensible; R, resistente.
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portancia mdica: S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis. Estas se diferencian segn las pruebas bioqumicas que se detallan en la tabla 6.
Tabla 6.
Caracteres S. aureus S. saprophyticus Coagulasa + DNAsa + Nucleasa termoestable + Presencia de protena A + Susceptibilidad a la novobiocina R R +, reaccin positiva; -, reaccin negativa; S, sensible; R, resistente. S. epidermidis S
PRUEBA DE LA COAGULASA
Objetivo: permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que genricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos (ScoN). Fundamento: S. aureus posee dos tipos de coagulasa: a) Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que est unida a la pared celular. Esta acta directamente sobre el fibringeno provocando la formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado (test en lmina). b) Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la activacin de un factor srico (CRF), formndose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibringeno producindose un cogulo de fibrina (test en tubo). Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lmina nos sirve como una rpida y econmica tcnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarn negativas en el test en lmina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en tubo. Test en lmina Procedimiento: se emulsionan sobre un portaobjetos una o ms colonias en una gota de suero fisiolgico hasta formar una suspensin lechosa. Luego se agrega, al lado, una gota de plasma citratado de conejo y se mezclan. Interpretacin de resultados: debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la formacin de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo. Test en tubo Procedimiento: se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a 35 C y se chequea la formacin del cogulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el cogulo luego de 18 horas de incubacin y de esta manera se produzcan un test falso negativo. Interpretacin de resultados: se observa la formacin de un cogulo total o parcial si el test es positivo.
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AGLUTINACIN CON PARTCULAS DE LTEX
Objetivo: permite separar S. aureus de otras especies de estafilococos. Es un test alternativo para detectar la presencia de la coagulasa y la protena A. Fundamento: se utilizan partculas de ltex cubiertas con plasma. El fibringeno se une al ltex y detecta el clumping factor. Adems, las inmunoglobulinas presentes en las partculas detectan la protena A, capaz de unirse a la porcin Fc de la IgG. Procedimiento: se trata de test comerciales por lo cual cada formulacin tiene su procedimiento especfico. Generalmente se mezcla el reactivo del test con una porcin de la colonia. Interpretacin de resultados: la formacin de grumos indica un test positivo.
PRESENCIA DE DESOXIRRIBONUCLEASA (DNASA)
Objetivo: permite diferenciar S. aureus que posee DNAsa de otras especies del gnero Staphylococcus. Fundamento: se basa en la presencia de la enzima DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molcula de DNA. Se utiliza un medio slido que contiene verde de metilo, el cual se combina con DNA altamente polimerizado. Cuando la combinacin no ocurre, por accin de la enzima DNAsa, se produce una decoloracin del medio. Existen otros tipos de medios de cultivo como el que contiene azul de toluidina metacromtico en vez de verde de metilo. Procedimiento: se siembra una colonia de estafilococo en forma de moneda en una placa de medio slido que contiene DNA y verde de metilo. Se incuba 18 horas a 35 C. Interpretacin de resultados: la formacin de un halo transparente alrededor de la siembra indica presencia de DNAsa.
PRESENCIA DE NUCLEASA TERMOESTABLE
Objetivo: permite diferenciar S. aureus, que posee esta enzima, de otras especies que no. Fundamento: se basa en la presencia de nucleasa termoestable, que es una enzima con propiedades endo y exonucleolticas y capaz de clivar DNA y RNA. Existen varias formas de investigar la presencia de esta enzima. Se utilizan cualquiera de los medios slidos mencionados en la prueba anterior pero en estos se realizan hoyos de aproximadamente 3 mm de dimetro. Procedimiento: cada hoyo se llena con un cultivo en caldo de la cepa en estudio, que ha sido previamente llevado a 100 C por 15 minutos. Se incuba 18 horas a 35-37 C. Interpretacin de resultados: se interpreta igual que la prueba anterior.
SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Objetivo: separar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los dems estafilococos coagulasa negativos. Fundamento: varias especies del gnero Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco de 5 g.) dentro de las cuales se encuentra S. saprophyticus. Procedimiento: se siembra una placa de agar sangre o agar Mueller-Hinton como si se fuera a realizar un antibiograma. Se utiliza un hisopo embebido en una suspensin, con una turbidez equivalente a un Mc Farland 0,5, de la cepa a estudiar. Luego se aplica el disco de novobiocina y se incuba a 35 C por 18 horas. Interpretacin de resultados: un halo de inhibicin de crecimiento menor o igual a 16
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mm corresponde a S. saprophyticus. Un halo de inhibicin mayor de 16 mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos.
SISTEMAS DE IDENTIFICACIN COMERCIAL
Las pruebas anteriormente descritas se utilizan en forma manual pero existen sistemas de identificacin comercial para identificar las especies dentro del gnero Staphylococcus. Los kits comerciales disponibles utilizan, para la identificacin, test de fermentacin de azcares modificados, adaptacin de test manuales estndar y substratos enzimticos cromognicos. Estos sistemas de identificacin son adaptados a un formato particular utilizado por el fabricante (por ej.: tira con microcpulas, tarjetas plsticas, pequeas bandejas, etc.). Existen tambin sistemas de identificacin a nivel molecular. Para S. aureus existen sondas genticas para su deteccin rpida con un 100% de especificidad.
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Gneros Streptococcus y Enterococcus

G. Rodrguez
Los gneros Streptococcus y Enterococcus estn formados por bacterias esfricas u ovoides que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La mayora son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporos, catalasa negativos e inmviles, y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales. La infeccin estreptoccica es una de las ms frecuentes, siendo algunos de los cuadros ms importantes relacionados con el gnero: amigdalitis aguda, otitis media, sinusitis, neumona, meningitis, infeccin del tracto urinario, infeccin abdominal o cutnea, etc. Las infecciones ms frecuentemente asociadas con el gnero Enterococcus son la endocarditis, las infecciones urinarias y la colonizacin o sobreinfeccin de enfermos que reciben tratamiento con antimicrobianos, especialmente cefalosporinas.
Taxonoma
No existe un sistema de clasificacin sencillo para diferenciar este heterogneo grupo de microorganismos y la misma est sometida a revisin constante. Por el contrario, la clasificacin depende de una combinacin de caractersticas, incluyendo: patrn de hemlisis en placas de agar sangre, composicin antignica, caractersticas de crecimiento, reacciones bioqumicas y, ms recientemente, anlisis gentico. La tecnologa de hibridacin del DNA ha revolucionado la taxonoma, poniendo de manifiesto que los enterococos son tan diferentes del resto de los estreptococos, que constituyen un nuevo gnero, ubicado dentro de la faminilia Enterococcaceae. Cuando los estreptococos son cultivados en agar sangre se puede observar, adems de la morfologa macroscpica caracterstica de cada cepa, la presencia de un halo transparente alrededor de la colonia donde los glbulos rojos han sido completamente lisados. Este patrn es designado hemlisis de tipo beta y es de considerable importancia ya que la exhibe Streptococcus pyogenes y muchos otros Streptococcus patgenos humanos. Un segundo grupo de microorganismos, produce hemlisis parcial o hemlisis alfa, observndose como un halo verdoso alrededor de la colonia; perteneciendo a este grupo S. pneumoniae as como otros Streptococcus que habitan el tracto respiratorio superior y gastrointestinal del hombre. Finalmente, el trmino hemlisis gamma se utiliza para designar aquellas especies que no producen hemlisis, aunque el trmino estreptococo no hemoltico es preferible. Una identificacin ms precisa de los estreptococos betahemolticos fue creada por Rebecca Lancefield. Esta clasificacin en serogrupos esta basada en las diferencias antignicas
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de los carbohidratos de la pared celular. Los antgenos de grupo son rpidamente extrables de la pared celular e identificables por reacciones de precipitacin usando antisueros especficos. Los estreptococos que carecen de antgeno de grupo reconocible son identificados por caractersticas fenotpicas (reacciones de fermentacin, produccin de enzimas) y por hibridacin del DNA. En la actualidad se reconocen aproximadamente 30 especies de Streptococcus; siendo algunas de las especies de mayor importancia en patologa humana: S. pyogenes (estreptococo del grupo A), S. agalactiae (estreptococo del grupo B), y S. pneumoniae (neumococo).
Principales serogrupos de Streptococcus en enfermedad humana.
Serogrupo A Antgeno grupo especfico de la pared celular Ramnosa-N-acetil-glucosamina Aspectos clnicos Faringitis, amigdalitis, escarlatina, erisipela, imptigo, celulitis, secuelas no supurativas: fiebre reumtica, glomerulonefritis Corioamnionitis, sepsis puerperal y neonatal, meningitis neonatal Infecciones respiratorias altas Infecciones del tracto genitourinario, heridas, endocarditis Infecciones respiratorias altas, celulitis, sepsis
B C D G
Ramnosa-glucosamina Ramnosa-N-acetil-galactosamina cido glicerol teicoico Ramnosa-galactosamina
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A) es una de las bacterias ms importantes en patologa humana. Este ubicuo organismo es la causa bacteriana mas frecuente de faringitis aguda y tambin da lugar a una gran variedad de infecciones cutneas y sistmicas. Ocupa un lugar especial en la microbiologa mdica por ocasionar dos secuelas no supurativas, fiebre reumtica (FR) y glomerulonefritis difusa aguda postestreptoccica (GNDA).
CARACTERES MICROBIOLGICOS
Streptococcus del grupo A (SgA) se presenta microscpicamente como clulas esfricas u ovoides de 0.6-1.0 m de dimetro y se agrupa en pares o cadenas de longitud variable en muestras clnicas, o cuando crece en medios lquidos enriquecidos con suero o sangre. Son, al igual que el resto de los estreptococos, Gram positivos, inmviles, no formadores de esporos, catalasa negativos y, facultativamente anaerobios. SgA es exigente desde el punto de vista nutricional, requiriendo medios complejos enriquecidos con sangre para su desarrollo ptimo. Cuando crece en medios slidos con sangre se observa alrededor de las colonias grises de 1-2 mm de dimetro un halo de hemlisis beta (pueden existir cepas que no la exhiban, pero es excepcional). Se han identificado un gran nmero de componentes estructurales y productos extracelulares en SgA. A continuacin sern reseados los ms importantes.
COMPONENTES CELULARES
a) La cpsula es la capa mas superficial que envuelve al microorganismo y est compuesta por cido hialurnico, encontrndola en los microorganismos solamente cuando estn
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b) c)
d)
e)
cursando enfermedad en el husped. Es un factor de virulencia accesorio que dificulta la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares y macrfagos del husped. El carbohidrato especfico de grupo (carbohidrato C) est constituido por un dmero de ramnosa y N-acetil glucosamina. El mucopptido (peptidoglicano) que le confiere rigidez a la pared, al cual se unen protenas, carbohidratos y lipoprotenas. Sus componentes tienen carcter antignico y pueden contribuir a la patogenicidad. La protena M es uno de los principales factores de virulencia de SgA. Se localiza en estructuras fibrilares confirindole a las cepas ricas en ella, resistencia a la fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares. Las cepas que no la expresan son avirulentas. SgA puede ser dividido en serotipos basndose en las diferencias antignicas de la molcula de protena M. Alrededor de 80 serotipos son reconocidos actualmente. La inmunidad adquirida contra la infeccin estreptoccica est basada en el desarrollo de anticuerpos opsonizantes dirigidos contra la porcin antifagoctica de la molcula de protena M. Tal inmunidad es tipo-especfica y permanece por varios aos, tal vez indefinidamente. En algunos casos se ha demostrado proteccin cruzada por anticuerpos de un serotipo contra organismos de un serotipo heterlogo. La protena M es una macromolcula filamentosa que se encuentra como un dmero estable con una estructura alfa helicoidal. Se encuentra anclada a la membrana celular y atraviesa la pared celular. La porcin proximal de la molcula contiene eptopes conservados en todos los SgA, mientras que la porcin distal contiene eptopes tipo-especficos. Esta configuracin localiza el sector tipo-especfico en la punta de las fibrillas, protruyendo en la superficie celular (figura 1). En el husped no inmune, la protena M ejerce su efecto antifagoctico al inhibir la activacin de la va alterna del complemento en la superficie celular. Este efecto es mediado, en parte, por la habilidad de la protena M de precipitar fibringeno directamente en la superficie bacteriana. El efecto antifagoctico es anulado en presencia de concentraciones adecuadas de anticuerpos tipo-especficos. El factor de opacificacin del suero (FO), es otro antgeno estrechamente asociado a la molcula de protena M. Este factor es una alfa-proteinasa que es detectada por su propiedad de opacificar el suero de caballo. No todas las cepas de SgA tipificables por la protena M poseen este factor. El FO es antignico y tipo-especfico, es decir que su habilidad para opacificar el suero puede ser inhibida por anticuerpos homlogos y no heterlogos de protena M. Esta sustancia es importante principalmente por dos razones: es un marcador epidemiolgico muy til que ayuda en la clasificacin de los estreptococos cuando no es detectable por el tipo de protena M.
Figura 1.
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la respuesta tipo-especfica y no tipo-especfica a la protena M es generalmente ms dbil despus de una infeccin farngea con FO positivo que con serotipos FO negativos. f) Las protenas T y R constituyen otro complejo antignico que no intervienen en la patogenicidad del microorganismo, pero son de utilidad para completar la tipificacin de Streptococcus, especialmente en las cepas no identificables por la protena M. g) La protena F, no fibrilar, juega un rol crtico en el primer paso de la colonizacin, que es la adherencia de SgA a la molcula de fibronectina, glucoprotena situada en la superficie de las clulas epiteliales humanas. El cido lipoteicoico formado por unidades de poliglicerol fosfato unidas a lpidos, podra jugar tambin un rol en la adherencia, en asociacin con protenas de superficie. h) Recientemente se ha descrito una peptidasa unida a la clula que cliva el componente C5 del complemento e inhibe la quimiotaxis de los neutrfilos in vitro e in vivo.
PRODUCTOS EXTRACELULARES
Durante el desarrollo in vivo e in vitro, SgA elabora numerosos productos extracelulares, pero solamente un nmero limitado de ellos han sido bien caracterizados. Algunos poseen carcter antignico, y la determinacin de anticuerpos frente a ellos se utiliza para establecer el diagnstico de infeccin estreptoccica reciente. a) Hemolisinas: existen dos tipos de hemolisinas elaboradas por SgA que se denominan O y S. La estreptolisina O deriva su nombre de su oxgeno labilidad. Es reversiblemente inhibida por el oxgeno e irreversiblemente por el colesterol. Adems de su efecto ltico sobre los eritrocitos es txica sobre una variedad de clulas y fracciones celulares, incluyendo leucocitos polimorfonucleares, plaquetas y lisosomas. La estreptolisina O es producida por casi todas las cepas de SgA (as como por algunos organismos de los grupos C y G), y es antignica. La titulacin de los anticuerpos antiestreptolisina O (AELO) en suero humano ha probado ser una prueba til como indicador de infeccin estreptoccica reciente. La estreptolisina S es una hemolisina producida por los estreptococos en presencia de suero (de ah S) o en presencia de una variedad de otras sustancias tales como albmina, alfa-lipoprotena, RNA. La estreptolisina S no es antignica. Tiene la capacidad de daar la membrana de leucocitos, plaquetas y organelos subcelulares. No es inactivada por el oxgeno pero es termolbil. Dadas las caractersticas de ambas hemolisinas se observa que la hemlisis en la superficie de las placas de agar es debida primariamente a estreptolisina S, en tanto la hemolisina O exhibe su efecto en la profundidad del agar debajo del desarrollo bacteriano. b) La exotoxina pirognica estreptoccica (SPE), antes conocida como toxina eritrognica, es responsable del rash de la fiebre escarlatina. Experimentalmente, esta sustancia exhibe una variedad de otras propiedades txicas incluyendo pirogenicidad, citotoxicidad, y aumento de la susceptibilidad a los efectos letales de la endotoxina. La produccin de toxina est inducida por la presencia de un fago temperado en fase lisognica. Se conocen 10 toxinas serolgicamente diferentes (A-J), cuyos efectos pueden ser neutralizados por anticuerpos. Se trata de exotoxinas que actan como superantgenos, es decir, productos que estimulan de modo intenso e inespecfico el sistema inmune. c) Muchos productos extracelulares, pueden tericamente, favorecer la licuefaccin del pus y la diseminacin de los S. pyogenes a travs de los diferentes planos tisulares. Estos incluyen:
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cuatro enzimas antignicamente distintas que participan en la degradacin de DNA (DNAsas A, B, C y D); hialuronidasa, que degrada enzimticamente al cido hialurnico del tejido conectivo; estreptoquinasa, la cual promueve la disolucin de cogulos al catalizar la conversin del plasmingeno en plasmina. d) Otros productos extracelulares son: NADasas, proteinasa, amilasa y esterasa. La mayora de las sustancias recientemente enumeradas son antignicas y los anticuerpos para cinco de estos productos han sido usados para serodiagnstico de infeccin por SgA. Ellos son: anti-DNAsa, AELO, antihialuronidasa, anti-NADasa y anti-estreptoquinasa.
Las dos manifestaciones clnicas de las infecciones por SgA son la faringitis y la piodermitis. Faringoamigdalitis estreptoccica La infeccin faringoamigdalar aguda es uno de los motivos de consulta ms frecuentes en la prctica clnica. La misma puede ser de etiologa viral o bacteriana. Dentro de estas ltimas SgA es responsable de la mayora de estas infecciones aunque otros serogrupos pueden ocasionarla (grupos C y G). Es una enfermedad autolimitada, aunque debe siempre realizarse el tratamiento antimicrobiano para prevenir las complicaciones, y afecta con ms frecuencia a nios de edades comprendidas entre 5 y 15 aos, pero todas las edades son susceptibles. Se transmite de persona a persona por gotitas de secreciones aerosolizadas. El nmero de microorganismos y su virulencia van disminuyendo desde la fase aguda a la de convalecencia, marcando un distinto grado de infecciosidad. El cuadro clnico no es especfico de la etiologa estreptoccica. La fiebre escarlatina es debida a la infeccin estreptoccica con una cepa que elabora la exotoxina pirognica. Esta enfermedad est generalmente asociada a faringitis, aunque puede seguir a otras infecciones estreptoccicas tales como heridas. Las complicaciones de la faringitis causada por el SgA se pueden dividir en supurativas y no supurativas. Las complicaciones supurativas se observan con poca frecuencia desde el advenimiento de antibioticoterapia efectiva. Entre ellas se citan: absceso y celulitis periamigdalinos, otitis media, sinusitis. Las complicaciones no supurativas son la fiebre reumtica (FR) y la glomerulonefritis difusa aguda (GNDA), que researemos ms adelante. El diagnstico etiolgico se efecta a travs del cultivo del exudado farngeo. En caso de existir simultneamente fiebre escarlatina el diagnstico se facilita. El tratamiento est dirigido a prevenir la FR y las complicaciones supurativas. La prevencin de la fiebre reumtica requiere de la erradicacin de la infeccin por SgA de la faringe, lo cual depende de un tratamiento prolongado ms que de altas dosis de antibitico. SgA es hasta el presente homogneamente sensible a la penicilina, antibitico de probada eficacia en la prevencin de la FR. Se utiliza penicilina G benzatina 1.2 millones de unidades y para nios que pesan menos de 30 kg, 600.000 U. En pacientes alrgicos a la penicilina se administra eritromicina. Segn datos actuales pueden tambin ser tiles nuevos macrlidos (azitromicina, claritromicina). Los regmenes va oral deben mantenerse por 10 das. Aproximadamente un 15% de individuos quedan como portadores luego del tratamiento.
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Piodermitis Con este trmino se designan colectivamente las infecciones estreptoccicas localizadas de la piel. Imptigo: es una infeccin cutnea superficial, caracterizada por la aparicin de vesculas, de 1-2 mm, que rpidamente evolucionan a costras de color ambarino, pruriginosas y acompaadas de adenopatas satlites. La localizacin ms frecuente es en las extremidades. El SgA que causa imptigo difiere de aquellos que ocasionan faringoamigdalitis, perteneciendo a diferentes serotipos M. Los aislamientos a partir de las lesiones de piel son primariamente pertenecientes al grupo A, pero ocasionalmente se encuentra otros serogrupos como responsables (C y G). La respuesta inmune AELO para las infecciones cutneas difiere de la respuesta en casos de infeccin farngea, siendo ms dbil. Hay evidencias experimentales que sugieren que esto podra deberse a la inactivacin local de la estreptolisina O por los lpidos cutneos. Por el contrario, la respuesta anti-DNAsa y anti-hialuronidasa estn conservadas y son tiles para el diagnstico serolgico. Tratamiento y profilaxis: existen gran nmero de antimicrobianos orales efectivos en el tratamiento del imptigo. Entre ellos se incluyen penicilina V, cefalosporinas de primera generacin, eritromicina, etc. El tratamiento tpico con mupirocina tiene altas tasas de curacin, pero es caro. No menos importantes son las medidas de higiene personal, que constituyen la medida profilctica ms importante.
INFECCIONES INVASIVAS DE PIEL Y PARTES BLANDAS
Desde mediados de la dcada de 1980, se observa un cambio epidemiolgico en las infecciones invasivas ocasionadas por SgA, coexistiendo con la reaparicin de ciertas cepas de SgA correspondientes a determinados serotipos M, observndose un aumento en la severidad y frecuencia de las mismas. Afectan mayoritariamente a adultos, y la puerta de entrada es generalmente cutnea. En algunos casos, la infeccin lleva al shock y fallo multiparenquimatoso, parecindose en ciertos aspectos al sndrome del shock txico estafiloccico. Por lo que se ha designado a esta entidad como sndrome del shock txico estreptoccico (SST). A continuacin se har una breve resea de las infecciones estreptoccicas severas de piel y partes blandas y del SST. Erisipela Es una inflamacin aguda de la piel con marcada afectacin del drenaje linftico, que es causada por SgA. Su frecuencia ha aumentado en los ltimos aos. Puede afectar cara, extremidades o tronco. Se acompaa de sndrome toxiinfeccioso. El tratamiento con penicilina es curativo. Celulitis estreptoccica Es una inflamacin aguda y extendida de la piel y el tejido subcutneo, que puede seguir a quemaduras, heridas o incisiones quirrgicas. Se diferencia de la erisipela porque la lesin no esta limitada y no existe una demarcacin entre la zona de piel afectada y no afectada. Otros agentes pueden ser causa de celulitis, pero la mayora de los casos son debidos a SgA y S. aureus. Aunque la penicilina es una buena eleccin para la etiologa estreptoccica, debido a que en las etapas iniciales es difcil la diferenciacin etiolgica desde un punto de vista clnico, se recomienda el uso de penicilinas semisintticas resistentes a las penicilinasas, o vancomicina.
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Fascitis necrotizante (gangrena estreptoccica) Es una infeccin de las fascias y tejidos subcutneos profundos, caracterizada por una necrosis rpida y extensa. En forma tpica comienza por una lesin traumtica, generalmente trivial, en la cual se puede presentar como un rea eritematosa, que en un perodo de 24-72 horas tiene una rpida evolucin. La inflamacin se extiende y se intensifica, la piel se oscurece y se torna prpura, y aparecen bullas de contenido hemorrgico. Se acompaa frecuentemente de bacteriemia y pueden presentarse abscesos metastsicos. El proceso tiene un curso inexorable a la agravacin progresiva a menos que se tomen medidas especficas y rpidas para contenerlo. Las tasas de mortalidad son altas incluso con un tratamiento adecuado. El manejo adecuado de esta entidad depende de un correcto diagnstico precoz. El estudio mediante tincin de Gram de exudados serosanguinolentos de las lesiones, puede ser til si revela cocos Gram positivos en cadena. El diagnstico diferencial entre celulitis y fascitis necrotizante es crucial, ya que, si bien en ambos casos el tratamiento requerir de antibioticoterapia, el segundo requiere adems de tratamiento quirrgico, extensas debridaciones en algunos casos. Sndrome del shock txico estreptoccico En los ltimos aos se han descrito varios casos de SST en diferentes reas del mundo, observndose en primera instancia en adultos y, posteriormente, en nios. Las cepas de SgA que causan SST se transmiten rpidamente de persona a persona y se observa un alto porcentaje de transmisin a contactos. Patogenia: se ha encontrado una mayor frecuencia de determinados serotipos M en SST. Aunque no estn an dilucidados los mecanismos patognicos, los estudios se enfocan actualmente a las exotoxinas pirognicas estreptoccicas (SPE). Adems de provocar el rash en la escarlatina, las SPE tienen una variedad de efectos biolgicos adversos observados en modelos animales, como alteracin de diferentes rganos y shock. Se encontr una homologa aminoacdica entre las SPE y las enterotoxinas B y C estafiloccicas. SPE es un superantgeno, y es un inductor muy potente del factor de necrosis tumoral (FNT). Adems del serotipo M, otros factores se han encontrado asociados con las cepas de SgA responsables del SST, como calidad y cantidad de SPE y, recientemente, sntesis de una proteasa. stos y otros elementos son los responsables de la habilidad de estas cepas de invadir rpidamente los tejidos y el torrente circulatorio, y desencadenar la liberacin de los factores mediadores de la cascada de la inflamacin, responsables de la falla multiparenquimatosa. La clnica puede estar entrelazada con los aspectos de la fascitis necrotizante que a menudo se asocian. Pero lo que lo caracteriza es la rpida evolucin al shock, precedida de un cuadro leve localizado en un pequeo traumatismo, caracterizado por dolor local y eritema, que evoluciona a lesiones bullosas, acompaado por un sndrome febril. El shock se ve acompaado por fallo agudo de diferentes rganos: dao cerebral severo, insuficiencia renal, distrs respiratorio, miocardiopata txica y disfuncin heptica. Desde el punto de vista del laboratorio, se observa la alteracin multiparenquimatosa, y, a diferencia del shock de etiologa estafiloccica, se encuentran los hemocultivos positivos en un 60% de los casos. Para el tratamiento del paciente se requiere una unidad de cuidados intensivos y se debe realizar el soporte de las funciones vitales. Desde el punto de vista microbiolgico se debe instituir una teraputica antimicrobiana precoz, emprica al inicio, y una vez confirmada la etiologa estreptoccica la penicilina G es el antibitico de eleccin, aunque la misma es relativamente inefectiva cuando la concentracin de microorganismos es alta. Actualmente
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se est investigando tambin la eficacia de tratamientos que se dirijan al componente del hospedero en la patogenia de la enfermedad, es decir, interactuando con la respuesta inflamatoria (bloqueo perifrico de la accin de interleucinas y el factor de necrosis tumoral).
COMPLICACIONES NO SUPURADAS
Fiebre reumtica La fiebre reumtica (FR) es una enfermedad caracterizada por producir lesiones inflamatorias no supuradas que involucran el corazn, tejidos subcutneos y el sistema nervioso central. En su forma clsica es una enfermedad de curso agudo, febril y autolimitada. Sin embargo, puede ocurrir lesin valvular cardaca, y este dao ser crnico y progresivo, conduciendo a falla cardiovascular, inhabilitacin y, eventualmente, la muerte. Patogenia: la FR es una secuela postestreptoccica posterior a una infeccin respiratoria alta debida a SgA. Esto est apoyado por varios hechos: Hay una relacin temporal entre epidemias de infecciones farngeas por SgA y epidemias de FR. La mayora de pacientes con FR tienen un antecedente reciente de faringitis. En pacientes con FR se detectan anticuerpos anti-estreptoccicos que revelan infeccin reciente. El uso continuo de antimicrobianos profilcticos que disminuyen las faringitis por SgA recurrentes, se acompaa de una disminucin de FR en pacientes con antecedentes de la misma. La FR se asocia con infeccin farngea por SgA, no as por infecciones cutneas, y a su vez con determinados serotipos M que se llaman comnmente cepas reumatgenas. Estas cepas tienen la caracterstica de no poseer el factor de opacificacin (FO) y de poseer una gruesa cpsula. Aunque SgA sea la causa de la FR, no est totalmente aclarado el mecanismo exacto por el cual el microorganismo induce la enfermedad, existiendo varias teoras al respecto: Efectos txicos de ciertos productos de SgA, particularmente las estreptolisinas S y O; Reaccin tipo enfermedad del suero mediada por complejos Ag-Ac, tal vez localizados en los sitios de dao tisular; Fenmenos autoinmunes inducidos, tal vez, por la similitud o identidad entre ciertos Ag estreptoccicos y ciertas molculas de los tejidos humanos. Clnicamente tiene una presentacin muy variada y no existe un test diagnstico especfico. Se presenta por una variedad de sntomas y signos que pueden ocurrir solos o en combinacin. De acuerdo a su importancia diagnstica se dividen en criterios mayores y menores. Criterios mayores: carditis, poliartritis, corea, ndulos subcutneos, y eritema marginado. Criterios menores: fiebre, artralgia, falla cardaca, reactantes de fase aguda (protena C reactiva, velocidad de erotrosedimentacin elevada, leucocitosis). Desde el punto de vista diagnstico, a los criterios recientemente analizados debemos sumarle la presencia de evidencia de infeccin estreptoccica reciente. Tal evidencia puede ser un episodio de faringitis estreptoccica documentado bacteriolgicamente o la demostracin de un ttulo elevado de anticuerpos anti-estreptoccicos en suero. Este ltimo estudio, si bien no permite hacer diagnstico de FR, posibilita evidenciar la existencia de una infeccin por SgA reciente. Se realiza en suero la dosificacin de AELO siendo considerado como indicador de infeccin reciente valores iguales o mayores a 200 unidades Todd. Se pueden dosificar tambin los anticuerpos anti-DNAsa y anti-hialuronidasa. Tratamiento y profilaxis: el tratamiento est destinado a disminuir la inflamacin, disminuir la fiebre y control cardiovascular. En cuanto a la profilaxis es importante destacar
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que los pacientes que han tenido FR tienen un riesgo elevado de repetir los episodios junto con cada infeccin farngea por Sga, de modo que estos pacientes requieren una profilaxis continua para prevenir las infecciones recurrentes por estos microorganismos. Esta consiste en la administracin de 1.2 millones de unidades de penicilina G benzatina administrada cada 4 semanas. En pacientes con alergia a la penicilina se administrar eritromicina estearato 250 mg dos veces al da. En cuanto a la duracin de esta profilaxis continua existe gran controversia. Algunos grupos opinan que la misma no debe ser discontinuada hasta que el paciente cumpla 20 aos. Otros grupos recomiendan que sta se mantenga indefinidamente. Por otra parte, se investiga intensamente en el desarrollo de una vacuna segura y efectiva en base a la protena M para prevenir la infeccin por SgA. La misma debera ser polivalente, y poseer determinantes antignicos que otorguen inmunidad tipo-especfica y no contengan antgenos cruzados con tejidos humanos. Glomerulonefritis difusa aguda (GNDA) La GNDA es una afeccin aguda de los glomrulos renales que est caracterizada anatomopatolgicamente, por lesiones proliferativas difusas de los glomrulos; y clnicamente, por edema, hipertensin, hematuria y proteinuria. Es una secuela no supurada de infecciones farngeas o cutneas causadas por ciertas cepas de SgA llamadas nefritgenas que pertenecen a serotipos determinados, diferentes de los relacionados con FR, siendo el ms frecuente el serotipo 12. Al igual que en la FR, no se conoce el mecanismo exacto por el cual se produce la afeccin. Dado el perodo existente entre la infeccin y el desarrollo de GNDA, la presencia de hipocomplementemia, y que inmunoglobulinas y componentes del complemento estn presentes en el rin desde el inicio de la afeccin, existen grandes evidencias para adjudicar a un mecanismo inmunolgico la causa de la injuria renal. La hiptesis ms aceptada al respecto sugiere que el dao renal sera causado por el depsito de complejos inmunes compuestos por antgenos estreptoccicos y anticuerpos del husped, a nivel del glomrulo. El diagnstico se hace en base a la clnica y a evidencias de infeccin estreptoccica reciente. Esta ltima en base a historia previa de escarlatina, infeccin farngea por SgA o por demostracin de ttulos elevados de Ac antiestreptoccicos. Se debe recordar que en las GNDA asociadas a piodermitis los AELO no se elevan, por lo que se deben titular los anticuerpos anti-DNAsa o anti-hialuronidasa. Tratamiento y profilaxis: desde el punto de vista microbiolgico los pacientes deben recibir penicilina G benzatina para erradicar las cepas nefritgenas, siendo este tratamiento slo con propsitos epidemiolgicos ya que no modificar el curso de la GNDA preexistente. A diferencia de la FR no se recomienda la profilaxis continua ya que son raros los episodios de GNDA recurrentes.
Streptococcus agalactiae
Streptococcus agalactiae o Streptococcus del grupo B (SgB), fue descrito como patgeno humano en 1935 por Fry en tres casos de fiebre puerperal.
SgB son cocos Gram positivos, anaerobios facultativos, exigentes, que en medios slidos con sangre crecen formando colonias grisceas de 3 a 4 mm de dimetro, rodeadas de un halo estrecho de beta-hemlisis. SgB poseen dos antgenos en la pared celular de naturaleza polisacrida, uno es el antgeno C especfico de grupo, y otro es tipo-especfico, la sustancia S
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que permite la clasificacin en cinco serotipos: Ia, Ib, Ic, II y III. Por fuera de la pared aparece rodeado de una cpsula de naturaleza polisacrida, que inhibe la fagocitosis. La cpsula del serotipo III en particular, inhibe la activacin de la va alterna del complemento, que participa en el proceso de opsonofagocitosis de estas bacterias. El cido silico constituye el residuo terminal de los serotipos la y III, y es responsable del efecto recin nombrado.
La asociacin entre colonizacin del tracto genital materno en el momento del parto por SgB e infeccin neonatal invasiva temprana est bien establecida. Se describen en el recin nacido sndrome de dificultad respiratoria, meningitis, sepsis, otitis, empiema. En adultos, puede ser agente etiolgico de infecciones urinarias, vaginales, y es muy importante como agente de sepsis puerperal. El diagnstico microbiolgico se realiza mediante aislamiento de SgB a partir de hemocultivos, lquido cefalorraqudeo o focos de supuracin. Existen mtodos rpidos de diagnstico que consisten en la deteccin de antgenos capsulares en lquido cefalorraqudeo. SgB es uniformemente sensible a las penicilinas y estas son el tratamiento de eleccin una vez establecido el diagnstico etiolgico. La prevencin de la colonizacin del feto puede lograrse mediante la profilaxis con ampicilina durante el parto a las madres portadoras. No obstante la solucin en un futuro prximo puede radicar en la inmunizacin activa con preparaciones de polisacridos capsulares purificados.
Streptococcus betahemolticos de los grupos C y G

En humanos se han aislado en infecciones farngeas y cutneas similares a las del grupo A. Tambin se han descrito casos aislados de infeccin puerperal, sepsis, endocarditis y neumona. Son sensibles a la penicilina, pero se han descrito cepas tolerantes.
Enterococcus y Streptococcus del grupo D

ENTEROCOCCUS
Los enterococos son cocos Gram positivos que se agrupan en pares o cadenas cortas. Pertenecan al grupo D de la clasificacin de Lancefield junto con los no enterococos, que permanecen en el gnero Streptococcus. Caracteres microbiolgicos Son anaerobios facultativos, capaces de desarrollar en condiciones extremas tales como NaCl 6.5%, pH 9.6 y a temperaturas que oscilan entre 10-45 C. Pueden sobrevivir 30 min a 60 C y desarrollan en presencia de 40% de sales biliares. La especie ms frecuentemente aislada en la clnica es E. faecalis en 80-90% de los aislamientos, seguido por E. faecium, el cual est aumentando su incidencia en hospitales, especialmente cepas multirresistentes. Se encuentran en el medio ambiente y su hbitat ms importante es el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Patogenia Aunque no se ha descrito un factor de virulencia clsico, la resistencia de los enterococos a mltiples agentes antimicrobianos le permite sobrevivir y proliferar en pacientes que reciben tratamiento antimicrobiano. Esto da cuenta de la habilidad de los enterococos para sobrein-
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fectar pacientes que estn recibiendo antimicrobianos de amplio espectro. Los enterococos pueden adherirse a las vlvulas cardacas y a las clulas epiteliales renales, propiedades que sin duda contribuyen a su habilidad para causar endocarditis e infecciones del tracto urinario. Por formar parte de la flora intestinal los enterococos son capaces de producir infecciones en pacientes ambulatorios u hospitalizados, y se pensaba anteriormente que la mayora de las infecciones causadas por estos agentes eran endgenas. Sin embargo, la mayora de las infecciones ocurren en pacientes hospitalizados, o bajo tratamiento con dilisis peritoneal o hemodilisis, en los cuales el agente es exgeno, encontrndose las cepas en el medio ambiente y en manos de personal. En algunos pases ocupa el segundo o tercer lugar en frecuencia como causa de infeccin hospitalaria. Los enterococos han sido aislados de infecciones del tracto urinario, bacteriemia y endocarditis, infecciones plvicas, abdominales y de heridas. El atributo ms sorprendente de los enterococos es su resistencia relativa y absoluta a los antimicrobianos de uso ms comn en las infecciones por Gram positivos. Los enterococos poseen una variedad de mecanismos adquiridos de resistencia, la mayora de los cuales estn mediados por genes codificados en plsmidos o transposones. Es muy importante la resistencia de alto nivel adquirida a los aminoglucsidos que da como resultado resistencia a la combinacin sinrgica de aminoglucsidos con agentes betalactmicos, asociacin teraputica muy usada, y para la cual debe estudiarse la sensibilidad frente a una infeccin grave por enterococos. A fines de la dcada de 1980 fue descrita en Europa la resistencia a la vancomicina (nico antimicrobiano til frente a las cepas resistentes a los dems agentes) causando actualmente impacto en otras partes del mundo. Es tambin en esta dcada que se encuentra la primera cepa productora de betalactamasas. El tratamiento de las infecciones enteroccicas es complicado, tanto por los patrones especiales de sensibilidad o resistencia que ellos exhiben, como por la necesidad de pruebas de estudio de la sensibilidad especiales para demostrar su verdadera susceptibilidad en el laboratorio.
STREPTOCOCCUS DEL GRUPO D
S. bovis es la especie ms frecuentemente aislada en patologa humana dentro del grupo. Son clasificados dentro del grupo D en base a su antgeno de pared (Lancefield). Las manifestaciones clnicas ms importantes causadas por S. bovis son bacteriemia y endocarditis. La puerta de entrada es generalmente el tracto gastrointestinal, aunque la va biliar o el tracto urinario tambin han sido implicados como probables fuentes. Hay una llamativa asociacin entre bacteriemia producida por S. bovis y neoplasia de colon subyacente, por lo que todo paciente con bacteriemia debida a S. bovis debe ser sometido a un estudio exhaustivo para descartar la posibilidad de esa patologa subyacente. Est en discusin si S. bovis juega algn rol en dicho neoplasma o si es solamente un marcador. La bacteriemia por S. bovis se acompaa en un 25-50% de los casos de endocarditis, la cual tiene un curso subagudo y es indistinguible clnicamente de la producida por los estreptococos del grupo viridans, con raras complicaciones spticas perifricas y excelente respuesta a los antimicrobianos. S. bovis es muy susceptible a la penicilina. Si bien la asociacin penicilina-aminoglucsido se ha mostrado sinrgica contra S. bovis, el curso de tratamiento durante cuatro semanas slo con penicilina se ha mostrado igualmente efectivo. La vancomicina es una alternativa razonable en los pacientes alrgicos a la penicilina.
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Streptococcus del grupo viridans o grupo alfa hemoltico

Los Streptococcus del grupo viridans constituyen un grupo heterogneo compuesto por diferentes microorganismos con diferentes nichos ecolgicos y patogenicidad. Aunque son organismos que forman parte de la flora normal del tracto respiratorio y digestivo, pueden, bajo determinadas circunstancias, invadir sitios estriles pudiendo provocar enfermedades graves. Comparten las caractersticas generales del gnero y se caracterizan por producir un halo de alfa-hemlisis alrededor de sus colonias. Tienen requerimientos nutricionales variables y desde el punto de vista de sus requerimientos atmosfricos la mayora son anaerobios facultativos, existiendo algunas cepas capnfilas y otras microaerfilas. Aunque algunos aislamientos pueden reaccionar con los antisueros de Lancefield, son no agrupables. Se distinguen varias especies en este grupo, requiriendo su identificacin de una variedad de pruebas bioqumicas. Dentro de sus factores de virulencia se destacan: la presencia de cido lipoteicoico que favorece la adherencia del microorganismo (importante en la adherencia a las vlvulas cardacas cuando ocasiona endocarditis); la produccin de abundantes polisacridos extracelulares (limo) que interviene en los mecanismos patognicos de produccin de caries y les brinda adherencia entre ellos, mecanismo importante en endocarditis. Los estreptococos de este grupo se aslan de diferentes procesos patolgicos: caries dental, infecciones quirrgicas, bacteriemias, endocarditis (de la cual es responsable del 50-75% de los casos sobre vlvulas nativas), abscesos profundos, etc. La mayora de Streptococcus del grupo viridans son susceptibles a la penicilina G; pero se estn reportando recientemente cepas moderada y altamente resistentes en algunas reas del mundo. Tambin se han descrito algunas cepas que presentan el fenmeno de tolerancia, en el cual los microorganismos pueden ser inhibidos por concentraciones bajas del antimicrobiano, pero se requiere un nivel 32 veces mayor para lograr la actividad bactericida.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae es un importante patgeno humano, agente etiolgico reconocido de neumona, meningitis, sinusitis y otitis media; es menos frecuentemente el origen de endocarditis, artritis, y peritonitis.
Es un coco Gram positivo que se agrupa formando cadenas en medio lquido. Es catalasa negativo, exigente desde el punto de vista nutricional y requiere para su ptimo desarrollo de una atmsfera enriquecida con 5-10% de CO2. Posee una alfa-hemolisina que degrada la hemoglobina dando un color verde alrededor de la colonia cuando desarrolla en agar sangre. El peptidoglicano y los cidos teicoicos son los constituyentes principales de la pared celular. En la figura 2 se observa una representacin esquemtica de la cpsula, pared celular y membrana celular. La integridad de la pared depende de la presencia de numerosas cadenas peptdicas laterales que estn entrelazadas por enzimas (transpeptidasas y carboxipeptidasas), siendo el sitio activo de estas enzimas el punto de unin de los antibiticos betalactmicos. Un constituyente nico de los neumococos es el polisacrido C, un cido teicoico compuesto por fosfato de colina covalentemente unido al peptidoglicano en la capa externa de la pared celular.
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Figura 2.
Por fuera de la pared se encuentra una cpsula de naturaleza polisacrida presente en prcticamente todos los aislamientos clnicos. Se reconocen aproximadamente 80 serotipos de S. pneumoniae en base a las diferencias antignicas en los polisacridos capsulares.
MECANISMOS PATGENICOS
La adherencia bacteriana es el primer paso en la produccin de infeccin. Recientemente se ha descubierto una adhesina en el neumococo que le permite unirse a receptores especficos de las clulas epiteliales. La naturaleza qumica de estos adhesinas an no ha sido dilucidada. Una vez que la colonizacin ha tenido lugar, la infeccin resultar si los microorganismos son llevados a sitios donde los mecanismos defensivos (especficos e inespecficos) del husped no los eliminen. S. pneumoniae tiene la capacidad de producir enfermedad por su habilidad para escapar a la fagocitosis y la destruccin por las clulas fagocticas del husped. A diferencia de SgA el S. pneumoniae produce pocas toxinas, de modo que produce enfermedad debido a su capacidad de replicarse en los tejidos del husped y generar una respuesta inflamatoria intensa. a) Evasin de la fagocitosis: los neumococos son pobremente ingeridos por las clulas fagocticas en ausencia de anticuerpos capsulares y complemento. Se ha observado experimentalmente, por transposicin mutagnica, que la interrupcin en la produccin de cpsula torna una cepa virulenta en avirulenta. Los mecanismos por los cuales la cpsula inhibe la fagocitosis an no estn totalmente aclarados, existiendo varias posibilidades: ausencia de receptores en la clula fagoctica que reconozcan los polisacridos capsulares; la presencia de fuerzas electroqumicas que repelen las clulas fagocticas; enmascaramiento por anticuerpos no especficos y complemento que se depositan en la superficie bacteriana y la tornan inaccesible a la fagocitosis. b) Activacin del complemento: la pared celular del neumococo, parece activar la va alterna del complemento. La inyeccin de peptidoglicano o cido teicoico separadamente en el espacio subaracnoideo causa una reaccin inflamatoria con caractersticas de meningitis
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bacteriana. Esta activacin est asociada con la liberacin de C5a que atrae gran cantidad de polimorfonucleares al medio. c) Existen otros factores que contribuyen de forma secundaria en la produccin de enfermedad, entre ellos se encuentran: neumolisina, que es una toxina que se inserta en la bicapa lipdica de las membranas celulares mediante su interaccin con el colesterol, y causa una gama de efectos citolticos y citotxicos, por ejemplo, inhibiendo la funcin bactericida de los leucocitos polimorfonucleares y el barrido ciliar. Quizs ms importante an es que esta sustancia produce una intensa inflamacin al activar la va clsica del complemento. otros: protenas de superficie, autolisina (produce la desintegracin de la pared bacteriana liberando sustancias bacterianas en el foco), alfa-hemolisina y, finalmente, neuraminidasa, que podra contribuir a la adherencia bacteriana por clivado del cido silico en las superficies mucosas.
MECANISMOS DEFENSIVOS DEL HUSPED
Existen amplias evidencias que la respuesta de anticuerpos anticapsulares otorga una proteccin efectiva contra la infeccin neumoccica, apareciendo anticuerpos anticapsulares especficos a los 5-8 das de comenzada la infeccin, que es el tiempo en que la fiebre desaparece cuando no media tratamiento antimicrobiano.
FACTORES QUE PREDISPONEN A INFECCIN NEUMOCCCICA
S. pneumoniae es el principal ejemplo de bacteria patgena extracelular. En estos microorganismos las alteraciones en los principales elementos defensivos (factores humorales como Ac, complemento y clulas antifagocticas), llevarn a una predisposicin del husped a infeccin repetida.
PRESENTACIN CLNICA
S. pneumoniae produce una gran variedad de cuadros clnicos, destacndose entre ellos por su gravedad y frecuencia, la meningitis y la neumona. Meningitis S. pneumoniae junto con Neisseria meningitidis constituyen los agentes ms frecuentes de meningitis en el adulto. sta se produce como resultado de una bacteriemia o por extensin de focos cercanos (senos paranasales, odo medio). La patognesis de la meningitis se resea en otro captulo. Neumona S. pneumoniae es el agente ms frecuente de neumona bacteriana de origen en la comunidad. Es una patologa muy frecuente que afecta todas las edades, su incidencia est relacionada con la estacin, y puede ser causa de muerte sobre todo en mayores de 65 aos. El diagnstico es clnico, radiolgico y microbiolgico. En cuanto al ltimo, el diagnstico es confirmado por la identificacin de S. pneumoniae en las secreciones bronquiales o el hemocultivo.
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
La penicilina ha sido el antibitico de eleccin para el tratamiento de infecciones neumoccicas hasta hace pocos aos, que se ha tornado gradualmente ms resistente a la misma. Esta resistencia refleja la seleccin de mutantes espontneas, para las cuales se requiere una
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concentracin mayor para saturar las protenas fijadoras de penicilina (PBP). Ms recientemente an, han aparecido cepas altamente resistentes a la penicilina, situacin ms grave todava. La resistencia a la penicilina constituye solamente una parte del problema, ya que las cepas que la poseen tienen tambin un aumento en la resistencia a otros antibiticos betalactmicos. Vancomicina puede llegar a ser la ltima alternativa en la actualidad, pero se debe tener en cuenta la aparicin de enterococos resistentes a la misma, y la posibilidad de transmisin de esta resistencia a S. pneumoniae. En la actualidad el tratamiento debe basarse en los estudios de susceptibilidad, por lo que los laboratorios clnicos deben hacer la determinacin de la concentracin inhibitoria mnima (CIM) para S. pneumoniae.
PREVENCIN
Se recomienda la vacunacin de aquellos grupos con riesgo incrementado de infeccin neumoccica: enfermedad pulmonar crnica, enfermedad cardiovascular avanzada, diabetes mellitus, cirrosis, insuficiencia renal crnica, y aquellos individuos de ms de 65 aos de edad. Un segundo grupo de individuos estara integrado por personas que tengan un compromiso del sistema inmune: infeccin por VIH, asplenia, linfoma, mieloma, enfermedad de Hodgkin, transplantados, etc. La vacuna est constituida por los polisacridos capsulares de los 23 serotipos ms frecuentemente aislados de infecciones. Un estudio reciente de efectividad de la vacuna present datos epidemiolgicos que demostraron que el efecto protector de la misma persiste por 5 aos en personas jvenes sanas, decreciendo ms rpidamente a medida que aumenta la edad. La inmunizacin pasiva con inmunoglobulina humana tambin protege contra la infeccin neumoccica, y se ha usado en nios portadores de infeccin por VIH y en adultos con linfoma, en los cuales no se espera tener una respuesta de anticuerpos frente a la vacunacin.
Gnero Streptococcus. Procedimientos de laboratorio

Como ya mencionamos para el gnero Staphylococcus la identificacin comienza con el estudio de la morfologa macroscpica y microscpica a partir de un cultivo puro. Slo haremos mencin a aquellas especies ms frecuentes en la prctica clnica. En cuanto a los requerimientos nutricionales el gnero Streptococcus es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo agar sangre ovina al 5%. Dentro de las pruebas bioqumicas para la identificacin, la primera, luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos, es la prueba de la catalasa. Ver captulo 16, Gnero Staphylococcus. Luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos, catalasa negativos, debemos observar el efecto que producen las colonias de la cepa en estudio sobre placas de agar sangre ovina al 5% (tipo de hemlisis). As podemos clasificar este grupo de grmenes en: beta-hemolticos: son aquellos que producen una hemlisis total de los glbulos rojos, observndose como un halo transparente alrededor de las colonias. alfa-hemolticos: son aquellos que producen hemlisis parcial, la cual se observa como un halo con tonalidad verdosa alrededor de las colonias. gamma-hemolticos: son aquellos que no producen hemlisis sobre el agar sangre.
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ESTREPTOCOCOS BETA HEMOLITICOS
Los grupos ms importantes son aquellos que se mencionan en la tabla 2, junto a las pruebas bioqumicas que se utilizan para su identificacin presuntiva.
Tabla 2.
Sensibilidad a la bacitracina Streptococcus grupo A Streptococcus pyogenes Streptococcus grupo B Streptococcus agalactiae + PYR + Prueba de CAMP + Bilis esculina -
Sensibilidad a la bacitracina Objetivo: separar el Streptococcus pyogenes de los dems estreptococos beta hemolticos. Fundamento: el 99% de las cepas de Streptococcus pyogenes son sensible a bajas concentraciones de bacitracina (discos con 0,04 U). Un 5% de las cepas de Streptococcus agalactiae son sensibles a la bacitracina. Procedimiento: se realiza sembrando 3-4 colonias, tomadas con asa bacteriolgica de un cultivo puro, que se estran sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente. Luego se coloca el disco de bacitracina y se incuba 18-24 horas a 35-37C. Interpretacin de los resultados: la aparicin de cualquier halo de inhibicin del crecimiento alrededor del disco se considera una prueba positiva (no importa el dimetro del halo). Hidrolisis del PYR Objetivo: separar Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los dems estreptococos. S. pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el substrato PYR (pirridonil -naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. Existen varias configuraciones comerciales de este test por eso no detallaremos ninguna en particular. En general siempre se revelan por un cambio de color. Este test es ms especfico y menos laborioso que realizar el test de sensibilidad a la bacitracina, la bilis esculina y caldo salado (se vern ms adelante). Prueba de CAMP Objetivo: separar Streptococcus agalactiae de los dems estreptococos -hemolticos. Fundamento: los estreptococos del grupo B producen una protena extracelular difusible llamada factor CAMP (iniciales de los autores que lo describieron) que acta sinrgicamente con la -lisina de S. aureus, potenciando la lisis de los eritrocitos. Procedimiento: se realiza estriando un cultivo del estreptococo -hemoltico en estudio en forma perpendicular a una estra de un estafilococo productor de -lisina, en placas de agar sangre. Se incuban 18-24 horas a 37C. Interpretacin de los resultados: la prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de potenciacin de la hemlisis en forma de punta de flecha en el lugar donde se contactan las dos estras.
ESTREPTOCOCOS ALFA Y GAMMA HEMOLITICOS
Dentro de este grupo se incluyen Streptococcus penumoniae, Streptococcus del grupo viridans y Enterococcus (algunas cepas pueden presentar beta-hemlisis). Describiremos los ensayos bioqumicos utilizados para su identificacin.
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Tabla 3. Algunas caractersticas de las bacterias del gnero Streptococcus frecuentes en patologa humana
Clasificacin bioqumica S. pyogenes S. anginosus S. agalactiae S. disgalactiae S. bovis Clasificacin serolgica A A,C,F,G o no agrupables B C,G D Tipo de hemlisis (en placa de agar sangre ovina al 5%) Beta Beta, Alfa o Gamma Beta, ocasionalmente Gamma Beta Alfa, Gamma, ocasionalmente Beta
Bilis esculina Objetivo: separar los estreptococos del grupo D y Enterococcus de los dems grupos de estreptococos. Fundamento: se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D y Enterococcus para crecer en un medio de cultivo que contiene 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina; sta se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentracin de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis. Procedimiento: se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado. Interpretacin de resultados: una reaccin positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio. Prueba de tolerancia a la sal (caldo salado) Objetivo: separar los enterococos, capaces de crecer en caldo salado, de los dems estreptococos del grupo D. Fundamento: se basa en la capacidad de los enterococos de crecer en una concentracin de 6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo lquido que contiene adems de NaCl, glucosa y un indicador de pH: prpura de bromocresol. Procedimiento: se inocula el caldo salado con la cepa a estudiar y se incuba 18-24 horas a 35C. Interpretacin de los resultados: se considera la prueba positiva cuando aparece turbidez con o sin acidificacin del medio, que se observa como un viraje de color del prpura al amarillo. La no aparicin de turbidez indica una prueba negativa.
PYR
La prueba de PYR se utiliza para la identificacin del gnero Enterococcus, como ya fue mencionado. Para la identificacin de especies dentro del gnero Enterococcus se realizan una serie de pruebas bioqumicas basadas en la utilizacin de distintos azcares y aminocidos, entre otras. Sensibilidad a la optoquina Objetivo: diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos -hemolticos.
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Fundamento: se basa en la sensibilidad de S. pneumoniae a una concentracin menor o igual a 5 g/ml de hidroxicuprina (optoquina). Procedimiento: estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones con una suspensin Mc Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el centro del rea estriada. Incubar 18-24 horas a 37C en 5-10% de CO2. Interpretacin de resultados: halos de inhibicin iguales o mayores a 14 mm; o iguales o mayores a 16 mm con discos de optoquina de 6 y 10 mm de dimetro, respectivamente, indican sensibilidad. Identificacin serolgica Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas poseen antgenos especficos de naturaleza polisacrida (polisacrido C o cidos teicoicos) que se encuentran en la pared celular. La extraccin del polisacrido C por diferentes tcnicas y su posterior enfrentamiento con antisueros especficos definen una serie de grupos que se denominan con letras maysculas a partir de la A. La utilidad de la extraccin antignica depender del tipo de hemlisis. En los estreptococos -hemolticos se ha confirmado como el mejor mtodo para su clasificacin. En los no -hemolticos, la extraccin antignica slo es til para la identificacin de los grupos D y B. Existen diferentes mtodos para la extraccin enzimtica que no detallaremos. Actualmente se utilizan mtodos de extraccin rpida por medio de enzimas de extraccin. Luego se procede a la identificacin del polisacrido por medio de tcnicas de aglutinacin con partculas de ltex que tienen absorbido el antisuero especfico. Tambin existen en el mercado kits comerciales que utilizan tcnicas de coaglutinacin.
Bibliografa
Manual of Clinical Microbiology. 7th edition. Edited by Murray P , Baron E.J, Pfaller M, Tenover F, Yolken R. 1999. ASM Press, Washington. Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 3rd ed. Edited by Brogden KA et al. 2000. ASM Press, Washington. Mims, Playfair, Roitt, Wakelin and Williams, Microbiologa Mdica, 2 edicin. Mosby, Harcourt Brace, Espaa, 1999.
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Principales grupos de bacilos y cocos gramnegativos exigentes

M. Torres
Neisserias
El gnero Neisseria comprende dos especies patgenas para el hombre; siendo ste el nico reservorio conocido: N. meningitidis y N. gonorrhoeae. Otras especies de Neisseria no patgenas, se encuentran habitualmente formando parte de la flora normal de la orofaringe. La familia Neisseriaceae comprende varios gneros: Neisseria, Moraxella, Acinetobacter y otros. Moraxella catarrhalis (antes denominada Branhamella catarrhalis), inicialmente incluido en esta familia ha sido actualmente reclasificada como un subgnero de Moraxella. Las tcnicas de identificacin de este germen son similares a las de la familia Neisseriaceae. Su crecimiento en medios simples a temperatura de 22 C, su incapacidad de fermentar hidratos de carbono y la produccin de una desoxirribonucleasa (DNAasa) permiten su identificacin. Un gran porcentaje de cepas producen -lactamasas. Este germen ha sido implicado en los ltimos aos como agente de diversas enfermedades infecciosas, entre ellas otitis media en nios, exacerbacin de bronquitis crnica y neumona, sobre todo en pacientes con enfermedad respiratoria subyacente. El gnero Acinetobacter est compuesto por cocobacilos Gram negativos, oxidasa negativos, no exigentes. Forman colonias lisas, blancas o grisceas, a veces hemolticas, similares a las de las enterobacterias. Los miembros de este gnero habitan en el agua y el suelo, y tambin forman parte de la flora normal humana de la piel. Estos sitios suelen ser el reservorio de la bacteria en hospitales y causar brotes, en los que el germen se comporta como oportunista. Suelen ser resistentes a mltiples antibiticos y en general afectan a pacientes portadores de tubos endotraqueales, sondas, catteres, etc.
Morfologa
Las bacterias del gnero Neisseria son cocos Gram negativos, inmviles, que se agrupan en pares en diplococos, cuya forma se ha comparado a granos de caf. El citoplasma y la ultraestructura son muy similares en N. meningitidis y N. gonorrhoeae y comparten 80% de sus secuencias de bases del ADN. Aunque son Gram negativas, contienen endotoxinas, y ultraestructuralmente tienen una pared celular tpica de las bacterias Gram negativas, se parecen a los cocos pigenos en su patogenicidad y su sensibilidad intrnseca a la penicilina. Ambas especies pueden colonizar las mucosas sin causar sntomas. La enfermedad causada
grave, diseminada, muchas veces fatal. Esto podra deberse a que N. meningitidis presenta una cpsula polisacrida bien definida. Ambas especies poseen fimbrias o pili, las cuales han sido relacionadas con la virulencia.
Metabolismo
Son aerobios, y las especies patgenas son exigentes desde el punto de vista de sus requerimientos nutricionales (agar sangre o agar chocolate), de temperatura (crecen a 37 C pero no a 22 C) y atmosfricos (atmsfera con 5 a 7 % de CO2). Son oxidasa positivos. Estos requerimientos de cultivo, as como el patrn de utilizacin de distintos azcares (en especial glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y fructosa) se utilizan para diferenciar las distintas especies de Neisserias (tabla 1)
Tabla 1.
N. meningitidis N. gonorrhoeae N. lactamica N. sicca N. mucosa N. subava N. avescens M. catarrhalis glucosa + + + + + + maltosa + + + + + sacarosa + + V Lactosa + DNAasa +
M. catarrhalis produce desoxirribonucleasa, lo que permite diferenciarla de Neisseria. Las especies patgenas del gnero Neisseria son bacterias extremadamente sensibles a las condiciones ambientales adversas, como las temperaturas extremas, cambios de pH y desecacin; lo que debe ser tenido en cuenta en la recoleccin y el transporte de las muestras clnicas al laboratorio.
Neisseria meningitidis
Este germen causa principalmente meningitis, meningococemia y ms raramente otros cuadros clnicos.
ESTRUCTURA ANTIGNICA
La presencia de cpsula esta asociada a la virulencia. Las cepas que colonizan las membranas mucosas sin producir enfermedad en general no son capsuladas. Sobre la base de diferencias antignicas del polisacrido capsular se han identificado al menos trece serogrupos. Estos son: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, y Z. Estos antgenos capsulares pueden ser puestos en evidencia por distintas tcnicas (aglutinacin de partculas de ltex o contrainmunoelectroforesis), ya sea en una cepa aislada, o directamente en el liquido cefalorraqudeo. La mayora de las enfermedades invasivas son producidas por los serogrupos A, B, C, W135 e Y. Han sido descritas epidemias de meningitis causadas por el serogrupo A, mientras que los grupos B y C causan fundamentalmente enfermedad en forma espordica o endmica. La estructura de estos polisacridos ha sido extensamente estudiada y se conoce para la mayora de los serogrupos. La identificacin y purificacin de estos antgenos ha dado como
El polisacrido capsular del grupo B, por si solo no es inmunognico. Se han encontrado similitudes antignicas entre este polisacrido y los de otras bacterias no relacionadas como Escherichia coli K1 (que causa meningitis en el recin nacido). En base a antgenos subcapsulares (protenas de pared celular) las cepas de N. meningitidis se clasifican a su vez en serotipos, subtipos e inmunotipos. Hay 5 clases de protenas de membrana externa (OMP , por sus siglas en ingls) mayores, que se designan con cifras del 1 al 5 y que se diferencian por su peso molecular, mapa peptdico y patrn electrofortico. El serotipo se basa en reacciones serolgicas utilizando anticuerpos monoclonales antiprotena 2 o 3 (una cepa tiene protena 2 o 3 pero no ambas a la vez). El subtipo se define en diferencias antignicas de la OMP 1. El inmunotipo se define sobre la base de diferencias antignicas del lipopolisacrido (LPS). Cada serogrupo contiene cepas con una variedad de tipos, subtipos e inmunotipos; no hay tipos restringidos a un determinado serogrupo. Por ejemplo, a la fecha hay aproximadamente 20 serotipos, 7 subtipos y 8 inmunotipos dentro del serogrupo B; pero hay muchas cepas no tipificables. De acuerdo a una convencin, una cepa puede ser designada: B:15:P1.3:L3,8 serogrupo B serotipo 15 subtipo 3 inmunotipo 3 y 8 Estos sistemas se utilizan en laboratorios de referencia con fines epidemiolgicos, para caracterizar las cepas que circulan en una comunidad en un determinado momento y para desarrollar vacunas. Otros mtodos para tipificar cepas se basan en la movilidad electrofortica de enzimas metablicas producidas por N. meningitidis. Este mtodo, denominado electroforesis de enzimas multilocus, es til para caracterizar el genoma y agrupar cepas por su relacin gentica. Existen al menos 78 tipos electroforticos en esta clasificacin.
ATRIBUTOS DE VIRULENCIA
Polisacrido capsular Parece ser el mayor factor que contribuye a la virulencia. La presencia de cpsula le confiere a la bacteria la capacidad de sobrevivir en el torrente sanguneo ya que esta impide la fagocitosis; slo cuando el paciente ha desarrollado anticuerpos anticapsulares especficos la bacteria puede ser opsonizada, esto es lisada con la colaboracin del sistema del complemento. Endotoxina Bsicamente es similar a otros LPS en su estructura. Se caracteriza por ser un LPS fuertemente inductor del fenmeno de Shwartzman-Sanarelli, con una potencia notablemente superior a la del LPS de otros Gram negativos. Durante el crecimiento de N. meningitidis se liberan al medio grandes cantidades de LPS que daan al endotelio, causando una importante respuesta inflamatoria y necrosis vascular. Proteasa de IgA Es producida por todos los serogrupos y liberada al medio; es una endopeptidasa con una gran afinidad por la IgA humana. Sustancias quelantes del hierro El hierro es esencial para el metabolismo de la bacteria y ella compite con el husped por l,
Pili Como es sabido son filamentos proteicos pequeos, que se extienden desde la superficie de la bacteria y cuyo papel es fundamental en la patogenia ya que median la adherencia a las superficies mucosas. Aunque han sido menos estudiados que los pili de N. gonorrhoeae, seran similares en cuanto a su estructura. Median la adherencia de N. menigitidis a la mucosa nasofarngea y son importantes en la determinacin del estado de portador. Tambin ha sido postulado que intervendran en traspasar la barrera hematoenceflica e interactuar con las meninges. Las bases moleculares de estas interacciones no han sido an del todo aclaradas, pero parece tratarse de una interaccin con un receptor especfico tanto en lo anatmico (epitelio nasal anterior) como para la especie humana.
PATOGENIA
N. meningitidis ingresa a travs de las vas areas superiores y se establece en la mucosa nasofarngea. No ha sido an aclarado como el germen atraviesa la mucosa e ingresa a la circulacin. La enfermedad meningoccica es el resultado de la invasin del torrente sanguneo. Los huspedes susceptibles son aquellos que carecen de anticuerpos anticapsulares especficos, que son bactericidas. Los individuos con estos anticuerpos especficos (producidos posiblemente como respuesta a la colonizacin previa por N. meningitidis o bien a antgenos relacionados de otros grmenes de la flora normal) resisten a la capacidad del germen de invadir el torrente circulatorio. Los anticuerpos son opsoninas y determinan que el germen sea destruido. Una vez en el torrente circulatorio se multiplican y con gran rapidez pueden llegar a concentraciones que estn entre las ms elevadas que se conocen. El ingreso de N. meningitidis al torrente circulatorio puede llevar a una entidad denominada prpura fulminans con coagulacin intravascular diseminada, manifestaciones cutneas (petequias y equimosis), hipotensin, shock y muerte. La coagulacin intravascular diseminada, el shock y la fiebre son respuestas a la endotoxina mediadas por el factor de necrosis tumoral y la interleuquina 1. As, estos signos son consecuencia directa de la capacidad de N. meningitidis de sobrevivir y multiplicarse en el torrente circulatorio. Los aspectos clnicos sern desarrollados con ms detalle en el captulo de meningitis aguda supurada.
DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO
Frente a un cuadro clnico compatible con meningitis se deber realizar una puncin lumbar para obtener datos de la composicin citoqumica del liquido cefalorraqudeo (LCR) y para estudio microbiolgico. Debe recordarse la labilidad de los grmenes que causan meningitis y transportar la muestra de inmediato al laboratorio. Una vez en el laboratorio de bacteriologa, el LCR ser sometido a examen directo, cultivo y deteccin de antgenos capsulares de los distintos agentes de meningitis. El examen directo con coloracin de Gram es sencillo y rpido. Permite una orientacin inicial de la teraputica siempre y cuando lo realice un tcnico experimentado. El cultivo se realizara en agar sangre, agar chocolate y medios de enriquecimiento; deben recordarse los requerimientos de atmsfera del germen. A las colonias sospechosas se les realiza coloracin de Gram, prueba de oxidasa y pruebas para determinar la utilizacin de azcares. El laboratorio puede adems realizar la determinacin del serogrupo mediante antisueros especficos.
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS
Esta droga es bactericida y atraviesa la barrera hematoenceflica. En el momento actual no parece ser necesario realizar estudios de susceptibilidad en forma rutinaria ya que son habitualmente sensibles. Se han descrito raros casos de cepas con alteraciones a nivel de las protenas fijadoras de penicilina (PBP) que hacen aumentar la concentracin inhibitoria mnima a la droga.
PROFILAXIS
La probabilidad de desarrollar meningitis meningoccica es mucho mayor en sujetos que han estado en contacto con un caso, por ello se administra quimioprofilaxis a los contactos cercanos, para evitar casos secundarios. Esta se realiza con rifampicina por perodos cortos, droga efectiva en eliminar el estado de portador. Vacunas Se dispone de vacunas para los serogrupos A y C que han sido utilizadas en caso de epidemias en diversos pases, incluso el nuestro. En Estados Unidos existen vacunas tetravalentes anti A, C, Y y W135. Para esos serogrupos utilizan vacunas preparadas con polisacrido capsular. En general son poco eficaces en menores de dos aos. Se estima que esto podra mejorar si se obtienen vacunas conjugadas con protenas. La vacuna para prevenir la enfermedad por el serogrupo B contina siendo un problema, ya que el polisacrido capsular es poco inmungeno y este es el serogrupo que causa la mayor parte de los casos en pases desarrollados. Los investigadores han orientado su atencin a otros antgenos como las protenas de membrana externa para estimular la inmunidad. La vacunacin est especialmente indicada en: Nios y adultos con defectos de sus mecanismos de defensa tales como anesplenia o dficit de los componentes terminales del complemento. Prevencin de los casos secundarios al contacto con el paciente. Estos casos secundarios pueden desarrollarse incluso semanas ms tarde que el caso ndice. Viajeros a reas endmicas (N. meningitidis serogrupo A en el frica subsahariana, regin conocida como cinturn de la meningitis). Epidemias. Debe recordarse que es obligatorio notificar esta enfermedad a las autoridades sanitarias.
Neisseria gonorrhoeae
Descrito en 1879 por Neisser en pus uretral, es el agente etiolgico de la gonorrea. Comparte las caractersticas del gnero en cuanto a la morfologa celular. Para aislarlo de mucosas que presentan flora normal (por ejemplo uretra anterior o cuello uterino) se requiere de medios especiales como agar chocolate y antibiticos para inhibir otras bacterias. Existen diversos suplementos de antibiticos, el ms conocido es el medio de Thayer-Martin que contiene vancomicina, colistina y nistatina. El resto de los requerimientos de temperatura, humedad y atmsfera, as como las propiedades bioqumicas utilizadas para su identificacin son similares a los de N. meningitidis.
CARACTERSTICAS COLONIALES
Luego de 18 a 24 horas de incubacin se producen colonias cuyo aspecto puede diferir si se trata de un aislamiento reciente o si se han efectuado sucesivos pasajes in vitro. Se distinguen
queas y convexas. Luego de varios subcultivos se obtienen colonias ms grandes y aplanadas llamadas T3 y T4. Esto se atribuye a la prdida de la expresin de los pili. Cualquier tipo de colonia puede diferir tambin en su opacidad. Esto depende de la presencia en la pared celular de una molcula llamada protena II.
TIPIFICACIN DE CEPAS
Se dispone de varios mtodos para caracterizar cepas de N. gonorrhoeae con fines epidemiolgicos. Los ms desarrollados son los mtodos serolgicos y la auxotipificacin que pueden usarse por separado o en combinacin. Tambin los perfiles de resistencia a antimicrobianos se utilizan con fines epidemiolgicos. Los mtodos serolgicos se basan en diferencias en antgenos de superficie como protena I o pili, y en general se realizan por tcnicas de coaglutinacin. Auxotipificacin Por el crecimiento de N. gonorrhoeae en medios de cultivo qumicamente definidos se han podido conocer las necesidades de ciertos factores de crecimiento, y sobre estas bases se han definido los llamados auxotipos. Estas son caractersticas estables de una determinada cepa que se utilizan como marcadores en estudios sobre virulencia, capacidad invasiva y sensibilidad a antimicrobianos. Se ha observado que algunas cepas precisan para su desarrollo la presencia de arginina, hipoxantina y uracilo, lo que se denomina auxotipo AHU o bien Arg-Hyx-Ura. En general este auxotipo se corresponde con cepas muy sensibles a la penicilina y a la vez muy resistentes a la accin bactericida del suero humano normal, dando muchas veces infecciones diseminadas (bacteriemia). Antgenos de superficie y determinantes de patogenicidad Por tcnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida se separan diversas protenas de superficie de N. gonorrhoeae. Pili: son apndices que emergen como proyecciones desde la superficie de la bacteria. Estn constituidos por subunidades proteicas o pilina. Su funcin es mediar la adherencia de la bacteria a las clulas del husped, especialmente a las microvellosidades del epitelio columnar. Tambin le confieren al germen una mayor resistencia a la fagocitosis. N. gonorrhoeae puede variar de fase, es decir, presentar alternativamente formas con pili o sin ellos; en un proceso estrechamente regulado desde el punto de vista gentico. Adems de esta variacin de fases, los pili pueden presentar una importante variacin antignica, esto es, cambios antignicos en la protena de los pili expresada. La variacin antignica est determinada por la insercin o delecin de unos pocos residuos de aminocidos y ocurre a nivel del extremo carboxi terminal de la pilina. Este proceso tambin est controlado en el cromosoma bacteriano, por diversos genes. La porcin variable, terminal, de la pilina es justamente el blanco de la respuesta inmunitaria por lo que la variacin antignica a ese nivel representa un mecanismo de escape para evadir las defensas del husped. Por su papel fundamental en la patogenia, los pili han sido objeto de mltiples investigaciones como candidatos al desarrollo de vacunas; pero su extremo grado de variabilidad antignica ha hecho perder el entusiasmo en una vacuna de este tipo. Protena I: la mayor de las protenas de membrana externa, tiene funcin de porina, formando un canal hidroflico a travs de ella. Es posible que tambin intervenga en la fagocitosis, paso importante en la patogenia de la gonorrea. A diferencia de otras protenas de membrana externa de este germen, esta es expresada en forma constante,
protena I, denominadas IA y IB. Cada una de ellas tiene decenas de variantes, lo que define serovariedades. Como respuesta a la infeccin se producen anticuerpos opsonizantes anti-protena I en suero y secreciones. Estos anticuerpos pueden ser protectores si la reinfeccin es causada por una cepa con la misma serovariedad de protena I. Por otra parte, se sabe que las cepas portadoras de protena I subclase A se asocian ms a menudo con enfermedad diseminada y mayor resistencia al poder bactericida del suero humano, en tanto que las cepas IB tienden a producir enfermedad localizada (uretritis, cervicitis) y a ser resistentes a los antibiticos. Protena II: es una familia de protenas de membrana externa, que manifiestan una extensa variacin antignica de cepa a cepa e incluso dentro de una misma cepa. Esta protena no siempre es expresada por la bacteria, cuando est presente, le otorga la capacidad de formar colonias opacas in vitro. Desde el punto de vista funcional, su presencia aumenta la capacidad de adherencia a clulas epiteliales y a neutrfilos. Protena III: a diferencia de las anteriores es estable en su composicin. Existen protenas similares en N. meningitidis y en otras bacterias. Es una protena poco inmunognica y tiene la capacidad de bloquear anticuerpos dirigidos contra otros antgenos de superficie. Su papel en la patogenia no se comprende an. La protena III tiene funciones de porina (al igual que la protena I) que permite el ingreso a la bacteria de nutrientes de bajo peso molecular por difusin. Adhesinas: se ha postulado la presencia de otras molculas con capacidad de adhesin, distintas de los pili, pero no han sido bien caracterizadas todava. Protenas reguladoras del hierro: son una familia de protenas que le permiten a la bacteria adquirir el hierro del husped; por lo tanto, la presencia de este tipo de protenas representa una ventaja para su supervivencia. Proteasa de IgA: esta protena cliva la inmunoglobulina A1 humana en la regin bisagra, con lo que la inactiva. Se especula que este sera un mecanismo importante para inactivar la Ig A secretoria. Lipooligosacrido (LOS): al igual que en otros grmenes Gram negativos acta como endotoxina pero carece de las largas cadenas de polisacridos que se encuentran en las enterobacterias. Median la mayora de los efectos txicos observables en los modelos experimentales. Como los pili, el LOS presenta variaciones entre diversas cepas y en pasajes sucesivos de una misma cepa. Plsmidos: la mayora de las cepas presentan un plsmido de 2,6 megadaltons de funcin no conocida (plsmido crptico). Se han identificado al menos cinco plsmidos diferentes que codifican -lactamasas y que se caracterizan por diferencias en su peso molecular. Tambin se ha descrito un plsmido conjugativo que media la resistencia de alto nivel a la tetraciclina (tet M).
PATOGENIA DE LA INFECCIN POR N. GONORRHOEAE
El germen se disemina de persona a persona por contacto directo y estrecho con secreciones infectadas, habitualmente contacto sexual. Afecta en forma selectiva al epitelio no cornificado. La vaginitis no es una manifestacin de la gonorrea en la mujer en edad genital activa, pero s en la etapa prepuberal o posmenopusica. No est del todo aclarado cmo el germen asciende por la va genital, se ha postulado que esto estara favorecido por contracciones uretrales y uterinas, o tal vez vehiculizados por el esperma. Las mucosas producen IgA secretoria que podra ser clivada por la proteasa. Una
moleculares que finalmente determinan la invasin de esas clulas. Dado que se trata de un patgeno exclusivamente humano hay pocos modelos experimentales animales que permitan aclarar detalles de la patogenia de la enfermedad. Los estudios han sido realizados principalmente en cultivo de tejidos (explantes). Por ejemplo cultivos de trompas de Falopio han sido usados para estudiar la colonizacin. Dos tipos de clulas epiteliales se encuentran en este rgano: clulas ciliadas y no ciliadas. Cuando el germen es incubado en estos explantes, ocurren una serie de eventos: Adhesin a clulas no ciliadas El primer paso en la infeccin es la colonizacin del epitelio columnar. Al igual que otras bacterias, en el proceso de adherencia e invasin intervendran fenmenos de polimerizacin de molculas de actina. Algunos componentes de superficie de N. gonorrhoeae estn involucrados en estas etapas iniciales. Los pilis median la adhesin inicial (no estrecha o distante) a las clulas epiteliales. Cepas mutantes que carecen de ellos, an son capaces de invadir las clulas epiteliales, por lo que en esta etapa, seguramente intervienen adems otros factores. La familia de protenas de membrana externa P .II (o tambin OPA, por opacidad) parecen mediar, al menos en parte, una segunda etapa de adherencia ntima, y contribuir a la invasin. Las protenas de membrana externa llamadas P .I parecen impedir la unin fagolisosmica en los polimorfonucleares y reducir su metabolismo oxidativo, por lo que determina la capacidad de ciertas cepas de sobrevivir (al menos un pequeo porcentaje de bacterias) dentro de los fagocitos. Endocitosis del germen, disminucin progresiva del movimiento ciliar y prdida de las cilias de las clulas adyacentes, causada por el lipooligosacrido Las clulas no ciliadas engloban a las bacterias por medio de seudpodos. Esta fagocitosis, llevada a cabo por fagocitos no profesionales se conoce como endocitosis dirigida por el parsito. Las clulas ciliadas mueren y son selectivamente eliminadas de la superficie del epitelio. Esta etapa no requiere de la presencia del germen intacto y puede ser reproducida solamente con el LOS o fragmentos de peptidoglicano. El LOS desencadena la respuesta inflamatoria, con gran liberacin de factor de necrosis tumoral (TNF), el cual a su vez determina la escarificacin del epitelio de las trompas de Falopio. Probablemente el LOS sea el responsable de la mayora de los sntomas de la gonorrea. Esta molcula contribuye a la resistencia al suero y a una mayor capacidad de producir enfermedad sistmica (probablemente debido a una menor capacidad de activar el complemento). Transporte de la bacteria a travs de la clula epitelial Las bacterias son transportadas en una vacuola de endocitosis, dentro de la cual an pueden replicarse y se acentan los procesos de citotoxicidad determinados por el LOS. Dentro de la vacuola el germen se halla protegido de los macrfagos, de los anticuerpos y de los antimicrobianos. Liberacin del germen al espacio subepitelial Las bacterias son transportadas hacia el sector basal de la clula, las vacuolas se fusionan con la membrana basal y descargan los grmenes en el tejido conectivo subepitelial. All causan inflamacin local como consecuencia de lo cual, se produce un exudado, rico en polimorfonucleares y que contiene numerosas bacterias intra y extracelulares. Eventualmente ingresan
Sobrevida de N. gonorrhoeae en el torrente circulatorio El suero humano normal tiene la capacidad de destruir bacterias Gram negativas circulantes, a diferencia de las Gram positivas que son resistentes a ese poder bactericida. Este efecto depende fundamentalmente de la presencia del complemento y no se requieren anticuerpos especficos. Las cepas de N. gonorrhoeae que se asocian a la forma diseminada de la enfermedad suelen ser ms resistentes al poder bactericida del suero humano normal. Esto probablemente sea debido al agregado de residuos de cido silico a nivel de la pared del germen. El cido silico es un componente de la superficie de muchas clulas humanas, inclusive eritrocitos, y se cree que la presencia de ste en la superficie de la bacteria enmascarara a los antgenos responsables de desencadenar la lisis bacteriana.
CLNICA
El espectro de manifestaciones clnicas comprende desde infecciones localizadas en el aparato genitourinario (uretritis, cervicitis), infecciones locorregionales (enfermedad inflamatoria plvica, epididimitis), hasta la enfermedad diseminada, con invasin del torrente sanguneo y eventualmente, invasin de rganos a distancia. Estos aspectos sern tratados ms extensamente en el captulo correspondiente. Uretritis y cervicitis Son las manifestaciones ms comunes de la gonorrea. En el hombre se manifiesta por disuria y corrimiento uretral purulento, luego de un perodo de incubacin de 2 a 5 das. En la mujer la sintomatologa suele ser mucho menos especfica y, de estar presente, se traduce en flujo cervical purulento, disuria; ms raramente absceso de las glndulas de Bartholino. Orquiepididimitis En el hombre el dolor y edema a nivel de testculo y epiddimo reflejan el compromiso de stos rganos. Enfermedad inflamatoria plvica Es determinada por la progresin de la infeccin al aparato genital alto (endometrio, trompas, peritoneo). Est entidad puede responder a otras etiologas (Chlamydia trachomatis, infecciones por flora mixta proveniente de la vagina). La inflamacin de la mucosa tubaria y posterior cicatrizacin puede determinar una obstruccin permanente de la luz, con las consiguientes secuelas: infertilidad y embarazo ectpico. Proctitis Se caracteriza por dolor, tenesmo, sangrado y exudado, a veces con produccin de abscesos rectales o perianales. Faringitis Es habitualmente asintomtica. Conjuntivitis Es adquirida por el recin nacido al pasar por el canal del parto (oftalma neonatorum); aunque puede verse a otras edades. Sin tratamiento, puede conducir a la ceguera. Su incidencia se ha reducido en forma notable con la instilacin profilctica y obligatoria de gotas de nitrato
de plata (cred) en la conjuntiva de todos los recin nacidos u otros compuestos antimicrobianos. Enfermedad gonoccica diseminada Es complicacin que se registra con una frecuencia menor al 1% de los casos de gonorrea. Es ms frecuente en mujeres y, como ya se mencion, es causada por cepas pertenecientes al auxotipo AHU. Las manifestaciones incluyen monoartritis, tenosinovitis, fiebre y lesiones de piel (mculas o pstulas, hemorrgicas o necrticas) que afectan sobre todo extremidades y son debidas a arteritis sptica. Ms raramente se produce meningitis, pericarditis o endocarditis. Portadores asintomticos Un porcentaje no desdeable de individuos que entran en contacto con N. gonorrhoeae, especialmente mujeres, desarrollan una infeccin asintomtica. Como se comprender estos portadores asintomticos representan un reservorio importante de la enfermedad.
El examen directo de las secreciones uretrales con coloracin de Gram es muy sensible y especfico para el diagnstico de uretritis gonoccica. Permite observar un exudado con abundantes polimorfonucleares y diplococos Gram negativos intra y extraleucocitarios. Su valor es menor en otras localizaciones. El cultivo es indispensable para realizar las pruebas bioqumicas de identificacin y estudios de susceptibilidad. La inoculacin en medios de cultivo, una vez obtenida la muestra, debe hacerse en forma inmediata o utilizar medios de transporte que aseguren la viabilidad del germen. Las muestras provenientes de las mucosas debern ser sembradas en medios selectivos ya mencionados, para inhibir la flora normal. Las muestras de sectores del organismo habitualmente estriles (sangre, lquido sinovial, etc.) son sembradas en agar chocolate. Una vez obtenidas las colonias se identifican por su morfologa con la coloracin de Gram, reaccin positiva de oxidasa y utilizacin de azcares.
SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Si bien la penicilina fue la droga de eleccin para el tratamiento de la gonorrea por muchos aos, en el momento actual, la alta prevalencia de cepas resistentes determina que esta droga no pueda ser utilizada para el tratamiento emprico de la enfermedad. La resistencia a los antimicrobianos puede deberse a mltiples mecanismos y ser: plasmdica: debida a la presencia de -lactamasas en especial tipo TEM 1. Este tipo de resistencia puede ser detectada en el laboratorio por tcnicas rpidas como por ejemplo mediante el uso de una cefalosporina cromgenica. La resistencia a la tetraciclina tambin es codificada por un plsmido (tet M). cromosmica: que puede deberse tanto a una disminucin de la afinidad de las protenas fijadoras de penicilina (PBP) por la droga, como a una alteracin en la permeabilidad de las porinas de la membrana externa de la bacteria. Esta resistencia requiere de otros estudios de susceptibilidad para ser detectada. Una cepa puede combinar ms de un mecanismo de resistencia. Tambin ha sido descrita la resistencia cromosmica para otras drogas, como por ejemplo tetraciclinas y espectinomicina. Las drogas recomendadas en el momento actual son ceftriaxona, azitromicina y cipro-
Para el tratamiento, adems de la susceptibilidad del germen, se deben considerar factores tales como sitio anatmico afectado, presencia de complicaciones y posibilidad de otros patgenos asociados. Los planes teraputicos recomendados para cada caso se tratarn en otro captulo.
PROFILAXIS Y POSIBLES CANDIDATOS AL DESARROLLO DE VACUNAS
Muchos de los antgenos de superficie antes mencionados resultan atractivos para desarrollar vacunas que prevengan la adherencia y colonizacin de las clulas epiteliales del husped. Desde hace tiempo se sabe que los pacientes que padecen gonorrea pueden experimentar reinfecciones y que una infeccin pasada determina una respuesta inmune vigorosa (sobre todo de anticuerpos), pero que no confiere proteccin frente a nuevas infecciones. Tanto los pilis como otras protenas de superficie se hallan regulados por complejos mecanismos genticos que, como ya se dijo, le otorgan a la bacteria la posibilidad de controlar la presencia o ausencia de esas molculas (variacin de fases), o controlar su composicin (variacin gentica). La razn por la que una persona no desarrolla una respuesta protectora a la reinfeccin probablemente sea que N. gonorrhoeae es capaz de variar sus antgenos de superficie, especialmente la pilina. Para el caso de esta protena la bacteria tiene un repertorio antignico que puede ser tan grande como un milln de variantes antignicas diferentes. Actualmente se trata de buscar antgenos de superficie altamente conservados. El desarrollo de una vacuna contra gonorrea probablemente sea uno de los mayores desafos que enfrentan los investigadores. En tanto no se disponga de una vacuna los esfuerzos para prevenir la enfermedad deben basarse en: diagnstico precoz y tratamiento adecuado; notificacin de los contactos; debe recordarse que se trata de una enfermedad de denuncia obligatoria al Ministerio de Salud Pblica; promover, a nivel de salud pblica, la educacin que lleve a modificaciones en las conductas sexuales; uso de colirio en todo recin nacido para prevenir la enfermedad ocular (obligatorio por ley).
Haemophilus
Los miembros del gnero Haemophilus son bacilos Gram negativos, pequeos y pleomrficos. Integran la flora normal de las mucosas del aparato respiratorio superior. La mayora de las especies son no patgenas o oportunistas, aunque algunas de esas especies son patgenos primarios como H. influenzae, H. aegyptius y H. ducreyi. Haemophilus influenzae es la especie tipo y puede causar enfermedades graves, invasivas. En esta especie existen cepas capsuladas y no capsuladas. El antgeno capsular permite distinguir seis serotipos que se designan con letras de la a hasta la f. Antes que se dispusiera de una vacuna eficaz, H. influenzae serotipo b era una de las causas ms importantes de meningitis y neumona bacteriana en nios.
CLASIFICACIN
El gnero Haemophilus pertenece a la familia Pasteurellaceae, bacilos Gram negativos exigentes desde el punto de vista nutricional. Estos grmenes requieren para su desarrollo de uno o
factor X es la protoporfirina IX para grmenes que poseen una enzima quelante del hierro (como H. influenzae), o la hemina para grmenes que no la poseen (como H. aegyptius). Los microorganismos que requieren de factor V no crecen en agar sangre convencional. El factor V puede ser agregado al medio o proporcionado por otro microorganismo que crezca en su proximidad (por ej. una colonia de Staphylococcus). Este crecimiento alrededor de una colonia que le proporciona factores de crecimiento se denomina satelitismo y no es exclusivo de Haemophilus, sino tambin de ciertos Streptococcus.
IDENTIFICACIN
Se hace sobre la base del aspecto en coloracin de Gram, requerimientos de factor X y V, presencia o no de hemlisis, utilizacin de hidratos de carbono, y la produccin de indol, ureasa y decarboxilasa de la ornitina. Estos tres ltimos sirven para diferenciar biotipos de H. influenzae. La tipificacin de las cepas capsuladas de H. influenzae se realiza con sueros especficos contra los seis serotipos existentes.
Haemophilus influenzae
MECANISMOS DE VIRULENCIA
El mayor determinante de virulencia es, claramente, el polisacrido capsular, que le confiere a la bacteria resistencia a la fagocitosis. Para el caso del serotipo b es un polmero de ribosil ribosa fosfato. Este antgeno, como otros polisacridos, no es procesado por el sistema inmune a travs de las clulas T, sino por una va independiente de ellas. La capacidad de generar esta respuesta inmune no est desarrollada en nios de menos de 18 meses. Las vacunas recientes han convertido a este antgeno en T dependiente por medio de su unin o conjugacin a protenas. Estas vacunas conjugadas provocan respuesta aun en lactantes pequeos. Otros posibles factores de virulencia son los pili, se ha demostrado que ciertas clases de pili permitiran la adherencia a clulas epiteliales, etapa fundamental en la colonizacin.
PATOGENIA
H. influenzae es una bacteria muy adaptada al ser humano. Desde los primeros meses de vida puede ser encontrada colonizando las mucosas del tracto respiratorio superior; en general se trata de cepas no capsuladas o de serotipos distintos del b. La enfermedad por H. influenzae tipo b es desarrollada slo por un pequeo porcentaje de nios que entran en contacto con enfermos o portadores. La inmunidad natural frente al serotipo b se adquiere a medida que aumenta la edad. Muchas bacterias de la flora normal poseen eptopes que reaccionan en forma cruzada con el antgeno capsular b. El germen ingresa por el epitelio de la va area superior; la bacteria tiene la capacidad de invadirlo. Una vez all, dependiendo de factores del husped y probablemente de su virulencia, puede producir enfermedades confinadas a las mucosas, o no invasivas, o bien enfermedades invasivas, graves. En la submucosa se produce una respuesta inflamatoria que a nivel del rbol respiratorio da como resultado bronquitis o neumona. En algunos nios la bacteria invade la laringe causando inflamacin y edema de las distintas estructuras, comprometiendo la va area, lo que se denomina epiglotitis. La meningitis es el resultado de la invasin del torrente circulatorio y del espacio subaracnoideo. Los grmenes sobreviven en la sangre en tanto no aparezcan anticuerpos anticapsulares especficos. Estos anticuerpos son
de bazo se hallan especialmente predispuestos a desarrollar enfermedades severas por esa y otras bacterias capsuladas. Una vez en la sangre los grmenes llegan a las meninges por las arterias cerebrales. Inicialmente hay inflamacin de los plexos coroideos. Estos plexos estn altamente vascularizados, ya que es a ese nivel que se produce el LCR, y es por ello el sitio ms lgico para atravesar la barrera hematoenceflica. El dao que causa H. influenzae tipo b a nivel local le permite ingresar al LCR, primero en los ventrculos laterales y luego en la cisterna magna. El LCR se llena de un exudado inflamatorio y la obstruccin al flujo determina un aumento de la presin intracraneana que se traduce clnicamente por cefalea, vmitos y depresin de la conciencia. La fagocitosis da como resultado la liberacin de endotoxina y otros compuestos que aumentan an ms la respuesta inflamatoria. La endotoxina es la responsable de la fiebre, coagulacin intravascular diseminada y tal vez otros fenmenos. H. influenzae tipo b, en forma caracterstica, determina un dao mayor que otros grmenes, con mayor porcentaje de nios que desarrollan secuelas tales como sordera, hidrocefalia obstructiva, ceguera y retraso mental. Los cuadros clnicos ocasionados por H. influenzae de otros serotipos capsulares o no tipificables son otitis media, sinusitis, conjuntivitis, etc.
Las muestras debern ser enviadas de inmediato al laboratorio y procesadas en l lo ms pronto posible. Para el aislamiento debe incluirse la siembra en agar chocolate suplementado con factores X y V. La identificacin del germen se basa en sus requerimientos nutricionales, la coloracin de Gram de la colonia aislada, presencia de hemlisis y los requerimientos de factores X y V para diferenciar las especies ms frecuentes. Los aislamientos son identificados mediante diversas pruebas bioqumicas, determinacin de biotipos y serotipificacin.
SENSIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS
Debido a que surgieron cepas productoras de -lactamasas capaces de inactivar la ampicilina, esta droga ha dejado de ser de eleccin para el tratamiento de la enfermedad grave por H. influenzae. Tambin para este germen se ha descrito la resistencia a los -lactmicos debida a protenas fijadoras de penicilina con baja afinidad. Otra droga que se utiliz (asociada a la ampicilina) fue el cloranfenicol, que atraviesa bien la barrera hematoenceflica y es bactericida para este germen; pero luego fueron reportadas cepas productoras de una enzima (cloranfenicol acetil transferasa) que lo inactiva; lo que determin nuevamente cambios en los planes teraputicos. Actualmente, para el tratamiento de las infecciones graves por esta bacteria, se recomienda ceftriaxona o cefotaxime que no son hidrolizados por la -lactamasa de H. influenzae. Para infecciones respiratorias se emplean adems combinaciones de ampicilina con inhibidores de las -lactamasas. En el laboratorio, las cepas resistentes a ampicilina pueden ser detectadas mediante prueba de betalactamasas. El antibiograma por disco-difusin para Haemophilus es una adaptacin de la tcnica de Kirby Bauer a las exigencias del germen, y es necesario para detectar resistencia a otras drogas y mecanismos distintos a la produccin de -lactamasas.
PROFILAXIS, VACUNAS
Actualmente en nuestro pas es obligatoria la vacunacin de lactantes y nios pequeos con
de ribosil ribosa fosfato) conjugado a protena (por ej. toxoide diftrico o tetnico). Se administran integradas al esquema de vacunacin a los 2, 4 y 6 meses, y al ao de edad. A los contactos susceptibles (nios menores de 4 aos, no vacunados) de pacientes con meningitis, se debe administrar quimioprofilaxis para prevenir la aparicin de casos secundarios. En este caso la droga utilizada es rifampicina. Persiste el problema de hallar una vacuna para cepas de Haemophilus distintas al serotipo b, que causan enfermedades muy frecuentes, como otitis o sinusitis.
Haemophilus aegyptius
Tradicionalmente asociado a conjuntivitis aguda en pases de clima clido, en los aos 80 fue sindicado como el agente de una nueva entidad, la fiebre purprica brasilera. Esta es una enfermedad grave que afecta sobre todo a nios y que cursa con conjuntivitis, fiebre, petequias, prpura, shock y muerte, hasta en el 70% de los casos. Las cepas responsables de este cuadro clnico se distinguen de otras de la misma especie por la presencia de ciertas protenas de membrana externa y perfiles plasmdicos.
Haemophilus ducreyi
Es el agente del chancro blando, enfermedad de transmisin sexual que cursa con lcera genital no indurada y adenopatas inguinales. No se observa en nuestro pas.
Bordetella
El gnero Bordetella comprende tres especies. B. pertussis es el agente de la tos convulsa o pertusis; B. parapertussis y B. bronchiseptica causan enfermedad con menor frecuencia.
Bordetella pertussis
MORFOLOGA Y METABOLISMO
Son bacilos Gram negativos cortos, ocasionalmente presentan formas filamentosas, y son capsulados. Presentan grnulos metacromticos bipolares al ser teidos con azul de toluidina. Son exigentes, especialmente en cultivos de aislamiento inicial; su desarrollo se logra en medios suplementados con agar sangre, papa, glicerol y carbn activado (Bordet Gengou). Para el aislamiento a partir de muestras clnicas se agrega penicilina para inhibir la flora orofarngea. Como otros grmenes exigentes, son muy sensibles a las temperaturas extremas y a la desecacin. La incubacin se lleva a cabo a 35 C durante 3 a 7 das en ambiente hmedo, luego de lo cual las colonias se hacen visibles presentando un aspecto de gotas de mercurio. La hemlisis es caracterstica de las cepas virulentas. Es un germen aerobio estricto. No requiere de factores V ni X. Desde el punto de vista metablico son relativamente inactivos: no fermentan prcticamente azcares, no reducen nitratos, no producen indol, no poseen ureasa ni utilizan el citrato como fuente nica de carbono.
VARIACIN DE FASES
Las cepas recin aisladas, virulentas, producen colonias lisas o en fase I, que al ser sometidas a sucesivos pasajes in vitro experimentan variacin de fase hacia formas no virulentas (fases
PATOGENIA
La patogenia de la tos convulsa no ha sido an bien aclarada; las investigaciones en esta rea, destinadas al desarrollo de una nueva vacuna, han llevado al conocimiento de diversos factores de virulencia tales como: toxina de Pertussis, adenilato ciclasa extracelular, hemaglutinina filamentosa, toxina dermonecrtica, citotoxina traqueal y hemolisina. Adherencia B. pertussis se caracteriza por una predileccin por el epitelio respiratorio ciliado, produce mltiples adhesinas que median la unin a los cultivos a clulas de mamferos y que le permiten adherirse de forma especfica al epitelio respiratorio. De stas las ms estudiadas son: la fitohemaglutinina (hemaglutinina filamentosa o Fha) y la toxina de Pertussis. Fitohemaglutinina (Fha): es una protena de alto peso molecular que forma estructuras filamentosas en la superficie de las clulas; aunque carecen de la organizacin de los pilis. Su nombre deriva de que aglutinan eritrocitos. Esta hemaglutinina se une a residuos de galactosa de glucolpidos sulfatados. Las clulas ciliadas presentan en sus membranas grandes niveles de estas sustancias, denominadas sulftidos y esto puede explicar en parte la preferencia de B. pertussis en adherirse a ellas. Toxina de Pertussis (Ptx): tambin llamada factor promotor de linfocitosis, esta toxina puede actuar como toxina y como adhesina. La Ptx es una protena (exotoxina) hexamrica, pequeas cantidades de ella pueden ser liberadas al medio, pero la mayora permanece unida a la superficie bacteriana. Esta toxina es sin duda el mayor factor de virulencia. Es una protena del tipo A-B cuya estructura hexamrica es similar a la de la toxina del clera (aunque no idntica), con una subunidad enzimtica (S1) y 5 subunidades de unin (S2, S3, dos copias de S4 y S5). La subunidad S1 cataliza (al igual que la toxina colrica) la ribosilacin del ADP de la clula del husped a nivel de una protena G, lo que determina finalmente un aumento del nivel del AMP cclico. Esta aumenta los niveles de Gi activado. La protena Gi pertenece a una familia de protenas que regulan la actividad de la adenilato ciclasa de la clula eucariota. A diferencia de la toxina colrica, que actuando sobre la protena Gs estimula la adenilato ciclasa, la toxina de Pertussis inhibe la desactivacin de la adenilato ciclasa una vez que esta ha sido estimulada, actuando sobre Gi. Como se nota, a pesar de las similitudes estructurales con la toxina colrica, los cuadros clnicos que producen estas enfermedades son muy diferentes; lo que probablemente se vincule con el hecho de que estas bacterias tienen especificidad por distintos tipos de clulas. Ptx es responsable del aumento de las secreciones respiratorias y la produccin exagerada de mucus que se observa en la tos convulsa. Tambin se la ha responsabilizado de la encefalopata que puede ser vista en los casos de enfermedad severa. Esta toxina puede adems sensibilizar a la histamina, activar a las clulas de los islotes del pncreas y causar la tos paroxstica que se ve en las primeras etapas de la enfermedad. Adenilato ciclasa invasiva: B. pertussis produce una toxina que es capaz de producir AMP cclico directamente, determinando una desregulacin en la clula del husped. Las cepas mutantes que carecen de esta toxina son avirulentas, aunque conservan la capacidad de colonizar las mucosas. Esto indica que esta toxina tiene un importante papel en los estadios tardos de la enfermedad. Lipopolisacrido Este germen es capaz de producir al menos dos tipos de LPS. Las dos molculas difieren a
activa el complemento y estimula la liberacin de citoquinas. Probablemente tambin sea el responsable de algunos efectos secundarios de la vacuna.
CUADRO CLNICO
La tos convulsa o pertusis es una enfermedad severa de la infancia. Es sumamente contagiosa entre nios susceptibles. Entre sus manifestaciones locales se encuentran la bronquitis, con gran aumento de las secreciones respiratorias; stas estn compuestas por clulas epiteliales muertas, desprendidas de la mucosa respiratoria, clulas inflamatorias y bacterias. El flujo mucociliar est alterado por el dao de las clulas ciliadas y, debido a la sensibilizacin de los receptores de la tos, esta se desencadena fcilmente, en violentos accesos que le dan nombre a la enfermedad. La tos convulsa tiene adems manifestaciones sistmicas como fiebre moderada y linfocitosis. Se ha estimado que alrededor del 20% de los casos son enfermedades atpicas, y esos pacientes son capaces de contagiar a otros individuos susceptibles. Despus de la inhalacin de gotitas infectadas, los grmenes colonizan el tracto respiratorio. El perodo de incubacin dura entre 5 y 21 das. En forma clsica se diferencian tres etapas en el curso de la enfermedad: La etapa catarral o prodrmica dura 1 a 2 semanas; se trata de un cuadro clnico de infeccin inespecfica del aparato respiratorio superior. La segunda etapa dura entre 1 y 6 semanas, y se caracteriza por la progresin hacia la tos paroxstica. En cada episodio de paroxismo, el nio presenta entre 5 y 20 accesos de tos seca, forzada, emetizante. El paciente no tiene tiempo de respirar entre los diferentes accesos y puede ocurrir hipoxia. La inspiracin final tiene lugar a travs de la glotis estrechada, lo que produce un estridor caracterstico. La ingestin de alimentos puede precipitar episodios de tos e impedir la adecuada alimentacin. La tercera etapa es la de convalecencia. La tos puede persistir durante varios meses y su curso no se altera con la administracin de antibiticos. Es una enfermedad potencialmente mortal en lactantes con enfermedades cardacas o respiratorias subyacentes, y puede ocasionar manifestaciones y secuelas neurolgicas debido a la hipoxia.
DIAGNSTICO
La tos convulsa es una enfermedad que, en pases donde se aplica la vacuna DPT (ver mas adelante), puede presentarse en forma atpica; por lo tanto se requiere alta sospecha clnica para establecer el diagnstico. Incluso con cuadros clnicos muy caractersticos otros agentes infecciosos pueden producir sndromes similares. Paraclnica Los estadios tempranos de la enfermedad frecuentemente se asocian con una leucocitosis de 12000 a 20000 por mm3 con 60% de linfocitos. El diagnstico etiolgico definitivo se establece al aislar el germen del paciente; lo que se logra sobre todo al inicio del perodo catarral. Habitualmente el aislamiento del germen no se realiza en forma rutinaria en laboratorios clnicos debido a que el diagnstico suele ser tardo, con la aparicin de la tos paroxstica el germen ya no se asla de las vas respiratorias. La muestra apropiada es la extrada de la nasofaringe. El aislamiento del germen depende de un cuidadoso transporte y procesamiento en medios adecuados. Para la identificacin se realizan pruebas bioqumicas y serolgicas, con antisueros especficos. Para el diagnstico rpido tambin puede utilizarse la inmunofluorescencia directa.
SENSIBILIDAD DE BORDETELLA A LOS ANTIMICROBIANOS
Eritromicina es la droga de eleccin para el tratamiento de la tos convulsa cuando ste esta indicado, aunque estudios in vitro indican que el germen es sensible a una amplia gama de agentes. Los antibiticos, en la segunda etapa de la tos convulsa no modifican los sntomas ni acortan la enfermedad, solamente disminuiran la diseminacin y el contagio. Esto destaca la importancia de la profilaxis a travs de la vacunacin.
INMUNIDAD
La proteccin contra nuevas infecciones no se correlaciona bien con los niveles de anticuerpos. En la inmunidad probablemente estn involucrados adems mecanismos celulares como las clulas T citotxicas. Apoyan esta teora el hecho de que este tipo de mecanismos se ven en grmenes con fases de vida intracelular y que B. pertussis es capaz de sobrevivir en ciertas lneas celulares derivadas de macrfagos. Debido a ello se ha postulado la existencia de una fase de crecimiento intracelular de este germen que, adems de estos hechos, explicara la persistencia del mismo en el husped y el establecimiento del estado de portador.
VACUNAS
La vacuna DPT, que se administra a los lactantes, consiste en grmenes enteros muertos, junto con los toxoides tetnico y diftrico. Ciertos efectos secundarios indeseables de esta vacuna estn determinados por el componente pertusis y no por los otros (tetnico o diftrico). Estos efectos secundarios son poco frecuentes, y se los puede agrupar en tres tipos: Fiebre, malestar general y dolor a nivel del sitio de inyeccin, son los ms frecuentes y se atribuyen a la reaccin inflamatoria provocada por el lipopolisacrido de la pared celular y otras sustancias. Convulsiones en aproximadamente 1 de cada 2000 nios vacunados; por ello la vacuna no se recomienda para nios con antecedentes de convulsiones. Con una frecuencia muchsimo menor se producen enfermedades neurolgicas severas, como encefalopata; tal vez con una tasa de incidencia similar a la de poblaciones no vacunadas. La morbilidad por la enfermedad prolongada, la necesidad de hospitalizacin y la posibilidad de secuelas hacen comprender que los riesgos de la inmunizacin son mucho menores que los asociados a la enfermedad natural. La vacuna a clulas enteras contiene diversos antgenos Ptx, FHA, LPS, y aglutingenos. Los nios vacunados con vacunas a clulas enteras muestran un aumento en los niveles de anticuerpos anti FHA, Ptx, LPS, aglutingenos y protenas de membrana externa. Tambin se incrementan los ttulos neutralizantes, sobre todo luego de tres dosis. Se han ensayado diversas vacunas acelulares; una de las ms conocidas es la desarrollada en Japn. Es una vacuna que contiene diversos antgenos FHA, aglutingenos y toxoide pertusis. Su eficacia es similar a la vacuna a clulas enteras; alrededor del 78%. No est desprovista de efectos secundarios, si bien son ms leves. Se necesita adquirir ms conocimientos acerca de eptopes que puedan ser tiles para desarrollar una vacuna acelular que no tenga efectos indeseables y cuyo costo permita usarla, aun en pases subdesarrollados.
Brucella
Los integrantes del gnero Brucella producen enfermedad fundamentalmente en animales y ocasionalmente en humanos. Son parsitos intracelulares facultativos, con poca actividad
marcada por los distintos huspedes. Brucella abortus infecta sobre todo a bovinos, B. suis al ganado porcino, B. melitensis a cabras y B. canis a perros. De estas especies las tres primeras son transmisibles al hombre, siendo B. abortus y B. suis las que causaran enfermedad en nuestro medio. En el hombre, la brucelosis se caracteriza por presentar una fase bacterimica aguda, seguida de una etapa crnica que puede durar aos y que afecta diversos parnquimas.
Son cocobacilos pequeos de 1,2 de longitud, Gram negativos, pero que a veces se tien de manera irregular. Son aerobios, inmviles y no esporulados. Pueden tener cpsula. Al igual que otros parsitos intracelulares tienen necesidades nutricionales complejas. Para su desarrollo se requieren medios enriquecidos, como TSA agar soya-tripticasa con sangre. Son capnfilas. En medios slidos, las colonias se desarrollan lentamente, hacindose visibles en 3 a 5 das. Las cepas capsuladas dan colonias mucoides que se asocian a la virulencia. In vitro, con pasajes sucesivos las colonias se tornan rugosas, avirulentas. En medios lquidos pueden no desarrollar turbidez, por lo que cuando se estudian hemocultivos se recomienda hacer subcultivos sistemticos a ciegas, por ejemplo, a los 2, 7 y 14 das. El medio de Castaeda utilizado para el cultivo de Brucella contiene a la vez un medio slido y caldo en el mismo frasco (bifsico) que permite la observacin directa de las colonias. Brucella utiliza hidratos de carbono pero no producen grandes cantidades de cido ni gas como para ser utilizados en su identificacin. Pueden ser oxidasa y catalasa positiva, producir sulfuro de hidrgeno y reducir nitratos a nitritos. Son sensibles a la accin del calor (mueren al pasteurizar la leche) y a pH cido. La diferenciacin entre las especies se hace sobre la base de la especificidad de husped, la sensibilidad a colorantes, la produccin de sulfhdrico, presencia de ureasa y requerimientos de CO2. Dentro de cada especie existen biotipos. La identificacin y biotipificacin en general se reserva a laboratorios de referencia.
HUSPED
Existe cierta especificidad de husped. En estos animales, se ha descrito la presencia de sustancias (una globulina y una lipoprotena) que suprimen el crecimiento de las variantes rugosas y por lo tanto favorecen la expresin de cepas lisas, virulentas. Los animales resistentes carecen de estas sustancias, de modo que en ellos ocurre un pasaje hacia formas rugosas.
ESTRUCTURA ANTIGNICA
Dos antgenos denominados A y M se encuentran en distinta proporcin en las cuatro especies, por lo que existen reacciones cruzadas en las pruebas serolgicas. Poseen adems un antgeno de superficie denominado antgeno L, similar al antgeno Vi de Salmonella.
PATOGENIA
Si bien cada especie tiene un husped principal, cualquiera de las especies puede infectar gran variedad de animales y al hombre. La puerta de entrada es a travs de las mucosas o la piel. Una de las ms comunes es el ingreso a travs del aparato digestivo por la ingestin de leche no pasteurizada o sus derivados. El contacto de la piel con tejidos de animales infectados o la inoculacin accidental con vacunas son otros factores que deben ser investigados. Desde la puerta de entrada y por va linftica, los grmenes llegan al conducto torcico y de all a la circulacin general que los distribuye por los diferentes rganos. Los sitios ms afectados son
el tejido linftico, hgado, bazo, mdula sea y sistema reticuloendotelial. En esos lugares se producen ndulos granulomatosos que pueden evolucionar a la abscedacin. Ms raramente ocurre osteomielitis, meningitis o colecistitis. La anatoma patolgica muestra granulomas, constituidos por clulas epitelioides y clulas gigantes, con zonas de necrosis central y fibrosis perifrica.
CLNICA
En el ganado Brucella causa placentitis y aborto. Esto se ha vinculado a la presencia en las membranas fetales animales de eritrol, factor de crecimiento para el germen. La placenta humana no contiene eritrol y el aborto no es parte del cuadro clnico de la brucelosis humana. Cuadro clnico en el hombre Las cuatro especies tienden a producir cuadros clnicos de diferente gravedad. As B. canis y B. abortus causan cuadros ms leves, sin complicaciones supurativas. La infeccin por B. suis tiende a evolucionar a la cronicidad, con gran produccin de focos de caseum y tendencia a la supuracin. La infeccin por B. melitensis (Fiebre de Malta) causa cuadros ms graves. Luego de un perodo de incubacin de una a seis semanas, en forma insidiosa o repentina se inicia la enfermedad, con fiebre, astenia marcada, mialgias, artralgias, sudoracin, a lo que se agregan adenopatas, esplenomegalia y, raramente, ictericia. En esta etapa los cultivos son positivos, si el paciente no ha recibido antibiticos. Los sntomas ceden en semanas o meses y las lesiones localizadas prosiguen su evolucin. Luego de la etapa aguda puede desarrollarse una etapa crnica con astenia, artralgias, mialgias y otros sntomas. A veces se producen complicaciones serias tales como encefalitis, meningitis, neuritis perifrica, espondilitis, artritis supurativa y endocarditis. En esta etapa los cultivos son negativos y puede ser difcil establecer el diagnstico. El ttulo de anticuerpos puede ser alto.
DIAGNSTICO
En el hombre, el diagnstico de brucelosis se basa en la sintomatologa, los antecedentes epidemiolgicos y debe ser siempre confirmado en el laboratorio. Este diagnstico se establece con certeza al aislar el germen. Siempre se deben realizar hemocultivos en casos sospechosos. Tambin se puede aislar el germen de sitios como mdula sea, hgado, bazo, o LCR, dependiendo del curso de la enfermedad. Debe trasmitirse al laboratorio la sospecha de brucelosis, no slo porque se requieren tcnicas y procedimientos especiales para aislar el germen, sino porque las muestras deben ser manipuladas con ciertas normas de bioseguridad (nivel de bioseguridad 3) ya que se han reportado casos de transmisin por aerosoles al personal del laboratorio.
DIAGNSTICO SEROLGICO
Se dispone de test de aglutinacin usando antgenos de B. abortus que detectan anticuerpos circulantes (tanto IgG como IgM) contra B. abortus, B. melitensis y B. suis. Las muestras de suero deben ser obtenidas lo antes posible, al inicio de la enfermedad, y una segunda muestra a las 2 3 semanas de evolucin. Anticuerpos tipo IgM se producen al inicio de la enfermedad, pero tambin en la etapa de cronicidad. La presencia de anticuerpos puede ser puesta en evidencia por tcnicas de aglutinacin, la prueba de Rosa de Bengala, inmunofluorescencia indirecta y otras. Ttulos de 1:320 o ms, y ttulos crecientes en muestras sucesivas, permiten establecer el diagnstico de brucelosis, mientras que la ausencia de anticuerpos aleja consi-
SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Dado que se trata de un patgeno intracelular, de lento crecimiento, los test de sensibilidad in vitro no sirven para predecir la respuesta a los antibiticos. Se utilizan asociaciones de drogas por perodos prolongados y que sean activas intracelularmente. Los regmenes ms aceptados incluyen combinaciones de tetraciclina (o doxiciclina) con rifampicina por seis meses. Otras combinaciones posibles son tetraciclinas ms aminoglucsidos o rifampicina y trimetoprm, en especial en nios.
EPIDEMIOLOGA, PROFILAXIS Y CONTROL
Es fundamentalmente una zoonosis ocupacional, son patgenos animales y el contagio humano suele ser accidental, por contacto con tejidos, orina o leche de animales infectados. Las tasas de infeccin del ganado varan en los diferentes pases. La leche no pasteurizada, sus derivados y la exposicin laboral, son los antecedentes ms frecuentes (veterinarios, personal de mataderos). Ocasionalmente el contagio ocurre por va area. Los hombres se ven afectados con ms frecuencia que las mujeres. Cierto porcentaje de infecciones pueden ser asintomticas. La profilaxis de la enfermedad se logra a travs de la vacunacin del ganado con cepas vivas avirulentas. Para el control de la Brucelosis bovina se utiliza una vacuna preparada con B. abortus, cepa 19, que confiere inmunidad al animal de por vida, y es de bajo costo. El control de la enfermedad debe estar orientado a evitar la diseminacin, erradicar los reservorios animales, pasteurizar la leche y disminuir el riesgo laboral.
Helicobacter
En 1982, Marshall y Warren publicaron un trabajo que informaba acerca de la presencia de bacilos Gram negativos espirilares en biopsias gstricas de pacientes afectados de gastritis. Originalmente esta bacteria se denomin Campylobacter pyloridis. En 1989 se cre el gnero Helicobacter que agrupa varias especies, de las cuales 3 son patgenas para el hombre (H. pylori, H. fennelliae y H. cinaedi). Otras especies se encuentran en animales.
Este gnero comprende bacilos Gram negativos curvos o espirilares. En cultivos viejos adoptan forma de bacilos o cocobacilos. Poseen fagelos nicos o mltiples. Se trata de grmenes microaerfilos de lento desarrollo, cuya temperatura ptima de crecimiento es 37 C. Presentan complejos requerimientos nutricionales y, habitualmente, son aislados en medios ricos con bases como agar brucella, suplementada con sangre y el agregado de antibiticos para inhibir otros grmenes que puedan hallarse en la muestra. Las colonias demoran 3 a 4 das en hacerse visibles. Son catalasa y oxidasa positivos. Helicobacter pylori posee adems una enzima ureasa que es til para la identificacin y el diagnstico.
HBITAT
Su distribucin es mundial, ha sido aislado en pacientes de pases desarrollados y no desarrollados, tanto en adultos como en nios pequeos. La va de transmisin no ha sido an determinada, probablemente sea fecal-oral u oral-oral. En los pases en desarrollo la infeccin se adquiere temprano en la infancia, mientras que en Estados Unidos la edad de adquisicin es mucho ms tarda. La mayor incidencia de esta infeccin se asocia a malas condiciones
El hbitat natural de H. pylori es la mucosa gstrica humana. El estmago, con su pH cido no es un sector propicio para el crecimiento bacteriano. La enzima ureasa, producida en grandes cantidades por la bacteria, convierte la urea en amonio lo que crea condiciones ms favorables para la sobrevida del germen. Adems, la forma de espirilo y la movilidad le conferiran la capacidad de resistir la peristalsis. La adherencia por medio de adhesinas especficas tambin contribuira a la persistencia de H. pylori en la mucosa gstrica. Luego de adquirida la infeccin, la bacteria reside en la mucosa sin invadir el epitelio. Se desencadena una respuesta inmune de tipo humoral pero no es eficaz para curar la infeccin.
MECANISMOS PATOGNICOS, PAPEL EN LA ENFERMEDAD GASTRODUODENAL
H. pylori produce diversas sustancias que intervendran en la patogenia de esta infeccin: ureasa, citotoxinas, mucinasa, lipasa, fosforilasa A, adhesinas y hemolisinas. El germen parece colonizar el estmago por aos o dcadas, causando inflamacin gstrica leve y persistente; esta suele ser asintomtica. En ciertos casos, y por factores an no aclarados, (probablemente debido a caractersticas del husped o de la cepa involucrada) la respuesta inflamatoria progresa. Entre los factores ms estudiados que llevaran a la progresin de la inflamacin estn una citotoxina, una enzima con capacidad de producir vacuolizacin de las clulas y otras sustancias proinflamatorias. La asociacin de gastritis crnica y lcera pptica con la infeccin por H. pylori es muy fuerte y las tasas de infeccin por H. pylori son significativamente superiores en pacientes con lcera pptica que en aquellos controles sanos. Tambin existe asociacin de la infeccin por H. pylori y lcera duodenal; luego de un seguimiento de 10 aos se demostr que pacientes con gastritis crnica superficial tienen un riesgo 13 veces mayor de desarrollar lcera duodenal que los que no tienen gastritis. Por otra parte, el tratamiento de la infeccin lleva a la remisin de los sntomas o a la cura de la enfermedad, aunque no previene las recidivas. La gastritis superficial puede progresar a gastritis crnica atrfica, y ms tarde desarrollar adenocarcinoma gstrico, por lo que H. pylori sera un factor de riesgo para este tipo de tumores. Se espera disponer, en un futuro no muy lejano, de modelos experimentales que permitan aclarar la patogenia de esta infeccin.
MTODOS DE DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR H. PYLORI
Bacteriologa Se realiza a partir de biopsias de mucosa gstrica o duodenal. Dichas biopsias son homogeneizadas y procesadas mediante examen directo y cultivo en medios y condiciones de atmsfera y temperatura ya analizados. Luego de 4 a 7 das las colonias aisladas son identificadas mediante microscopa y pruebas de oxidasa, catalasa y test de ureasa rpida. A parir de esos cultivos se pueden realizar estudios de susceptibilidad a drogas. La actividad de la enzima ureasa es tan importante que si se coloca un trozo de biopsia gstrica en caldo urea, la presencia de H. pylori se evidencia por la alcalinizacin del medio de cultivo en minutos a horas, lo que tambin se utiliza para el diagnstico. Histologa El estudio anatomopatolgico de las biopsias ha demostrado ser muy sensible y especfico para el diagnstico de esta infeccin. Permite visualizar a las bacterias y sirve para determinar el tipo de lesin histolgica (por ej. gastritis crnica superficial, etc.) y otras lesiones asociadas.
Al igual que el cultivo tiene la desventaja de ser invasivo ya que se requiere de endoscopa digestiva para obtener la muestra. Prueba de la urea marcada con carbono radiactivo Consiste en administrar al paciente por va oral urea marcada con 13C. De estar presente H. pylori en el tubo digestivo, la urea es hidrolizada a nivel gstrico por la ureasa liberando CO2 marcado. Este es detectado por tcnicas espiromtricas. Serologa La respuesta de anticuerpos puede ser detectada en suero mediante diversas tcnicas, resta por aclarar el valor de la serologa, en el diagnstico y seguimiento de los pacientes.
TRATAMIENTO
An no se han establecido claramente la indicacin ni el mejor plan teraputico para erradicar la infeccin. En general se han usado planes que combinan uno o dos antibiticos activos a nivel gstrico con inhibidores de la bomba de protones.
Campylobacter
Es un gnero de bacilos Gram negativos, de forma curva semejante a una gaviota, o de aspecto espirilar. La especie C. jejuni es la responsable de ms del 95% de los casos de diarrea por Campylobacter. La importancia de este enteropatgeno se demostr en poca relativamente reciente, cuando se dispuso de tcnicas y medios de cultivo especiales y se conocieron sus condiciones de crecimiento. Necesita de medios ricos para crecer, una temperatura ptima de 42-43 C y un ambiente escaso en oxgeno (microaerfilo). Es agente comn de diarrea aguda comunitaria (EPEC, Rotavirus, Campylobacter, etc.). En nios hospitalizados es la causa ms frecuente de diarrea con sangre, despus de Shigella. Se acompaa en general de fiebre y dolores abdominales. La concentracin de leucocitos fecales eliminados en estos procesos es menor que en las shigelosis. Igual ocurre para Salmonella o Yersinia enterocoltica. En algunos casos (0,15%) se produce invasin sistmica y bacteriemia; esto ocurre en especial en pacientes aosos o inmunocomprometidos. La infeccin por C. jejuni es actualmente reconocida como un antecedente de riesgo para el desarrollo del sndrome de Guillain-Barr, una neuropata perifrica que se atribuye a reacciones inmunopatolgicas por similitud entre los antgenos lipopolisacridos superficiales de esta bacteria y los del tejido neural. Las infecciones por este germen predominan en verano, pero se siguen observando en otoo y ya iniciados los fros. El reservorio de Campylobacter es muy extenso, ya que la mayor parte de los animales domsticos pueden ser afectados y transmitir la infeccin por sus heces, o por los alimentos que de ellos se obtienen, si bien la bacteria no se multiplica habitualmente en los mismos. Es tambin frecuente la transmisin fecal-oral interhumana. La mayor parte de los infectados excretan el germen durante 4-7 semanas. Aun se discute la patogenia de la diarrea producida por C. jejuni. Muchas cepas son invasoras de las clulas epiteliales; algunas producen citotoxinas y otras elaboran enterotoxinas semejantes a las de Vibrio cholerae o de Escherichia coli. Existen otras especies como C. coli, C. laridis, etc., que han sido asociadas a diarrea en humanos. Campylobacter puede ser observado en frotis de materias fecales diarreicas teidos con
El cultivo se realiza por siembra directa en medios ricos y selectivos, con agregado de antibiticos, o sin sustancias inhibitorias, si se filtra previamente la muestra a travs de membranas de 0,45um, que pueden atravesar gracias a su delgadez y gran movilidad, como ocurre con Leptospira. Se pueden practicar cultivos de enriquecimiento con posterior reaislamiento. Las colonias de Campylobacter aparecen como gotas de agua extendidas sobre la placa, y su identificacin debe ser confirmada por observacin microscpica de su aspecto y movilidad, reaccin de catalasa y oxidasa positivas, y otras caractersticas metablicas. Es posible clasificarlos en serotipos segn sus antgenos superficiales proteicos y lipopolisacridos, o en genotipos por anlisis de sus cidos nucleicos. C. jejuni es habitualmente sensible a macrlidos y quinolonas, y resistente a betalactmicos.
Bibliografa
Gorbach SL, Bartlett JG and Blacklow NR, editors Infectious Diseases 2nd. ed. Philadelphia: Saunders;1998. Koneman E. Diagnstico Microbiolgico, Atlas Color y Texto. 5ta. ed. Buenos Aires: Editorial Medica Panamericana; 1999.
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Principales grupos de bacilos gramnegativos no exigentes

G. Algorta, F. Schelotto
Introduccin
El gran grupo de bacilos Gram negativos no exigentes incluye diferentes familias y gneros, muchos de ellos muy frecuentes en patologa mdica. Comparten algunas caractersticas tales como poseer en su pared externa un lipopolisacrido (LPS), que les otorga caractersticas patognicas particulares, txicas, la llamada endotoxina de las bacterias Gram negativas. Muchos de ellos son ubicuos, encontrndose muy difundidos entre los animales y la naturaleza, pudiendo causar enfermedad en el hombre y los animales como es el caso de Salmonella; otros, aunque bien adaptados al medio ambiente, son patgenos humanos exclusivos, por ejemplo Vibrio cholerae; por ltimo, otros se encuentran bien adaptados a su husped, como por ejemplo Shigella. Algunos de estos bacilos Gram negativos poseen atributos de virulencia bien definidos, comportndose como patgenos primarios, Yersinia pestis, Salmonella typhi, responsables de la Peste y la Fiebre tifoidea respectivamente. Otros, tales como Acinetobacter y Pseudomonas producen infecciones oportunistas. Es de destacar que algunos de ellos, como Escherichia coli, forman parte de la flora normal del tubo digestivo y permanecen en l sin causar enfermedad, siempre y cuando no se modifiquen las condiciones de su hbitat. En este captulo se har nfasis en aquellas familias, gneros y especies que se encuentran ms frecuentemente relacionados con la patologa humana.
Enterobacteriaceae
Esta familia comprende un nmero muy variado de gneros y especies bacterianos cuyo hbitat natural es el tubo digestivo del hombre y los animales. No todos los bacilos Gram negativos que tienen este hbitat forman parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas, y en los animales, desde los insectos al hombre. La familia est definida por un conjunto de caractersticas fenotpicas (bioqumicas, fisiolgicas e inmunolgicas) a las que se han agregado posteriormente otros elementos establecidos por tcnicas de hibridacin de cidos nucleicos que miden distancias evolutivas y han definido mejor la interrelacin de todos los microorganismos integrantes de la familia. Son bacilos Gram negativos rectos, con un dimetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son mviles, presentan flagelos pertricos. No forman esporos. Desarrollan en presencia o en ausencia de oxgeno (aerobios-anaerobios facultativos). Desarrollan rpidamente en medios simples, no siendo exigentes desde el punto de vista nutricional. Algunos desarrollan en glucosa como
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nica fuente de carbono, mientras otros requieren el agregado de vitaminas o minerales en el medio de cultivo. Son quimioorganotrofos, poseen metabolismo fermentativo y respiratorio. Son catalasa positivos y oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. El contenido de Guanina + Citosina del DNA total es de 38 a 60 moles %. En los medios de cultivo forman colonias lisas, convexas y circulares de bordes definidos. Algunas especies desarrollan colonias ms mucoides que otras (por ejemplo Klebsiella).
CARACTERES BIOQUMICOS
Los bacilos Gram negativos que integran esta familia pueden identificarse por medio de la expresin fenotpica de algunos caracteres genticos. Los mtodos utilizados tienen como principio: La investigacin de la fermentacin de azucares o alcoholes en un medio peptonado con el agregado de un indicador de pH para detectar la produccin de metabolitos cidos. La investigacin de la utilizacin de un substrato como nica fuente de C. La investigacin de produccin de ciertas enzimas sobre substratos generadores de color. La investigacin de la produccin de un metabolito, producto final caracterstico de una va metablica. La investigacin de la aptitud de desarrollar en presencia de un inhibidor.
CARACTERES ANTIGNICOS
Los microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae poseen una estructura antignica compleja. Los antgenos O, antgenos somticos Son la parte ms externa del LPS y estn formados por unidades polisacridas repetidas. Algunos contienen un nico azcar. Son termoestables y alcohol-estables, detectndose por aglutinacin simple. La naturaleza de los grupos terminales y el orden en que estos azucares estn dispuestos en las unidades repetitivas determina la especificidad de los numerosos antgenos O. Un mismo microorganismo puede poseer varios antgenos O. Cada gnero est asociado a grupos antignicos especficos, por ejemplo la mayora de los serotipos de Shigella comparten uno o ms antgenos O con Escherichia coli (Shigella y E. coli pertenecen al mismo gnero). Por otra parte E. coli puede tener reacciones cruzadas con especies de los gneros Klebsiella y Salmonella. En E. coli algunos antgenos somticos estn asociados con fenotipos virulentos especficos, por ejemplo E. coli O:111 y O:119 son frecuentemente agentes etiolgicos de diarrea aguda en los nios pequeos. Los antgenos K, externos a los antgenos O Algunos constituyen una verdadera cpsula visible al microscopio, como sucede con Klebsiella, mientras que en E. coli por ejemplo, su estructura no es visible al microscopio ptico y se los denomina antgenos de envoltura por comportarse como si envolvieran la bacteria volviendo inaglutinable el antgeno O de la pared. Son de naturaleza polisacrida. Otros antgenos de envoltura pero de naturaleza proteica se presentan como fimbrias. Los antgenos H, flagelares Son de naturaleza proteica. Esta protena que constituye los flagelos es llamada flagelina. Este antgeno es termolbil y destruido por el alcohol. El contenido de aminocidos y el
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orden en que estos se encuentran en las flagelinas determina la especificidad de los diversos antgenos. Como ya fue mencionado, los flagelos bacterianos estn compuestos de un solo tipo de protena. En Salmonella existe variacin de fase. Como resultado de ello, la protena flagelar puede ser de dos tipos por medio de un mecanismo de regulacin gentica (inversin sitio especfico), que involucra: dos genes que codifican las dos protenas, pero solo uno se expresa en cada momento; un gen represor de uno de estos genes; y la inversin de un segmento de DNA que modifica la direccin de la transcripcin.
CARACTERSTICAS PATOGNICAS
Se ha asociado a cepas de Enterobacteriaceae con abscesos, neumonas, meningitis, septicemia, infecciones de heridas, infecciones de las vas urinarias e intestinales. Son el componente mayor de la flora normal intestinal, pero son relativamente poco frecuentes en otros sitios del organismo. Algunas especies son importantes como causa de infecciones nosocomiales. Significan el 50% de todos los aislamientos clnicos y el 80% de los bacilos Gram negativos. Representan el 50% de los casos de septicemia y ms del 70% de las infecciones urinarias. Hasta 1940 solo Salmonella y Shigella estaban relacionadas con gastroenteritis humana. Actualmente es bien conocido que algunas variantes patognicas de E. coli son causa significativa de enfermedad diarreica y que cepas invasivas de Yersinia enterocoltica son causa de diarrea y adenitis mesentrica. Clsicamente se han descrito a las especies no relacionadas con enfermedad diarreica, como agentes de infecciones oportunistas, capaces de producir enfermedad en el hospedero inmunocomprometido o por transposicin de flora. Es importante destacar, algunas excepciones ya mencionadas. Por otra parte salvo Shigella que raramente causa infecciones fuera del tracto gastrointestinal, muchas especies de Enterobacteriaceae causan frecuentemente infecciones extraintestinales.
ESCHERICHIA COLI
Es llamada as en honor del pediatra que la aisl y caracteriz en 1885. Junto a otras especies de incidencia excepcional, forma el gnero Escherichia. Constituye la especie dominante de la flora aerobia del tubo digestivo, ms de 10 serotipos coexisten normalmente en el mismo individuo. Son estas mismas bacterias integrantes de la flora normal las que pueden causar en diversas circunstancias infecciones abdominales, septicemias, meningitis, etc. El poseer determinadas caractersticas antignicas, como el antgeno de envoltura K1, muy parecido por su composicin en cido silico al antgeno capsular de Neisseria meningitidis del grupo B, dara a este germen potencialidades invasivas. El 80% de E. coli aisladas de meningitis del recin nacido poseen este antgeno K1. Por otra parte el poseer plsmidos que portan genes que codifican para la produccin de diferentes adhesinas, enzimas o enterotoxinas otorga a E. coli caractersticas patognicas particulares y la capacidad en una u otra circunstancia, dependiendo de la o las protenas producidas, de dar infecciones urinarias o gastrointestinales. Los caracteres bioqumicos para la identificacin de esta especie se describen en la tabla correspondiente. Es habitualmente fermentador de la lactosa, urea y citrato negativo, indol positivo y mvil. Desde el punto de vista antignico en E. coli se han descrito ms de 150 serogrupos O. Poseen antgenos de envoltura polisacridos K, que, como es habitual en el mundo bacteriano, permiten a la bacteria resistir ms fcilmente la fagocitosis que las bacterias no capsuladas.
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Asimismo se describen ms de 56 antgenos H que permiten completar su clasificacin en serotipos O:H. De lo dicho se desprende que una tipificacin antignica completa es resorte de laboratorios especializados y no forma parte del trabajo corriente de los laboratorios. Patogenia Como ya fue mencionado E. coli puede integrar la flora normal, causar diarrea, infeccin urinaria, meningitis, etc. Pero una cepa que causa diarrea no causara infeccin urinaria ni meningitis. La versatilidad de este microorganismo esta dado porque E. coli ha adquirido conjuntos diferentes de genes de virulencia. E. coli es un excelente ejemplo de que el poseer un conjunto de genes es lo que hace que una bacteria sea patgena, y no la designacin de gnero o especie. Se ha propuesto para E. coli agente de diarrea una clasificacin de acuerdo a sus mecanismos de virulencia, los llamados virotipos. Aunque arbitraria, esta clasificacin es muy til. Se describen 5 virotipos. E. coli enterotoxigenico (ETEC), E. coli enteroagregativo (EAggEC), E. coli enteropatognico (EPEC), E. coli enterohemorrgico (EHEC), y E. coli enteroinvasor (EIEC). E. coli enterotoxignico (ETEC) Se parece mucho a V. Cholerae; la enfermedad que produce es similar, pero ms leve. Adhiere a la mucosa del intestino delgado, no la invade, y elabora toxinas que causan diarrea. No hay cambios histolgicos en las clulas de la mucosa y hay muy poca inflamacin. Clnicamente hay diarrea acuosa, vmitos y raramente fiebre. Es la llamada infeccin no inflamatoria del intestino delgado. Esta clase de E. coli causante de diarrea est integrada por numerosos serogrupos y serotipos (O:6, O:8, O:25, O:78, etc.), ya que los determinantes patognicos (fimbrias y toxinas) estn codificados en plsmidos transferibles. Su identificacin es compleja, ya que requiere la deteccin de su DNA caracterstico (por sondas o PCR), o la demostracin por ELISA de la produccin de toxinas en cepas que pueden encontrarse en forma minoritaria en el coprocultivo.
Factores de virulencia
Para adherirse a las clulas de la mucosa ETEC produce diversos tipos de pili. Un tipo de ellos, los llamados factores antignicos de colonizacin I y II (CFA/I y CFA/II) y otros, parece contribuir fuertemente a la colonizacin por estos microorganismos. Los receptores para estas adhesinas estn aun en estudio, pero se piensa que son glicoprotenas. Los genes que codifican para CFA estn frecuentemente localizados en plsmidos. La diarrea producida por cepas de ETEC es causada por la accin de dos diferentes toxinas: toxina termolbil (LT) y toxina termoestable (ST). Hay dos LT y su estructura y mecanismo de accin es el de la toxina colrica. Tienen diferencias en la excrecin de la clula bacteriana y en la regulacin gentica de su sntesis. ST es una familia de pequeas toxinas polipeptdicas. Los genes que codifican para LT y ST son portados por plsmidos. A menudo el mismo plsmido lleva los genes de las adhesinas y toxinas. E. coli enteroagregativo (EAggEC) Son agentes de diarrea persistente en nios. Las cepas de EAggEC se parecen a ETEC en que se unen a las clulas intestinales, no son invasivas y no causan modificaciones histolgicas
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en las clulas de la mucosa. Difieren de ETEC en que no adhieren en forma uniforme sino que lo hacen en pequeos agregados.
Estas cepas poseen unas estructuras fibrilares muy delgadas que se presumen son los pili de adherencia. Aunque es posible que estos pili promuevan la adherencia de estas bacterias entre s, ms que la adherencia a la clula del hospedero (forma de adherirse en agregados). Producen una toxina similar a ST llamada EAST (ST enteroagregativa). Otra toxina producida por EAggEC es una toxina muy similar a una hemolisina producida por cepas de E. coli que causan infecciones urinarias. Esta toxina no hidroliza eritrocitos pero produce poros en las membranas celulares del hospedero. E. coli enteropatgeno (EPEC) EPEC es causa de diarrea severa en nios pequeos, de gran trascendencia en pases subdesarrollados. EPEC exhibe un patrn de adherencia en parches, pero no forma el mismo tipo de agregados que EAggEC. A diferencia de las anteriores, la adherencia de EPEC produce alteraciones importantes en la ultraestructura de las clulas del husped. Las clulas a las que EPEC est adherida alargan las microvellosidades donde EPEC no se encuentra y stas desaparecen en el sitio donde la bacteria est adherida. Este fenmeno se refiere como de unin y borramiento, y es el resultado de un reordenamiento de actina en la vecindad de la bacteria adherida. EPEC es ms invasora que las anteriores y se produce una reaccin inflamatoria. Esta clase de E.coli est integrada por varios serogrupos, en general los serogrupos asociados con EPEC estn limitados a este virotipo (existen excepciones).
La diarrea producida por EPEC es una enfermedad ms compleja y se piensa que sucede en tres etapas. En un inicio, hay una asociacin de la clula bacteriana a la clula del hospedero llamada unin no ntima, mediada por pili. Este pili llamado Bfp parece no ser la nica adhesina de EPEC. Posteriormente a travs de un sistema dependiente de contacto llamado sistema de secrecin tipo III la bacteria infecta protenas desde el citoplasma bacteriano directamente desde el citoplasma de la clula eucariota, produciendo alteraciones en la funcin de la culla eucariota con activacin de enzimas celulares y aumento de los niveles de Ca++ intracelular, probablemente debido a fosforilacin de protenas del citoesqueleto y la activacin de enzimas despolimerizantes de actina. La bacteria se asocia entonces ms prximamente con la clula del hospedero (unin ntima) producindose un reagrupamiento de actina en la vecindad de la superficie celular. Histolgicamente la deformacin de algunas microvellosidades y la destruccin de otras se acompaa de la formacin de estructuras similares a pedestales en la clula, por debajo del sitio de adherencia de la bacteria. Estos pedestales son fibras densas de actina. La unin ntima esta mediada por una protena de membrana externa llamada intimina, que adhiere a receptores translocados por la bacteria al enterocito junto a otras seales proteicas (TIR: translocated intimin receptor). Otras protenas se encuentran tambin involucradas en este proceso. Algunas bacterias son posteriormente internalizadas dentro de vesculas fagocticas. Los genes que codifican los pili Bfp estn localizados en plsmidos EAF, pero la mayor parte de los factores patognicos estn codificados en el cromosoma bacteriano.
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E. coli enterohemorrgico (EHEC) Se ha reconocido recientemente a EHEC como responsable de cuadros graves. Estas cepas causan una enfermedad que clnicamente se parece a la disentera producida por Shigella, aunque no invade las clulas de la mucosa. La enfermedad producida por EHEC puede complicarse con sndrome urmico hemoltico (SUH) que puede llevar al paciente a la muerte por falla renal aguda. O157:H7 es el serotipo caracterstico de este grupo de EHEC. Los cultivos STEC abundan en el intestino de bovinos y otros animales. Pertenecen habitualmente a serotipos no frecuentes en infeccin humana, pero pueden transferir sus atributos patognicos a cepas adaptadas al hombre. Un factor importante de diseminacin de estas bacterias es la posibilidad de contaminacin de la carne durante la faena. La mala coccin de la carne mezclada en hamburguesas y usada en la preparacin de comidas rpidas ha llevado a la existencia de brotes de diarrea o SUH causados por STEC O157 en pases desarrollados. En nuestro pas, se han estudiado en los ltimos aos algunas decenas de pacientes con SUH, presentndose en forma de casos aislados, sin relacin aparente entre ellos.
VTEC posee adhesinas fimbriales codificadas en un plsmido de virulencia de 60 mda., y genes cromosmicos y plasmdicos que median en los enterocitos del colon un efecto de fijacin y borramiento de las microvellosidades similar al que produce EPEC en el intestino delgado. A diferencia de EPEC, EHEC produce toxinas iguales o parecidas a la toxina Shiga, por lo cual se los llama tambin STEC (Shiga Toxin E. Coli). Estas sustancias proteicas constituyen una familia de exotoxinas (VT1, VT2, VT2vha, VT2vhb, etc.) llamadas tambin verotoxinas por su accin citotxica sobre cultivos de clulas Vero de laboratorio. Cada bacteria puede codificar una o ms variantes. La diarrea con sangre y el SUH asociado a STEC son principalmente debidas a la produccin de toxinas Stx, aunque existen otros factores participantes como la enterohemolisina y otros productos microbianos. Las citotoxinas son producidas localmente y contribuyen a la patologa intestinal, pero pasan a la sangre produciendo efectos sistmicos que derivan principalmente de la alteracin endotelial microangioptica, que favorece la fragmentacin globular, la glomerulopata y otras alteraciones parenquimatosas. Los genes que codifican para las STX se encuentran en fagos temperados, lo que permite a otras cepas productoras de diarrea adquirir capacidad toxignica y producir una forma grave de enfermedad. E. coli enteroinvasor (EIEC) EIEC produce una enfermedad indistinguible de la disentera producida por Shigella. Los pasos en la invasin y diseminacin clula a clula parecen ser idnticos a los de Shigella. A diferencia de sta no produce toxinas, por lo cual no se han descrito casos de SUH en relacin a estas cepas. Al igual que Shigella muchos de los genes involucrados residen en un gran plsmido de virulencia. La mayora de estos grmenes son inmviles, anaerognicos, no decarboxilan la lisina y no utilizan la lactosa (lactosa negativos). Pertenecen a un conjunto de serogrupos caractersticos, bien estudiados por la escuela microbiolgica brasilea. E. coli uropatognico Las infecciones del tracto urinario comienzan generalmente con la colonizacin de la uretra por cepas originarias del colon previa colonizacin de la vagina. Una de las mayores defensas del husped es la accin lavadora de la orina. Las bacterias que no se pueden adherir van a
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ser lavadas ms rpidamente de la vejiga de lo que tardan en multiplicarse. Por otra parte las bacterias que adhieren estn ms cerca de la mucosa y tienen mayores facilidades para provocar respuesta inflamatoria. Numerosas adhesinas de E. coli uropatgeno han sido estudiadas. Los pili tipo 1 contribuyen a la colonizacin de la vagina y parecen intervenir muy poco en la adherencia al resto del aparato urinario. La adhesina ms importante, sobre todo en cepas que causan infeccin renal es pili P . Hay diversidad antignica en estos pili pero todos reconocen el mismo carbohidrato como receptor, globobiosa. Este azcar se encuentra unido a una ceramida anclada en la membrana de las clulas del husped. Estas cepas pueden poseer otras adhesinas que no son pili, por ejemplo adhesinas afimbriales (AFAI, AFAIII) o la adhesina Dr, que reconoce al antgeno del grupo sanguneo Dr como receptor. En general las cepas de E. coli uropatognico producen mltiples adhesinas por combinacin de diferentes tipos de pili o diferentes serotipos del mismo pili. Esto podra permitir a las bacterias adaptarse a diferentes superficies mucosas y ambientales, brindndole un mecanismo de evasin de las defensas del hospedero. En cuanto a la respuesta inflamatoria, hay evidencias de que LPS junto a pili P actan sinrgicamente provocando esta respuesta. Por otra parte, algunas cepas uropatognicas de E. coli producen una exotoxina llamada hemolisina, porque lisaba eritrocitos, aunque luego se vio que tambin lisaba otras clulas. Esta hemolisina (HlyA) pertenece a una gran familia de hemolisinas llamadas RTX. Todas ellas actan creando poros en las membranas celulares de los eucariotas. En el ratn las cepas que poseen HlyA y pili P colonizan la vejiga, el rin y matan dos tercios de los ratones testados, por otra parte cepas isognicas que producen solo pili P , colonizan pero no causan dao renal ni muerte. Las cepas que no poseen pili y no producen hemolisina no colonizan. Al menos en el modelo animal la hemolisina media el dao renal. Los genes que codifican para pili P estn agrupados en el cromosoma. El conjunto contiene genes para la subunidad mayor (pap A), para las protenas del tip (pap E, F, G), para protenas de procesamiento y ensamblado (pap C, D, H, J, K) y protenas reguladoras (pap B, I). Salvo el gen I los dems forman un opern transcripto desde un solo promotor. Por otra parte los genes para hlyA tambin estn agrupados y en proximidad de los genes para pili. A las regiones que contienen los genes de virulencia se las ha llamado islas de patogenicidad.
SHIGELLA
Como ya fue mencionado Shigella son bacterias estrictamente humanas. Como sucede frecuentemente esta adaptacin se produce con prdida de funciones. Shigella, que por hibridacin se encuentra tan cercano a E. coli que podran pertenecer a una misma especie, a diferencia de ste son auxotrofos, inmviles, poco glucidolticos, y prcticamente no producen gas en la fermentacin de glucosa. Los caracteres bioqumicos se describen en la tabla correspondiente. En base a los caracteres bioqumicos y antignicos se describen cuatro especies. S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii y S. sonnei. Estas especies se subdividen en serotipos sobre la base de un factor somtico O caracterstico. Shigella produce una enfermedad inflamatoria aguda del colon con diarrea sanguinolenta, que en su presentacin ms caracterstica se manifiesta como una disentera o diarrea disenteriforme. Este sndrome clnico est caracterizado por deposiciones de poco volumen con mucus, pus y sangre; clicos y tenesmo, acompaados de fiebre; adems es caracterstica la presencia de abundantes leucocitos en el frotis de materias fecales. Se trasmite de persona a persona directamente por las manos contaminadas o indirectamente por alimentos o agua contaminados con heces humanas. Se necesita una dosis infectante pequea para causar
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enfermedad; frecuentemente unas pocas centenas de bacterias ingeridas son suficientes para provocarla. En el adulto sano es una enfermedad autolimitada aunque molesta; en los nios pequeos y de poblaciones marginadas puede ser una enfermedad grave que lleve al nio a la muerte. Se trata de una enfermedad ms frecuente en poblaciones con mal saneamiento. Puede ser espordica o dar lugar a brotes extensos, e incluso a endemias en instituciones cerradas como crceles u organizaciones para discapacitados. La eliminacin fecal de los grmenes puede prolongarse por varias semanas. Un porcentaje de los enfermos pueden complicarse, presentando alteraciones hidroelectrolticas, neurolgicas (letargia, cefalea, convulsiones) o fallo renal (HUS), esto ultimo cuando se trata de S. dysenteriae 1. Patogenia Shigella es un buen modelo de enfermedades en las cuales la bacteria invade las clulas del hospedero, se replica en su citoplasma y se disemina de clula a clula. Existen dificultades al no poseer un modelo animal claro, salvo el mono, para estudiar los factores de virulencia. La mayora de las investigaciones han utilizado cultivos celulares (clulas HeLa, macrfagos o fibroblastos de pollo), el test de la queratoconjuntivitis de Sereny realizado en el ojo del cobayo y ensayos en asa ileal aislada de conejo. En estudios realizados en clulas HeLa, la bacteria se adhiere en una primer etapa a las clula del hospedero. Probablemente los receptores sean protenas llamadas integrinas. Esta adherencia provoca reorganizacin de la actina (protena mayor del citoesqueleto de la clula del husped), polimerizacin y formacin de filamentos no solubles en la vecindad de la unin bacteriana. Esto provoca la formacin de seudpodos y de esta forma clulas normalmente no fagocticas de la mucosa ingieren las bacterias adheridas. Esta invasin es mejor descrita como fagocitosis inducida. Jugando el papel activo la clula del hospedero, la bacteria tiene un papel relativamente pasivo luego de la estimulacin inicial. Luego de ingeridas, las bacterias se liberan de su vescula de endocitosis y se multiplican en el citoplasma de las clulas. Posteriormente las bacterias utilizan filamentos de actina en su vecindad y comienzan a moverse a travs de la clula del hospedero. Eventualmente las bacterias pueden diseminarse a clulas adyacentes. Esto se ha llamado ICS (diseminacin intercelular, en ingls: intercellular spread). En este movimiento se polimeralizan filamentos de actina en uno de los extremos de la bacteria, creando colas similares a cometas que propelen las bacterias a travs del citoplasma. Una protena bacteriana alojada en la membrana externa, llamada IcsA se requiere para este movimiento. IcsA se localiza en un extremo de la bacteria y tiene actividad ATPasa. Eventualmente la bacteria puede tomar contacto con la membrana que separa dos clulas, protruir y escapar a la clula vecina. En trabajos realizados en clulas polares, Shigella no se une a los polos apicales de estas clulas diferenciadas. Las integrinas se encuentran solo en la superficie basal de la mucosa. Por lo que otro modelo se ha propuesto para la entrada inicial de Shigella. Esta se hara en tres etapas. En primer lugar, Shigella atraviesa la mucosa a travs de las clulas M de las placas de Peyer, clulas fagocticas naturales cuyo papel principal es tomar antgenos del lumen intestinal por fagocitosis y presentarlos al tejido linfoide subyacente de las placas de Peyer. En una segunda etapa, Shigella usa sus invasinas para invadir las clulas de la mucosa desde abajo, donde estn ubicadas las integrinas, para, en una tercera etapa, diseminarse a clulas adyacentes, causando la muerte de estas clulas e inflamacin. La forma como se produce la muerte de las clulas no esta del todo aclarada. Por un lado, cuando las bacterias estn multiplicndose en forma intracelular disminuyen los niveles de ATP de la clula y aumentan dramticamente los niveles de piruvato, indicando una alteracin del metabolismo energtico. Por otra parte, Shigella puede inducir la muerte celular programada
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en los macrfagos, un fenmeno llamado apoptosis, lo que sugiere otra va de muerte celular y, por supuesto, de inflamacin. El LPS contribuira tambin al dao celular. Shigella dysenteriae fue aislada por primera vez por Shiga en 1896, durante una epidemia de disentera en Japn. Produce una toxina, denominada toxina de Shiga, que est asociada al espacio periplsmico y se libera durante la lisis bacteriana. Esta posee una subunidad denominada A que tiene accin enzimtica y 5 subunidades chicas B, cuya accin es de fijacin a la clula intestinal, endotelial, etc., a travs de receptores glicolpidos Gb3 de la membrana celular. Una vez que ingresa a la clula por endocitosis, A inhibe la sntesis proteica, clivando un residuo adenina de la subunidad 28 S del ribosoma eucariota, e inhibiendo la funcin del factor de elongacin 1. Se ha visto que la toxina no es esencial para la invasin ni para la muerte de la clula intestinal. S se piensa que juega un rol fundamental en la patogenia del SUH. En nuestro pas, S. dysenteriae es una bacteria rara. Los 2 aislamientos que tenemos registrados en los ltimos 30 aos no corresponden al tipo 1. Los casos de SUH que se diagnostican localmente no parecen deberse a este germen, sino a VTEC. S. boydii se asla tambin en forma espordica. Las especies de Shigella prevalentes en nuestra poblacin son S. sonnei, que es lactosa positiva tarda, y forma en agar MacConkey colonias relativamente grandes y rosadas, confundibles con otras enterobacterias, y S. flexneri, que predomina todos los aos. Muchas de las cepas de S. flexneri recuperadas de los nios montevideanos son resistentes a la ampicilina, al cotrimoxazol, o a ambos productos, utilizados tradicionalmente para el tratamiento de estas infecciones. S. sonnei sigue siendo habitualmente sensible. Muchos de los genes que intervienen en la adherencia, invasin de la mucosa y diseminacin se encuentran en un gran plsmido de virulencia. Los genes que intervienen en la invasin son llamados Ipa. Dos de las protenas codificadas por estos genes, IpaB y IpaC se encuentran expuestas en la superficie de la bacteria y pueden encontrarse libres en el lquido extracelular. Otras protenas no estn aun bien estudiadas. IpaB no slo intervendra en la invasin sino que tambin lo hara en la liberacin en el citoplasma por lisis de las vesculas, probablemente por formacin de poros en la pared de las mismas. Algunos loci cromosmicos contribuyen a la invasin pero codifican sobretodo protenas reguladoras. Otros genes involucrados en las etapas posteriores de la patognesis de Shigella se encuentran tambin en el cromosoma (por ej.: toxina Shiga).
SALMONELLA
La mayora de los serotipos de Salmonella habitan el intestino del hombre y los animales. Hay algunos serotipos que se encuentran adaptados a una sola especie animal, como por ejemplo Salmonella typhi, responsable de la fiebre tifoidea, que se encuentra solamente en el hombre. Las caractersticas patognicas son tan variadas como su hbitat natural. Las salmonelosis se pueden dividir segn las presentaciones clnicas en: Formas digestivas, gastroenteritis, el ms frecuente de los cuadros clnicos causados por Salmonella. Estas son las diarreas del nio pequeo y las clsicas toxiinfecciones alimentarias, consecutivas a la ingestin de alimentos contaminados con una cepa de Salmonella. Formas septicmicas, graves, prototipo de las cuales es la fiebre tifoidea. Formas diversas de gravedad variable: meningitis, ostetis, etc.; mucho menos frecuentes. La clasificacin de Salmonella es compleja. Dentro del gnero Salmonella prcticamente una nica especie tiene importancia en patologa humana y animal y una nica subespecie
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llamada Salmonella enterica subespecie enterica, pero se describen aproximadamente 2000 serotipos dentro de esta subespecie, por lo que corrientemente se los llama por el nombre del serotipo, por ejemplo Salmonella typhi, ya mencionada, o Salmonella enteritidis. Salmonella son mviles y, salvo los serotipos bien adaptados a una especie animal, son prototrofos. Las caractersticas bioqumicas se describen en la tabla correspondiente. Desde el punto de vista antignico, poseen antgenos O somticos, antgenos de envoltura y antgenos flagelares H con dos especificidades antignicas expresadas alternativamente, como ya fue descrito. Presentaciones clnicas Gastroenteritis: los sntomas aparecen 6 a 24 horas luego de la ingestin del alimento o agua contaminados, y pueden durar hasta una semana o ms. Nuseas, vmitos, dolor abdominal y diarrea, son los sntomas principales. La severidad vara de una persona a otra, pudiendo llegar a presentar dolores que hagan pensar en apendicitis y diarreas severas, inclusive con sangre. La mayora de los casos ocurren en nios menores de 10 aos y los sntomas pueden ser ms severos en este grupo. La infeccin puede volverse sistmica. La infeccin sistmica es ms frecuente en lactantes o enfermos inmunocomprometidos (cncer, SIDA). En adultos inmunocompetentes, ello ocurre slo con S. typhi, y a veces con S. choleraesuis y otras, pero en los nios puede ocurrir con muchos serotipos. Esto fue estudiado y descrito por la escuela microbiolgica uruguaya, que contribuy histricamente al estudio de las gastroenteritis infantiles y sus agentes etiolgicos (identificacin de Salmonella montevideo, S. cerro, S. berta y otras). Funciona actualmente en el Instituto de Higiene, Departamento de Bacteriologa y Virologa, el Centro Nacional de Salmonelas, que realiza la identificacin bioqumica y antignica de cepas aisladas en el pas o en el exterior, y que contribuye al estudio y control de los ltimos brotes. En general se trata de una enfermedad molesta pero poco peligrosa, aunque durante los grandes brotes se ven algunos enfermos graves y pueden morir algunos pacientes. S. enteritidis y S. typhimurium son los serotipos ms frecuentes aislados en toxiinfecciones alimentarias. Diversos alimentos estn involucrados, los derivados crnicos y huevos son algunos de los ms frecuentes. Las tcnicas modernas en la cra de las aves, el hacinamiento y las dietas hiperproticas llevan a altos niveles de portacin intestinal de Salmonella. En los mataderos es frecuente la contaminacin de las carcasas y de las superficies de los huevos. Se ha demostrado tambin la transmisin transovrica de Salmonella de las gallinas a sus huevos. La idea de que huevos de cscara sana son seguros es por lo tanto falsa. La enfermedad resulta del consumo de alimentos contaminados mal cocidos o de contaminacin cruzada con alimentos crudos en las cocinas. Con escasa frecuencia esto ltimo puede ocurrir a partir de portadores humanos del germen que manipulan alimentos, (el hombre puede excretar Salmonella durante meses despus de la infeccin clnica, o en forma permanente con reservorio habitualmente biliar, xomo puede suceder con S. typhi. Otra forma de propagacin de la enfermedad, no desdeable, dejando de lado las toxiinfecciones alimentarias, es la transmisin interhumana, de persona a persona por medio de las manos contaminadas. S. typhi es el serotipo especfico que causa la fiebre tifoidea. El hombre la adquiere por consumir alimentos o agua contaminados por heces humanas. La contaminacin de los alimentos puede tambin ocurrir durante su preparacin con manipuladores de alimentos portadores de S. typhi y que eliminan gran nmero de bacterias en sus materias fecales. Infectados asintomticos y portadores que han padecido la enfermedad previamente, son los que mantienen la fuente de infeccin. En los pases desarrollados y aquellos que han logrado buenos niveles
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de saneamiento y educacin no es un problema de salud pblica. El perodo de incubacin es de 1 semana a 1 mes. Puede presentar diarrea. Posteriormente el paciente presenta fiebre y anorexia que puede durar hasta 2 o 3 semanas. La enfermedad sin tratamiento antibitico puede llevar al paciente a la muerte. Patogenia Es sorprendente lo limitado del conocimiento en la patogenia de las infecciones causadas por Salmonella. S. typhi atravesara la mucosa por medio de las clulas M, se multiplicara en la submucosa y de all se diseminara. Las bacterias se multiplican en hgado y bazo y pasaran desde all a la circulacin general. Se han visto, en otros serotipos, bacterias dentro de las clulas mucosas absortivas y en macrfagos asociados a la mucosa. No es claro el mecanismo por el que se produce la diarrea. S. typhimurium produce en el ratn un cuadro muy similar al de la fiebre tifoidea en el hombre por lo que se lo ha aceptado como un buen modelo para su estudio. Salmonella, al igual que otros patgenos digestivos, induce a las clulas del husped a englobarlos, pero de modo algo diferente a la fagocitosis inducida ya descrita para otros patgenos. Luego de adherida la bacteria a la superficie celular, se produce un pliegue en la clula, que la rodea y la introduce en una vescula de endocitosis. Hay intensa polimerizacin de actina en la vecindad y luego de introducida, sta desaparece. La bacteria no escapa de la vescula ni entra en el citoplasma, se multiplica en este fagosoma para ser posteriormente liberadas. Por otra parte, estas bacterias pueden sobrevivir a la fagocitosis, resisten la muerte por el complemento. Al menos 200 genes se encuentran involucrados. S. typhimurium posee un plsmido de virulencia cuya presencia otorga a la bacteria la capacidad de causar enfermedad sistmica en el ratn. En S. typhi todos los genes son cromosmicos. Los genes de virulencia de Salmonella estn regulados por un gran nmero de factores ambientales, tales como falta de nutrientes, anaerobiosis, pH, etc. El LPS tiene un papel importante en la respuesta inflamatoria durante la invasin de la mucosa y es responsable de los sntomas de la infeccin sistmica.
KLESBIELLA
La principal especie de este gnero es Klebsiella pneumoniae, muy expandida en la naturaleza. Se la asla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero tambin de aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmviles, a menudo capsulados. La cpsula es de naturaleza polisacrida. Las propiedades bioqumicas se describen en la tabla correspondiente. Desde el punto de vista antignico, es til en epidemiologa la determinacin de los antgenos capsulares. Existen ms de 70 tipos capsulares diferentes. Pueden existir reacciones cruzadas con antgenos capsulares de otras especies bacterianas. El poseer cpsula otorga a estas bacterias un aspecto colonial mucoide. Se trata de patgenos oportunistas, pueden provocar diversos cuadros clnicos en el hombre: infecciones urinarias, bacteriemias, neumonas, infecciones hepatobiliares, etc. Un porcentaje elevado de aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales, contienen plsmidos de resistencia a los antibiticos. Puede ser resistencia a betalactmicos, aminoglucsidos, etc.
ENTEROBACTER - SERRATIA
Estos dos gneros comprenden diversas especies presentes en general en el tubo digestivo
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Tabla 1. Propiedades bioqumicas de Enterobacteriaceae

Salmonella Citrobacter Shigella E. coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter Erwinia Serratia Proteus vulgaris Proteus mirabilis Morganella Providencia Edwarsiella Yersinia enterocoltica
Movilidad Gas en glucosa Lactosa Test ONPG SH2 Ureasa Ph.alanina deaminasa PDA Indol LDC Citrato de Simmons Manitol Adonitol Sacarosa Salicina Dulcitol RM VP Malonato ADH ODC
+ + + + + + + + -
+ + +oX + + -(+) + + d d d + -
d d d d + d
+o+ +oX + + d + d d d + d d
+ + + + + + + + + + d + + -
+ + +oX + d + + d + + + d d +
+ d d + + + d d d + d -
+ d -oX + + + + d + + +
+ + + + + + + +
+ + + + + + +
+ d + + + d d d + -
+ + + + + + +
-a 37C -(+) d + d + d X + +a 28C d
+ + + - d d + + + X d + d +
-(+) d -
-(+) + -
+: positivo,-: negativo,X: irregularmente positivo,(+): positivo tardo,d: diferentes reacciones,ONPG: orotonitrofenil-B-D-galactopyrtansido, PH-alanina DA: fenilalanina deaminasa, LDC: lisina decarboxilasa, ODC: orinitina decarboxilasa, ADH: arginina dihidrolasa, RM: rojo de metilo, VP: Voges-Proskauer
del hombre y los animales, en el suelo, vegetales y en aguas. Las caractersticas bioqumicas se describen en la tabla correspondiente. Son patgenos oportunistas. Al igual que Klebsiella los aislamientos hospitalarios generalmente presentan resistencias a mltiples antibiticos.
PROTEUS-MORGANELLA-PROVIDENCIA
Estos tres gneros forman un grupo caracterizado por poseer la capacidad de desaminar oxidativamente los aminocidos formando cidos cetnicos. Habitan el tubo digestivo del hombre y los animales, encontrndose tambin en el suelo, vegetales y aguas. Las especies ms frecuentemente aisladas en cada genero son Proteus mirabilis, Morganella morgagnii y Providencia rettgeri.
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Son bacilos Gram negativos muy polimorfos, mviles. Proteus spp. poseen una movilidad extrema que les permite invadir los medios slidos bajo forma de hauch. Las propiedades bioqumicas se describen en la tabla correspondiente. Desde el punto de vista patognico, son agentes de infecciones del tracto urinario, pudiendo causar infecciones sistmicas en huspedes inmunocomprometidos. P . mirabilis ha sido ms estudiado, encontrndose factores de virulencia para el aparato urinario, tales como adhesinas y una hemolisina; se ha sostenido por aos el papel de la ureasa producida por Proteus y Morganella en la patogenia de pielonefritis.
YERSINIA
Este gnero comprende varias especies, entre ellas Y. pestis, agente de la peste o plaga bubnica o neumnica, comnmente llamada la muerte negra, enfermedad de los roedores, trasmitida ocasionalmente al hombre por las pulgas, con pandemias histricas desde el siglo VI, donde mat a un tercio de la poblacin en Europa. Luego de la edad media han habido brotes en diversas partes del mundo, sobre todo en relacin con las guerras. Se han denunciado casos en 1995 y comienzos de 1996 en India, Madagascar y otros pases africanos, en Brasil y Per. Y. pestis es endmica en algunas regiones tales como Irn y el oeste de Estados Unidos. Otra especie, Y. enterocoltica es muy ubiquitaria. Algunos biotipos estn relacionados con enterocolitis en el hombre. Raramente presenta infecciones sistmicas, sin embargo, las bacterias atraviesan con frecuencia la mucosa y se multiplican en los ndulos linfticos mesentricos. Debido a los intensos dolores abdominales el cuadro puede confundirse con apendicitis. Ocasionalmente puede haber una artritis reactiva 2 a 6 semanas luego de la infeccin. Esto se ve frecuentemente en pacientes con antgeno HLA-B27 de histocompatibilidad. Y. enterocoltica posee la caracterstica de crecer mejor in vitro a 28 C que a 37 C, y de desarrollar tambin a 4 C, siendo esta ltima la causa de la existencia de brotes de infeccin intestinal a partir de agua o alimentos conservados (leche, pescado, carnes, especialmente porcina), o de infeccin parenteral con origen en derivados sanguneos refrigerados. Son relativamente frecuentes como agentes de gastroenteritis en pases fros (Canad, Suecia, Blgica). En el nuestro son escasos los aislamientos clnicamente significativos. Y. enterocoltica posee un plsmido de virulencia de 40-45 mda. que le confiere expresin de ciertas protenas de superficie, invasividad, resistencia al suero humano normal, y otras propiedades. Tambin Y. pestis posee al menos un gran plsmido de virulencia.
Vibrionaceae
La familia Vibrionaceae agrupa diferentes gneros de bacilos Gram negativos con un hbitat primario acutico. Se los encuentra en el mar en aguas frescas y en relacin con animales acuticos. Diversas especies son patgenas para el hombre, peces, as como otros vertebrados e invertebrados. Aunque la familia fue definida inicialmente en un intento de agrupar especies oxidasa positivas y mviles por flagelos polares, para diferenciarlas de los integrantes de la familia Enterobacteriaceae, se vio que todos estos microorganismos comparten atributos distintivos que sugieren un origen evolutivo comn. Son bacilos Gram negativos, rectos o curvos. Mviles por flagelos polares. No forman esporos. Quimioorganotrofos, desarrollan en medios simples, son anaerobios facultativos, capaces de tener un metabolismo fermentativo o respiratorio. La mayora oxidasa positivos. La
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Tabla 2. Propiedades bioqumicas de Vibrionaceae

Vibrio Aeromonas Manitol + + O129 S R Tween 80 estearasa + + LDC + ODC (+) ADH (+) Inositol +: positivo, -: negativo, (+): positivo tardo, S: sensible, R: resistente. Plesiomonas R + + + (+)
Tabla 3. Propiedades bioqumicas de V. cholerae

Oxidasa LDC ODC ADH Manitol Inositol Sacarosa VP Gelatinasa NaCl gr% + + + + + d + 0-5
LDC: lisina decarboxilasa, ODC: ornitina decarboxilasa, ADH: arginina dehidrolasa, VP: Voges-Proskauer.
mayora de las especies requiere 2-3% de ClNa o agua marina para desarrollar. El porcentaje G + C del ADN va de 38 a 63%. Los gneros que forman esta familia son: Vibrio, Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas, teniendo importancia mdica especies de los gneros Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. Las propiedades bioqumicas se describen en la tabla correspondiente. Por muchos aos la nica especie que interes a los microbilogos fue V. cholerae, agente del clera epidmico. Otras especies tales como V. parahemolyticus pueden causar toxiinfecciones alimentarias en el hombre luego de la ingestin de productos del mar; siendo la primera causa de diarrea en el Japn, donde se consume pescado crudo. Otras especies de Vibrio y Plesiomonas shigelloides tambin estn relacionadas con gastroenteritis. Por otra parte, Aeromonas hydrophila es responsable de infecciones de heridas que han sido expuestas a aguas poluidas, y ocasionalmente, puede provocar infecciones sistmicas en enfermos inmunodeprimidos.
VIBRIO CHOLERAE
Es el agente del clera, una enfermedad epidmica grave que ha matado millones de personas y contina siendo un importante problema de salud en todo el mundo. Conocida desde la antigedad, permanece endmica en las regiones del delta del Ganges y en el Sudeste Asitico. A partir del comienzo del siglo XIX la enfermedad se ha expandido en todo el mundo en ondas sucesivas, junto a grandes movimientos poblacionales. La historia moderna del clera comienza en 1817 con la primera de las 7 pandemias. El continente americano estuvo libre de clera desde el comienzo del siglo XX, la ltima epidemia en Uruguay fue en 1895. Luego de cada introduccin todas duraban unos aos y parecan haber desaparecido. En 1950 slo haba clera en Asia.
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En 1961 V. cholerae O:1 biotipo el Tor se disemin fuera de Indonesia, primero a otros pases asiticos y Medio Oriente luego en la dcada de 1970 a Africa, Sureste europeo e islas del Pacfico. En enero de 1991 se notificaron los primeros casos de clera en Per. En unas semanas se disemin rpidamente en el pas. La enfermedad afect todas las edades con una muy alta incidencia y al principio alta mortalidad. Esta ltima fue disminuyendo a medida que se implement la asistencia mdica. Entre 1991 y 1992 el nmero acumulativo de casos en Per, represent el 2,5% de la poblacin. Dada la alta incidencia de la epidemia y asumiendo que adems muchas de las infecciones fueron asintomticas, luego de 2 aos, la mayora de la poblacin haba estado infectada. Hacia 1993 todos los pases de Amrica Central y Amrica del Sur, salvo Uruguay, haban reportado casos. Y todos los afectados en 1991 continuaron reportando en los siguientes aos. El comportamiento es de oscilacin estacionaria, apareciendo el mayor nmero de casos en los meses clidos. Luego de la diseminacin epidmica inicial, es posible que el clera persista en algunas reas por aos en un estado de endemia. Es indiscutible que la mejor forma de controlar el clera en las poblaciones es el poseer agua potable y un adecuado saneamiento, que, junto a la educacin, son los pilares fundamentales del control de estas epidemias y adems contribuyen al desarrollo de estas poblaciones. De todas formas, desde 1880 se ha tratado de desarrollar vacunas; los intentos ms recientes se dirigen a la utilizacin de vacunas orales, atenuadas, buscando una respuesta IgA secretoria. V. cholerae es un bacilo Gram negativo, curvo, con forma de coma. Desarrolla bien en medios simples. Aunque su desarrollo est estimulado por la presencia de sodio, esta especie, a diferencia de las otras especies del gnero, desarrolla en medios sin el agregado de ClNa. V. cholerae tolera condiciones de alcalinidad y es capaz de desarrollar a pH 10. Estas propiedades se utilizan para aislar el germen de las muestras clnicas, de alimentos o del agua. Las cepas epidmicas de V. cholerae se dividen en dos biotipos: clsico y el Tor. Estructura antignica Se puede dividir en base a sus antgenos somticos. Se describen al menos 139 serogrupos diferentes. Todos comparten un mismo antgeno flagelar. Las cepas pertenecientes al serogrupo O:1 hasta 1992 fueron las nicas asociadas con clera epidmico. Desde 1992 un nuevo serogrupo O:139 ha sido relacionado con clera epidmico en India y Bangladesh. Los biotipos son aplicables solamente a V. cholerae O:1. Las cepas pertenecientes a los otros serogrupos se asocian a casos de diarrea ocasional o enfermedades extraintestinales. Las cepas del serogrupo O:1 se dividen clsicamente en 3 serotipos: Ogawa, Inaba e Hirojima. Las cepas aisladas pueden sufrir conversiones de Inaba a Ogawa, por lo que los serotipos son de escaso inters epidemiolgico. Patogenia V. cholerae causa enfermedad en el hombre porque es capaz de colonizar el intestino delgado luego de ingerido. Se adhiere a la superficie mucosa y produce una enterotoxina, la toxina colrica que acta en las clulas mucosas intestinales. Esta accin est dirigida a alterar el balance hidroelectroltico de estas clulas, disminuyendo la entrada de sodio y aumentando la salida de cloro y agua hacia la luz intestinal, resultando en diarrea importante y disbalance electroltico, que puede llevar al paciente a la muerte por shock hipovolmico. Con un buen soporte de lquido y electrolitos el paciente sobrevive, siendo una enfermedad autolimitada. Factores de virulencia Hasta hace cinco aos se crea entender muy bien los mecanismos patognicos de V. cholerae.
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Estos se explicaban por tres factores: flagelo, que permita a la bacteria nadar hasta la mucosa intestinal; pili, que mediaba la adherencia a las clulas de la mucosa; y la toxina colrica, que produca diarrea severa. Investigaciones recientes demuestran una mayor complejidad en este modelo. Primero, la regulacin de los factores de virulencia ha demostrado ser mucho ms compleja de lo esperado, con muchos cambios adaptativos al husped humano. Segundo, muchas cepas producen otras toxinas adems de toxina colrica, aunque esta es indiscutiblemente la causa ms importante de los sntomas en el clera. Tercero, las clulas del husped no son slo blancos pasivos de la accin de la toxina.
Colonizacin de la mucosa del intestino delgado.
Adems de las evidencias descritas de que la motilidad flagelar puede ayudar a V. cholerae a alcanzar la mucosa intestinal, la mayora de las investigaciones han sido dirigidas a ver lo que sucede cuando V. cholerae alcanza la mucosa. Una contribucin importante a la colonizacin es la presencia de largos filamentos formando un agrupamiento en la superficie de la bacteria. Cepas que carecen de estos pili son avirulentas. Se los ha llamado Tcp pili (pili coregulado con la toxina). Tres genes estn involucrados en la regulacin de la expresin de los genes de la pilina, y al menos cuatro lo estn en la secrecin y ensamblaje. Son un conjunto de 15 genes que tienewn origen fgico y forman una isla de patogenicidad. A diferencia de lo que sucede en otras bacterias estos pili estn localizados solamente en una porcin de la superficie celular. Por otra parte, V. cholerae produce una hemaglutinina que podra contribuir a la adherencia, adems de otra posible adhesina codificada por unos genes llamados factores de colonizacin accesorios (acf). V. cholerae secreta una proteasa originalmente llamada mucinasa que no parece tener un papel importante en la virulencia.
Toxina colrica
No hay dudas sobre la relevancia de esta toxina como factor de virulencia. Es una toxina que acta por ADPribosilacin tipo A-B. Posee una subunidad A (enzimtica), y 5 subunidades B idnticas (unin). Tienen un peso molecular de 27 y 11,7 kDa respectivamente. La subunidad A debe ser clivada para ser enzimticamente activa en A1 y A2. Los genes que codifican la subunidad A (ctxA) y la subunidad B (ctxB) son parte del mismo opern y se encuentran en el cromosoma, en un segmento mvil que tiene origen fgico. Los pili Tcp, constituyen los receptores del fago codificante de la toxina. El gen ctxB es ms activamente transducido, producindose en exceso. Las subunidades A y B transducidas son secretadas al espacio periplsmico donde son ensambladas. Una protena (TcpG) que acta en la formacin del pili, intervendra tambin en la liberacin de la toxina. La toxina excretada en la proximidad de las clulas de la mucosa intestinal, se adhiere a la clula del hospedero por unin a los ganglisidos Gm1 celulares, que son oligosacridos que contienen cido silico unido covalentemente a una ceramida. El oligosacrido es reconocido por la subunidad B. Luego la toxina cambiara su configuracin y, presumiblemente por reduccin de un puente disulfuro, el fragmento A1 es liberado de la toxina y entra a la clula del hospedero por un mecanismo aun no aclarado. El fragmento A1 ADPribosila una protena de membrana llamada Gs. Gs son protenas de la familia GTP hidrolizantes que regulan muchos aspectos de la funcin de las clulas eucariotas. Las protenas G estn compuestas de tres subunidades (G, G, G). La asociacin y disociacin de estas subunidades, junto a la hidrlisis de GTP , activa o desactiva la protena G. Gs es la protena G que regula la actividad de la adenilciclasa de la clula del hospedero de una forma hormonodependiente y esto determina los niveles de AMP cclico (cAMP)
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de las clula. La forma activa de Gs (unida a GTP) aumenta la actividad de la adenilciclasa, mientras que la inactiva vuelve la adenilciclasa inactiva. Normalmente la forma activa se produce en respuesta a una estimulacin hormonal y luego de un tiempo se convierte a la forma inactiva. La ADPribosilacin de Gs cortocicuita este control natural, dejando a Gs activada y los niveles de cAMP descontroladamente elevados. La variedad de efectos que se producen incluye la alteracin de las actividades de los transportadores de sodio y cloro. Esto lleva a un disbalance inico que causa la prdida de agua asociada al clera. En clulas polarizadas como las de la mucosa intestinal, la adenilciclasa se localiza en la membrana basolateral, por lo que la toxina unida a la superficie apical debe actuar al otro lado de la clula. Diversos modelos buscan explicar este mecanismo, aunque queda claro que la accin de la toxina es un proceso complicado que involucra A1, Gs, adenilciclasa y otras protenas del hospedero. Cualquiera sea los pasos que se produzcan en esta interaccin, la clula del hospedero es un participante activo en la accin de la toxina.
OTRAS
TOXINAS
A pesar que la toxina colrica es indiscutiblemente la toxina ms importante en la patogenia de V. cholerae, este germen produce otras toxinas. En ensayos para producir vacunas se vio que cepas desprovistas de A1 eran capaces de seguir produciendo la enfermedad en voluntarios, administradas en forma oral. Recientemente se han clonado los genes que codifican para la produccin de dos enterotoxinas: toxina Zot y toxina Ace. El descubrimiento de estas nuevas toxinas abre grandes expectativas sobre factores de virulencia aun no determinados.
Bacilos Gram negativos no fermentadores

Este gran grupo de bacilos Gram negativos incluye grmenes pertenecientes a diferentes familias y otros gneros de incierta clasificacin. Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, son algunos de ellos, en general desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, no producen enfermedad en el individuo sano, pero pueden comportarse como oportunistas en enfermos inmunodeprimidos.
PSEUDOMONAS
De las numerosas especies de Pseudomonas descritas slo unas pocas tienen importancia en patologa humana. Pseudomonas mallei y P . pseudomallei causan enfermedad severa en el hombre, pero se aslan raramente en el hemisferio occidental. Por otra parte P . cepacia es un oportunista poco frecuentemente asociado con enfermedad en el hombre. Nos referiremos en particular a la especie Pseudomonas aeruginosa por su frecuencia en patologa humana y por estar mejor estudiada que otros. Es un microorganismo verstil, ampliamente distribuido en el suelo, agua, plantas e intestino de animales. Puede causar enfermedad en el hombre, ciertos animales, plantas e insectos. El agua contaminada puede ser una fuente de infeccin para el hombre. Es susceptible a la desecacin, pero sus habilidades metablicas le permiten sobrevivir y multiplicarse en lquidos y ambientes hmedos de los hospitales. Sus requerimientos nutricionales son variados, se ha aislado P . aeruginosa de aguas termales, e incluso de soluciones desinfectantes en el hospital. La mayora de las infecciones humanas estn restringidas a los pacientes hospitalizados, que adquieren el microorganismo de fuentes ambientales (infeccin exgena) por contacto con vectores humanos o inanimados.
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P . aeruginosa desarrolla bien en medios simples, utilizndose para su aislamiento los medios de cultivo de uso corriente en el laboratorio clnico. La identificacin de cepas de P . aeruginosa tpicamente productoras de pigmento no es difcil, pero las cepas no pigmentadas pueden presentar un problema. La mayora se identifican por la produccin de un pigmento, pyocyanina, soluble en agua, azul, no fluorescente. P . aeruginosa produce adems otro pigmento, pyoverdina, soluble en agua, verde-amarillento, fluorescente; otras especies del gnero Pseudomonas tambin producen pyoverdina. Otros pigmentos, menos frecuentes pueden ser producidos por P . aeruginosa. La morfologa colonial y el olor frutado de aminoacetofenona son elementos de una identificacin sencilla, y aunque existen caracteres de identificacin confirmatorios, son de uso poco corriente. Son bacilos Gram negativos, rectos o ligeramente curvos, mviles, con un solo flagelo polar. Oxidasa y catalasa positivos, aerobios estrictos, no fermentan glucosa, utilizan diversos azcares oxidativamente con produccin de cido. Uno de los caracteres ms constantes es su capacidad de desarrollar a 42 C. Producen varias enzimas, proteasas, lipasas, lecitinasas. Patogenia Las defensas inespecficas del husped son en general suficientes para prevenir la infeccin por P . aeruginosa, pero brechas en esta barrera permiten a P . aeruginosa invadir y causar infecciones de diversa gravedad. Producen el 10% de las infecciones nosocomiales, infectan heridas y quemaduras y causan infecciones pulmonares, sobre todo, neumona nosocomial e infecciones respiratorias en pacientes con fibrosis qustica. La fibrosis qustica es una enfermedad gentica asociada a un defecto en la secrecin de cloro, caracterizada por la produccin de mucina con una alteracin de su composicin inica, inusualmente espesa. Esto lleva a una menor eficiencia de la mucina para limpiar las bacterias del pulmn y las vas areas y puede impedir el movimiento de las clulas fagocticas. Estos hechos explican la susceptibilidad de los pacientes con fibrosis qustica a la colonizacin con P . aeruginosa. Si los enfermos son tratados los sntomas pueden desaparecer pero las bacterias permanecen, presentando infecciones recurrentes. Las condiciones del paciente se ven agravadas con la infeccin a P . aeruginosa por las dificultades teraputicas que se plantean debido a su alta resistencia a los antimicrobianos. Factores de virulencia P. aeruginosa posee los mismos tipos de factores de virulencia que otras bacterias capaces de causar enfermedad en el hombre inmunocompetente. Pero algo interesante es por qu P . aeruginosa no es un patgeno franco y slo es capaz de producir infecciones oportunistas? Es probable que P . aeruginosa sea ineficiente en su habilidad para llevar a cabo los primeros pasos de la infeccin; puede colonizar pero no invadir piel y mucosas sanas y tampoco dar infecciones persistentes con produccin concomitante de factores txicos que daen los tejidos del husped.
Adhesinas
Produce al menos dos tipos de adhesinas proteicas, pili y adhesinas no pili. Los pili son pili tipo 4, similares a los de N. gonorrhoeae y se parecen tambin a los pili Tcp de V. cholerae. Permiten a la bacteria adherirse a las clulas epiteliales, preferentemente a receptores asialo-GM1. P . aeruginosa produce una neuraminidasa que saca los residuos de cido silico de GM1, creando sitios de unin para la pilina. Por otra parte, P . aeruginosa es capaz de unirse a la mucina
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y lo hace por medio de las adhesinas no pili. Adems del gen que codifica para la protena estructural del pili otros genes codifican protenas ensambladoras y reguladoras.
Exoenzima S
Es una enzima excretada que puede actuar como exotoxina. Tiene actividad de ADPribosilacin como otras toxinas, pero aplicada en forma exgena no daa las clulas del husped. Luego de internalizada intervienen protenas de las clulas del husped en la activacin de la toxina para lograr su mxima actividad. Se sostiene que actuara dificultando la accin de los fagocitos lo que facilitara la sobrevida de P . aeruginosa en el torrente sanguneo y rganos. En el pulmn actuara inhibiendo la muerte intrafagoctica de las bacterias y promoviendo la infiltracin fagoctica en el rea. Tambin puede presentar efecto txico directo en los pulmones.
Exotoxina A
Esta exotoxina tiene el mismo mecanismo que la toxina diftrica. Es una toxina A-B con tres unidades funcionales: dominio R (regin de unin al receptor celular); dominio T (regin que media la translocacin de la porcin enzimtica al interior de la clula); dominio C (regin cataltica). Los dominios R y T se localizan en la cadena B y el dominio C en la cadena A. La cadena A es enzimticamente activa por ADPribosilacin del factor de elongacin 2 (EF-2) de la sntesis proteica, que lo vuelve inactivo. Su receptor es una glicoprotena de las clulas del hospedero. La mayora de los aislamientos clnicos la producen, y actuara produciendo dao en los tejidos y disminuyendo la actividad de los fagocitos.
Elastasas
Elastina es el 30% de las protenas del tejido pulmonar. Adems est presente en la pared de los vasos sanguneos. Es responsable de las propiedades elsticas de estos rganos que se expanden y contraen. P . aeruginosa tiene actividad elastoltica, produce dos enzimas que actuaran concertadamente: LasA y LasB. LasA actuara clivando la elastina y permitiendo la accin de LasB, que es una zinc metaloproteasa, uno de cuyos substratos es la elastina. Estas enzimas actuaran en las etapas tempranas de la enfermedad, por dao directo de los tejidos, pero no en infecciones crnicas, debido a la presencia de anticuerpos antielastasas. Tambin pueden intervenir degradando componentes del complemento e inhibidores de 1 proteinasa (inhibe el dao de los tejidos por las proteasas de los polimorfonucleares). En las infecciones crnicas, altos niveles de anticuerpos producidos pueden llevar a la formacin de complejos inmunes y su depsito en el pulmn activar complemento y atraer polimorfonucleares (PMNs). Los PMNs producen su propia elastasa, ms potente que LasA-LasB. Pequeas cantidades de LasA pueden facilitar la degradacin de la elastina pulmonar causada por la elastasa de los PMNs.
Otras enzimas extracelulares
Produce varias enzimas adems de las mencionadas. Una lipasa alcalina y dos fosfolipasas, no bien estudiadas. Por otra parte, pyocianina puede funcionar como factor de virulencia. Puede daar el tejido endotelial in vitro, lo que sugiere una accin in vivo. Un atributo de virulencia muy importante es la produccin de alginato. Es un polmero de cido mannurnico
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y gulurnico que forma un gel viscoso alrededor de la bacteria. Las colonias que lo producen tienen aspecto mucoide. Para las bacterias marinas esto es un atributo importante para su supervivencia. P . aeruginosa ha adaptado esto a su supervivencia en el pulmn. En medios de cultivo ricos pierde esta propiedad. Esta capa que rodea a la bacteria y a las colonias de bacterias en el pulmn puede actuar como adhesina y probablemente, previene la ingestin fagoctica de la bacteria. Los genes que intervienen en su codificacin estn agrupados en un sector del cromosoma y organizados en un opern, poseen un sistema de regulacin extremadamente complejo. El LPS tambin vara durante la transicin mucoide-no mucoide. En cepas no mucoides el antgeno O del LPS tiene cadenas largas y carga negativa mientras que las cepas mucoides tienen cadenas ms cortas y una composicin de azcares que lo hacen mucho ms neutro; esto sera importante en la alta resistencia a algunos antibiticos que presenta P . aeruginosa, situacin problemtica en pacientes internados, pero dramtica en los pacientes con fibrosis qustica, que muchas veces presentan infecciones por P . aeruginosa resistente a todos los antibiticos disponibles.
Prctico de bacilos Gram negativos

B. Amorn
CASO 1: paciente de 30 aos, sexo femenino, que comienza hace cuatro das con fiebre, disuria, polaquiuria y tenesmo. El da de la consulta agrega dolor en fosa lumbar izquierda. Al examen fsico se presenta dolorida, febril (39 C axilar). Abdomen: dolor en puntos ureterales superior y medio. Tacto vaginal: punto ureteral inferior positivo. Diagnstico clnico: infeccin urinaria. Prctico: se observarn placas de agar sangre y agar Mac Conkey, sembradas con la orina de la paciente, en las cuales se podrn apreciar colonias bacterianas. Se realizar, a partir de ellas, siembra con punta en medios de TSI (Triple azcar hierro), citrato, urea y SIM (Movilidad-Indol-Sulfdrico), (ver descripcin de medios y procedimiento al final del captulo). Se mostrarn tiras reactivas comerciales, mtodo que determina distintos parmetros urinarios, entre ellos esterasas leucocitarias. Discusin: se hablar de posibles etiologas, factores determinantes de las infecciones urinarias (grmenes, mecanismos de agresin y vas de llegada), factores predisponentes (anatmicos, higinicos y malformaciones). Se discutir cmo se realiza la toma de muestra, el transporte, el procedimiento a emplear para sembrar un urocultivo. CASO 2: paciente de 30 aos, sexo femenino, con antecedentes personales de ser portadora de litiasis renal, que se encuentra internada desde hace varias horas con el diagnstico de infeccin urinaria. A las 48 h del ingreso presenta picos febriles de 39 C, chuchos de fro y mal estado general. Al examen fsico: depresin de conciencia, fascies txica, piel plida y sudorosa. FC: 120 cpm, oliguria. Examen abdominal: hepatomegalia. Con el diagnstico de sepsis a punto de partida urinario se comienza inmediatamente con el tratamiento.
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Prctico: se observarn placas de agar sangre sembradas a partir del hemocultivo en caldo de la paciente. Las colonias se sembrarn en medios de TSI, citrato, urea y SIM. Discusin: se discutir el significado de la sepsis, como se expresa clnicamente, el punto de partida de la infeccin, diseminacin y multiplicacin del germen, mediadores y efectos fisiopatolgicos de la sepsis, y se mencionarn que antibiticos se pueden utilizar en estos casos. CASO 3: paciente de 52 aos, con antecedentes personales de ser un alcoholista crnico, es trado al hospital. Al examen fsico se encuentra somnoliento, en mal estado general. Febril (38,5 C axilar) y taquicrdico. Frecuencia respiratoria 36 rpm. Pleuropulmonar: el hemitrax derecho se moviliza menos con la respiracin. A la percusin dolor y matidez en dos tercios superiores de dicho hemitrax. A la auscultacin: murmullo alvelovesicular abolido en esa topografa y soplo tubario. La radiografa de trax muestra una imagen homognea que ocupa los dos tercios de la superficie del hemitrax derecho, con borramiento del fondo de saco pleural. Diagnstico: neumona aguda con derrame pleural. El cultivo del esputo y los hemocultivos fueron positivos para un bacilo Gram negativo. Prctico: observaremos placas de agar sangre y medio Mac Conkey. Las colonias sospechosas se sembrarn en TSI, citrato, FA y SIM. Se observarn frotis teidos con tinta china para observacin de la cpsula. Discusin: discutiremos los agentes etiolgicos, factores predisponentes y los mecanismos defensivos a nivel del aparato respiratorio. CASO 4: paciente de 4 aos que recibe quimioterapia por leucemia linfoctica aguda (en remisin). Ingresa por fiebre de 41 C rectal y fatiga. Al examen fsico: plido, polipneico y taquicrdico. Frialdad perifrica y sudoracin. En el cuello presenta una va venosa central, sin signos inflamatorios. Pleuropulmonar: sin particularidades. El resto del examen fsico fue normal. Luego de las tomas para hemocultivo se inici antibioticoterapia por va i/v. En las horas siguientes su estado se agrava, requiriendo intubacin orotraqueal, asistencia respiratoria mecnica y reposicin de fluidos. Diagnstico: shock sptico. Los hemocultivos fueron positivos para Pseudomonas aeruginosa. Prctico: se observarn en placas de agar sangre, TSA y Mac Conkey, las colonias sospechosas, y se sembrarn con punta en TSI y el medio OF (xido-reduccin). Tambin realizaremos la prueba de oxidasa. Discusin: enfatizaremos en los factores predisponentes que explican en este nio la infeccin por Pseudomonas aeruginosa; qu otros cuadros clnicos puede ocasionar, sus mecanismos patognicos y la teraputica antibitica que se emplea en estos casos. CASO 5: paciente de 20 aos, sexo masculino, internado en el CTI por sufrir politraumatismos al chocar con su moto. Por presentar traumatismo de trax con neumotrax e
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insuficiencia respiratoria, requiri un tubo de drenaje bajo agua, intubacin orotraqueal y conexin a un ventilador mecnico. A los 4 das de internacin se presenta febril con 40 C, fascies txica, palidez cutaneomucosa. Taquicardia. Presin arterial de 70/50. Abdomen: hepatoesplenomegalia. Diagnstico: shock sptico. Se realizaron tres hemocultivos que fueron negativos. Se realiza fibrobroncoaspiracin de secreciones respiratorias, donde se asla bacilo Gram negativo. Prctico: se proceder a la observacin del crecimiento en placas de agar sangre y de TSA. Las colonias sospechosas se sembrarn con punta en TSI. Realizaremos la prueba de oxidasa y mostraremos otro mtodo de diagnstico comercial que es fcil de realizar y rpido.
MEDIOS Y PRUEBAS BIOQUMICAS
Para el cultivo de los bacilos Gram negativos se utilizarn diferentes tipos de medios: Medios simples: son aquellos que contienen pocas sustancias nutritivas. Ejemplo: agar nutriente. Medios ricos: son aquellos a los cuales se aaden ingredientes nutritivos, habitualmente de composicin qumica no bien definida, como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, lquidos orgnicos; que permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos de la ms amplia exigencia nutricional. Ejemplo: agar sangre. Medios diferenciales: son aquellos a los que se agrega un indicador de pH de distinta ndole y que contienen un azcar degradable por la bacteria, el cual cambiar de color (viraje del indicador) cuando un grupo de organismos determinado se desarrolla en l utilizando ese carbohidrato. Ejemplo: agar-lactosa-rojo-fenol. Medios selectivos y diferenciales: son medios a los que se agrega por ej. lactosa, rojo neutro y otras sustancias tales como cristal violeta, que permite el crecimiento de bacilos Gram negativos e inhibe el desarrollo de los Gram positivos. Ejemplo: agar Mac Conkey. Medios de identificacin Se incluyen bajo este nombre todos aquellos medios que ponen en evidencia distintas propiedades fisiolgicas de las bacterias, por ejemplo: reacciones bioqumicas o enzimticas, movilidad, produccin de pigmento, etc.
Prueba de la oxidasa
Pone en evidencia la enzima indofenol-oxidasa, mediante la oxidacin de un colorante previamente reducido, que cambia de color en su presencia. Permite diferenciar entre bacilos Gram negativos no fermentadores, como Pseudomonas, que son oxidasa positivos, de aquellos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Se toma una porcin de una colonia pura de 24 horas, con una pipeta pasteur, se deposita sobre una tira de papel impregnada en el reactivo de oxidasa. LECTURA: Reaccin positiva: aparicin de un color rojo violceo entre los 10 y 60 segundos.
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Metabolismo energtico (oxidativo-fermentativo)
El medio utilizado se denomina OF, que es semislido y tiene azul de bromotimol como indicador de pH, y una baja concentracin de glucosa. Se siembra en dos tubos en profundidad con una punta, un tubo sin vaselina y el otro con vaselina. Se incuba a 37 C por 24 h. Ver tabla 4
Tabla 4.
Tipo de metabolismo oxid./ferm. oxidativo inactivo Tubo abierto amarillo en todo el tubo amarillo en superficie no viraje Tubo cerrado amarillo en todo el tubo no viraje no viraje
Metabolismo de los carbohidratos
Se explora por la adicin al medio (que puede ser slido, semislido o lquido), de el o los carbohidratos deseados ms un indicador de pH. Ejemplo: TSI. Este medio sirve de gua como primera aproximacin al estudio de bacilos Gram negativos. Es un medio slido con una concentracin de lactosa y sacarosa al 1% y de glucosa al 0,1%, peptonas, sulfato ferroso y rojo fenol como indicador de pH (pH cido = amarillo, pH alcalino = rojo, pH neutro = rojo plido). Se reparte en tubos dejando una superficie inclinada (slant), y un fondo (butt) de 3 a 4 cm de profundidad. Se siembra por puntura y en superficie. Se incuba a 37 C por 18-24 horas. LECTURA: se lee el cambio de pH (viraje del indicador) desde la superficie al fondo, la produccin de gas (burbujas) y de gas sulfhdrico; registrndolo del modo siguiente: por ej. A/A gas (+) H2S (-). Si el nico carbohidrato utilizado es la glucosa, se observar la superficie roja y el fondo amarillo (K/A). La superficie alcalina indica que luego de la degradacin aerbica de la glucosa, debido su baja concentracin en el medio, el organismo comienza a utilizar las peptonas como nutrientes, cuyos productos finales son alcalinos. En el fondo, la degradacin de la glucosa produce metabolitos cidos que viran el indicador al amarillo y no pueden ser transferidos al ambiente. Si adems de usar la glucosa, la bacteria utiliza la lactosa o la sacarosa, se produce una reaccin cida tanto en la superficie como en el fondo del tubo. Si ninguno de los azcares es metabolizado, se observa un viraje al rojo por la utilizacin de las peptonas del medio. Si hay produccin de gas sulfhdrico el medio se observa de color negro.
Metabolito proteico
Puede ser explorado estudiando los procesos de desaminacin y decarboxilacin de varios aminocidos, como por ejemplo, la prueba de la desaminacin de la fenilalanina a cido fenil pirvico por actividad enzimtica microbiana. Es un medio slido repartido en tubo inclinado, se siembra en superficie con asa y se incuba a 37 C por 18 a 24 h. Para la lectura se agrega al cultivo 4 o 5 gotas de cloruro frrico al 10%. LECTURA: la reaccin es positiva si se observa un color verde en la superficie. Es negativa si no hay cambios, observndose un color amarillo caracterstico del cloruro frrico.
Prueba del citrato
Determina la capacidad de un germen de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y energa. El desarrollo bacteriano provoca un viraje del indicador de pH (azul de bromotimol) del verde (neutro) al azul (alcalino), porque los grmenes producen metabolitos alcalinos a
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partir de las sales de amonio contenidas en el medio. Es un medio slido repartido en tubo inclinado; se siembra en superficie y se incuba 24 a 48 h a 37 C. LECTURA: reaccin positiva: se observa un intenso color azul. Reaccin negativa: no hay desarrollo ni cambio de color.
Prueba de la ureasa
Determina la habilidad de un microorganismo de hidrolizar la urea formando dos molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa. La alcalinizacin del medio por el hidrxido de amonio hace virar el indicador de pH (rojo fenol). Es un medio lquido, de color naranja plido que se siembra con asa, y se incuba a 37 C por 24 horas. LECTURA: reaccin positiva: cuando hay viraje del indicador al rosa intenso. Reaccin negativa: el color permanece incambiado.
SIM
Es un medio semislido que contiene 0,3% de agar. Se siembra con punta en profundidad. Se incuba 24 horas a 37 C. Se observan tres caractersticas: Movilidad, cuando el desarrollo se produce en todo el medio causando turbidez difusa; o inmovilidad, cuando el desarrollo se produce slo a lo largo de la lnea de siembra. Produccin de sulfhdrico: se observa un precipitado de color negro. Produccin de indol a partir del triptofano: al agregar un reactivo (Kovacs o Ehrlich) se forma un anillo rojo intenso en la superficie del medio.
Bibliografa
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Principales grupos de bacilos Gram positivos aerobios

M. Macedo, M. Vola
Comprende un amplio conjunto de bacterias agrupadas por sus caractersticas morfolgicas y tintoriales. Caractersticamente, dentro de este grupo se encuentran bacterias capaces de esporular. Clostridium spp y Bacillus spp son capaces de sobrevivir en medios hostiles mediante la formacin de una estructura muy resistente, la endospora (tambin llamada espora o sporo), la estructura con vida ms resistente a los agentes fsico-qumicos, y por lo tanto, a la esterilizacin y desinfeccin. Como veremos, esto tiene grandes implicancias mdicas, en la industria alimentaria, en los procesos de esterilizacin e increblemente, en el bioterrorismo. La endospora puede, en condiciones favorables, germinar y dar lugar a la clula vegetativa. Deben diferenciarse las esporas bacterianas, que constituyen una forma de resistencia y no tienen funcin reproductora, de las de los hongos, que tienen funcin reproductora, son externas, numerosas y que no confieren resistencia. Recurdese que una espora bacteriana da lugar a una nica clula vegetativa. Si bien dentro de los bacilos Gram positivos (BGP) se encuentran algunos de los patgenos ms agresivos para el ser humano, la gran mayora de las especies bacterianas de este grupo no son patgenos primarios. Muchos forman parte de la flora normal del cuerpo humano (piel, tracto gastrointestinal, cavidad oral) y se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente. Por este motivo, se debe ser cuidadoso en la interpretacin del hallazgo de un BGP en un estudio microbiolgico, ya que frecuentemente se trata de contaminantes. De acuerdo a su comportamiento frente al oxigeno los BGP se dividen en: a) aerobios: Bacillus spp, Listeria spp, Corynebacterium spp, Erysipelothrix spp, etc. b) anaerobios: Clostridium spp, Eubacterium spp, Propionibacterium spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Mobiluncus spp, etc. En este captulo nos referiremos nicamente a los BGP aerobios de importancia mdica. stos pueden ser clasificados segn su morfologa en: 1. Esporulados: Bacillus spp 2. No esporulados: 2a. regulares: Listeria spp.; Erisipelothrix spp. 2b. irregulares: Corynebacterium spp.; Nocardia spp.
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Esporulados
BACILLUS
Caractersticas generales Este gnero es prototipo de la familia Bacillaceae. Son BGP grandes y esporulados, no exigentes y en general mviles. Incluye bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Estn ampliamente distribuidos en la naturaleza; algunos forman parte de la flora normal y suelen ser contaminantes del laboratorio. El manual Bergeys de sistemtica bacteriana describe 34 especies, pero Bacillus anthracis es el ms importante en microbiologa mdica y veterinaria. Existe una gran diversidad de contenido G+C en su genoma, 32-62 mol % dentro del gnero, lo que refleja su gran heterogeneidad. Ciertos miembros del gnero tienen implicancias mdicas por la produccin de antibiticos como polimixina y bacitracina, adems de uso industrial en la produccin de solventes, enzimas, vitaminas, etc. Bacillus anthracis El carbunco o ntrax (evitar la confusin con el trmino carbunclo) fue una de las primeras infecciones bacterianas para las cuales se estableci definitivamente la causa. Dio lugar al desarrollo de la primera vacuna bacteriana que fue desarrollada por Louis Pasteur. Es una enfermedad que afecta sobretodo a animales herbvoros, en particular ovinos y bovinos. El hombre la adquiere de forma accidental: en el contexto agrcola como una infeccin cutnea local, en el contexto industrial (manipuladores de cuero y pelo de animal) como una neumona (poco frecuente). Es entonces, una zoonosis y una enfermedad laboral. Por producir endosporas altamente resistentes y ser capaz de producir infecciones respiratorias graves, es un arma biolgica potencial. De hecho, es conocido el episodio de bioterrorismo que ocurri en Estados Unidos hace algunos aos, que dio lugar a varias muertes y que alarm enormemente al mundo entero. Morfologa y fisiologa de B. anthracis Microscopa: bacilos rectos de extremos cuadrados de 3-5 m de largo y 1-1.2 m de ancho, aislados o en pares. Es inmvil a diferencia de la mayora de las otras especies del gnero. Cuando desarrolla in vivo presenta cpsula, pero para demostrarla in vitro debe cultivarse en medios especiales (por ej. medios con bicarbonato e incubacin a 6% de CO2). La endospora es elptica, ubicada centralmente, y no modifica el soma bacteriano; no se produce en tejidos de animales vivos, pero si en cultivos de varios das, suelos o animales muertos. Macroscopa: luego de 24 horas de cultivo, las colonias son grandes (2-3 mm de dimetro), sobreelevadas, blanco-grisceas, opacas y de bordes irregulares, en aspecto de cabeza de medusa. Tienen una consistencia membranosa con dificultad para emulsionarlas. No producen hemlisis. Caractersticas del cultivo: se realiza en aerobiosis, crecen bien en cualquier medio, pero se visualiza mejor la morfologa de las colonias en agar sangre al 5%, pH 7-7,4 y 37 C. Resistencia: la clula vegetativa es comparable con otras bacterias no esporuladas pero, debido a su capacidad para esporular, es sumamente resistente. Las esporas permanecen viables durante aos en el ambiente. Esta propiedad fue demostrada por experimentos de guerra biolgica realizados en Escocia, que consistieron en la dispersin de 4 x 1014 esporas, cuya persistencia se demostr por ms de 20 aos, lo que requiri posteriormente la desinfeccin de la zona con formaldehdo. Pueden ser destruidas si son sometidas a esterilizacin, siendo la
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estructura viva ms resistente (solo los priones son ms resistentes, pero difcil considerarlos como estructuras vivas). En base a esto esporas de especies de Bacillus distintas a B. anthracis, son utilizadas como controles biolgicos de esterilizacin (ver captulo de Esterilizacin, desinfeccin y antisepsia). Estructura antignica Poseen tres antgenos principales: Polipptido capsular de gran peso molecular formado casi exclusivamente por cido Dglutmico. Esta es la nica especie bacteriana de importancia mdica que posee cpsula peptdica en lugar de polisacrida. Existe un nico determinante antignico. Por razones no muy bien conocidas los anticuerpos anticpsula no son protectores. Los genes que codifican esta estructura se encuentran en un gran plsmido. Antgeno somtico polisacrido, es un componente de la pared celular. Los anticuerpos no son protectores. Reacciona en forma cruzada con la sangre de tipo A y Streptococcus pneumoniae tipo 14. Toxinas: factor edema y toxina letal. Determinantes de patogenicidad de B. anthracis No todas las cepas de B. anthracis son capaces de producir carbunco. Los principales atributos de virulencia de las cepas que producen enfermedad estn codificados en dos plsmidos y son: Toxinas Produce dos toxinas modelo A-B, que poseen idntica subunidad B. La subunidad B se conoce como antgeno protector. Es la porcin de la toxina que se fija al sitio blanco y permite el ingreso a la clula. Toxina edema: su subunidad A es el componente enzimticamente activo; se denomina factor edema. Es una adenilato-ciclasa calmodulina-dependiente. Es responsable del importante edema en los sitios de infeccin, la inhibicin de la funcin de los neutrfilos y obstaculiza la produccin de factor de necrosis tumoral (TNF) e interleuquina 6 (IL-6) por parte de los monocitos. Toxina letal: su porcin A, llamada factor letal, es una metaloproteasa que inhibe la sealizacin transduccional intracelular. Estimula la liberacin de TNF e IL-1 por parte de los macrfagos; este mecanismo parece contribuir a la muerte por bacteriemia. Cpsula Al igual que sucede con otras bacterias la cpsula es un importante factor de virulencia al inhibir la fagocitosis. Infeccin clnica de B. anthracis
Epidemiologa
La infeccin veterinaria tiene una alta tasa de mortalidad por sepsis. En los humanos es una enfermedad actualmente poco frecuente. Dependiendo de la va de transmisin, produce dos clases de infecciones principales: una cutnea relativamente benigna y una respiratoria que compromete la vida del paciente. La infeccin cutnea se produce por contacto directo con animales infectados. La infeccin respiratoria requiere la va inhalatoria, la cual, para ser efectiva, requiere que los sporos bacterianos sean aerosolizados. Por este motivo, esta va raramente ocurre de manera natural y despierta la sospecha de intencionalidad (bioterrorismo), aunque se han asociado casos de ntrax inhalatorio con el procesamiento a gran
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escala de pelos y lana de animales contaminados realizado en espacios pequeos y cerrados. Excepcionalmente se produce una forma gastrointestinal por la ingesta de esporas bacterianas, a partir de carne contaminada. No se transmite de persona a persona.
Patogenia
El carbunco cutneo se produce por contacto de la piel con material infectado. Los sporos ingresan a travs de una lesin de la piel. Al ser ingeridos por los macrfagos en el sitio de entrada, los sporos germinan y las clulas se multiplican produciendo cpsula y toxinas. El carbunco pulmonar ocurre cuando las esporas ingresan a la va area y se depositan en los espacios alveolares, donde son fagocitadas por los macrfagos alveolares. En el interior de los mismos germinan y producen las toxinas, para ser luego transportadas por la circulacin linftica a los ganglios mediastinales. Alcanzan el torrente sanguneo pudiendo causar shock sptico. La germinacin puede ocurrir hasta 60 das despus del ingreso de las esporas a la va respiratoria; de ah la importancia de que la profilaxis antibitica en casos de exposicin se prolongue por 60 das. Se estima que la dosis inhalatoria letal para los seres humanos es de 2500 a 55000 esporas.
La infeccin cutnea, que comprende el 95% de los casos humanos, se manifiesta por una ppula indolora de centro color negro-azulado con un gran borde edematoso. Sin tratamiento tiene un 20% de mortalidad. La infeccin pulmonar es una severa infeccin respiratoria que evoluciona a la insuficiencia respiratoria aguda y tiene una muy alta tasa de mortalidad (100% sin tratamiento). Sensibilidad antibitica Es sensible a penicilina (aunque existen informes de unos pocos casos resistentes), eritromicina, tetraciclina, gentamicina, cloranfenicol y quinolonas. Prevencin El control del carbunco humano depende fundamentalmente del control del carbunco animal. As, deben tomarse medidas como la vacunacin del ganado y manejo adecuado del ganado muerto, ropa y material de trabajo, etc.
Inmunizacin activa
Se dispone de vacuna elaborada con subunidades B, obtenidas por filtracin. Actualmente no se usa en forma sistemtica, solo es utilizada en situacin de mayor riesgo (personal militar, sobre todo). A nivel veterinario se utiliza una vacuna de mayor eficacia, elaborada a partir de esporas vivas, de cepa no capsulada. Esta en estudio una vacuna recombinante de subunidades B. Otros Bacillus de importancia B. cereus: es agente de toxiinfeccin alimentaria, es capaz de producir una enterotoxina termoestable que produce vmitos y una termolbil responsable del sndrome diarreico. El arroz y otros vegetales son los principales vehculos de transmisin. En Uruguay, entre 1995 y 2001, se notificaron 3 brotes de enfermedad transmitida por alimentos (ETA). Morfolgicamente es similar a B. anthracis pero se diferencia por ser mvil y resistente a la penicilina. Produce una -lactamasa y es tambin resistente al trimetoprim-sulfametoxazol.
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Es agente tambin de infecciones oculares. B. stearothermophilus: se utiliza como control biolgico en el autoclave. B. subtilis: presente en el aire y polvo, es un contaminante del laboratorio pero puede producir enfermedad en inmunodeprimidos. Se utiliza como control biolgico en el horno Pasteur y esterilizacin con ETO gas. B. thuringiensis: es utilizado como pesticida por producir una toxina letal para ciertos insectos.
No esporulados regulares
LISTERIA
Gnero de cocobacilos cortos ubicuos en la naturaleza. El ms importante en microbiologa mdica es L. monocytogenes, ya que es el principal patgeno humano. Excepcionalmente se han reportado infecciones por L. ivanovii (en animales es responsable de abortos). Las mujeres embarazadas son especialmente susceptibles a las infecciones por Listeria, tambin afecta a otros individuos con alteraciones del sistema inmune, en especial de la inmunidad celular: personas aosas, recin nacidos, cirrticos, trasplantados, personas afectas de cncer, las que reciben terapia inmunosupresora, etc. L. monocytogenes
Morfologa y fisiologa
Microscopa: cocobacilos, Gram positivos, de 0,5 - 2 m por 0,5 m, que se presentan aislados o agrupados en cadenas cortas; mviles por presentar de 1 a 5 flagelos a 28C. Macroscopa: colonias pequeas (0,5 1,5 cm.), translcidas. En agar sangre produce colonias similares a Streptococcus spp. Las cepas patgenas producen un halo muy estrecho de -hemlisis; frecuentemente es necesario remover las colonias para visualizar la hemlisis. Fisiologa y caractersticas bioqumicas: son aerobios facultativos, pero su crecimiento es estimulado con la disminucin en la tensin de O2 y CO2 al 5-10%. Su crecimiento ptimo es a 30-37C pero puede proliferar a 4C en unos das; esta caracterstica fisiolgica es til para su aislamiento selectivo, ya que otras bacterias de inters mdico no son capaces de desarrollar a tan bajas temperaturas (tcnica de enriquecimiento en fro). Por otra parte, le confiere a la bacteria una ventaja ya que es capaz de desarrollar en alimentos refrigerados y as dar origen a infecciones a partir del consumo de los mismos. No son exigentes nutricionalmente. Son catalasa positivos (a diferencia de los Streptococcus spp), fermentan azcares como la glucosa, manosa y ramnosa, pero no el manitol (a diferencia de otras especies no patgenas); tambin hidrolizan la esculina. Tienen cuatro flagelos, los que se pierden cuando ingresan al ser humano. Cuando se siembran en medios semislidos en tubo y se incuban a 25C, muestran una movilidad caracterstica en aspecto de sombrilla, la cual no se observa cuando se incuba a 37C.
Estructura antignica
Los determinantes antignicos ms caracterizados son el antgeno O (somtico) y antgeno H (flagelar) que permiten la clasificacin en diferentes serotipos. Hasta la fecha se han descrito 13 serotipos. La mayora de las infecciones humanas son producidas por un serotipo en particular (4b), mientras que en alimentos predominan otros serotipos diferentes. La serotipificacin es til en estudios epidemiolgicos.
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Determinantes de patogenicidad Explicaran en parte la capacidad de L. monocytogenes de proliferar dentro de las clulas ya que es un microorganismo intracelular facultativo (principalmente en macrfagos y clulas epiteliales). Productos solubles excretados: listerolisina O (LLO), es una hemolisina. Su prototipo es la estreptolisina O y la pneumolisina, de los estreptococos. Rompe la membrana del fagosoma y permite la reproduccin de la bacteria en un medio menos hostil, el citoplasma de la clula husped. Adems, inhibe el procesamiento del antgeno mediado por macrfagos. Recientemente se ha demostrado que genera un influjo de calcio extracelular que estimula el ingreso de la bacteria en las clulas epiteliales. Codificada por el gen hly. Internalinas: se conocen dos protenas, A y B, que estn involucradas en el ingreso a las clulas. Siderforos: componentes bacterianos que captan hierro, mineral indispensable para la supervivencia bacteriana. Otros: fosfolipasas, etc. Infeccin clnica
Epidemiologa
De distribucin mundial, ubicuo en la naturaleza se encuentra en diferentes animales, suelos, plantas y agua. Al parecer su hbitat primario es el suelo y la materia vegetal en descomposicin. Adems se halla en el intestino del 5 al 10% del hombre, sin causar enfermedad. Es un importante patgeno veterinario y se transmite al hombre por el consumo de alimentos contaminados de origen animal. Es por lo tanto, otro ejemplo de zoonosis y ETA. Tiene una tasa de mortalidad mayor a la de otras bacterias de transmisin alimentaria.
Patogenia
Es importante recordar que la inmunidad del husped es en general efectiva contra Listeria y que se desarrolla enfermedad dependiendo de la dosis infectante (se requiere altas dosis, mayor a 109), de los determinantes de virulencia, y de la inmunidad celular del husped. Ingresan por va digestiva e inducen la fagocitosis por parte del enterocito, siendo incluidas en un fagosoma (antes de formarse el fagolisosoma), del cual escapan rpidamente para multiplicarse en el citoplasma de la clula husped. Una de las protenas responsables de esto es la LLO. En el interior del citoplasma celular son capaces de polimerizar los filamentos de actina en uno de los polos bacterianos. De esta forma es impulsada hacia la periferia, a la membrana citoplamtica, formando all protrusiones o pseudpodos lo que le permite luego penetrar en otra clula adyacente. As, es capaz de moverse clula a clula sin estar expuesta a los anticuerpos, el complemento o los polimorfonucleares. Por ello es ms importante la inmunidad celular que la humoral. Finalmente alcanzan el torrente circulatorio y de all alcanzan otros rganos, teniendo predileccin por el sistema nervioso central y la placenta. La infeccin connatal se trasmite de diferente manera. Las mujeres embarazadas infectadas pueden transmitir la infeccin al feto por va transplacentaria. No se ha demostrado claramente la transmisin en el canal de parto.
Se describen dos tipos de listeriosis: materno-fetal y no materno-fetal. En el primer caso, la mujer embarazada sufre infecciones en general leves y autolimitadas
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(excepto cuando se produce corioamnionitis) que pueden incluso pasar desapercibidas, o que se manifiestan por malestar general, cefaleas, mialgias, fiebre de bajo grado. En cambio la infeccin en el feto es grave y puede dar lugar a bito o al parto prematuro de un recin nacido infectado. El espectro de manifestaciones clnicas en el recin nacido es similar al producido por Streptococcus agalactiae, son: un cuadro de instalacin precoz de sepsis, y un cuadro de instalacin tarda que se manifiesta en general por meningitis. Es discutido si este ltimo ocurre cuando la transmisin se produce en el canal de parto, ya que esta va de infeccin no se ha demostrado claramente. La principal forma de presentacin de la listeriosis no materno-fetal es la bacteriemia sin foco evidente. Le sigue en frecuencia la meningitis. En los ltimos aos, varias investigaciones han sugerido que Listeria puede causar gastroenteritis, incluso en adultos inmunocompetentes. Debido a que por lo menos un 5% de personas sanas son portadoras intestinales de Listeria, es difcil determinar si son agentes etiolgicos de diarrea. Otras infecciones mucho menos frecuentes incluyen: endocarditis, infecciones localizadas (conjuntivitis, infecciones de piel, linfadenitis), abscesos profundos, etc.; se descart como agente de infeccin cervicovaginal clnica. Sensibilidad antibitica Es sensible a penicilina, ampicilina, eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol y rifampicina. Es moderadamente sensible a las quinolonas y las cefalosporinas de tercera generacin carecen de efectividad in vitro. Recientemente aparecieron cepas resistentes a cloranfenicol, macrlidos y rifampicina. Para el tratamiento es necesario que estos antibiticos penetren las clulas, y en casos de meningitis que atraviesen la barrera hematoenceflica; para esto se utiliza ampicilina con un aminoglucsido como gentamicina. Prevencin No se dispone de vacunas. La profilaxis depende de las medidas de control que se aplican para cualquier enfermedad de transmisin alimentaria, con especial cuidado en las mujeres embarazadas y personas inmunocomprometidas.
ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE
La enfermedad humana por este agente es muy poco frecuente y se limita a trabajadores de la pesca, de mataderos, carniceros, etc., configurando una enfermedad laboral. Es un microorganismo ampliamente distribuido en la naturaleza. Es un bacilo Gram positivo, microaerfilo y exigente, que no produce cpsula ni esporas. Es inmvil, catalasa negativo, produce H2S y alfa hemlisis. Como uno de los mecanismos de patogenicidad presenta hialuronidasa y neuraminidasa. Produce una celulitis erisipeloide caracterizada por una lesin eritematosa prpura, dolorosa, no supurada, pruriginosa. En general el proceso es autolimitado y rara vez causa enfermedad sistmica. Produce adems endocarditis. Es sensible a penicilina (puede sustituirse por eritromicina en alrgicos).
No esporulados irregulares
CORYNEBACTERIUM
Es un gnero con numerosas especies (ms de 46), algunas de ellas forman parte de la flora normal de mucosas y piel del ser humano; excepcionalmente algunas de ellas causan enfer-
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medad en pacientes inmunodeprimidos. La especie patgena por excelencia es C. diphtheriae, responsable de una grave enfermedad: la difteria. Son bacilos pleomrficos, no esporulados y no cido-alcohol resistente. La mayora fermentan la glucosa y son catalasa positivos. Su genoma contiene de 51 a 68 mol % de G + C, y mediante el estudio del 16s rARN se lo encontr estrechamente relacionado con Mycobacterium, Nocardia y Rhodococcus. Corynebacterium diphtheriae Es por excelencia la especie ms importante del gnero. Se describen cuatro biotipos: gravis, mitis, belfanti e intermedius; su importancia es epidemiolgica. Morfologa y fisiologa de C. diphteriae Microscopa: bacilo delgado en forma de clava, mide 1,5-5 m de ancho y 0,5-1 m de largo; es Gram positivo, no esporulado e inmvil. Aparecen agrupados formando estructuras que semejan letras chinas. Con azul de metileno se observan grnulos metacrmaticos caractersticos que los diferencian de otras especies de Corynebacterium. Macroscopa: las colonias tpicas son pequeas, blanco grisceas brillantes. En medios selectivos con telurito se ven grisceas a negras. La presencia y el tipo de hemlisis es variable. Es un microorganismo anaerobio facultativo, pero crece mejor en medios aerobios. Es exigente desde el punto de vista nutricional. Su pared celular est compuesta por cido mesodiaminopimlicos (no L-lisina), polmeros de arabino galactano y cidos miclicos de cadena corta (por ello su posicin taxonmica y su relacionamiento con Nocardia, Mycobacterium y Rhodococcus). Resistencia: dentro de las bacilos no esporulados C. diphtheriae es uno de los ms resistentes a la luz, desecacin y congelamiento. Pero son susceptibles a los desinfectantes de uso habitual. Estructura antignica Los ms caracterizados son: Antgeno K: son protenas termolbiles localizadas sobre la superficie, son uno de los principales factores de virulencia. Responsables de la especificidad de tipo. Antgeno O: es un polisacrido que contiene arabinogalactanos y es el antgeno responsable de la reactividad cruzada con Mycobacterium y Nocardia. Factor de cordn: glicolpido un muy importante factor de virulencia. Toxina Determinantes de patogenicidad Los ms importantes son: Factor de cordn: contiene los cidos miclicos propios de C. diphtheriae, tiene actividad similar al de Mycobacterium spp; en las clulas del ratn provoca rotura de las mitocondrias, disminucin de la respiracin y la muerte. Antgeno K: antes mencionado, responsable de inmunidad antibacteriana, hipersensibilidad e inmunidad antitxica. Provee invasividad junto al factor de cordn. Neuraminidasa y N-acetilneuraminato liasa. Exotoxina: es el principal determinante de patogenicidad y explica casi todos los sntomas sistmicos de la enfermedad. Dicha toxina es producida por las cepas de C. diphtheriae infectadas por un bacterifago
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temperado que transporta el gen estructural para la toxina; en general es un fago tox+. La expresin del gen tox est sumamente regulada por factores genticos y fisiolgicos. La toxina slo se produce a niveles mximos cuando declina el crecimiento bacteriano, cuando las concentraciones de hierro en el medio disminuyen. Esto parece estar regulado de forma que cuando hay hierro en el medio se forma un complejo represor-hierro que se une especficamente al operador tox del fago . En condiciones de baja concentracin de hierro en el medio, el complejo se disocia y el gen tox, se desreprime y se sintetiza la toxina. La toxina se sintetiza a nivel de los polisomas de la membrana de C. diphtheriae y es secretada co-traduccionalmente como una cadena polipeptdica no txica. Adquiere su toxicidad al actuar la tripsina que pone al descubierto sus sitios enzimticos activos. Es un modelo A-B de toxina: la subunidad B (sitio de unin a la clula eucariota) unida a la subunidad A (sitio enzimtico activo) por un puente disulfuro. Accin: la toxina ingresa a la clula y al llegar al citoplasma altera la sntesis proteica. La subunidad A produce una ADP-ribosilacin del factor de elongacin EF-2 de los ribosomas celulares, lo que produce su inhibicin. Los ribosomas al poseer un solo EF-2 quedan inhibidos por una sola subunidad A. Se produce as la inhibicin de la sntesis proteica lo que lleva rpidamente a la lisis celular, produciendo necrosis e inflamacin local de la mucosa. Adems, esta toxina es la responsable de los efectos sistmicos de la enfermedad ya que produce toxicidad cardaca, del sistema nervioso central y perifrico, y dao renal. Infeccin clnica de C. diphteriae
Epidemiologa
La difteria es una enfermedad de distribucin mundial, pero con una incidencia notablemente variable segn el grado de inmunizacin en la regin. En nuestro pas, la vacunacin se incluy en el PAI (programa ampliado de inmunizacin) por lo que todos los nios estn vacunados; lo que disminuye la frecuencia y la severidad de la enfermedad. La vacunacin ha logrado que no existan casos notificados en nuestro pas actualmente, el ltimo caso se notific hace alrededor de 30 aos. El ser humano es el nico husped natural de C. diphtheriae. Los portadores asintomticos y los individuos en etapa de incubacin son las principales fuentes de infeccin.
Inmunidad
Se adquiere por la presencia en sangre de la antitoxina (anticuerpos antitoxina), adquirida de manera pasiva (como los lactantes de hasta 6 meses) o por inmunizacin activa (infeccin natural o vacunacin). El estado inmune de una persona puede ser evaluado por medio de la prueba de Schick, similar al PPD utilizado en la tuberculosis.
Patogenia
Se trata de una enfermedad toxignica. La bacteria no tiene gran capacidad de invasin y en general persiste en la superficie de las mucosas y la piel, desde donde produce la toxina con actividad sistmica. La infeccin respiratoria se trasmite principalmente por las gotitas de Pflgge y las lesiones cutneas altamente infectantes son fuente de enfermedad farngea y cutnea. Dicha transmisin se ve favorecida por el hacinamiento y el fro. Los microorganismos se establecen en la orofaringe y amgdalas y se reproducen con rapidez. Luego comienzan a secretar la exotoxina que produce necrosis local y gran respuesta inflamatoria con la produccin de exudados fibrinosos, que se van organizando y forman una seudomembrana gruesa y muy adherente.
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Dicha pseudomembrana junto con el edema y las importantes adenomegalias locales producen obstruccin respiratoria alta (crup). Las manifestaciones sistmicas de la enfermedad se deben a la toxicidad cardaca y del sistema nervioso perifrico que produce la toxina.
Enfermedad respiratoria: es una amigdalitis con fiebre y malestar general. Puede ser leve o muy grave cuando compromete nasofaringe y trquea; las seudomembranas, caractersticas de esta faringoamigdalitis, y el edema que se forman pueden llevar a la asfixia y a la muerte del paciente. Cutnea: se produce ms frecuentemente en zonas clidas del mundo. Complicaciones: disfuncin miocrdica, afeccin de los pares craneanos y polineuritis perifrica; todas lesiones reversibles. Sensibilidad antibitica Es sensible a penicilina y eritromicina, como alternativa para pacientes alrgicos. Debe ser administrada tempranamente junto con la antitoxina. Prevencin
Inmunizacin activa
En nuestro pas se realiza mediante la vacunacin con la vacuna pentavalente en el 1er ao de vida que contiene toxoide diftrico, tetnico y grmenes muertos de B. pertussis, adems de polisacrido capsular de H. influenzae y antgenos del virus de la hepatitis B. Luego se hace refuerzo administrada solamente junto al toxoide tetnico. El toxoide diftrico se prepara a partir de la toxina diftrica tratada con formalina al 0,3% a 37C.
NOCARDIA
Pertenece a la familia Nocardiaceae, suborden Corynebacterineae, perteneciente a los Actinomycetes. En el suborden se encuentran adems otras familias como Mycobacteriaceae y Corynebacteriaceae. Comparte con estas dos familias los componentes de su pared: cidos miclicos, galactosa, arabinosa, cido mesodiaminopimlico, etc. Comprende numerosas especies, pero las especies que infectan al hombre son: complejo N. asteroides y N. brasiliensis. Las infecciones producidas por este microorganismo son infrecuentes, pero est aumentando el nmero de casos reportados. Causa infecciones localizadas tanto como diseminadas en humanos, frecuentemente inmunodeprimidos, y en animales. Morfologa y fisiologa Macroscopa y microscopa: son cocobacilos ramificados que frecuentemente forman hifas areas (formando colonias algodonosas), parcialmente cido-alcohol resistentes. Las colonias son de color naranja, de superficie y bordes irregulares, con un caracterstico olor a tierra mojada, variable segn la especie. Son aerobios y moderadamente exigentes desde el punto de vista nutricional. Son de crecimiento lento, los cultivos en agar infusin, en Sabouraud, en Lowenstein-Jensen o en agar sangre pueden ser examinados al cabo de algunos das. Se pueden utilizar medios selectivos con antibiticos. Infeccin clnica La nocardiosis es una infeccin mundialmente distribuida. Afecta fundamentalmente a pacien-
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tes inmunodeprimidos, pero no en forma exclusiva. La resistencia del husped a la infeccin depende del nmero y de la capacidad fagoctica y ltica de los polimorfonucleares y otras clulas de defensa. El hecho que la enfermedad afecte de forma importante a los pacientes VIH positivos reafirma la importancia de la inmunidad celular en este tipo de infecciones. La transmisin de la enfermedad se produce por la inhalacin de partculas contaminadas, ocasionando nocardiosis pulmonar, o mediante inoculacin cutnea directa en donde se produce celulitis y linfangitis. No existe evidencia an de transmisin persona-persona. La infeccin se manifiesta clnicamente por: Nocardiosis pulmonar: es una neumona de evolucin aguda o subaguda con formacin de abscesos y cavitacin. Habitualmente provocada por N. asteroides Nocardiosis cutnea y subcutnea: puede producir el clsico micetoma (enfermedad crnica de la piel y el tejido celular subcutneo que destruye progresivamente la piel, el celular subcutneo, las fascias, el msculo, llegando al hueso) adems de celulitis, pstulas, etc. En general causada por N. brasiliensis. Nocardiosis sistmica: a partir de las dos formas anteriores pueden producirse bacteriemias y afectar el sistema nervioso central, la piel y tejido subcutneo, los riones, articulaciones, huesos, corazn y ojos. Tanto la infeccin pulmonar como la sistmica no son infecciones autolimitadas por lo que requieren de correcto tratamiento antibitico y muchas veces ciruga. Determinantes de patogenicidad La composicin diferente de su pared y la presencia de factor de cordn o dimicolato de trehalosa parecen permitirle la vida en el interior celular. Tambin los niveles altos de lactosa y superxido dismutasa. Sensibilidad antibitica Son sensibles a las sulfonamidas, trimetoprim-sulfametoxazol y dapsona con sulfato de estreptomicina. Son sensibles adems a amicacina, que muestra actividad sinrgica con imipenem, con cefalosporinas de tercera generacin y con trimetoprim-sulfametoxazol. Se tratan habitualmente con sulfas o con cotrimoxazol.
RHODOCOCCUS
Es otro gnero bacteriano que integra la familia Nocardiaceae y comparte muchas de sus caractersticas biolgicas. Crece formando colonias rosadas extendidas sobre agar infusinsangre con o sin sustancias selectivas agregadas. Produce infecciones oportunistas, en especial de pulmn y de partes blandas, en pacientes inmunocomprometidos (VIH positivos), con frecuente invasin sangunea.
Identificacin de bacilos Gram positivos (BGP)

Al igual que para la identificacin de cualquier especie bacteriana, lo primero a realizar es un frotis con tincin de Gram. Luego debemos conocer los requerimientos atmosfricos de la cepa a identificar, ya que sabemos que este grupo posee tanto bacterias aerobias como aerobias facultativas y anaerobias. Para esto sembramos en un caldo de tioglicolato. Realizaremos posteriormente un cultivo en medios agar simple, agar sangre y las diferentes pruebas bioqumicas.
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* Lecitinasa: se siembra la bacteria en agar yema de huevo (agat TSA con el agregado de 10% de yema de huevo) y se observa luego un halo de opacificacin del medio alrededor de la colonia
Con las caractersticas observadas, nos orientamos al gnero (por ej.: la presencia de sporos en un BGP aerobio o facultativo nos orienta a Bacillus; la presencia de cocobacilos pequeos nos orienta a Listeria; los bacilos irregulares en letras chinas o empalizadas nos orientan al gnero Corynebacterium).
GNERO BACILLUS
Microscopa: se observan bacilos Gram positivos grandes (1 por 3 a 10 m) de extremos rectos, aislados, en pares o cadenas con tincin de Gram. Se observan reas claras sin teir que corresponden a endosporas, ovoides, de posicin subterminal, que no deforman el soma bacteriano. Pueden teirse con tcnicas de coloracin especiales como el verde de Malaquita. La endospora solo se observa a partir de cultivos viejos o mediante tcnicas que provoquen la esporulacin, no a partir de muestras clnicas. Lo opuesto sucede con la expresin de la cpsula, que se pierde al ser cultivada en medios artificiales. Macroscopa: para su observacin deben ser cultivados en medios ricos y simples tales como agar sangre, agar chocolate y agar nutriente. Su morfologa es variable segn la especie: B. anthracis: colonias grandes, grises, opacas, chatas, de bordes irregulares que remedan una cabeza de medusa. Son no hemolticos. B. cereus: colonias grandes, blancogrisceas, opacas, betahemolticas. B. subtilis: colonias grandes, chatas, con pigmento naranja, pueden ser beta hemolticas Para su cultivo a partir de muestras clnicas con contaminantes pueden realizarse tcnicas que eliminan las formas de vida vegetativa y solo permiten la sobrevida de esporas; estas tcnicas son shock de calor o shock de alcohol. Tambin se utilizan medios selectivos como el PLET para B. anthracis. Algunas pruebas para identificacin de especie Es un desafo para el microbilogo diferenciar B. anthracis de las muchas especies no patgenas que se encuentran en el ambiente como contaminantes. Las pruebas ms comnmente realizadas son las que se observan en el diagrama (en la parte superior): lecitinasa, movilidad, susceptibilidad a la penicilina, y otras como indol, nitratos, citrato, voges proskauer, etc.; adems de la observacin de la macroscopa y microscopa, bastante caractersticas de cada especie en particular. Tambin se pueden utilizar tcnicas de biologa molecular como anlisis de los fragmentos de restriccin o mtodos inmunolgicos para deteccin de las toxinas.
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GNERO LISTERIA
Microscopa: cocobacilos (0,4 por 1,0 a 2,0 m), dispuestos al azar. Pueden parecerse a Corynebacterium y a los estreptococos. Macroscopa: no son exigentes desde el punto de vista nutricional pero conviene cultivarlas en agar sangre. Para las muestras provenientes de alimentos o muestras clnicas de sitios no estriles existen numerosos medios de enriquecimiento. Pueden ser cultivadas a 35C. El enriquecimiento se suele hacer a temperaturas menores. La movilidad en medio semislido se observa mejor a 25C y no a 35 o 37C. En agar simple se observan colonias pequeas, grises translcidas, circulares, de bordes lisos. En agar sangre producen -hemlisis estrecha. Requerimientos atmosfricos: se observa turbidez a lo largo de todo el tubo de tioglicolato, por lo que concluimos que es anaerobia facultativa. Algunas pruebas bioqumicas para identificacin del gnero Listeria Catalasa positivos (excepto algunas cepas), oxidasa negativos. Fermentacin de hidratos de carbono: glucosa positivos. Hidrlisis de la esculina positiva. TSI A/A sin gas ni sulfhdrico. Rojo de Metilo y Vogues Proskauer: ambos positivos.
Especie L. monocitogenes
Fermentacin de hidratos de carbono: xilosa negativo, manitol negativo, ramnosa positivo, salicina positivo. Hemlisis: beta, angosta. Es importante, ya que la diferencia de L. innocua (contaminante de alimentos pero no patgena) que no la posee; y de L. ivanovii, que posee una amplia zona de hemlisis beta. Catalasa positivo. Esta prueba es importante ya que permite diferenciar a L. monocytogenes de Streptococcus beta hemolticos, que poseen caractersticas morfolgicas similares. CAMP: se observa potenciacin de la beta hemlisis en forma de cabeza de fsforo. Esto es debido a la presencia de alfa lisina y listeriolisina O (similar a la estreptolisina de Streptococcus). L. seeligeri tambin es positivo. SIM: a 37C no se observa movilidad, a 25C se observa movilidad en forma de paraguas. Existen mtodos inmunolgicos para la deteccin de listerias a partir de alimentos pero an no han sido desarrollados para muestras clnicas. Los mtodos serolgicos (para la deteccin de anticuerpos) an no estn bien desarrollados para diagnstico clnico. Para la tipificacin se pueden utilizar tcnicas de biologa molecular como: fagotipificacin, ribotipificacin, electroforesis en campos pulsados (de las tcnicas ms utilizadas al momento), entre otras.
CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE
Microscopa: se observan bacilos Gram positivos delgados, pleomrficos (en forma de clava), de alrededor de 1,5-5 m de largo y 0,5-1 m de ancho. Aparecen agrupados formando estructuras que semejan letras chinas. Con azul de metileno se visualizan los caractersticos grnulos metacromticos. Macroscopa: para su observacin deben ser cultivadas por 24-48 h, en medios exigentes a 37C y en una atmsfera enriquecida con 5% de CO2. En agar sangre se observan colonias caractersticas: pequeas, blanco grisceas brillantes. Puede sembrarse en medio de Leffler,
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ya que si bien no se visualizan las colonias caractersticas, este medio aumenta la produccin de grnulos metacromticos. Para el cultivo directo de muestras clnicas se utilizan medios selectivos y diferenciales con telurito y cistena como el CTBA o el Tinsdale. En estos medios las colonias se visualizan gris-negruscas, ya que reducen el telurito, y con un halo marrn alrededor de la colonia por poseer actividad cistinasa. Luego pueden realizarse las siguientes pruebas: catalasa, metabolismo fermentador u oxidador, motilidad, produccin de ureasa, reduccin de nitritos, fermentacin de diferentes hidratos de carbono, etc. Para comprobar si la cepa en cuestin posee la toxina deben realizarse pruebas que solo son realizadas por laboratorio de referencia: Prueba de Elek modificada: consiste en cultivar la cepa a estudiar en una placa de Petri con un medio especializado, junto con un disco impregnado en antitoxina; si la bacteria presenta la toxina, se visualiza luego de la incubacin una zona de precipitacin. Pruebas de biologa molecular como PCR del gen tox; tiene la ventaja de poderse realizar directamente a partir de la muestra clnica. Otras pruebas como electroforesis en campos pulsados, anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin, ribotipificacin, etc. son realizados para estudios epidemiolgicos. ELISA: fue desarrollada recientemente para la deteccin de la toxina. La cromatografa para la bsqueda de cidos miclicos y otros componentes de la pared, tambin es utilizada en laboratorios de referencia para la identificacin de cepas de C. diphteriae.
GNERO NOCARDIA
Microscopa: bacilos Gram positivos delgados, dispuestos en cadenas cortas o largas. Puede realizarse una variante de coloracin para bacilos cido-alcohol resistentes (Kinyoun) en donde se pueden ver tanto cido alcohol resistente (AAR) como no-AAR. Las hifas areas pueden visualizarse tanto microscpicamente como macroscpicamente. Macroscopa: observamos colonias secas, con un tinte anaranjado (N. brasiliensis) con particular olor a tierra mojada, dependiendo su aspecto de la especie, la temperatura y el tipo de medio de cultivo. Para su cultivo pueden utilizarse medios tales como: agar Sabouraud dextrosa, agar cerebrocorazn infusin, agar sangre, Lowenstein Jensen y Middlebrook. Deben incubarse a 37C, en donde se visualizarn colonias entre el segundo da de incubacin y las 3 semanas. Para la identificacin se utilizan las caractersticas micro y macroscpicas adems de requerimientos de cultivo, tipo de metabolismo de la glucosa, produccin de arylsulfatasa, crecimiento en presencia de lisozima y caracterizacin molecular.
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Bacterias anaerobias
C. Rivas, M. Mota
Introduccin
La presencia de una atmsfera terrestre rica en oxgeno permiti a los seres vivos evolucionar desarrollando un metabolismo aerbico, el cual se caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtencin de energa. Las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aerbicas y sin duda, predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse. El reconocimiento de la naturaza anaerobia de determinados microorganismos se acredita a Pasteur, quien en 1863 observ que la motilidad de ciertas bacterias desapareca con la exposicin al aire. El conocimiento sobre las bacterias anaerobias es poco y relativamente reciente, ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio se necesitaban, hasta los aos 60, equipos costosos y tcnicas bacteriolgicas muy dificultosas. A partir de la introduccin de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo, el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun as, no hay un gran nmero de microbilogos que se dediquen al tema, la taxonoma est en permanente revisin e infinidad de aspectos se mantienen oscuros.
Definiciones
Anaerobios son aquellos grmenes que slo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades significativas de oxgeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al oxgeno molecular libre en la atmsfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados por tratarse de formas biolgicas metablicamente inertes y con muy escasa proporcin de agua en su composicin. Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer slo en ausencia de oxgeno, la sensibilidad frente al oxgeno vara ampliamente de una especie a otra. As, distinguimos bacterias microaerfilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados. Las bacterias microaerfilas resultan daadas por niveles altos de oxgeno como el atmosfrico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%. Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones breves al oxgeno atmosfrico desarrollando ptimamente en condiciones anaerobias. Los anaerobios estrictos no toleran
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el oxgeno y mueren en su presencia, por tanto slo desarrollan en condiciones anaerobias; (de aqu en adelante los denominaremos simplemente anaerobios).
Potencial de xido-reduccin
El potencial de xido-reduccin (Eh) de una pareja redox es la medida en voltios de la tendencia espontnea a donar o recibir electrones por parte de uno de los integrantes de la pareja (flujo de electrones). Una pareja redox posee una forma reducida (dador de electrones) y una forma oxidante (receptor de electrones): reductor <---> oxidante + electrones. En consecuencia cuanto menor sea la cantidad de formas oxidantes menor o ms bajo ser el potencial redox. Es por esto que el oxgeno debe ser eliminado imprescindiblemente del microclima de desarrollo de las bacterias anaerobias (O2 atmosfrico y en solucin), ya sea en los medios de cultivo o en el medio natural. An ms, el descenso del potencial de xido-reduccin debe afirmarse con la presencia en el medio de sustancias reductoras que superen en gran nmero a las oxidantes.
Oxgeno sensibilidad
Si bien el oxgeno es potencialmente txico para cualquier forma de vida, los anaerobios son intolerantes al mismo aunque en diferentes grados. Existe un espectro que va desde los extremadamente intolerantes (aerointolerantes) hasta los aerotolerantes moderados los cuales pueden sobrevivir a la presencia de O2 durante breves perodos. Esta diferente relacin con el oxgeno parece deberse a varios factores. En primer lugar, el oxgeno es un poderoso agente oxidante, es decir, un vido receptor de electrones, por lo tanto su presencia en solucin es incompatible con potenciales redox bajos. En esta situacin el flujo de electrones se ve interferido por un receptor extrao al usual de los grmenes provocando shunts letales. En segundo lugar, el oxgeno puede interactuar directamente con enzimas o cofactores, a travs de la oxidacin de grupos qumicos sensibles (por ej.: sulfhidrilos), causando inactivaciones irreversibles. En tercer lugar y aparentemente, la causa ms importante de la oxgeno-toxicidad, se atribuye a la produccin de sustancias txicas derivadas de la reduccin parcial de la molcula de O2. Estos productos son el radical superxido, perxido de hidrgeno y radical hidroxilo: O2 + e - O2- (radical superxido) O2- + e - + 2 H+ H2O2 (perxido de hidrgeno) H2O2 + e - + H+ H2O + OH (radical hidroxilo) Estos productos son extremadamente txicos porque son agentes oxidantes poderosos y provocan destruccin de constituyentes celulares rpidamente. Los neutrfilos y macrfagos utilizan estos productos txicos del O2 para destruir los patgenos invasores. Muchos microorganismos poseen enzimas que los protegen de estos productos txicos del oxgeno. Las bacterias aerobias y las facultativas poseen las enzimas superxido dismutasa (SOD) y catalasa, que catalizan las siguientes reacciones respectivamente: dismutasa O 2 + H 2 O2 2O2- + 2H+ superxido 2H2O2 catalasa 2H2O + O2
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Los microorganismos aerotolerantes pueden carecer de catalasa pero la mayora tiene SOD; ms an, las SOD han sido postuladas como factores de virulencia en los anaerobios, ya que estas enzimas permitiran la sobrevida de las bacterias en tejidos oxigenados hasta que el consumo de oxgeno determina el ambiente adecuado para la multiplicacin y desarrollo. Los anaerobios estrictos carecen de ambas enzimas o las tienen en bajas concentraciones y por eso no toleran el oxgeno.
Generalidades
BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS
Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustancias orgnicas son los aceptores finales de electrones, aunque tambin pueden obtener energa a partir de la respiracin anaerobia. Otras caractersticas comunes a los microorganismos anaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad, lo cual, sumado a sus requerimientos atmosfricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su aislamiento sea difcil; adems, al ser la mayora de las infecciones mixtas (aerobios y anaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento ms rpido pueden crecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias. Los plsmidos estn ampliamente difundidos entre los anaerobios especialmente a nivel de especies de Clostridium y Bacteroides. Un muy buen porcentaje de estos elementos no han demostrado funciones especficas. Entre los plsmidos funcionalmente conocidos encontramos: Plsmidos que codifican la produccin de bacteriocinas. Similares a las colicinas, son producidas por especies de Clostridium y Bacteroides. Plsmidos toxignicos, ampliamente distribuidos entre las especies de Clostridium productoras de exotoxinas (toxignicas). La correlacin fehaciente entre plsmido y produccin de toxina no se ha podido establecer en muchos casos. El caso con ms evidencia de la relacin plsmido-toxina es el de Clostridium tetani donde puede afirmarse que la toxina tetnica est codificada en un plsmido. Plsmidos que codifican la resistencia a los antibiticos. Existen evidencias de que entre diferentes especies de Clostridium, Bacteroides y cocos anaerobios existen plsmidos de diferente tamao que codifican la resistencia a macrlidos, tetraciclinas y cloramfenicol.
FACTORES DE VIRULENCIA
Se pueden separar en dos categoras segn su importancia. Por un lado existen las poderosas toxinas producidas por los clostridios; por otro, una serie de estructuras y sustancias de mucho menor poder patgeno que se observan en varias especies de microorganismos no esporulados. Se conocen los lipopolisacridos de superficie de varias especies de Fusobacterium, Veillonella y Bacteroides. Estas sustancias tienen una actividad endotoxina similar a las de los bacilos gramnegativos facultativos. Su actividad es algo menos potente pero se ha demostrado su capacidad (en Bacteroides) de participar en la produccin de abscesos y de causar hipercoagulabilidad. El polisacrido capsular de Bacteroides del grupo fragilis es otro factor de virulencia importante, ya que se comporta en forma similar a las cpsulas de otras bacterias, es decir, le confiere al germen la lanza y el escudo en cuanto favorece su poder invasivo y dificulta la accin defensiva de los leucocitos polimorfonucleares. Aun ms, est claramente demostrada su participacin en la formacin de abscesos. Diversas enzimas producidas por los microorganismos anaerobios deben considerarse como
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factores de virulencia: colagenasas, hialuronidasas, DNAsas, elastasas, heparinasas son las principales. Tambin deben incluirse aquellas enzimas que protegen contra la accin letal del O2 tales como catalasa y superxido-dismutasa, en cuanto permiten la sobrevida del germen en un ambiente adverso hasta que se presenten las condiciones favorables. Estos factores de virulencia no deben considerarse como toxinas.
EPIDEMIOLOGA
Las bacterias anaerobias estn diseminadas en la naturaleza. La mayora de las bacterias anaerobias que causan infecciones en humanos son parte de la flora normal de piel y mucosas, superando en cantidad a las bacterias facultativas en el intestino por un factor de 1000:1, mientras que en piel, boca, vas areas superiores y tracto genital inferior femenino la relacin anaerobios-facultativos es de 5-10:1. Otros patgenos anaerobios como Clostridium botulinum y Clostridium tetani se encuentran en suelos y no son considerados parte de la flora humana. Aunque la transmisin persona-persona de C. difficile entre los pacientes hospitalizados representa un gran problema, la mayora de las infecciones por anaerobios ocurren cuando microorganismos de la flora normal del paciente acceden a un sitio normalmente estril como resultado de la ruptura de alguna barrera anatmica. Por esto el conocimiento de esta flora normal es importante pues nos permite sospechar qu microorganismos pueden estar involucrados en determinado proceso infeccioso y en consecuencia, establecer una antibioticoterapia emprica racional, as como seleccionar los medios de cultivo apropiados para el aislamiento e identificacin bacterianos. La tabla 1 muestra la frecuencia de los microorganismos anaerobios ms comunes como flora normal humana en diferentes localizaciones.
Tabla 1. Incidencia de las bacterias anaerobias como ora normal humana
Tracto res- Boca piratorio superior Bacilos grampositivos esporulados Clostridium 0 0 1 Bacilos grampositivos no esporulados Actinomyces 0 2 2 Bifidobacterium Eubacterium Lactobacillus* Propionibacterium Bacilos gramnegativos Bacteroides Fusobacterium Cocos Gram positivos Cocos Gram negativos 0 1 0 3-4 0 0 2 0 0 1 0 2 2 2 2 2 2 2 2 1 3-4 3-4 3-4 3-4 Piel Intestino Genitales externos Uretra Vagina
3-4 1 1 3-4 2 1 2 2 3-4 2
0 0 0 d 0 d 2 2 2 0
1 0 0 d 1 0 2 2 1 d
1 0 2 1 3-4 2 2 1 2 2
Tracto respiratorio superior incluye vas nasales, nasofaringe, orofaringe y amgdalas.(*) Incluye anaerobios, facultativos y microaerfilos, (d=desconocido) (0=no encontrados o raros) (1=hallazgo irregular) (2=habitualmente presentes) (3-4=presentes en gran nmero).
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RECOLECCIN DE MUESTRAS
Teniendo en cuenta que los anaerobios estn presentes en gran nmero en prcticamente toda la superficie cutaneomucosa, es difcil muchas veces evitar la contaminacin de la muestras con estos microorganismos. Es por esto que las siguientes muestras son inaceptables para cultivar en anaerobiosis: Exudado farngeo, nasofarngeo o bucal. Expectoracin. Secreciones obtenidas por aspiracin oro o nasotraqueal. Cepillado o lavado bronquial (salvo el obtenido por catter de doble luz). Contenido gstrico e intestinal (salvo excepciones). Materias fecales (salvo para la bsqueda de C. difficile) Exudado rectal. Orina obtenida por sonda o espontneamente. Exudados vaginales y cervicales. Exudado uretral. La expectoracin no debe cultivarse en anaerobiosis porque el esputo se contamina con la flora anaerobia normal de la faringe y la boca en su pasaje al exterior; igualmente pasa con el esputo obtenido por fibroscopa o los aspirados nasotraqueales ya que el tubo arrastra en su introduccin flora normal en su extremo distal. La orina emitida espontneamente o con sonda se contamina por la colonizacin natural de la porcin distal de la uretra y el meato, o por la colonizacin de la sonda. Si existen catteres suprapbicos o renales pueden utilizarse para tomar la muestra con resultados aceptables. Una recoleccin de muestra adecuada debe evitar siempre la ms mnima contaminacin con flora normal. Las muestras ms adecuadas para el cultivo de anaerobios son las siguientes: Bilis. Sangre. Mdula sea. Lquido cefalorraqudeo. Otros fluidos de sitios normalmente estriles (por ej: lquido articular). Lquido de ascitis. Orina obtenida por puncin suprapbica. Tejidos obtenidos por biopsia o autopsia. Lquido pleural obtenido por toracocentesis. Lavado bronquial obtenido con cepillo protegido. Aspirado transtraqueal. Puncin pulmonar transparietal (PPTP). Aspiracin con aguja de abscesos cerrados. Contenido uterino colectado con cepillo protegido.
TRANSPORTE DE MUESTRAS
Otro factor crucial para el xito en el aislamiento de anaerobios es el transporte adecuado de la muestra. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos nocivos del oxgeno atmosfrico durante el tiempo que transcurre entre la extraccin y la siembra anaerbica de la muestra. La primera y ms efectiva medida es correr ya que en ninguna otra ocasin como esta el envo inmediato al laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente dis-
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ponibles en los que se ha sustituido el aire por otro gas, como CO2 o N2, denominados tubos gaseados y que contienen un indicador de anaerobiosis. Dichos tubos sirven para el transporte de muestras lquidas que se inyectan a travs de un tapn de goma luego de eliminar todo el aire de la jeringa y aguja. Un sistema similar sirve para transportar hisopos. Si la muestra es un tejido o una biopsia, esta puede mantenerse en un tubo o recipiente con suero fisiolgico y ste a su vez en una bolsa o sobre de anaerobiosis, que describiremos ms adelante. En casos de extraccin de material con aguja y jeringa, si la demora no supera los 30 minutos puede enviarse el material en la misma jeringa expulsando el aire residual y obturando la aguja con un tapn de goma. Las muestras deben conservarse a temperatura ambiente hasta ser procesadas en el laboratorio ya que la refrigeracin puede oxigenar la muestra.
MTODOS DE CULTIVO
Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubacin en anaerobiosis se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras anaerbicas, bolsas de anaerobiosis y la cmara de anaerobiosis o cmara de guantes. El ltimo mtodo es muy caro, requiere equipamiento complejo, es lento y se usa para estudios de flora normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista prctico las jarras y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los sistemas ms sofisticados y son aceptables para el aislamiento de bacterias anaerobias en el laboratorio clnico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios slidos para la obtencin de aislamientos que permitan la identificacin bacteriana. Jarras de anaerobiosis Es el sistema ms utilizado para generar una atmsfera anaerbica. Consiste en una jarra de plstico con una tapa que cierra hermticamente. La atmsfera anaerobia puede lograrse por dos mtodos diferentes. El ms sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrgeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adicin de agua o por la humedad de las placas de agar. El H2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta reaccin es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra. El segundo mtodo consiste en la extraccin del aire contenido en la jarra a travs de la generacin de vaco, sustituyendo el mismo por otro gas libre de O2 como el nitrgeno. El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases conteniendo generalmente 80-90% de nitrgeno, 5-10% de hidrgeno y 5-10% de CO2. Una tirilla de papel impregnada en azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en su ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis. Bolsas de anaerobiosis Consiste en una bolsa plstica transparente, gas impermeable, un indicador de anaerobiosis (azul de metileno o resarzurina) y un sobre generador de anaerobiosis igual al utilizado para las jarras. Una o dos placas de Petri pueden introducirse antes de sellar la bolsa. Este sistema tiene las ventajas de su economa y practicidad, adems de poder observar directamente si existe crecimiento en las placas de Petri sin abrir el sistema; tambin se puede utilizar para los sistemas de identificacin tipo API-20A. Estas bolsas sirven adems para el transporte de muestras como habamos visto anteriormente.
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IDENTIFICACIN DE LOS ANAEROBIOS
Examen macroscpico de la muestra Al recibir la muestra en el laboratorio debe ser examinada en busca de algunas caractersticas que sugieren la presencia de anaerobios, como: olor ftido, grnulos de azufre (asociados a la presencia de Actinomyces spp., Propionibacterium spp., o Eubacterium nodatum), fluorescencia bajo luz ultravioleta (que ocurre ante la presencia de cepas pigmentadas de Prevotella o Porphyromonas). Tincin de Gram Una caracterstica general de los microorganismos anaerobios es su tendencia a tornarse gramnegativos cuando se aplica la coloracin de Gram, sea por la poca estabilidad frente a la decoloracin lo que los convierte en Gram inestables al examen directo de los materiales, sea porque existe una variacin tintorial en los cultivos bacteriolgicos. Por esto es que pueden realizarse las siguientes modificaciones a la tcnica de la tincin de Gram: efectuar la decoloracin solamente con alcohol etlico prescindiendo de la acetona prolongar el tiempo de contacto con lugol hasta 1 minuto. Cultivo Los medios de cultivo primarios para la siembra de una muestra de anaerobios son varios, pero en general incluyen un medio no selectivo como el agar sangre y algn medio selectivo. Adems otra placa de agar sangre, una de agar chocolate y una de agar MacConkey son inoculadas e incubadas en aerobiosis, ya que la mayora de las infecciones por anaerobios son polimicrobianas e incluyen bacterias aerobias y facultativas. Un medio de cultivo lquido habitualmente caldo tioglicolato se utiliza como medio de enriquecimiento cuando la muestra proviene de un sitio estril. Existen varios medios lquidos comercialmente disponibles para hemocultivos. Algunos contienen (SPS) sodium polyanetol sulfonate, el cual estimula el desarrollo de los anaerobios, aunque al parecer sera inhibidor para Peptococcus anaerobius. Se trata de frascos de 100 ml, al vaco, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digerido trptico de soja o peptonas) y un agente reductor (tiol o tioglicolato). El porcentaje de sangre a inocular es del 5 al 10 % v/v. Los frascos se examinan diariamente buscando turbidez, hemlisis o gas; se consideran negativos definitivamente a los 10 das de incubacin previo subcultivo final. Las placas inoculadas deben ser inmediatamente incubadas en condiciones anaerobias a 37 C durante 48 horas, al cabo de las cuales si no hay desarrollo deben ser incubadas al menos 5 das antes de ser descartadas. Identificacin La morfologa colonial as como la presencia de hemlisis, olor, etc. son algunas caractersticas a tener en cuenta como primera aproximacin a la identificacin. Todas los morfotipos coloniales de la placa de agar sangre incubada en anaerobiosis deben ser examinados con una tincin de Gram y subcultivadas para determinar su aerotolerancia. Para ello cada colonia debe ser subcultivada en una nueva placa de agar sangre en anaerobiosis y en una placa de agar chocolate en CO2. En la placa de agar sangre se colocan los siguientes discos de antibiticos para una identificacin preliminar de los anaerobios y no con fines de probar la susceptibilidad antibitica: kanamicina, colistina, vancomicina. La identificacin completa de los anaerobios es bastante costosa, frecuentemente requiere varios tests bioqumicos, cromatografa gas-lquido de los productos metablicos derivados
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de la fermentacin de la glucosa, y cromatografa de cidos grasos de cadena larga. Es por esto que en general la identificacin completa o confirmatoria queda reservada a laboratorios de referencia. La mayora de los laboratorios clnicos deben conformarse con una identificacin presuntiva que adems es suficiente para guiar la terapia antimicrobiana adecuada. Una agrupacin preliminar de los anaerobios se obtiene de la combinacin de las siguientes caractersticas: origen de la muestra, morfologa microscpica, reaccin al Gram, morfologa colonial, prueba de aerotolerancia. En el diagrama siguiente se esquematizan los pasos a seguir:
Registrar Morfologa de colonias Pigmento Hemlisis Fluorescencia Susceptibilidad a: Vancomicina Kanamicina Colistin SPS Actividad lipasa Actividad lecitinasa Cultivo en placa Realizar Gram Indol Catalasa Test NO3
Susceptibilidad a los antibiticos

La antibioticoterapia de las infecciones por anaerobios es habitualmente emprica ya que los cultivos y el aislamiento son lentos y dificultosos. Por otra parte, las pruebas de sensibilidad realizadas en los laboratorios clnicos no dan resultados confiables. De manera pues, que nos debemos guiar por las pruebas realizadas en los laboratorios de referencia internacionales que aportan datos sobre sensibilidad y nos permiten predecir con un nivel razonable de seguridad cuales son los antibiticos de eleccin para cada germen. Las pruebas de sensibilidad se realizan de forma similar a las de grmenes aerobios.
Bacilos grampositivos no esporulados

Este grupo diverso de microorganismos incluye bacterias anaerobias estrictas y aerotolerantes que forman parte de la flora normal de piel y mucosas. Todos comparten la caracterstica de ser poco virulentos o de escaso poder patgeno, produciendo infecciones oportunistas en el caso de Actinomyces, Mobiluncus, Propionibacterium. Lactobacillus, Eubacterium y Bifidobacterium muy rara vez causan enfermedad.
ACTINOMYCES
Se trata de bacilos grampositivos largos y ramificados, delgados y delicados, bajo ciertas circunstancias, frotis o cultivos pueden fragmentarse simulando bacilos del tipo difteroides. En general son facultativos, aunque crecen mejor en anaerobiosis. A. meyeri es el nico anaerobio estricto. Son capnfilos. Crecen lentamente y en el hospedero suelen producir infecciones crnicas. Forman parte de la flora normal de las mucosas del tracto respiratorio superior, tracto
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digestivo y aparato genital femenino, pero normalmente no estn presentes en la superficie cutnea. La cavidad oral es su hbitat principal. Los microorganismos tienen un bajo potencial de virulencia, por lo tanto producen enfermedad slo cuando las barreras mucosas normales se alteran por traumatismos, ciruga o infeccin. La enfermedad producida por Actinomyces se llama actinomicosis y se caracteriza por el desarrollo de lesiones granulomatosas crnicas que se hacen supurativas y forman abscesos conectados mediante fstulas. En los abscesos y los tractos fistulosos se pueden observar colonias macroscpicas que recuerdan a los granos de arena, llamadas grnulos de azufre por su aspecto amarillo o naranja y estn formadas por masas de microorganismos unidos entre s por fosfato clcico. Las zonas de supuracin estn rodeadas por un tejido fibroso de granulacin lo que da a la superficie que cubre a los tejidos afectados una consistencia dura o de madera. Actimomyces israelii es el patgeno humano ms importante. La actinomicosis es entonces una enfermedad endgena y se clasifica segn los rganos que afecta en: actinomicosis cervicofacial constituye aproximadamente el 50% de los casos de actinomicosis. Ocurre en personas con mala higiene bucal o que han sido sometidas a un procedimiento dental invasivo o a un traumatismo oral. De esta manera los microorganismos presentes en la boca invaden los tejidos enfermos y producen una enfermedad pigena aguda o, ms frecuentemente, un proceso inflamatorio de evolucin lenta, relativamente indoloro, con fibrosis y cicatrizacin, as como con fstulas de drenaje a lo largo del ngulo de la mandbula y del cuello. Producen tambin enfermedad periodontal. actinomicosis torcica se produce por aspiracin del agente desde el tracto respiratorio superior y la boca o por extensin de lesiones cervicofaciales. Al inicio de la enfermedad se produce un absceso pulmonar. Conforme la enfermedad progresa ocurre fistulizacin al exterior a travs de la pared torcica pudiendo interesar costillas y vrtebras. actinomicosis abdominal ocurre en pacientes sometidos a ciruga digestiva o que han sufrido un traumatismo en el intestino. Puede extenderse por todo el abdomen y afectar a cualquier rgano. Es posible la extensin vertebral y la fistulizacin al exterior. actinomicosis plvica puede presentarse como una vaginitis o ms frecuentemente puede haber una gran destruccin de tejidos con formacin de abscesos tubo-ovricos. Se ha descrito infeccin en mujeres que utilizan dispositivos intrauterinos con sintomatologa escasa y sin presencia de grnulos. actinomicosis del sistema nervioso central se produce generalmente por diseminacin hematgena desde otros tejidos infectados, como los pulmones. La manifestacin ms frecuente es un absceso cerebral solitario, pero tambin puede ocasionar meningitis, empiema subdural y abscesos epidurales. La confirmacin en el laboratorio de la actinomicosis es difcil. Si se detectan grnulos de azufre en una fstula o en un tejido, el grnulo se debe aplastar entre dos lminas, teirse y mirarse al microscopio ptico. Se pueden ver en la periferia de los grnulos bacilos grampositivos delgados y ramificados. Actinomyces spp. son exigentes y crecen lentamente en condiciones anaerobias, se pueden tardar 2 semanas o ms en aislar los microorganismos. Las colonias son blancas y tienen una superficie en forma de cpula que se puede volver irregular luego de una incubacin de una semana o ms, lo que recuerda a la parte superior de una muela. Las especies individuales de Actinomyces se pueden diferenciar mediante pruebas bioqumicas. El tratamiento de la actinomicosis implica la asociacin del desbridamiento quirrgico de los tejidos afectados y la administracin prolongada de antibiticos. La penicilina es el
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antibitico de eleccin. El mantenimiento de una buena higiene bucal y el uso de profilaxis antibitica adecuada cuando se realizan maniobras invasivas en la boca o el tubo digestivo disminuyen el riesgo de estas infecciones.
PROPIONIBACTERIUM
Son bacilos grampositivos pequeos que se disponen en cadenas cortas o en agregados. Integrantes de la flora normal de piel (en contraposicin a Actinomyces), conjuntiva, odo externo, orofaringe y aparato genital femenino. Son anaerobios estrictos o aerotolerantes, inmviles, catalasa positivos y capaces de fermentar hidratos de carbono produciendo como principal residuo cido propinico (de ah su nombre). Las especies que se aslan con mayor frecuencia son Propionibacterium acnes, P . granulosum y P . propionicus. P . acnes es responsable del acn en adolescentes y adultos jvenes as como de infecciones oportunistas en pacientes con prtesis (valvulares o articulares) o dispositivos intravasculares. Las propionibacterias se aslan tambin a partir de hemocultivos, pero suele deberse a contaminacin con bacterias de la piel en el sitio de venopuncin. El papel principal de P . acnes en el acn es estimular la respuesta inflamatoria. La produccin de pptidos de bajo peso molcula por parte de los bacilos que habitan en los folculos sebceos atrae a los leucocitos. Luego de fagocitar a los bacilos los fagocitos liberan enzimas hidrolticas que junto a una variedad de toxinas bacterianas como lipasas, proteasas, neuraminidasa e hialuronidasa estimulan la respuesta inflamatoria lo que lleva a la destruccin del folculo. Las propionibacterias crecen en la mayora de los medios de cultivo pero puede tardarse entre 2 y 5 das en evidenciar el crecimiento.
LACTOBACILLUS
Se trata de bacilos grampositivos largos, de bordes paralelos y extremos rectangulares, facultativos, microaerfilos o anaerobios estrictos. No producen la enzima catalasa ni citocromos. Producen cido lctico como principal producto de fermentacin y tienen requerimientos nutricionales complejos. Llevan a cabo la fermentacin homolctica a travs de la va de Embden-Meyerhof o la fermentacin heterolctica a travs de la va de las pentosas fosfato. Su crecimiento es ptimo en condiciones cidas (pH entre 4.5 a 6.4). Se encuentran en la superficie de las plantas as como en la carne, el agua, frutas y otros productos alimenticios. Son indispensables para la industria del alimento donde se utilizan para la fermentacin de alimentos y bebidas, como pickles, cerveza, vino, jugos, quesos y yogurt. En el hombre se encuentran formando parte de la flora normal de la boca, estmago, intestino y tracto genitourinario (constituyen la flora vaginal predominante en mujeres en edad reproductiva). Son los microorganismos ms frecuentes en la uretra, por lo tanto su recuperacin en los urocultivos procede invariablemente de la contaminacin de la muestra. La razn por la cual los lactobacilos rara vez producen infecciones del tracto urinario es su incapacidad para crecer en la orina. Generalmente no son patgenos. Por el contrario, su efecto beneficioso ha sido demostrado cuando se administran en forma de probiticos (suplemento alimentario que contiene microorganismos vivos con efectos beneficiosos en el husped al mejorar el balance microbiano intestinal) en la prevencin y el tratamiento de algunas enfermedades como la diarrea aguda infantil, diarrea asociada a antibiticos, diarrea del viajero, colitis alrgicas y probablemente otras como la candidiasis vaginal, etc. De todas maneras pueden invadir el torrente circulatorio ocasionando bacteriemias transitorias de origen genitourinario (por ej: despus del parto o de un procedimiento ginecolgico), endocarditis y sepsis en pacientes inmunodeprimidos.
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Son uniformemente resistentes a la vancomicina. Se obtiene actividad antimicrobianas sinrgica mediante la combinacin de penicilina ms un aminoglucsido. Mobiluncus Los miembros de este gnero bacteriano son bacilos gramvariables o gramnegativos, a pesar de tener una pared celular grampositiva, carente de lipopolisacrido, y sensibles a vancomicina, clindamicina, eritromicina y ampicilina, pero resistentes a colistina. Bacilos curvos con extremos en forma de punta, son anaerobios estrictos. Son exigentes desde el punto de vista nutricional y crecen lentamente incluso en medios enriquecidos. En humanos se han identificado dos especies, Mobilunucs mulieris y M. curtisii. Los microorganismos colonizan el tracto genital femenino en un nmero bajo, pero son abundantes en las mujeres con vaginosis bacteriana. Su aspecto microscpico es una marcador til para esta enfermedad, pero no est claro el papel preciso de estos microorganismos en la patognesis de la vaginosis bacteriana. Bifidobacterium y Eubacterium Los microorganismos pertenecientes a estos dos gneros se encuentran con frecuencia en la orofaringe, intestino grueso y vagina. Estas bacterias se pueden aislar en las muestras clnicas pero tienen un potencial de virulencia muy bajo y generalmente se aslan como contaminantes sin significacin clnica. La confirmacin de su papel etiolgico en una infeccin requiere el aislamiento repetido del microorganismo a partir de mltiples muestras y la ausencia de otros microorganismos patgenos.
Cocos grampositivos
PEPTOSTREPTOCOCCUS
A pesar del nombre del gnero la morfologa de estos grmenes incluye formas en pares, ttradas, racimos, y cadenas. Un estudio microscpico cuidadoso muestra a estos cocos con tamao irregular y alguna decoloracin parcial, lo que permite diferenciarlos de sus similares aerobios. Forman parte de la flora de la boca, intestino y genitales. Se encuentran involucrados en infecciones pleuropulmonares, abscesos, infecciones ginecolgicas, sinusitis. Casi constantemente son sensibles a los betalactmicos.
Bacilos grampositivos esporulados

CLOSTRIDIUM
Los clostridios son bacilos anaerobios formadores de esporas y en general Gram positivos. Casi todas las especies son anaerobias obligadas pero unas pocas especies son aerotolerantes. Las especies patgenas producen toxinas solubles, algunas de las cuales son extremadamente potentes. Los clostridios estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se encuentran en los suelos y en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y los animales. Los clostridios patgenos pueden dividirse para su estudio en cuatro grandes grupos de acuerdo al tipo de enfermedad que producen: 1. Los clostridios histotxicos tpicamente causan una variedad de infecciones tisulares, en general luego de heridas abiertas y otras lesiones traumticas. 2. Los clostridios enterotoxignicos producen intoxicacin alimentaria y formas ms severas de enfermedad gastrointestinal.
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3. Clostridium tetani, agente causal del ttanos, produce la enfermedad por medio de una potente exotoxina que es elaborada durante la proliferacin limitada en los tejidos. 4. Clostridium botulinum es el agente etiolgico del botulismo, enfermedad que resulta de la ingestin de una poderosa exotoxina formada previamente por los microorganismos en alimentos contaminados. Clostridios histotxicos Pueden ocasionar una severa infeccin a nivel muscular denominada mionecrosis por clostridios (antes conocida como gangrena gaseosa o miositis por clostridios). Clostridium perfringens es la especie ms importante responsable del 80-90% de los casos de mionecrosis. C. novyi, C. septicum, C. histolyticum, C. sordellii, C. fallas tambin ocasionan estas infecciones. Todos ellos producen una variedad de toxinas con potencias diferentes; para cada especie las toxinas se designan con letras griegas. Ninguno de ellos se comporta como un patgeno altamente invasivo, sino que cada uno juega un papel oportunista que requiere un conjunto de condiciones en los tejidos para que se inicie la infeccin. Determinan un espectro de compromiso clnico en infecciones de heridas que va desde la simple contaminacin hasta la mionecrosis. Dada su amplia distribucin en la naturaleza, la contaminacin de heridas es muy comn (39%). Sin embargo una pequea proporcin de heridas contaminadas evoluciona a la verdadera mionecrosis. Por lo tanto el aislamiento de clostridios histotxicos a partir de heridas o material de drenaje no indica por s mismo la presencia de mionecrosis: el diagnstico de dicha afeccin es clnico.
Clostridium perfringens
Existen cinco tipos diferentes: A, B, C, D y E, que se diferencian por la produccin de cuatro toxinas letales principales: alfa, beta, epsilon y theta. C. perfringens tipo A es el principal responsable de enfermedad humana; produce alfa toxina y otras de menor poder (omega, kappa, micrn); habita suelos e integra la flora normal del tracto gastrointestinal de hombre y animales. Los tipos B, C, D y E existen en el tracto gastrointestinal de animales y slo de forma ocasional en el hombre. Producen una variedad de enfermedades en animales domsticos; no habitan de forma permanente los suelos como lo hace el tipo A.
BIOLOGA
DEL MICROORGANISMO
Es un bacilo netamente grampositivo, corto y grueso, de bordes redondeados, con formas hasta cocoides. En los frotis directos de muestras clnicas no se observan esporos y es caracterstica la ausencia de clulas eucariotas debido a la intensa citlisis txica; pueden observarse cpsulas. En los frotis realizados a partir de cultivos pueden observarse esporos medianos o subterminales que no deforman el soma vegetativo. Es anaerobio aerotolerante, algunas cepas producen la enzima superxido dismutasa. Desarrolla a un pH variable (5.5 a 8) y en un rango de temperatura que va de 20 C a 50 C. Es el nico inmvil de los clostridios patgenos. Crece rpido en agar sangre, pudiendo observarse colonias a las 24-48 hs de incubacin.
ESTRUCTURA
ANTIGNICA
C. perfringens produce por lo menos 12 exotoxinas diferentes, de naturaleza proteica y antignicas. De los cuatro antgenos letales principales, alfa es la ms importante y es producida por
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los cinco tipos de C. perfringens. Los antgenos menores son enzimas y no son letales: antgeno K es una colagenasa, antgeno V es una desoxirribonucleasa, antgeno u tiene actividad hialuronidasa. La serotipificacin de acuerdo a antgenos somticos ha tenido aplicacin en estudios epidemiolgicos de brotes de intoxicacin alimentaria, donde existe una correlacin entre los serotipos de C. perfringens de tipo A aislado en heces de pacientes y los serotipos recuperados de alimentos contaminados.
FACTORES
DE VIRULENCIA
La toxina alfa posee actividad letal, dermonecrtica y hemoltica; es una lecitinasa C o fosfolipasa C (degrada la lecitina en fosforilcolina y un diglicrido), tambin hidroliza la esfingomielina; es activada por Ca++ y Mg++. Es un antgeno excelente, tanto que la proteccin o el tratamiento in vivo dependen totalmente del ttulo antitoxina alfa. In vivo acta sobre complejos lipoproticos que contienen lecitina en la membrana celular y probablemente sobre la membrana mitocondrial; produce adems alteracin de las membranas de eritrocitos, plaquetas, leucocitos y clulas endoteliales ocasionando lisis de estas clulas; aumenta la permeabilidad vascular con hemlisis masiva y hemorragia, as como destruccin tisular y edema observados durante la enfermedad. Recientemente se ha descrito su comportamiento como superantgeno (es decir que es capaz de estimular la proliferacin policlonal de linfocitos T). La toxina beta tiene actividad necrotizante (enteritis necrotizante) e induce hipertensin por liberacin de catecolaminas. La toxina epsilon aumenta la permeabilidad vascular de la pared gastrointestinal. La toxina theta posee actividad necrotizante e induce un aumento de la permeabilidad vascular. La enterotoxina producida por cepas de C. perfringens principalmente tipo A, pero tambin de los tipos C y D, es una protena termolbil producida en el colon y liberada durante la esporulacin. Posee estructura y funcin similar a las toxinas LT y CT de E. coli y V. cholerae respectivamente. Tambin tiene cierta actividad citotxica. Produce enteritis, la dosis infectante es elevada. Los antgenos omega, kappa y mu tienen un papel auxiliar en la diseminacin local de la infeccin a travs de los tejidos y en la provisin de nutrientes para la proliferacin de los microorganismos; en bajas concentraciones la toxina omega es txica para los leucocitos humanos y puede ser responsable de la ausencia inusual de clulas polimorfonucleares en el tejido muscular infectado.
EPIDEMIOLOGA
C. perfringens es un microorganismo ubicuo: el tipo A (principal responsable de enfermedad en humanos) se encuentra en el tracto gastrointestinal de hombre y animales, y son numerosos en suelos, tanto las formas vegetativas como las esporuladas; tambin estn en aguas contaminadas con heces. La infeccin por estos microorganismos puede tener un origen endgeno o exgeno. En lesiones traumticas la fuente de clostridios en general es la tierra presente en las heridas (la incidencia de contaminacin e infeccin de heridas depende de la concentracin de C. perfringens en los suelos, lo que vara segn la localizacin geogrfica). En las infecciones endgenas la fuente de clostridios es la flora fecal presente en la piel
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o las vestimentas introducidas en las heridas, o clostridios que escapan del intestino cuando este es perforado, ya sea por enfermedad, lesiones traumticas o intervenciones quirrgicas.
PATOGENIA
Los clostridios son incapaces de iniciar una infeccin en tejidos sanos (Eh normal). Factores primordiales que predisponen a la mionecrosis son la isquemia y necrosis muscular, que proporcionan una tensin de O2 y un potencial de oxido-reduccin disminuidos, condiciones necesarias para la proliferacin de estos microorganismos. Esto explica que an con alta incidencia de contaminacin de heridas, la incidencia de mionecrosis contine siendo baja. En reas con menor tensin de O2 en el msculo, se acumula cido lctico y el pH desciende. La combinacin de la disminucin del Eh y la cada del pH, puede activar enzimas proteolticas endgenas y dar como resultado autlisis tisular. Esta liberacin de nutrientes y la disminucin del potencial de xido-reduccin proporcionan condiciones adecuadas para el desarrollo de las microorganismos anaerobios. La proliferacin de los microorganismos se acompaa de produccin de toxinas solubles. En la mionecrosis estas toxinas difunden desde el sitio inicial, proliferan y atacan msculo y tejidos circundantes sanos. Estos tejidos son destruidos por las toxinas permitiendo la diseminacin de la infeccin hacia nuevas reas necrticas. El lquido de edema (producido por accin de la toxina y enzimas de clostridios sobre los tejidos) y el gas del metabolismo bacteriano, aumentan la presin del compartimiento muscular agravando la isquemia, disminuyendo an ms el potencial de xido-reduccin y el pH, proporcionando nuevas reas adecuadas para la proliferacin de clostridios.
ESPECTRO
DE MANIFESTACIONES CLNICAS
Contaminacin simple de heridas. Celulitis, fascitis y otras infecciones de partes blandas. Mionecrosis por clostridios. Infecciones uterinas. Septicemia por clostridios. Intoxicacin alimentaria. Enteritis necrotizante.
E IDENTIFICACIN
AISLAMIENTO
Tincin de Gram: el examen directo muestra bacilos Gram positivos rectos sin esporas ni leucocitos Cultivo: en agar sangre incubado en anaerobiosis a 37 C durante 24-48 h, colonias planas extendidas, 2-4 mm dimetro Patrn caracterstico cuando crece en agar sangre: hemlisis doble, compuesta por una estrecha zona de hemlisis completa producida por la toxina alfa y una zona ms amplia de hemlisis incompleta producida por la toxina omega. B-hemlisis sinrgica al sembrarlo junto a S. agalactiae: prueba CAMP inversa Precipitacin (opalescencia) en medios que contienen lecitina, causada por la toxina alfa e inhibida de forma especfica por la antitoxina. Fermentacin tormentosa en medios con leche: la fermentacin de la lactosa produce gran cantidad de cido, lo que provoca la coagulacin de las protenas (casena); luego el cogulo es alterado y roto por el gran volumen de gas formado a partir de la fermentacin
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de la lactosa (esta reaccin tambin es producida por otras especies como C. septicum y otras) Produccin de gas a partir de glucosa, fermentan lactosa, produccin de cido a partir de glucosa y lactosa, etc.
ANTIBITICA
SENSIBILIDAD
Todos los microorganismos del gnero Clostridium son uniformemente sensibles a penicilina. Clostridios enterotoxignicos
Intoxicacin alimentaria
C. perfringens es la tercera causa de toxiinfeccin alimentaria bacteriana despus de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus. Es causada por C. perfringens, usualmente cepas tipo A, productoras de enterotoxina. Dicha toxina es una protena que se comporta como un superantgeno promoviendo la liberacin de mediadores de la inflamacin en forma masiva.
EPIDEMIOLOGA
La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un elevado nmero de microorganismos productores de enterotoxina (100 millones). Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, suina, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se produce la esporulacin y la liberacin de enterotoxinas. No son comunes los brotes familiares pero s los producidos a travs de alimentos preparados comercialmente destinados a restaurantes o instituciones. En Uruguay segn datos recogidos por el Sistema de Informacin Regional para la Vigilancia Epidemiolgica de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) se han declarado 3 brotes en el perodo 1993-2001, con 37 individuos afectados, no registrndose muertes. Los alimentos implicados fueron carnes rojas y carnes de aves. Dos ocurrieron en comedores y uno en una vivienda.
PATOGENIA
Todos los sntomas son atribuibles a la enterotoxina, que en general se sintetiza durante la esporulacin de los microorganismos en el intestino delgado. La enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo e induce una alteracin de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una prdida de iones y metabolitos. Esta prdida electroltica altera la funcin metablica intracelular provocando dao morfolgico y eventual lisis.
CLNICA
Entre 7 y 15 horas luego de la ingestin de alimento contaminado los pacientes experimentan dolor abdominal agudo y diarrea; estos sntomas duran 12-18 horas y la recuperacin suele ser completa, salvo raros casos de muerte en pacientes de edad avanzada y personas debilitadas.
DIAGNSTICO
Para confirmar el diagnstico debe recuperarse el agente del alimento y del paciente. El diagnstico se establece mediante el recuento de ms de 100.000 UFC (unidades formadoras de colonias) por gramo de alimento o 1.000.000 UFC por gramo de materia fecal en el primer da de enfermedad. Tambin puede buscarse la presencia de enterotoxina en las heces utilizando
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ELISA o hemaglutinacin pasiva reversa; se han desarrollado adems tcnicas moleculares para la deteccin de estos agentes
TRATAMIENTO
Y PREVENCIN
En general no requiere tratamiento antimicrobiano, slo medidas de sostn. Como accin preventiva debe ser mantenida una refrigeracin adecuada de los alimentos cocidos de no ser consumidos de inmediato.
Enteritis necrotizante
Es causada por C. perfringens tipo C y es ms severa que la intoxicacin alimentaria causada por el tipo A. Tiene un perodo de incubacin de menos de 24h luego del cual aparecen dolor abdominal intenso y diarrea; en algunos pacientes ocurre prdida de la mucosa intestinal con enterorragia. Puede ser letal con shock u oclusin intestinal y peritonitis. La toxina beta producida por C. perfringens tipo C es responsable de los sntomas; la administracin de antitoxina reduce la mortalidad.
Enterocolitis seudomembranosa
Clostridium difficile es el microorganismo responsable de esta entidad. Se trata de una gastroenteritis asociada a antibioticoterapia de severidad variable desde diarrea autolimitada a colitis seudomembranosa grave, potencialmente mortal. C. difficile es un microorganismo anaerobio obligado, sacaroltico y dbilmente proteoltico, a travs de la fermentacin cida produce un conjunto de productos detectables por medio de cromatografa gas-lquida. Es parte de la flora normal del intestino del hombre y los animales.
FACTORES
DE VIRULENCIA
C. difficile produce dos toxinas proteicas principales, antignicamente diferentes, ambas implicadas en la patogenia: la toxina A, una enterotoxina potente y la toxina B citotxica. La toxina A o enterotoxina es quimiotctica para neutrfilos, produce infiltracin de leucocitos polimorfonucleares en la lmina propia del leon e induce la liberacin de citoquinas por parte de macrfagos y polimorfonucleares, potenciando la respuesta inflamatoria a nivel local, con la resultante hipersecrecin de lquidos y necrosis hemorrgica. La citotoxina o toxina B depolimeriza la actina ocasionando destruccin del citoesqueleto celular. Otros factores de virulencia: factor de adherencia o adhesina (in vitro se une especficamente a clulas del colon humano), una hialuronidasa que hidroliza el cido hialurnico del tejido conjuntivo, favoreciendo la diseminacin; la formacin de endosporas permite la supervivencia de estos moo en el medio ambiente hospitalario durante meses.
PATOGENIA
El tratamiento antibitico extenso altera la flora entrica normal, permitiendo la proliferacin de C. difficile relativamente resistentes o la colonizacin exgena (las cepas infecciosas de C. difficile pueden ser endgenas o exgenas); los antibiticos ms a menudo vinculados a colitis seudomembranosa son ampicilina, clindamicina y cefalosporinas.
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TRATAMIENTO
La interrupcin del antibitico usado suele alcanzar para el caso de enfermedad leve. Los cuadros graves pueden tratarse con metronidazol o vancomicina va oral. Puede haber recidivas por esporas resistentes al tratamiento antibitico.
PREVENCIN
Es importante conocer el potencial para generar enfermedad gastrointestinal de la administracin de antibiticos. Ante la presencia de diarrea sin otra causa evidente en pacientes que estn recibiendo antibiticos es aconsejable suspender el tratamiento antibitico o sustituirlo por otro que se asocie menos con diarrea y colitis. Clostridium tetani Agente causal del ttanos, una enfermedad rara hoy en da en pases desarrollados. Sin embargo, en pases pobres, el ttanos neonatal tiene un impacto significativo sobre la mortalidad global. En el adulto la enfermedad ocurre clsicamente luego de una herida punzante y se caracteriza por espasmos musculares, el ms tpico de los cuales es el del maxilar inferior, de ah el trmino de trismus. La naturaleza anaerobia de C. tetani fue responsable en parte de la demora en su descubrimiento y aislamiento, que fue logrado en 1889 por Kitasato. As se lleg al descubrimiento de la toxina tetnica y a la deteccin poco tiempo despus de la antitoxina especfica.
Biologa del microorganismo
C. tetani es un bacilo largo y delgado en comparacin con otros clostridios patgenos. Son grampositivos, aunque como todas las bacterias anaerobias tienden a tornarse Gram variables, sobre todo en los cultivos ms viejos. Producen esporas terminales de mayor dimetro que la clula vegetativa, dando la caracterstica imagen de palillo de tambor. Tienen flagelos peritricos que le confieren activa motilidad. Es anaerobio estricto, difcil de cultivar por su extremada sensibilidad al oxgeno. Posee requerimientos nutricionales complejos (entre ellos ciertos aminocidos y vitaminas); es capaz de crecer en agar sangre y en caldo con carne cocida. No fermenta ningn hidrato de carbono, tiene escasa actividad metablica.
Poseen antgenos flagelares o antgenos H (10 serotipos) y antgeno somtico o antgeno O (un solo serogrupo). Todas las cepas de C. tetani producen un solo tipo antignico de toxina y su efecto es neutralizado por una sola antitoxina lo que tiene una enorme importancia prctica en cuanto a la profilaxis de esta enfermedad.
Toxina tetnica: todos los sntomas del ttanos son atribuibles a una neurotoxina sumamente txica, la tetanospasmina, toxina intracelular liberada por autlisis celular. El gen estructural de la toxina se localiza en un plsmido. Es una protena termolbil (inactivada por calentamiento a 60C durante 20 min). Se trata de una toxina tipo A-B. Por analoga con estas toxinas, se cree que la toxina tetnica es captada por endocitosis mediada por receptores y que el bajo pH presente en al luz endosmica hace que la toxina se inserte en la bicapa lipdica y atraviese la membrana endosmica para llegar al citoplasma. La toxicidad de la toxina tetnica intacta se asocia con la cadena liviana A. El fragmento B purificado de la cadena
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pesada forma canales en las membranas lipdicas y posee el sitio de unin a los receptores celulares (sitio fijador de ganglisidos). La toxina tetnica es una de las sustancias ms txicas que se conocen (slo la toxina botulnica y la toxina Shiga tienen una toxicidad comparable). El toxoide producido a partir del tratamiento de la toxina con formaldehdo es til para la inmunizacin contra la enfermedad. El toxoide no es txico pero conserva los determinantes antignicos de la toxina tetnica que dan origen a los anticuerpos antitoxina. La molcula de la toxina tetnica contiene 20 determinantes antignicos diferentes como mnimo, y los anticuerpos contra por lo menos 9 de ellos son capaces de neutralizar la toxicidad de la toxina. La tetanolisina es una hemolisina oxgeno lbil relacionada serolgicamente con hemolisinas de otros clostridios y con la estreptolisina O de S. pyogenes. Las esporas de C. tetani son capaces de persistir en el medio ambiente (suelo, tracto gastrointestinal de humanos y animales) durante meses o aos.
Epidemiologa
Si bien la incidencia del ttanos ha disminuido en las regiones del mundo donde se alcanza un alto porcentaje de inmunizacin de la poblacin, contina siendo una enfermedad comn y no controlada en algunos pases en desarrollo.
Patogenia
Las esporas de C. tetani son ubicuas: se recuperan en 20-64% de muestras de suelos recolectadas para cultivos as como del tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Si se efectan cuidadosos cultivos de material de heridas traumticas la presencia de C. tetani tambin puede demostrarse con mucha frecuencia. Sin embargo es bastante raro que se desarrolle ttanos a partir de estas heridas. El aspecto ms significativo de la patogenia del ttanos es el contexto de la herida donde el potencial de oxido-reduccin debe tener el equilibrio apropiado para permitir la multiplicacin del microoorganismo y la toxignesis. Clsicamente las heridas halladas en la prctica son las heridas punzantes producidas por clavos, astillas o espinas, pero tambin en otros contextos como las fracturas expuestas, el uso drogas intravenosas, las lceras de decbito y las varicosas, las otitis externas y las extracciones dentales, se dan las condiciones adecuadas. La forma ms temida de ttanos, el ttanos neonatal es una causa importante de morbimortalidad en pases en desarrollo y es producida por el corte del cordn umbilical con instrumentos no estriles o por el cuidado inapropiado del mun umbilical. Un factor contribuyente importante es la presencia de bacterias aerobias que pueden proliferar hasta el punto de eliminar el O2 y luego continuar proliferando de forma facultativa en anaerobiosis. Esta proliferacin puede reducir el Eh hasta el punto en el cual las esporas tetnicas pueden germinar. Despus de la germinacin de las esporas se elabora la toxina, que ingresa en el sistema nervioso central. La infeccin por C. tetani permanece localizada con reacciones mnimas a menos que se encuentren otros microorganismos. La forma de accin de la toxina involucra la unin a ganglisidos GT1 en las membranas de las terminaciones nerviosas perifricas a travs la subunidad B, seguida de la internalizacin de la subunidad A y su desplazamiento hacia el sistema nervioso central por transporte axonal retrgrado. Cuando llega a la regin del ncleo es transportada hacia las interneuronas inhibidoras, donde inhibe la liberacin de neurotransmisores inhibidores (GABA, glicina) conduciendo a una actividad sinptica excitadora descontrolada dando lugar a una parlisis espstica. Esta inhibicin de la liberacin de sustancias inhibitorias permite que prevalezcan los msculos ms poderosos: espasmos musculares de los maseteros con trismus, flexin de
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las extremidades superiores y extensin de las inferiores con arqueamiento de la espalda (opisttonos).
Ttanos generalizado: afectacin maseteros o trismo, dando lugar a la risa sardnica, salivacin, sudoracin, irritabilidad y espasmos persistentes de los msculos de la espalda (opisttonos). Adems puede haber afectacin del sistema nervioso autnomo dando lugar a arritmias cardacas, fluctuaciones de la presin arterial, sudoracin intensa y deshidratacin. Ttanos localizado: afecta la musculatura slo de la zona de infeccin primaria.
Aislamiento e identificacin
Para su aislamiento debe sembrarse de inmediato en medios slidos prerreducidos y medios de cultivo lquidos para anaerobios. Las colonias son translcidas con borde que avanza filamentoso y delicado, betahemolticas. La prueba final para la identificacin de C. tetani es la demostracin de la produccin de toxina tetnica in vivo cuando se inyecta en ratones, y la neutralizacin de su toxicidad en ratones previamente inoculados con antitoxina.
Tratamiento
Se basa en el debridamiento de la herida y la administracin de penicilina (en pacientes alrgicos se puede administrar tetraciclinas o metronidazol), la inmunizacin pasiva con inmunoglobulina antitetnica humana (que neutraliza la tetanoespasmina libre) y la inmunizacin activa con toxoide tetnico. Para los espasmos musculares se utilizan drogas como curare o, en tetanoespasmos leves, barbitricos y diazepam, adems del soporte de las funciones vitales.
Prevencin
Se realiza a travs de la vacunacin con toxoide tetnico (toxina tratada con formalina); se administran 3 dosis al principio y luego dosis de refuerzo cada 10 aos. La inmunizacin de embarazadas en el tercer trimestre del embarazo asegura la inmunizacin pasiva del neonato (mediante el pasaje de anticuerpos maternos a travs de la placenta), disminuyendo el riesgo de ttanos neonatal. La enfermedad natural no confiere inmunidad contra infecciones posteriores, por lo tanto los pacientes que se recuperan de la enfermedad deben ser inmunizados activamente para prevenir la reinfeccin exgena o la recurrencia a partir de esporas retenidas dentro del organismo. Clostridium botulinum C. botulinum produce la exotoxina ms potente que se conoce, que es una neurotoxina causante del botulismo, una severa enfermedad neuroparaltica caracterizada por comienzo sbito y evolucin rpida que culmina en un parlisis marcada y un paro respiratorio. La enfermedad es rara en el ser humano, muy comn en los animales. A diferencia de la toxina tetnica, hay ocho toxinas botulnicas serolgicamente diferentes, denominadas A, B, C1, C2, D, E, F, G. La forma mas comn de botulismo es el transmitido por los alimentos, una intoxicacin causada por la ingestin de la toxina botulnica preformada en los alimentos contaminados. El empleo del autoclave con temperaturas lo bastante elevadas como para destruir las esporas en la industria del enlatado ha reducido la importancia relativa de los alimentos comercialmente enlatados como fuente de la enfermedad, excepto cuando se producen errores en el proce-
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dimiento. Dado que la toxina es destruida por el calor, la coccin de rutina de los alimentos enlatados en el hogar limita la frecuencia de ste tipo de intoxicacin. Adems del botulismo transmitido por los alimentos la enfermedad tambin ocurre cuando la toxina es producida por miembros de la especie C. botulinum que contaminan heridas traumticas (botulismo de las heridas) y cuando se elabora la toxina en el tracto gastrointestinal de los lactantes (botulismo infantil o de los lactantes).
Biologa del microorganismo
Son bacilos grampositivos largos, rectos a levemente curvos, con extremos redondeados. Forman esporas ovales y subterminales que distienden los bacilos. Poseen flagelos peritricos que le confieren movilidad. Son anaerobios estrictos, con requerimientos nutricionales complejos. Existen siete tipos de toxina botulnica (A a G). Es posible dividir a los microorganismos en cuatro tipos (I a IV) segn la toxina que producen y su actividad proteoltica. La enfermedad humana est vinculada a los tipos I y II y a la toxina A principalmente. La resistencia al calor de la espora es mayor que la de cualquier otro microorganismo anaerobio (sobreviven varias horas a 100 C y hasta 10min a 110 C). Las esporas son tambin resistentes a las radiaciones y pueden sobrevivir a 190 C.
C. botulinum ha sido dividido en ocho tipos serolgicamente diferentes sobre la base del tipo de toxina producida.
La toxina botulnica es una protena tipo A-B con una subunidad A o cadena ligera A que posee actividad neurotxica y una o ms subunidades B o cadenas pesadas B no txicas, responsables de la unin al receptor celular y posterior internalizacin de A; adems protege a la subunidad A de la inactivacin por el pH gstrico. Se clasifica como una exotoxina debido a su potencia y antigenicidad elevadas, sin embargo se diferencia de una exotoxina clsica por cuanto no es liberada durante la vida del microorganismo sino que aparece en el medio solo despus de la muerte y la autlisis de ste. La toxina es sintetizada como un polipptido de cadena nica; el clivaje o la formacin de muescas en la molcula por medio de proteasas bacterianas en el curso de su liberacin de la clula dan como resultado una molcula compuesta por una cadena pesada y una cadena liviana unida por enlaces no covalente y un puente de disulfuro. La produccin de la toxina botulnica esta dirigida por bacterifagos especficos.
Patogenia
Los casos de botulismo se clasifican en cuatro categoras: 1. El botulismo transmitido por los alimentos es un intoxicacin alimentara letal que es resultado de la ingestin de la neurotoxina en alimentos procesados de manera incompleta y contaminados por los microorganismos. 2. El botulismo infantil relacionado con la ingestin por los lactantes de esporas de C. botulinum, la multiplicacin de los microorganismos en el tracto gastrointestinal y la posterior absorcin de la toxina. 3. El botulismo de las heridas, el menos comn, enfermedad neuroparaltica asociada con las heridas, las cuales muestran pocas evidencias clnicas de infeccin activa.
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4. El botulismo no clasificado se produce en las personas de ms de un ao de vida que tiene sntomas de botulismo clnico, sin un vehculo de transmisin identificable. Las manifestaciones clnicas del botulismo son atribuibles a la toxina de C. botulinum presente en los alimentos ingeridos en el tracto gastrointestinal de los lactantes o en las heridas. Es una de las toxinas ms potentes que se conocen: 1g es suficiente para matar a toda la humanidad. El botulismo humano en general es resultado de la ingestin de toxina botulnica preformada en los alimentos contaminados. Luego de la ingestin, la toxina es absorbida en el estmago y el intestino delgado, tambin en el colon. Despus de un periodo de incubacin que se relaciona de forma inversa con la dosis, la intoxicacin conduce a una alteracin funcional del sistema nervioso perifrico que resulta de la inhibicin de la liberacin de acetilcolina desde las terminaciones nerviosas colinrgicas en la unin neuromuscular producida por la toxina botulnica. La toxina acta en tres pasos: 1) unin a un receptor en la superficie en la membrana plasmtica, 2) translocacin o internalizacin de la toxina y 3) suceso intracelular cuyo resultado final es el bloqueo de la liberacin de acetilcolina inducida por el estmulo nervioso. Adems la toxina botulnica afecta la transmisin colinrgica en el sistema autnomo, tanto en los ganglios simpticos como en las placas terminales motoras parasimpticas ubicadas de forma perifrica. En el botulismo de las heridas, C. botulinum contamina una lesin traumtica. Es probable que la rareza de sta forma de botulismo se deba a la incapacidad de las esporas para germinar con rapidez en los tejidos. El papel de la infeccin del tracto gastrointestinal como fuente de botulismo es menos claro. Los lactantes son especialmente susceptibles a la colonizacin del tracto intestinal por C. botulinum y a la produccin de la toxina in vivo. La resistencia relativa del adulto a la colonizacin intestinal se adjudica a los cambios evolutivos de la dieta y a la flora bacteriana del intestino. Sin embargo en la actualidad se estn observando casos de botulismo infantil en los adultos en especial en aquellos con anormalidades del tracto gastrointestinal como consecuencia de una enfermedad inflamatoria intestinal o de un procedimiento quirrgico. Las alteraciones de la flora intestinal normal como resultado de aclorhidria o de la administracin de antibiticos de amplio espectro, son factores de riesgo adicionales para el desarrollo por infeccin de C. botulinum y la produccin de la toxina in vivo.
Epidemiologa
Se encuentran esporas de C. botulinum en suelos y agua de todo el mundo. Existen tres formas de botulismo: botulismo clsico o transmitido por alimentos, botulismo infantil y de las heridas. La toxiinfeccin alimentaria se manifiesta en brotes relacionados con alimentos comercialmente preparados como enlatados mal conservados, pero ms frecuentemente por vegetales, frutas y pescados en preparaciones caseras de tipo mermeladas, pimientos, condimentos para carnes, etc. En Uruguay en el perodo 1993-2001 se ha declarado un brote de botulismo con un total de 4 individuos afectados, con 1 fallecimiento. El botulismo del lactante afecta a nios dentro del primer ao de vida y es causado por la ingestin de esporas de C. botulinum que germinan en el intestino delgado con produccin de la toxina in vivo. El alimento involucrado fundamentalmente es la miel.
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Despus de 12 a 36 horas de la ingestin del alimento contaminado (para el caso del botulismo transmitido por alimentos) el paciente presenta nuseas, sequedad de boca, y diarrea. La enfermedad progresa a debilidad y parlisis flccida descendente y bilateral de los msculos perifricos, llegando luego a la parlisis respiratoria. Si el paciente no muere la recuperacin es lenta, pudiendo llevar varios aos el restablecimiento de las terminaciones nerviosas afectadas. La tasa de mortalidad depende del tipo de toxina, la distribucin de la toxina en el alimento y del diagnostico y tratamiento precoz con antitoxina (32% para el tipo A, 17% para el B y 40% para el E).
Diagnstico
El diagnstico de laboratorio se realiza preferentemente en laboratorio de referencia por aislamiento y pruebas bioqumicas convencionales. La enfermedad es confirmada por la presencia de toxina en suero, heces o contenido gstrico del paciente y la presencia de toxinas en el alimento confirma su participacin como origen del brote.
Tratamiento.
El paciente requiere asistencia respiratoria, eliminacin del germen del tracto gastrointestinal por lavado gstrico, tratamiento con penicilina y antitoxina botulnica trivalente (antitoxina A, B y E para neutralizar la toxina en sangre). Este tratamiento logra una considerable disminucin de la mortalidad.
Prevencin
La profilaxis consiste en evitar la germinacin de esporas en los alimentos mantenindolos a pH cido o a 4 C o menos. El calentamiento de los alimentos a 80 C durante 20 minutos puede destruir la toxina preformada. En el caso del botulismo del lactante la prevencin est orientada al no consumo de miel antes del primer ao de vida.
Bacilos gramnegativos
GNERO BACTEROIDES
Los bacteroides son bacilos gramnegativos anaerobios obligados que estn presentes en gran cantidad en el intestino grueso del ser humano y otros vertebrados. Llegan a 1011 o ms por gramo de materia fecal y son los moo predominantes, junto con los estreptococos anaerobios (E. coli est presente en una proporcin 108). El gnero incluye muchas especies de las cuales B. fragilis y B. thetaiotamicron son los patgenos ms prominentes (otras especies: B. vulgatus, B. ovatus, B. distasonis, B. ureolyticus y B. gracilis). Entre los bacteroides intestinales B. fragilis es un componente menor, que en general se halla en concentraciones de 108 o 109 por gramo de materia fecal, sin embargo es por lejos el moo aislado con ms frecuencia de las infecciones. Esto puede explicarse por algunos factores de virulencia adicionales que posee esta especie. Los bacteroides se asocian a infecciones anaerobias subdiafragmticas y genitales (por su vecindad con la porcin final del aparato digestivo y regin perineal) y sepsis a punto de partida de estas infecciones. Todos los miembros del gnero son resistentes a penicilinas (por produccin de betalactamasas) y cefalosporinas, con alguna excepcin.
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B. fragilis
BIOLOGA
DEL MICROORGANISMO
Cocobacilos pequeos gramnegativos, pleomrficos con vacuolas evidentes. Las colonias son pequeas, bajas, convexas, de color blanco a gris, semiopacas y brillantes, y algunas pueden ser hemolticas. B. fragilis aislado de muestras clnicas posee una cpsula polisacrida que puede perderse o disminuir con los cultivos sucesivos en el laboratorio. B. fragilis es un microorganismo anaerobio moderado que prolifera de forma mxima con una presin de oxgeno de menos del 3% pero que es capaz de sobrevivir a exposiciones prolongadas al O2. El microorganismo produce superxido dismutasa y catalasa (en presencia de hemina). Proliferan ms rpidamente que la mayor parte de las bacterias anaerobias no formadoras de esporas, y la proliferacin es estimulada por bilis.
ESTRUCTURA
ANTIGNICA
Dos antgenos, el proteico termolbil y el lipopolisacrido termoestable han proporcionado la base para la clasificacin serolgica de los Bacteroides. Se ha demostrado un antgeno polisacrido capsular especfico de especie en las cepas de B. fragilis.
FACTORES
DE VIRULENCIA
La cpsula polisacrida de B. fragilis confiere mayor virulencia a esta especie por iguales mecanismos que en otras bacterias: interferencia en la quimiotaxis, en la fagocitosis y la destruccin opsonofagoctica por los neutrfilos y posiblemente tambin en la depuracin de los microorganismos por la mayor adherencia de los moo encapsulados al mesotelio peritoneal. Otras especies del gnero Bacteroides tambin presentan cpsula. El lipopolisacrido de la membrana externa de los bacteroides tiene una estructura qumica alterada en comparacin con las endotoxinas clsicas de las bacterias Gram negativas aerobias y facultativas, y tiene menos actividad biolgica. An as el lipopolisacrido del B. fragilis parece promover la formacin de abscesos en animales de experimentacin (aunque la cpsula es ms activa en este aspecto que el lipopolisacrido). Adems, se ha demostrado el aumento de la coagulacin (disminucin del tiempo de coagulacin) en los ratones inyectados con lipopolisacrido. Estos microorganisos producen muchas enzimas periplasmticas, como las lipasas, las proteasas y una neuraminidasa, aunque su papel en la patogenia todava no ha sido bien documentado. Las enzimas protectoras contra el oxgeno como la superxido dismutasa, la peroxidasa y la catalasa pueden considerarse factores de virulencia porque aumentan la supervivencia de los anaerobios en los tejidos ante el establecimiento de una tensin de oxgeno y un potencial de oxidorreduccin bajos. El succinato, un cido graso de cadena corta elaborado como producto final metablico, es producido por todas las especies del gnero Bacteroides. El cido succnico en las concentraciones que corresponden a las medidas en los abscesos reduce de manera significativa la destruccin fagoctica de E. coli por los leucocitos polimorfonucleares humanos y disminuye su migracin quimiotctica. Se han descrito cepas de B. fragilis que producen una enterotoxina. Estas cepas enterotoxignicas se asocian de manera significativa con enfermedades diarreicas en el ser humano y en el ganado que no presentan otros patgenos entricos conocidos.
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PATOGENIA
La pared del colon puede romperse como resultado de un traumatismo penetrante o no penetrante, la ruptura del intestino o ciruga abdominal. Cualquiera que sea el mecanismo, el nmero de moo que contaminan la cavidad peritoneal es enorme. Los fagocitos son movilizados rpidamente en gran cantidad hacia el sitio infectado y pueden eliminar un gran nmero de bacterias. Los microorganismos que ingresan en la cavidad peritoneal se hallan primero en una fase liquida que podra, en principio, llevar a su diseminacin en toda la cavidad. Sin embargo, el epipln mayor y las asas intestinales delgadas se envuelven alrededor de las reas de inflamacin y sirven para contener la infeccin. Esto lleva tiempo pero los abscesos que se desarrollan finalmente, en general, estn muy bien localizados. El drenaje linftico y el esfuerzo de la fuerza de gravedad tambin influyen en la localizacin de los abscesos. Dada la diversidad del inoculo bacteriano, un gran numero de factores deben estar involucrados en la determinacin de qu especie resulta dominante en la infeccin. Muchas bacterias intestinales pueden crecer en el lquido peritoneal. Es muy probable que la primera lnea de defensa sea la movilizacin de las clulas fagocticas que ocurre con rapidez. Por ende, las bacterias que finalmente sobreviven y crecen deben ser bastante resistentes a la fagocitosis. De hecho, muchas son encapsuladas. Este puede ser uno de los motivos principales de la mayor frecuencia de aislamiento del B. fragilis, dado que este moo se encuentra entre los miembros del gnero Bacteroides que tiene la cpsula ms grande. Cuando el contenido del colon se derrama la cavidad peritoneal esta bien oxigenada y los moo anaerobios altamente sensibles al oxigeno son destruidos. Los primeros microorganismos que resultan numricamente dominantes son los anaerobios facultativos, en especial Escherichia coli. Sin embargo, muchos de los anaerobios estrictos menos sensibles al oxgeno sobreviven y pueden ser aislados del lquido y de la superficie de las clulas mesoteliales. Por ultimo el sitio de la infeccin se vuelve cada vez ms anaerobio, en parte porque los moo anaerobios facultativos metabolizan el oxgeno presente y en parte porque el sitio se torna cada vez mas avascular. Entonces comienzan a predominar los microorganismos anaerobios estrictos sobrevivientes. Esta sinergia entre los diversos microorganismos necesaria para la formacin de abscesos se demuestra claramente en el estudio con animales. La inoculacin de una sola especie de bacterias intestinales rara vez provoca infeccin, mientras que la infeccin con una mezcla de moo anaerobios facultativos y estrictos lleva a la inflamacin aguda y la formacin de abscesos. Si las defensas peritoneales no son capaces de erradicar el contenido intestinal derramado, en general se desarrolla un absceso. Las reas de inflamacin se tabican y son rodeadas por una gruesa capa fibrosa que contiene colgeno. En su interior hay leucocitos, bacterias vivas y muertas, y restos celulares. En los abscesos peritoneales B. fragilis, predominante, a menudo est acompaado no solo por microorganismos anaerobios facultativos, sino tambin por otros microorganismos anaerobios estrictos, como los miembros del genero Clostridium o los estreptococos anaerobios (Peptococcus, Peptostreptococcus). Los abscesos intraabdominales imponen un alto riesgo al husped porque pueden extenderse hacia sitios cercanos y adems constituyen reservorios a partir de los cuales los moo pueden ingresar en el torrente circulatorio. La bacteriemia resultante puede producir un shock sptico o causar infecciones metastticas en sitios alejados. Adems de B. fragilis tambin se encuentran otras especies de este gnero en abscesos del tracto genital femenino, en general debido a contaminacin con la biota vaginal. Aqu los microorganismos infecciosos ascienden a travs del cuello uterino, el tero y las trompas
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de Falopio hasta llegar a la vecindad de los ovarios. La infeccin resultante se conoce como enfermedad inflamatoria plvica (EIP). La causa predisponente es la cicatrizacin de las trompas de Falopio debida a infecciones previas por Chlamydia o gonococos, lo que altera la accin normal de los cilios de las clulas epiteliales de las trompas. Los abscesos tuboovricos, que de forma ocasional complican la EIP , a menudo conducen a la infertilidad. El agente causal ms comn de esta enfermedad no es B. fragilis sino B. bivius, un habitante comn de la vagina humana.
SENSIBILIDAD
A LOS ANTIMICROBIANOS
Son sensibles a clindamicina, metronidazol, imipenem, carbapenems y las penicilinas de espectro ampliado combinadas con inhibidores de betalactamasas. Sin embargo hay que tener presente que rara vez es una sola especie bacteriana la causa de estas infecciones. Por este motivo se emplea una combinacin de antibiticos o un antibitico efectivo tanto contra microorganismos aerobios, como anaerobios (clindamicina + gentamicina; ampi-sulbactam)
GNEROS PREVOTELLA Y PORPHYROMONAS
Todos los bacilos productores de un pigmento negro en las colonias en la sangre que previamente se clasificaban como subespecies de Bacteroides melaninogenicus se han reclasificado en estos dos nuevos gneros Porphyromonas y Prevotella. Este ltimo tambin incluye algunas especies no pigmentadas. Forman parte de la flora normal de boca, tracto genital e intestinal, y son patgenos importantes en boca, cabeza, cuello e infecciones pleuropulmonares. Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella loescheii, Prevotella intermedia y Prevotella corporis son miembros de la flora normal de la boca, vas respiratorias superiores y partes blandas subyacentes. Prevotella bivia prevalece en la flora vaginal y produce vaginosis e infecciones de origen obsttrico. Porphyromonas endodontalis y Porphyromonas gingivalis forman parte de la flora normal de la boca y las encas, mientras que Porphyromonas asaccharolytica se halla en la flora intestinal. La morfologa celular depende del origen de los microorganismos: a partir de medio slido son cocobacilos pequeos, pero a partir de caldo son bacilos ms largos y con marcado pleomorfismo. Las colonias en agar sangre por lo comn son convexas, lisas, circulares, algunas veces betahemolticas y habitualmente pigmentadas, adquieren un color tostado a negro en 2 a 21 das. La vitamina K y la hemina son necesarias para la proliferacin de la mayor parte de las cepas, o la estimulan mucho. Se ha visto que producen polisacrido capsular que es inmunognico y especfico de especie. El lipopolisacrido de estos microorganismos al igual que en Bacteroides es diferente de aquel de los microorganismos Gram negativos anaerobios facultativos, y su potencia biolgica es variable. La produccin de enzimas como la colagenasa y otras enzimas proteolticas, as como el polisacrido capsular son los principales factores de virulencia en las cepas que los producen. Los aislamientos clnicos pueden producir betalactamasa y algunas cepas son resistentes a las penicilinas y a ciertas cefalosporinas. Estos moo son agentes causales importantes de infecciones orales, pulmonares, pelvianas, intraabdominales y de partes blandas.
GNERO FUSOBACTERIUM
Existen seis especies causantes de infecciones en humanos. El ms frecuentemente aislado
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es Fusobacterium nucleatum, flora normal de la boca, tracto respiratorio superior, tracto genital y gastrointestinal. Es un agente causal de infecciones orales, abscesos de pulmn, otras infecciones pleuropulmonares e infecciones del lquido amnitico. Fusobacterium necrophorum es un anaerobio muy virulento que puede causar infeccin ampliamente diseminadas. Es el agente etiolgico principal de la Angina de Vincent (asociado a Borrelia), infeccin necrtica de amgdalas y faringe, que presenta un exudado purulento membranoso, acompaada de mal olor. Adems se halla en una variedad de infecciones subdiafragmticas. Su hbitat normal es el tracto gastrointestinal. Tpicamente son bacilos largos con extremos acintados o filamentos delgados. Algunos como F. necrophorum son ms abultados en su sector medio. Producen alfa y beta hemlisis en los cultivos en agar sangre, y las colonias son translcidas, de formas varias y a veces irregulares. La mayor parte de las fusobacterias son susceptibles a la penicilina G y las cefalosporinas ms antiguas, adems de los agentes anaerobios ms activos (clindamicina, metronidazol).
Cocos gramnegativos
VEILLONELLA PARVULA
Pequeos cocos gramnegativos en diplococos o cadenas cortas y racimos, miembros de flora bucal, intestinal y genital, se asla de materiales clnicos, pero es dudoso y desconocido su poder patgeno.
Bibliografa
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Mycobacterias
G. Rodrguez
Il bacili non ancora tutta la tuberculosi. G.Bacelli, 1882 El gnero Mycobacterium est integrado por bacilos largos de 3 a 5m de longitud o curvos en forma de maza, inmviles, no esporulados, con abundantes grnulos citoplasmticos, que poseen una resistencia mayor a la tincin por los colorantes comunes, pero una vez teidos son resistentes a la decoloracin con una mezcla de alcohol cido. Desde el punto de vista de los requerimientos atmosfricos algunos son aerobios y otros microaerfilos. En cuanto a la velocidad de crecimiento algunas especies son de crecimiento rpido y otras lento. Se destaca en su estructura una gran riqueza en lpidos (20-60%). El contenido de bases de guanina ms citosina en la molcula de ADN es de 62 a 70 moles %. El gnero comprende 50 especies, entre ellas patgenos primarios, oportunistas y saprofitas. La especie tipo es Mycobacterium tuberculosis (M.tuberculosis), la cual vamos a utilizar como modelo al referirnos a las principales caractersticas del gnero.
Importancia
Las mycobacterias son agentes de enfermedades infecciosas que han acompaado al hombre a lo largo de su historia. Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiolgicos ms frecuentes de las dos enfermedades ms conocidas de este gnero. Poco tiempo despus que Roberto Koch descubriera M. tuberculosis en 1882, fueron identificadas otras mycobacterias, constituyendo el grupo de las mycobacterias atpicas. El hallazgo de estas ltimas estuvo vinculado por aos a colonizacin transitoria o contaminacin de la muestra clnica, pero es a partir de 1950 que se les ha asignado un rol en determinadas patologas; por ejemplo, actualmente M. Avium Complex y enfermedad pulmonar y diseminada en pacientes con SIDA. Desde un punto de vista histrico evolutivo, existen evidencias de tuberculosis (TBC) espinal desde el neoltico, pero es a partir de la revolucin industrial donde la enfermedad adquiere carcter endmico, debido a una mayor aglomeracin de la poblacin en las urbes, lo cual facilit su diseminacin. Desde 1945, con el descubrimiento de las drogas antituberculosas, la utilizacin del examen radiolgico de trax y la implementacin de programas estrictos de control de diagnstico y
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tratamiento, se logr una disminucin de la incidencia de tuberculosis, lo que hizo pensar a principios de la dcada de 1980, en una posible erradicacin de la enfermedad para el ao 2010 (Center for Disease Control, Estados Unidos). Pero, a partir de 1985, comienza a emerger la TBC en tasas que no se vean desde haca 20 aos en los pases desarrollados. Los factores postulados para explicar esta reemergencia de la enfermedad son varios: el compromiso del sistema inmune en los individuos infectados por el VIH, que permite tanto una reactivacin de una antigua infeccin, como un aumento de la susceptibilidad a una nueva infeccin; cambios sociales: aumento del ndice de pobreza, hacinamiento; falla en los sistemas de control de la salud pblica; emergencia de bacilos tuberculosos multirresistentes a las drogas; escasa asignacin de recursos para la investigacin de nuevas drogas, nuevos mtodos diagnsticos y vacunas.
Clasificacin y nomenclatura
En 1950, Timpe y Runyon propusieron una clasificacin til de Mycobacterium en cuatro grupos, que se basaba en la velocidad de crecimiento (rpido o lento, segn sea superior o inferior a una semana), produccin de pigmento en presencia o ausencia de luz (fotocromgeno, escotocromgeno y no cromgeno) y caractersticas coloniales. En la tabla 1 se presenta una clasificacin modificada de la original de Runyon, que incluye los miembros del gnero Mycobacterium de importancia humana actualmente.
Mycobacterium tuberculosis
En la prctica se acostumbra sealar como sinnimos a M. tuberculosis y bacilo tuberculoso, pero conviene recordar que, taxonmicamente, existen dos especies emparentadas genticamente y, a la vez, aunque poco frecuente, agentes de tuberculosis, que son Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum.
MORFOLOGIA, ESTRUCTURA Y COMPOSICIN
La morfologa caracterstica suele ser bacilar, ligeramente curvada, siendo la observable en frotis provenientes de cultivo ms regular que la que se observa en frotis de materiales patolgicos. Como todas las clulas procariotas, las mycobacterias poseen un citoplasma, la membrana celular y un espacio periplsmico que lo separa de una gruesa y compleja pared celular. A continuacin se describirn las particularidades de estas estructuras en M. tuberculosis, las cuales son tiles para diferenciarlo de otras bacterias y comprender su interaccin. Naturaleza de la envoltura de M. tuberculosis La envoltura bacteriana provee proteccin y soporte a las bacterias y tambin posee mecanismos que permiten el intercambio de sustancias entre la bacteria y el medio ambiente. Hay una marcada similitud tanto qumica como estructural entre las envolturas de la mayora de las bacterias. M. tuberculosis y otras mycobacterias son biolgicamente similares a las bacterias Gram positivas (aunque frente a la tincin de Gram las mycobacterias son dbilmente Gram positivas o no se tien), pero tienen aspectos distintos. En especial, se debe destacar que aunque ambos poseen peptidoglicano, las molculas unidas o asociadas a este polmero
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son en las Mycobacterias, fundamentalmente de naturaleza lipdica en vez de protenas y lipopolisacridos, como en otras bacterias. La envoltura consiste en dos partes principales: la membrana plasmtica y, alrededor de ella, la pared celular. La primera le otorga a la clula proteccin osmtica y transporte de iones y molculas, en tanto que la segunda le brinda soporte mecnico y proteccin. Un importante tema de investigacin ultraestructural relaciona cada componente con su funcin biolgica, pero esto ha sido exitoso slo con los componentes mayores, ya que las molculas menores asociadas a la envoltura estn todava pobremente comprendidas.
Pared celular
La pared celular est constituida por tres capas. Con tinciones convencionales su apariencia es: capa interna moderadamente electrn-densa, compuesta por el peptidoglicano cuya estructura es similar a la de otras bacterias; capa media, ms ancha que la anterior y electrn-transparente, compuesta por polisacrido, el arabinogalactano, cuyos extremos distales estn esterificados con cidos grasos de alto peso molecular, los cidos miclicos, de tamao y estructura nica para las mycobacterias (70-90 tomos de carbono). capa externa de grosor variable, electrn-opaca, de la cual no puede conocerse con las tcnicas actuales, su exacta composicin, aunque se le atribuye una estructura glucolpida. Adems de los componentes anteriores existen protenas asociadas a la pared, algunas con funcin enzimtica (necesarias para la construccin y reconstruccin de los polmeros de la pared durante el proceso de divisin celular y crecimiento), otras, recientemente descubiertas, con funcin de porina. Estas ltimas, encontradas en bajo nmero, lo que est de acuerdo con la baja permeabilidad de las mycobacterias a las molculas hidroflicas.
Membrana citoplsmica
La membrana plasmtica de las mycobacterias aparece en cortes ultrafinos como una membrana biolgica trilaminar clsica, es decir, dos capas electrn-densas separadas por una capa transparente. Sin embargo, tiene como caracterstica la presencia de molculas de lipopolisacridos, lipoarabinomananos (LAM), lipomananos y fosfatidil-inositol-mansidos. Fisiologia y metabolismo El metabolismo de las mycobacterias es muy variable, encontrndose las mycobacterias de crecimiento rpido, que crecen en menos de tres das en medios simples, as como mycobacterias que crecen lentamente y necesitan medios ms ricos, hasta M. leprae que an no ha podido ser cultivada en medios sin clulas. Los medios de cultivo pueden ser slidos o lquidos, dependiendo de su uso. Los medios slidos pueden ser en base de agar o en base de huevos (Lowenstein-Jensen), siendo este ltimo el ms usado. En tres a cinco semanas se observa el desarrollo de colonias para las mycobacterias de crecimiento lento (por ej.: M. tuberculosis). Desde el punto de vista de los requerimientos atmosfricos M. tuberculosis y la mayora de las mycobacterias, son aerobios estrictos, excepto M. bovis que es microaerfilo. El crecimiento es favorecido con una atmsfera de 5-10% de CO2. La temperatura ptima de crecimiento es variable; M. tuberculosis lo hace a 37 C con un rango entre 30 y 42 C.
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Resistencia a los agentes fisicos y quimicos Las mycobacterias son altamente resistentes a la desecacin y permanecen viables en el esputo desecado de seis a ocho meses cuando estn protegidas de la luz solar directa. Son, en general, ms resistentes a los agentes desinfectantes que otras formas vegetativas, pero son destruidos por procedimientos de pasteurizacin. Factores de virulencia
Sobrevida en fagocitos
Un aspecto caracterstico de M. tuberculosis que contribuye a su virulencia es su habilidad para crecer dentro de monocitos y macrfagos. An no est aclarado exactamente como M. tuberculosis entra en el macrfago. Existen dos posibilidades no totalmente aclaradas: mediante el proceso habitual de fagocitosis mediado por la opsonizacin por C3b o C3b. la bacteria estimula su propia fagocitosis a travs de invasinas. Por otra parte, se sabe actualmente que un factor de virulencia que podra contribuir a la supervivencia de M. tuberculosis en los macrfagos, es su habilidad para prevenir la acidificacin del fagosoma. Habitualmente la ingestin de una bacteria por fagocitosis es seguida de la acidificacin del fagosoma, mediada por ATPasas de la membrana fagosomal, la que bombea protones hacia el interior de esta estructura, reduciendo el pH en l. Dicha acidificacin no slo inhibe el desarrollo bacteriano sino que, adems, es un paso importante en la fusin lisosoma-fagosoma, y en la activacin de los factores bactericidas liberados durante la fusin. M. tuberculosis presumiblemente, contrarresta la acidificacin produciendo amonaco y de esta manera mantiene las condiciones ptimas para el crecimiento dentro de las vesculas. Otro mecanismo recientemente estudiado contra la destruccin fagoctica es debido a los glucolpidos abundantes de la pared de mycobacterias, que protegera las bacterias de las formas txicas de O2 producidas en el fagolisosoma.
Interferencia con la activacin de los macrfagos
Aunque M. tuberculosis puede sobrevivir dentro de los macrfagos no activados, la bacteria es destruida por las mismas clulas activadas. El interfern gamma y, en general, las citoquinas (producidas por las clulas T, especialmente la CD4) son esenciales para la activacin de los macrfagos. M. tuberculosis produce compuestos como el lipoarabinomanano que suprime la activacin de las clulas T. Se ha encontrado una protena secretada por M. tuberculosis, el antgeno 85A, que se une a la fibronectina, la cual puede estimular las clulas T al unirse a sus receptores. De modo que el antgeno 85A puede prevenir la activacin de clulas T mediada por la fibronectina y, de ese modo, impedir la activacin de macrfagos.
Destruccin tisular
Muchos patgenos bacterianos causan dao en los tejidos del husped por desencadenar una respuesta inflamatoria local o sistmica. Esta hiptesis es una posible explicacin del dao pulmonar causado por M. tuberculosis y hay gran inters en detectar qu antgenos son los responsables del desencadenamiento de esta respuesta destructiva del hospedero. Se sabe poco acerca de los antgenos ms importantes responsables de esta respuesta, pero los implicados en la actualidad son: cidos miclicos de la pared celular (factor cuerda). Son txicos cuando son inyectados a animales y pueden desencadenar una respuesta inflamatoria;
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muramil dipptido, estimula el sistema inmune y dispara la produccin de citoquinas; compuestos de la pared no identificados y productos txicos liberados por los lisosomas que estimulan la produccin de factor de necrosis tumoral alfa (TNF). Sera una hiptesis que explicara el dao pulmonar. Patogenia Los ncleos goticulares conteniendo muy pocos bacilos, dispersos en el aire, provenientes de un sujeto enfermo con tuberculosis pulmonar abierta, son lo suficientemente pequeos para no quedar atrapados en el aparato mucociliar bronquial y as alcanzar el espacio terminal areo donde comienza la multiplicacin. El foco inicial es casi siempre de localizacin subpleural generalmente ubicado en la zona media de los pulmones donde el mayor flujo areo favorece el establecimiento de los bacilos inhalados. Excepcionalmente se encuentra el foco inicial en otras reas (por ej.: piel, intestino, orofaringe, genitales). En la mayora de los casos el foco pulmonar inicial es nico, aunque en un 25% de los casos pueden ser mltiples. En el pulmn las bacterias son ingeridas por los macrfagos alveolares, los cuales pueden tener un bajo grado de actividad antimycobacteriana como para eliminar pequeas cantidades de bacilos. Sin embargo, la multiplicacin bacteriana no puede ser impedida y, eventualmente, destruye los macrfagos. Desde el torrente sanguneo son atrados hacia el foco linfocitos y monocitos, diferencindose los ltimos en macrfagos que ingieren las bacterias liberadas de las clulas degeneradas, y lentamente se desarrolla una o ms reas de neumonitis. Los macrfagos infectados son llevados por va linftica a ganglios linfticos regionales (hiliares, mediastinales y, a veces, supraclaviculares o retroperitoneales), pero en el husped no inmune no son retenidos all y se puede diseminar por va hemtica a diferentes tejidos, hecho condicionado por el tipo de flujo sanguneo. Preferentemente se ubicarn en: ganglios linfticos, riones, epfisis de huesos largos, espacio subaracnoideo, pero el sitio ms importante sern las reas apicales pulmonares. Antes del desarrollo de hipersensibilidad el desarrollo bacteriano no est inhibido, tanto en el foco inicial como en los metastsicos, dando lugar a sitios de probable evolucin a enfermedad progresiva en los pices pulmonares o en focos extrapulmonares, prontamente o despus de largos perodos de latencia. Los bacilos tuberculosos que continan multiplicndose lesionan los rganos donde estn localizados, provocando licuefaccin de los tejidos, donde crecen extracelularmente, llegando a ser millones. En estas condiciones es fcil que, dado el gran nmero de bacilos, aparezcan mutantes resistentes a los agentes antituberculosos. La hipersensibilidad retardada aumenta el riesgo de licuefaccin, provocndola los monocitos atrados por las linfoquinas secretadas por los linfocitos sensibilizados, que al transformarse en macrfagos con sus enzimas proteasas, nucleasas y, quizs, lipasas, conducen a la licuefaccin. La licuefaccin produce extensa destruccin en los tejidos y proporciona vas para la diseminacin de los bacilos de un rgano como el pulmn a otras localizaciones. El material de licuefaccin, con gran cantidad de bacilos, puede, por drenaje o por golpes de tos, extenderse por va bronquial a otras zonas del mismo pulmn o al contralateral. Si la enfermedad no se desarrolla en el pulmn o en otro lugar en los dos aos siguientes a la implantacin inicial el riesgo de enfermedad posterior ser escaso. Un 5% aproximadamente de los infectados desarrolla la enfermedad durante el primer ao y otro 5% lo har ms tarde como resultado de reactivaciones de los bacilos persistentes dentro de viejos focos de infeccin. Estas reactivaciones tardas se producen habitualmente en las zonas altas del pulmn, pero puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo.
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Clnica
Tuberculosis primaria. Primoinfeccin tuberculosa
En cualquier rea donde el bacilo se localice provocar una reaccin inflamatoria que constituye el chancro de inoculacin, habitualmente pulmonar y mucho menos frecuentemente digestivo, cutneo o mucoso. Alrededor del bacilo se agrupan una serie de clulas mononucleadas linfocitos y macrfagos con algunas clulas gigantes (clulas de Langhans). El centro de este folculo o granuloma suele necrosarse y luego se calcifica. En la mayora de los casos se produce la destruccin de las mycobacterias y la nica evidencia de infeccin es un test cutneo de hipersensibilidad a la tuberculina positivo y otras veces los bacilos pueden persistir en forma latente. En una minora de casos los antgenos en el complejo primario (foco pulmonar inicial ms ganglio linftico regional) alcanzaran una concentracin suficiente, que el desarrollo de hipersensibilidad resultara en una necrosis y calcificacin visible radiolgicamente. Junto con el desarrollo de hipersensibilidad pueden asociarse manifestaciones alrgicas como eritema nodoso o queratoconjuntivitis flictenular. La mayora de estos casos quedan en esta primoinfeccin que da lugar a la alergia tuberculnica y a la inmunidad tuberculosa, que provoca un estado defensivo en el organismo hacia nuevas infecciones o a la diseminacin de la infeccin en curso. Esta inmunidad fallar bajo alguna circunstancia que produzca inmunodepresin, provocando una enfermedad tuberculosa meses o aos despus de la infeccin por el mismo bacilo: reinfeccin endgena o por reinfeccin exgena (adquisicin de un nuevo bacilo del exterior).
Enfermedad tuberculosa
Se manifiesta por un gran polimorfismo con variadas localizaciones, ya sean pulmonares o extrapulmonares (menos frecuentes). La tuberculosis pulmonar puede ser aguda, neumnica o bronconeumnica. Puede provocar una diseminacin hematgena con afectacin miliar o menngea, as como tambin complicaciones bronquiales debido a adenopatas mediastinales que pueden ocasionar atelectasias por comprimir el rbol bronquial. Epidemiologa M. tuberculosis infecta a 1.7 billones de personas en el mundo (1/3 de la poblacin mundial) y causa 3 millones de muertes por ao. Los dos factores esenciales para su rpida diseminacin son el hacinamiento, que favorece la transmisin area, y la poblacin con baja resistencia natural. La distribucin etaria de la enfermedad refleja el grado de transmisin en una poblacin dada. Es por esta razn que la enfermedad en la vejez es generalmente debida a reactivacin de una infeccin adquirida en el pasado, mientras que en los nios pequeos indica transmisin activa en la comunidad. Adems, actualmente la tuberculosis est siendo ms frecuentemente diagnosticada en adultos jvenes y la principal razn es la infeccin por VIH en estos pacientes. La incidencia de tuberculosis activa en esta poblacin es mucho mayor que en la poblacin general y debido a esta observacin es que se incluye desde 1993 a la tuberculosis pulmonar o extrapulmonar en la definicin de caso de SIDA. Segn los criterios del CDC (Center for Disease Control, EE.UU.), todo paciente VIH positivo con menos de 200 clulas CD4 y un cuadro de tuberculosis diagnosticado equivale a un estadio SIDA.
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Cadena epidemiolgica Reservorio: hombre, representado por el enfermo bacilfero, o animal, 1-3% de todas las tuberculosis, se reconoce sobre todo transmisin por bovinos (leche no pasteurizada).
MECANISMO
DE TRANSMISIN
va respiratoria: sin lugar a dudas la ms frecuente, llevndose a cabo por gotitas de pflgge o ncleos goticulares de Wells; va digestiva: generalmente a travs de la leche contaminada; va cutaneomucosa: excepcional.
Poblacin sana susceptible
Cualquier persona sana puede ser susceptible de enfermar de tuberculosis dependiendo de su estado inmunitario, de factores socioeconmicos y de factores individuales como edad (extremos de la vida), sexo y receptividad gentica.
Riesgo de infeccin
El determinante de riesgo ms importante es el contacto directo con el paciente y la infecciosidad de este. Los casos con microscopa positiva son altamente infecciosos, en tanto aquellos con cultivo positivo solamente, son mucho menos infecciosos. El grado de positividad del esputo y los patrones de tos son tambin importantes. Antes de la aparicin del SIDA se estableca que la presencia de cavidad era necesaria para la contagiosidad, sin embargo, los pacientes con SIDA y tuberculosis pulmonar pueden ser altamente contagiosos en ausencia de cavitacin (radiografa de trax normal).
Influencia de la antibioticoterapia en la transmisin de la infeccin
Los pacientes que estn recibiendo quimioterapia rpidamente se tornan no infecciosos, en tanto su tos y la concentracin de microorganismos disminuyen. Se acepta que esto ocurre despus de dos semanas de iniciado el tratamiento. Por lo tanto, este es el mtodo ms efectivo para el control de la tuberculosis. Tuberculosis y SIDA Los pacientes VIH positivos, como ya se ha citado, tienen un mayor riesgo de padecer tuberculosis, siendo susceptibles a la reactivacin de una infeccin antigua, como as tambin a una rpida propagacin de una infeccin recientemente adquirida. La poblacin ms frecuentemente afectada la constituyen los adictos a drogas, poblacin sin vivienda y con escasos recursos econmicos, siendo estos mismos factores los que dificultan el cumplimiento de los tratamientos, favoreciendo el surgimiento de cepas multirresistentes. Desde el punto de vista clnico la presentacin depende del grado de inmunodepresin.
Aspectos inmunolgicos
La tuberculosis es el prototipo de infeccin de la cual la respuesta inmune de tipo celular es esencial para su control. Si bien se ha comprobado una produccin abundante de anticuerpos durante la infeccin, no se ha demostrado su papel en la defensa del husped. ste casi no tiene una respuesta inmunolgica en las primeras semanas, en las que los bacilos se multiplican libremente en el espacio alveolar, adentro de los macrfagos. El efecto bacteriosttico de estos macrfagos alveolares sobre los bacilos parece ser variable y muy dbil. La multiplicacin irrestringida de
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mycobacterias prosigue por semanas en el foco inicial y en los metastsicos (linfohematgenos), hasta el desarrollo de la inmunidad celular e hipersensibilidad. La hipersensibilidad es muy florida en comparacin a otras infecciones intracelulares debido a la potente actividad adyuvante de los lpidos de la pared mycobacteriana. Cuando la poblacin de linfocitos activados alcanza un cierto nmero, la hipersensibilidad retardada se torna manifiesta (3-9 semanas). Simultneamente aparece la inmunidad celular. Es motivo de controversia si la inmunidad celular, que connota resistencia a la infeccin, y la hipersensibilidad retardada, que describe una reactividad celular alterada (formacin de granuloma, necrosis tisular), son punto final de una misma secuencia de eventos inmunolgicos y qumicos, o son fenmenos paralelos y estrechamente asociados, que dependen de diferentes antgenos y poblaciones linfocitarias, o ambos. Sin embargo, en un sentido clnico ellos parecen ser inseparables. Los aspectos patolgicos de la tuberculosis son el resultado del grado de hipersensibilidad y la concentracin local de antgenos. Cuando la concentracin de antgenos es baja y la hipersensibilidad alta, los elementos celulares y capilares forman un granuloma que puede ser proliferativo, exudativo o caseoso. Cuando la situacin es a la inversa, la reaccin tisular puede ser poco especfica, con escasos polimorfonucleares y clulas mononucleares, condicin llamada tuberculosis no reactiva. El espectro inmunolgico, desde la hipersensibilidad florida hasta la baja o no especfica, es similar al visto en pacientes VIH positivos en el transcurso de la disminucin del conteo de CD4.
Tratamiento de la tuberculosis
Antes que existieran drogas efectivas, la mitad de los pacientes con tuberculosis pulmonar moran en 2 aos, y slo 25% se curaban. Con el advenimiento de la quimioterapia los tratamientos con largos perodos de reposo en cama, aislamiento prolongado y colapsoterapia, se tornaron innecesarios. M. tuberculosis es inhibido in vitro, a concentraciones alcanzables en suero humano en dosis teraputicas, por una serie de antimicrobianos que son conocidos como agentes antituberculosos y han sido clasificados tradicionalmente en los siguientes grupos: Antituberculosos mayores: isoniacida, rifampicina. Antituberculosos secundarios: pirazinamida, estreptomicina, etambutol. Antituberculosos menores: PAS. Los mecanismos de accin de los agentes antituberculosos no estn an totalmente aclarados. Isoniacida probablemente acta inhibiendo la sntesis de cidos nucleicos y etambutol interferira con el metabolismo glucdico. Resistencia de M. tuberculosis a los agentes antimicrobianos La aparicin de resistencia constituye el principal problema del tratamiento. Podemos clasificar las cepas en sensibles y cepas resistentes, que se desarrollaran en presencia de antimicrobianos por seleccin de mutantes resistentes, y que aparecen en forma espontnea con diferente frecuencia para los frmacos antituberculosos, como se esquematiza en el siguiente cuadro. Es de importancia resear los conceptos de: resistencia primaria, aquella que muestran las cepas de enfermos que nunca recibieron tratamiento; resistencia secundaria, la que es consecutiva generalmente a un tratamiento incorrecto. El nico mecanismo demostrado hasta el presente capaz de originar resistencia en M. tuberculosis es el resultado de mutacin espontnea a nivel cromosmico.
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En el siguiente cuadro se resumen los principales factores que favorecen la aparicin de mutantes resistentes en M. tuberculosis. Del anlisis de estos factores surge la necesidad de una teraputica combinada, ya que esta permite la destruccin de bacilos resistentes a una droga a travs de las otras. El problema emergente actualmente en algunas poblaciones es la multirresistencia y, aunque en bajo porcentaje, ya est descripto en nuestro pas como en otras partes del mundo, siendo la poblacin ms afectada la de los pacientes VIH positivos. El tratamiento debe ser prolongado debido a que M. tuberculosis es una bacteria de crecimiento lento. Existen diferentes esquemas a nivel mundial (oscilan entre 4-12 meses) dependiendo de la edad del paciente, la localizacin de la enfermedad y el estado inmunitario. En nuestro pas estas pautas estn regidas por la Comisin Honoraria para la lucha Antituberculosa, que las entrega a los mdicos peridicamente en su sede. Profilaxis
Inmunoprofilaxis
BCG es una vacuna con microorganismos vivos atenuados en forma irreversible, derivada de una cepa de M. bovis (bacilo de Calmette y Guerin, en honor a sus creadores). Esta cepa entra en los macrfagos y se replica brevemente antes de ser destruida, y debera desencadenar el mismo tipo de respuesta inmune que M. tuberculosis, asumiendo que los antgenos ms importantes estn expresados. Ya han sido administrados billones de dosis a nivel mundial teniendo escasos efectos colaterales (chancro de inoculacin, adenopata localizada), que la hacen una de las vacunas ms seguras conocidas. Una contraindicacin es el paciente inmunodeprimido (SIDA). La vacunacin en nios produce una disminucin del 60-80% de la incidencia de tuberculosis en una poblacin dada. Su uso es recomendable en reas de alta prevalencia de infeccin tuberculosa. En tanto que la BCG no previene la infeccin, generalmente previene contra la progresin a enfermedad clnica y su efectividad en prevenir la enfermedad generalizada en nios es sorprendente (7-8 veces menos que en poblacin no vacunada). El efecto de la vacunacin con BCG en la hipersensibilidad a la tuberculina depende de la edad de vacunacin y el intervalo al realizar el test cutneo, disminuyendo el porcentaje de test positivo cuando menor haya sido la edad en que se administr la ltima dosis. En un estudio hecho en la ciudad de Montreal, se encontr 7.9% de test positivo a la edad de 25 aos cuando la vacuna se administr antes del ao, en tanto el porcentaje ascendi al 25.9% cuando la administracin fue luego de los 5 aos de edad. Existen intensas investigaciones para desarrollar vacunas ms efectivas que BCG para proteger contra tuberculosis, aunque, por otra parte, debido al bajo costo de BCG, la seguridad de la misma y que estimula una respuesta mediada por clulas, as como humoral, se estudia la posibilidad de usar a BCG como vehculo para una vacuna multivalente. Esto sera posible al saber que es factible introducir en M. bovis BCG, DBA clonado que codifica antgenos protectores contra una variedad de bacterias y virus.
Mycobacterias atpicas
Todas las mycobacterias no comprendidas dentro del complejo tuberculoso ni M. leprae han
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recibido muy distintos nombres. Desde 1969 se las engloba bajo el trmino de mycobacterias atpicas.
Son similares a los estudiados para M. tuberculosis, diferencindose algunos en cuanto a la produccin de pigmento frente a la luz, velocidad de crecimiento y diferentes resultados frente a las pruebas bioqumicas de identificacin.
ROL COMO PATGENO
Para que una mycobacteria atpica sea considerada como agente etiolgico de una infeccin por mycobacterias, esta debe ser hallada, identificada y debe descartarse la presencia de mycobacterias del complejo tuberculoso y M. leprae. De lo contrario, sern estos ltimos los responsables del proceso, siendo las mycobacterias atpicas simples acompaantes.
LOCALIZACIN ANATOMOCLNICA
En el cuadro siguiente se esquematiza la relacin entre la localizacin, agente etiolgico y cuadro clnico.
Localizacin Bronco pulmonar Agente etiolgico M. kansasii M. xenopi M. szulgai Ganglionar Cutnea Osteoarticular Generalizada M. avium complex M. scrofulaceum M. avium complex M. ulcerans M. marinum M. avium complex M. scrofulaceum M. avium complex M. kansasii Adenitis supura profunda y linfticos generalizados Ulceras tropicales. Pequeas lesiones trpidas Huesos largos planos Sepsis Cuadro clnico Igual a tuberculosis
MYCOBACTERIAS ATPICAS EN EL PACIENTE CON SIDA
En el paciente con SIDA las mycobacterias atpicas constituyen una causa de infeccin frecuente. No suelen encontrase ni cavernas ni granulomas como en tuberculosis y se presentan habitualmente como formas diseminadas. Mycobacterium avium complex es responsable del 80% de las infecciones generalizadas en estos pacientes. Epidemiologia Si bien en la tuberculosis la cadena epidemiolgica (reservorio, transmisin, husped susceptible) est determinada, en las mycobacteriosis esto no sucede as, ya que los reservorios son diferentes y variados. Reservorio - el hombre enfermo es un reservorio de estas mycobacterias, pero en general desempea un papel poco importante en la transmisin de la infeccin. El reservorio principal y la fuente de infeccin est en el medio ambiente contaminado (los alimentos, el suelo, el agua).
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Mecanismo de transmisin - la transmisin puede hacerse va rea o cutnea. El contagio interhumano no es decisivo como en tuberculosis o lepra. Husped susceptible. Existen tres grupos de riesgo: pacientes con irritacin o lesin previa a nivel pulmonar, para mycobacteriosis pulmonar; empleados de piscinas y acuarios para las afecciones cutneas; pacientes inmunodeprimidos, especialmente con SIDA, que se han convertido en el grupo de riesgo ms importante. Tratamiento Por la importancia referida anteriormente en el paciente con SIDA, destacamos el tratamiento de M. avium complex. Se utiliza la terapia combinada igual que para M. tuberculosis, pero se destaca la multirresistencia a los antituberculosos de primera lnea, por ello las pautas son muy variables. En las adenitis supuradas, ndulos pulmonares e infiltrados localizados, se plantea la reseccin quirrgica.
Mycobacterium leprae
La enfermedad de Hansen o lepra ha sido, ms que ninguna, a lo largo de la historia una de las de mayor impacto psicosocial. Aislados, marcados, sealados, rehuidos por la sociedad, los pacientes han sentido su enfermedad como un verdadero estigma. Desde 1940 con el advenimiento de antibioticoterapia adecuada, un diagnstico precoz y un equipo multidisciplinario en el tratamiento, han hecho que estos conceptos tiendan a desaparecer.
M. leprae es un bacilo cido alcohol resistente de 1-8m de longitud y 0.3-0.5m de ancho y no puede ser distinguido microscpicamente de otras mycobacterias. No desarrolla en los medios libres de clulas ni en cultivos celulares, pero s se ha logrado su crecimiento en la almohadilla plantar del ratn y en el armadillo de nueve bandas encontrado en Estados Unidos. Crecen mejor a temperaturas menores a 38 C. Su tiempo de duplicacin es de 12 das en la almohadilla plantar del ratn. M. leprae posee una gruesa cpsula externa por fuera de la pared celular, rica en glucolpido fenlico (PGL-1) el cual ha sido implicado en la supervivencia intracelular y en la limitacin a la entrada de los antibiticos. El PGL-1 y el lipoarabinomanano de la pared celular han sido responsabilizados de la falta de respuesta de los linfocitos y macrfagos en la anergia de la forma lepromatosa. Estos dos componentes constituyen los factores de virulencia ms importantes. Patogenia Los bacilos de lepra se diseminan a partir de los enfermos con lepra lepromatosa por va nasal. Una descarga nasal contiene aproximadamente 100 millones de bacilos por ml, y pueden permanecer viables varios das en las secreciones desecadas. A partir de stos se contaminara la piel de los contactos ntimos, estimndose un perodo de incubacin de 2-7 aos. Se ha comprobado que lepra es bastante contagiosa, pudiendo producir muchas infecciones, si bien se sabe que la frecuencia de enfermedad en los contactos es muy baja. Ms del 95% no seran susceptibles a la infeccin por M. leprae. Los que enferman lo haran por un defecto
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de su inmunidad celular que hace que sus clulas macrofgicas ingieran los bacilos pero no los destruyan. Clnica Se distinguen tres formas clnicas de lepra.
Lepra lepromatosa
En ella el paciente tiene ndulos cutneos simtricos, placas y la dermis engrosada. Como el bacilo crece a temperaturas bajas, las reas fras del cuerpo como nariz, lbulo de la oreja, son reas propensas. Puede ocurrir prdida de las cejas, especialmente las porciones laterales. El aparato respiratorio, particularmente la mucosa nasal, est infiltrada por estos microorganismos, produciendo una congestin nasal crnica y epistaxis. En la era preantibitica y, ocasionalmente en la actualidad, la progresin de este proceso puede llevar a la destruccin del tabique nasal, siendo responsable de las deformidades a este nivel. La neuropata, cuando est presente en la forma lepromatosa, es simtrica y generalizada. La reaccin de la lepromina es negativa.
Lepra tuberculoide
Es el otro polo de la enfermedad. Los pacientes con esta forma de lepra slo tienen escasas manchas hipopigmentadas, anestsicas, con bordes elevados y eritematosos. Se encuentra afectacin de troncos nerviosos perifricos, asimtrica. A diferencia de la forma lepromatosa, no existen sntomas y signos respiratorios. La reaccin de la lepromina es positiva.
Lepra borderline
La mayora de los pacientes tiene una forma intermedia, entre lepromatosa y tuberculoide, compartiendo formas clnicas de una y otra. La leprominoreaccin es positiva. Epidemiologa La enfermedad predomina en Asia, Africa, Amrica Latina y pases del Pacfico. Hay 10 millones de casos en el mundo. El reservorio aceptado es el hombre y las fuentes de infeccin radican en la localizacin de la enfermedad en ste, sobre todo la forma lepromatosa no tratada. El mecanismo de transmisin es a travs de la piel, aparato respiratorio y aparato digestivo, siendo esta ltima localizacin de escaso inters. El contacto ntimo y prolongado hara que los sujetos predispuestos pasen de la infeccin al inicio de la enfermedad. Sufre lepra quien tiene un trastorno de su inmunidad celular que le impide destruir los bacilos. Tratamiento El tratamiento de lepra, como el de otras mycobacterias, es largo, y, a menudo, esto ocasiona fallas en el cumplimiento del mismo. Dos problemas se originan: emergencia de cepas resistentes a las drogas, en particular, dapsona; persistencia de bacilos sensibles a los antibiticos que quedan en estado latente luego del tratamiento adecuado. Las drogas que se utilizan en el tratamiento son: dapsona, antibitico que acta en la sntesis de folatos, rifampicina, clofazimine, etionamida, estreptomicina. Se encuentra en estudio la utilizacin de nuevos macrlidos y quinolonas.
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Inmunoterapia
Se encuentra en investigacin debido a las dificultades del tratamiento con antimicrobianos. Es as que se ensaya con interfern gamma o interleucinas. La frase del comienzo de G. Bacelli no es una simple frase. La tuberculosis no es slo el bacilo, resta mucho por conocer del binomio husped-parsito y este concepto se puede extender a todas las enfermedades ocasionadas por el gnero Mycobacterium. Los prximos aos plantean el desafo.
Mtodos de estudio
INTRODUCCIN
La tuberculosis, junto a la lepra y otras mycobacteriosis, han sido inseparables y terribles compaeras de la humanidad. La lepra, que necesita de un largo tratamiento, difcilmente efectivo, con pocos frmacos tiles y gran nmero de abandonos del tratamiento, no dispone de cultivos ni de vacunas adecuadas. La tuberculosis, que necesita tambin de un largo tratamiento, caracterizado por el incumplimiento y la creciente resistencia a las drogas, aumenta su incidencia en el mundo debido al SIDA. Igualmente las mycobacteriosis ocasionadas por mycobacterias atpicas, aumentan su incidencia por la inmunodepresin en pacientes con SIDA. En stos, Mycobacterium Avium Intracelullare se ha convertido en un patgeno oportunista frecuente. Por todo esto la microbiologa clnica de la tuberculosis, la lepra y otras mycobacteriosis aparece como fundamental en el diagnstico y control de curacin de estas enfermedades. Las caractersticas que hemos mencionado del gnero Mycobacterium y otras que sealaremos a continuacin, determinan un conjunto de particularidades (en relacin a recoleccin de las muestras clnicas, procesamiento, etc.) que enmarcan estos grmenes en un captulo distinto al de las dems bacterias en el laboratorio microbiolgico. Asomarse a estas particularidades constituye no slo un hecho ineludible en la formacin mdica, sino tambin una posibilidad apasionante.
DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS
Bioseguridad en la bacteriologa de la tuberculosis Existen estrictas normas de bioseguridad para el manejo de las muestras clnicas en el laboratorio. Como ya fue visto en los aspectos tericos del tema, la va de transmisin principal es la inhalatoria, por la aspiracin de partculas aerosolizadas; stas pueden provenir del paciente o ser diseminadas al manipular las muestras en el laboratorio (apertura de frascos, flameo del asa, etc.). Evitar el desprendimiento de estas partculas, trabajar en ambientes amplios y ventilados de circulacin restringida, y recordar las normas de no fumar, beber, comer, o aplicarse cosmticos en el laboratorio, son algunos de los puntos a tener en cuenta. El estudiante que se dedicar fundamentalmente a la observacin de frotis y cultivos ya procesados y no al manejo de muestras clnicas, deber cumplir con las habituales normas de bioseguridad y buenas prcticas en el laboratorio. Obtencin de la muestra Las muestras pueden provenir de zonas naturalmente estriles, zonas naturalmente contaminadas o de zonas estriles pero en las que al efectuar la toma, se pasa por un rea contaminada. El siguiente cuadro esquematiza los ejemplos ms frecuentes.
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Muestras contaminadas Expectoracin Orina Jugo gstrico Exudados
Muestras no contaminadas Lquido cefalorraqudeo Lquido pleural Lquido articular Biopsias
La expectoracin es la muestra de ms frecuente manejo, ya que como dijimos, la pulmonar es la presentacin ms habitual. La expectoracin debe ser representativa de las secreciones del tracto respiratorio inferior; para ello se debe recoger a primera hora de la maana, previa higiene bucal, y con el esfuerzo de la tos, en frasco estril. La toma debe repetirse tres veces en das consecutivos, ya que la eliminacin de bacilos no es constante. Mujeres y nios pueden tener dificultades por no poder, o no saber, expectorar, pudiendo entonces hacer nebulizaciones con NaCl hipertnico. En pacientes hospitalizados graves puede recurrirse a FBA o lavado gstrico. Transporte y conservacin La rapidez es una condicin fundamental en el transporte pues los bacilos se debilitan con el tiempo y prolifera, en caso de ser una muestra contaminada, la flora acompaante, por ej.: proliferacin de la flora del tracto respiratorio superior en la expectoracin. La conservacin puede hacerse a 4 C hasta 7 das. Procesamiento El trabajo con las muestras clnicas en el laboratorio se realiza en cabina de seguridad, con las debidas protecciones para el personal (tnicas, tapabocas, etc.). Metodos directos
Microscopa - baciloscopa
El examen microscpico directo o baciloscopa es la tcnica fundamental para la investigacin bacteriolgica de la tuberculosis pulmonar, tanto para el diagnstico como para el control de tratamiento, resultando tambin til para muestras provenientes de otros orgenes.
TCNICA
DE
ZIEHL-NEELSEN
Se trata de una coloracin diferencial basada en la capacidad de las mycobacterias de incorporar colorantes y luego retenerlos ante la accin de una mezcla de alcohol y cido, lo que es conocido como cido-alcohol resistencia. Las particulares caractersticas de la pared de las mycobacterias parece ser responsable de esta propiedad, pudiendo formar complejos cido estables, cuando se exponen a colorantes aninicos, con los lpidos de la pared, especialmente los cidos miclicos, o tambin constituyendo complejos fucsina-ARN. Con un frotis seco y fijado se recorren los siguientes pasos:
Coloracin Fucsina + calor (calor hasta emisin de vapor; no ebullicin) Alcohol-Acido Azul de metileno Aproximadamente 5 min.
Decoloracin Coloracin de contraste
Aproximadamente 3 a 5 min. Aproximadamente 1 min.
Se debe lavar con agua corriente a baja presin entre paso y paso. Despus se seca y se
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observa con lente de inmersin. Las mycobacterias se ven rosadas sobre un fondo de leucocitos, fibrina y escasa flora asociada, coloreados de azul. La observacin debe recorrer unos 200 campos microscpicos y se informa segn el siguiente criterio semicuantitativo:
Baciloscopa negativa Baciloscopa positiva + Baciloscopa positiva ++ Baciloscopa positiva +++ No se observan bacilos cido-alcohol resistentes en 200 campos microscpicos observados. Se observan menos de un bacilo por campo en 200 campos observados. Se observan 1 a 10 bacilos por campo en 100 campos observados. Se observan ms de 10 bacilos por campo en 50 campos observados.
La baciloscopa por la tcnica de Ziehl-Neelsen es una tcnica sencilla de bajo costo, cuya utilidad ya hemos destacado. Aplicado a la expectoracin se estima que se necesitan 10.000 para que la probabilidad sea del 95-100%. En nuestro pas el hallazgo de bacilos cido-alcohol resistentes en la baciloscopa de muestras provenientes de reas estriles es diagnstica y especfica de M. tuberculosis en un alto porcentaje. Lo mismo ocurre con las muestras de lavado gstrico.
TCNICA
DE FLUORESCENCIA
AURAMINA RODAMINA
Basada igual que el Ziehl-Neelsen en la cido-alcohol resistencia de la mycobacterias, aqu se colorean con un fluorocromo y no se decoloran con la mezcla de alcohol-cido. La tcnica no necesita del agregado de calor y permite una visualizacin ms rpida ya que los bacilos se ven luminosos sobre un fondo oscuro. La observacin se hace con objetivo en seco y se requiere un microscopio de fluorescencia, lo que hace esta tcnica ms cara con respecto al Ziehl-Neelsen. Se utiliza en laboratorios que manejan un nmero importante de muestras por da. Respecto al valor de la microscopa y a las tcnicas de coloracin mencionadas, nos parece oportuno sealar: Si se tiene una baciloscopa positiva y una clnica sugestiva, casi siempre se tratar, en nuestro pas, de una tuberculosis, pero es necesario tener presente que puede tratarse de otras especies del gnero Mycobacterium. La microscopa no sustituye el cultivo. Referente a las tcnicas de coloracin, recordar la importancia de las mismas, y que la tcnica de Gram, muy difundida en el diagnstico de otras bacterias, no es til para las mycobacterias.
Cultivo
El cultivo es complemento de la microscopa; permite diagnosticar como positivos casos negativos en el examen microscpico. Las muestras contaminadas se someten a una descontaminacin que destruye la flora asociada y mantiene viables a las mycobacterias. Despus se siembra en los medios adecuados. Las muestras no contaminadas se siembran directamente (previa centrifugacin para concentrar). La incubacin se realiza a 35-37 C en aerobiosis. Se observan los medios peridicamente y, al cabo de 3-5 semanas, crecen colonias rugosas, secas, amarillentas. Deben esperarse hasta ocho semanas para informar un cultivo como negativo. El medio empleado es el de Lowenstein-Jensen, compuesto por hierro, aminocidos,
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sales, glicerina, fcula de papa, huevo, y verde de malaquita (este ltimo inhibe la flora asociada). La inoculacin en animales se ha dejado de usar por ser poco prctica y no definitiva en algunas situaciones.
Identificacin de los aislamientos
En nuestro pas los laboratorios clnicos pblicos y privados realizan el examen microscpico de la muestra y slo algunos realizan los cultivos. La identificacin definitiva y las pruebas de sensibilidad se realizan en la Comisin Honoraria de Lucha Antituberculosa, (CHLA, 18 de Julio 2175 esquina Beisso) donde est el laboratorio de referencia con el personal y el equipo adecuado. La CHLA cubre el pas por medio de una extensa red de puestos que recuperan y envan las cepas aisladas al laboratorio central, adems de realizar diagnstico precoz, control de los casos, prueba tuberculnica, pautas de tratamiento y administracin de vacunas. M. tuberculosis puede ser diferenciado de otras mycobacterias por pruebas simples y observacin de caractersticas micro y macroscpicas, as como el estudio de sus requerimientos. M. tuberculosis crece lentamente, es no cromgeno, productor de niacina, reduce nitratos, produce una catalasa sensible al calor, es generalmente sensible a la isoniacida, etc.
Estudio de sensibilidad
La sensibilidad de las mycobacterias se estudia como para otros grmenes, poniendo en contacto el bacilo con el antibitico a probar; pero existen algunas diferencias con el antibiograma utilizado de rutina en los laboratorios, por ejemplo, no se utiliza el medio de Mueller Hinton, ni el mtodo de difusin en agar (Kirby-Bauer). En su lugar se emplea Lowenstein-Jensen y distintas tcnicas para el antibiograma. Mencionaremos solamente una, la cual consiste en inocular un medio control y simultneamente medios que contienen en solucin el antibitico a probar en diferentes concentraciones. El inculo bacteriano debe ser de concentracin conocida. La resistencia o sensibilidad se determina por comparacin entre el control y los otros medios. Nuevos mtodos para aislamiento, identificacin y sensibilidad
Mtodos radiomtricos
Son tiles para el aislamiento y estudio de sensibilidad. El medio de cultivo es suplementado con un substrato marcado con 14C. El substrato es utilizado, y durante el metabolismo se libera 14CO2, el que es medido, detectndose as en forma indirecta el desarrollo bacteriano. El sistema comercial Bactec que utiliza este mtodo realiza el aislamiento y la determinacin de la sensibilidad en aproximadamente 18 das. El mtodo convencional requiere cerca de 40 das.
DETECCIN
DE COMPONENTES CELULARES
Se trata de identificar por diferentes tcnicas algunos componentes de la bacteria.

Mtodos genticos
DNA fingerprinting, basado en la fragmentacin del ADN por una endonucleasa de restriccin especfica; el ADN despus se separa electroforticamente y se trata con una sonda que hibridiza con una secuencia repetitiva del ADN (IS 6110). Los aislamientos que muestren esta secuencia pueden ser identificados como M. tuberculosis. Esta tcnica parte de cultivo puro.
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REACCIN
EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
A diferencia de otras pruebas, PCR no necesita partir de cultivo puro pudiendo hacerlo directamente de la muestra clnica. En esta tcnica se ampla una secuencia del genoma de M. tuberculosis para despus ser reconocida. El resultado de la PCR puede estar listo en 48 hs. Una muestra conteniendo 10 bacilos puede ser positiva por PCR (para la baciloscopa se necesitan 10.000). La tcnica puede ser til para la deteccin rpida de resistencia, si se conocen los genes responsables de la misma. Las deficiencias de la tcnica estn en los riesgos de contaminacin cruzada y que no resulta de utilidad en el control de tratamiento, ya que no distingue entre bacilos vivos y muertos. Metodos indirectos Se han estudiado mtodos inmunolgicos para la deteccin de anticuerpos por tcnicas inmunoenzimticas, aglutinacin, etc. Estos tienen dificultades para su desarrollo debido a la falta de antgenos purificados especficos.
Prueba de la tuberculina
Siendo la respuesta inmune esencialmente de tipo celular, las pruebas cutneas se transforman en una ayuda importante. Se pueden realizar pruebas cutneas frente a todas las mycobacterias, pero nos referiremos a la prueba tuberculnica. Esta prueba estudia la hipersensibilidad frente a antgenos proteicos de M. tuberculosis. La tuberculina de Koch (OT: old tuberculin) era un extracto de caldo de bacilo tuberculoso. En 1934 Siebert cre un precipitado proteico que llam derivado proteico purificado (PPD) y que se usa hasta hoy. La reaccin se prueba con la intradermorreaccin de Mantoux. Se inyectan en la dermis de la cara anterior del antebrazo 0,1 ml de tuberculina de 5 UT. Despus de 72 hs se mide el dimetro de la induracin producida (no del eritema). La interpretacin de los dimetros de las induraciones es la siguiente: 10 mm Positiva 5-9 mm Dudosa 0-4 mm Negativa El PPD positivo (ms de 10 mm) permite separar una poblacin infectada de otra que no lo est, siendo un buen estudio de masas. De todos modos, debe considerarse el contexto del paciente, su sintomatologa y signologa, as como estudios radiogrficos y datos epidemiolgicos. Concepto de viraje. Si se realizan dos pruebas tuberculnicas con un intervalo de dos meses en un ao, y la primera es negativa y la segunda positiva con una diferencia de 6 mm o ms, se habla de viraje e indica una infeccin actual. Puede o no acompaarse de hallazgos clnicos o radiolgicos.
CRITERIO
DIAGNSTICO
Paciente con sospecha clnica y epidemiolgica de tuberculosis. Paciente con tuberculosis extratorcica en la que hay dificultades para aislar el germen.
CRITERIO
EPIDEMIOLGICO
Contacto con enfermos de tuberculosis. Tuberculosis confirmada (para registro). Si la reaccin tuberculnica es positiva:
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1. El paciente est infectado. 2. El paciente recibi BCG. Si la reaccin tuberculnica es negativa: 1. El paciente no est infectado. 2. El paciente est en perodo prealrgico (perodo que va desde la infeccin hasta la aparicin de la hipersensibilidad retardada). Si dos meses ms tarde se repite la prueba se puede ver el viraje de la reaccin. Puede haber falsos negativos por aspectos tcnicos o en tuberculosis avanzadas en las que el 50% no reacciona por tener elevadas concentraciones de antgenos en sus tejidos; se revierte al recuperarse el paciente. Otros falsos negativos: fisiolgicos-embarazo; infecciones-sarampin; desnutricin; neoplasias-linfomas; medicamentos-corticoides. El 3-5% de la poblacin es inmunocompetente y no reacciona nunca frente a las pruebas cutneas. Prueba tuberculnica en el paciente VIH positivo: en el paciente VIH positivo la reactividad disminuye a medida que los CD4 disminuyen. Un dimetro de induracin de 5 mm es aceptado como positivo en un paciente VIH positivo para realizar inmunoprofilaxis (CDC, Center for Desease Control, Estados Unidos).
Diagnostico de las mycobacteriosis

El diagnstico de las mycobacteriosis en el husped con defensas normales es similar al que acabamos de mostrar para la tuberculosis. Las mycobacteriosis en el paciente con SIDA u otros inmunocomprometidos, demanda una sistemtica diagnstica ms exhaustiva por parte del laboratorio, al igual que en las mycobacteriosis diseminadas. La microscopa incluye el estudio de un mayor nmero de muestras: sangre, heces, ganglios, etc. En cuanto a los cultivos, se realizan los convencionales; el hemocultivo parece ser la mejor manera de aislar mycobacterias en casos diseminados. Los sistemas Bactec e Isolator (lisis-centrifugacin) son medios comerciales disponibles para el procesamiento de los hemocultivos. Para la identificacin, los mtodos convencionales mantienen vigencia, pero los mtodos genticos parecen ser los ms adecuados.
DIAGNSTICO DE MYCOBACTERIUM LEPRAE
El diagnstico bacteriolgico de lepra ofrece la dificultad de que su agente etiolgico no puede ser cultivado en medios sintticos ni en cultivos celulares. La inoculacin animal (armadillo y plantilla plantar del ratn) es muy restringida y tiene dificultades prcticas. Mtodos directos Estos se hallan limitados a la observacin microscpica de frotis provenientes de las lesiones clnicamente sospechosas.
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Microscopa
La tcnica utilizada es la de Ziehl-Neelsen o la de fluorescencia. En tinciones de biopsias puede usarse el Ziehl u otras (Fite). Con los resultados de la microscopa se confecciona el llamado ndice morfolgico, que es el porcentaje de bacilos bien teidos (vivos) en relacin al total; con este se evidencia la actividad de la enfermedad. Mtodos indirectos
Inmunidad humoral
La bsqueda de los anticuerpos est supeditada al hallazgo de antgenos especficos para as diferenciar M. leprae de otras mycobacterias, y determinar los ttulos de una poblacin normal, una infectada y una enferma. Las tcnicas estn en fase de implementacin (ELISA, Inmunofluorescencia, etc.).
Inmunidad celular. Prueba de la lepromina
La prueba cutnea de hipersensibilidad utiliza clulas muertas de M. leprae en inyeccin intradrmica (0,1 ml en la cara anterior del antebrazo). Produce una induracin a los 3 4 das (reaccin de Fernndez), y una induracin papular a las 3 4 semanas (reaccin de Mitsuda). El test de la lepromina es positivo en pacientes con lepra tuberculoide, en individuos no afectados en reas endmicas y en ciertos pacientes lepromatosos tratados, pero es negativa en los pacientes lepromatosos no tratados, por lo que no tiene valor diagnstico. El clnico, el radilogo, el anatomopatlogo, pueden sospechar la enfermedad; el microbilogo puede aislar e identificar el agente etiolgico. Pero esto no es todo, el diagnstico bacteriolgico contina siendo lento, las tcnicas que aceleran la obtencin de resultados estn en desarrollo o recin comienzan a comercializarse. La preocupante asociacin tuberculosis y SIDA contina avanzando. El equipo de salud debe estar atento y con conocimientos firmes para manejar la situacin.
Bibliografa
Bloom, B.R. Tuberculosis. Pathogenesis, protection and control. ASM Press, Washington, 1994. Gorbach SL, Bartlett JG, Blacklow NR. Infectious Diseases. 2nd. Ed. Saunders, Pa., 1998 Chin J, (ed): El control de las enfermedades transmisibles, Organizacin Panamericana de la Salud, (OPS, Publicacin cientfica 581). Washington, 2001
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Virus respiratorios
S. Mateos
Introduccin
Las infecciones respiratorias agudas (IRA) representan un problema prioritario de salud a nivel mundial. Son aspectos a destacar su alta morbimortalidad que aumenta en los meses de invierno donde constituyen el motivo de consulta ms frecuente en atencin primaria y en centros hospitalarios. Es la causa ms frecuente de ausentismo laboral y escolar. Primer causa de internacin en los meses invernales generando grandes exigencias a los centros de internacin, tanto en nios como en adultos. En Uruguay las IRA ocupan el tercer lugar como causa de muerte en nios menores de cuatro aos. Los virus respiratorios son los agentes responsables de la mayora de las IRA, los mismos penetran por va aergena y se replican en el tracto respiratorio, la transmisin se produce por va aergena (gotitas de pflgge) o bien por manos u objetos contaminados con secreciones respiratorias. Numerosos virus afectan predominantemente y en forma primaria el aparato respiratorio, representan ms de 100 agentes etiolgicos distintos, algunos de ellos, como el virus del sarampin, parotiditis y de la rubola, no quedan localizados en la puerta de entrada, sino que se diseminan a otros rganos (viremia). En este captulo trataremos brevemente la clasificacin, estructura y morfologa de las principales familias responsables de IRA, en otros captulos se trataran los procesos respiratorios producidos por virus.
Clasificacin
VIRUS RESPIRATORIOS HUMANOS Familia/ Subflia Orthomixoviridae Paramyxoviridae Gnero Influenza Respirovirus Rubulavirus Morbillivirus Megamyxovuruses Pneumoviridae Pneumovrius Especie A, B, C Parainfluenza Parainfluenza Sarampin Hendra y Nipali virus Virus Respiratorio Serotipos Muchos 1,3 2, 4A, 4B 1 Enfermedad Gripe IRA alta, baja Paperas Parotiditis Sarampin
1 subgr. A y B
IRA alta y baja
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Methapneumovirus Adenoviridae Togaviridae Picornaviridae Mastadenovirus Rubivirus Rinovirs Enterovirus
Sincicial (VRS) HMPV (humano) (MPV) Adenovirus Rubeola Rinovirs humanos Echo Coxsackie
y no A no B
Varios 1 > 130 varios varios varios
IRA alta y baja Rubeola IRA alta IRA alta Encefalitis Miocarditis IRA alta Neumonitis en pacientes inmunodeprimidos
Herpesviridae
Coronavirus Herpesvirus
Herpes simplex Varicela zoster Citomegalovirus
Familia Orthomyxoviridae
La influenza o gripe fue reconocida hace varios siglos como una enfermedad respiratoria aguda, extraordinariamente contagiosa. A pesar de que a menudo aparenta ser una enfermedad benigna, la gripe es una enfermedad grave que provoca la muerte a miles de personas cada ao. No solamente produce pandemias, tales como al gripe Espaola (1918) la gripe Asitica (1957), sino tambin epidemias anuales que pueden tener consecuencias dramticas sobre los grupos de alto riesgo (principalmente ancianos y personas que padecen enfermedades crnicas). El agente causal fue aislado por primera vez en 1933, a partir de secreciones respiratorias de casos humanos y fue denominado virus influenza tipo A. Desde entonces es quizs el virus humano mejor estudiado, su estructura bien caracterizada y su genoma secuenciado; el desarrollo de vacunas y antivirales sin embargo, no han podido resolver el problema sanitario de la gripe.
TAXONOMA
Las familias Orthomixoviridae (del griego orthos: derecho y myxo: mucus) y Paramyxoviridae (par: al lado) estn integradas por virus que poseen afinidad por las mucinas. La familia Orthomyxoviridae posee slo un gnero, influenza y tres especies A, B y C. El ordenamiento alfabtico de los tres tipos corresponde a su importancia epidemiolgica y clnica. Los virus influenza A producen infeccin en humanos y animales (aves, porcinos, equinos, focas) mientras que influenza B y C estn asociadas slo a enfermedades humanas.
NOMENCLATURA
Los antgenos NC y M son especficos de tipo y en base a ellos se caracteriza al virin como perteneciente al tipo A, B o C. Las variaciones antignicas se producen en los antgenos de superficie NA y HA. Considerando el papel fundamental de estas glicoprotenas en la determinacin del carcter antignico la OMS ha propuesto un sistema de nomenclatura en el cual los antgenos de superficie se designan numricamente. En la designacin actual se consideran: 1- el tipo de virus (A, B, C); 2- el husped de origen si no es humano (por ej.: eq equino; sw porcino, etc.); 3- lugar geogrfico del aislamiento; 4- nmero de la cepa del laboratorio; 5- ao del aislamiento. Para el virus A se agrega el subtipo de HA y NA. En los virus A existen hasta el momento 13 subtipos de HA y 9 de NA. Por ejemplo, A/Panam/2007/99 (H3N2).
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MORFOLOGA Y ESTRUCTURA
Forma redondeada u oval de aproximadamente 80 a 120 nm. Son virus envueltos con 2 tipos de espculas glicoproticas en su superficie dispuestas a intervalos regulares, denominadas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), especficas para cada cepa, enclavadas en una doble membrana lipdica (envoltura) ubicada sobre una capa proteica (protena M o matriz) que da forma y estabilidad a la envoltura (ver figura 1). La nucleocpside (NC) es de simetra helicodal, dividida en ocho fragmentos que contienen segmentos de ARN genmico. La NC est constituida por 1 solo tipo de protenas. El genoma est constituido por ARN de cadena simple y sentido negativo con ocho segmentos para el virus influenza A y B, y siete segmentos para influenza C. Protenas: polipptido-polimerasas son componentes internos del virin. Los segmentos mayores del ARN viral 1, 2 y 3 codifican 3 polipptidos con actividad de ARN polimerasa, dependiente de ARN, denominados PA, PB1 y PB2. PB1 y PB2 sintetizaran el ARN complementario de las PA, y junto con la nucleoprotena se encargaran de la sntesis del ARN viral. Hemaglutinina: forma de bastn, ubicada en la superficie viral representa el 25% de las protenas totales. Codificada como un monmero por el segmento 4 del ARN viral. Al continuar su sntesis el pptido indicador amino terminal es removido, la molcula de HA sufre un clivaje postraduccin por la accin secuencial de una endoproteasa y carboxipeptidasa que se originan en el husped. Se obtienen as dos cadenas polipeptdicas (HA1 y HA2) que constituyen un dmero y permanecen unidos por una unin disulfuro. Este clivaje es esencial para activar las propiedades de la molcula: infectividad, fusin y hemlisis. La HA consta de dos regiones distintas: una cola fibrilar constituida por una triple cadena espiralada de helicoides, y una regin globular de capas antiparalelas que en su extremo distal contienen: 1) un sitio adsortivo viral (receptor viral), por el cual la HA1 se une a los receptores silicos de la clula husped y a los eritrocitos; y 2) los determinantes antignicos variables (eptopes) cuyos cambios en las secuencias de aminocidos hacen que el virus se comporte como epidmico o pandmico. En el extremo NH2 de la HA2, existe una regin conservada de 10 aminocidos (pptido de fusin), que sera homlogo a la regin aminoterminal de la glicoprotena de fusin (F) de los virus parainfluenza. La infectividad viral dependera de la
Figura 1. Esquema de la estructura de Influenza A
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fusin de la HA. A pH 5 la HA2 sufre cambios conformacionales y adquiere la habilidad de hemolisar eritrocitos. En suma las funciones de la HA seran: a) adsorcin y penetracin del virus a la clula b) fusin entre la membrana celular y la envoltura viral, para lo cual requiere el clivaje de HA en HA1 y HA2 c) hemaglutinacin, hemadsorcin d) induce la aparicin de anticuerpos neutralizantes protectores. Neuraminidasa (NA): forma de hongo, formada por una cabeza cuadrangular integrada por cuatro subunidades globulares y una prolongacin cilndrica adherida centralmente, que posee en su extremo distal una regin hidrfoba por la que penetra en la envoltura viral. Enzima destructora de receptores, representa el 6.7% del total de protenas del virin 1 a 5 en relacin con la HA. Codificada por el segmento 6 del ARN viral, se sintetiza como cadena simple igual que la HA, no sufre clivaje postraduccin. Penetra a la envoltura por su extremo aminoterminal, donde existe una secuencia de seis aminocidos que se han conservado inalterados en cada uno de los nueve subtipos de NA conocidos para influenza A. A esta secuencia le sigue una segunda que se enclava en la envoltura y que no es conservada por todos los subtipos. El sitio activo ha sido identificado en el centro de cada cabeza globular del tetrmero y contiene muchos residuos conservados que no son accesibles a los anticuerpos neutralizantes. Su funcin es facilitar la movilidad del virus hacia y desde el sitio de infeccin. En suma las funciones de la NA son: a) catalizar el clivaje de las uniones entre el cido silico terminal y un residuo azucarado adyacente celular. Lo que facilita la liberacin de las partculas virales de la superficie celular al destruir la unin virus clula. b) previene la agregacin viral protegiendo al virus de su propia HA, al agregarse a receptores de cido silico. c) estimula la produccin de anticuerpos que confieren proteccin contra la enfermedad o modifican el curso de la misma. Nucleoprotena: codificada por el segmento 5 del ARN viral. Es uno de los antgenos especficos de grupo y es diferente en los tipos A, B y C. Constituye la columna vertebral del complejo interno helicoidal, al estar asociada a los segmentos de ARN y las polimerasas PA, PB1 y PB2, induce la produccin de anticuerpos especficos de tipo. Protena M: codificada por el segmento 7, asociada al sector interno de la envoltura, se han aislado 3 ARNm trasncriptos del segmento 7 que codifican la produccin de M, M1 y M2. Contribuye a la estabilidad del virin y participa del ensamblaje de ste en la clula infectada. Es un antgeno especfico de tipo y puede ser utilizado como antgeno para identificar virus influenza en pruebas serolgicas. Protenas no estructurales (NS1-NS2): codificadas por el segmento 8. Su funcin se desconoce. Lpidos: los virus influenza se liberan de la clula que infectan por brotacin a nivel de la membrana citoplasmtica y en su paso incorporan la doble membrana celular con sus componentes. Hidratos de carbono: constituyen el 5-8% de la masa del virin y es similar a los de la clula husped.
VARIACIN ANTIGNICA
Uno de los aspectos nicos y ms notables del virus influenza es la frecuencia con la cual ocurren cambios en la antigenicidad. Este hecho es ms frecuente para el virus A que para el B, y
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no se ha observado para el virus C. Este fenmeno ayuda a explicar porqu la gripe contina siendo una enfermedad epidmica. Las variaciones antignicas involucran fundamentalmente a la HA y NA. Las variaciones en la HA son las ms importantes por ser ms frecuentes. Por otro lado los anticuerpos neutralizantes estn dirigidos contra estas glicoprotenas. Se conocen dos tipos de variaciones antignicas producidas por mecanismos diferentes y que afectan la HA y NA: 1- variaciones menores o fluctuaciones antignicas (drift) y 2- las variaciones mayores (shift). 1. Variaciones menores: se producen gradualmente cada 2 o 3 aos dentro de un subtipo de influenza. Cada subtipo se denomina por su HA o NA. Estos cambios son el resultado de la seleccin de mutantes que tienen alteraciones en la secuencia de aminocidos de los pptidos de HA o NA, causadas por mutaciones puntuales en el ARN virales. Estos cambios, aunque menores, son suficientes para no ser reconocidos por los anticuerpos. Se produce una seleccin inmunolgica, es decir nuevos virus con poca variacin antignica. 2. Variaciones mayores: han sido descritas slo para influenza A. Son cambios sbitos y dramticos producidos en los genes que codifican para la HA y NA. Son virus nuevos para los cuales la poblacin no tiene ningn recuerdo inmunolgico. Estas son las cepas que causan las mayores pandemias, son ejemplos de ello los cambios de estructura de H1N1 a H2N2 en 1957 y de H2N2 a H3N2 en 1968. El virus humano influenza tipo A H1N1 aislado por primera vez en 1933, circul hasta 1957, ao en que se produjo el primer cambio mayor detectado en los antgenos de superficie. En 1968 aparece el virus H3N2 y en 1977 reaparece el H1N1, desde entonces hasta la fecha coexisten cepas de influenza A H1N1 y H3N2. Hay varias hiptesis que tratan de explicar estas variaciones: a) entrecruzamiento o reordenamiento gentico entre virus influenza humanos y no humanos, en especial los de origen aviario. Los virus B y C no muestran variaciones, quizs debido a que existen pocos virus semejantes en animales. b) que se hallan acumulado mutaciones puntuales y que en un momento se manifiesten como variaciones mayores.
REPLICACIN
Los virus influenza pueden producir infecciones productivas o no productivas. Las primeras ocurren cuando el virus se propaga en clulas permisivas (mucosa respiratoria, clulas de rin de mono o huevos embrionados). En las infecciones no productivas, el virus no cumple el ciclo total de replicacin y genera virus incompletos o partculas virales no infecciosas (ver figura 2). Cuando un virus completo infecta clulas permisivas, el primer paso es la adsorcin a la superficie celular. La partcula viral se adhiere a receptores celulares que contienen cido silico a travs de la HA1. En una segunda etapa ocurre la penetracin del virus a la clula para lo cual se requiere que la HA sea clivada en HA1 y HA2, y que exista pH 5 para que la capacidad de fusin sea expresada. El virus se internaliza rpidamente en el endosoma, cuando el pH desciende, la HA es clivada exponiendo el pptido de fusin. Se produce la fusin entre las membranas celular y la membrana viral que se libera de su envoltura y penetra en el citoplasma, luego se moviliza hasta el ncleo. La sntesis de ARNm requiere estimulacin previa de la sntesis de ARN de la clula husped. A continuacin comienza el perodo de eclipse (dos horas), durante el cual no se detecta virus. Durante esta etapa temprana, el ARNm es transportado al citoplasma donde dirige la sntesis de protenas virales. El ARN complementario sirve como molde para la formacin de ARN genmico. A las dos
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Figura 2. Replicacin de los virus Influenza
o tres horas postinfeccin se detecta ARN polimerasa dependiente de ARN y NP , alcanzando su concentracin mxima a las seis horas de la infeccin. Las glicoprotenas HA y NA son sintetizadas en el citoplasma sobre la membrana de los polirribosomas, migran hacia la membrana celular, va retculo endoplsmico y complejo de Golgi, y al mismo tiempo se van incorporando las cadenas laterales de los hidratos de carbono. La nucleocpside viral y la protena M son formadas sobre polirribosomas libres. Se trasladan y se ubican en un sector interno de la membrana celular donde se encuentran las protenas especficas virales. No se conoce el proceso por el cual una copia de cada segmento de ARN se empaqueta en cada partcula, es probable que esto sea un evento al azar. Los segmentos de membrana celular que contienen las HA y NA envuelven a los antgenos internos virales y se inicia la brotacin, que progresa hasta que emerge la nueva partcula. Los residuos de cido silico son eliminados de la superficie de la clula husped por accin de la NA viral, para prevenir la readsorcin de la progenie viral, y se promueve la liberacin del virus. La replicacin del virus produce la muerte de la clula infectada.
EPIDEMIOLOGA
El virus influenza A infecta no slo al hombre sino tambin animales (porcinos, aves domsticas y silvestres, focas). En mamferos, la enfermedad est limitada al aparato respiratorio, mientras que en aves se puede manifestar como infeccin asintomtica o enfermedad sistmica letal. El virus C es el menos importante y causa infecciones leves espordicas no epidmicas, el virus B en ocasiones puede producir epidemias, sin embargo, el virus A puede cruzar continentes y causar pandemias.
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La epidemiologa de la gripe, como ocurre con las infecciones virales en general, est influenciada por una compleja interaccin de factores que afectan la transmisin del virus de persona a persona. Estos factores son: la virulencia y antigenicidad viral; la inmunidad del husped y el ambiente. La virulencia de los virus influenza coincide con el orden alfabtico. El virus A est asociado con neumona e infecciones graves en adultos mayores y nios pequeos, infecciones menos graves se asocian con los virus B y C. Los brotes son claramente influenciados por factores estacionales, la gripe aparece con mayor frecuencia en los meses de invierno, las temperaturas bajas y la humedad aumentan la susceptibilidad del epitelio respiratorio a la infeccin y al mismo tiempo, favorece la supervivencia del virus en las secreciones respiratorias eliminadas. Los nios en edad escolar son los vectores fundamentales de transmisin, el hacinamiento en las escuelas favorece la propagacin del virus. Si bien los brotes epidmicos ocurren en invierno, hay que recordar que los virus influenza cocirculan durante todos los meses del ao. Una vez instalado el brote de influenza A y B, se extiende durante 4 a 8 semanas, respectivamente, mientras que el virus C puede extenderse hasta 17 semanas, sugiriendo una mayor endemicidad en la poblacin. Los cuadros gripales causados por algunos subtipos de influenza A (H1N1, H2N2, H3N2) pueden presentarse en forma pandmica (difusin mundial), epidmica (difusin restringida a nivel regional) o en forma de brotes espordicos moderados. En los ltimos aos se han comunicado a la poblacin, a travs de la prensa, casos de gripe humana de origen aviar, la llamada gripe del pollo. La gripe aviar es un subtipo del virus A (H5N1) primariamente aislada en frica del sur en 1961, que circula entre aves en todo el mundo. Este virus no infecta tpicamente a humanos, sin embargo, en 1997 se demostr por primera vez un caso de transmisin ave-humano (H5N1) en Hong Kong, esta cepa se aisl en 18 personas con una infeccin respiratoria aguda y severa, de las cuales 6 fallecieron. Hasta el momento no se ha demostrado la transmisin interhumana de esta cepa aviar. Desde 1997 se han reportado varios brotes de gripe aviar en Asia. En 2003 se comunicaron casos de gripe aviar (H7N7) en los Pases Bajos con ms de 80 casos, predominando infecciones respiratorias leves a moderadas, e infecciones oculares, con baja mortalidad (1 caso). La vigilancia de los brotes de influenza es ms extensa que cualquier otra infeccin, ya que ocasiona grandes prdidas econmicas, la misma tiene por finalidad identificar la aparicin temprana de nuevas cepas para preparar vacunas contra estas cepas antes de que ocurra una epidemia. En nuestro pas el centro de vigilancia de influenza opera bajo la rbita del MSP .
PANDEMIAS Y EPIDEMIAS
Las pandemias son eventos mundiales producidos por nuevas variantes antignicas del virus influenza A, que aparecen en perodos variables de 10 aos. Las tasas de ataque son altas en todos los pases y afectan a todos los grupos etarios, la mortalidad es elevada. Las pandemias comienzan y se diseminan en cualquier poca del ao y pueden producir 2 o 3 ondas en 1 o 2 aos de expansin. Las pandemias de influenza se han originado frecuentemente en el sudeste asitico, donde las comunidades rurales densamente pobladas, viven en estrecha proximidad con aves. Este ecosistema permite que ocurran recambios genticos entre virus de diferentes especies y virus humanos. Las epidemias son producidas por virus influenza A o B que han sufrido variaciones menores. Aparecen cada 2 o 3 aos y no se inician en un lugar determinado, sino que surgen en diferentes lugares. En el hemisferio sur se detectan 6 meses antes o despus que en el hemisferio norte, con iguales o similares cepas de virus.
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La primera pandemia del siglo se registr en 1918-1919, gripe Espaola (H1N1) se estima que fallecieron ms de 20 millones de personas y casi la mitad de las muertes ocurrieron en adultos jvenes y sanos. De todas las pandemias producidas en este siglo slo las de 1957, 1968 y 1977 fueron estudiadas clnica, virolgica y epidemiolgicamente. Las tres se iniciaron en China, y dos de ellas tuvieron como agente causal a dos nuevas variantes para este siglo, las estructuras H2N2 y H3N2. La tercera, producida en 1977, fue causada por la reaparicin de un virus histrico que desapareci del mundo por 20 aos (H1N1).
PATOGENIA
Como para el resto de los virus respiratorios la puerta de entrada es la va respiratoria. Altamente infeccioso, se transmite de persona a persona por gotitas llevadas por el aire, por contacto directo con otra persona infectada, o por contacto con superficies contaminadas con secreciones respiratorias, destacamos muy especialmente las manos como vehculo de transmisin de los virus respiratorios por su importancia capital en la prevencin de infecciones nosocomiales en especial entre nios. Luego de que ingresa a las vas respiratorias, alcanza la mucosa o directamente llega a los alvolos pulmonares. Si las partculas virales no son expulsadas por el reflejo de la tos y escapan a la neutralizacin por anticuerpos IgA especficos, o es inactivado por sustancias inespecficas de las secreciones mucosas, pronto se formar una progenie de viriones nuevos que se diseminan a las clulas adyacentes. La NA como vimos disminuye la viscosidad de la pelcula mucosa y favorece la dispersin del virus hacia sectores inferiores del tracto respiratorio. En los estudios histolgicos se observa reordenamiento de las clulas columnares, picnosis, fragmentacin nuclear y vacuolizacin citoplasmtica. Al desintegrarse los ncleos se observan cuerpos de inclusin en el citoplasma y las cilias desaparecen. En definitiva la infeccin termina destruyendo las clulas que infecta.
El perodo de incubacin es de pocas horas a tres das. El comienzo es agudo y predominan los sntomas sistmicos como fiebre, chuchos de fro, artromialgias, malestar general, anorexia, cefalea (sndrome de impregnacin viral), es caracterstica la inyeccin conjuntival y lagrimeo. Los sntomas respiratorios incluyen estornudos, tos seca al inicio que luego de algunos das se vuelve mucosa y muco purulenta, secrecin nasal, odinofagia. Se pueden ver trastornos digestivos como vmitos, dolor abdominal, diarrea. El perodo de estado vara entre 1 a 3 semanas y el perodo de excrecin viral vara entre 3 a 7 das. Las complicaciones de la gripe pueden ser respiratorias (ms frecuentes) laringitis, laringotraqueobronquitis, bronquitis, bronquiolitis, neumona. Es clsica la neumona a Staphylococcus aureus como complicacin de una gripe. Complicaciones neurolgicas (menos frecuentes) incluyen encefalitis, radiculitis, polineuritis, sindrome de Guillain-Barr, sindrome de Reye, convulsiones. Otras complicaciones incluyen: miocarditis, pericarditis, miositis.
PROFILAXIS
El Center for Disease Control (CDC) recomienda dos mecanismos para disminuir el impacto de la gripe: inmunoprofilaxis y quimioprofilaxis. La vacunacin es sin duda la medida ms efectiva. La misma est elaborada a partir de virus vivos inactivados por sucesivos pasajes en huevo de gallina embrionados e inactivados por formalina. Las vacunas se reformulan en cada primavera para que contengan los antgenos virales que circularon ese ao. Est constituida por tres cepas de virus influenza B y dos
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tipos de IA (H3N2-H1N1), como se dijo se reformula con las cepas que ya circularon. Las personas sanas desarrollan ttulos elevados de anticuerpos contra la cepa vacunal aunque los lactantes y personas con enfermedades de base desarrollan ttulos menores. A pesar de que la vacuna no previene las infecciones respiratorias agudas sin previenen las complicaciones de las mismas fundamentalmente la neumona. La eficacia vara entre 30-70%. La utilizacin de vacunas no ha demostrado disminuir la incidencia de epidemias, pero si reduce la morbimortalidad, especialmente entre individuos de alto riesgo, a los cuales se recomienda especialmente la vacunacin, estos son: personas mayores de 65 aos, pacientes portadores de insuficiencia cardaca, EPOC, bronquticos crnicos, diabticos, alcoholistas, asmticos, personal de salud, embarazadas en perodo epidmico en el segundo o tercer trimestre. Hay poca informacin en cuanto al VIH y la vacuna, algunos reportes no sugieren la vacunacin con virus vivos independientemente del recuento de CD4. Est contraindicada en pacientes con hipersensibilidad al huevo y los que estn cursando un cuadro febril.
Familia Paramixoviridae
En las ltimas dcadas ha habido cambios considerables en la nomenclatura y taxonoma de los virus parainfluenza humanos (HPIV). Fueron descritos en 1950, cuando 3 tipos distintos de virus fueron aislados en nios que padecan una IRA baja, estructuralmente parecidos a los mixovirus (influenza), rpidamente fueron separados en otra familia. Difieren de los virus gripales en su tamao, estructura antignica y genoma, no crecen con facilidad en huevos embrionados. La familia Paramixoviridae incluye a los agentes causales de enfermedades comunes en la infancia como el sarampin y paperas, y virus que producen infecciones respiratorias que son los que trataremos en este captulo. Todos ingresan por va respiratoria y producen infecciones agudas, ya sea localizadas en el tracto respiratorio, o bien diseminadas a otros rganos.
TAXONOMA
Esta familia comprende virus que infectan al hombre y animales. Actualmente se dividen en dos subfamilias: Paramixoviridae y Pneumoviridae. Paramixoviridae, incluye cuatro gneros: 1- Respirovirus, (una especie, Parainfluenza 1 y 3); 2- Rubulavirus, (dos especies, Parainfluenza 2, 4A, 4B y Parotiditis); 3- Morbilivirus, (una especie, Sarampin). 3- Megamyxovirus, (dos especies, Hendra y Nipali recientemente descritos). Pneumoviridae, incluye dos gneros: 1- Pneumovrius, (una especie, VRS); 2- Methapneumovirus, (una especie, metapneumovirus humano (HMVP), recientemente descrito filogenticamente, ms cercanamente relacionado con los morbilivirus).
Los paramixovirus son virus esfricos de mayor tamao que los orhomixovirus, presentan ms pleomorfismo debido a que poseen una envoltura laxa. Su tamao vara entre 150 y 250nm. Es muy lbil al calor, a la desecacin, por ello el transporte de las muestras clnicas para aislamiento debe realizarse con extremo cuidado a 4C para evitar la inactivacin viral. Nucleocpside: tubular de simetra helicoidal, constituida por dos protenas (N y NP) cercanamente relacionadas con el genoma. El mismo est constituido por ARN de polaridad negativa asociada a una transcriptasa viral, una diferencia esencial con respecto a los orthomixovirus es que el genoma no es segmentado, lo que hace que sea ms estable genticamente.
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Envoltura: una doble capa lipdica que adquieren al brotar de la clula husped posee tres protenas: dos son glicoprotenas y una es no glicosilada y se encuentra en la parte interna (protena M). Las dos glicoprotenas se encuentran en dos tipos de proyecciones o espculas, una de ellas contiene juntas la actividad de hemaglutinina y neuraminidasa y se denomina HN. La otra espcula de los paramixovirus contiene la glicoprotena F o protena de fusin, fundamental para la penetracin viral por fusin de su envoltura con la membrana celular, as como la diseminacin intracelular, dando lugar a la formacin de sincicios (clulas gigantes multinucleadas). Para ser activa la protena F debe ser clivada en dos polipptidos F1 y F2, lo que ocurre por accin de proteasas celulares.
REPLICACIN
La adsorcin a receptores celulares se produce a travs de la hemaglutinina y la protena F, la neuraminidasa presente en la misma espcula puede revertir este proceso. El ciclo de replicacin entre los paramixovirus es similar si bien difieren en el perodo de latencia. Luego que penetran al citoplasma pierden la cubierta de la nucleocpside liberando su ARN. La sntesis de ARN se realiza en el citoplasma, mediante una ARN polimerasa ARN dependiente (ver figura 3). Se sintetiza, por un lado, el ARNm que codificar las protenas virales, por otro lado este ARN sirve de molde para copiar el ARN genmico que ser rodeado por las protenas de la NC. Durante el ensamblaje y maduracin de los nuevos viriones, las NC se ubican en zonas cercanas a la membrana celular, la que se modifica por accin viral y expresa glicoprotenas de origen viral que dan lugar a los fenmenos de hemadsorcin, hamaglutinacin o fusin celular, con la tpica formacin de sincicios. Los nuevos viriones salen por gemacin arrastrando la envoltura celular.
VIRUS PARAINFLUENZA
Los virus parainfluenza pueden producir un amplio espectro de cuadros clnicos, de gravedad variable que dependen del tipo de virus y sobre todo de la edad del paciente. Tienen una distribucin mundial, existen 5 tipos (1, 2, 3, 4A y 4B). Producen habitualmente infecciones leves del tracto respiratorio superior en adultos y constituyen clsicamente la causa ms frecuente de laringitis en nios pequeos. La primoinfeccin, habitualmente en lactantes se manifiesta como una infeccin respiratoria aguda alta (rinitis, faringitis). Sin embargo cuando afecta al tracto respiratorio
Figura 3.

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inferior producen, laringitis (crup), bronquiolitis, neumona. Las primoinfecciones suelen ser producidas por el tipo 3, despus del primer mes de vida. Se ha demostrado que la mitad de los nios poseen anticuerpos antes del primer ao de vida. Ocurren infecciones durante todo el ao, son frecuentes los brotes epidmicos en guarderas. En nios entre 6 meses y 6 aos los virus parainfluenza 1 y 2 constituyen las causas ms frecuentes de laringitis. En nuestro pas la mayora de los casos se observa en forma epidmica en los meses de otoo. Parainfuenza 3 puede producir bronquiolitis, neumonas y otitis media. Los tipos 4A y 4B producen habitualmente infecciones respiratorias altas de menor gravedad. Las reinfecciones son frecuentes, tanto en nios como en adultos, ya que la inmunidad es de escasa duracin y tipo especfica.
VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL (VRS)
Es un importante patgeno productor de infecciones respiratorias agudas en nios pequeos tanto por su frecuencia como por su gravedad. El VRS es la causa ms frecuente de bronquiolitis en nios menores de un ao, y constituye la causa ms frecuente de hospitalizacin por IRA en menores de un ao. Se diferencia de otros paramixovirus en que no posee hemaglutinina, en su envoltura posee una glicoprotena mayor, protena G, que permite la unin al husped y una protena de fusin o F, factor esencial en la infeccin y la patogenia, ya que media la fusin de la envoltura y la membrana celular. Se conoce slo un serotipo con cuatro variantes o subtipos (A, B, no A-no B y AB). Es un virus muy lbil a la desecacin, al calor y a los agentes externos, una adecuada higiene de manos y objetos es fundamental en el control de la transmisin del mismo. Los dos grupos antignicos principales A y B han sido identificados sobre la base de anticuerpos monoclonales, estos grupos antignicos cocirculan en cada epidemia, siendo el grupo A el ms frecuentemente encontrado y el que habitualmente se asocia a enfermedad ms grave segn distintas series. Sin embargo, en nuestro pas existe una alternancia en la predominancia entre los grupos A y B durante aos sucesivos, no habiendo diferencias en cuanto a la gravedad de la enfermedad segn grupo antignico. En nuestro pas, segn datos de un estudio realizado en el CHPR entre los aos 19992002 el 82% de las causas de IRA que se hospitalizaron en nios menores de 2 aos fueron producidos por VRS. VRS es responsable de ms de la mitad de las infecciones respiratorias agudas en menores de 90 das. Las formas graves de infecciones por VRS, potencialmente evitables, afectan tanto a nios sanos como a pretrminos, o nios con comorbilidad. El conocimiento de la epidemiologa de esta infeccin en adultos es muy limitado, ya que no hay muchos estudios al respecto y ninguno nacional hasta el momento. En un estudio retrospectivo publicado en Clinical Medical Reviw 2000 (ASM), se encontr a VRS como agente de neumona en un 4 a 18% de los adultos. Y de estos, 80% eran mayores de 65 aos. La mayora de ellos presentaba comorbilidad (EPOC, asma, insuficiencia cardaca congestiva, inmunodeprimidos). En nuestro pas se ha documentado a VRS como causa frecuente de infeccin intrahospitalaria, siendo las manos del personal de salud el vehculo ms frecuente de transmisin. Las epidemias se suceden al final del otoo, durante todo el invierno extendindose hacia el inicio de la primavera. Precede a la epidemia por virus influenza A.
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Familia Adenoviridae
TAXONOMA
Comprende un gran nmero de especies de origen humano y animal. La clasificacin actual ha agrupado a los miembros de esta familia en dos gneros: mastadenovirus y aviadenovirus. Los mastadenovirus incluyen adenovirus humanos, simiescos, bovinos, equinos, porcinos, ovinos y murinos. Todos ellos se caracterizan por ser especficos de especie y por presentar gran variabilidad gentica. Producen una amplia gama de enfermedades que tienen como puerta de entrada ya sea la orofaringe, mucosa ocular o intestinal. Clasificacin de los adenovirus humanos: se han descrito hasta el momento 42 especies o serotipos diferentes. Los adenovirus humanos se han agrupado en seis subgneros (A a F) en base a las caractersticas fisicoqumicas, homologa de sus ADN genmicos. El subgnero A comprende los serotipos 12, 18 y 31. El subgnero B contiene a los serotipos 3, 7, 11,14, 16, 21, 34 y 35. El subgnero C incluye los serotipos 1, 2, 5 y 6. El D comprende lo serotipos 8, 9, 100, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25,, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, y 42 al 49. El subgnero E contiene una nica especie, hAd4. El subgnero F est representado por los serotipos 40, 41, adenovirus entricos.
Nucleocpside: de simetra icosadrica, constituida por 252 unidades morfolgicas o capsmeros, formadas a partir de protenas estructurales. De ellas, 240 son hexones, que constituyen cada una de las caras triangulares del prisma y 12 son pentones, que se ubican en cada uno de los vrtices y poseen una proyeccin con apariencia de antena que se denomina fibra y es la estructura que interacta con la superficie celular en la adsorcin viral. Los principales determinantes antignicos estn localizados en los hexones y pentones. El hexn est formado por tres cadenas idnticas del polipptido II y cada fibra por tres unidades idnticas del polipptido IV (ver figura 4). Son virus desnudos, hecho que les ofrece gran resistencia a las condiciones ambientales, son estables a pH bajo y resistentes a las secreciones cidas del estmago, tambin resisten solventes orgnicos como ter, alcohol, clorhexidina; el hipoclorito 500ppm lo inactiva en 10 minutos y la temperatura mayor de 60C tambin. Genoma: constituido por ADN bicatenario, lineal, asociado a los polipptidos V y VII formando un core organizado en 12 subunidades esfricas, cada una de ellas asociada con un vrtice del icosaedro.
REPLICACIN
Los adenovirus slo se replican bien en clulas epiteliales, el ciclo de replicacin se divide en una fase temprana (E) y una fase tarda (L). La infeccin se inicia con la unin de la fibra a un receptor presente en la superficie de las clulas permisivas, la partcula penetra por endocitosis, los pentones son removidos y el resto de la nucleocpside migra hacia el ncleo donde tiene lugar la replicacin del ADN. La traduccin de los mensajeros tiene lugar en el citoplasma. Luego de la entrada del virus a la clula se produce la interrupcin de la sntesis proteica del husped, esto explicara en parte, el motivo de la lisis celular. En la fase temprana el genoma viral se transcribe segn un programa complejo y se duplica. En la fase tarda la transcripcin de los mensajeros tardos se inicia poco despus de comenzada la duplicacin del ADN. Estos codifican todas las protenas estructurales. Los polipptidos estructurales son transportados al ncleo donde comienza el ensamblaje. Las partculas virales recin formadas constituyen
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Figura 4.
agregados cristalinos en forma de cuerpos de inclusin intranucleares. Los adenovirus formados son liberados por ruptura de la clula infectada.
PATOGENIA
Los adenovirus se caracterizan por su capacidad para suprimir la expresin del genoma de la clula husped y por la importante sntesis de protenas estructurales que tiene lugar en la misma. Esto tiene como consecuencia la acumulacin de protenas virales (cuerpos de inclusin) que interfieren en el normal funcionamiento de la clula. La protena de la base del pentn (fibra) se asocia con una actividad txica responsable del desprendimiento de monocapas celulares en cultivo, por otro lado la cpside es capaz de ejercer un efecto directo sobre la bicapa lipdica del endosma provocando la liberacin de su contenido al citosol.
EPIDEMIOLOGA Y MANIFESTACIONES CLNICAS
Causan infecciones oculares, diarrea, infecciones urinarias y de vas respiratorias. Las infecciones por adenovirus ocurren en todo el mundo como epidemias, endemias o casos espordicos. Los diferentes genotipos muestran diferencias segn su distribucin geogrfica. En EE.UU. predomina en subgnero C serotipos 1, 3 y 5 y subgnero B serotipos 3 y 7 como causas de enfermedad respiratoria, los serotipos 40, 41 se asocian a diarrea infecciosa. En Amrica del Sur predomina el subgrupo B serotipo 7H. Las infecciones por adenovirus son ms frecuentes en invierno y primavera. La faringoamigdalitis se ve ms frecuentemente en verano asociado a las piscinas. Las infecciones respiratorias tienen un pico de incidencia entre los seis meses y cinco aos. Los factores de riesgo son las deficiencias en la inmunidad mediada por clulas, prematuros, recin nacidos, transplantados, pobreza. La transmisin se realiza a travs del contacto directo con aerosoles o secreciones respiratorias a travs de las manos, va fecal-oral, agua contaminada. Tambin se ha demostrado como agente de infecciones nosocomiales.
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Infecciones respiratorias: responsables del 5% de los casos de infecciones respiratorias en nios menores de 5 aos y del 10% de las infecciones que requieren hospitalizacin. En adultos los cuadros clnicos caractersticos incluyen faringoamigdalitis pultcea, conjuntivitis, congestin nasal, tos, fiebre alta, mialgias, cefaleas. Tambin pueden ocasionar fundamentalmente en nios, laringitis, bronquiolitis, pero las neumonas son, sin lugar a dudas, las manifestaciones clnicas ms severas, sobre todo en nios e inmunodeprimidos, muchas veces mortales. En algunas oportunidades, luego de una infeccin severa por adenovirus en nios, se observa dao pulmonar residual con bronquiectasias y bronquiolitis obliterante, sndrome de pulmn hiperclaro unilateral, condiciones que pueden llevar al nio a ser dependiente de oxigeno (dao potviral). En suma, los adenovirus afectan fundamentalmente a la poblacin peditrica, la gravedad depender del husped y del serotipo implicado. Raramente se producen infecciones por el mismo serotipo debido a que se produce una respuesta inmune tipo especfico.
Familia Picornaviridae
Son los virus de ARN de menor tamao, de donde deriva su nombre (pico = pequeo). Constituida por diferentes gneros: enterovirus, rinovirus y dos gneros que infectan animales, aftovirus y cardiovirus.
Picornavirus humanos
Gnero Enterovirus Especie Polio Coxsackie grupo A Coxsackie grupo B ECHO Enterovirus Rinovirus humanos Serotipo 3 (1 a 3) 23 (A1 a A22, A24) 6 (b1 a B6) 31 (1 A 9, 11 A 27, 29 A 33) 5 (68 a 71, el 72 Virus hepatitis A) > de 110
Rinovirus
Miden entre 20 y 30 nm, su genoma es de ARN de cadena simple no segmentado de polaridad positiva. Poseen una cpside de simetra icosadrica y son virus desnudos. Al carecer de envoltura son resistentes a los solventes y detergentes, sin embargo se inactivan rpidamente por radiaciones ionizantes, hipoclorito y formol. Los enterovirus son resistentes a pH cido lo que les permite, luego de la replicacin inicial en orofaringe, atravesar estmago e implantarse en el tracto digestivo inferior. La temperatura ptima de replicacin de los enterovirus es a 37C mientras que para los rinovirus es de 33C. Los rinovirus infectan slo a primates superiores y humanos. Son los agentes responsables del resfro comn, existen ms de 100 serotipos que no presentan inmunidad cruzada entre ellos, lo que permite la existencia de infecciones repetidas. En regiones de climas templados como el nuestro se presentan picos caractersticos en otoo y primavera, mientras que en regiones de clima tropical las infecciones se localizan en la poca lluviosa del ao. Su distribucin es mundial y la transmisin se produce en forma directa por va respiratoria e indirecta por manos u objetos contaminados. Los principales sitios de transmisin son el hogar y la escuela, siendo los nios en edad escolar los que frecuentemente la introducen.
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Sndrome respiratorio agudo y severo (SARS)

En noviembre de 2002 fue reportado el primer caso del sndrome respiratorio agudo y severo en Foshan, Guangdong, China. La dramtica expresin del SARS a fines del invierno y principios de la primavera amenazaba con ser una enfermedad epidmica de distribucin mundial. Sin embargo, tan rpidamente como fue identificada pudo ser controlada en sus lugares de orgenes. Este sndrome es producido por un coronavirus (SARS CoV). Los coronavirus son virus ARN, monocatenarios, ARN, envueltos y pleomrficos, con proyecciones de la superficie en forma de palo de golf. Dentro de esta familia de virus han sido identificados agentes de infecciones respiratorias e intestinales en animales. En humanos fueron identificados como una de las etiologas del resfro comn, tambin asociados a diarrea infecciosa. Si bien por su morfologa y estructura se agrupan dentro de los coronavirus, la enfermedad producida por estos virus difiere sustancialmente de las ocasionadas por los antes mencionados (ver figura 5). El SARS tiene un perodo de incubacin ms prolongado en comparacin con el resto de los virus respiratorios, el cual tpicamente vara entre 4 a 7 das, para el SARS sera de 14 das; tiene un comienzo insidioso y los signos y sntomas que comprometen al tracto respiratorio superior son raros; la sintomatologa que compromete el aparato respiratorio bajo se establece lentamente pero constante durante 14 a 15 das. La enfermedad es ms leve en nios que en adultos, as como es menor la excrecin viral. Es poco conocida la forma de transmisin exacta, hecho fundamental en el control de futuros brotes. La heterogeneidad en la transmisin fue bien ilustrada en la descripcin de Olsen y colaboradores en un avin de pasajeros en donde 22 de los 119 pasajeros contrajeron la infeccin a partir de 4 pasajeros infectados y sintomticos.
Figura 5. Microfotografa electrnica de SARS
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Las autoridades de la OMS se encuentran alerta frente a la posibilidad de nuevos brotes de esta enfermedad en los meses de invierno, en distintos puntos geogrficos, esto depender de donde se encuentre el reservorio del SARS-CoV, que podra incluir a humanos (personal de laboratorio) y animales. Si bien se piensa que los animales seran el principal reservorio de esta enfermedad. En este momento tenemos ms preguntas que respuestas acerca de esta enfermedad. La aparicin del SARS en 2002 nos hace recordar que nuevas enfermedades infecciosas continan emergiendo y que necesitamos de la colaboracin internacional de las autoridades de salud pblica para poder identificarlas, estudiarlas y controlarlas oportunamente.
El laboratorio de virologa clnica en el diagnstico de las infecciones respiratorias agudas bajas

INTRODUCCIN
La virologa diagnstica se ha agregado hace poco a los servicios ofrecidos por los laboratorios de microbiologa, a medida que los laboratorios han proporcionado a los clnicos datos objetivos para la evaluacin de los pacientes con infecciones virales. En nuestro pas el diagnstico viral de las infecciones respiratorias agudas bajas (IRAB) en la prctica clnica, recin se est empezando a implementar como rutina en la poblacin peditrica. Las presiones econmicas estn haciendo imperioso proporcionar resultados clnicamente tiles y efectivos en relacin con los costos. Es el momento adecuado para que la virologa haga su entrada en el laboratorio de diagnstico.
TCNICAS DE DIAGNSTICO VIRAL EN LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BAJAS
La tcnica primaria de diagnstico para la mayora de las infecciones virales es el aislamiento viral en cultivos celulares (patrn de oro). La deteccin de antgenos por diferentes tcnicas es el mtodo utilizado con mayor frecuencia para el diagnstico de las infecciones respiratorias, como veremos. Las tcnicas serolgicas pueden ser de utilidad en estudios epidemiolgicos. a) Toma de muestra: La muestra de eleccin es el aspirado nasofarngeo (ANF), fundamentalmente en nios. El hisopado nasofarngeo es la muestra que se prefiere en adultos. Otras muestras posibles incluyen aspirado traqueal, lavado broncoalveoalar, biopsia de pulmn. Como regla general, la frecuencia de recuperacin de virus disminuye a medida que aumenta la duracin de la enfermedad, de tal manera que deben hacerse todos los esfuerzos para obtener muestras tan temprano como sea posible en el curso de la infeccin. b) Transporte y conservacin de las muestras: Se debe recoger en frascos estriles e irrompibles. Los hisopos deben colocarse en medios de transporte con antibiticos. Los hisopos secos no son aceptables. Existen varios medios de transporte, entre los ms utilizados estn el medio de PBS, VIB, Hanks, Stuart, y el medio de Leibovit-Emory. Las muestras deben mantenerse refrigeradas (4C) hasta su procesamiento. El tiempo que trascurre desde la toma de la muestra y su procesamiento debe ser el menor posible. Algunos autores como Ray y Minnich no encontraron efectos significativos sobre la tasa de aislamiento con demoras en el trasporte de hasta 24 horas.
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Aislamiento viral El aislamiento viral en cultivos celulares es el patrn de oro para el diagnstico de virus respiratorios agentes de IRAB, sin embargo, es una tcnica con limitaciones ya que es lento, caro, requiere de la existencia de lneas celulares muy sensibles a los virus que se quiere estudiar y de un laboratorio con capacidad de manejar cultivos celulares. Se utilizan varias lneas celulares para el aislamiento de virus respiratorio por ejemplo Hep-2 (lnea celular continua de origen humano) para virus respiratorio sincicial (VRS) y adenovirus, MDCK (clulas primarias de rin de mono) para aislamiento de virus influenza. Luego de la inoculacin de la muestra en las lneas celulares se observa las clulas en forma diaria a fin de registrar el efecto citoptico, caracterstico para cada virus. Luego se levanta el cultivo y se realiza la confirmacin por tcnicas inmunolgicas. Todo esto hace que el cultivo celular sea de poca aplicabilidad al diagnstico clnico rpido del agente. No obstante, nosotros creemos que, siempre que sea posible, los cultivos deben de realizarse en paralelo con las pruebas inmunolgicas rpidas, pues es la nica forma de recuperar el virus para estudios posteriores de caracterizacin e identificacin de la cepa prevalente. Existen tcnicas de aislamiento viral rpidas como el Shell Vial, las cuales permiten obtener un desarrollo viral en 48 horas aproximadamente, se encuentran en desarrollo para algunos virus como citomegalovirus y adenoviurs, para los que el aislamiento viral representa la tcnica de mayor sensibilidad. Deteccin inmunolgica de antgenos virales Las tcnicas inmunolgicas y ms recientemente las moleculares, se utilizan con eficacia en el diagnstico de las infecciones respiratorias. La tincin por inmunofluorescencia (IF) o inmunoenzimticas (ELISA) de secreciones respiratorias y los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, son tcnicas utilizadas con frecuencia. Estas tcnicas tienen muchas ventajas y han funcionado bien cuando fueron utilizadas por personal entrenado. El diagnstico de las infecciones producidas por VRS ha sido evaluado ampliamente en estudios clnicos, la sensibilidad de la IF o del ELISA ha sido del 80 al 95%, pero quizs la IF sea ms sensible. Algunos estudios indican que la IF es ms sensible que el cultivo para el diagnstico de VRS. En relacin con adenovirus sigue siendo la inoculacin en cultivo celular la tcnica diagnstica de mayor eficacia. El virus influenza A, B y parainfluenza 1, 2 y 3 tambin han sido identificados de muestras clnicas por estos mtodos. Han sido creadas tcnicas inmunocromatogrficas para el diagnstico de VRS, adenovirus e influenza A, las cuales tienen menor sensibilidad que la IF realizada por observadores expertos, sin embargo, es una tcnica sencilla que puede ser realizada por personal menos entrenado, rpida y econmica. Durante el ao 1999 se realiz en el laboratorio de Virologa del departamento de Bacteriologa y Virologa de la Facultad de Medicina el diagnstico viral de las IRAB en el marco del Plan de Invierno del CHPR. Se procesaron 1436 muestras procedentes de 1152 nios con diagnstico de IRAB. La muestra utilizada fue el ANF, el diagnstico se realiz mediante deteccin de antgenos virales por IF. En los pacientes con neumonas graves que requirieron CTI se realiz adems de IF aislamiento en cultivos celular para VRS y adenovirus. Realizamos diagnstico positivo en el 42% de las muestras (figura 6), de las cuales 82% correspondieron a VRS (figura 7).
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Figura 6. Diagnsticos de virus respiratorios. CHPR 1999
Figura 7. Diagnsticos virales positivos. CHPR (mayo-setiembre 1999)
Conclusiones
Aunque todava no hay un tratamiento eficaz contra la mayora de las infecciones virales la identificacin de un virus afecta directamente el manejo del paciente, al permitirle al clnico disear un tratamiento racional y formular un pronstico.
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Es fundamental el diagnstico viral en la identificacin de brotes de infecciones intrahospitalarias, las cuales estn bien demostradas en el caso de los virus respiratorios, es fundamental el diagnstico etiolgico para controlar y prevenir los mismos tomando una serie de medidas como el asilamiento por cohorte o asilamiento individual, dependiendo del virus identificado. Como resultado de nuestra experiencia en el diagnstico de las IRAB con el CHPR, en el departamento de Bacteriologa y Virologa (Facultad de Medicina), se pudo lograr la integracin del diagnstico viral en la prctica clnica. Nuestro objetivo futuro ser lograr integrar el diagnstico de virus respiratorios en la poblacin adulta.
Bibliografa
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Retrovirus y VIH
N. Cordeiro, R. Taroco
Introduccin e importancia
La familia Retroviridae es una de las familias ms interesantes y complejas de los virus animales. El trmino retro significa hacia atrs, y el nombre hace referencia a que estos virus tienen un modo inverso de replicar el cido nucleico. Los retrovirus son virus con un genoma constituido por ARN, pero se replican por medio de un ADN intermediario usando la enzima transcriptasa inversa (o reversa). Los retrovirus son interesantes por varias razones: 1. Fueron los primeros en que se demostr la capacidad para causar cncer habindose estudiado ampliamente por sus caractersticas carcinognicas. 2. Un grupo de retrovirus, el causante del SIDA, aunque se conoce solo desde los primeros aos de la dcada de 1980, ha llegado a representar uno de los mayores problemas de salud pblica. 3. El genoma de los retrovirus puede integrarse especficamente en el genoma del hospedador gracias al ADN intermediario, proceso que est siendo estudiado.
Taxonoma y clasificacin
Esta familia viral ha sido dividida en tres subfamilias. La primera, Oncovirinae, comprende los siguientes grupos: C, B y D; y un grupo sin nombre donde se encuentra el virus de la leucemia humana de clulas T (o linfotrpico): VLTH-I y VLTH-II. Todos ellos son virus oncognicos, producen leucemias, linfomas, tumores mamarios y neuronales. La segunda, Lentivirinae, comprende el grupo de los virus Visna y el VIH. Se parecen a los anteriores en lo que se refiere a su morfologa, a la naturaleza de su genoma y a la posesin de una transcriptasa reversa, pero no transforman clulas. El nombre de la subfamilia alude al largo perodo de incubacin que transcurre entre la infeccin y la enfermedad clnica, que puede incluso superar los 10 aos. La tercera, Spumavirinae, comprende los virus espumantes los cuales se encuentran en cultivo de clulas de rin que degeneran de forma espontnea y que provocan la formacin de clulas gigantes vacuoladas y multinucleadas, con un aspecto muy caracterstico.
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Generalidades morfolgicas de los retrovirus

Comprende una gran cantidad de virus que se caracterizan por presentar una morfologa comn, un genoma constituido por dos molculas idnticas de ARN de polaridad positiva, y por poseer una transcriptasa reversa. Los virus de la familia Retroviridae se caracterizan por ser partculas envueltas, con un dimetro entre 80 y 120 nm, que contienen nucleocpside enrollada dentro de una cubierta probablemente icosadrica. La envoltura contiene glicoprotenas vricas (espculas) y es adquirida al brotar por gemacin a travs de la membrana plasmtica de la clula husped. Existen varias protenas en la cubierta de los virus y siete protenas internas tpicas, cuatro estructurales y tres enzimticas. Las protenas con actividad enzimtica (codificadas por el gen pol) que se encuentran dentro de la partcula vrica son, la transcriptasa inversa, una endonucleasa de ADN (integrasa) y una proteasa. El virin tambin contiene molculas especficas de ARNt celular que se usan en la replicacin.
Caractersticas y replicacin del genoma de los retrovirus

El genoma de los retrovirus contiene dos copias de ARN monocatenario de polaridad positiva. El extremo 5 del ARN presenta cap y el extremo 3 esta poliadenilado, de modo que el ARN es capaz de actuar directamente como ARNm, aunque no es usado como tal. Todos los retrovirus contienen los siguientes genes y en el mismo orden: gag: que codifica protenas estructurales internas (antgeno especifico de grupo). pol: que codifica la transcriptasa inversa, la proteasa y la integrasa. env: que codifica las protenas de la envoltura.
REPLICACIN
La replicacin de los retrovirus es iniciada por la unin de las espculas a protenas receptoras especficas de la superficie celular. La presencia de receptores para el virus es el determinante inicial del tropismo para tejidos y huspedes concretos. El proceso global de replicacin del virus se puede resumir en los siguientes pasos: entrada a la clula, transcripcin inversa, integracin del ADNc (ADN copia) viral en el genoma hospedador, transcripcin del ADN vrico originando la formacin de ARNm vricos y el ARN de la progenie, encapsidacin en el citoplasma y por ultimo, la gemacin de viriones con envoltura, con la consiguiente liberacin de la clula. La transcriptasa inversa es en esencia una ADN polimerasa que convierte el ARN viral en una copia de ADN lineal y monocatenario en el citoplasma de la clula husped. Esta enzima muestra tres actividades enzimticas: 1) sntesis de ADN usando como molde el ARN viral, 2) sntesis de ADN usando como molde ADN, y 3) actividad de ribonucleasa H (degrada la cadena de ARN de un hbrido ARN:ADN). Como todas las ADN polimerasas, la transcriptasa inversa necesita un cebador, que en los retrovirus es un ARN de transferencia especfico (ARNt) de origen celular. Usando el ARNt como cebador, se transcribe a ADN un centenar de nucletidos cercanos al extremo 5 del ARN viral, all el proceso de transcripcin se detiene. Para copiar el resto del ARN viral (que representa la mayor parte), se emplea un mecanismo distinto. Primero se eliminan secuencias terminales redundantes del extremo 5 de la molcula de ARN por medio de la ribonucleasa H. Esto conduce a la formacin de un pequeo ADN monocatenario que es complementario al segmento de ARN que esta en el otro extremo del ARN vrico (3). Este pequeo trozo de ADN hbrida luego el otro extremo de la molcula de ARN (3) donde
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continua la copia de las secuencias del ARN vrico (cambio de plantilla), as se crea una cadena negativa de ADN. Aqu vuelve a actuar la ribonucleasa H y elimina toda la cadena positiva de ARN, excepto un pequeo fragmento usado como cebador que es eliminado luego de sintetizarse un pequeo segmento de ADN de polaridad positiva complementario, aqu vuelve a actuar la transcriptasa inversa y se termina de sintetizar la cadena de ADN bicatenario con largas repeticiones terminales (LTRs) en cada extremo. Estas LTRs contienen promotores transcripcionales y estn relacionadas con el proceso de integracin (figura 1). La integracin del genoma viral puede ocurrir en cualquier zona del ADN celular (que una vez integrado se denomina provirus) pasa a ser un elemento gentico estable. As, el provirus puede expresarse o permanecer en un estado latente y no expresarse. Si se activan los promotores en la LTR adecuada, se transcribe el ADN proviral integrado formndose transcriptos que pueden ser encapsidados en partculas vricas o pueden ser procesados y traducidos a protenas vrales. Cuando las protenas vricas se acumulan en suficiente cantidad, tiene lugar el ensamblaje de la nucleocpside que luego se mueven hacia la membrana citoplasmtica para la constitucin final de las partculas vricas con envoltura.
Patogenia de los retrovirus

La mayora de los retrovirus afectan a un espectro de huspedes y especies muy limitado. El espectro restringido de huspedes y el tropismo tisular limitado han dificultado la consecucin de sistemas celulares apropiados para su cultivo. La capacidad para integrarse en los cromosomas y permanecer all, dificulta su deteccin, estudio y tratamiento. Sin embargo, los retrovirus han proporcionado un instrumento fundamental para la biologa molecular y han permitido el anlisis del crecimiento y la diferenciacin de las clulas y de la oncognesis a travs del estudio de los oncogenes vricos. Aunque no todos los retrovirus causan cncer, son muy comunes los retrovirus tumorales. Algunos conocidos virus tumorales causan sarcomas o leucemia aguda y poseen un alto potencial oncognico. La infeccin con uno de estos virus puede originar transformacin celular y la formacin de tumores. Se cree que estos retrovirus poseen un gen transformante u oncogn que codifica una protena responsable de la transformacin celular. Este gen codifica una fosfoprotena que posee actividad de protena quinasa, estas catalizan la fosforilacin de protenas, mecanismo que regula la actividad de las protenas. En las clulas normales se han encontrado genes similares, los protooncogenes, lo que sugiere que estos genes son importantes en el crecimiento celular. Los retrovirus son capaces de incorporar esas secuencias normales, que luego se alteran o se expresan de modo anormal. En consecuencia, los retrovirus son agentes mediante los cuales tales genes se transfieren de clula a clula. Un retrovirus importante, el VIH causante del SIDA, es un retrovirus no tumoral.
VIH - Virus de la inmunodeficiencia humana

INTRODUCCIN
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) produce una infeccin/enfermedad (SIDA: sndrome de inmunodeficiencia adquirida) que se caracteriza por una inmunodepresin progresiva que sin acciones teraputicas y preventivas puede llegar a ser fatal, que conduce al desarrollo de infecciones oportunistas, neoplasias secundarias y manifestaciones neurolgicas.
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Figura 1. Esquema de la transcripcin inversa del genoma retroviral. a) Sntesis de la

hebra de ADN de polaridad negativa. El retrovirus provee la hebra de ARN de polaridad positiva y el primer constituido por un ARNt incluido en el virus, se hibridiza al sitio de unin en el ARN retroviral. La transcriptasa reversa comienza la sntesis de la hebra de ADN de polaridad negativa; al llegar al extremo de la hebra molde se genera una fuerte seal de terminacin. La regin 5 terminal del ARN es degradada y la regin R de la hebra de ADN de polaridad negativa se aparea con el extremo 3 de la segunda hebra del ARN retroviral (primer salto) y la transcriptasa inversa continua la sntesis de la hebra de ADN (-). b) Sntesis de la hebra de ADN de polaridad positiva. En una primera instancia se remueve el primer de ARNt. El ARN es degradado, dejando algunos fragmentos que serviran de cebadores para la sntesis de ADN. Comienza la sntesis de la hebra de ADN de polaridad positiva. La hebra de ADN (+) es transferida al extremo opuesto de la hebra de polaridad negativa (segundo salto) y se completa la sntesis de la hebra de ADN (+). Una vez finalizada esta etapa se termina de sintetizar la hebra de ADN (-).
a)
R U5 5 U3 R 3 3 R U5 5 U3 R 3 3 3 5 3 3 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 5 5
b)
5 5
5 3
5 5
3 5
5 3
A comienzos de los aos ochenta, en 1981, se descubri que un nmero inusual de varones homosexuales, haitianos, adictos a la herona y hemoflicos, moran por infecciones oportunistas habitualmente benignas. Sus sntomas definieron una enfermedad, el SIDA. Hoy el SIDA no se limita a esos grupos y representa una epidemia sin precedentes de deficiencia inmunolgica para la salud mundial. En Paris en 1983 Montagnier y colaboradores aislaron el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) a partir de cultivos de linfocitos T activados, provenientes de una biopsia de un ndulo linftico de un paciente con poliadenopatas y SIDA. Desde su aparicin hasta la actualidad la enfermedad se ha diseminado mundialmente, siendo considerada una pandemia, y su mortalidad sigue siendo de 100% a pesar de los avances farmacolgicos, por lo que el SIDA se ha convertido en un problema mundial. Hasta la fecha se han descubierto dos tipos de virus: VIH-1 y VIH-2, este ltimo, se encuentra sobre todo en algunos pases africanos y parece estar ms relacionado con los virus de la inmunodeficiencia simiana, adems parece ser miembro de una familia diferente de lentivirus.
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EPIDEMIOLOGA
El primer caso de SIDA fue descrito en Estados Unidos, pero en la actualidad el numero de pacientes infectados con VIH se concentra principalmente en los pases pobres (95%) y se encuentra en aumento, estimndose que ocurren unas 14.000 infecciones diarias a nivel mundial. Segn datos de la organizacin mundial de la salud (OMS), a fines del 2003 la cifra aproximada de personas infectadas por VIH es de 40 millones, siendo el frica subsahariana la regin ms afectada (figura 2). La terapia antirretroviral (administrada en nuestro pas en el servicio de pacientes infectocontagiosos del Instituto de Higiene) disponible en los pases industrializados de Amrica del Norte, Europa occidental y el Pacifico, ha disminuido la progresin de la enfermedad, las muertes y la transmisin vertical; aun as el nmero de nuevas infecciones se ha mantenido constante. Los casos de VIH/SIDA continan diseminndose por todas las regiones del mundo en diferentes proporciones. Se ha demostrado que existe un periodo de incubacin desde la primoinfeccin por el virus y el desarrollo del SIDA, que vara en general desde 1 a 15 aos. El virus VIH-1, es el ms ampliamente estudiado y es el que est ms distribuido a nivel mundial. Posee una tasa aproximadamente de 100 % de presentar enfermedad clnica. El ser humano y el chimpanc son las nicas dos especies conocidas donde el VIH produce infeccin crnica. Infeccin por VIH en Uruguay: la epidemia de VIH/SIDA es de baja prevalencia, ya que afecta a menos del 1% de la poblacin en general (0,45%). Es una epidemia concentrada en poblaciones vulnerables. Segn informaciones brindadas por el ministerio de salud pblica (ao 2005) el nmero de nuevos infectados por da se ha duplicado, al igual que el nmero de casos reportados. Predomina la transmisin sexual (71%) sobre la sangunea (25,4%), seguida de la perinatal (3,6%). Existe adems un porcentaje de casos en los que no se ha determinado la forma de transmisin. Dentro de la transmisin sexual predominan los heterosexuales (casi el 90% en 2004 y 2005) incluyendo la prostitucin fememina (3,2%). Le siguen los homosexuales (28,5%) y luego los bisexules (17,4%). La transmisin sangunea predomina entre usuarios de drogas intravenosas (96,8%). Con respecto a la distribucin por sexos, el porcentaje acumulado de casos de SIDA es de 66,5% correspondiente a hombres y 33,5% a mujeres. A pesar de ello, en cuanto a los casos de HIV se ha visto en los ltimos aos un aumento en el nmero de casos correspondientes al sexo femenino ( 44% de los casos reportados en 2005) siendo esta por lo tanto una poblacin mas susceptible respecto a los aos anteriores. La incidencia de infecciones por VIH en 2005 fue de 576 casos y la de SIDA en el mismo perodo de 300 casos.
TRANSMISIN DEL VIH
Ocurre en situaciones que facilitan el intercambio de sangre o lquidos orgnicos que contienen el virus o clulas infectadas por este. Entonces las principales vas de transmisin son: el contacto sexual, la inoculacin parenteral y el pasaje vertical madre-hijo. Se definen grupos de alto riesgo de adquirir la infeccin: Varones homosexuales o bisexuales, actualmente la transmisin en este grupo esta en regresin. Usuarios de drogas intravenosas. Usuarios de drogas no intravenosas (inhalatorias).
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Figura 2. Distribucin mundial de adultos y nios infectados por VIH. Las cifras estimadas fueron obtenidas por la OMS y publicadas en Actualizacin de la epidemia del SIDA, diciembre del 2003. El total aproximado de personas afectadas se calcula entre 34 y 46 millones
de personas.
Hemoflicos. Receptores de sangre y hemoderivados no hemoflicos. Contactos heterosexuales de los miembros de otros grupos de riesgo (constituyendo el 10% de los enfermos). La transmisin sexual es la principal forma de infeccin en el mundo, responsable de aproximadamente el 75% de todos los casos. La velocidad de propagacin por esta va es superior a cualquiera de las otras, y es mxima en las parejas femeninas de drogadictos por va intravenosa, lo que hace que aumente muy rpidamente el nmero de mujeres con SIDA. El virus viaja en el semen, libre y dentro de los linfocitos; adems se encuentra en las secreciones vaginales y en las clulas de la mucosa cervical de las mujeres infectadas. Es bien demostrada la transmisin de varn a varn y de varn a mujer, pero la infeccin desde la mujer al varn depende mas que nada del tipo de virus y de su virulencia. Normalmente se estima que el riesgo de transmitir VIH de hombre a mujer durante el acto sexual duplica el riesgo de transmitir el virus de mujer a hombre. El virus se transmite de dos formas: 1) a travs de las clulas de Langerhans (clulas dendrticas) de la mucosa y 2) por la inoculacin directa en los vasos sanguneos rotos por traumatismos, este ltimo es el que interviene en las relaciones sexuales anales, por el que los varones homosexuales fueron en un principio los principales infectados. La coexistencia de otras enfermedades de transmisin sexual, principalmente las asociadas a ulceraciones genitales, favorece la infeccin. Son de especial importancia la sfilis, el chancro blando y el herpes. En estas enfermedades que cursan con inflamacin genital se produce mayor concentracin del virus en el semen. La transmisin parenteral se produce principalmente en los usuarios de drogas intra-
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venosas, cuando estos comparten jeringas, agujas y otros objetos contaminados con sangre infectada. La infeccin a travs de transfusiones es muy rara (fue prcticamente eliminada), y el riesgo de que as ocurra es muy bajo gracias a tres medidas de salud: el anlisis de los anticuerpos anti-VIH en la sangre y plasma donados, el tratamiento con calor de los concentrados de factores de coagulacin, y la deteccin selectiva de donantes a partir de sus antecedentes. Aun as existe un riesgo muy pequeo de infeccin a travs de sangre negativa para los anticuerpos anti-VIH, porque la persona se infect muy recientemente y todava no ha desarrollado los anticuerpos (perodo ventana). Actualmente otras metodologas contribuyen a disminuir este perodo. La transmisin madre-hijo es la causa ms importante de SIDA peditrico. Son tres las vas de transmisin: 1) dentro del tero, mediante propagacin transplacentaria, 2) durante el parto, a travs del canal del parto infectado y 3) despus del nacimiento, por ingestin de leche materna. El riesgo de transmisin vertical se puede reducir con el estudio serolgico de VIH durante los controles del embarazo y con el tratamiento oportuno de las madres. Entre el 10 y el 35% de los nios nacidos de madres infectadas no tratadas desarrollan la infeccin. La misma puede ocurrir intratero y entonces el desarrollo de SIDA y la muerte ocurren en los primeros aos; si la infeccin es perinatal la instalacin del SIDA se retrasa. En el Uruguay la incidencia de la transmisin vertical del VIH ha descendido desde un 28% (1995) hasta un 2% (2002). La infeccin por el VIH no puede transmitirse por contactos personales casuales, tampoco se ha demostrado que pueda hacerse a travs de la picadura de insectos.
TAXONOMA Y CLASIFICACIN
El VIH es un virus perteneciente a la familia Retroviridae. Dentro de esta se ubica en la subfamilia lentivirinae. En esta familia estn tambin: el virus de inmunodeficiencia felina, el virus de inmunodeficiencia de los simios, el virus visna de las ovejas y el virus de la anemia infecciosa equina. Se han aislado dos formas genticamente diferentes: VIH-1 y VIH-2. Aunque son distintos, poseen antgenos comunes, pero existen pruebas especificas para detectarlos a ambos. Basndose en diferencias en el gen env se ha dividido al VIH-1 en tres grupos: M, O (u outlier) y N (o no M/no O). El grupo M a su vez se divide en distintos subtipos que van de A-L; por otra parte el VIH-2 se divide en cinco subtipos (A-E). El grupo M es el responsable de la pandemia SIDA, mientras que el grupo O est restringido a unos pocos pases del frica occidental.
MORFOLOGA VIRAL
Es un virin esfrico de 100-200 nm de dimetro, contiene una nucleocpside electrondensa en forma de cono, rodeado de una bicapa lipdica que proviene de la membrana de la clula husped, donde se insertan 80 espculas (protenas virales) constituidas cada una por varias molculas de gp120 (glicoprotena externa) unida no covalentemente a una protena integral de la membrana, gp41. Estas dos glucoprotenas virales son esenciales para que el virus infecte las clulas. El ncleo del virus contiene: la protena de la cpside, p24 (p26 en VIH-2); la protena p7/p9 de la nucleocpside; dos copias de ARN; y tres enzimas virales (proteasa, transcriptasa inversa e integrasa). La protena p24 es el antgeno ms fcil de detectar y son los anticuerpos contra l, los que se utilizan para el diagnostico de infeccin por VIH por medio de ELISA.
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Figura 3. Morfologa y estructura del VIH. La partcula viral envuelta contiene dos cadenas idnticas de ARN, ARN polimerasa, integrasa y dos ARNt emparejados base a base con el genoma dentro del core. Este se encuentra rodeado por protenas y una bicapa lipdica.
Abreviaturas: TM, protena transmembrana; MA, matriz; CA, cpside; NC, nucleocpside; SU, subunidad

Este ncleo viral esta rodeado por una matriz proteica p17 (p16 en VIH-2) por debajo de la membrana lipdica (figura 3).
GENOMA VIRAL
Est constituido por dos molculas de ARN de cadena simple de 9400 pares de bases, unidas por enlaces no covalentes. Los clsicos genes estructurales gag, pol, y env codifican protenas precursoras que sern divididas luego por la proteasa en protenas maduras (figura 4). Sobre esta proteasa actan frmacos muy efectivos, que la inhiben e impiden el ensamblaje viral. El precursor gag es clivado en cuatro protenas: a) p17-18 para el VIH-1 y p16 para el VIH-2; b) una protena mayor, parte de la capside, p24-25 en el VIH-1 y p26 en el VIH-2; c) la protena de la nucleocpside p7 que adems promueve la dimerizacin y encapsidacin del ARN. d) por ultimo una protena p6 cuya funcin esta en estudio. Se sabe que aquellas partculas virales mutantes que carecen de esta protena tienen un defecto en el ensamblaje de las partculas virales hijas. El gen pol se divide en: la proteasa que cliva los productos de gag y pol; la transcriptasa reversa y la integrasa. El gen env codifica las glicoprotenas de envoltura, que sern sintetizadas como un gran precursor que luego es clivado dejando una protena transmembrana (gp41). En esta
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Figura 4. Transcripcin y traduccin del genoma retroviral (VLTH-1). Nomenclatura: MA,

matriz; CA, cpside; NC, nucleocpside; PR, proteasa; SU, componente superficial; TM, componente transmembrana; N, extermo aminoterminal; C, extremo carboxiterminal; p, protena; Pr, poliprotena precursora; gp, glicoprotena; gPr, poliprotena precursora glicosilada.
molcula en su parte externa posee el sitio de unin para la molcula CD4 (gp120). Pero esta protena posee adems otros sitios importantes para la infectividad del virus, el mas conocido es el V3 loop o bucle, que es el principal eptope neutralizante y sitio que promueve otros eventos aun luego de la unin al receptor CD4. Esta glicoprotena transmembrana fija el complejo glicoproteico a la membrana viral y tiene un sitio hidrofbico, el cual promueve la fusin de las membranas celulares. El genoma del VIH contiene adems otros genes: tat, rev, vif, nef, vpr y vpu, encargados de la regulacin de la sntesis y de la organizacin de las partculas virales infecciosas: La protena Tat acta aumentando 1000 veces la transcripcin de los genes virales, lo que favorece la replicacin del virus. La protena Rev tiene su efecto a nivel postranscripcional, regulando el transporte de ARNm desde el ncleo al citoplasma. El gen vpu parece ser fundamental para la gemacin del virus desde las clulas infectadas. Podra interferir con la unin intracelular del precursor env con CD4. El gen vif es importante para la creacin de virus libre con capacidad de infectar otras clulas. El gen vpr facilita la infeccin de las clulas que no estn en divisin (por ej.: macrfagos) y detiene el ciclo celular en fase G2, con esto incrementa al mximo la proteccin del virus. La protena Nef parece ser necesaria para el desarrollo de la infeccin progresiva, producira la apoptosis de algunas clulas y una regulacin en baja de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I en las clulas infectadas por el VIH. La disminucin de estas molculas podra evitar el reconocimiento y la lisis de las clulas
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diana infectadas por el VIH. En consecuencia Nef podra ayudar a superar la resistencia inmunitaria frente a la infeccin por VIH. En conclusin, los productos de los genes reguladores son vitales para la patogenicidad del virus y de ah su importancia para el desarrollo de agentes que puedan bloquear la accin de dichos genes. El anlisis molecular de los diferentes virus aislados demuestra que existe una gran variabilidad en algunas partes de su genoma. La mayora de esas variaciones se agrupan en determinadas regiones de la envoltura glucoproteica. Dado que la respuesta inmune se desarrolla contra la envoltura del VIH, esta variabilidad supone un problema para el desarrollo de una vacuna nica.
SNTESIS E INTEGRACIN DEL ADN VIRAL
Luego de ingresar a la clula las dos molculas de ARN son transcriptas en forma reversa en una molcula lineal de ADN de doble cadena. La cadena positiva de ADN tiene dos sitios de origen distintos para su sntesis, en lugar de uno. En todos los retrovirus la cadena positiva es determinada por una secuencia de polipurinas localizadas en 5 en la regin U3 de regiones de regulacin (long terminal repeat o LTR). El VIH tiene una segunda regin en el centro de su genoma que se utiliza como sitio de origen adicional, este sitio parece mejorar el proceso de transcripcin reversa. Luego de la sntesis en el citoplasma el ADN viral es transportado al ncleo y se integra a la cedula husped, esta reaccin es mediada por una integrasa codificada por un sector del ADN viral. Cuando ocurre la activacin y divisin de la clula husped el ADN viral se duplica y comienzan a expresarse las protenas virales.
REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA
La regin LTR del VIH contiene promotores virales activos que para su transcripcin requieren la presencia de activadores celulares. La protena Tat es requerida para la transcripcin y se une a una parte de la regin R del LTR (TAR: transactivating response element o elemento transactivador de respuesta) y junto con los activadores transcripcionales de origen celular (SP-1, NF-B) promueven el inicio de la transcripcin y la elongacin del transcripto. De esta manera aparecen en la infeccin aguda tres clases de transcriptos: molculas de ARN que producen las protenas gag y pol; molculas para las glicoprotenas de envoltura; y molculas para las protenas reguladoras. El sistema Rev controla la exportacin citoplasmtica y estabilidad de estos transcriptos.
VARIABILIDAD GENTICA
El alto grado de variabilidad gentica del VIH es una de sus caractersticas ms relevantes. La regin ms variable del genoma es la que codifica para las glicoprotenas de envoltura. La regin mas conservada es la de los genes gag y pol. Esta variabilidad se debe a la existencia de la transcriptasa reversa, esta enzima no tiene la capacidad de corregir errores durante la retrotranscripcin. Gracias a esta variabilidad el virus escapa a la respuesta inmune antiviral. Las glicoprotenas de envoltura evaden el sistema inmune porque se originan en regiones hipervariables.
MECANISMOS DE PATOGENICIDAD
En las personas infectadas con el VIH es habitual la observacin de distintas anormalidades inmunolgicas: severa linfopenia, principalmente de clulas T CD4 +, reacciones de hipersensibilidad cutnea retardada disminuidas o ausentes,
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perdida de la funcin citotxica de las clulas natural killer (NK), funcin anormal de los monocitos, hipergammaglobulinemia policlonal. La molcula CD4 sirve como receptor del VIH, es por ello que el virus no solo infecta a los linfocitos T CD4 +, sino a otras clulas que tambin expresan este receptor, como monocitos de sangre perifrica, precursores de clulas T de la medula sea y el timo, y macrfagos tisulares: entre ellos estn las clulas dendrticas foliculares de los ganglios linfticos y la piel, las clulas de Langerhans del timo y las clulas microgliales en el cerebro. Este virus reduce la capacidad funcional global (disminucin de funcin y de nmero) de los linfocitos T perifricos y de las clulas presentadoras de antgeno, e inhibe la produccin y maduracin de los precursores de la medula. Por tanto, la patogenicidad el VIH se debe a su afinidad por las clulas CD4+ que lleva a una disminucin de las respuestas inmunes normales del husped, luego, a la destruccin de la inmunidad, y finalmente, a la muerte por infecciones oportunistas.
ENTRADA A LA CLULA
La infeccin se inicia cuando una partcula viral completa encuentra una clula con receptor CD4. La glicoprotena gp120 se une fuertemente a este receptor. Actualmente se sabe que es necesaria la presencia de otro correceptor para mediar la fusin del virus a la clula, son los denominados receptores para quemoquinas. Las quemoquinas son pptidos pequeos, con funcin quimiotactica para las clulas que intervienen habitualmente en los mecanismos de defensa: neutrofilos, macrfagos, linfocitos. En presencia de un proceso inflamatorio, estas clulas son atradas hacia el foco de infeccin o injuria, por medio de sustancias solubles: las quemoquinas. Estas clulas presentan en su superficie receptores para quemoquinas, los cuales a su vez son correceptores para el VIH. Por lo tanto, no es suficiente la presencia en la superficie de un receptor CD4 que se una a la gp120, sino que para que la clula sea infectada por el VIH, tambin debe expresar un correceptor al que se unir la gp41, produciendo entonces la fusin del virus y la clula. Existen dos tipos de correceptores, presentes en tipos distintos de clulas: CXCR-4: se encuentra en los linfocitos T CCR-5: se encuentra en monocitos y macrfagos Por este motivo diferentes cepas de VIH pueden afectar predominantemente a los linfocitos o macrfagos, de acuerdo al correceptor que utilicen. De este modo las glicoprotenas de membrana - gp120 y gp41 - se unen al receptor CD4 y al correceptor - CXCR4 o CCR5 respectivamente, y as se produce la fusin. Una vez producida esta fusin se liberan dentro del citoplasma las dos copias de ARN viral y las enzimas transcriptasa inversa e integrasa.
CICLO VIRAL
Una vez dentro de la clula el VIH comienza su ciclo: 1. Retrotranscripcin: en el citoplasma celular la enzima transcriptasa inversa convierte en ARN viral en ADNc. Muchas drogas (AZT, ddC, ddI) actan a este nivel interfiriendo con esta enzima. 2. Integracin: el ADN viral as formado migra hacia el ncleo donde es integrado al ADN celular con la ayuda de la integrasa. Una vez incorporado el genoma celular el ADN viral pasa a llamarse provirus. El virus VIH puede permanecer sin multiplicarse en una clula porque en ella su replicacin se vio restringida. Estas clulas infectadas sern activadas luego por diferentes citoquinas, entre ellas el factor de necrosis tumoral (TNF) y la
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interleuquina 6 (IL-6), dando lugar a la formacin de la progenie viral lo que lleva a la muerte de las clulas T infectadas y a la fusin con otras clulas no infectadas para formar clulas gigantes multinucleadas. Las clulas T infectadas y lisadas liberan gran cantidad de partculas virales que infectaran a las clulas vecinas, pero adems se libera la protena de envoltura externa, soluble, que es capaz de unirse a la molcula CD4 de otras clulas y hacerlas vulnerables a la lisis por el complemento y a la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Por lo tanto cuando un linfocito se pone en contacto con su antgeno, es estimulado y se activa, as comienza a duplicar su ADN y el material gentico viral integrado a su genoma. 3. Transcripcin: para la produccin de nuevos virus se necesita de ARN mensajero, sintetizado en el proceso de transcripcin utilizando enzimas de origen celular. Los genes virales controlan este proceso a travs de, por ejemplo, el gen tat. Otras infecciones por organismos tales como Mycobacterium tuberculosis pueden acelerar el proceso de transcripcin. 4. Traduccin: el ARNm procesado en el ncleo es transportado al citoplasma, aqu el gen rev es critico, sin la protena rev no existiran protenas estructurales. En el citoplasma el ARNm, utilizando la maquinaria de sntesis proteica celular, sintetiza las largas cadenas de protenas y enzimas virales. 5. Ensamblaje y brotacin: las protenas del core, las enzimas y el ARN se ubican debajo de la membrana celular, mientras que las protenas de envoltura viral se agregan a la membrana celular. Esto da origen a formas virales inmaduras (no infecciosas an) que surgen de la superficie celular adquiriendo una envoltura que incluye protenas virales y celulares. Las largas cadenas proteicas que conforman esta partcula viral inmadura son clivadas en pequeas estructuras por una enzima viral, proteasa. Existen drogas inhibidoras de la proteasa como saquinavir, titonavir, indinavir, nelfinavir, que interfieren en este paso del ciclo viral. De este paso resulta una partcula viral infecciosa. Luego, al momento de la activacin del linfocito, el material viral se multiplica y tiene lugar la liberacin de la progenie viral por dos mecanismos posibles: Nuevas generaciones de partculas infectivas por gemacin (figura 5). Se acumulan partculas virales en el interior de la clula infectada, producindose la destruccin de sta, liberndose al exterior esas partculas virales, la mayora de las cuales son defectivas ya que carecen de la cubierta necesaria.
EVENTOS DE LA INFECCIN
La va sexual implica la entrada del virus a travs de las mucosas: orofarngea, genital y anal. La efectividad de la transmisin es mayor si es por va parenteral. En las superficies mucosas, adems de las clulas epiteliales se encuentran las clulas de Langerhans; las mismas tienen funcin de clulas presentadoras de antgenos (CPA). A nivel de las submucosas tambin se hallan presentes clulas de Langerhans y macrfagos. Las partculas virales que viajan en las secreciones vaginales o en el semen, atraviesan la barrera mucosa (con mayor facilidad si est lesionada, si bien esto no constituye un factor limitante) y se encuentran en la mucosa o la submucosa con las CPA. Estas clulas reconocen a la partcula viral como extraa, la incorporan a su superficie o la procesan por medio de fagocitosis, procesando tambin los antgenos virales para ser presentados a los linfocitos. El macrfago es incapaz de destruir a la partcula viral. Se limita a procesarla, y en el interior de un macrfago es posible encontrar innumerables partculas virales. Tambin a este nivel la partcula viral puede encontrarse adems con los linfocitos CD4+. Por lo tanto, el virus una vez atravesada la barrera mucosa puede: a) quedar dentro de un macrfago, b) ser pre-
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Figura 5. Ciclo replicativo del VIH. A) Vista general. B) Transcripcin reversa. Durante este paso el ARN viral es retrotranscripto en ADN de doble cadena y las secuencias terminales son parcialmente duplicadas de modo tal que lleva a la formacin de regiones de regulacin (LTR) compuestos por las regiones U3-R-U5. C) Organizacin del genoma proviral del VIH-1 y VIH-2. El genoma codifica para protenas estructurales y enzimas que son empaquetadas en la progenie viral (recuadros rayados) y para protenas reguladoras o accesorias (recuadros lisos).
Virion Envelope
Nucleocapsid
B
R U5 U3 R
Reverse transcription
Adsorption to receptor
A
Maduration Penetration and uncoatig Capsid ensamby Traslation Pre - Integration complex
RNA
5
LRNA
DNA
U3 R U5 U3 R U5 Provirus Integration Budding
Transcription
HIV-1
5 LTR gag pol
vif
rev tat env vpr vpu
3 LTR
nef
HIV-2
5 LTR gag pol
vif
rev tat env vpx vpr
3 LTR
nef
sentado a los linfocitos CD4 por las CPA, o c) adherirse directamente a los linfocitos CD4+ y comenzar a multiplicarse en su interior. Posteriormente, los linfocitos CD4+ y los macrfagos con las partculas virales en su interior, o las partculas virales libres, se dirigen hacia los ganglios linfticos regionales. En los centros germinales de estos ganglios regionales se encuentran otras clulas con un papel fundamental en la patogenia del VIH: las clulas foliculares dendrticas. Estas tienen en su superficie numerosas proyecciones digitiformes con receptores CD4, a los cuales se unirn las partculas virales libres de la circulacin, atrapando de esta manera innumerables virus. Estos son presentados por estas clulas a todos los linfocitos que, circulando por la linfa o la sangre, pasan por dichos ganglios, siendo as infectados. De ese modo, a partir del ganglio regional el virus se disemina a todo el organismo, a todos los tejidos con clulas que tengan receptores y correceptores que las hagan pasibles de ser infectadas, multiplicando de esta
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manera la infeccin. Las partculas virales se diseminan por todo el organismo, sembrando varios rganos, particularmente rganos linfoides como ndulos linfoides, bazo, amgdalas y adenoides. Si bien tiene una diseminacin sistmica, el blanco fundamental del VIH es el sistema inmune y dentro de ste, los linfocitos CD4+. Una vez en la sangre, se producen los eventos tempranos de la infeccin por el VIH. En esta etapa temprana, se puede detectar gran cantidad de partculas virales a nivel plasmtico. Esto se expresa como carga viral, y en esta etapa temprana de la infeccin puede llegar a 10 millones o ms de partculas por ml de plasma (107/ml). Estas partculas tienen una corta vida media libre en el plasma (aproximadamente unos 10-15 minutos). Los linfocitos CD4 que estn produciendo virus tienen una vida media de 1-2 das. La partcula viral, una vez liberada al plasma, tiene que buscar nuevas clulas con receptores CD4 para poder infectar y continuar su ciclo de replicacin viral. En esta fase aguda el nmero de clulas CD4+ en la circulacin decrece en 20 a 40%, quizs por muerte celular o por dejar la circulacin y dirigirse a los rganos linfoides para preparar la respuesta inmune. Dos a cuatro semanas luego de la exposicin, cerca del 70% de las personas sufren sntomas similares a una gripe (sndrome retroviral agudo). El sistema inmune enfrenta la infeccin mediante las clulas T killer y los anticuerpos producidos por los linfocitos B, logrando una reduccin dramtica de los niveles de virus. En el momento inicial de la infeccin existen muchas partculas libres en plasma. Pero en un periodo de dos a tres meses se van generando una serie de respuestas por parte del sistema inmune del husped, producindose de manera espontnea una drstica cada de la carga viral, sin que medie un tratamiento antiviral. Este nivel de carga viral (setpoint) vara de individuo a individuo y es predictivo de la evolucin clnica a largo plazo. Los mismos permanecen bajos (dependiendo del sistema inmune de cada individuo) durante un largo periodo de tiempo, que puede llegar a 10 aos o ms. En determinado momento, la carga viral plasmtica comienza a aumentar nuevamente, coincidiendo con la etapa clnica de SIDA. A esta fase temprana le sigue el perodo de infeccin activa inaparente, no obstante lo cual no significa que no haya replicacin viral. Si bien la carga viral cae, y no existen sntomas, la replicacin viral contina permanentemente. Se establece un equilibrio, por el cual habra una produccin y destruccin de 10 billones de partculas virales por da, as como una produccin y destruccin de 2 billones de linfocitos CD4 por da. Este equilibrio se mantiene aproximadamente por 10 aos (dependiendo de la carga viral inicial o setpoint, el estado inmunolgico de la persona infectada, entre otros). Durante este perodo la replicacin viral no tiene lugar a nivel sanguneo, la misma se da en los tejidos linfoides profundos: los ganglios linfticos y el tejido linfoide asociado a las mucosas (gastrointestinal, respiratoria, etc.) Perodo de enfermedad clnica: existen variaciones en el perodo de infeccin sin clnica de enfermedad, distintos factores influyen en la progresin hacia la enfermedad: edad, diferencias genticas entre los individuos, la virulencia de las diferentes cepas y la coinfeccin con otros microorganismos. La existencia de mutaciones en los correceptores puede influenciar el curso evolutivo hacia la enfermedad. Por ejemplo una mutacin especfica en una de las dos copias del gen del correceptor CCR5 tiene como resultado un curso ms lento hacia la enfermedad. Varios estudios demuestran que los individuos con alta carga viral circulante (setpoint) desarrollan ms rpidamente los sntomas de SIDA y mueren. Las drogas utilizadas para prevenir o tratar las infecciones asociadas al SIDA han permitido prolongar y mejorar la calidad de vida. Las combinaciones de drogas que incluyen un inhibidor
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Cuadro 1. Enfermedades indicadoras de Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)* Infecciones oportunistas Protozoos Toxoplasmosis cerebral Criptosporidiasis con diarrea Isosporidiasis con diarrea Candidiasis esofgica, traqueal y pulmonar Neumonia por Pneumocystis carinii Criptococosis extrapulmonar Histoplasmosis diseminada Coccidiomicosis diseminada Enfermedad por citomegalovirus
Infeccin peristente o diseminada por virus de Herpes simple Leucoencefalopata multifocal progresiva Infeccin diseminada por miembros del complejo Mycobacterium avium Infecciones por micobacterias atpicas Tuberculosis extrapulmonar Septicemia recurrente por Salmonella sp Infecciones por micobacterias atpicas Tuberculosis extrapulmonar Septicemia recurrente por Salmonella sp. Infecciones mltiples o recurrentes por bacterias piognicas
Hongos
Virus
Bacterias
Neoplasias Oportunistas Sarcoma de Kaposi Linfoma primario del cerebro Otros linfomas no Hodgkin Otros Sndrome de caquexia por VIH Encefalopata por VIH Neumonia Intersticial linfoide
de la proteasa con dos inhibidores de la transcriptasa reversa, reducen la carga viral a niveles muy bajos y retrasan la progresin de la enfermedad por perodos muy prolongados. Se considera afectados de SIDA a los pacientes infectados por el VIH que presentan alguna de las 26 complicaciones (infecciones o enfermedades diagnosticas de estadio SIDA - entre ellas la tuberculosis y/o candidiasis esofgica) o que tienen un conteo de linfocitos CD4+ inferior a 200/L. Queda clara entonces la importancia clnica de la cifra de linfocitos CD4+, independientemente de la existencia o no, de manifestaciones clnicas. Cuando el paciente alcanza el estadio clnico de SIDA, aparecen infecciones oportunistas caractersticas y neoplasias asociados a dicha patologa (cuadro 1). Los monocitos y macrfagos infectados por el virus, y relativamente resistentes a la muerte celular, viajan por todo el cuerpo llevando el VIH a varios rganos especialmente a los pulmones y al cerebro; 40 a 50% de las personas infectadas con VIH frecuentemente tienen manifestaciones neurolgicas. La clula microglial y el macrfago son las clulas del cerebro infectadas por el VIH de manera habitual, pero tambin pueden infectarse las neuronas y las clulas gliales. La liberacin de sustancias neurotxicas o factores quimiotcticos por los monocitos y las clulas microgliales favorecen el desarrollo de respuestas inflamatorias en
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el cerebro. Tambin es probable que exista un efecto citoptico directo del virus sobre las neuronas dando lugar a cuadros como la encefalopata o complejo de demencia del SIDA. Paradjicamente, aunque el VIH causa inmunodeficiencia, el curso de la enfermedad esta caracterizado por la hiperactivacin del sistema inmune con consecuencias negativas. La activacin crnica del sistema inmune durante la enfermedad puede resultar en una estimulacin masiva de las clulas B, perdiendo stas la habilidad de producir anticuerpos contra otros patgenos. Esta activacin crnica lleva tambin a la apoptosis (o muerte celular programada) y al aumento en la produccin de citoquinas que no solo estimulan la replicacin del VIH, sino que tambin tiene efectos perjudiciales.
RESPUESTA INMUNE
La misma es iniciada por la inmunidad mediada por clulas. La respuesta humoral contra las protenas virales ms importantes (Gag, Pol, Env) aparece entre tres semanas y tres meses luego de la exposicin viral. Posee dos componentes: a) Componente celular: Respuesta de los linfocitos T CD8+ citotxicos que reconocen en la superficie de la clula infectada la presencia de partculas virales unidas a molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de tipo I; estos linfocitos liberan entonces enzimas contenidas en sus grnulos (por ej.: perforinas), que determinan la destruccin de la clula por un efecto citoltico directo. Los linfocitos T CD8+ pueden actuar tambin por otro mecanismo, liberando mediadores o linfoquinas (quemoquinas), sustancias solubles con funcin quimiotctica, que atraen al foco nuevas clulas defensivas; pero estas quemoquinas se unen tambin a los receptores para quemoquinas presentes en las clulas pasibles de ser infectadas, bloqueando la fusin de nuevas partculas virales a estas clulas. Los linfocitos T CD4+ reconocen a su vez las partculas virales procesadas por las CPA y presentadas en conjunto a molculas MHC de tipo II, produciendo as linfoquinas que se unen a sus receptores (de quemoquinas) bloqueando tambin la unin de nuevos virus a clulas, pero sobre todo la funcin principal del linfocito T helper es potenciar (por medio de sus citoquinas estimuladoras) la respuesta de los linfocitos T CD8+, ya que ellos son el principal efector de la respuesta inmune. b) Componente humoral: La misma est dada por los linfocitos B, los cuales reconocen en las CPA la presencia de sustancias antignicas y reaccionan activndose, transformndose en plasmocitos y produciendo anticuerpos anti-VIH. Si bien el sistema inmune es capaz de montar una respuesta de tipo humoral, se ve abrumado por la rapidez con la que el virus, producto de su variabilidad antignica, continuamente elabora partculas virales hijas capaces de evadir la neutralizacin. Se da as un ciclo de neutralizacin seguido por la creacin de mutantes de escape, en el cual el suero, en un punto temporal determinado, puede neutralizar el virus circulante contemporneo, pero no al virus aislado en un momento ulterior. Este fenmeno condiciona, hoy en da, el desarrollo de una vacuna efectiva contra el VIH. No obstante se producen anticuerpos neutralizantes que pueden ser especficos de tipo (especficos para un aislamiento viral determinado) o pueden ser especficos de grupo (capaces de abarcar una gama mayor de aislamientos virales). La mayora de estos anticuerpos reconocen la regin V3 de la protena gp120, pudiendo impedir el clivaje y cambio conformacional (en el interior de gp120) necesarios para el ingreso del virin para la formacin de sincicios. Los anticuerpos neutralizantes
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especficos de grupo reconocen epitopos internos de gp41, y epitopos localizados cerca de la unin de esta protena con gp120. Cabe mencionar que adems se elaboran anticuerpos contra las dems protenas virales. La produccin de anticuerpos puede detectarse de dos a ocho semanas despus de la infeccin, luego de la declinacin de la viremia inicial. La seroconversin se inicia con la respuesta IgM anti protena Gag; la respuesta IgG se produce entre la primera semana y la 41. En tal sentido, los primeros marcadores serolgicos en ser evidenciados son IgG anti-p24 e IgG anti-gp120, seguido de IgG anti-gp41. Se ha visto que durante los primeros meses de la infeccin existe un aumento en el ttulo de anticuerpos anti-p24 en simultneo a una disminucin en el nivel de antgeno p24. Luego de este tiempo el ttulo de tales anticuerpos permanece estable, invirtindose esta relacin durante la ltima etapa de la enfermedad (caen los niveles de IgG anti-p24 y suben los de p24) (figura 6). Como se mencion anteriormente, luego de la infeccin aguda por VIH sigue una fase de infeccin activa inaparente con una duracin de entre 1 y 15 aos, en la cual los pacientes permanecen asintomticos pero con una declinacin lenta y progresiva de su sistema inmune. Aquellas funciones dependientes de las clulas T CD4+ son las primeras en verse afectadas. Despus de este perodo el sistema inmune, que hasta ese momento haba sido capaz de equilibrar la produccin y destruccin de las partculas virales, fracasa y ya no logra contener la replicacin viral, se dispara nuevamente la carga viral y comienzan las manifestaciones de la etapa SIDA. Las mismas aparecen cuando los linfocitos disminuyen por debajo de 200 por mm3 (siendo el valor normal: 500-750 por mm3, aproximadamente).
Figura 6. Curso cronolgico y fases de la enfermedad por VIH. Las diferentes fases de la enfermedad por VIH estn definidas en funcin de los niveles de clulas T CD4+ y la ocurrencia de enfermedades oportunistas.
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La perdida progresiva de linfocitos T CD4+ (calculada entre 60 y 70 linfocitos CD4+ por mm3 por ao), puede atribuirse a una variedad de mecanismos, entre ellos: Muerte celular directa: los virus se multiplican en su interior dando lugar a grandes progenies virales que al liberarse por gemacin destruyen la clula. Formacin de sincicios: las clulas infectadas son capaces de fusionarse con otras clulas infectadas y adems con clulas no infectadas, formando de este modo clulas gigantes denominadas sincicios. Apoptosis: la presencia de material gentico y protenas virales activan el mecanismo apopttico del linfocito T CD4+. Por otra parte, clulas no infectadas tambin pueden sufrir este proceso por seales inapropiadas recibidas a partir de clulas infectadas. Observadores inocentes: los linfocitos T CD4+ con partculas virales en su superficie son atacados por los linfocitos T CD8. Anergia: se ha observado en cultivos celulares que existira alguna seal del VIH capaz de inhibir a las clulas T CD4+ impidiendo futuras respuestas a la estimulacin inmunitaria. Dao a los precursores celulares: algunos estudios sugieren que el virus destruye precursores celulares con funciones inmunes especiales, as como tambin, partes de mdula sea y de timo necesarias para el desarrollo de tales clulas. La presencia de hbridos genmicos virales de ADN/ARN resulta txica para el linfocito.
MTODOS DE ESTUDIO
El diagnstico de la infeccin por VIH tiene distintos objetivos, uno de ellos es el diagnstico per se de personas que se sospechan pueden estar infectadas y requieren de atencin mdica, consejo no directivo y educacin sanitaria respecto a su estado. Otro de los objetivos del diagnstico de VIH es la seguridad en las transfusiones, productos hemoderivados y donaciones de rganos. Finalmente, otros objetivos del diagnstico de la infeccin por VIH, son la aplicacin de programas de vigilancia serolgica de esta infeccin (estudios de incidencia y prevalencia, tendencias en grupos poblacionales, etc.) o en programas de investigacin clnica, farmacolgica, virolgica e inmunolgica. El mtodo ms comnmente empleado para el diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH se basa en tcnicas serolgicas que detectan anticuerpos del virus en el suero de las personas infectadas. En este sentido, se dispone de reactivos para pruebas que pueden ser automatizadas, total o parcialmente, y aplicarse paralelamente a un gran nmero de sueros. Estas pruebas utilizadas para el diagnstico de una persona individualizada, reciben el nombre de pruebas de diagnstico de la infeccin por VIH, pero tambin pueden utilizarse como un instrumento para desechar o rechazar productos sanguneos o biolgicos contaminados, en cuyo caso se denominan de cribado. Conviene subrayar, que la estrategia a emplear en el cribado rutinario es distinta a la utilizada para el diagnstico individualizado de la infeccin por VIH. De forma conceptual, se denominan pruebas diagnsticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona y pruebas de cribado (o tamizaje) cuando se aplican a un conjunto de muestras y su finalidad no es la diagnstica. Ensayos serolgicos de tamizaje Enzimoinmunoanlisis (EIA). La deteccin de anticuerpos anti-VIH con tcnicas de EIA es el mtodo ms empleado en la actualidad existiendo distintos principios en la deteccin de los anticuerpos (ELISA indirecto, competitivo, sandwich y captura). La mayora de los
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ensayos aprobados emplean antgenos de VIH inmovilizados capaces de fijar anticuerpos IgG a partir del suero de un paciente. La sensibilidad del ELISA oscila entre un 93 a un 100%, pudiendo presentarse resultados falsos negativos durante la infeccin primaria, en pacientes inmunosuprimidos, o por errores de procesamiento (rotulado y manipulacin). Por otro lado, la especificidad de esta tcnica es del 99%; los resultados falsos positivos se presentan por error humano o enfermedades autoinmunes entre otras. Los ensayos de primera generacin utilizan lisado viral obtenido a partir de lneas celulares de linfocitos T humanos. Poseen, sin embargo, una gran capacidad de captacin de cualquier tipo de anticuerpos anti-VIH presente en la muestra. Las pruebas de segunda y tercera generacin utilizan como Ag protenas recombinantes (PR) o pptidos sintticos (PS). Son muy sensibles y los resultados son ms reproducibles, al utilizar un antgeno ms normalizado y purificado. Actualmente, las pruebas de cuarta generacin reconocen no solo los anticuerpos sealados anteriormente sino tambin antgeno p24 viral, permitiendo acortar el perodo ventana. Existen reactivos comercializados con los antgenos y formatos citados para la deteccin de anticuerpos anti-VIH-1 y anticuerpos anti-VIH-1 +2. Para la deteccin especfica de anticuerpos anti-VIH-2 solamente se dispone de EIA con pptidos sintticos o lisado viral y formato indirecto. La confirmacin de infeccin por VIH-2 se realiza con Western Blot y PCR especfica. Aglutinacin. Estas pruebas estn basadas en la aglutinacin de antgenos de VIH que previamente han sido fijados a partculas capaces de aglutinarse en presencia de suero que contenga anticuerpos anti-VIH. Este tipo de pruebas comenzaron a desarrollarse a mediados de los aos 80 como alternativa a los EIA. Pueden utilizar partculas de gelatina o partculas de ltex, y como antgenos, lisados virales, pptidos sintticos o protenas recombinantes. Son tcnicas de manejo muy sencillo, rpidas, de lectura visual, apenas requieren instrumentacin y pueden adaptarse a un gran nmero de sueros. Su sensibilidad parece comparable al EIA, pero su grado de especificidad es mucho menor. Estas tcnicas son las indicadas para ser utilizadas en laboratorios con escasa dotacin instrumental o con un manejo reducido en cuanto al nmero de muestras. Pruebas de EIA de membrana (Dot-Blot). En estas pruebas los anticuerpos anti-VIH son detectados mediante un mtodo inmunoenzimtico. El antgeno, compuesto por protenas recombinantes o pptidos sintticos de uno o ambos virus, est fijado a tiras de nitrocelulosa. La mayora de las pruebas rpidas de deteccin de anticuerpos emplean este principio. Tienen lectura visual y no requieren instrumentacin; su sensibilidad y especificidad an no estn suficientemente evaluadas. Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus, y su mayor inconveniente (en pases como el nuestro) es su elevado costo. Pruebas fluorimtricas. Han sido las ltimas en incorporarse a la oferta diagnstica (a partir de 1990). Los antgenos especficos estn ligados a micropartculas y el indicador de la reaccin es un fluorocromo que acta como sustrato. La fluorescencia emitida durante la reaccin es medida por un fluormetro. Tiene por tanto lectura objetiva y requiere un nivel de instrumentacin similar a las tcnicas de EIA. Dada su reciente introduccin en el mercado, hay poca experiencia y aunque la posibilidad de automatizacin y el procesamiento de gran nmero de muestras son muy ventajosas, es necesario estudiar su sensibilidad y valorar el costo de su incorporacin de forma rutinaria.
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Pruebas de confirmacin Dada las implicancias clnicas y sociales de un resultado falso positivo, las pruebas serolgicas deben ser confirmadas empleando tcnicas con fundamentos distintos y ms especficos. Por lo general, se utilizan para la confirmacin de sueros positivos, pero en determinados casos pueden emplearse tambin para continuar el estudio en casos dudosos, dada su mayor sensibilidad en muchos casos. Existen diferentes pruebas de confirmacin, entre ellas, las ms utilizadas son las basadas en la inmunoelectrotransferencia o Western Blot (WB), la inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la radioinmunoprecipitacin (RIPA). Western Blot: tcnica de inmunoelectrotransferencia, permite una discriminacin puntual de anticuerpos frente a las distintas protenas del virus. Las tiras de nitrocelulosa en las que se han transferido los antgenos virales contienen, generalmente, casi todas las protenas estructurales del VIH y algunas protenas precursoras de aquellas. La tcnica consiste en la incubacin de una de esas tiras con el suero problema durante un tiempo que oscila entre 2 a 4 horas y hasta 18 horas, tras lo cual se revela la presencia de anticuerpos frente a las diferentes protenas del virus mediante reacciones inmunoenzimticas distintas, dependiendo del fabricante. El resultado es la aparicin de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad, en el lugar de la tira de nitrocelulosa en el que estn situadas las protenas del VIH contra las cuales existen anticuerpos en el suero problema. Se identificarn, por su posicin en la tira segn peso molecular, comparndolas con el control positivo, las bandas especificas de reactividad (gp160, gp120, p66, p55, p51, etc.). Existen distintos criterios de positividad para el Western Blot. El propuesto por la OMS resulta el ms sensible cuando se manejan sueros de muy variada procedencia poblacional. Adoptando este criterio un suero es considerado positivo cuando presenta reactividad al menos frente a dos de los siguientes 3 antgenos virales: p24, gp120 y gp4l. El criterio propuesto por el CDC (el utilizado en nuestro pas) indica que un suero es positivo cuando presenta reactividad frente a p24 ms alguna de las glucoprotenas de superficie (gp160/120, gp41). Los sueros negativos no debern mostrar reactividad frente a ninguna de las protenas presentes en la tira. Finalmente los sueros se denominan indeterminados por Western Blot cuando, existiendo reactividad frente a una o ms protenas, no cumple el criterio de positividad adoptado (figura 7). Con el Western Blot pueden darse falsos negativos, posibilidad que debe tenerse en cuenta en individuos con factores de riesgo, o signos de infeccin por VIH, y en casos de exposicin reciente al virus. Se han descrito ensayos indeterminados por Western Blot en personas con factor reumatoideo, lupus eritematoso sistmico (LES), bilirrubinemias elevadas, anticuerpos contra el sistema HLA, en pacientes hemodializados, y otras causas. En otros casos la indeterminacin en el Western Blot de VIH-1 puede ser causada por una infeccin causada por VIH-2 u otros retrovirus (VLTH-I, VLTH-II). En aquellos sueros indeterminados, el seguimiento debe prolongarse durante al menos 6 meses para verificar si existe un cambio en el patrn de anticuerpos, hacia la positividad, o por el contrario, hacia la desaparicin de las bandas detectadas inicialmente. Las personas con resultados persistentemente indeterminados al cabo de 6 meses, en ausencia de factores de riego, sntomas o hallazgos clnicos compatibles con la infeccin por VIH, deben considerarse negativas para anticuerpos anti-VIH. Sin embargo, no deberan donar sangre, plasma, semen u rganos y debern ser informadas correctamente sobre el significado de su situacin. Inmunofluorescencia indirecta: la confirmacin por esta tcnica est basada en la demos-
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Figura 7. Ejemplo de un Western blot para un suero positivo (a). La segunda tira corresponde a un individuo sano que exhibe una reaccin dbil para gp160 y para p24. La tira C, corresponde a una segunda muestra tomada del mismo individuo, y muestra el mismo patrn. Esto arroja un resultado indeterminado que debe seguir siendo evaluado hasta la aparicin de mas bandas, o la desaparicin de las existentes.
gp160 gp120 p66 p55 gp41 p32 p24 p17 IgG control
tracin de anticuerpos frente a clulas infectadas por VIH, los resultados slo pueden expresarse como positivos o negativos. Como antgenos son empleados linfocitos humanos infectados y fijados sobre portaobjetos. Las clulas infectadas expresan gran cantidad de antgenos correspondientes a distintos momentos de la infeccin celular, por lo que esta tcnica detecta todo tipo de anticuerpos anti-VIH. Las diluciones seriadas del suero problema nos permiten expresar los resultados indicando el ttulo obtenido. Tcnica de radioinmunoprecipitacin: consiste en la demostracin de la existencia de anticuerpos anti-VIH en el suero en estudio, que en presencia de protenas vrales marcadas radioactivamente conduce a la formacin de innunocomplejos. Es la tcnica de referencia. La elaboracin del antgeno requiere condiciones de alta seguridad, ya que se realiza mediante cultivo del virus en lneas celulares de linfocitos humanos y su posterior marcaje radioactivo. Los complejos protena viral-anticuerpo especfico son separados por tcnicas electroforticas segn su peso molecular y se ponen en evidencia mediante la impresin del marcaje radioactivo en una placa fotogrfica. Se trata de una tcnica muy compleja y de difcil implementacin. Deteccin de Ag p24: este antgeno puede detectarse en suero o plasma durante la fase aguda de la infeccin primaria por VIH y durante la fase SIDA. El antgeno p24 es detectable solamente en el 4% de los adultos asintomticos. En la poblacin adulta es una tcnica de baja sensibilidad (hasta un 60%), y la presencia de p24 es indicativa de la replicacin activa del virus. La deteccin de este antgeno puede utilizarse para el diagnstico de infeccin por VIH en lactantes nacidos de madres VIH positivas. La sensibilidad de esta tcnica para esta franja etaria vara entre un 50 a un 75%, siendo aun ms baja para nios menores a 6 meses de vida.
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PCR: La amplificacin genmica por reaccin en cadena de la polimerasa, demuestra la existencia de parte del genoma viral a partir de muestras de sangre perifrica. Se trata de una tcnica de elevada sensibilidad y especificidad (95 y 98%, respectivamente) que provee un diagnstico ms rpido y precoz de la infeccin por VIH en determinadas situaciones: recin nacidos de madres infectadas por VIH (sensibilidad: 75 a 97%), demostracin de infecciones por VIH-2 con serologa no concluyente, deteccin de mutaciones especficas asociadas a la resistencia a los antivricos. Aislamiento viral: el aislamiento del VIH sigue siendo hoy en da una tcnica de referencia, su empleo queda restringido a laboratorios bien equipados. Supone el cultivo del virus a partir de muestras clnicas que contengan partculas virales libres o clulas infectadas. El aislamiento es obligado cuando se pretende establecer el fenotipo de VIH, la actividad in vitro de antivirales y puede servir de referencia de la carga viral presente en la muestra del paciente. Requiere el cocultivo de linfocitos de sangre perifrica del paciente con linfocitos de un donante no infectado, junto con la adicin de IL-2 para favorecer el crecimiento de clulas T. El cultivo permite detectar incluso el virus latente. Es caracterstico la observacin de formacin de sincicios y citlisis. Deteccin y cuantificacin de ARN viral: se trata de tcnicas con una sensibilidad muy alta a la hora de determinar infecciones agudas. Si bien no tienen indicaciones para su uso como herramienta diagnstica en la poblacin adulta, son herramientas sumamente tiles para el seguimiento del tratamiento antirretroviral, y para el diagnstico en recin nacidos de madres portadoras de VIH. Esto radica en que los recin nacidos presentan en su sangre hasta los seis meses de vida IgG maternos, por lo que los ensayos serolgicos podran arrojar falsos positivos. Por otra los ttulos de IgM en esta poblacin son sumamente bajos. El diagnstico de neonatos y lactantes debe basarse en la deteccin de antgenos. En tal sentido, los ensayos de PCR de ADN proviral y de cultivo de clulas mononucleares de sangre perifrica son los mtodos ms sensibles para la determinacin de la infeccin por VIH, alcanzando un 50% durante el primer mes de vida y cerca del 100% en lactantes mayores de 6 meses. Los resultados positivos deben confirmarse mediante un segundo ensayo (RT-PCR), realizado con una segunda muestra obtenida posteriormente
PREVENCIN Y CONTROL
Anualmente se destinan unos 500 millones de dlares a la investigacin de vacunas eficaces contra el VIH, habindose evaluado desde 1987 hasta el presente unas 30 vacunas candidatas. Varios han sido los enfoques para las posibles vacunas, habindose abarcado una amplia gama de estrategias para el desarrollo de las mismas (vacunas a virus entero inactivado, a virus vivo atenuado, vacunas compuestas por pptidos de envoltura recombinantes, pptidos sintticos, protenas internas, cidos nucleicos, entre otras). Estas han demostrado ser seguras y bien toleradas, y casi todas han producido una respuesta inmune especfica contra el VIH con diversos grados de xitos y fracasos. Hoy en da existen dos de estas vacunas en ensayos de eficacia de fase III, una de ellas en Estados Unidos, basada en el subtipo (B) circulante en esa regin; la otra, en evaluacin en Tailandia, se basa en los subtipos que circulan en dicho pas (B y E). Ambas vacunas estaran dirigidas contra la glicoprotena de envoltura gp120. El desarrollo de una vacuna eficaz se ha visto impedido por la importante variacin genotpica del VIH junto con su elevada tasa de mutacin y recombinacin experimentado durante el proceso de replicacin. A esto debe sumrsele la actual falta de comprensin de
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los parmetros crticos de inmunidad que podran proteger contra la infeccin o la enfermedad por VIH (o ambas). Con respecto a lo anterior, debe contemplarse adems la poblacin de seropositivos para VIH; el objetivo de la vacunacin en estas personas es la induccin de una respuesta inmune tal que detenga la progresin de la enfermedad; esta rama de la investigacin ha cobrado un inters renovado a partir del advenimiento de la terapia antirretroviral depositndose cifradas esperanzas en que la combinacin de esta terapia junto a una vacuna de este tipo sea capaz de controlar eficazmente tanto la replicacin viral como su diseminacin. De momento no existe vacuna disponible para la inmunizacin activa y al alcance de la poblacin con riesgo de contagio por el VIH-1; probablemente requerir an varios aos de estudios y en la actualidad la posibilidad real de obtener una vacuna efectiva parece todava bastante alejada. El nico camino eficiente para la prevencin es la educacin acerca de las vas de transmisin, el uso sistemtico de anlisis de la sangre en los bancos de sangre y el uso de preservativo en las relaciones sexuales. En ausencia de una vacuna, la prevencin de la infeccin por el VIH-1 debe basarse en evitar su transmisin. Por tanto, debe aconsejarse a las personas que mantienen relaciones homosexuales o heterosexuales mltiples que reduzcan el nmero de parejas y que eviten la exposicin de su mucosa oral o genital a la sangre, semen, saliva y secreciones vaginales. La correcta utilizacin de preservativos y espermicidas puede evitar la infeccin por el VIH-1 y otras enfermedades de transmisin sexual. Debe aconsejarse a los drogadictos que no compartan las agujas y jeringuillas. Tratamiento antirretroviral El tratamiento de la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana se basa en una combinacin de varias drogas. Habitualmente se emplean dos inhibidores de la retrotranscriptasa anlogos de nuclesidos (AZT, ddI o didanosina, lamivudina, entre otros) con un inhibidor de la proteasa (nelfinavir, saquinavir, indinavir), logrando una supresin impresionante en la replicacin viral, tanto en nivel como en duracin. Otras combinaciones incluyen dos inhibidores de la proteasa ms un inhibidor de la retrotranscriptasa anlogo de nuclesidos, o tres inhibidores de dicha enzima de igual caracterstica. Todas estas han producido una supresin viral potente en estudios preliminares. La eficacia de las mismas est dadas por la potencia global de la combinacin: aquellas combinaciones que logren una mayor reduccin en la carga viral tienen mayor probabilidad de producir beneficios ms duraderos. Por otro lado, los mejores resultados se han obtenido en individuos que a los que no se les haya administrado antirretrovirales previamente y que presentan recuentos de clulas T CD4+ ms elevados. No existe acuerdo sobre cuando debe iniciarse el tratamiento antirretroviral (TARV) en pacientes con infeccin crnica por VIH. Aquellos pacientes que presenten menos de 200 CD4/l debern iniciar dicho tratamiento, cualquiera sea la carga viral que presenten. El problema mayor se presenta con los pacientes que tienen entre 200 y 350 CD4/l. Existe fuerte evidencia de que deben tratarse todos los pacientes con menos de 350 CD4/l o cargas virales mayores a las 50.000 copias (medidas por ensayos como PCR o bDNA), ya que valores ubicados entre 30.000 y 100.000 copias son indicadores de un mal pronstico. De todos modos, los frmacos en una combinacin determinada deben ser administrados simultneamente ya que el agregado secuencial de los mismos durante un periodo prolongado aumenta la probabilidad del desarrollo de resistencia. Es importante que el paciente acepte y cumpla estrictamente con el esquema de dosificacin. En este sentido, la evaluacin clnica regular del paciente junto con el recuento de clulas T CD+ y la determinacin de la carga
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viral, son de suma importancia a la hora de evaluar un tratamiento en curso y la posterior determinacin de cambiar o no la teraputica. Entre las diferentes causas que pueden motivar dicho cambio se encuentran: 1. Una mala respuesta virolgica temprana a la teraputica (evidenciada por una pobre reduccin en la carga viral en un periodo de dos meses). 2. Un aumento significativo de la carga viral luego de un mnimo, no correlacionado a una causa corregible. 3. La disminucin contina del conteo de clulas T CD4+. 4. El deterioro clnico del paciente bajo tratamiento con un rgimen estable. Prevencin de la transmisin vertical: embarazo Debe aconsejarse a aquellas mujeres infectadas por el VIH-1 que eviten el embarazo, ya que es posible la transmisin de la infeccin al feto en al menos el 10-30% de los casos. La administracin de zidovudina a partir de las semanas 14-34 del embarazo y en el perodo del parto, y en el recin nacido durante las seis primeras semanas de vida, reduce la tasa de transmisin maternofetal a menos del 8% y se tolera muy bien. La combinacin del tratamiento con AZT y cesrea ha disminuido la transmisin vertical del VIH-1 a menos del 2%. En los pases desarrollados las madres deberan evitar la lactancia ya que la enfermedad se contagia tambin por esta va. Profilaxis postexposicin Para el caso concreto del personal sanitario, el riesgo de infeccin es del 0,2-0,5% en caso de pinchazo o herida accidental con una aguja u otro objeto contaminado con sangre, y prcticamente nulo si slo ha existido un contacto accidental de sangre u otras secreciones contaminadas con la piel y las mucosas intactas. No obstante, y dado que las consecuencias fsicas, morales, sociales y econmicas de adquirir una infeccin por VIH-1 a travs de un accidente laboral pueden ser irreparables, debe recomendarse el tratamiento triple con AZT o d4T, 3TC e indinavir o nelfinavir (siempre que no se hayan administrado al paciente fuente) tras la exposicin percutnea (pinchazo) o mucosa con sangre contaminada. El tratamiento debe instaurarse lo antes posible (menos de cuatro horas) y debe administrarse durante al menos cuatro semanas. Precauciones universales Es obligatorio la aplicacin de precauciones universales (aplicables a todos los pacientes) cuando se manipula sangre o determinados productos biolgicos considerados peligrosos (lquido pericrdico, pleural, peritoneal, articular y cefalorraqudeo, adems del semen y las secreciones vaginales) y al efectuar cualquier maniobra invasiva. Por tanto, el personal sanitario deber utilizar mtodos de barrera (guantes y, si es necesario, mascarilla, protectores oculares y batas) y adoptar precauciones para evitar la produccin de heridas por agujas, bistures u otros instrumentos punzantes en el transcurso de su empleo o limpieza. El descarte de tales elementos debe realizarse en recipientes de paredes rgidas a fin de evitar cortes y pinchaduras. Esterilizacin del instrumental sanitario Los mtodos habituales de esterilizacin (por ej. autoclave, xido nitroso) y desinfeccin (por ej. germicidas, leja, jabones) son adecuados para esterilizar el instrumental sanitario o efectuar una desinfeccin ambiental. Estos virus son rpidamente inactivados por detergentes y desinfectantes efectivos contra otros virus envueltos. Se recomienda el uso de hipoclorito
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de sodio en una concentracin de 5.000 ppm para superficies contaminadas, pudindose emplear concentraciones ms elevadas (10.000 ppm) cuando se trabaje con preparados y/o cultivos virales.
Virus linfotrpicos humanos y otros retrovirus oncognicos

INTRODUCCIN
Los oncovirus fueron denominados originalmente virus ARN tumorales y han sido asociados con leucemias, sarcomas y linfomas en muchos animales diferentes. No son citolticos. Los miembros de la subfamilia se distinguen por el mecanismo de transformacin celular y, en consecuencia, por la duracin del periodo entre la infeccin y el desarrollo de enfermedad. Un gran grupo de oncovirus, los virus causantes de sarcoma y leucemias agudas, tienen incorporados en sus genomas genes celulares (protooncogenes) que codifican factores de crecimiento, como hormonas de crecimiento, receptores de hormonas de crecimiento, proteincinasas, protenas de unin al GTP y protenas de unin al ADN nuclear. Estos virus pueden causar transformacin y son altamente oncognicos. Se han identificado por lo menos 35 oncogenes virales diferentes. Las mutaciones de los protooncogenes celulares originales presentes en el oncogn viral, o la sobreproduccin del oncogn, favorecen la transformacin de las clulas infectadas. La incorporacin del oncogn en muchos de esos virus sustituye secuencias codificadoras para los genes gag, pol o env, de forma que tales virus son defectuosos y requieren de virus facilitadores para su replicacin. Es frecuente que los virus permanezcan dentro del husped (virus endgenos) y sean transmitidos verticalmente a travs de clulas germinales.
PATOGENIA
Los virus de leucemia, incluyendo el VLTH-1 pueden replicarse de modo eficaz pero no pueden transformar las clulas in vitro. Causan cncer despus de un perodo de latencia largo, de al menos 30 aos. El virus puede favorecer la proliferacin de las clulas por dos mecanismos. En primer lugar, el virus puede activar su expresin mediante integracin prxima y yuxtaposicin de la secuencia de los genes facilitadores y promotores vricos de la regin LTR a la regin de los genes que controlan el crecimiento celular. En segundo lugar, se produce un regulador de la transcripcin (tax), capaz de activar los promotores de la regin LTR y genes celulares especficos (como genes de linfocinas y controladores de crecimiento, por ej.: IL-2 y GM-CSF) para favorecer la proliferacin de la clula. El crecimiento celular incontrolado puede ser suficiente para inducir transformacin neoplsica, y adems puede favorecer otras aberraciones genticas a lo largo de un perodo prolongado. Estos virus se asocian tambin con trastornos neurolgicos no neoplsicos y otras enfermedades. Entre los oncovirus humanos se incluyen VLTH-1, VLTH-2 y VLTH-5, pero solo el VLTH-1 ha sido asociado de modo inequvoco con alguna enfermedad.
VLTH-1 (VIRUS LINFOTRPICO HUMANO DE CLULAS T TIPO I)
El aislamiento original de este virus se hizo a partir de clulas leucmicas de pacientes con formas agresivas de carcinomas de clulas T. Este virus causa leucemia linfoctica aguda de clulas T del adulto (LLTA) y la paraparesia espstica tropical, una enfermedad neurolgica no oncognica que presenta un cuadro similar al producido por la esclerosis mltiple. Adems,
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se han descrito otras tres condiciones asociadas con la infeccin por VLTH-1: uvetis por VLTH-1, dermatitis infecciosa asociado a VLTH-1 y artropata asociada a VLTH-1 Caractersticas estructurales El virus linfotrpico humano de clulas T, tipos I y II, es un miembro de la subfamilia Oncovirinae, y es un tpico exponente de retrovirus de clase C. Tanto VLTH-I como VLTH-II poseen una organizacin genmica similar (gag, pro/pol, env, p, flanqueados por repeticiones terminales largas o LTR) y presenta una homologa del 60% a nivel de sus secuencias nucleotdicas. El gen gag codifica para las protenas estructurales p19, p24, y p15. Los genes pro/pol codifican para la proteasa y la transcriptasa reversa, respectivamente. El gen env codifica para las protenas transmembrana y las glucoprotenas de la envoltura gp21 y gp46. El gen p codifica para las protenas reguladoras Tax y Rex y otros tres marcos abiertos de lectura. Epidemiologa Las regiones inmunodominantes de las protenas estructurales y ciertas regiones de los genes reguladores son la base para la diferenciacin de VLTH-I y II. Si bien el genoma de estos virus se encuentra bastante conservado, existe una mayor divergencia en lo referente a las LTR; esta diferencia ha sido explotada mediante RFLP (polimorfismos en el largo de fragmentos de restriccin) para la separacin del VLTH-I en tres subtipos (denominados cosmopolita, africano y melanesio, cada uno relacionado al origen geogrfico del virus). Otras herramientas de biologa molecular han permitido subdividir al subtipo cosmopolita en subtipos designados A-D. Los estudios virolgicos han confirmado la presencia de VLTH-1 en las clulas T de los pacientes seropositivos para los anticuerpos anti-VLTH-1. La comparacin de los virus aislados en Estados Unidos, Japn, el Caribe e Israel ha demostrado que son iguales sobre la base de la homologa de cidos nucleicos. Se han identificado reas endmicas de infeccin por VLTH-1 en Asia, frica, Medio Oriente, Europa y el Hemisferio Occidental. Del mismo modo, VLTH-II ha sido dividido en dos subtipos, IIa y IIb, que no parecen tener una distribucin geogrfica determinada, aunque s se asocian a determinadas poblaciones de riesgo. En este sentido, el subtipo IIa se halla frecuentemente asociado a usuarios de drogas intravenosas a lo largo de todo el mundo, mientras que el subtipo IIb se halla presente en indios americanos. Transmisin El VLTH-1 permanece asociado con las clulas y se contagia por trasfusin de sangre, relaciones sexuales o alimentacin mamaria. Se ha sugerido la transmisin sexual (mayor probabilidad de VLTH-1 positivas en mujeres de hombres infectados, habindose detectado linfocitos portando el virus en el semen). Se han hallado linfocitos infectados por el VLTH-1 en la leche de mujeres con anticuerpos contra el virus. Adems, se han detectado clulas infectadas en la sangre del cordn umbilical de recin nacidos de mujeres infectadas, hecho que sugiere de manera contundente que la infeccin podra ocurrir intratero. Tambin se ha demostrado que la transmisin se produce por va parenteral. Ciclo del virus Entra al torrente sanguneo e infecta los linfocitos T helper CD4+ y otros linfocitos implicados en la hipersensibilidad retardada. Esas clulas T tienden a residir en la piel, lo que
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contribuye a los sntomas de LLTA. El VLTH es competente para la replicacin y los genes gag, pol y env son transcriptos, traducidos y procesados de una manera muy similar al VIH, aunque su regulacin es diferente. Adems de su accin sobre los genes virales, la protena tax, transactiva los genes celulares para el factor de crecimiento de las clulas T, IL-2 y sus receptores, lo que activa el crecimiento de la clula infectada. El virus puede permanecer latente o multiplicarse con lentitud durante muchos aos, pero tambin puede inducir proliferacin de clones particulares de clulas T. Aunque esta proliferacin de clulas T habitualmente es de origen policlonal, la leucemia linfoctica de clula T del adulto (LLTA) causada por el VLTH-1 suele ser monoclonal. En las clulas con crecimiento estimulado por VLTH se acumulan aberraciones cromosmicas y reordenamientos del gen que codifica para el receptor beta del antgeno de las clulas T, lo que favorece la transformacin leucmica. Clnica La mayor parte de las infecciones ocurren mas tarde en la vida y casi todos los individuos infectados permanecen asintomticos de por vida, y la incidencia acumulativa de las formas de leucemia de clulas T del adulto se produce aproximadamente en el 4% de los infectados. Aproximadamente 1 de cada 20 personas desarrollan leucemia a los largo de un perodo variable entre 10-50 aos. La LLTA por el VLTH-1 es una neoplasia de las clulas T helper CD4+ con curso agudo o crnico. Los linfocitos malignos han sido denominados clulas en flor porque son pleomrficos y contienen ncleos lobulados. Adems de una cifra alta de leucocitos, esta forma de LLTA se caracteriza por lesiones cutneas similares a otras leucemias. La LLTA aguda suele conducir a la muerte en menos de un ao desde el momento del diagnostico, independientemente del tratamiento. Mtodos diagnsticos Se ha implementado el monitoreo en bancos de sangre para evitar la transmisin de VLTH-1 y 2 por transfusin. Dicho monitoreo emplea mtodos indirectos para deteccin anticuerpos especficos en suero y plasma. La respuesta inmunolgica est dada principalmente contra ciertas regiones altamente inmunognicas de las protenas codificadas por los genes gag y env. Habitualmente se emplean EIA como el ELISA para el tamizaje (screening) primario de los distintos sueros. Estos ensayos son simples y sensibles y estn preparados a partir de lisados de clulas infectadas por VLTH-1. Las pruebas confirmatorias se realizan mediante WB. Estos ensayos serolgicos, sin embargo, no son capaces de discernir entre una infeccin presente o pasada. La deteccin directa del virus en fluidos corporales puede realizarse mediante ensayos para protenas o cidos nucleicos virales, como ELISA de captura para antgenos virales (usualmente productos del gen gag), hibridacin de cidos nucleicos (Southern Blot) con sondas marcadas o PCR. Esta ltima se ha convertido en el mtodo de referencia para la determinacin de infecciones presentes, validando ensayos serolgicos, diferenciando entre infecciones por VLTH-1 y VLTH-2. En la poblacin peditrica el diagnstico se realiza mediante PCR; esta herramienta es de suma utilidad ya que los ensayos serolgicos no son indicadores confiables de infeccin debido a la transferencia pasiva de anticuerpos maternos. Tratamiento, prevencin y control No se conoce tratamiento eficaz contra la infeccin por el VLTH-1. Es probable que el AZT
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y otros inhibidores de la transcriptasa inversa sean efectivos contra el VLTH-1, pero se necesitan estudios controlados para demostrar el beneficio de estas terapias. Los medios para limitar la diseminacin del virus son los mismos descritos para el VIH: precauciones sexuales, deteccin del suministro de sangre y la divulgacin de los riesgos y enfermedades potenciales, contribuirn a bloquear la transmisin del virus. Es muy difcil controlar la infeccin de origen materno en los nios. En un futuro prximo probablemente se instituyan procedimientos de despistaje o screening habituales para el virus en la sangre donada. Hasta el momento se han reportado en el Uruguay dos casos por el VLTH-1.
RETROVIRUS ENDGENOS
Diferentes retrovirus estn integrados y forman parte de los cromosomas de humanos y animales. En las personas se pueden detectar secuencias provirales completas y parciales, con secuencias de genes similares a las del VLTH, el virus de tumor mamario del ratn (MMTV) y otros retrovirus. Estos virus endgenos carecen generalmente de capacidad para multiplicarse, debido a deleciones, insercin de codones de terminacin o escasa eficacia de la transcripcin. Las secuencias de retrovirus pueden constituir hasta el 0,1% del genoma humano. Esas secuencias pueden proporcionar sitios de integracin para otros retrovirus o cumplir alguna funcin desconocida.
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Virus de las hepatitis

N. Cordeiro, R. Taroco, H. Chiparelli
Introduccin
La hepatitis viral es una enfermedad infecciosa del hgado causada por distintos virus y caracterizada por necrosis hepatocelular e inflamacin. El cuadro clnico y las lesiones histolgicas producidas por los distintos agentes virales son prcticamente idnticos, pero existen diferencias en el mecanismo de transmisin, el perodo de incubacin y la evolucin y, sobre todo, en los marcadores serolgicos que permiten reconocer el agente responsable. Se definen como hepatotropos primarios aquellos virus que tienen un tropismo especial por los hepatocitos y por lo tanto, los infectan en forma preferencial lo cual no quiere decir que no infecten otros tipos celulares; y se definen como hepatotropos secundarios aquellos virus que infectan primariamente a otros tipos celulares pero que pueden, en el contexto de una infeccin generalizada infectar los hepatocitos. Tradicionalmente la hepatitis viral se dividi en dos tipos: la hepatitis A o infecciosa causada por el virus de la hepatitis A y la hepatitis srica causada por el virus de la hepatitis B. En el transcurso de estos ltimos 30 aos se han identificado nuevos virus causantes de hepatitis en forma primaria: el virus de la hepatitis delta (VHD), el virus de la hepatitis C responsable de la hepatitis no A no B clsica transmitida por va parenteral (VHC), hepatitis no A no B epidmica que se transmite por va entrica denominado virus de la hepatitis E (VHE). Investigaciones recientes destinadas a la identificacin de nuevos virus causales de hepatitis condujeron al descubrimiento de otros candidatos potenciales, el virus de la hepatitis F el cual hasta el momento no ha sido comprobado como tal; el virus C de la hepatitis GB (HGBV C) y el virus de la hepatitis G, ambos terminaron siendo el mismo agente con algunas pequeas diferencias genmicas que se detallan ms adelante. Se conocen muchos virus (hepatotropos secundarios) capaces de infectar el hgado e inducir un sndrome similar a la hepatitis, pero ello ocurre en el contexto de una patologa mas generalizada. Como por ejemplo virus de Epstein-Barr, CMV, Herpes simple. Algunos agentes infecciosos no virales tambin pueden causar inflamacin heptica infecciones bacterianas como la neumona neumocccica y la infeccin por Leptospiras tambin.
Manifestaciones clnicas y de laboratorio

Sin ser el objetivo de este captulo entrar en profundidad en lo que tiene que ver con las
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manifestaciones clnicas de las hepatitis (a las cuales haremos referencia cuando se cite cada tipo viral) existen algunos conceptos que queremos remarcar. Cuando hablamos de hepatitis aguda estamos haciendo referencia temporal de una inflamacin aguda (definida histolgicamente) que ocurre en el parnquima heptico y que puede corresponder a una variedad de etiologas (txicas, farmacolgicas, autoinmunes, bacterianas, virales, etc.). Indudablemente, al igual que en las hepatitis crnicas la etiologa viral es la ms frecuente. Haciendo referencia a los virus de las hepatitis todos estos son agentes potenciales de hepatitis aguda. La hepatitis aguda de etiologa viral abarca desde una enfermedad asintomtica hasta una insuficiencia heptica fulminante. Se divide en cuatro estadios clnicos: perodo de incubacin, fase preictrica, fase ictrica y perodo de convalecencia. No siempre se cumplen todas estas etapas. Durante el perodo de incubacin los pacientes permanecen asintomticos. La fase de mxima infectividad tiene lugar durante los ltimos das asintomticos del perodo de incubacin y los primeros das de sintomatologa aguda. Los primeros sntomas son inespecficos: malestar general, anorexia, nuseas, vmitos y dolor de tipo gravativo en el hipocondrio derecho. Estos sntomas pertenecen a la fase preictrica, y generalmente duran entre 3 y 10 das. Luego la enfermedad ingresa en la fase ictrica sealada por la instalacin de la ictericia; acompandose de grados variables de coluria (evidencia la presencia de bilirrubina directa en la orina), y grados variables de hipocolia (no constituyendo generalmente una acolia franca como ocurre en las ictericias fras obstructivas). La ictericia se observa en un 20-50% de los casos de todas las hepatitis. En aquellos casos en los que no se observa ictericia igual se ven alteraciones del funcional y enzimograma heptico con invariablemente un aumento de la bilirrubina. El prurito puede acompaar a la ictericia o incluso precederla. Pueden aparecer diferentes manifestaciones clnicas como la poliartritis nodosa asociada al VHB, la glomrulonefritis asociada al VHB y al VHC, etc. Un 10% de los pacientes con hepatitis aguda, sobre todo los casos de infeccin por VHB, desarrollan un sndrome parecido a la enfermedad del suero caracterizado por fiebre, erupcin cutnea, y artralgias, atribuible a los inmunocomplejos circulantes. Tambin pueden estar presentes el fenmeno de Reynaud, la crioglobulinemia mixta, la formacin de ampollas o el eritema nudoso. La fiebre acompaa las etapas iniciales y rara vez persiste durante la fase ictrica. Las manifestaciones en el examen fsico son en general escasas. La ictericia se detecta en general cuando el nivel de bilirrubina en sangre es mayor de 2.5-3.5 mg/dl y se aprecia con mayor claridad en las esclerticas o la regin sublingual. Pueden aparecer lesiones de rascado debido al prurito intenso. La palpacin abdominal puede revelar una ligera hepatomegalia congestiva dolorosa. Las hepatitis crnicas tambin responden a una gran variedad de etiologas (txicas, autoinmunitarias, virales, hereditarias, etc.). Tiempo atrs la hepatitis crnica se defina sencillamente como el aumento de las alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) o de ambas, por ms de 6 meses. De acuerdo con esta definicin, un paciente con un nivel srico normal de estas enzimas no padece hepatitis crnica ni corre riesgos de complicaciones a largo plazo. Se sabe que ciertos virus como el VHC y el VHB, casi nunca son erradicados por completo del hgado, an cuando los niveles sricos de las transaminasas hepticas se normalicen y no se aprecien partculas virales circulantes. Es por este y otros motivos que la clasificacin en hepatitis crnica dado por un factor temporal ha cado en desuso. En general el diagnstico de hepatitis crnica se asocia con implicancias clnicas dado que la afeccin puede conducir a una cirrosis y a otros trastornos graves si los pacientes no
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son controlados. Por lo antedicho, se ha establecido una nueva clasificacin de las mismas, basada en una combinacin de variables clnicas, serolgicas e histolgicas. Esta clasificacin de las hepatitis se basa en su causa, su actividad histolgica o grado (de acuerdo a la actividad necroinflamatoria segn la biopsia) y en su grado de progresin o estadio, este ltimo basado fundamentalmente en el grado de fibrosis (grado 0=ausencia de fibrosis; grado 1=fibrosis leve; grado 2=fibrosis moderada; grado 3=fibrosis intensa; grado 4=cirrosis).
* Infiltrado inflamatorio de clulas mononucleares limitado al interior del espacio porta. Hay
Cuadro 1. Correlacin entre la nomenclatura antigua y actual de la hepatitis crnica

Clasificacin antigua Hepatitis crnica persistente Hepatitis crnica lobulillar Hepatitis crnica activa Clasificacin Actual Grado (actividad) Estadio (fibrosis) Mnima o leve Ninguna o leve Leve o moderada Leve Leve, moderada o grave Leve moderada o grave
indicios de actividad regenerativa heptica como una distribucin en empedrado de los hepatocitos. Hay una leve fibrosis y no hay cirrosis; ** Focos de necrosis e inflamacin en el lobulillo heptico; *** Necrosis heptica mantenida, inflamacin portal y periportal, as como fibrosis. El infiltrado mononuclear se extiende al lobulillo heptico.
Esta clasificacin es una clasificacin clnico-histolgica y no hace referencia a la presencia o ausencia, replicacin o no de aquellos virus capaces de dar lugar a hepatitis crnicas. Dentro de los virus hepatotropos primarios causantes de hepatitis viral crnica se encuentran: VHB, VHC. Si bien el VHD requiere de antgenos de superficie del VHB para infectar, este tambin se asocia a hepatitis crnica. En el caso del VHG y el TTV la situacin permanece en estudio. No existe ningn hallazgo clnico que permita diferenciar entre una infeccin crnica por hepatitis B u otros agentes virales. En general la infeccin persistente por el VHB u otro virus es asintomtica, pero un nmero significativo de pacientes con infeccin crnica por VHB finalmente desarrollan cirrosis. La hepatitis fulminante es la forma ms grave de presentacin de la hepatitis. Se define como una insuficiencia heptica aguda severa asociada a encefalopata heptica en el transcurso de las 8 semanas posteriores a la fase ictrica. Se define como insuficiencia heptica de instalacin tarda a la que aparece en el transcurso de 8 a 12 semanas luego de la fase ictrica. El 75% de los casos de hepatitis fulminante se deben a hepatitis viral y de estas, el VHB es responsable del 30-60% de los casos en diferentes regiones aunque en nuestro medio la asociacin ms frecuente es por VHA. En un 30% de estos casos la serologa tambin es positiva para el VHD y padeceran una coinfeccin. El VHC no ha sido implicado por s solo a hepatitis fulminante, sino como cofactor en pacientes infectados por el VHB. Menos del 1% de los casos de infeccin por VHB evolucionan a hepatitis fulminante. La hepatitis fulminante puede instalarse en cualquier fase de la enfermedad. El desarrollo de una hepatitis fulminante es anunciado por signos de encefalopata heptica como letargo, somnolencia, confusin, trastornos de la memoria, estupor y coma. Pueden presentarse severos trastornos de la coagulacin por sntesis inadecuada, con presencia de grandes sangrados. Una manifestacin tpica es la presencia de asterixis.
HALLAZGOS EN EL LABORATORIO
El diagnstico del agente etiolgico especfico de las hepatitis virales depende sobre todo de las pruebas serolgicas que sern comentados al igual que otros mtodos de estudio con cada virus.
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A nivel del laboratorio general el rasgo ms distintivo de las hepatitis agudas es el notable aumento de las aminotransferasas hepticas; la aspartato aminotransferasa (AST) o transaminasa glutmico oxalactica (TGO) y la alanina aminotransferasa (ALT) o transaminasa glutmico pirvica (TGP). Estas se elevan hasta valores 8 veces superiores al valor normal, en el momento que se instala la ictericia. Los niveles de AST y ALT comienzan a elevarse durante la ltima fase del perodo de incubacin, continan aumentando durante la fase preictrica y alcanzan un pico en un estadio temprano de la fase ictrica. La fosfatasa alcalina al igual que la LDH se encuentran levemente aumentadas. Los niveles de bilirrubina se encuentran invariablemente elevados sin alterar la relacin entre ambas (no hay predominio franco de una sobre la otra). El recuento de leucocitos es normal o levemente disminuido pudiendo observarse una linfocitosis leve. El recuento plaquetario en general es normal. El tiempo de protrombina en general es normal. Aunque en pacientes con hepatitis severa se detectan niveles elevados de ALT, los niveles altos no se correlacionan necesariamente con una evolucin adversa. La presencia de un tiempo de protrombina alargado debe orientar hacia la posibilidad de una necrosis heptica ms severa que puede evolucionar hacia una hepatitis fulminante. Este es un signo de mal pronstico. En la hepatitis fulminante puede verse alterado el recuento plaquetario y puede sobrevenir una coagulacin intravascular diseminada (CID). El aumento de las transaminasas es en general muy importante en aquellas hepatitis severas. En el caso de la hepatitis fulminante puede suceder que las transaminasas estn francamente disminuidas. Esto no nos debe confundir, y en presencia del contexto clnico de una hepatitis fulminante esto nos habla de la extensin y gravedad de la lesin heptica. La gamma-GT persiste en general muy elevada como un elemento de colestasis heptica. La colinesterasa se presenta en niveles extremadamente bajos. En general, cuando la infeccin se asocia con hepatitis crnica persistente los pacientes tienen un buen estado general y presentan elevaciones persistentes o recurrentes de AST y ALT, sin ictericia. Es comn la hepatomegalia leve y en ocasiones hay esplenomegalia. En algunos casos el seguimiento a largo plazo no muestra evidencia de progresin y en algunos casos hay resolucin completa. Rara vez hay desaparicin tarda de HBsAg. Los pacientes con hepatitis crnica activa pueden presentar ictericia crnica, episodios intermitentes de ictericia o esta puede no estar presente en la evolucin de la enfermedad. Por lo general estos episodios se asocian con elevaciones significativas de las transaminasas. Debemos tener siempre presente que la definicin de la hepatitis crnica activa es histolgica. El pronstico de los pacientes es variable. En algunos pacientes con hepatitis crnica activa la progresin hacia la insuficiencia heptica y la muerte se produce antes de que pase un ao.
Virus de la hepatitis A
La hepatitis por virus A, otrora denominada hepatitis infecciosa, constituye un problema de salud pblica mundial, siendo la ms frecuente de la hepatitis virales tanto en pases en desarrollo como en pases desarrollados, mostrando un aumento de la incidencia a medida que aumenta la edad de la poblacin. Se estima que la incidencia anual a nivel mundial excede los 1.4 millones de casos, resultando en un enorme costo tanto en cuidado mdico como en prdida de productividad. La identificacin del virus causante de esta enfermedad infecciosa no pudo realizarse sino hasta principios de la dcada de 1970 mediante el uso de la microscopa electrnica. A partir de entonces intensos trabajos se han desarrollado con este virus, logrndose el cultivo, clonado y finalmente la secuenciacin nucleotdica completa de su genoma.
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El virus de la hepatitis A (VHA) pertenece a la familia Picornaviridae que incluye a los enterovirus y a los rinovirus humanos. Anteriormente se lo clasificaba como enterovirus 72, pero la posterior determinacin de su secuencia nucleotdica y aminoacdica y su mayor resistencia a la inactivacin trmica resultaron en la reclasificacin de este agente infeccioso dentro de un nuevo grupo/gnero: Heparnavirus.
CARACTERSTICAS ESTRUCTURALES
Al igual que el resto de los picornavirus, el VHA es un virus esfrico, desnudo y presenta una nucleocpside icosahdrica de 27-30 nm, constituida por 3 polipptidos de gran tamao VP1, VP2, VP3 y otra protena de menor tamao VP4, si bien su presencia no ha sido demostrada de manera fehaciente. VP1 es la que se encuentra en mayor proporcin en la superficie del virin. Tambin se puede detectar un pptido VP0 que es el precursor de la VP4 y la VP2 en especial en los viriones inmaduros. Las partculas virales parecen ensamblarse como precursores pentamricos, en donde 12 pentmeros se uniran, en un proceso dependiente de su concentracin, para formar partculas vacas. Entonces la cpside viral estara formada por 60 capsmeros.
GENOMA
El genoma de VHA consiste en ARN simple de cadena lineal, de polaridad positiva. Posee una protena denominada VPg unida mediante un residuo de tirosina a su extremo 5. Este ARN tiene una longitud de aproximadamente 7500 nucletidos (cepa HM 175). Contiene un nico marco abierto de lectura (ORF) de 6681 nucletidos que codifica para una poliprotena de 2227 residuos aminoacdicos. Esta poliprotena sufre un clivaje postraduccional, mediado por una proteasa viral, para dar lugar a protenas estructurales y no estructurales. Se distinguen as en el genoma 3 regiones: a) extremo 5 no codificante (5 ntr) que no presenta cap, encontrndose en su lugar una protena pequea denominada VPg; b) el marco abierto de lectura anteriormente mencionado; y c) el extremo 3 no codificante (3 ntr) de 63 nucletidos que se continan por una cola poli A.
REPLICACIN VIRAL
El ciclo de infeccin celular comienza con la adsorcin de la partcula viral a los receptores de membrana en clulas permisivas (aparentemente una protena similar a mucina) en un proceso calcio dependiente. Los procesos de penetracin y denudamiento no se conocen con claridad. Una vez en el interior celular, el genoma viral es traducido por los ribosomas celulares dando lugar a la poliprotena; mediante clivajes posteriores esta da lugar a distintas protenas, entre ellas la proteasa que acta en este proceso, al precursor de la VPg (necesaria para el comienzo de la sntesis de nuevo ARN y para la encapsidacin de los genomas hijos) y la ARN polimerasa ARN dependiente encargada de copiar el ARN de polaridad positiva en un ARN molde de polaridad negativa. Este ltimo servir como molde para la sntesis de genomas hijos ARN de polaridad positiva. A diferencia de otros picornavirus, la salida de los viriones de la clula no es por histlisis. El resultado de la replicacin del VHA usualmente no produce lisis celular, nicamente acmulos citoplasmticos en vesculas y membranas como cambios visibles en la estructura celular. Todo el proceso puede durar entre 5 y 10 horas (figura 1).
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Figura 1. Organizacin del ARN genmico del virus de hepatitis A y clivaje de las protenas. La protena VPg unida en forma covalente (extremo 5; arriba) comienza el codn a 0,73kb, posiciones de comienzo/final del gen (marcas verticales pequeas) y codones de terminacin en 7,4kb y poli(A) en el extremo 3. El ARN del virus de hepatitis se traduce (flecha grande vertical) en una poliprotena precursora (medio) que es clivada por las proteasas virales en varios pasos (flechas verticales pequeas) dando lugar a las protenas maduras. Se indican las regiones de la poliprotena de acuerdo a la nomenclatura estndar, al igual que los residuos predichos en los extremos amino y carboxiterminales de las protenas maduras. Los nombres, longitudes y funciones propuestas en los poliovirus se indican en el diagrama inferior junto con las protenas del virus de hepatitis A. El virus de hepatitis A est compuesto por cuatro polipptidos de la cpside codificadas en la regin P1. Estas protenas se indican como protenas del virin (VP1, VP2, VP3 y VP4). Las protenas no estructurales se codifican en las regiones P2 y P3.
Abreviaturas. A: alanina ; D: aspartato; E: glutamato; G: glicina; M:metionina; Q: glutamina; R: arginina; S. serina; V: valina
VARIABILIDAD ANTIGNICA
Las tres protenas mayores que forman la cpside del VHA poseen sitios antignicos inmunodominantes que estn altamente conservados en todas las cepas humanas. El VHA tiene un solo serotipo y no reacciona de manera cruzada con anticuerpos especficos para enterovirus. Las cepas humanas sin embargo pueden agruparse en 4 genotipos (I, II, III, VII) en base a diferencias en la secuencia nucleotdica de la regin P1 del genoma.
RESISTENCIA A LOS AGENTES FSICOS Y QUMICOS
El VHA es ms resistente al calor que otros picornavirus, siendo todava infeccioso luego de ser sometido a 60 grados durante 10-12 horas. Al tratarse de un virus desnudo no presenta lpidos en su estructura y por lo tanto ser resistente a aquellos agentes usados para inactivar virus envueltos (solventes). As, es estable al tratamiento con ter, cloroformo, cido (es resistente a extremos de pH, mantenindose estable a pH 3 y requirindose un pH superior a 10 para inactivarlo). La inactivacin total de la partcula viral se da casi de inmediato a temperaturas superiores a los 90C La actividad viral se inhibe por ebullicin durante 5 minutos, con formalina a altas concentraciones y por radiacin UV. Por otro lado, a 4 C permanece estable durante semanas a meses, mientras que conservado de 20 a 70 grados mantiene su infectividad por aos.
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Se inactiva por la esterilizacin con autoclave (121 C durante 20 min.), y la exposicin al cloro durante 15 minutos en concentraciones de 10.5-2.5 mg/l. La capacidad de los virus para sobrevivir a temperaturas relativamente altas y a la inactivacin con solvente remarca los requisitos de un cuidado meticuloso cuando se manipula materia fecal en el contexto hospitalario o de laboratorio, y de la desinfeccin de las superficies potencialmente contaminadas.
EPIDEMIOLOGA
El VHA causa enfermedad en humanos, chimpancs, y primates inferiores. La hepatitis A es una enfermedad aguda autolimitada que rara vez provoca la muerte. A pesar de lo antedicho, se han comunicado casos de recidivas y colestasis de instalacin en la fase aguda tarda y de varios meses de duracin. Estas dos variantes son inusuales y generalmente benignas. La tasa de mortalidad asociada a la hepatitis A ictrica es de 2 por cada 1000 casos. Nunca evoluciona a una hepatitis crnica ni hacia estado de portador. La hepatitis a virus A es endmica en todo el mundo y se caracteriza por presentarse de modo epidmico o en forma de brotes aislados. Se transmite de manera predominante por va fecal-oral, es altamente contagiosa y se transmite con rapidez a los contactos ntimos. Los casos se presentan usualmente durante el periodo otoo-invierno asociado a su forma de transmisin. Al propagarse por va fecal-oral la epidemiologa de este virus se relaciona directamente con las condiciones higinicas de la poblacin, el acceso de la misma a una fuente de agua potable limpia y las condiciones de saneamiento. Su diseminacin est dada por la eliminacin de partculas virales en la materia fecal de individuos infectados durante la ltima etapa del periodo de incubacin. El pico de liberacin viral en heces se da generalmente entre los 5 y 10 das previos al comienzo de los sntomas clnicos de la enfermedad, extendindose hasta una semana despus de aparecida la ictericia o del aumento en el nivel de las transaminasas. Este periodo es el de mayor contagio y no se evidencia sino hasta la aparicin de los sntomas. Se han relacionado ciertos brotes con manipuladores de comidas e incluso a la ingesta de moluscos bivalvos. Otros modos menos frecuentes de transmisin incluyen relaciones homosexuales y el uso de drogas intravenosas. En ocasiones las guarderas son origen de brotes epidmicos sobre todo cuando albergan nios que an utilizan paales. La transmisin parenteral es francamente inusual. El perodo de incubacin no depende de la va de transmisin. El periodo de incubacin dura aproximadamente entre 2 a 7 semanas con una media de 4 semanas. Un 60-70% de los pacientes son asintomticos cuando la infeccin se produce en los primeros aos de vida. Sin embargo, en adolescentes y en adultos jvenes, el 90% o ms son formas ictricas y con sintomatologa importante. Menos del 1% de los infectados por VHA puede sufrir una hepatitis fulminante, (totalizando un 5-10% de todas las causadas por virus hepatotropos). Un 60% de los pacientes con hepatitis fulminante se recuperan sin sufrir un trasplante heptico. La poblacin de pases con condiciones higinico-sanitarias inadecuadas se infecta durante los primeros aos de vida, convirtindose as en una enfermedad de la primera y segunda infancia o adolescencia, y rara vez en adultos, por lo que en estas comunidades la prevalencia de anticuerpos en adultos es superior al 90%. En pases desarrollados el panorama es distinto, la infeccin deja de ser frecuente en la infancia, pasando a ser espordica para todos los grupos etarios. En estos pases, conforme disminuye la infeccin subclnica en la infancia surge una poblacin de adultos predispuestos a la enfermedad. Parte de la importancia de dicho suceso radica en que la enfermedad es clnicamente ms evidente en adultos, adems de ser ms grave
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con una mayor tasa de morbimortalidad. El factor ms importante relacionado a la severidad de la enfermedad es la edad del paciente al momento de la infeccin. En nuestro pas la enfermedad es endemo-epidmica y su prevalencia ha cambiado en los ltimos aos. En Montevideo, la infeccin por virus de hepatitis A muestra una prevalencia intermedia, con variaciones en relacin a la edad y las condiciones sanitarias, y dentro del grupo de los manipuladores de alimentos es mayor que en la poblacin global. La incidencia segn datos de Vigilancia Epidemiolgica del MSP de nuestro pas durante el ao 2005 se han registrado 2877 casos nuevos de VHA. En estos estn incluidos los casos del brote de infeccin por VHA en Bella Unin (Artigas) en 2005.
PATOGENIA
El virus, resistente al cido, probablemente pase al estmago, se replique en menor cantidad en el intestino y luego es transportado hacia el hgado, sitio ms importante de replicacin. El virus se elimina a partir de las clulas infectadas del hgado a travs de los sinusoides hepticos y los canalculos, pasa al intestino y se excreta en las heces. Como se mencion anteriormente la progenie viral emerge de los hepatocitos sin causar lisis celular, de manera que la citopatologa sera ms una consecuencia de la respuesta inmune del husped, fundamentalmente la respuesta inmune celular, que la inducida por el virus en s. La presencia de grandes cantidades de partculas virales en los hepatocitos antes de inicio de la hepatitis tambin est en contra de un efecto citoptico directo importante del VHA. En los estudios humanos se encontr que los linfocitos de los pacientes convalecientes producan efectos citotxicos contra lneas celulares infectadas por el VHA y que los clones de clulas T CD8+ mostraban actividad citotxica contra los fibroblastos autlogos infectados por VHA. Estos hallazgos son compatibles con la hiptesis de que los linfocitos T CD8+ median el dao celular heptico. Adems las clulas NK mostraron ser capaces de lisar las clulas en cultivos de tejidos infectados por VHA. Los anticuerpos circulantes probablemente sean ms importantes en la limitacin de la diseminacin del virus a las clulas hepticas no infectadas y otros rganos.
RESPUESTA INMUNE
Desde el momento en que aparecen los sntomas puede detectarse anticuerpos (Ac) clase inmunoglobulina M (IgM) circulantes, persistiendo en sangre por varios meses, rara vez persisten mas de 6 a 12 meses. En la fase de convalecencia la aparicin de IgG (y en menor medida de la IgA) se da poco tiempo despus de iniciada la enfermedad y generalmente persisten de por vida. Estos ltimos tienen actividad neutralizante y protectora frente a una posible reinfeccin. Como se dijo anteriormente, la respuesta inmune del husped es la que contribuye en mayor medida a la patognesis de la enfermedad. La respuesta celular es el principal mecanismo involucrado en la patologa heptica, en donde linfocitos T citotxicos CD8+ y clulas NK actuaran eliminando a aquellos hepatocitos infectados. La respuesta inmune humoral tambin juega un papel en el dao heptico ya que la unin de anticuerpos a clulas infectadas desencadenara el mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). El examen de pacientes con infeccin aguda por VHA en bsqueda de la presencia de citoquinas mostr niveles elevados en suero de interleuquina 1 y 1, interleuquina 6 (IL 6) y factor de necrosis tumoral (F), lo que sugiere que estos mediadores qumicos puedan estar asociados a la enfermedad y tener algn rol en el dao heptico. Se ha demostrado
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tambin la presencia en suero de inmunocomplejos IgM-antgenos e IgG-antgenos, siendo los primeros los ms abundantes.
DIAGNSTICO
El diagnstico puede hacerse por mtodos directos o indirectos. Los directos se basan en la deteccin del virus en heces. La eliminacin de virus ocurre muy tempranamente, en un periodo bastante anterior a la aparicin de los sntomas (cuando estn presentes), por lo que las posibilidades de xito con esta alternativa son pocas. Los mtodos empleados para la deteccin de VHA en heces fueron, entre otros, la inmunomicroscopa electrnica, usando tcnicas ms difundidas como RIA (radio inmuno anlisis) y ELISA de doble sandwich. En los laboratorios de investigacin se han utilizado tcnicas diagnsticas basadas en estudios moleculares, que incluyen la hibridacin y en especial la PCR cuando se requiere una prueba muy sensible para la presencia del VHA. La retrotranscripcin-PCR (RT-PCR) ha demostrado ser una tcnica til para la identificacin de VHA a partir de muestras clnicas, siendo muy especfica. Se ha intentado cultivar el virus en lneas celulares establecidas para el diagnstico, pero ha resultado poco prctico debido al enorme tiempo necesario para detectar la presencia del VHA en tales cultivos celulares, y a sus elevados costos. El otro enfoque para el diagnstico de VHA es la serologa, que representa los mtodos indirectos, actualmente el mtodo apropiado para la confirmacin del diagnstico. Mediante la deteccin, por EIA (enzimo inmuno anlisis), de anticuerpos IgM especficos se puede determinar eficazmente una infeccin reciente. A los 15-20 das de comenzados los sntomas se elevan tambin los ttulos de anticuerpos IgG que permanecen detectables prcticamente de por vida, transformndose as en una cicatriz inmunolgica de la infeccin. En raras ocasiones est indicada la biopsia heptica. Mediante los estudios de inmuFigura 2. Evolucin clnica, virolgica y serolgica de un caso tpico de hepatitis A. Abreviaturas: ALT, alanina aminotransferasa; ANTI-HAV, anticuerpos contra el virus de la hepatitis A; HAV, virus de la hepatitis A. Ictericia Sntomas Anti-HAV ALT
HAV FECAL IgM anti-HAV
Meses despus de la exposicin
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nofluorescencia, tincin con inmunoperoxidasa o por microscopa electrnica de cortes de espesor delgado, se pueden detectar el antgeno de la hepatitis A y las partculas de VHA en el citoplasma de las clulas infectadas (figura 2).
PROFILAXIS
El control del VHA incluye la prevencin de la infeccin en grupos susceptibles, la prevencin o atenuacin de la enfermedad en contactos de casos, y la prevencin y contencin de brotes. Medidas sanitarias El fomento de las normas estrictas de higiene personal, el suministro de agua limpia para beber y para el lavado, buenos sistemas de alcantarillado, etc., resultan de suma importancia. Se deben realizar las recomendaciones para una alimentacin adecuada a aquellas personas viajeras, en especial el cuidado de verduras crudas y mariscos. En el rea hospitalaria se recomienda el lavado de manos y la utilizacin de guantes frente a la manipulacin de material potencialmente contaminado con materia fecal. Los pacientes requieren solo aislamiento entrico. El personal hospitalario no tiene una prevalencia ms elevada de anticuerpos contra el VHA que los sujetos control de caractersticas similares. Inmunizacin pasiva La proteccin individual puede ser lograda en forma pasiva por la administracin de globulina srica obtenida de un pool de IgG de un gran nmero de individuos con alto ttulo de Ac neutralizantes. Todas las preparaciones de inmunoglobulinas (Ig) contienen una concentracin suficiente de anticuerpos anti-VHA para ser protectores. Cuando se administra tras la exposicin o durante la fase inicial del periodo de incubacin, previene la aparicin de hepatitis A clnicamente manifiesta. Su efectividad es mayor dentro de las dos semanas de la exposicin. En algunos casos la Ig no aborta la infeccin pero, al atenuarla, la hace asintomtica. Como resultado se produce una inmunidad pasivo activa de larga duracin, sin embargo, actualmente se considera que esto es la excepcin y no la regla. La Ig se recomienda en general para profilaxis postexposicin y tambin para los que no pueden recibir la vacuna. Otra recomendacin la constituyen los nios menores de dos aos para quienes la vacuna an no ha sido aprobada. No es necesario establecer una profilaxis para los contactos ocasionales, en las personas mayores, ni en los portadores de anticuerpos anti-VHA en suero. En general cuando se detectan los brotes epidmicos el periodo de incubacin suele estar demasiado avanzado para que la Ig sea eficaz, sin embargo la profilaxis puede reducir la frecuencia de casos secundarios. La Ig nunca fue exitosa para alterar la epidemiologa de la hepatitis en una comunidad de riesgo elevado, dada la naturaleza transitoria de la proteccin, las tasas de cobertura y quizs, la falta de inmunidad en gran parte de la poblacin. Se recomienda profilaxis a los viajeros a zonas tropicales. Inmunizacin activa En cuanto a la inmunizacin activa se han diseado vacunas a virus atenuados, que se obtienen por pasajes sucesivos del virus en cultivos celulares con prdida progresiva de la virulencia. Las vacunas a virus atenuados estn basadas en las cepas CR326 y HM175. El otro diseo de vacuna se logr con el cultivo del VHA y la posterior inactivacin con formalina. Se ha demostrado que son inocuas, eficaces y que inducen una respuesta importante de anticuerpos neutralizantes en forma rpida (en dos semanas ya se observa formacin
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de anticuerpos). La vacuna contra la hepatitis A constituye el mtodo de eleccin para la inmunoprofilaxis preexposicin. Otros grupos candidatos a recibir la vacuna son poblacin militar, poblaciones con brotes epidmicos cclicos, cuidadores de primates, trabajadores de laboratorio expuestos al virus, portadores de hepatopata crnica de diferentes etiologas, entre ellos los portadores de hepatitis C, varones homosexuales, adictos a drogas intravenosas, viajeros, pacientes con trastornos de la coagulacin que necesitan administraciones frecuentes de transfusin de concentrados de factores de la coagulacin entre otros. En nuestro pas dicha vacuna todava no integra el plan nacional de vacunaciones, sin embargo se recomienda su administracin a nios por encima de los dos aos, pero dado el costo (o la situacin socioeconmica de nuestra poblacin) gran parte de la misma no accede a la misma. El esquema que se recomienda incluye una dosis nica seguida de una dosis de refuerzo 6 a 12 meses ms tarde. Esto produce niveles muy elevados de anticuerpos, aunque los ttulos todava estn por debajo de lo que se ve luego de la infeccin natural; estos ttulos son menores que los observados tras la administracin de Ig.
Virus de la hepatitis B
Solo hasta los aos 60 fue descrito el virus B como uno de los agentes responsables de la hepatitis srica. El virus presenta un estrecho rango de huspedes posiblemente restringido a los seres humanos y algunos primates. Los seres humanos seran el nico reservorio conocido para nuevas infecciones humanas. Son capaces de inducir persistencia de la infeccin con formas virales en el hgado y sangre durante aos o de por vida. La infeccin persistente puede estar acompaada de escasa enfermedad heptica o ninguna, pero es comn la hepatitis crnica persistente o activa. La expectativa de vida de los pacientes infectados por el VHB se ve acortada por el riesgo significativo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular.
El virus de la hepatitis B (VHB) pertenece a una familia de virus animales denominada Hepadnaviridae y es un hepadnavirus junto a otros virus relacionados como el virus de la hepatitis de la marmota, el de la hepatitis de la ardilla terrera y el de la hepatitis del pato de Pekn. Todos ellos son virus ADN hepatotrpicos. El VHB es el nico que infecta al hombre. Estos virus tienen un moderado rango de hospederos, tropismo por los hepatocitos y la produccin in vivo, en los hepatocitos, de: gran cantidad de envolturas virales no infecciosas (secretadas a la circulacin) y partculas virales infecciosas.
Es un virus de forma esfrica de 42 nm de dimetro (partcula de Dane). Posee una envoltura de 7 nm de espesor que contiene las protenas que forman el antgeno S (o antgeno Australia), HBsAg, y glucoprotenas y lpidos celulares. Dentro de la cubierta encontramos la nucleocpside de 28 nm de dimetro que forma el antgeno del core de la hepatitis B, HBcAg. En el interior de sta se sita el genoma y una enzimas con actividad ADN polimerasa (incluida transcriptasa inversa) y con actividad proteinquinasa El HBsAg est representado por tres polipptidos codificados por VHB designados grande, mediano y pequeo, y por lpidos derivados del husped. La protena pequea est codificada por la regin S del gen S, la protena mediana est codificada por las regiones pre-S2 y S del gen S, y la protena grande est codificada por las regiones pre-S1 + pre-S2 y S del gen S del
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genoma del HBV. Las glucoprotenas del HBsAg contienen un determinante especfico de grupo (a) y determinantes tipo-especficos (d o y, w o r), habindose identificado los subtipos: adw, adr, ayw y ayr, tiles como marcadores epidemiolgicos. Estos subtipos estn distribuidos geogrficamente alrededor del mundo, siendo el subtipo adw el que predomina en las Amricas. Tambin se ha descrito heterogeneidad antignica del determinante w y determinantes adicionales como j, k, q, etc. El determinante a puede generar inmunidad protectora contra virus de cualquier subtipo, y los determinantes de subtipo parecen generar proteccin especfica de subtipo. La nucleocpside consiste en 180 monmeros de protenas arreglados en forma icosadrica. Estn codificados por el gen C (central o de la nucleocpside). Cuando los polipptidos se ensamblan formando el core se manifiesta la especificidad de antgeno, HBcAg. Una forma truncada de esta protena posee especificidad de antgeno e (HBeAg). El marco de lectura del gen C incluye una regin pre-C. Cuando se inicia la traduccin a partir de esta regin se secreta el polipptido truncado con especificidad HBeAg. Este, a diferencia del HBcAg se encuentra en forma soluble y es un indicador de replicacin viral. Tambin se observan otras entidades morfolgicas en varias proporciones. Las formas ms numerosas son las partculas esfricas pleomrficas, no infecciosas, con un dimetro que vara entre 17-25 nm; se ven tambin formas tubulares o filamentosas de varios largos pero con dimetros similares a los de las partculas pequeas. Estas partculas son producto de la sntesis en exceso de la cubierta o envoltura.
GENOMA VIRAL
Est compuesto por una pequea molcula de ADN de doble cadena incompleta de 3,2 kb. La cadena de polaridad negativa es la completa, circular pero no cerrada, con un polipptido covalente en el extremo 5 que probablemente funcione como primer. La cadena corta, incompleta, de polaridad positiva tiene una longitud variable (15-60% de la cadena negativa). El extremo 3 de la cadena negativa tiene una ADN polimerasa capaz de completarla, formando un ADN circular de doble cadena completa en el inicio del ciclo de replicacin. La cadena negativa es la que posee la totalidad de la informacin gentica. Posee cuatro marcos abiertos de lectura (MAL): S, C, P y X, cada uno de los cuales codifica la sntesis de una protena vrica distinta: HBsAg, HBcAg, DNA-polimerasa y la protena X, que interviene en el proceso de replicacin del virus. Estas regiones del ADN se superponen parcialmente entre s, de manera que la cadena es leda una vez y media (figura 3). Esta caracterstica permite incrementar la capacidad codificante del ADN viral ms pequeo conocido que infecta a mamferos. El ADN de VHB se encuentra en los hepatocitos no solo en las formas episomales, sino tambin integrados al ADN celular. Se desconoce si esta integracin ocurre en todas o solo en algunas clulas infectadas y si el ADN viral se encuentra en muchos sectores del ADN celular. La integracin del ADN viral al ADN celular interrumpe el genoma viral por lo que no se produce replicacin viral a partir de las secuencias integradas en clulas hepticas infectadas. Por lo tanto la integracin no forma parte del proceso de replicacin viral como ocurre en los retrovirus. Sin embargo se pueden expresar algunos genes virales, habitualmente el gen del antgeno de superficie.
PROTENAS VIRALES
Los cuatro MAL que codifican protenas virales son traducidos en siete protenas, cuatro de ellas son los antgenos que produciran la respuesta inmune en el individuo infectado:
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1. Ag. de superficie HBsAg: protena estructural, es una asociacin de tres protenas: grande, mediana y pequea, mencionadas anteriormente, inmersas en una bicapa lipdica. La protena pequea es la que se encuentra en mayor cantidad, llevando la seal necesaria para el ensamblaje de las protenas grande y mediana. Se piensa que la protena grande lleva el sitio de unin para los receptores celulares. 2. Ag. del core HBcAg: el M.A.L. del core codifica para dos protenas: la de la cpside viral Ag del core y el: 3. Ag. e HBeAg: los anti-HBe se hallan en aquellos pacientes cuya sntesis viral es reducida o incompleta. La persistencia en sangre de HBeAg en una hepatitis viral aguda esta asociada con un aumento de riesgo de hepatitis crnica o cirrosis. 4. El MAL de la polimerasa codifica una protena, la transcriptasa reversa viral, este polipptido tiene por lo menos cuatro actividades enzimticas requeridas para la sntesis del ADN genmico. 5. Protena X: se la asocia a una funcin reguladora: transactivador de varios promotores, y ha demostrado capacidad transformante en cultivos celulares, por lo que se la ha relacionado con la gnesis del hepatocarcinoma.
REPLICACIN
El ciclo replicativo comienza con la adsorcin y entrada del virus a la clula. Se han descrito dos mecanismos relacionados con receptores celulares: uno asociado a la protena media del HBsAg que tiene la capacidad de ligar albmina humana polimerizada, sta actuara como puente en la utilizacin de los receptores de albmina del hepatocito. El otro mecanismo relaciona a la protena grande de HBsAg con la capacidad de utilizar los receptores para IgA presentes en el hepatocito, ya que su estructura molecular es similar.
Figura 3. Representacin esquemtica de las formas virales de hepatitis B encontradas en la sangre de pacientes infectados.
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Una vez que el virus se ha adsorbido a la clula, debe entrar en ella, para esto son varios los mecanismos propuestos: fusin de la cubierta viral con la membrana plasmtica, lo cual permitira una entrada directa de la nucleocpside, o endocitosis del virin y fusin de membranas entre la cubierta viral y la membrana endosomal. Una vez dentro de la clula la nucleocpside debe desnudarse para permitir que el ADN viral ingrese al ncleo. La transcripcin la realiza la ARN polimerasa II del husped que produce dos clases de ARN virales: los ARN subgenmicos que codifican para las protenas virales de envoltura y los ARN genmicos, que son bifuncionales: sirven como mensajeros para las protenas del core y de la polimerasa viral; y adems son el templado de la transcripcin reversa. Estos ARN luego son transportados al citoplasma donde sern traducidos. El ARN genmico es encapsidado en partculas de nucleocpside viral junto con la polimerasa. Esta encapsidacin es altamente especifica, no encapsida ni ARN celular ni ARN subgenmicos viral, slo el ARN genmico. Esta reaccin, no solo requiere las protenas del core, sino tambin los productos del gen P. Esto se ha comprobado con virus mutantes que al perder el gen P, producen nucleocpsides vacas. Una vez lograda la encapsidacin, el ARN genmico comienza su transcripcin inversa que dar lugar a la cadena negativa de ADN. La sntesis de esta primera cadena utiliza como iniciador (o primer) una protena, codificada por el gen P de la polimerasa viral. La segunda cadena de ADN positiva, utiliza como molde o templado a la cadena negativa y como iniciador un pequeo ARN derivado del extremo 5 del ARN genmico. No es necesaria la sntesis completa de la cadena positiva de ADN para que la partcula se envuelva y se libere. Los viriones extracelulares contienen en forma incompleta la cadena positiva de ADN, e inclusive hbridos ARN-ADN. Luego de la sntesis del ADN viral, estas partculas core brotan del retculo endoplsmico, adquiriendo la cubierta de glicoprotenas. La partcula de Dane madura es secretada de la clula por los mecanismos normales de transporte vesicular. Se ha estudiado un camino alternativo: la partcula del core portando el ADN viral, en lugar de envolverse y exportarse, podra recomenzar el ciclo, aportando ADN viral en el ncleo, aumentando su concentracin. Se piensa que es un fenmeno que ocurre con cierta frecuencia en el hepatocito infectado. Las protenas estructurales de cubiertas, son sintetizadas en el retculo endoplsmico. Su excrecin puede ser de dos formas: como pptidos glicosilados o como polipptidos sin glicosilar. Los polipptidos pareceran autoensamblarse para formar las partculas de 22 nm sin otras protenas virales ni celulares, estas reaccionan con la membrana del retculo y forman la envoltura de las partculas vacas. Una vez formadas son excretadas muy rpidamente.
FORMAS VIRALES EN LA SANGRE
Una de las caractersticas de la infeccin por el VHB es la produccin de grandes cantidades de formas antignicas, en las infecciones agudas y en la mayora de las infecciones crnicas. El HBsAg sigue siendo el indicador ms til de infeccin activa. Solo aparece en la sangre como componentes de los viriones y las formas virales particuladas incompletas. La concentracin de formas virales incompletas en suero suelen exceder en mucho las concentraciones de viriones completos o partculas de Dane. En la sangre no se encuentra HBcAg. Como se mencion anteriormente, el HBeAg proveniente del anterior, es soluble y es el que se encuentra en el suero del paciente.
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RESISTENCIA A AGENTES FSICOS Y QUMICOS
Es muy importante recordar que la infectividad del HBV permanece inalterada durante 6 meses a temperatura ambiente, 4 horas a 60 C y 15 aos a 20 C. El calor destruye el virus rpidamente (a 100 C por 15-29 min., a 121 C por 15 min.), tambin lo hacen agentes qumicos como el hipoclorito de sodio (0,5% por 15-30 min.), formol o glutaraldehido (por ms de 10 horas).
EPIDEMIOLOGA
Es un virus de distribucin mundial, pero pueden diferenciarse zonas endmicas de alta prevalencia: Sudeste asitico, ciertas zonas de frica y en Sudamrica, la regin amaznica. La principal va de transmisin es la parenteral (sangre o sus derivados). Se han establecido con seguridad varias vas especficas de transmisin. El tiempo de incubacin es variable, de 6 semanas hasta 6 meses. Sin duda las ms importantes son la transferencia percutnea y el contacto de las membranas mucosas con sangre y quizs otros lquidos corporales por ej. saliva, adems de contactos homosexuales y heterosexuales. La va sexual es responsable del 30% de los casos. Adems son significativas la va oral y perinatal; en zonas endmicas (madres con HBsAg positivo con HBeAg en el momento del parto) donde se estima que tienen un 90% de probabilidades de transmitir la infeccin al neonato. Un 90% de los neonatos infectados evolucionan a una hepatitis crnica, cirrosis y tienen alta probabilidad de desarrollar un carcinoma hepatocelular. La infeccin neonatal puede darse in tero, en el momento del parto; la presencia de HBsAg en la leche materna supone esta es tambin una va de transmisin pero dicha situacin permanece en estudio. No se han descrito trastornos fetales por la infeccin HBV durante el embarazo, pero es fundamental conocer el estado de infeccin en las embarazadas a trmino, para evitar una infeccin perinatal. La mayora de las infecciones primarias en poblaciones de alta endemia ocurren en edades tempranas (10-50% de las infecciones persistentes son adquiridas en forma perinatal de madres infectadas). Solo el 5-10% de las infecciones que ocurren en adultos se hacen persistentes. La prevalencia de los portadores es mayor en hombres. Uruguay est ubicado dentro de las reas de baja prevalencia, determinado por la deteccin del HBsAg y anti-HBs. Los grupos de mayor riesgo de infeccin para este virus son: los politransfundidos, los homosexuales, los drogadictos endovenosos, los dializados y el personal de salud. Se ha detectado HBsAg en sangre, suero, saliva, semen, lagrimas, secreciones vaginales, sudor, orina, etc., es decir todos aquellos lquidos corporales que en algn momento se encuentran en contacto con la sangre. La incidencia de casos de infeccin por VHB y VHC en 2005 segn Vigilancia Epidemiolgica del MSP es de 877 casos.
TRANSCURSO DE LA ENFERMEDAD Y RESPUESTA INMUNE
Una vez producida la infeccin, ya sea por va parenteral, sexual, oral o perinatal, el virus se instalar en los hepatocitos dando lugar a una infeccin productiva. Como caracterstica se liberan grandes cantidades de partculas virales vacas, no infectantes, al torrente sanguneo. Es decir la infeccin por el VHB determina no slo la produccin en el hgado de viriones completos, sino tambin una gran produccin de partculas incompletas (con capacidad inmunognica pero no infecciosa) constituidas exclusivamente por HBsAg y la liberacin a la sangre de un antgeno soluble ligado al HBcAg, denominado antgeno e (HBeAg).
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Infeccin primaria autolimitada Despus de la infeccin por el VHB aparecen en la sangre, durante el perodo de incubacin, HBsAg, HBeAg, DNA del VHB y actividad DNA-polimerasa. Los ttulos de estos marcadores vricos aumentan progresivamente hasta la aparicin de los sntomas y la elevacin de las transaminasas, para luego decaer. En este caso el HBsAg se detecta en forma transitoria siendo el primer indicador viral que aparece en la sangre. La presencia de este antgeno se considera sinnimo de infeccin aguda. Se pueden detectar luego de la primera o segunda semana luego de la exposicin. Las manifestaciones clnicas aparecen en promedio 4 semanas despus de la aparicin de HBsAg. A medida que disminuyen los sntomas, los ttulos de HBsAg diminuyen hasta ser indetectables en la mayora de los pacientes asintomticos. El HBeAg es otro indicador temprano de la infeccin. Aparece a los pocos das de la aparicin del HBsAg, y el ttulo forma un pico y luego declina en paralelo con el HBsAg. El HBeAg desaparece justo antes de la desaparicin del HBsAg. En la mayora de los pacientes, los anticuerpos anti-HBe aparecen cuando ya no se detecta HBeAg o poco despus. Los anticuerpos anti-HBe persisten 1-2 aos despus de la resolucin de la infeccin por VHB. El tercer indicador viral en orden de aparicin son los viriones que contienen ADN y ADN polimerasa. Estas partculas de detectan por su actividad ADN polimerasa o por hibridacin con ADN viral, y se encuentran en la sangre de la mayora de los pacientes poco despus de la aparicin de HBsAg. Su concentracin alcanza alto niveles durante el perodo de incubacin tarda y desciende con el inicio de la hepatopata. Un cuarto indicador de infeccin que aparece en casi todos los pacientes y en la mayora antes del inicio de la lesin heptica son los anticuerpos anti-HBc. Aparecen 3 a 5 semanas despus de la aparicin de HBsAg en la sangre, y antes del inicio de la hepatitis clnicamente evidente o en forma simultnea. Los anticuerpos anti-HBC se pueden detectar 5 a 6 aos despus de la infeccin aguda en la mayora de los pacientes. Estos pueden ser de clase IgM o IgG. La de tipo IgM sugiere una infeccin primaria en algn momento posterior al perodo temprano precedente; un ttulo elevado de anti-HBc de tipo IgG sin IgM anti-HBc sugiere infeccin persistente. Se ha demostrado la aparicin de anticuerpos anti-HBs durante la antigenemia. La negativizacin del HBsAg, constituye la primera evidencia de cese de la replicacin viral y resolucin de la infeccin. Con la aparicin de anticuerpos anti-HBs, se tiene la certeza de resolucin e inmunidad. Tambin se han detectado complejos inmunes HBsAg-anti-HBs. Sin embargo en la mayora de los pacientes con infeccin por VHB autolimitada solo pueden detectarse anti-HBs despus de que desaparece HBsAg de la sangre. Los anticuerpos anti-HBs no se pueden detectar an con las pruebas ms sensibles en muchos pacientes inmediatamente despus de que desaparece HBsAg. Esto puede ocurrir hasta en la mitad de los pacientes con infecciones autolimitadas. De modo que existe un perodo despus de la resolucin de una hepatitis B durante el cual no se detecta ninguno de los dos marcadores: perodo ventana. Este se caracteriza porque los anticuerpos se encuentran formando inmunocomlpejos (IC) circulantes con el HBsAg que es producido en exceso, como se dijo anteriormente. Este perodo es ms corto en los pacientes con depuracin ms rpida del HBsAg. En el 5-12% de las personas que curan despus de una hepatitis B no se forman anti-HBs. Cuando los anticuerpos anti-HBs son detectados, su titulo aumenta lentamente durante la recuperacin y puede seguir en ascenso hasta 6 a 12 meses despus de la desaparicin del HBsAg. Estos anticuerpos pueden persistir varios aos despus de la infeccin por el VHB y est asociado con proteccin contra la reinfeccin.
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Figura 4. Representacin esquemtica de los marcadores serolgicos virales en la sangre durante una evolucin tpica de infeccin primaria por virus de hepatitis B autolimitada positiva para HBsAg.
Ttulos de HBsAg, antiHBs, antiHBc y partculas de Dane de DNA pol.
Hepatitis clnica
HBsAg AntiHBc
Part. Dane DNA pol.
HBeAg
antiHBe
10
20
30
10
semanas Tiempo despus de la infeccin por HBV
Esta forma de infeccin primaria autolimitada puede transcurrir sin la aparicin del HBsAg. Esto puede deberse a la desaparicin muy precoz del antgeno, sin embargo la no aparicin de HBsAg en ningn momento se ha comprobado que es una posibilidad. Los anticuerpos anti-HBs aparecen por lo general 4-12 semanas despus de la exposicin a VHB. El HBcAg aparece en ttulos menores (figura 4). La enfermedad suele ser en general asintomtica. Infeccin persistente En aproximadamente el 10-12% de los casos se produce una infeccin persistente (figura 5) que dura aos. Esta proporcin aumenta en los pacientes con inmunodeficiencia natural (ancianos) o adquirida (hemodilisis, HIV). Cuando la negativizacin del HBsAg no se produce en un perodo prolongado podemos sospechar una hepatitis crnica. En estos pacientes la infeccin no se resuelve y el virus contina su replicacin. Es muy probable que los pacientes que se mantienen positivos para HBsAg durante dos semanas o ms despus de la infeccin primaria permanezcan positivos indefinidamente, en cuyo caso se los llama portadores crnicos de HBsAg. Se pueden detectar viriones, actividad de ADN polimerasa, HBeAg o ADN viral en la sangre de una fraccin significativa de pacientes con infeccin persistente. Casi todos los pacientes tienen ttulos elevados de anti-HBc en sangre. Los niveles de este anticuerpo son significativamente superiores durante la infeccin persistente comparados con las infecciones autolimitadas y pueden ser detectados en forma indefinida en las infecciones persistentes. Se ha detectado HBeAg en el 25-50% de los pacientes con infeccin persistente y anti-HBe en casi la totalidad del resto.
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Figura 5. Esquema de los indicadores virales en sangre durante una evolucin tpica por hepatitis B con pasaje a la cronicidad.
Hepatitis subclnica
Ttulos de HBsAg, antiHBc y partculas de Dane de DNA pol.
AntiHBc HBsAg
HbsAg
HbsAg o antiHBc
Partcula de Dane DNA pol. 10 20 30 2 6
antiHBs 10
semanas Tiempo despus de la infeccin por HBV
Puede ocurrir que el anti-HBe se encuentra formando inmunocomplejos con el HBeAg por lo que puede ser no detectado anticuerpo libre. Los ensayos estndar para anti-HBs rara vez detectan este anticuerpo en suero de personas con enfermedad persistente debido al gran exceso de antgeno. Algunos pacientes con infeccin persistente que continan produciendo HBsAg no generan cantidades detectables de VHB infeccioso y seran portadores de HBsAg sin ADN polimerasa viral o HBeAg detectables. Se desconoce la fraccin de portadores de HBsAg sin virus infeccioso detectables. Los pacientes con ADN polimerasa viral y HBeAg detectables en suero parecen ser muy contagiosos. Existen unos pocos pacientes portadores de HBsAg sin viriones que contienen ADN y ADN polimerasa o HBeAg detectables en la sangre; estos replican muy escasos virus completos, si acaso replican alguno, y el nico gen viral expresado parece ser el gen que codifica para HBsAg en un estado integrado. Muchos de estos pacientes, pero no todos, parecen tener escasa o ninguna hepatopata, y por lo tanto sintomatologa, y son considerados portadores sanos. La infeccin persistente puede estar acompaada de sintomatologa constituyendo una hepatitis crnica activa. Pero para clasificar una hepatitis crnica como activa es necesaria la imagen histolgica que evidencie inflamacin y necrosis. Luego de meses o aos de iniciada la infeccin persistente puede aparecer una seroconversin dada por aparicin de anticuerpos anti-HBe, que se asocia con mejora clnica, funcional e histolgica (10-15% por ao). Esta situacin suele preceder a la resolucin espontnea de la infeccin, la que se acompaa en un 1% anual de la desaparicin del HBsAg y aparicin de anticuerpos anti-HBs.
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Por ltimo, se han adjudicado a infeccin activa por VHB ciertos casos de hepatitis crnica sin HBsAg detectable debido a los niveles altos y persistentes de anticuerpos anti-HBc.
INMUNIDAD PROTECTORA CONTRA LA INFECCIN
La presencia de anti-HBs parece aportar resistencia casi completa a la reinfeccin. Este anticuerpo presenta sobre todo especificidad anti determinante de grupo (a). Se ha demostrado la proteccin contra la reinfeccin contra el mismo subtipo as como tambin se han hallado segundas infecciones e incluso por subtipos diferentes. En definitiva en anti-HBs protege contra la infeccin. Se ha demostrado que los anticuerpos anti-HBc tambin protegen contra la infeccin en aquellos pacientes que no tienen anticuerpos anti-HBs.
PATOGENIA
La infeccin persistente por VHB puede asociarse con un hgado normal o casi normal desde el punto de vista histolgico y con una funcin heptica normal. Segn la histologa tambin puede presentarse como una hepatitis persistente crnica o como una hepatitis crnica activa. Con altas dosis infectantes de VHB se suelen observar perodos de incubacin ms breves y hepatitis agudas ms graves que con bajas dosis infectantes. La infeccin por VHB a muy corta edad se suele asociar con hepatitis inicial muy leve; lo que sugiere que la edad es un factor determinante en el pronstico. Ha sido difcil definir los mecanismos que intervienen en la lesin de la clula heptica. Entre estos mecanismos se encuentran descritos: 1. La respuesta de los linfocitos T citotxicos con restriccin HLA clase I dirigida contra los HBcAg y HBeAg sobre los hepatocitos infectados. Se necesitan an ms estudios para definir el papel de este mecanismo. 2. Efecto histopatolgico directo de expresin de HBcAg en clulas infectadas. Las clulas cultivadas que presentan HBcAg y solo las que expresan HBsAg sufren cambios histopatolgicos y mueren. Esto indica que la expresin de HBcAg puede ser txica para las clulas. 3. Expresin a gran nivel y la secrecin ineficiente de HBsAg. Este mecanismo est sugerido por la observacin en ratones transgnicos que solo expresan la protena HBsAg grande. Esta se secreta en forma ineficiente y se acumula en los hepatocitos producindose lesin. 4. El ltimo mecanismo sera la coinfeccin con el VHD. Esta coinfeccin produce lesin heptica y supresin de la replicacin del VHB. Esta situacin se describe con el VHD. En el husped humano el estado de necrosis o injuria tisular puede prolongarse en el tiempo debido a una respuesta inmune deficiente o lenta, asociada a la respuesta inflamatoria y regeneracin heptica continua por varios aos. Este proceso patolgico, particularmente cuando llega a la cirrosis, puede ser considerado carcingeno, sin involucrar un accin oncognica directa del virus, ya que no se han encontrado oncogenes virales. El carcinoma hepatocelular es de distribucin universal. Las regiones geogrficas con mayor incidencia de carcinoma hepatocelular tambin son aquellas donde la infeccin por VHB es habitual, donde se encuentran las ms altas frecuencias conocidas de infecciones persistentes por VHB. Muy pocos casos de carcinoma hepatocelular se producen en nios. Entre el 60-90% de los pacientes con carcinoma hepatocelular tambin tienen cirrosis, lo que sugiere que la asociacin de esta lesin con la infeccin persistente por VHB aumenta el riesgo de desarrollo de carcinoma hepatocelular. An no se ha identificado un mecanismo viral de hepatocarcinogenicidad. Este
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carcinoma a menudo tiene ADN viral integrado. Se han identificado mutaciones genticas que podran contribuir con un efecto oncognico en algunos hepatocarcinomas, por ejemplo mutaciones puntuales en el gen supresor de tumores. El 80% de los carcinomas hepatocelulares en el mundo se asocian con infeccin por VHB, habiendo otros factores de riesgo reconocido, entre ellos se encuentran infeccin crnica por VHC, hepatopata alcohlica, hemocromatosis y otras causas de cirrosis. En consecuencia el papel de VHB en el hepatocarcinoma puede no ser a travs de un mecanismo oncognico viral especfico, sino como agente causal de hepatopata necroinflamatoria crnica. Este es un proceso que puede ser carcinognico sin considerar el agente productos de la lesin del hepatocito.
DIAGNSTICO
El diagnostico etiolgico se basa en la deteccin de las protenas virales como HBsAg y HBeAg (el HBcAg no se detecta circulante) y de los anticuerpos especficos contra estos tres antgenos, mediante tcnicas serolgicas. Dentro de estas se encuentran los mtodos inmunoenzimticos (tanto mtodos indirectos como directos), y mtodos genricos como PCR para deteccin del genoma viral. Es posible detectar ADN en suero mediante PCR en concentraciones muy inferiores a los de la hibridacin de ADN; algunos sueros con pruebas de hibridacin dot blot negativas para ADN mostraron resultados positivos con PCR. La PCR es una prueba de muy elevada sensibilidad. El perfil evolutivo de los marcadores serolgicos fue descrito anteriormente. (Cuadro 2).
Cuadro 2. Indicadores serolgicos de virus de hepatitis B (VHB) en distintos estadios de infeccin y convalescencia
Estadio de infeccin Periodo de incubacin tardo de hepatitis B Hepatitis B aguda Hepatitis B aguda negativa para HBsAg Portador sano de HBsAg Hepatitis B crnica Infeccin por HBV en el pasado reciente Infeccin por HBV en el pasado lejano Vacunacin reciente para HBV HBsAg + Anti HBs IgG anti HBC IgM anti HBC HBeAg +oAnti HBe -
+ -
+ +
+ +
+ +
+ + -
++
+++ +++ ++
+o+o+o-
+ -
+ +
+o-
+o-
++
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PROFILAXIS
La profilaxis pasiva se realiza mediante una gammaglobulina hiperinmune "HBIg" contra este virus. La HBIg debe administrarse dentro de las 48 h. de producida la exposicin (preferentemente antes de las 6 h) por va intramuscular o intravenosa, en una dosis nica. Tambin puede realizarse con globulina srica inmune estndar (ISG). La profilaxis activa se realiz en un principio (comienzos de la dcada de 1980) por medio de una vacuna de primera generacin. Fue la primera vacuna a partir de suero humano, consiste en la administracin de antgenos virales con el propsito de estimular la respuesta inmune. La vacuna consiste en partculas de 22 nm del VHB obtenidas de portadores crnicos separadas por mtodos fsicos e inactivadas por mtodos qumicos. La seroconversin se produce en el 95% de los vacunados. Actualmente la vacuna mas difundida para prevenir la hepatitis B es una vacuna de segunda generacin, es una vacuna recombinante donde se usan plsmidos conteniendo el gen S del ADN del HBV en levaduras (Saccharomyces cerevisiae) permitiendo la expresin del HBsAg en estas levaduras. Con esta tcnica de ingeniera gentica las partculas esfricas obtenidas son inmunognicas, pero su utilizacin, sin embargo, tampoco produce la seroconversin del 100% de los vacunados. Es importante determinar los individuos susceptibles y protegerlos: personal sanitario, pacientes con hemodilisis, hemoflicos, comunidades cerradas, homosexuales, drogadictos, etc., y nios cuyas madres sean portadoras en el momento del parto. Los programas de inmunizacin contra la hepatitis B deben tener como meta principal la prevencin de la condicin de portador crnico. Se establece esta meta para todos los grupos de poblacin que tengan tasas de portadores superiores al 2%. Al establecerse que existen grupos con tasas superiores al 8-10%, el problema se transforma en una prioridad para el sistema de salud. Por esto la organizacin mundial de la salud (OMS) y la organizacin panamericana de la salud (OPS) han considerado la inclusin de esta vacuna en los programas ampliados de inmunizacin. El precio de la vacuna esta actuando como factor limitante en el numero de pases en desarrollo que pueden incluirla en sus planes de vacunacin. La inmunizacin universal de los recin nacidos es la nica forma en que la enfermedad pueda controlarse a largo plazo. En nuestro pas forma parte del plan nacional de vacunaciones. Despus de completar la vacunacin se determinaran los ttulos de anti-HBs. Ttulos inferiores a 10 mUI/ml se interpretan como falta de proteccin y necesidad de revacunacin. El 85-95% de los sujetos normales se inmunizan adecuadamente, solo si el ttulo es superior a 1000 mUI/ml se confiere una inmunidad promedio por 3 a 5 aos. Es de mucha importancia que el personal de salud, de laboratorio y todo aquel personal que se halle expuesto al virus mantenga las medidas de seguridad bsicas: esto se basa en educacin sanitaria, vacunacin, planificacin del reciclaje de material, deteccin peridica de HBsAg. Los mtodos de inactivacin segura del material son: 30 min de ebullicin; 15 min a 121 C y una atmsfera en autoclave, o 2 horas a 160 C en calor seco. Si destacamos que solo bastan 0.0004 mililitros de suero positivo para infectar a un individuo sano podemos entender la importancia de las medidas de seguridad.
Virus de la hepatitis C
En la dcada de 1970 se vio que la mayora de los casos de hepatitis asociados a transfusiones no eran causados por HAV ni HBV. La enfermedad asociada con estos hallazgos se llam Hepatitis no A-no B, no conocindose el tipo y nmero de agentes etiolgicos. En
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1989, con la descripcin de un nuevo agente mediante tcnicas de biologa molecular, y el desarrollo de nuevas tcnicas serolgicas, pudo diagnosticarse a la mayora de las hepatitis postransfusionales como causadas por el virus hepatitis C (HCV).
El HCV posee caractersticas biolgicas y genticas que le permite ser agrupado dentro de la familia Flaviviridae, gnero Hepacivirus.
El HCV es un virus esfrico, envuelto, con un dimetro aproximado de entre 30 60 nm. Presenta una nucleocpside de simetra icosadrica y un genoma de ARNsc de polaridad positiva.
GENOMA
Consta de una nica cadena lineal de ARN, de polaridad positiva, no segmentado. Al igual que los Picornaviridae, las secuencias codificantes en el genoma se encuentran dispuestas en forma polarizada en direccin 5-3, estando ms prximos al extremo 5 los genes que codifican para las protenas del core y envoltura (necesarias en gran nmero de copias), mientras que por el contrario, cercano al extremo 3 se encuentran los genes que codifican para protenas no estructurales (NS), como por ejemplo la replicasa viral (una copia por partcula viral). Esta disposicin responde al mecanismo de regulacin de la expresin de las protenas virales, el cual consiste en la mayor probabilidad de despegue del ribosoma desde el transcripto viral; lo cual lleva a la sntesis de altos niveles de protenas estructurales y relativamente pocas copias de aquellas protenas que no formarn parte de la progenie viral (ahorro energtico). El genoma consta, comenzando por su extremo 5 de: una regin 5UTR (no codificante), seguida por un codn AUG que inicia un gran marco de lectura abierto (ORF) el cual codifica una gran poliprotena de aprox. 3000 aminocidos (AA) de secuencia, la cual contiene a todos o gran parte de los productos codificados por los submarcos de lectura estructurales y no estructurales. Hacia el extremo 3 encontramos otra regin no codificante (3-UTR), de menor longitud. Tanto la 5-UTR como la 3-UTR se hallan implicadas en los eventos de regulacin, tropismo celular, estabilidad del transcripto, secuestro de la maquinaria traduccional del husped, etc.
Figura 8. Organizacin del genoma del virus de la hepatitis C. El cuadro rectangular ms grande representa el marco abierto de lectura, dentro del cual las lneas verticales indican los sitios de clivaje proteoltico por las proteinasas celulares y virales. Las lneas en cada extremo del marco abierto de lectura representan los segmentos 5 y 3 (izquierda y derecha, respectivamente) no traducidos del genoma (5 UTR y 3 UTR).
Envoltura Serin proteasa NTPasa RNA helicasa
E1
E2
NS2
NS3
NS4b
NS5a
NS5b
Nucleocpside
NS2a NS4a Proteinasa cis-activa Cofactor de la proteinasa Zn3 Zn3 -dependiente
ARN polimerasa ARN dependiente
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PROTENAS VIRALES
De la poliprotena se derivan por fragmentacin enzimtica: Una protena de la nucleocpside: C Dos protenas de envoltura. E1 y E2/NS1 Las cinco protenas restantes son no estructurales: NS2 o p23, con actividad proteasa; NS3 o p76, con actividades proteasa, ATPasa y helicasa; NS4 (dmero p8- p27), con posible funcin reguladora y unin a ARNsc; NS5A (p56-58), con funcin tambin reguladora; y la ARN replicasa viral o protena NS5B (p68), con probable funcin de ARN replicasa. Figura 6.
CICLO DE REPLICACIN
La estrategia de replicacin del genoma de HCV esta en estudio. Los estudios sobre la replicacin, adsorcin, penetracin, ensamblaje y liberacin de las partculas hijas, aportan muy poco aun. Se han propuesto modelos de cmo el virus lleva a cabo su ciclo replicativo, entre ellos tenemos: el virus probablemente entra a la clula previa unin de la glucoprotena E2 a su receptor especfico (desconocido, posiblemente del tipo: lipoprotenas de baja densidad y el receptor CD81 de membrana del hepatocito). Luego el genoma viral es liberado en el citoplasma, en donde comienza a traducirse directamente en la poliprotena de 3000 AA (a partir de una molcula de ARN de polaridad positiva), por un proceso independiente, regulado por la presencia a nivel de la regin UTR 5 de un sitio de alta afinidad de unin para el ribosoma. A medida que la poliprotena es traducida (o despus), comienza el procesamiento de la misma, es catalizada por las proteasas codificadas por el virus (NS2 y NS3) neosintetizadas y posiblemente proteasas celulares, para dar lugar a todas las protenas estructurales y no estructurales en su forma nativa. El procesamiento comienza con el autoclivaje de las proteasas virales como parte de la poliprotena en proteasas maduras, las cuales prosiguen con el procesamiento del resto de la poliprotena. A partir de este proceso se sintetiza la ARN replicasa viral (actividad ARN polimerasa-ARN dependiente) la cual primero cataliza la sntesis de un intermediario replicativo de ARN de polaridad, con una longitud igual a la del genoma, el cual sirve despus como molde para la replicacin, por mltiples horquillas simultneas, dando lugar a un elevado nmero de copias de ARN genmico (simple cadena, de polaridad positiva) viral. Probablemente la envoltura es adquirida por invaginacin dentro de vesculas citoplasmticas; mientras que el mecanismo de liberacin an permanece desconocido (se sospecha que podra ser por exocitosis). El HCV suele no generar un efecto citoptico evidente.
Se han identificado regiones hipervariables en todos los genes que codifican protenas virales, pero los ms variables son los que codifican para las protenas de la envoltura. Al igual que con otros genomas de ARNsc y debido a la ausencia de actividad proofreading y nick translation de la replicasa de HCV, el genoma viral posee una alta tasa de sustitucin de nucletidos (2x10-3) por ao. Esto trae consigo la acumulacin de variantes genticas incluso en un mismo individuo infectado (cuasiespecies), las cuales muchas veces pueden infectar nuevos individuos constituyendo nuevas poblaciones del virus genticamente distintas o genotipos segn el porcentaje de variabilidad. Hasta el momento se han identificado seis
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genotipos predominantes de HCV, cada uno de los cuales integrado por variantes genmicas menores o subtipos genmicos, denominados A, B y C. El anlisis de secuencia de la regin del genoma que codifica para la polimerasa viral (NS5B) proporciona informacin con respecto a dicha variabilidad, siendo la utilizada en la determinacin de los genotipos y sus variantes: 12% de divergencia de secuencia o menos entre diferentes aislamientos es caracterstico de un mismo subtipo; mientras que una divergencia del 36 - 28% o menos es correspondiente a un mismo genotipo. En Uruguay predominan los genotipos 1, 2 y 3 en sus diferentes subtipos. En lo que a prevalencia se refiere, el genotipo 1 corresponde a un 70% de los casos, dentro del cual los subtipos A y B predominan de la misma forma (50% cada uno); le sigue el genotipo 3, subtipo 3A, con un 26% de los casos, y finalmente el genotipo 2, subtipo 2A, con un 3%.
RESISTENCIA FRENTE A AGENTE QUMICOS Y FSICOS
Este agente infeccioso se ve inactivado por exposicin a solventes lipdicos o detergentes; a 100 C durante 5 min; a 121 C durante 15 min; es inestable a temperatura ambiente o frente a congelamiento y descongelamiento repetido. Puede ser destruido por hipoclorito de sodio al 0,5%, formol, etc.
EPIDEMIOLOGA
El VHC es la principal causa (87% aproximadamente) de hepatitis no A no B; tiene distribucin mundial. Es un virus de transmisin sangunea o parenteral fundamentalmente. Tambin puede darse la transmisin de tipo sexual y vertical (o perinatal). Las personas en riesgo de adquirir el virus son aquellas sometidas a transfusiones sanguneas o sus productos (hemoflicos), drogadictos intravenosos, pacientes nefrolgicos, en hemodilisis; receptores de rganos, personal sanitario, personas VIH positivas, etc. En lo que refiere a la transmisin vertical, los hijos de padres drogadictos intravenosos (especialmente las madres) constituyen el grupo de riesgo ms importante. En el mundo hay un 0 15% de transmisin vertical de HCV, por lo general asociado a niveles socioeconmicos deficitarios y marginacin, el 10% de estos nios desarrollan hepatopata. Al parecer la transmisin ocurre cuando la madre tiene viremia alta (en hepatitis agudas o en las portadoras de VIH). La transmisin por va sexual es posible, pero es mucho menor que para el virus B y, en general, se asocia a infeccin con el VIH. En pacientes comunitarios en los que puede no haber riesgo previo de infeccin por va parenteral quiz pequeas dosis del virus accedan al organismo a travs de las membranas mucosas, replicndose a nivel local hasta alcanzar el nmero necesario como para invadir la circulacin y provocar viremia (de una forma ms tarda), ganando acceso hacia el tejido blanco definitivo.
PATOGENIA
El mecanismo por el cual el VHC causa manifestaciones clnicas an esta en estudio, pudiendo tener lugar un efecto citoptico directo o que sea resultado de una respuesta inmune patolgica. No se distingue clnicamente de otras formas de hepatitis, con mayor tendencia a formas leves anictricas y 75% de las veces asintomticas. Aproximadamente el 80% de las infecciones desembocan en una hepatitis crnica, es decir que solo un 15-20% de los infectados desarrollan nicamente una infeccin aguda y luego se curan. Las formas agudas de la enfermedad por lo
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general son asintomticas lo cual hace difcil la identificacin de aquellas personas infectadas con riesgo de contraer una enfermedad grave por VHC. Los pacientes con hepatitis crnica severa o leve por VHC pueden desarrollar una cirrosis heptica. De estos un 10% desarrollan hepatocarcinoma. Infeccin aguda En casos postransfusionales, el virus se hace detectable en circulacin en 1 a 3 semanas, habiendo ocasionado en el hgado una infeccin considerable quiz mucho tiempo antes. El 6070% de los pacientes con infeccin aguda son, por lo general, asintomticos o presentan manifestaciones no especficas asociadas a un dao heptico moderado (20%), luego de un perodo de incubacin de 4 20 semanas. La hepatitis fulminante es rara. La fase inicial de replicacin extensa en el hgado es seguida, luego de varios meses, por una declinacin de la viremia, pudiendo resolverse la infeccin en un 15-20% de los enfermos, con curacin. No obstante, en la mayora de los casos la infeccin aguda progresa a una infeccin crnica. Se ha visto que la resolucin de la enfermedad va de la mano que va de la mano con una potente respuesta T helper de tipo 1 (respuesta celular) frente a antgenos virales en el individuo, la cual no ocurre de la misma manera en todos los pacientes, pudiendo ser un factor que predispone a la cronicidad. Infeccin crnica La gran mayora de los pacientes infectados por VHC desarrollan una infeccin crnica (el 85% de hepatitis postransfusionales y el 50% de las espordicas), hacindose portadores del virus. Estos mantienen sus niveles de transaminasas normales y suelen estar libres de sntomas durante los primeros perodos, pero con el correr del tiempo la funcin normal del hgado tiende a deteriorarse como resultado del dao hepatocelular acumulado, dando lugar a una enfermedad heptica grave (hepatitis crnica activa 25%) que puede desembocar en cirrosis (25%) e incluso hepatocarcinoma (15%). Por lo general, durante la fase crnica, aumentan los niveles de transaminasas, as como del nmero de viriones en sangre, en forma fluctuante, lo cual es muy caracterstico.
Figura 7. Evolucin natural de la infeccin por el virus de hepatitis C.
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RESPUESTA INMUNE
La infeccin por VHC induce la formacin de anticuerpos contra las diferentes protenas del virus. Estos anticuerpos aparecen despus del inicio de la hepatitis aguda y persisten tanto en los pacientes que evolucionan a la cronicidad (ms del 75%) como en los casos que curan. Su deteccin suele interpretarse como evidencia de infeccin activa cuando se asocia a elevacin de las transaminasas. Cuando stas son normales no permite distinguir entre infeccin activa o pasada. Para ello puede recurrirse a la determinacin del RNA del VHC en el suero, cuya positividad es sinnimo de infeccin activa. Los anticuerpos anti-protena de la cpside son los primeros que generalmente se detectan, dentro de los primeros das o semanas del inicio de la hepatitis clnica. Los anticuerpos anti-glucoprotenas de envoltura son detectados en un bajo porcentaje de los infectados, debido quiz a la diversidad serolgica subyacente a estas; a la ausencia de un test serolgico apropiado o porque quiz simplemente no se desarrollen en el individuo infectado. Hay que tener en cuenta que se han observado respuestas tardas, de hasta 12 meses luego del inicio del cuadro clnico. Recientemente se han reportado ensayos serolgicos que permitiran distinguir aquellos individuos portadores del virus de aquellos que se han curado pero mantienen una respuesta de anticuerpos (figura 7).
MTODOS DE ESTUDIO
Actualmente se dispone de procedimientos inmunoenzimticos que evidencian la presencia de anticuerpos en sangre de pacientes infectados contra tres antgenos virales. pC100 no estructural; C22 o protena del core, y p33C, codificada por la regin NS3. Existe un perodo ventana (no deteccin de anticuerpos) de aproximadamente 80-90 das. En general la deteccin de anticuerpos se realiza en dos etapas: 1) el tamizaje sanguneo por ELISA (de alta sensibilidad) a nivel de las instituciones de salud y bancos de sangre; la cual no permite diferenciar de una infeccin pasada o presente, aguda o crnica, etc, generando tambin muchos falsos positivos; y 2) los estudios complementarios como el Western Blot (ensayos inmunolineales), los cuales dan un resultado positivo, negativo o indeterminado (en el caso de que halla seroconversin o en inmunodeprimidos, etc). La deteccin del genoma del virus en sangre es otro de los estudios que se realizan para el diagnstico de HCV y para diferenciar las formas crnicas de la enfermedad de aquellos pacientes curados pero con respuesta de anticuerpos. El diagnstico de actividad viral se realiza por RT-PCR a partir de muestras de sangre con anticoagulante o plasma. Se basa en la retrotranscripcin de la secuencia correspondiente a la regin 5-UTR (conservada) del genoma de HCV, la cual sirve como molde o templado para la amplificacin con cebadores especficos de esa regin. Adems, la PCR utilizada en forma cuantitativa permite hacer el seguimiento de estos pacientes durante el tratamiento con interfern. La determinacin de los genotipos aislados se realiza tambin por RT-PCR. El patrn en electroforesis en gel de agarosa es tpico para cada genotipo.
PROFILAXIS
La clave para reducir la incidencia de la infeccin por el VHC es disminuir la exposicin a la sangre contaminada.
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Cuadro 3. Personas en las que se debera realizar el monitoreo para detectar infeccin por hepatitis C
Prevalencia elevada Personas que alguna vez se han inyectado drogas ilegales Exmenes posteriores a la exposicin Personas con exposicin mucosa o percutnea importante a sangre positiva para HCV Personas con niveles elevados de aminotransNios nacidos de mujeres infectadas con ferasas el HCV Personas en hemodialisis Parejas sexuales de personas infectadas con el HCV, que deberan ser considPersonas que reciben transfusiones o transeradas para rastreo de HCV si bien el plantes de rganos incluidos concentrados de riesgo de transmisin es bajo a travs del factores de coagulacin producidos antes de 1987 o tanto transfusiones como transplantes de contacto sexual. rganos antes de julio de 1992 Personas en contextos de elevada prevalencia demostrada de HCV y en que es dificil determinar los factores de riesgo, por ej. internados, pacientes que se atienden en clnicas de barrios carenciados por enfermedades de transmisin sexual y pacientes que se atienden en algunos departamentos de urgencias de universidades
Debido a que an no existen vacunas contra el VHC, el control de la infeccin se lleva a cabo mediante el correcto tamizaje de la sangre y sus productos en bancos de sangre. Hoy la infeccin por HCV es tratable mediante el uso de interfern (IFN) y ribavirina, aunque ya existen cepas resistentes a uno y otro frmaco. La resistencia al IFN recombinante se debe a mutaciones en la regin NS5A que codifica para una proteinquinasa viral (factor transregulador). Los genotipos 1 son malos respondedores al tratamiento, a no ser que el mismo sea de larga duracin (1 ao con monitorizacin por RT-PCR). Los dems genotipos suelen responder bien al tratamiento. El tratamiento debe acompaarse de estudios de cuantificacin peridicos del nmero de partculas virales por ml de plasma (carga viral para VHC), ya sea mediante el mtodo de dilucin final o por mtodos moleculares. El desarrollo de una vacuna eficaz va a ser difcil y no a corto plazo, dada su variabilidad antignica y su pobre inmunogenicidad.
Virus de la hepatitis D
Fue identificado por primera vez en 1977 como el agente delta. Es un virus defectivo que requiere del VHB para su replicacin y expresin. Requiere adems que este ltimo se est replicando para poder infectar. Las caractersticas del virin (agente delta) son similares a las de los virus ARN satlites de las plantas, que no pueden multiplicarse sin la ayuda de un virus cooperador.
Este agente infeccioso permanece aun est sin clasificar.
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Es una partcula esfrica de 37 nm de dimetro, presenta envoltura, la cual esta constituida por el HBsAg (porque toma la cubierta del VHB), en su interior contiene antgeno delta (HDAg) y una molcula de RNA de simple cadena.
GENOMA
Es una nica molcula de ARN circular cerrado de polaridad positiva de 1700 nucletidos. Contiene varios marcos abiertos de lectura, siendo uno solo el que codifica para el HDAg.
PROTENAS VIRALES
Presenta una nica protena: el antgeno VHD, no expuesto en la superficie viral. Hay dos especies de esta protena, una de 24 kDa. y otra de 27 kDa. La protena menor es sintetizada primero y luego de una replicacin prolongada se sintetiza la de mayor tamao. La primera es requerida para la replicacin viral, mientras que la segunda acta inhibiendo dicha replicacin, siendo necesaria para el ensamblaje. La otra protena identificada en estas partculas es el HBsAg, que deriva de una coinfeccin con este virus, y es esencial para el ensamblaje y transmisin del VHD.
Si bien existe heterogeneidad en las secuencias de los aislamientos del VHD de distintas regiones geogrficas, no hay diferencias serolgicas entre los aislamientos. Se describieron tres genotipos de VHD en base a diferencias en la secuencias de sus genomas. El genotipo I es el ms frecuente en todo el mundo. El genotipo II se encuentra en Taiwn y el genotipo III predomina en Sudamrica.
EPIDEMIOLOGA
La va de transmisin es similar a la del VHB, fundamentalmente parenteral. Es endmico en las mismas zonas que el VHB. Aparece tambin en forma espordica en los mismos grupos de riesgo para el VHB. Se han descrito incluso epidemias de hepatitis aguda a virus delta en poblaciones con alta tasa de infeccin por el virus de hepatitis B (Sudamrica). En reas de baja prevalencia de infeccin por VHD el principal factor de riesgo es el consumo de drogas por va intravenosa y los hemoflicos politransfundidos, mientras que en reas muy endmicas predomina la transmisin vertical. De todas maneras fuera de estas reas la importancia de la transmisin perinatal es mnima y ocurre solo en madres con HBeAg. La transmisin sexual del VHD parece menos eficiente que la del VHB. La prevalencia global de la infeccin en portadores crnicos de VHB es del 5%. El riesgo de transmisin por transfusin es mayor si el receptor es portador crnico del VHB porque cantidades mnimas del VHD desarrollan la infeccin. La hepatitis D es infrecuente en hemodializados y en homosexuales.
PATOGENIA
Dos posibles mecanismos han sido propuestos: 1. Efecto citoptico directo, resultando en necrosis hepatocelular y degeneracin grasa, observando que aquellas clulas con alto nivel de expresin del antgeno del VHD no sobreviven. 2. Patogenicidad inducida por la respuesta inmune. La infeccin aguda puede producirse simultneamente con el HBV (coinfeccin) esto da
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un cuadro de hepatitis aguda clsica que solo se cronifica en un 10%; o puede producirse en un paciente con hepatitis crnica por HBV (superinfeccin) la cual tiene un pronstico ms grave que la anterior. Lleva a enfermedad heptica progresiva en hasta un 90% de los casos. En estos pacientes tambin es comn desarrollo de una hepatitis fulminante. La coinfeccin por el VHB y el VHD induce una hepatitis aguda autolimitada, habitualmente con resolucin hacia la curacin, aunque puede causar una lesin heptica extensa que se manifieste como una hepatitis fulminante en un 5%. Esta no parece aumentar el riesgo de una infeccin crnica por VHB. La replicacin del VHD en los hepatocitos ocasiona una inhibicin de la replicacin del VHB (puede determinar negativizacin del antgeno S), con lo cual la duracin del perodo agudo de enfermedad suele ser breve. La eliminacin del VHB impide la persistencia de la infeccin delta y determina la curacin de ambas infecciones. Superinfeccin: cuando la infeccin por un inculo que contiene VHB y VHD se produce en un portador crnico de HBsAg, se facilita la replicacin del VHD. En estos casos la infeccin delta tiene, casi indefectiblemente, una evolucin a la cronicidad, induciendo una enfermedad heptica ms severa y de rpido progreso, o una cirrosis heptica a menos que el paciente fallezca por una hepatitis fulminante. Una tercera forma de infeccin aguda se vera luego de trasplantes hepticos en la que la infeccin latente por VHD del aloinjerto se reactiva antes de la reinfeccin franca por VHB del hgado transplantado.
RESPUESTA INMUNE Y DIAGNSTICO
En ambos casos: coinfeccin y superinfeccin se sumarn los cambios serolgicos propios de la hepatitis B con los propios de la infeccin delta, estos ltimos consisten en la aparicin en la sangre durante un breve perodo de tiempo (das) del antgeno delta (HDAg), seguido de la aparicin de una respuesta anti-delta en forma de anticuerpos IgM e IgG. La repuesta IgM aparece en forma temprana y de manera transitoria. Esta persiste adems durante la infeccin crnica por lo que no es posible distinguir entre infeccin aguda y crnica a travs de esta. La IgG anti-delta es indetectable una vez que el antgeno S ha desaparecido. La infeccin induce inmunidad tanto humoral como celular. Esta respuesta inmune no es protectora contra una reinfeccin, aunque puede modular la sintomatologa. Los marcadores especficos de infeccin por VHD son: presencia de antgenos de VHD, de ARN viral en suero y las respectivas respuestas inmune par ellos. Estos marcadores coexisten necesariamente con marcadores de infeccin por VHB. La infeccin por VHD debe sospecharse siempre en los pacientes con infeccin por VHB que se tornaron anti-HBe positivos pero siguen presentando signos de hepatitis crnica, dado que la inflamacin heptica por lo general remite con rapidez despus de la seroconversin para VHB. La posibilidad por VHD tambin debe tenerse presente en los pacientes HBsAg positivos estables que muestran un aumento brusco significativo del nivel srico de ALT o AST sin alteraciones del HBeAg y en los pacientes con enfermedad rpidamente progresiva y cirrosis de instalacin temprana. No obstante, el diagnstico de infeccin por VHD aguda es difcil debido a que las inmunoglobulinas G (IgG anti-VHD) pueden tardar varias semanas en aparecer en la circulacin. Los anticuerpos IgM anti-VHD suelen detectarse antes de la aparicin de IgG. En los casos crnicos se observa el mantenimiento de los niveles elevados de IgG e IgM durante un tiempo indefinido. Esta IgM mantenida constituye un buen indicador del pasaje a la cronicidad. La presencia de ttulos sricos elevados de IgG suelen indicar una replicacin viral activa. Aunque
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Figura 8. A-D, patrones tpicos de indicadores serolgicos durante la infeccin por virus de hepatitis D (VHD). La coinfeccin suele ser autolimitada y se resuelve (no pasa a la cronicidad); es posible detectar HDAg (B) o no (A) en suero. Luego de estas infecciones por VDH sin antigenemia HD detectable, puede no detectarse una respuesta de IgG antiHDAg (A). La sobreinfeccin puede ser autolimitada y resolverse (C) o hacerse crnica (D) con HDAg persistente en el hgado e IgM antiHDAg en suero.
por el momento permanece en estudio, el ARN viral tambin podra ser un parmetro til para establecer la presencia o la ausencia de una infeccin activa por el VHD. Deteccin de los anticuerpos especficos contra el HDAg (anti-HD): este antgeno, si bien sale a la circulacin, lo hace recubierto con el HBsAg. Como esta infeccin esta directamente relacionada con el HBV, es til diferenciar si se trata de una coinfeccin o una superinfeccin, para eso se lo relaciona con los marcadores del HBV. Coinfeccin: presencia de AgHBs y respuesta IgM anti-HBc Superinfeccin: positividad para el AgHBs en ausencia de IgM anti-HBc En la muestra de biopsia heptica es posible detectar antgenos de VHD mediante tcnicas inmunohistoqumicas o de hibridacin in situ. Tambin puede detectarse en el suero de un 20% de los pacientes con infeccin aguda, pero en la mayora de los casos de infeccin crnica desaparece como consecuencia de su fijacin a los anticuerpos anti-VHD (figura 8).
PROFILAXIS
Es la misma que se describi para el virus de hepatitis B (VHB).
Virus de la hepatitis E
Una proporcin significativa de las Hepatitis virales agudas en jvenes y adultos jvenes en
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Asia, frica e India son causadas por una agente viral de transmisin entrica, no relacionado serolgicamente con el VHA. El agente viral de las Hepatitis no A no B entricamente transmitido ha sido recientemente aislado, parcialmente caracterizado y clonado; y se le ha dado el nombre de virus de Hepatitis E (VHE). Da lugar a una hepatitis autolimitada que puede ser desde asintomtica o leve, hasta una hepatitis fulminante.
Se lo relaciona con la familia Caliciviridae, pero se est considerando colocarlo en un nuevo grupo denominado virus parecidos a hepatitis E debido a ciertas caractersticas que lo distinguen de los tpicos Calicivirus (tamao ms pequeo, y una cpside ms sutil que la de los anteriores). Posee una estructura intermedia entre el agente Norwalk (un calicivirus) y el VHA (un picornavirus). Actualmente se encuentra sin clasificar.
Su forma es esfrica, de 27-34 nm de dimetro, con indentaciones en su superficie y est desprovisto de envoltura. Su genoma est constituido por una cadena simple cerrada de ARN de polaridad positiva, que presenta aproximadamente 7200 kilobases de longitud seguido por un tracto poli A. El genoma est constituido por una regin 5 corta con cap no traducido (5UTR), 3 MAL denominados ORF, cada uno en un marco de codificacin diferente y una regin no traducida corta terminado por residuos de adenosina expandidos. Se cree que el ORF1, considerado el ms grande, codifica para la o las protenas no estructurales del virus. Sobre la base de la identificacin de los motivos de aminocidos caractersticos se han identificados los elementos genticos que se mencionan en orden de comienzo 5 hacia el final 3 de ORF1: Una metiltransferasa que se supone que participa en la disposicin del cap en el extremo 5 del genoma viral Un dominio Y, de funcin desconocida. Una cistein-proteasa similar a la papana. Una bisagra rica en prolina que puede brindar flexibilidad y que contiene una regin de secuencia hipervariable. Un dominio X de funcin desconocida. Un dominio que contiene una helicasa. ARN polimerasa. El ORF 2 de cerca de 2000 nucletidos de longitud da origen aproximadamente a 40 nucletidos en el extremo 3 de la terminacin del ORF1 y consiste en: Una secuencia sealizadora 5. Una regin de 300 nucletidos rica en codones de arginina la que probablemente represente un sitio ligado al ARN. Tres sitios potenciales de glicosilacin. La protena codificada parece ser la protena de la cpside del VHE. El ORF3 de menos de 400 nucletidos de longitud se superpone al ORF1 y al ORF2 y su funcin es desconocida.
REPLICACIN VIRAL
En cuanto a la replicacin viral se ignoran los mecanismos de unin del virus a las clulas
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Figura 9. Organizacin del genoma del virus de la hepatitis E. El mismo consta de aproximadamente 7.2kb, posee tres marcos de lectura abiertos (open reading frames, ORF). Probablemente las protenas no estructurales estn codificadas dentro del ORF1. Las protenas de la cpside estaran codificadas en el ORF2. El tercer ORF (ORF3), de pequeo tamao y superpuesto al ORF anterior, codifica para una protena inmunognica de funcin desconocida. Abreviaturas: MT, metiltransferasa; P , proteasa similar a la papana; Pro, bisagra rica en prolina; X e Y, protenas de funcin desconocida; Hel, helicasa; RDPR, ARN polimerasa ARN dependiente.
susceptibles, de su entrada a la clula y de la prdida de su envoltura. Es probable que luego de la prdida de la envoltura el genoma sea directamente traducido mediante mecanismos celulares que reconocen al ARN con cap. Tambin es probable que el ORF1 traducido sea clivado por las proteasas celulares. Se cree que el ARN intermedio replicante de cadena negativa es sintetizado por la ARN polimerasa viral cuya codificacin se atribuye a la regin 3 del ORF1. Es posible que posteriormente la polimerasa viral tambin sintetice toda la longitud de las cadenas del ARN de cadena positiva as como por lo menos dos ARNm subgenmicos. Se sabe muy poco acerca del ensamblaje y el transporte del virus fuera de la clula. Se ha propuesto que el producto del gen del ORF2 es una protena de la cpside. Se ignora si la liberacin del virus de las clulas infectadas es un proceso activo o el resultado de la muerte celular mediada por el virus, pero este es hallado en la bilis durante la fase aguda de la infeccin, por lo que la bilis podra ser la fuente principal del VHE encontrado en las heces (figura 9).
Todos los aislamientos del VHE parecen compartir un eptope grupo especfico, observados usando inmunoelectromicroscopa con sueros de distintas reas geogrficas, por lo que todas las cepas recuperadas hasta el momento pertenecen al mismo serotipo. Las secuencias de los genomas de varias cepas de VHE procedentes diferentes regiones han sido establecidos en forma parcial o total. Sobre la base del anlisis de esas frecuencias las cepas del VHC pueden ser clasificadas en 3 grandes genotipos: 1) cepas asitico-africanas, 2) una cepa mexicana y 3) cepas estadounidenses y porcinas. Cada uno de estos tres grupos genticos mayores tiene deleciones o inserciones en los nucletidos, juntas o por separado, que son exclusivas de cada grupo. Las secuencias del ORF1 de los tres genotipos mayores difieren entre s en la identidad de la secuencia de nucletidos en cerca de un 20%, mientras que la identidad de la secuencia dentro de cada grupo difiere en no ms de 5-10%. Por lo tanto la heterogeneidad gentica parece tener una distribucin regional. Hace poco se descubri un cuarto genotipo del VHE en Asia y en Europa se han identificado otras variantes nuevas.
EPIDEMIOLOGA
Es difcil trazar un mapa epidemiolgico de este virus en el mundo. Se han podido detectado brotes epidmicos en diversas partes del mundo. Las regiones endmicas se localizan en gran
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parte de frica, centro y sur de Asia y Mxico. Los casos observados en regiones no epidmicas corresponden a personas que han regresado de viaje de zonas endmicas. La forma ms espectacular de la enfermedad, la hepatitis E epidmica, en realidad es una forma de presentacin muy infrecuente y en su gran mayora los casos se producen como una enfermedad endmica o espordica. La hepatitis endmica se limita a un conjunto de pases en vas de desarrollo. Casi todas las epidemias de hepatitis E han sido producidas por el agua contaminada, pero se ha informado que algunas epidemias ocurridas se debieron a la contaminacin de los alimentos como mariscos crudos o poco cocinados. La principal va de transmisin es la entrica, es decir por agua o alimentos contaminados. A pesar de que los nios tambin se ven afectados, la hepatitis E, es una enfermedad de adultos jvenes, especialmente hombres. El aumento en la prevalencia durante la adultez temprana sugiere una transmisin sexual, y existen trabajos que estaran indicando tambin la transmisin vertical. Se acepta que el VHE tiene caractersticas epidemiolgicas bastante diferentes de las de la mayor parte de los virus que se transmiten por va fecal-oral como el VHA. Es bastante evidente que la hepatitis E se observa en regiones del mundo donde la contaminacin fecal de las aguas para beber es muy comn. Los brotes tienen cierta estacionalidad, que coincide en ciertas zonas con la poca de grandes lluvias. La enfermedad afecta ms frecuentemente a individuos entre los 15 y 45 aos. La transmisin de persona a persona es menos eficiente que en la hepatitis A. La severidad promedio de las infecciones por VHE es algo mayor que la de las infecciones por el virus de la hepatitis A, por ende, la mortalidad asociada al VHE llega al 1%, mientras que la mortalidad por VHA es de 0.2%. El VHE no ha podido ser propagado en cultivos celulares. El hombre es el hospedero natural de este virus, aunque se han identificado anticuerpos anti-VHE en otros animales como monos salvajes, pollos, roedores y cerdos.
PATOGENIA
Produce una enfermedad aguda autolimitada, indistinguible de otras formas de hepatitis aguda, que puede presentarse desde una forma subclnica hasta formas fulminantes, sobre todo en mujeres embarazadas, donde alcanza un porcentaje del 15-20%, hacindose aun ms alto durante el tercer trimestre. Las causas de esta asociacin aun no estn del todo claras, y se ha detectado en aquellas mujeres con hepatitis fulminante una alta incidencia de coagulacin intravascular diseminada (CID). Al igual que la hepatitis a virus A, la hepatitis E no evoluciona a la cronicidad ni deja secuelas El VHE lograra el ingreso al organismo a travs de la va oral, desconocindose como alcanza el hgado. Presenta un perodo de incubacin desde la exposicin hasta el comienzo de la enfermedad clnica de alrededor de 28-40 das. La replicacin viral se da en el citoplasma de los hepatocitos, y constituye el primer evento detectable, que tiene lugar previo a los cambios hepatocelulares y mucho antes de los cambios inflamatorios y el aumento de las transaminasas. La progenie viral es liberada y, por un mecanismo desconocido, alcanzan la vescula biliar y son posteriormente excretados en las heces. La viremia y la excrecin de las partculas virales en las heces se dan al mismo tiempo, predominantemente durante el periodo de incubacin y la fase aguda temprana, y usualmente a muy bajas concentraciones. La produccin de anticuerpos anti-VHE y la hepatitis se dan concomitantemente, por lo que se considera que la hepatitis E es una enfermedad inmunopatolgica, en la cual el dao a los hepatocitos sera mnimo, y la respuesta inmune del husped conducira a la hepatitis.
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Figura 10. Diagrama de los sucesos clnicos y serolgicos en un caso tpico de hepatitis E aguda. Los patrones de anticuerpos estn dados por los resultados del ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA); la viremia y la eliminacin fecal estn basadas en datos aportados por la reaccin en cadena de la polimerasa. Abreviaturas: ALT, alanina aminotransferasa (transaminasa glutmico pirvica.
RESPUESTA INMUNE Y DIAGNSTICO
Tanto los humanos como los primates infectados experimentalmente han demostrado una respuesta en fase aguda caracterizada por la presencia de anticuerpos clase IgM y posteriormente de IgG, aunque algunas infecciones agudas o recientes pueden presentar niveles virtualmente indetectables de IgM (aunque casi siempre aparece IgG). La fase convaleciente est asociada con un grado variable de respuesta de IgG, aunque en aquellas personas que viven en reas endmicas esto puede estar indicando una infeccin pasada o que se encuentra en un periodo de incubacin. Esto se debe en parte a que el ttulo de IgG disminuye con mayor rapidez que para el VHA, lo que genera interrogantes acerca de la duracin de la enfermedad. Sin embargo estos anticuerpos han sido detectados hasta 13-14 aos despus de la infeccin. Se han encontrado tambin IgA aunque se desconoce su importancia. Las determinaciones de estos anticuerpos son realizadas actualmente por medio de tcnica de Western Blot, especfica pero no disponible para tamizaje; y por test inmunoenzimticos que se adaptan al estudio de numerosas muestras. En una gran proporcin de casos los ttulos de anticuerpos anti-VHE declinan rpidamente a bajos niveles, e incluso indetectables durante el fin de la fase convaleciente. El ARN viral puede ser detectado mediante RT-PCR en las heces y la sangre durante la fase aguda de la enfermedad, con frecuencia ese es el momento en que el virus puede ser detectado en la bilis. Los cebadores de la RT-PCR deben ser seleccionados con sumo cuidado porque el VHE es genticamente heterogneo (figura 10).
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PROFILAXIS
Al igual que en la hepatitis A, la mejora en cuanto a medidas sanitarias cobra un papel muy importante dado el mecanismo de transmisin. Los intentos de prevenir la hepatitis E por medio de la administracin de Ig no especfica en general han sido infructuosos o inciertos. No existen vacunas en el mercado para la prevencin de la hepatitis E.
Virus de la hepatitis G (VHG) o GBV-C

INTRODUCCIN TAXONOMA Y CLASIFICACIN
El VHG fue descubierto por dos grupos de investigadores independientes, aun no se ha llegado a un acuerdo en lo que concierne a la importancia de estas partculas en la etiologa de la hepatitis. El VHG ha sido clasificado dentro de la familia Flaviviridae por las similitudes en su organizacin con miembros pertenecientes a dicha familia. El GBV-C fue propuesto como agente de la hepatitis humana no A-E. Los anlisis posteriores demostraron que el VHG tiene ms del 95% de la secuencia global de aminocidos homloga con la del GBV-C, entonces estos dos agentes son casi idnticos y representan cepas variantes de un agente comn. Por el contrario el VHG y el GBV-C tenan menos del 25 % de homologa con cualquier otro miembro conocido de la familia Flaviviridae, incluido el VHC. No se ha demostrado que el VHG produzca hepatitis Es un virus envuelto, con una nucleocpside icosadrica, con un genoma ARN de cadena simple de polaridad positiva, de aproximadamente 9.4 kb que codifica para una poliprotena de 2873 aminocidos. La estabilidad del HGV no ha sido completamente dilucidada pero se cree que es muy similar al HCV. Es sensible a los detergentes orgnicos.
EPIDEMIOLOGA Y HOSPEDEROS
La transmisin es aparentemente parenteral. Se transmite con facilidad mediante las transfusiones de sangre y frecuentemente produce viremia persistente en el receptor infectado. Existe en una elevada prevalencia entre las prostitutas por lo que tambin podra transmitirse por va sexual. Tambin existen indicios de que se puede transmitir de madre a hijo. En aquellas madres con alta carga viral, y dependiendo del modo del parto pueden tener hijos con una infeccin persistente. Se lo ha encontrado en personas coinfectadas con HBV, HCV y VIH. El hgado no sera el sitio primario de replicacin y no existe una enfermedad significativa asociada al HGV. No se ha demostrado la asociacin del virus con la produccin de hepatitis fulminante y carcinoma hepatocelular. La mayora de las personas infectadas no desarrollan sntomas, aunque se han reportado casos de hepatitis post transfusin y casos de hepatitis fulminantes a HGV. Como se mencion anteriormente se ha encontrado el HGV en personas coinfectadas con otros virus hepatotropos. No obstante, en los pacientes infectados por el VHC, la coinfeccin por VHG afecta la expresin clnica de la enfermedad, la histopatologa heptica, la respuesta al tratamiento con interfern y el riesgo de hepatocarcinoma. Estos hallazgos determinaron que en la actualidad, por lo general, sea considerado un virus no causal de hepatitis que comparte vas de transmisin parenteral comunes a otros virus causantes de hepatitis. De todos modos el papel patgeno desempeado por el VHG an no ha sido elucidado con certeza.
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Respuesta inmune y diagnstico El diagnstico se hace mediante EIA contra HGV E2 (antgeno de envoltura) o mediante RT-PCR para detectar el ARN viral usando primers para las regiones 5-UTR que est ms conservada que NS3, NS5 anteriormente utilizadas. Tambin se han utilizado ensayos paralelos con dos juegos diferentes de primers para descartar falsos negativos. Si bien la presencia del ARN viral es un ndice exacto de la viremia y la transmisibilidad, los ensayos para su deteccin no son prcticos para el tamizaje o screening de los donantes de sangre o para otros programas de screening masivo. No se han encontrado anticuerpos que pudieran distinguir con confianza los portadores de VHG/GBV-C de la poblacin global. Los anticuerpos hacia la protena de la envoltura E2 pueden ser detectados con facilidad y parecen ser un marcador excelente de la recuperacin de la infeccin por VHG/GBV-C y una potente herramienta epidemiolgica. Por esto durante la infeccin aguda o crnica con el VHG/GBV-C el nico marcador de la infeccin es la deteccin del ARN viral mediante la tcnica de PCR o mediante otra tcnica de amplificacin molecular. Sin embargo despus de la depuracin del ARN de VHG/GBV-C pueden ser medidos los anticuerpos hacia E2. Los anticuerpos anti ARN de VHG/GBV-C y los anticuerpos anti E2 son mutuamente excluyentes. Los primeros indican viremia en curso y los otros indican recuperacin de una infeccin previa. En combinacin, estos dos marcadores reflejan la exposicin del VHG/GBV-C y proporcionan un perfil ms completo de la existencia de esa infeccin que el que podra dar cada marcador aislado. No se ha logrado el desarrollo exitoso del virus en lneas celulares.
Virus TTV
El TTV es otro candidato como virus potencialmente causante de hepatitis. El TTV, un virus ADN de cadena nica desnudo, fue aislado del suero de un paciente con hepatitis postransfusional. La comunicacin inicial de este caso proveniente de Japn documento la deteccin de ADN de TTV en el suero de 3 de 5 pacientes con hepatitis G no-A postransfusional, lo que implica que este agente podra representar un nuevo virus causante de hepatitis transmisible mediante la transfusin. Se ha comunicado la excrecin fecal de TTV. Si bien el TTV es un virus ADN, presenta un amplio espectro de divergencia de secuencias (hasta un 30%) lo que determin su clasificacin en 2 genotipos distintos. En Inglaterra el ADN de TTV se detect en un 10% de la poblacin general y en muestras de pacientes con hepatitis fulminante. Se ha postulado que este se replica en el hgado, no obstante, esta hiptesis no ha sido comprobada. En realidad an no se sabe con certeza si el TTV desempea un papel en la etiologa de la hepatitis.
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Enterovirus
D. Sandn, G. Rodrguez
Los enterovirus son un grupo de agentes virales que habitan en el intestino y que son los responsables de importantes y frecuentes enfermedades humanas con manifestaciones clnicas muy variadas. Los enterovirus son virus ARN pertenecientes a la familia Picornaviridae (pico pequeo;rnapor cido ribonucleico)
Caractersticas de los picornavirus

Son virus desnudos de simetra icosahdrica de aproximadamente 30nm de dimetro. La cpside viral est compuesta por 60 subunidades proteicas que envuelven al genoma viral, constitudo por una cadena nica lineal de ARN de sentido positivo que tiene un nico marco abierto de lectura (MAL) que codifica para una gran poliprotena. Esta poliprotena sufre subsecuentes clivajes especficos que generan los polipptidos estructurales, la replicasa de ARN, proteasas y polipptidos necesarios para la replicacin. Son resistentes al ter, cloroformo y alcohol, Pero son rpidamente inactivados por las radiaciones ionizantes, formaldehdo y fenol. Estos datos son de gran importancia mdica en el momento de elegir un antisptico, desinfectante o medio de esterilizacin frente a la presencia de estos agentes.
Clasificacin de picornavirus
La familia Picornaviridae est integrada por 4 grupos: 1. Aphthovirus. 2. Cardiovirus. 3. Enterovirus. 4. Rinovirus. Los 2 primeros son virus patgenos de animales solamente a diferencia de enterovirus y rinovirus donde hay serotipos patgenos humanos y serotipos patgenos animales. Los rinovirus se subclasifican del 1 al 100. Los enterovirus humanos se subclasifican en : a) Poliovirus. b) Coxsackievirus A1-A24 (A23 actualmente es clasificado como Echovirus 9). c) Coxsackievirus B1-B6
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d) Echovirus 1-34 (Echovirus 10 fue reclasificado como reovirus y Echovirus 28 fue reclasficado como rinovirus). e) Enterovirus 68-71. Numerosas propiedades clnicas, epidemiolgicas y fsicas distinguen a los enterovirus que habitan el tracto gastrointestinal de los rinovirus que habitan el tracto respiratorio superior.
Epidemiologa
La epidemiologa de todos los enterovirus (EV) humanos es muy similar. Tienen una distribucin mundial. En los climas templados predominan en otoo y verano y en los climas tropicales todo el ao. La seroepidemiologa de las infecciones por EV demuestra una transmisin de la infeccin aumentada en edades tempranas de poblaciones con bajo nivel socioeconmico. El hacinamiento y la pobre higiene aumenta la transmisin fecal oral de estos agentes. La transmisin a travs del agua puede presentarse como una extensin de la va fecal oral en la cual el vector es el agua en lugar de las manos o los fomites. La epidemiologa clnica de estas infecciones sugiere que la transmisin respiratoria de estos virus no es tan importante como la transmisin fecal oral.
Patogenia
La patogenia de las infecciones por EV ha sido estudiada a nivel molecular, celular y de rganos blanco. Los EV se distinguen por su estabilidad a pH cido, caracterstica responsable de su habilidad para pasar la barrera gstrica y alcanzar su sitio de infeccin primaria, especficamente las placas de Peyer en el intestino, donde ocurre una significativa replicacin viral. Seguidamente ocurre una viremia menor que siembra numerosos rganos incluyendo sistema nervioso central (SNC), hgado, pulmones y corazn. Una replicacin mayor en estos sitios resulta en una viremia secundaria asociada con los sntomas y signos de la infeccin viral. La patogenia y patologa de las infecciones por EV depende de la virulencia, tropismo e inculo de virus as como de factores especficos del husped.
Cuadros clnicos
ENTEROVIRUS NO POLIO
Los enterovirus no polio son responsables de un gran nmero de enfermedades muy frecuentes en nios y en recin nacidos con una gran variabilidad de cuadros clnicos. La forma ms frecuente de presentacin es la enfermedad febril inespecfica, que en los nios hace pensar generalmente en una sepsis bacteriana. Otras de las manifestaciones clnicas ms frecuentes son: 1. Tracto respiratorio: resfro comn, faringitis, herpangina, estomatitis, neumona y pleurodinia. 2. Tracto gastrointestinal: vmitos y diarrea, dolor abdominal y hepatitis. 3. Ojo: conjuntivitis aguda hemorrgica. 4. Corazn: miocardio-pericarditis 5. Piel: exantema 6. Neurolgicas: meningitis asptica, encefalitis y parlisis.
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Si bien cada uno de estos cuadros puede ser causado por diferentes enterovirus no polio se han visto fuertes asociaciones entre determinados serotipos y ciertos cuadros clnicos incluyendo los siguientes: virus Coxsackie A24 y enterovirus 71 en el sndrome mano-pie-boca; virus Coxsackie A24 y enterovirus 70 en la conjuntivitis hemorrgica aguda; enterovirus 71 en la encefalitis y parlisis flccida semejantes a poliomielitis; Echovirus 9 en exantema petequial y meningitis; Echovirus 30 en meningitis; virus Coxsackie B1-B5 en miocardio-pericarditis y asociados a encefalomiocarditis neonatal fulminante.
POLIOVIRUS
La enfermedad paraltica ocurre en el 0.1 a 2% de los infectados. El 90-95% de las infecciones son subclnicas o inaparentes y el 4-5% cursa con manifestaciones inespecficas (enfermedad menor) El comienzo es brusco, pudiendo estar precedido (dentro de los 5-7 das) por un sndrome infeccioso inespecfico de 24 a 72 horas de duracin. Si ello ocurre, se presenta el curso bifsico o en doble onda caracterstico. Las parlisis se instalan rpidamente y se caracterizan por ser: flccidas, asimtricas (compromiso selectivo de algunos grupos musculares: deltoides, cudriceps, tibial anterior), con hipotona o atona, hiporreflexia o arreflexia osteotendinosa, fuerza muscular disminuida, sensibilidad conservada, atrofia rpida y ausencia de reflejos de automatismo. Las parlisis progresan en alrededor de una semana. La atrofia es ostensible al finalizar la primera semana. La recuperacin muscular alcanza su mximo alrededor de los 18 meses a tres aos. La parlisis residual es permanente.
Mtodos de estudio
Dada la diversidad de cuadros clnicos producidos por estos virus es aconsejable la toma de muestras mltiples. Los materiales ms frecuentemente utilizados son: hisopado farngeo; materia fecal; LCR; sangre; lquido pericrdico, pleural o vesicular; biopsias. La muestra de heces se recoger tempranamente dentro de las primeras 48 horas y no mas all de los 10 das de comenzado el cuadro clnico. Los mtodos recomendados son los directos, es decir aquellos que permiten detectar el virus, sus antgenos o su cido nucleico. El aislamiento en cultivos celulares de EV sigue siendo la tcnica de referencia en el diagnstico de laboratorio. El mtodo ms sensible de diagnstico de algunas infecciones por Coxsackievirus A sigue siendo el aislamiento en ratn recin nacido aunque raramente se realiza dado la dificultad de la tcnica y el mantenimiento del bioterio. Actualmente, el mtodo ms prometedor en la deteccin directa de enterovirus es la aplicacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Han sido descritos diferentes sets de primers que detectan la mayora de serotipos de EV, todos ellos dirigidos a regiones altamente conservadas del genoma viral Las muestras de suero para el estudio de anticuerpos se deben tomar al comienzo de la
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enfermedad y cuatro semanas despus. Debido a que ningn antgeno comn para enterovirus no polio est disponible para el uso en el laboratorio clnico, generalmente no se realiza la serologa.
Tratamiento
Actualmente, no existe una terapia especfica para las infecciones por enterovirus. Se estn realizando los ltimos ensayos clnicos en humanos de una droga especfica anti EV llamada pleconaril que acta bloqueando la liberacin de ARN viral de la clula. La aplicacin de gamaglobulina intravenosa contra el virus infectante puede ser beneficiosa en pacientes inmunocomprometidos y en infecciones neonatales graves.
Medidas de prevencin y control

Debido a la carencia de tratamiento especfico de infecciones por EV los esfuerzos se dirigen a la prevencin. Se debe prestar particular atencin al lavado de manos e higiene de nios y personas infectadas as como sus convivientes y en caso de pacientes hospitalizados , observar el mismo cuidado con el personal hospitalario. Los mltiples tipos antignicos y la evolucin habitualmente autolimitada de la mayora de infecciones por virus Echo y Coxsackie han dado lugar a una falta de estmulo en el desarrollo de vacunas. De todas formas la historia de las vacunas para poliovirus ha sido una de las ms apasionantes y es parte de la historia de la microbiologa. En la actualidad, se utilizan en el mundo 2 tipos de vacunas: 1. Vacuna antipoliomieltica oral con virus vivos atenuados, desarrollada por Sabin, que combina los 3 tipos de poliovirus 1, 2 y 3. 2. Vacuna antipoliomieltica inactiva desarrollada por Salk. Es una suspensin acuosa de las cepas 1, 2 y 3 de poliovirus inactivados en formalina.
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Agentes virales de gastroenteritis

Rotavirus
A. Sirok, V. Le Pera, D. Sandn
Rotavirus
INTRODUCCIN
Rotavirus es una de las causas ms frecuentes de enfermedad diarreica en humanos, otros mamferos y aves, en todo el mundo. Fueron descubiertos observando al microscopio electrnico biopsias de duodeno en nios con diarrea aguda. Subsecuentemente fueron detectados en heces por microscopia electrnica. En pases en vas de desarrollo contribuye a una considerable morbilidad y mortalidad entre los nios pequeos. Son tambin causantes de brotes y epidemias de diarrea intrahospitalaria.
Pertenecen a la familia Reoviridae, junto con los reovirus. El trmino rotavirus deriva de la palabra del latn rota que significa rueda, por su aspecto de doble rueda al microscopio electrnico. El genoma viral consiste en 11 segmentos de ARN doble cadena, codificando cada uno de ellos para una nica protena, ya sea estructural o no estructural (salvo el segmento 11 que codifica para 2 protenas no estructurales). Las protenas estructurales (VPs) forman parte de la partcula viral mientras que las protenas no estructurales (NSPs) colaboran en la replicacin viral, morfognesis, restriccin del hospedero, secuestro de la maquinaria biosinttica celular y en la patogenia. Rotavirus porta su propia ARN polimerasa ARN dirigida, la cual es codificada en el segmento 1 (protena VP1). El virin intacto mide aproximadamente 100 nm de dimetro y se caracteriza por presentar una triple cpside proteica. La cpside externa se halla conformada por las protenas que conforman las espculas VP4 y por la protena mayoritaria de la cubierta VP7. Dichas protenas de la cpside externa son inductoras de la produccin de anticuerpos neutralizantes fundamentales en la proteccin inmune ante infecciones por rotavirus. La cpside intermedia se encuentra constituida en su totalidad por VP6, donde se encuentran los eptopes especficos de grupo y subgrupo antignico. Finalmente la cpside interna, denominada tambin con el nomobre de core, se halla constituida por la protena VP2 y en sus vrtices los complejos VP1-VP3 de transcripcin/replicacin. Dicha cpside es la que
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contiene en su interior el genoma viral. De acuerdo a esto los viriones podran presentarse en tres configuraciones distintas: las partculas de triple envoltura (TLPs), con o sin espculas; de doble envoltura (DLPs); y de envoltura nica (SLPs). Las TLPs son las partculas completas infectivas; poseen la cpside externa constituida por VP4 y VP7. Las DLPs carecen de VP7 y VP4, siendo las partculas con capacidad de replicarse y transcribirse, aunque no son infectivas. Poseen 780 molculas de VP6 dispuestas en 260 trmeros formando una especie de malla icosadrica perforada por 3 tipos de canales, los cuales se ubican siguiendo la simetra de la partcula, a nivel de los vrtices. Por ellos se transportan nucletidos, ATP , etc. hacia adentro de la partcula y, a su vez, se exportan los mARN virales hacia el citoplasma. La cpside de VP7 obstruye los canales por lo que los mensajeros no podran emerger de la partcula. Por otro lado, para que se d una replicacin y transcripcin activas VP6 debe adoptar una conformacin particular, dada a nivel de las DLPs. La conformacin activa de la polimerasa depende de contactos apropiados con VP2, los cuales dependen de su interaccin con VP6 en las DLPs. Las SLPs se corresponden con partculas que solo presentan la cpside de VP2. La misma esta constituida por 60 dmeros de dicha protena, presentando tambin perforaciones o canales que se contactan con los de la cpside intermedia. En su interior contiene al genoma viral compactado, junto a los complejos VP1VP3 (de replicacin/transcripcin) presentes en los vrtices internos del icosaedro. No es capaz de replicarse debido a que la polimerasa (VP1) para activarse, necesita interactuar con la VP2 en una conformacin apropiada dada por la VP6. Tampoco son infectivas, debido a que carecen de VP4 y VP7.
CLASIFICACIN
La protena VP6 presenta los eptopes especficos de grupo en base a los cuales se han definido siete variantes: A, B, C, D, E, F y G. Las variantes A, B, y C se asocian a infecciones en humanos y D, E, F y G se asocian con infecciones en animales. Para rotavirus del grupo A, los serotipos quedan determinados por la presencia de eptopes especficos presentes a nivel de protenas de la cpside externa VP4 y VP7 definindose 14 serotipos G glicoprotena (en base a eptopes reconocidos en VP7) y 13 serotipos P proteasa sensible (segn eptopes en VP4). Existe tambin una clasificacin basada en los perfiles de bandas correspondientes a los segmentos de genoma viral obtenidos tras un ensayo de electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante teido con nitrato de plata, definindose de esta manera lo que se ha denominado electroferotipos. Es posible as distinguir 2 grandes grupos de electroferotipos (figura 1): el largo y el corto dependiendo de que los segmentos 10 y 11 migren ms o menos en el gel respectivamente. Particularmente en los rotavirus del grupo A los 11 segmentos genmicos migran agrupados en 4 clusters o grupos de bandas con la conformacin 4-2-3-2 Los rotavirus del grupo A tambin se pueden clasificar en: 1) subgrupos I y II en base a anticuerpos monoclonales contra eptopes especficos de subgrupo en la protena VP6, las cepas que no reaccionan con ningn monoclonal se dicen que son no I, no II; 2) en genotipos NSP4, que se determinan secuenciando parte del segmento 10, identificndose hasta la fecha 6 genotipos, de la A a la F. Las cepas humanas se corresponden a los genotipos A, B, C, con igual distribucin. Los rotavirus no A se diferencian sobre todo mediante el perfil genmico obtenido por electroforesis en gel de poliacrilamida, (PAGE), teido con nitrato de plata (electroferotipos).
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Figura 1. Representacin esquemtica de una electroforesis en gel de poliaclilamida no desnaturalizante teido con nitrato de plata, mostrando los grupos de bandas correspondientes a cada segmento de genoma para cada uno de los grupos de rotavirus. Se observa la conformacin 4:2:3:2 caracterstica de cepas correspondientes a rotavirus del grupo A
CICLO DE REPLICACIN
Adsorcin-posible receptor La naturaleza del receptor o receptores celulares para rotavirus an permanece en investigacin. Se sabe que existe un dominio de unin al cido silico a nivel de la fraccin VP8 y un posible dominio de unin para protenas de tipo integrinas en la fraccin VP5, a nivel de de las espculas VP4. Recientemente se determin la presencia de dominios de unidad a alpha-beta integrinas a nivel, tanto de VP7 como VP4. VP5 y VP8 resultan del clivaje de VP4 por proteasas. VP8 tendra la funcin de acercar al virin al receptor por su interaccin con dicho carbohidrato, permitiendo una interaccin posterior ms ntima entre VP5 y el receptor definitivo. Penetracin Una vez unido a la clula, el virus se internaliza posiblemente con participacin de VP4 y VP7. Se sabe que la exposicin de las nuevas partculas a un ambiente rico en proteasas, como el intestino delgado (en especial a la tripsina) incrementa notablemente la infectividad de las mismas, hacindolas ms competentes tanto para la adsorcin como para la penetracin. VP7 tambin es modificada en su conformacin luego del tratamiento con tripsina, aunque su rol en la penetracin an permanece oscuro. Una vez dentro de la clula, la partcula no posee VP4 ni VP7, pudiendo perderlas fuera de la clula durante la penetracin o dentro de la misma, en un proceso dependiente del pH
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citoplasmtico. Se han descrito dos modelos de penetracin para rotavirus. Uno de ellos es el modelo de penetracin directa o de translocacin a travs de la bicapa lipdica mediada por VP5, el otro modelo es el de entrada por endocitosis. Transcripcinreplicacin Una vez en el citosol, las partculas sin VP7 ni VP4 comienzan a transcribir los ARN mensajeros virales. Durante la fase temprana (las primeras 3 h) se sintetizan primero los mensajeros que darn lugar a protenas no estructurales (NSP) fundamentales para el ciclo productivo, como la NSP1 (que especifica el rango de husped -posiblemente un factor transcripcional-), la NSP2 (helicasa viral -fundamental para el inicio de la transcripcin-), la NSP3 (la cual desplaza a la Poli-A binding protein de los mensajeros celulares llevndolos a su degradacin -permitiendo el secuestro de la maquinaria traduccional del husped-), la NSP4 (enterotoxina viral), entre otras. Algunas de estas cumplen roles durante la morfognesis de las nuevas partculas. Los mensajeros virales emergen hacia el citosol por los canales a travs de la cpside de VP2 y VP6. De esto queda claro entonces, que para la emergencia de los mensajeros virales es necesario que se elimine la cpside de VP7, puesto que esta obstruye los canales. Poco despus (o en forma solapada) comienzan a expresarse los mARNs para las protenas estructurales. A medida que se van sintetizando las protenas estructurales en el citosol (VP1, VP3, VP2, VP6 y VP4) comienzan a formarse los primeros intermediarios de morfognesis, los que se van acumulando en inclusiones conocidas con el nombre de viroplasmas. Tanto la NSP2 como otras protenas no estructurales tales como la NSP5 y NSP6 intervienen en la formacin de dichos viroplasmas y por tanto, en el ensamblaje de las nuevas partculas. Se sabe que la NSP2 es tambin necesaria para el empaquetamiento de los nuevos segmentos de genoma en las partculas progenie (debido a que se une al ARN viral monocatenario). Posiblemente a altos niveles, la protena se une a los mARNs virales y los introduce dentro de la subpartcula (actuando como seal de empaquetamiento), propiciando adems su replicacin (interactuando posiblemente de forma especfica con VP1-VP3 y VP2). Entonces, una vez que las molculas de mARN viral estn en el interior de la partcula se asocian con los complejos VP1-VP3, siendo transcriptas, una vez y solo una vez, en cadenas negativas, las cuales permanecen asociadas a su complementaria formando las molculas de dsARN progenie para cada segmento. Por otro lado, partculas virales hijas inmaduras con ARN bicatenario transcriben ms molculas de ARN de polaridad positiva las cuales son traducidas en ms protenas, repitindose la secuencia de reacciones (multiplicacin del ciclo de replicacin). Ensamblaje y emergencia Las primeras partculas en ensamblarse contienen solo la cpside de VP2 y los complejos VP1-VP3, siendo a nivel de estas donde se incorpora el genoma. Luego se ensambla la cpside de VP6 y se incorpora la VP4. La VP7 es una glucoprotena y como tal se sintetiza a nivel del retculo endoplsmico rugoso (al igual que la NSP4); por lo cual el ensamblaje de las partculas completas requiere de la entrada a dicho organelo. La NSP4 acta como seal de entrada al RER para las partculas inmaduras, sirviendo como receptor intracelular para la VP6 y como agente nucleador para la incorporacin de VP7. Una vez dentro del RER, las partculas adquieren triple envoltura, permaneciendo en el interior de vesculas en donde posiblemente se da la maduracin final de VP7 y quiz la exposicin temprana de las partculas hijas a proteasas (tripsina), estabilizando y llevando a su conformacin nativa apropiada tanto
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a VP7 como (y fundamentalmente) a VP4. Los virus salen de la clula por brotamiento (gemacin), a pesar de no ser virus envueltos. Es posible que lo hagan a travs de vesculas que emergen del RER. El brotamiento se da exclusivamente a nivel de la superficie apical del enterocito. Tambin se da la emergencia por lisis, cuando se acumulan numerosas partculas a nivel de la clula infectada.
PATOGENIA
Rotavirus infecta enterocitos maduros a nivel del intestino delgado; pero tambin puede extenderse al leon distal y colon. Una vez infectado, el enterocito experimenta vacuolizacin, distensin del retculo endoplsmico y de las mitocondrias, determinando la alteracin de la arquitectura de la mucosa, con el consiguiente borramiento de las microvellosidades. La diarrea posiblemente sea el resultado, sobre todo, de una menor superficie de absorcin y de una disrupcin del epitelio. Por otro lado, la NSP4 posee actividad enterotoxina y su rol al parecer sera importante al comienzo de la enfermedad. Un producto de clivaje de dicha protena es liberado desde las clulas infectadas por un mecanismo independiente del aparato de Golgi, siendo este producto el que ejerce efecto enterotoxina durante fases tempranas de la enfermedad, va induccin de un aumento en los niveles de calcio intracitoplasmtico. Una vez formado el complejo NSP4-receptor se inducen seales que llevan a la activacin de una protena G asociada a este ltimo, la cual activa una fosfolipasa C de membrana. Esta ltima cliva residuos de fosfatidil inositol desatando la va del inositol trifosfato. Este segundo mensajero promueve la liberacin de calcio desde compartimientos secuestrantes hacia el citosol y la posterior activacin y apertura de un canal de cloro especfico. Por lo tanto, se da una masiva liberacin de Cl- y agua hacia la luz intestinal, dando lugar a la diarrea. La activacin de dicho canal de cloro es un evento dependiente de la edad, por lo cual el efecto ejercido por NSP4 se da solamente en individuos jvenes. Se comprob tambin que dicha fraccin de NSP4 puede disminuir las uniones intercelulares, destruyndolas, y producir alteraciones en el citoesqueleto del enterocito. Aunque la replicacin puede darse a toda edad, la aparicin de los sntomas de la enfermedad depende de la edad del husped infectado. La cantidad de receptores para el virus a nivel de los enterocitos en el adulto podra disminuir, siendo quiz esto (al menos en parte) responsable del desarrollo de infecciones asintomticas. Que los lactantes sean los ms propensos a desarrollar la enfermedad puede depender, entre otras cosas, de un nivel reducido de proteasas a nivel del intestino, el cual favorece la infeccin, de una menor absorcin a nivel del colon, de la dieta, de la inmadurez de la respuesta inmune, etc.
EPIDEMIOLOGA
Rotavirus es la causa ms importante de gastroenteritis aguda en nios pequeos a nivel mundial. La infeccin por rotavirus es tpicamente ms comn durante el otoo e invierno, son menos frecuentes durante el verano. La diarrea por rotavirus se da generalmente entre los 6 - 24 meses de edad, sin embargo, tambin puede presentarse en nios mayores. Durante la temprana lactancia, la madre puede transferirle al recin nacido anticuerpos protectores (por lo general del isotipo IgA) a travs de la leche y calostro, pero a medida que el nio deja de ser amamantado, aumenta la susceptibilidad. El adulto suele infectarse pero no se enferma, porque ya posee una respuesta de anticuerpos especficos efectiva ya montada contra todas las variantes posibles de rotavirus, ya sea en forma directa como cruzada, siendo las infecciones de tipo asintomticas o con sntomas muy leves. La inmunidad natural va logrndose con las sucesivas reinfecciones en la infancia.
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Se transmite fundamentalmente va aguas, alimentos y objetos contaminados con heces; se da tambin por contacto directo y se ha postulado, aunque en mucho menor grado, que podra darse la transmisin por aerosoles respiratorios. Las cepas de rotavirus del grupo A son las ms importantes desde el punto de vista epidemiolgico, asociadas a enfermedad diarreica aguda, tanto en lactantes humanos como en variados animales; siendo responsable de enfermedad espordica como de brotes epidmicos. Muchas de las infecciones en lactantes terminan en diarrea grave, especialmente cuando se asocian a desnutricin, requiriendo hospitalizacin. En Uruguay, conjuntamente con Escherichia coli en todas sus variantes patgenas intestinales, rotavirus del grupo A es el agente ms frecuentemente asociado a gastroenteritis infantil (aproximadamente el 30 % de los casos). En los ltimos aos, se vino registrando un aumento de los casos de gastroenteritis por rotavirus y un descenso en aquellos debido a E. coli patgeno entrico, lo cual hace suponer que, al igual que en la mayor parte del mundo, rotavirus se ha convertido en el agente de gastroenteritis infantil de mayor prevalencia a nivel local. Nuevos estudios nacionales han demostrado que rotavirus es responsable del 40% de las diarreas intrahospitalarias en el Hospital Pereira Rossell. Estudios epidemiolgicos demuestran que la cocirculacin de diferentes electroferotipos, el predominio de una o pocas variantes durante un determinado perodo de tiempo y la aparicin secuencial de las mismas, son rasgos comunes en estos virus.
Los pacientes con infeccin por rotavirus se presentan con deposiciones lquidas abundantes, que pueden llevar a la deshidratacin, vmitos y fiebre leve en la mitad de los casos.
DIAGNSTICO
El diagnstico etiolgico de rotavirus se realiza directamente a partir de la materia fecal, fundamentalmente buscando antgenos especficos de grupo A (VP6) mediante tcnicas de ELISA directo, siendo una tcnica sensible y especfica. Tambin es posible extraer el ARN genmico viral directamente de la muestra, y llevar a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida teido con plata, para evidenciar los electroferotipos caractersticos de cepas de rotavirus del grupo A o de cepas pertenecientes a otros grupos (esta tcnica presenta una altsima especificidad siendo su sensibilidad menor, dependiendo de la presencia de un altsimo recuento de viriones en la materia fecal). Suele utilizarse para confirmar los resultados del ELISA directo. A partir del ARN viral extrado de la muestra es posible llevar a cabo ensayos de RT-PCR multiplex, en los cuales se utilizan varios primers anti-serotipos G especficos (PCR mltiple para el gen que codifica para VP7) o anti-mltiples genotipos asociados a los serotipos P ms prevalentes (PCR mltiple para el segmento 4). La RT-PCR ha mostrado una alta especificidad y sensibilidad, sirviendo adems para estudios de tipo epidemiolgico ya que permite identificar a que tipo pertenece un aislamiento dado, sin recurrir a tcnicas de secuenciacin o de identificacin en base a anticuerpos monoclonales de tipo neutralizantes, las cuales son muy costosas. Para estudios de tipo epidemiolgico (seroprevalencia), suelen utilizarse tcnicas de tipo serolgicas tales como ELISA de captura para Ac de tipo neutralizantes anti VP4 y VP7 presentes en el suero del paciente y estudios de seroconversin; deteccin de coproanticuerpos (IgM e IgA) mediante ELISA en muestras pareadas de materia fecal; etc.
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INMUNIDAD Y VACUNAS
La infeccin natural repetida por rotavirus protege al husped contra una subsecuente infeccin por dicho agente, estando asociada a la produccin de anticuerpos antirotavirus sricos y en la mucosa, de tipo IgM, IgG e IgA; esta proteccin es a largo plazo. Por otro lado, tiene lugar una respuesta de tipo celular mediada fundamentalmente por linfocitos TCD8 citotxicos, a corto plazo. La protena ms inmunognica sera VP6. Anticuerpos dirigidos contra esta protena generarn proteccin. Tambin se ha visto que anticuerpos dirigidos contra VP4 y VP7 neutralizan el virus y proveen de proteccin. Muchas de las respuestas producidas por VP7 son de tipo especfica. Se han propuesto vacunas, las cuales apuntan, no a erradicar la infeccin, sino a eliminar los sntomas de la diarrea severa en lactantes, y por tanto, el nmero de nios hospitalizados. Para el desarrollo de vacunas, los datos obtenidos de estudios de epidemiologa molecular son de vital importancia para establecer las cepas circulantes de una regin dada, y por tanto, los posibles candidatos para ser usados como inmungenos. Hasta la fecha existen dos vacunas contra rotavirus, pero con poco xito relativo: La vacuna recombinante humano rhesus, la cual contiene una cepa de rotavirus simiesca (mono rhesus) especfica para el serotipo 3 de VP7, y 3 cepas recombinantes humano rhesus con 10 genes de la cepa simiesca y un nico gen de rotavirus humano que codifica para VP7 especfica de los serotipos 1, 2 o 4. Esta vacuna indujo una buena respuesta frente a las 4 cepas de rotavirus ms importantes en trminos clnicos a nivel mundial (80% de efectividad); aunque se asocia a un cuadro febril leve transitorio en un tercio de los vacunados. En una cierta proporcin de los lactantes vacunados indujo trastornos intestinales graves (intususcepcin) una a dos semanas despus a la administracin de la primera dosis, por lo que fue retirada del mercado. La vacuna tetravalente recombinante humano bovino fue desarrollada utilizando cepas de rotavirus humano correspondientes a cada uno de los 4 serotipos ms prevalentes a nivel mundial (G1 4) como donantes del gen que codifica para VP7, y la cepa bovina UK Compton como donante de los 10 genes restantes. Primero se evalu la eficacia de las cepas recombinantes monovalentes por separado y luego del preparado tetravalente, demostrndose que resultaban seguros y capaces de inducir una buena respuesta inmune en nios menores de 6 meses (80%). Las reacciones febriles fueron menos frecuentes durante la fase de ensayos con voluntarios. An no se encuentra disponible. La inmunidad completa en nios requiere de mltiples dosis vacunales en el transcurso del tiempo (o mltiples reinfecciones naturales).
Otros virus entricos

Si bien rotavirus es el agente de gastroenteritis viral ms difundido en el mundo entero, existen varias familias de virus asociadas a este cuadro. Se han identificado como agentes importantes de enfermedad diarreica tanto en nios pequeos como en adultos, en pacientes inmunocompetentes e inmunodeprimidos (sobre todo HIV-positivos), asociados a brotes por ingesta de alimentos y agua contaminada, pueden causar infecciones en la comunidad o en el hospital, o presentarse como casos espordicos. Entre estos, podemos destacar a las familias Adenoviridae, Astroviridae, Caliciviridae y Picobirnaviridae (Picotrirnaviridae). Algunas de estas familias se caracterizan sobre todo, por incluir variantes con tropismo
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por otros tejidos o que afectan en forma preferencial otras superficies mucosas, no siendo patgenos estrictos del tracto gastrointestinal. Tal es el ejemplo de Adenoviridae (agentes de procesos respiratorios) y Caliciviridae (virus de la hepatitis E). Hasta el momento, los aislamientos humanos pertenecientes a las familias Astroviridae y Picobirnaviridae se han asociado enteramente a casos de gastroenteritis bajo diferente contexto. A pesar de no ser catalogado como agente de gastroenteritis, se ha postulado que en pacientes HIV-positivos en estadio SIDA, el propio virus de inmunodeficiencia humana podra infectar al enterocito produciendo un cuadro de diarrea, sin que este sea el sitio blanco definitivo de infeccin. Los miembros de la familia Picornaviridae, subfamilia Enterovirinae (virus de la polio, Echovirus, Coxsackie), el virus de la Hepatitis A, entre otros que utilizan la ruta de transmisin fecal-oral, tienen como sitio primario de infeccin la mucosa gastrointestinal, sin estar implicados como agentes de gastroenteritis. En esta seccin nos dedicaremos exclusivamente a las familias Adenoviridae, Astroviridae, Caliciviridae y Picobirnabviridae, las otras familias o agentes virales sern analizados en sus correspondientes captulos.
ADENOVIRUS ENTRICOS
Morfologa y estructura Los adenovirus entricos, al igual que las variantes asociadas de forma exclusiva a infecciones del tracto respiratorio, pertenecen al gnero Mastadenovirus. Son virus no envueltos de simetra icosadrica, miden aproximadamente 70-90 nm. Los 252 capsmeros (unidades estructurales de la partcula) que forman la cpside se organizan en 240 hexmeros y 12 pentmeros, en las caras y vrtices del icosaedro, respectivamente. Se caracterizan sobre todo por presentar en cada uno de sus 12 vrtices (pentmeros) un apndice proteico con forma de antena, al cual se le denomina fibra fusgena o fibra del pentn, de utilidad durante la adsorcin de la partcula a sus receptores especficos a nivel de la membrana plasmtica de la clula permisiva. Por otro lado, la fibra y la base del pentn intervienen en la liberacin de la partcula viral desde el endosoma al citosol y en el desensamblaje. Presentan un genoma de ADN doble hebra, lineal con un tamao que oscila entre 33 45 Kb. Se replican en el ncleo de la clula infectada, utilizando la ARN-polimerasa II celular para transcribir sus genes. Los genes virales se organizan en cinco unidades transcripcionales, de las cuales cuatro se corresponden a los genes de la fase muy temprana y temprana (E1-AB, E-2, E-3 y E-4), la quinta unidad comprende a los genes tardos (E-5). Cada unidad presenta un conjunto de genes y su propio conjunto de promotores y secuencias lderes, pudiendo ser transcripta en uno o varios transcriptos, los que a su vez, son procesados en las diferentes especies de mARN por mecanismos de splicing alternativo. Por otro lado, los mensajeros individualmente pueden codificar distintas protenas a partir de marcos de lectura superpuestos, codones de iniciacin alternativos, etc. Sintetizan su propia ADN-polimerasa y una protena terminal (PT) de unin al extremo 3 de cada hebra del ADN viral, la cual une una molcula de dCTP , actuando como cebador (primer) para la replicacin (ambos, junto a la protena de 72 KDa intensamente fosforilada, productos de la unidad E-2). La regulacin de la expresin de las diversas unidades transcripcionales se da por un efecto combinatorio en cascada de varios de los productos de los genes muy tempranos y tempranos (productos de los genes E1A y E1B; E-2; E-3 y E-4), la mayora, son fosfoprotenas activadoras en trans de la transcripcin de los genes virales, en colaboracin con factores transcripcionales celulares. Algunas de estas tambin se encargan de promover la replicacin
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viral y en ciertos casos, la activacin de replicones en la clula husped, siendo efectoras de transformacin celular. Algunas protenas codificadas en las unidades E-3 y E-4 se encargan de interferir con los mecanismos de defensa del husped (bloqueo de la presentacin de antgenos virales bajo la forma de pptidos en el contexto de molculas de HLA-1, inhibicin de la lisis inducida por el factor de necrosis tumoral alfa - TNF--, etc.) y del secuestro de la maquinaria biosinttica de la clula, entre otras funciones. Clasificacin Las cepas de adenovirus pueden clasificarse en seis subgneros (A F) en base a diferencias en la capacidad hemaglutinante, propiedades oncognicas, al tipo y tamao de las protenas estructurales (SDS-PAGE y Western blot) y al grado de homologa a nivel de la secuencia de nucletidos en el ADN genmico (perfiles de digestin con enzimas de restriccin; RFLP; etc). Mediante ensayos de neutralizacin, se sabe de la existencia de unos 47 serotipos distintos de adenovirus asociados a enfermedad en humanos. El trmino adenovirus entricos se refiere sobre todo a las cepas pertenecientes a los serotipos 40 y 41 en el subgnero F. Tambin, aunque en menor nmero, pueden darse aislamientos asociados a enterocolitis pertenecientes al subgnero A, de los serotipos 12, 18 y 31. Los serotipos 40 y 41 del subgnero F son causa importante de gastroenteritis a nivel mundial sobre todo en nios, aunque tambin se dan brotes que involucran individuos adultos inmunocompetentes. Patogenia Existe muy poca informacin acerca de los mecanismos fisiopatolgicos involucrados en las infecciones por adenovirus entricos. De algunos estudios in vitro e in vivo se vio que dichas cepas del virus tenan predileccin por clulas epiteliales con microvellosidades, concentrndose a nivel de las mismas, produciendo una alteracin en el borde en cepillo. Sin embargo, aun no se conoce cmo la infeccin afecta decididamente la funcin intestinal. El perodo de incubacin es de 3 a 10 das. La diarrea no se acompaa de deshidratacin ni de fiebre alta aunque, a diferencia de rotavirus, suele ser de mayor duracin. En promedio, los sntomas se extienden por 6 a 9 das, existiendo un rango de duracin que oscila entre los 4 a los 23 das. Muchas veces, la fiebre y los vmitos preceden o acompaan a la diarrea. Epidemiologa El 2 a 22% de las diarreas virales en todo el mundo son causadas por adenovirus, aunque esta cifra puede ser subestimada debido a inadecuados mtodos de estudio. No presenta un patrn estacional de aparicin como rotavirus. Infecta ms frecuentemente a nios de entre tres o cuatro aos, y menos frecuentemente a adultos. Se transmite por va fecal-oral. Diagnstico La microscopa electrnica fue el mtodo de deteccin inicial pero actualmente se dispone de ensayos inmunoenzimticos (ELISA) comerciales, a los cuales se les ha incorporado anticuerpos monoclonales, presentando una buena sensibilidad. Tambin se dispone de tcnicas de hibridacin pero tienen una muy baja sensibilidad. El anlisis del ADN con enzimas de restriccin es el mtodo utilizado para clasificar las distintas cepas aisladas.
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ASTROVIRUS
Los miembros de la familia Astroviridae se identificaron por primera vez en 1975 a travs de microfotografas electrnicas de muestras procesadas de materia fecal provenientes de nios con diarrea aguda. Los astrovirus han sido clasificados en ocho serotipos (HAstV-1 a HAstV-8) de acuerdo a diferencias en los eptopes presentes a nivel de la protena de la cpside. La serotipificacin se basa sobre todo en inmunofluorescencia directa (IF) sobre cultivo de clulas infectadas, utilizando antisueros de referencia hechos en conejo contra los distintos serotipos. Estos grupos antignicos se correlacionan perfectamente con 8 genotipos diferentes, los cuales se determinan secuenciando una regin de 348 pb a nivel de la secuencia nucleotdica del ORF-2. La mayora de los estudios llevados a cabo en el mundo indican que el serotipo mayoritariamente implicado a casos de gastroenteritis es el HAstV-1. Por otro lado, HAstV6/7/8 se aslan rara vez. Morfologa y estructura Astrovirus es un virus desnudo de simetra icosadrica, mide 28-30 nm de dimetro, cuya cpside al microscopio electrnico recuerda a una estrella de 5 o 6 puntas (por ello el nombre de astrovirus). Poseen un genoma de ARN monocatenario lineal, de polaridad positiva, de aproximadamente 6,8 Kb. El genoma esta constituido por una regin no codificante en el extremo 5 (UTR-5 o NCR-5); 3 marcos de lectura abiertos (ORFs), ORF-1a y ORF-1b, codifican protenas no estructurales (una proteasa viral y una ARN-polimerasa ARN dependiente) y ORF-2 codifica protenas precursoras de la cpside y finalmente, una regin UTR-3 corta (por lo general de 8 nucletidos), seguida de una cola poli-A de aproximadamente 30 nucletidos. La porcin C-terminal de la protena de la cpside presenta mayor variabilidad de secuencia que la N-terminal. Esta variabilidad es la que define los distintos genotipos asociados a los virus aislados hasta el momento. Recientemente, se ha detectado en el citoplasma de clulas infectadas por astrovirus la presencia de un ARN subgenmico que contendra solo a ORF-2; lo cual implicara algn tipo de procesamiento postranscripcional o la sntesis de ARNs menores durante la replicacin del genoma viral, como mecanismo de amplificacin de la sntesis de la protena de la cpside. Ciclo de replicacin Como para otras familias de virus ARN monocatenario (por ej. Picornaviridae) de polaridad positiva, el virus se adsorbe a receptores especficos en la superficie celular por medio de un dominio de unin en la protena de la cpside, siendo luego transportado al citoplasma donde sufre un proceso de decapsidacin liberando el genoma al citosol. Una vez all, el genoma procede inmediatamente al secuestro de la maquinaria de traduccin celular, sintetizndose una gran poliprotena viral (aproximadamente 2250 aminocidos) conteniendo a la proteasa, la ARN-polimerasa y al precursor de la cpside. sta primero es autoprocesada dando como producto a la proteasa viral en su forma nativa, la cual culmina el procesamiento de las restantes protenas virales. Una vez sintetizada la ARN-polimerasa viral, el genoma parental puede empezar a replicarse, sucediendo este proceso en el citoplasma. El ensamblaje de las nuevas partculas, la maduracin de las protenas virales y la replicacin son procesos que ocurren casi simultneamente. Existe todo un conjunto de intermediarios de morfognesis conformado por partculas inmaduras en distintos estadios. Posiblemente, el genoma sea
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incorporado dentro de la partcula a nivel de algunos de dichos intermediarios. La salida del virus se realiza por lisis celular. Patogenia Astrovirus ha sido detectado en la superficie epitelial del intestino delgado y en macrfagos de la lmina propia. En animales, astrovirus produce la vacuolizacin, seguida de la degeneracin y posterior muerte de la clula, lo que determina la atrofia vellositaria. Epidemiologa Las variantes humanas astrovirus conocidas hasta el momento, son patgenas exclusivas del tracto gastrointestinal, siendo agentes importantes de enfermedad diarreica en el mundo entero, sobre todo en nios y ancianos (aunque tambin puede darse en otros grupos etreos). Tambin se han asociado de manera importante con diarrea en el paciente HIV-positivo o con otros factores responsables de inmuno compromiso. Algunos estudios lo colocan como el primer agente etiolgico de gastroenteritis en pacientes HIV-positivos, por encima de los agentes bacterianos implicados; siendo s, el primer agente viral asociado a casos de diarrea en este grupo (por encima de calicivirus y adenovirus del grupo F, serotipo 40 y 41). Los brotes de diarrea por astrovirus son bastante frecuentes, pudiendo ocurrir tanto en comunidad como en el hospital. La incidencia de la diarrea por astrovirus en nios a nivel mundial, tanto en pases desarrollados como en vas de desarrollo, es del orden del 2 al 9 %; aunque algunos estudios reportan una prevalencia superior al 26%. La transmisin en nios es usualmente de persona a persona. En base a estudios de seroprevalencia en diferentes comunidades del mundo se ha visto que la mayora de los nios generan respuestas de anticuerpos contra las diversas variantes de astrovirus durante el primer ao de vida. Por lo que se ha reformulado la importancia de tales virus como agentes de enfermedad diarreica, siendo en muchos casos considerados como la segunda causa ms comn de gastroenteritis viral en nios (luego de rotavirus). Manifestaciones clnicas El perodo de incubacin es de uno a cuatro das despus de la exposicin, la enfermedad se manifiesta aproximadamente al cuarto da causando deposiciones lquidas, vmitos, distensin abdominal y deshidratacin, la severidad de la enfermedad es menor que rotavirus. Hay un aumento de la incidencia en el invierno. Diagnstico El diagnstico y los estudios de tipo epidemiolgico se basaban fundamentalmente en microscopa electrnica de las muestras (debido a la forma peculiar del virin y al alto recuento alcanzado en heces) o tcnicas inmunoenzimticas (ELISA directo). En los ltimos aos, se ha desarrollado e incrementado el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa con previa retrotranscripcin (RT-PCR), lo cual ha incrementado el nmero de casos positivos para astrovirus debido a una mayor sensibilidad respecto a las tcnicas anteriormente mencionadas, las cuales dependan de un alto ttulo de viriones en materia fecal. Por otro lado, la RT-PCR para regiones dentro de los marcos de lectura ORF1a, ORF1b y ORF2 permite genotipificar los aislamientos y analizarlos del punto de vista filogentico (tras la secuenciacin).
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PICOBIRNAVIRUS
Son virus relativamente pequeos, miden aproximadamente 35 nm de dimetro, desnudos, presentan una cpside de simetra icosadrica cuya superficie podra ser caracterstica exclusiva de tales virus, a juzgar por el mtodo de montaje de microfotografas electrnicas en cro. Presentan un genoma de ARN bicatenario (dsARN), doblemente segmentado, cada segmento presenta un tamao diferente, segn los diferentes aislamientos. De forma menos comn, se han obtenido aislamientos trisegmentados, conteniendo un fragmento adicional de dsARN con un tamao promedio de 2,92 kb. A estos se los ha denominado Picotrirnavirus, aunque presentan mucha similitud, no solo estructural y gentica, sino tambin en su ciclo de vida, rango de huspedes y procesos asociados con los picobirnavirus. Fueron descriptos por primera vez en 1988, al ser descubiertos por accidente en ensayos de electroforesis en gel de poliacrilamida y tincin con plata de extractos de ARN viral obtenidos a partir de muestras de materia fecal proveniente de pacientes (nios) con clara sospecha de infeccin por rotavirus. Junto al perfil de bandas caracterstico de estos ltimos, se evidenciaron bandas adicionales de tamao semejante al reportado, lo cual hizo sospechar de inmediato en la presencia de un nuevo tipo de virus. Ms adelante, a partir de muy pocos casos, pudo evidenciarse ambas bandas en PAGE solas, lo cual, junto a la microscopia electrnica permiti poner en evidencia al nuevo tipo de virus entrico. El rol de los picobirnavirus en la generacin de los sntomas que hacen a una gastroenteritis en seres humanos an no queda bien establecido. La frecuencia de deteccin de tales virus en materia fecal de individuos con diarrea ha mostrado cierta variabilidad para diferentes investigaciones llevadas a cabo en diferentes sitios a nivel mundial. Lo coincidente es que se han encontrado en proporciones bastante similares en pacientes sintomticos como asintomticos. Lo ms caracterstico de picobirnavirus del punto de vista epidemiolgico es su mayor asociacin a casos de gastroenteritis en pacientes portadores del virus de inmunodeficiencia humana (HIV-positivos). En muchos casos, asociado a diarreas de tipo persistente o crnicas, caracterizadas por la presencia del virus en excretas hasta 45 das de iniciados los sntomas. Se han detectado en aproximadamente el 9 % de los casos de gastroenteritis en pacientes HIVpositivos (sobre todo en el estadio SIDA), as como en el 2 % de los pacientes asintomticos, portadores del virus HIV. Por lo tanto, son el segundo agente viral de gastroenteritis ms frecuente en pacientes HIV-positivos despus de astrovirus, a nivel mundial. Todos estos estudios se basan en los resultados obtenidos mediante la bsqueda de dsARN viral en muestras de materia fecal por PAGE y tincin con nitrato de plata (con protocolos de extraccin adecuados), o por microscopa electrnica directa; ambos mtodos de baja sensibilidad, los cuales dependen de un alto recuento de partculas virales en la muestra. Por otro lado, se sabe que muchas veces la infeccin transcurre con bajos ttulos de partculas en materia fecal o que no en todo momento son secretadas altas cantidades del virus. Esto, junto a lo citado anteriormente, puede llevar a subestimar la verdadera incidencia de la diarrea por picobirnavirus. Recientemente se han propuesto ensayos de RT-PCR especficos para picobirnavirus utilizando como molde el dsARN extrado de la muestra de materia fecal, los cuales pretenden solucionar los problemas de sensibilidad.
CALICIVIRUS
Los calicivirus humanos son la causa ms comn de brotes de diarrea de origen no bacteriano en adultos y en nios mayores en todo el mundo. Se estima que son responsables de
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aproximadamente el 95 % de los brotes de gastroenteritis viral (por lo general, acompaada de vmitos) en dichos grupos etarios, sobre todo en Estados Unidos. Se conoce poco de su frecuencia en casos de diarrea de tipo aguda en nios, aunque se estima que la incidencia sera tan solo inferior a la de los casos de gastroenteritis por rotavirus. Morfologa y estructura Los calicivirus son virus pequeos, miden 30-35 nm de dimetro, desnudos, vistos al microscopio electrnicos presentan una morfologa tpica en forma de cliz o estrella de David. Su genoma est constituido por una nica cadena de ARN, de polaridad positiva. Clasificacion Existen cinco grupos o gneros de calicivirus basados en homologa de secuencia y organizacin del genoma. Cuatro de estos cinco grupos son patgenos humanos: los virus del tipo Sapporo, los virus circulares pequeos tipo Norwalk, los calicivirus marinos y el virus de la hepatitis tipo-E (HEV). Siendo los tres primeros agentes de gastroenteritis en humanos. El virus de la hepatitis-E, si bien se transmite por va fecal-oral, no tiene como rgano blanco definitivo al intestino sino al hgado, siendo agentes de hepatitis aguda autolimitada sin mayor riesgo, aunque (por razones an no muy claras) suele ser fatal para el 25% de las mujeres embarazadas infectadas, sobre todo en pases subdesarrollados. Los virus de tipo Norwalk (NLVs) muestran una considerable diversidad gentica, pudiendo ser clasificados del punto de vista filogentico en dos grandes genogrupos: el genogrupo 1 incluye al virus Norwalk propiamente dicho, mientras que el genogrupo II incluye variantes como el virus de Lordsdale y el virus de las Montaas Nevadas. En base a estudios de homologa y organizacin del genoma, se vio que los virus tipo Sapporo (SLVs) se encuentran mas relacionados a los calicivirus marinos que a otros grupos de calicivirus causantes de diarrea en humanos. Patogenia Hay poca informacin sobre la patogenia de calicivirus, se ha visto que la mucosa del intestino delgado proximal se encuentra inflamada, las clulas absortivas son anormales, las vellosidades estn disminuidas, hay hipertrofia de las criptas adems de un incremento de las clulas epiteliales. La mucosa gstrica y colnica es normal. Epidemiologa Los virus similares al Norwalk y los calicivirus marinos son los mayoritariamente asociados a brotes como a casos espordicos de gastroenteritis en adultos. Los SLVs se asocian tan solo a pocos casos comunitarios de gastroenteritis infantil. El cultivo en lneas celulares in vitro de estos virus indica que han estado emergiendo peridicamente desde fuentes ocenicas desde hace por lo menos 65 aos. Por lo tanto, resulta frecuente que los brotes de gastroenteritis asociada a calicivirus humanos, en especial a las cepas de calicivirus marinos, se deban al consumo de mariscos u otros productos del mar con mala preparacin. Se ha propuesto un reservorio ocenico para tal familia de virus. En el ocano los virus son expuestos a un rango amplio de animales, en donde se multiplican y surgen nuevas variantes por ciclo replicativo; algunas de ellas capaces de infectar y causar enfermedad en el hombre. Por esto mismo, las enfermedades por calicivirus son casi imposibles de contener o erradicar. Se ha visto que algunas variantes de calicivirus pueden permanecer viables por ms de 14 das a 15 C, en el agua de mar.
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El mecanismo de transmisin es fecal-oral y son ms comunes las infecciones en el invierno. Manifestaciones clnicas Produce diarrea aguda y presenta deposiciones lquidas, vmitos, nauseas, clicos y fiebre. La infeccin se resuelve en general espontneamente a las 24-48 horas. Diagnstico Como estos agentes no han podido ser cultivados in vitro ni se dispone de modelos animales para su estudio, su diagnstico depende de mtodos directos de visualizacin (microscopa electrnica), de tcnicas inmunolgicas (ELISA) y de la amplificacin genmica. La microscopa electrnica fue el mtodo usado originalmente para identificar estos virus. Su sensibilidad es baja para los calicivirus debido a que estos se excretan en bajas concentraciones en las heces. RT-PCR, actualmente es el mtodo diagnstico ms sensible utilizado tanto para el diagnstico como para estudios epidemiolgicos. Se utiliza para detectar la presencia del virus en el medio ambiente, incluyendo agua y comida contaminada.
Bibliografa
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Herpesvirus
A. Mattera, P. Barrios
Generalidades
Los miembros de la familia Herpesviridae son virus ADN, envueltos. Ms de 100 especies conocidas de herpesvirus infectan a un amplio espectro de animales. Ocho especies reconocidas infectan a los humanos.
Clasificacin
Se clasifican en tres subfamilias de acuerdo a la homologa y organizacin de su genoma, rango de husped y otras propiedades biolgicas. Las tres subfamilias son: alphaherpesvirinae, betaherpesvirinae y gammaherpesvirinae.
ALPHAHERPESVIRINAE
Presentan las siguientes caractersticas: Variabilidad de huspedes. Ciclo de replicacin relativamente corto. Difusin rpida a nivel de cultivos celulares. Destruccin efectiva de la clula infectada. Capacidad de establecer una latencia primaria, aunque no exclusiva, a nivel de los ganglios sensitivos. Dentro de sta subfamilia se citan virus herpes simplex tipo 1 y 2, y el virus varicela zoster (VVZ).
BETAHERPESVIRINAE
Posee una morfologa tpica. El genoma de ADN es grande. Poseen la capacidad de establecer infecciones virales persistentes y latentes. Son especie especficos. Crecen muy lentamente en cultivos celulares. Esta subfamilia comprende citomegalovirus (CMV) y a los herpes humanos 6 y 7 (HHV 6 y 7).
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Table 1. Classification and Structure of Herpesviridae That Infect Humans Common Name Other Desig- Sub- Genome No. of Genome nation family Size Genome Type (kbp Isomers 106) Human virus Herpes simplex Human her- a 152 4 E virus type 1 pesvirus 1 Herpes simplex Human her- a 152 4 E virus type 2 pesvirus 2 Varicella-zoster virus Human herpesvirus 3 Epstein-Barr virus Human herpesvirus 4 Cytomegalovirus Human herpesvirus 5 Human herpesvi rus 6 Human herpesvi rus 7 Human herpesviKaposis rus 8 sarcoma herpesvirus Simian virus Herpes B virus Herpesvirus simiae; cercopithicine herpesvirus 1 Abbreviation: kbp, Kilobase pairs. a g b b b g 125 172 229 165 145 165 D 1 1 1 1 1 D C E A A B
Guanineplus-Cytosine Content (% ) 67 69 46 59 57 43 42 55
150
74
GAMMAHERPESVIRINAE
Se replican y permanecen en forma latente en los linfocitos. Pueden causar linfomas, leucemias y trastornos linfoproliferativos en animales de experimentacin. Dentro de ella se encuentra el virus de EpsteinBarr (VEB) y herpesvirus 8.
Estructura
Los herpesvirus son partculas largas que miden entre 150 a 250 nm. La particula viral est compuesta, desde el exterior al interior, por una envoltura de naturaleza lipdica que deriva de la clula husped. Las protenas y las glicoprotenas virales insertadas en la envoltura forman las espculas, de las que algunas son responsables de la fijacin del virus a la clula. La integridad de la envoltura es necesaria para la infectividad viral. Anticuerpos contra algunas de las glicoprotenas virales neutralizan la infeccin. El tegumento es un complejo de protenas virales de estructura fibrilar que asegura la unin entre envoltura y cpside. Su naturaleza lipdica le da la posibilidad de ser degradables por los agentes fsicoqumicos y ello confiere a los herpesvirus de una gran fragilidad al medio exterior. Presenta una cpside icosadrica de 100 nm de dimetro constituida de 162 cpsomeros. Un core que contiene ADN viral, bicatenario lineal que se encuentra enrollado alrededor de una bobina proteica.
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Figura 1. Electron micrographs of varicella-zoster virus negatively stained with phosphotungstic acid (40,000). A, The complete enveloped virion. B, A purified viral nucleocapsid. (From Straus SE, Ostrove JM, Inchauspe G, et al. Varicella-zoster virus infections: Biology, natural history, treatment, and prevention. Ann Intern Med. 1988;108:221237.)
Ciclo de replicacin viral

La replicacin de los herpesvirus est cuidadosamente regulada. Adsorcin, penetracin y decapsidacin: por intermedio de las protenas de la envoltura viral los virus se unen a receptores de la membrana citoplasmtica de la clula. Luego de la fusin entre las envolturas virales y las membranas citoplasmticas, la nucleocpside se libera en el citoplasma, la cpside migra a travs del mismo y es degradada por las enzimas lisosomales dando lugar, por ltimo, a la penetracin del cido nucleico en el ncleo. La sntesis de protenas es regulada en el tiempo y aparecen tres tipos sucesivos de protenas en las clulas: Protenas muy precoces (inmediate early antigens) IEA Protenas precoces (early antigens) EA Protenas tardas (late antigens) LA Las protenas precoces son enzimas que regulan su propia sntesis y estimulan la sntesis de ellas mismas. En algunos herpesvirus la sntesis de las protenas muy precoces son inducidas por las protenas del tegumento. Las protenas precoces son las que participan propiamente en la replicacin viral ya que son ADN polimerasas y timidinacinasas. Las protenas tardas son protenas estructurales. Las copias de ADN viral replicadas se unen a las protenas de estructura que migran hacia el ncleo donde se ensamblan. Envoltura y liberacin de viriones: las nucleocpsides completas salen de los ncleos y se envuelven con membranas nucleares o intracitoplasmticas (lo cual es caracterstico de los herpesvirus). Los viriones atraviesan el citoplasma celular por el retculo endoplsmico y finalmente la clula termina siendo destruida.
Tropismo
Los herpesvirus varan en sus habilidades para infectar distintos tipos de clulas rasgo este que es considerado en la clasificacin en subfamilias. Por ejemplo el virus herpes simplex crece en clulas epiteliales y fibroblastos de humanos, monos, conejos, ratn y otros animales. El virus varicela zoster (VVZ) crece mejor en clulas epiteliales y fibroblastos in vitro. CMV crece slo en fibroblastos humanos, VEB puede ser cultivado slo en linfocitos. HHV 6 y 7 se replican in vitro en linfocitos T CD4. HHV 8 an no se ha podido producir su replicacin eficientemente in vitro.
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Latencia
Todos los herpesvirus permanecen en sus huspedes naturales y son responsables de infecciones latentes y de reactivaciones a menudo asintomticas. La latencia est caracterizada por una expresin limitada de una pequea cantidad de genes virales.
Patogenia
Los herpesvirus pueden causar dao por tres mecanismos: destruccin directa de los tejidos provocando respuestas inmunes patolgicas por la capacidad de transformar a la clula en neoplsica. Las lesiones mucocutneas por HVS 1 y VVZ son consecuencia, fundamentalmente, de un dao tisular directo, en cambio ciertas complicaciones por herpesvirus como eritema multiforme, anemia hemoltica y trombocitopenia, son consecuencia de respuestas inmunes patolgicas. Herpesvirus producen infecciones persistentes en humanos debido a que alteran genes celulares que previenen su eliminacin, permitiendo as su latencia, inhiben la apoptosis y evaden la respuesta inmune. La latencia se mantiene por la localizacin del virus en lugares inmunolgicamente privilegiados como la neurona en el caso de HVS, y por la falta de expresin de protenas que pueden ser detectados por el sistema inmune como en algunos linfocitos B por el VEB. Algunos integrantes de la familia Herpesviridae son virus oncognicos como el VEB, que describiremos ms adelante.
Epidemiologa
La infeccin por los distintos herpesvirus es de distribucin mundial y muy frecuente. Los herpesvirus a causa de su envoltura son virus frgiles. La transmisin de la infeccin se realiza: a travs del contacto directo y a veces ntimo entre los individuos por contaminacin con la saliva; por va genital: contactos sexuales, parto; por transplante de rganos, o por transfusiones sanguneas. Aunque son virus frgiles, pueden resistir cierto tiempo en el medio exterior y la infeccin puede ser vehiculizada por las manos o por los objetos contaminados por la saliva, lesiones o secreciones infectadas. La primoinfeccin por herpesvirus, acompaada o no de signos clnicos, se observa a menudo en el lactante y ms frecuentemente en medios socioeconmicos desfavorables, o cuando los jvenes viven agrupados en colectividades. En la infeccin latente los virus herpticos son excretados de forma intermitente sin signos clnicos asociados, lo que explica su gran difusin a nivel de la poblacin. Los factores que desencadenan la reactivacin son muy variables y poco conocidos: estmulos nerviosos, estmulos alognicos en transplantes o estmulos durante el embarazo.
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Table 2. Features of Productive, Latent, and Transforming Herpesvirus Infections of Humans Virus Typical Primary Typical Recur- Infection in the State of Association Infections rent Infections Compromised Latency with Human Host Cancers Herpes simGingivostomaHerpes Gingivostoma- Sensory None plex virus 1 titis labialis titis neurons Keratoconjunc- KeratoconKeratoconjunctivitis junctivitis tivitis Cutaneous Cutaneous Cutaneous herpes herpes herpes Genital herpes Encephalitis Esophagitis Encephalitis Pneumonitis Hepatitis, etc. Herpes simGenital herpes Genital herGenital herpes Sensory Cervical plex virus 2 pes neurons cancer? Cutaneous Cutaneous Cutaneous herpes herpes herpes GingivostomaAseptic men- Disseminated titis ingitis infection Meningoencephalitis Neonatal herpes Varicella-zos- Varicella Dermatomal Disseminated Sensory None ter virus zoster infection nerve ganglia Cytomegalo- Mononucleosis ? Hepatitis MonoNone virus cytes? Hepatitis Retinitis Neutrophils Congenital cyPneumonitis tomegalic incluEncephalitis sion disease Colitis, etc. Epstein-Barr Mononucleosis ? Polyclonal and B lympho- African-type virus Hepatitis monoclonal cytes Burkitts lymEncephalitis lymphopphoma, CNS roliferative lymphoma, syndromes and other lymphomas; nasopharyngeal carcinoma; leiomyosarcoma Oral hairy leukoplakia Human herRoseola infan? Pneumonitis? CD4 lym- Rare B-cell pesvirus 6 tum phocytes? lymphomas? Fever and otitis Encephalits? media Encephalitis Human herRoseola infan? ? CD4 lym- None pesvirus 7 tum phocytes?
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Human herpesvirus 8
Kaposis sarcoma
Simian herpes Mucocutaneous ? B virus lesions Encephalitis Abbreviation: CNS, Central nervous system.
Sensory neurons
Kaposis sarcoma; multicentric Castlemans disease; primary effusion lymphoma None
Herpes simplex
El miembro prototipo de la familia herpesvirus es el virus herpes simplex (HSV). Existen dos tipos antignicos HHV-1 y HHV-2 que comparten actividad antignica cruzada, pero patrones de neutralizacin diferentes y producen patrones clnicos diferentes. Posee una cpside icosadrica de 162 capsmeros. El genoma del virus es de alrededor de 152 kbp, est constituido por ADN y su disposicin es bicatenario y lineal. La envoltura est constituida por una membrana lipdica, proveniente de la clula infectada al salir por brotacin. Dicha envoltura contiene espculas constituidas por glicoprotenas. Entre la envoltura y la cpside se encuentra el tegumento, formado por protenas virales, de aspecto denso a los electrones, cuyas propiedades y funciones se desconocen an.
EPIDEMIOLOGA
El husped natural siempre se ha credo que es el hombre, pero el virus es capaz de infectar varios animales incluyendo los roedores. Alrededor del 50% de los adultos son seropositivos para HHV-1, no as para el HHV-2 para el cual la seropositividad es algo menor. A los 30 aos alrededor del 25% de los americanos tienen anticuerpos anti-HHV-2, pudiendo llegar a prevalencias de 50% en algunas regiones de frica. La prevalencia y la incidencia de la infeccin por herpes genital ha ido incrementndose ao a ao. Ms de 45 millones de personas en Estados Unidos estn infectadas con HHV-2 y ms de un milln de nuevos casos se diagnostican por ao (figura 2). Herpes genital es la infeccin de transmisin sexual ms comn en Estados Unidos, as como en el resto del mundo. La seroincidencia de HHV-2 podra tomarse como marcador de cambio en los hbitos sexuales de la poblacin, especialmente en aquellas regiones de frica con alta incidencia entre adultos jvenes. En los pases desarrollados su importancia radica en el rol potencial de facilitacin de la transmisin del VIH. Este virus es altamente prevalente en las regiones donde existen epidemias severas por VIH. La infeccin se incrementa con la edad en forma marcada, llegando a valores de hasta 70% o ms, en mujeres adultas en algunos sitios de frica. Las lceras genitales incrementan el potencial infeccioso de los sujetos VIH positivos y la susceptibilidad de los sujetos seronegativos al VIH. Existe un efecto recproco entre la inmunodepresin que causa el VIH determinando la exacerbacin de los sntomas por el HHV-2, as como el incremento de la capacidad infectante y de diseminacin en los pacientes VIH positivos que presentan una infeccin concomitante por HHV-2. Los ltimos datos sugieren que HHV-2 sera responsable en una proporcin sustancial de las nuevas infecciones por VIH en algunas partes de frica. Se necesita entonces de medidas urgentes de control para HHV-2, las cuales incluyen: terapia supresiva antiviral sobre todo en grupos de alto riesgo,
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Figura 2. Seroprevalencia de virus Herpes simplex (HSV) en Estados Unidos (%)
1990 1980
1=12-19 2=20-29 3=30-39 4=40-49 5=50-59 6=60-69 7>70
educacin de forma de reducir la transmisin de HHV-2, se estn tratando de desarrollar vacunas y nuevos antivirales con dicho propsito. La grfica nos muestra la incidencia creciente, luego de infectados los pacientes persisten de por vida infectados, las recurrencias en general retroceden espontneamente para luego reaparecer nuevamente. Las infecciones ms importantes son las queratitis herpticas y las encefalitis. La incidencia del herpes genital ha aumentado en las ltimas dcadas, factores asociados a este incremento pueden ser la promiscuidad sexual, el uso de anticonceptivos orales y la ausencia del uso de mtodos de barrera. Factores predisponentes que favorecen la infeccin por HHV-2: Sexo: ms frecuente en mujeres. Raza: ms frecuente en raza negra. Estado civil: ms frecuente en divorciadas que en solteras o casadas. Residencia: ms frecuente en grandes ciudades. Nmero de compaeros sexuales: a mayor nmero mayor riesgo de infeccin.
REPLICACIN
El primer paso para que se de la replicacin viral es la interaccin de las glicoprotenas virales con los receptores celulares, lo que resulta en la fusin de la envoltura viral con la membrana celular. No es necesario que se produzca endocitosis, pero sta puede ocurrir como ruta alternativa de penetracin a la clula. Durante el attachment la glicoprotena C interacta con el heparansulfato, ubicado en la superficie de la membrana celular. Dicha interaccin es lbil hasta que las otras glicoprotenas como la B y D comienzan a participar en el proceso de entrada. La glicoprotena B tambin provee un sitio de interaccin con otros glicosaminoglicanos, mientras que la glicoprotena D provee de una unin estable a los receptores celulares, as
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como al mediador de la entrada del herpesvirus. La adsorcin tarda se asocia con cambios conformacionales de la glicoprotena D que ocurren luego de la unin al receptor, luego de lo cual ocurre la interaccin de gD con el complejo heterodmero gH/gL. Los dominios del complejo gH/gL y gB permiten la penetracin ph-independiente. El complejo gE/gI y gM interacta con los receptores a nivel de las uniones celulares facilitando as la diseminacin. Lo mismo sucede en las clulas no polarizadas, pero con la salvedad que no se produce la liberacin del virin clula a clula por la superficie basolateral de las clulas polarizadas. La glicoprotena K que no se encuentra incorporada al virin juega un rol esencial en la envoltura de la cpside durante el ensamblaje en la membrana nuclear, en el transporte del virin a la superficie celular y en su liberacin. Luego de la fusin se libera la cpside en el citoplasma, migrando la misma hacia el ncleo, el core entra por un poro nuclear y all se circulariza el genoma. El genoma viral esta compuesto por una nica regin larga, tiene elementos de repeticin internos y terminales. En el HSV 1 y 2 hay dos bloques de secuencias nicas designadas UI (nica larga) y Us (nica corta), cada una de las cuales esta unida por repetidores terminales. El genoma viral se acompaa de la protena alfa TIF cuya funcin se basa en activar la trascripcin viral inmediata por medio de factores celulares de trascripcin. La infeccin de clulas no neuronales con el HHV-1 determina la degradacin del RNAm del husped y la consiguiente inhibicin de la sntesis de protenas. De esta forma el virin regula la expresin de los genes virales y promueve la replicacin eficiente durante la replicacin ltica. Luego de entrar las protenas virales producen la disgregacin de los polirribosomas y la degradacin del RNA celular y viral. El virus permanece conservado en todas las especies neurotrpicas y de ah el establecimiento de la latencia, para lo cual tambin es importante la resistencia de las neuronas a la infeccin por VHS. En el ncleo la trascripcin del genoma es regulada en una cascada y se producen tres tipos distintos de RNAm. Si se bloquea el proceso brevemente luego de iniciada la infeccin, se acumulan los RNAm inmediatos tempranos en el ncleo no transcribindose otros RNAm. Todos los productos de los genes inmediatos tempranos regulan la transcripcin de los otros genes tempranos y tardos. La sntesis de los productos tempranos se producen antes de la replicacin del ADN viral y por eso actan enzimas que participan en el metabolismo del DNA como la timidinacinasa y la ribonucletido-reductasa, y enzimas que actan directamente en la replicacin del ADN, como la polimerasa ADN y la helicasa ADN, por tanto se inicia la replicacin del genoma. Adems de todo lo antedicho, tambin las protenas celulares se requieren para la replicacin del genoma, y la misma ocurre en el ncleo. Los productos de los genes tardos se producen luego de la replicacin del ADN e incluyen protenas estructurales. La capacidad de establecer latencia es una caracterstica de los herpesvirus. Entendemos a la latencia como la capacidad de generar una infeccin improductiva y reversible de una clula por un virus capaz de replicarse. Para que la misma se de, dichos virus deben ser capaces de evadir con xito la respuesta inmune y deben ser capaces de insertar su genoma en las clulas del husped, esto incluye tres fases separables: Establecimiento Mantenimiento Reactivacin
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Siguiendo la infeccin natural, el establecimiento de la latencia ocurre conjuntamente en las neuronas sensoriales que inervan el sitio de infeccin primario, la prdida de permisividad de por lo menos algunas de las neuronas sensoriales resulta en una falla del ciclo productivo de expresin gentica, y por tanto, una falla del ingreso al ciclo ltico. Las neuronas en donde se establece primariamente la latencia residen en el ganglio sensorial, aunque tambin existe evidencia de presencia de virus latente en el sistema nervioso central. La transcripcin de una porcin restringida del genoma ocurre durante la latencia, siendo dirigida por un solo promotor generando RNAs nucleares que se han designado como transcriptos asociados a latencia. Su funcin an no ha sido determinada, pero las mutantes presentan una lenta recuperacin o establecen latencia con eficiencia reducida, parecera que presentan un efecto de inhibicin de la apoptosis. Este efecto promovera la reactivacin y esta sera por tres mecanismos: Generando mas neuronas infectadas en estado latente para reactivaciones futuras. Protegiendo neuronas en las cuales ocurre la reactivacin. Protegiendo las neuronas no infectadas durante la reactivacin Herpesvirus ha desarrollado una cantidad de estrategias para modular la respuesta del husped. La replicacin del ADN es el sitio blanco de las drogas antivirales, siendo dichas drogas anlogos de nucletidos de cadena terminal (aciclovir, ganciclovir, ambos anlogos de la guanina). Existen frmacos ms recientes como el famciclovir, similar al aciclovir y valaciclovir, que es la prodroga del aciclovir. El aciclovir necesita una fosforilacin inicial, que es realizada por la timidinacinasa. Luego el monofosfato es convertido en trifosfato de aciclovir por las cinasas celulares, el cual es incorporado al ADN viral por la polimerasa viral. La base incorporada previene la elongacin de la cadena, dado que carece de la ribosa que tendra la molcula normal. El ganciclovir es ms efectivo contra citomegalovirus. Ambos frmacos presentan el problema que generan resistencia de dichos virus al frmaco, debido a mutaciones de la ADN polimerasa o en las cinasas. Las partculas virales se ensamblan en el ncleo, luego son clivados los productos y empaquetados dentro de cpsides preensambladas. La envoltura se obtiene de la hoja interna de la membrana nuclear, acumulndose las partculas entre ambas hojas. Cmo es transportado el virus hacia la superficie se desconoce an. Las protenas que se producen se incorporan al virin, el resto se acumula en el ncleo determinando la aparicin de cuerpos de inclusin nuclear.
PATOGENIA
La infeccin primaria ocurre a travs de abrasiones de la mucosa de la boca o de la faringe, va ocular, va genital, o por abrasiones de la piel. La mayora de los individuos se infectan en los primeros dos aos de vida, hecho este que se debe a su carcter universal. La infeccin inicial en general es asintomtica, aunque pueden aparecer lesiones locales de tipo vesicular. La multiplicacin local va seguida de viremia y de infeccin sistmica. Luego ocurre el periodo de infeccin latente, que se prolonga a lo largo de la vida con reactivaciones peridicas. La media de recurrencia luego de la primoinfeccin con HSV-2 es de cuatro a cinco episodios por ao, lo episodios primarios severos se asocian con tasas de recurrencias mayores. Durante la infeccin primaria el virus accede a los nervios sensoriales perifricos, migrando por los axones hasta los ganglios sensoriales en el sistema nervioso central. Durante la infeccin latente el
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ADN se mantiene en forma epismica, con expresin limitada de los genes, elemento este requerido para que se mantenga la latencia. El estado de latencia depende de: Factores fsicos de disturbio: lesin fsica, rayos UV, hormonas Estrs, depresin. La reactivacin del virus latente determina enfermedad recurrente, el virus desciende a travs del nervio sensorial a la superficie del cuerpo, se replica y causa dao tisular. En un mismo individuo, el herpes recurrente se manifiesta prcticamente siempre en la misma zona. Luego de perodo prodrmico caracterizado por ardor, disestesias, se forman flictenas o vesculas yuxtapuestas de contorno policclico que posteriormente van a progresar a la ulceracin. En general el HHV-1 se asocia con herpes oral y ocular, y el HHV-2 se asocia a lesiones genitales y anales.
PRESENTACIN CLNICA
La forma de presentacin pueden ser leves o graves, ya caracterizamos previamente cuales son, para los dos serotipos, las formas de presentacin mas frecuente. Nos interesa destacar aqu las formas graves, dadas las secuelas que generan en el paciente, pudiendo determinar en ocasiones compromiso vital. Herpes ocular Se trata de una queratoconjuntivitis a menudo unilateral, la lesin viene determinada por la accin citoptica del virus, as como tambin por la respuesta inflamatoria del husped, todo lo cual puede determinar compromiso vascular de la crnea, produciendo fibrosis de la misma con prdida de la visin. Encefalitis herptica En general se debe a una reactivacin viral, sobre todo en el adulto. Los dos serotipos pueden estar implicados. Se caracteriza en su inicio por trastorno de la conciencia, con prdida de atencin, tendencia al sueo, desorientacin temporal y espacial, y fotofobia. El diagnstico es clnico-microbiolgico, realizndose la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a punto de partida de lquido cefalorraqudeo (LCR), para deteccin de genoma viral. Se debe realizar tambin el estudio citoqumico del LCR, pudindose objetivar linfocitosis moderada con proteinorraquia variable. La precocidad del diagnstico y del inicio del tratamiento son fundamentales para evitar lesiones secuelares, as como la muerte del paciente. Herpes neonatal La transmisin viral se realiza en el perodo perinatal, la va transplacentaria es poco frecuente, en general el virus se encuentra en el tracto genital materno y el feto lo adquiere en su pasaje a travs del mismo. La afectacin es ms severa an si la madre cursa la primoinfeccin, dada la falta de anticuerpos maternos que atraviesen la placenta y generen proteccin para el feto. Puede ocurrir la infeccin asintomtica o tambin infecciones graves, estas ltimas se caracterizan por erupcin generalizada, hepatitis y encefalitis, y en general son mortales. La infeccin materna antes de las 20 semanas de embarazo se asocia con aborto espontneo. La infeccin del recin nacido puede evitarse si se evita el pasaje del mismo a travs del canal de parto mediante operacin cesrea.
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Herpes en inmunodeprimidos En todo paciente con dficit inmunitario, ya sea por tratamiento con inmunosupresores, en pacientes neoplsicos o en pacientes con SIDA, se pueden observar reactivaciones. Las mismas se caracterizan por lesiones cutaneomucosas extensas, as como afectacin de otros rganos, por ejemplo: hepatitis, encefalitis, neumonitis viral. Herpes y cncer de cuello uterino Existira una relacin significativa entre ambos, relacin esta que se basa en el poder oncognico que tienen estos virus, y en su capacidad de producir una infeccin latente y desviar el ciclo normal celular hacia la transformacin maligna. Se plantea adems su rol carcingeno eventual como cofactor junto con papilomavirus humano.
DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Diagnstico directo Pone en evidencia al virus o alguno de sus componentes.

Citologa
El examen citolgico permite observar imgenes que se ven en la infeccin herptica, tales como el hinchamiento celular y la marginacin de la cromatina, aunque esto no es especfico de los herpesvirus.
Bsqueda de antgenos virales
Se debe realizar recoleccin de clulas infectadas por dicho virus donde se encuentran expresados los antgenos virales. Esto se puede realizar: Por raspaje de lesiones y puesta en solucin isotnica Por centrifugacin de lquidos biolgicos Por aspiracin bronquial Por biopsia La presencia de antgenos se reconoce con anticuerpos monoclonales (anti-HHV-1 y anti-HHV-2) conjugados con fluorocromo o una enzima que permite revelarlos y objetivarlos al microscopio. La utilizacin de anticuerpos en tcnica inmunoenzimtica pone de manifiesto antgenos solubles extracelulares. Estas tcnicas tienen una sensibilidad menor que el cultivo viral.
Aislamiento en cultivos celulares
Existen numerosas lneas celulares que son susceptibles de infeccin por herpesvirus. En la prctica se utilizan clulas embrionarias humanas y lneas continuas de rin de mono. Es importante realizar toma de muestras correctamente y utilizar medio de transporte adecuado para conservacin viral. El efecto citoptico consiste en hinchamiento celular y desprendimiento celular progresivo del soporte (botella, microplaca, etc.). Algunas cepas pueden producir formacin de sincicios. Se puede esperar ver el efecto citoptico y luego realizar identificacin viral por tcnicas de inmunofluorescencia, utilizando anticuerpos monoclonales especficos. Tambin se puede utilizar la tcnica rpida por mtodo shell-vial, aumentando la velocidad de adsorcin viral por centrifugacin y revelando luego sobre el cultivo con anticuerpos monoclonales especficos.
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Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Esta tcnica es altamente sensible, tiene la capacidad de detectar de 10 a 108 copias del DNA de los herpesvirus en 20ul de muestra. En el caso de los HHV-2 la PCR tiene mayor sensibilidad que el cultivo celular. Diagnstico indirecto Las tcnicas indirectas ms comunes son las inmunoenzimticas (ELISA), inmunofluorescencia. Tambin se puede realizar Western Blot pero consume ms tiempo, es caro y tcnicamente difcil de implementar en larga escala; mientras que el ELISA se encuentra ms disponible y es ms fcil de realizar, de implementar y de evaluar. Se basan en la deteccin de epitopes tipo-especficos presentes en las glicoprotenas G y C.
TRATAMIENTO
La acycloguanosina acta como inhibidor competitivo de la ADN-polimerasa, solo en las clulas en que hay replicacin activa. La afinidad por la timidincinasa viral es 1000 veces mayor que para la timidincinasa celular. Las mutantes resistentes al aciclovir son timidincinasa negativas. La va intravenosa se utiliza en las infecciones graves tanto por herpesvirus 1 y 2 como por varicela zoster. Se puede realizar terapia episdica para tratamiento del herpes primario o de las recurrencias. En el caso de los herpes genitales se indica 400 mg 3 veces da de aciclovir por 5 das, o 500 mg 2 veces al da por 5 das de valaciclovir. Beneficios de la terapia: Disminucin del dolor (menos das). Curacin mas rpida (4 das). Menor duracin de contagio (2 das). No genera cambios en la recurrencia. Reduce la duracin de la recurrencia. 25-50% no progresan a lesin mayor que la inicial. Terapia supresiva: se indica 400mg 2 veces al da de aciclovir o valaciclovir 500 mg al da. Previene las recurrencias en 80-85% de los casos. La liberacin en pacientes sin clnica se reduce al 94%. Beneficios psicolgicos. Vacunas profilcticas y teraputicas Protegen contra la infeccin o contra la enfermedad. Han funcionado en animales. Las vacunas teraputicas estn destinadas a disminuir la frecuencia y la severidad de las recurrencias. Una vacuna debe inducir inmunidad mediada por clulas Th y es deseable que tambin se induzca una respuesta mucosa. Existen vacunas que estn siendo probadas en estudios clnicos contra HHV-2: Vacuna recombinante gB2, gD2 y MF59 con buena respuesta Th y de anticuerpos neutralizantes, pero no lo suficiente para un buen efecto teraputico y profilctico, por lo que se suspendi el estudio. Recombinante, gD2 con SBAS4 70% de eficacia contra HHV-2, pero no confiere proteccin para las pacientes que inicialmente eran seropositivas para HHV-1. nico ciclo (DISC) HSV2 induce anticuerpos neutralizantes y respuesta linfoproliferativa,
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mejora la respuesta producida por la infeccin natural por HSV-1. La nica desventaja es que debe darse frecuentemente.
Virus varicela zoster (VVZ)

La varicela y el zoster representan distintas manifestaciones clnicas de la infeccin por el mismo agente. La varicela es la primoinfeccin por el VVZ, mientras que el zoster es la reactivacin del virus latente.
HISTORIA
La varicela y el herpes zoster se consideraban entidades nosolgicas diferentes. La naturaleza infecciosa de ambas entidades fue definida por Von Bokay que observ la varicela en personas que mantenan contacto cercano con otras que sufran de herpes zoster. Kundratitz en 1925, demostr la aparicin de varicela en pacientes susceptibles al inocular lquido de una vescula de un paciente con herpes zoster. Desde principios del siglo XX similitudes en los rasgos histopatolgicos de las lesiones de piel, y en estudios epidemiolgicos e inmunolgicos, indicaban que la varicela y el herpes zoster eran causados por el mismo agente. El aislamiento del VVZ en 1958 permiti definir la biologa del virus. Aislamientos del virus de pacientes con varicela y con herpes zoster resultaron en cambios similares en los cultivos de tejidos, especficamente en la aparicin de inclusiones intranucleares eosinoflicas y clulas gigantes multinucleadas. En ese mismo ao, Weller y colaboradores fueron capaces de establecer que no existan diferencias entre ambos agentes virales aislados de pacientes con esas dos entidades clnicas distintas. Estudios posteriores del ADN viral confirmaron que se trataba del mismo agente.
TAXONOMA
Pertenece a la subfamilia Alphaherpesvirinae, junto con los virus herpes simplex tipo 1 y 2.
ESTRUCTURA
Su estructura es similar a los otros miembros de la familia herpesviridae. El genoma es un ADN lineal de doble cadena de 125 kb, y codifica aproximadamente 75 protenas. Las protenas incluyen por lo menos 30 polipptidos de los cuales 5 o 6 son glicosilados. Existen 2 regiones en el genoma viral, una larga de 105 kb, y una corta de 5.2 kb, cada una de estas 2 regiones contiene secuencias terminales repetitivas. En la replicacin la regin corta puede invertirse sobre s misma y resultar en dos formas isomricas. Cinco familias de las glicoprotenas del VVZ han sido identificadas: gp I, gp II, gp III, gp IV, y gp V. La infeccin viral puede ser neutralizada por anticuerpos monoclonales contra las protenas I, II y III. Como todo virus envuelto es un virus frgil, muy lbil a las temperaturas habituales y rpidamente inactivado fuera de las clulas. El aislamiento del virus necesita de la inoculacin sin demora en cultivos de tejido luego de un transporte rpido de la muestra al laboratorio.
MULTIPLICACIN EN EL LABORATORIO
El VVZ se multiplica en clulas humanas y la lnea diploide de fibroblastos humanos embrionarios MRC5, que es corrientemente utilizada para su aislamiento. El ciclo de replicacin in vitro se parece al de los HSV y es relativamente corto. Aproximadamente 8 a 10 horas postinoculacin se puede evidenciar el virus por inmunofluorescencia en la clulas adyacentes
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al foco inicial de inoculacin. El efecto citoptico se localiza en focos y la infeccin celular es lentamente citoltica. El virus se disemina de clula a clula por contacto directo por fusin de las membranas plasmticas.
EPIDEMIOLOGA
El hombre es el nico reservorio conocido para el VVZ y se infecta cuando este entra en contacto con la mucosa del tracto respiratorio superior o con las conjuntivas. El VVZ es un virus altamente contagioso, la transmisin de persona a persona tambin se produce por contacto directo con pacientes con lesiones de varicela, o menos frecuentemente zoster, y por diseminacin area de secreciones respiratorias. Tambin puede producirse la infeccin in tero como resultado del pasaje a travs de la placenta de virus durante la infeccin materna por VVZ. La infeccin por VVZ de un miembro de la familia habitualmente tiene como resultado la infeccin de prcticamente todas las personas susceptibles de la familia. En los climas templados la varicela es una enfermedad de la infancia, ms frecuente a fines de invierno y comienzos de la primavera. La mayor parte de los casos de varicela ocurre en nios menores de 10 aos. La inmunidad por lo general es de por vida. La inmunidad celular es ms importante que la inmunidad humoral, tanto para limitar la extensin de la infeccin primaria por VVZ, como para prevenir la reactivacin del virus en forma de herpes zoster. Se cree que la reinfeccin sintomtica es infrecuente en personas inmunocompetentes, aunque existe la reinfeccin asintomtica. La infeccin primaria asintomtica es poco habitual, pero en vista de que algunos casos son leves, puede no ser detectada. Las personas inmunocomprometidas con infeccin primaria (varicela) o recurrente (herpes zoster) corren mayor riesgo de enfermedad grave. Otros grupos de pacientes que pueden presentar enfermedad grave o complicada incluyen los lactantes, los adolescentes y adultos, los pacientes con trastornos ctaneos o pulmonares crnicos, y los que reciben corticoesteroides sistmicos y salicilatos a largo plazo. Los pacientes son ms contagiosos durante uno a dos das antes del comienzo de la erupcin y poco despus de ese momento. Sin embargo, la contagiosidad puede persitir hasta la formacin de costras en las lesiones. En los pacientes inmunocomprometidos con varicela, la contagiosidad probablemente dure todo el perodo de erupcin y de nuevas lesiones. El perodo de incubacin suele ser de 14 a 16 das y en ocasiones tan corto como 10 das o tan prolongado como 21 das despus del contacto. El zoster es una enfermedad espordica. Se trata de una reactivacin viral con expresin clnica. Afecta al 1 % de la poblacin cada ao y de ese 1%, el 50% tiene ms de 50 aos de edad. La forma muy localizada de la erupcin y la ausencia del virus en las vas areas hacen que la contagiosidad sea baja. Sin embargo, las vesculas contienen virus susceptibles para transmitir la varicela a un sujeto receptivo.
FISIOPATOLOGA
El virus se multiplica en la puerta de entrada en las clulas del tracto respiratorio superior, difunde rpidamente a los tejidos linfticos y se asocia, y luego se generaliza por viremia. El virus de la varicela puede afectar tambin a rganos blanco como la piel, donde se multiplica en las clulas de la epidermis provocando lesiones vesiculares caractersticas. El VVZ puede persistir en estado latente en los ganglios de las races raqudeas posteriores y en los ganglios sensitivos de los nervios craneanos. El mecanismo de latencia es desconocido. En el zoster el virus reactivado migra a lo largo de las fibras nerviosas sensitivas hasta el territorio cutneo correspondiente, donde se multiplica de nuevo, dando la erupcin caracterstica. En los sujetos afectados de enfermedades malignas, leucemia, enfermedad de Hodgking y en otros pacientes
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inmunodeprimidos, pueden existir mltiples recurrencias. Los traumatismos, las enfermedades intercurrentes y los tratamientos inmunosupresores son otros desencadenantes.
Varicela La varicela se manifiesta por un exantema vesicular generalizado y pruriginoso que comienza a nivel de la cabeza, luego se extiende a cuello, tronco y extremidades. La evolucin se realiza por empujes durante 2-4 das. Los elementos pasan por los estadios sucesivos de mcula, ppula, vescula y costra. Es caracterstico de la varicela presentar lesiones en distintos estadios evolutivos. Fiebre baja y sntomas sistmicos leves. La erupcin puede afectar la mucosa respiratoria, digestiva y genital. La evolucin en general es benigna, la curacin se produce en dos semanas sin cicatrices, salvo en caso de lesiones de rascado. Las complicaciones incluyen sobreinfeccin bacteriana de las lesiones cutneas, que es la complicacin ms frecuente, trombocitopenia, artritis, hepatitis, ataxia cerebelosa, encefalitis, meningitis o glomerulonefritis. Algunos casos de varicela pueden ser seguidos por un sndrome de Reye. En los nios inmunocomprometidos puede presentarse una forma grave de varicela caracterizada por una erupcin continua de lesiones y fiebre elevada en la segunda semana de la enfermedad, as como encefalitis, hepatitis o neumona. La varicela hemorrgica es ms frecuente en los pacientes inmunocomprometidos. Los nios con infeccin por VIH pueden desarrollar una varicela crnica o recurrente, con lesiones nuevas que aparecen durante meses. Herpes zoster El virus se establece en forma latente en los ganglios de las races dorsales durante la infeccin primaria. La reactivacin produce herpes zoster apareciendo lesiones vesiculares agrupadas en la distribucin de uno a tres dermatomas sensitivos, a veces acompaada de dolor localizado en el rea. La neuralgia postherptica se define como el dolor que persiste ms de un mes. El herpes zoster puede tornarse generalizado en los paciente inmunocomprometidos, con lesiones que aparecen fuera de los dermatomas primarios y con complicaciones viscerales. Varicela materno-fetal La infeccin fetal como consecuencia de una varicela materna en el primer trimestre o a comienzos del segundo trimestre de la gestacin puede producir una embriopata por varicela, que se caracteriza por atrofia de las extremidades y formacin de cicatrices en los miembros (sndrome de la varicela congnita). Tambin pueden haber manifestaciones del sistema nervioso central, y oculares. Los nios que han estado expuestos al VVZ in tero durante las segundas 20 semanas de la gestacin pueden desarrollar una varicela inaparente y un zoster posterior al comienzo de la vida, sin haber tenido varicela extrauterina. La infeccin por varicela puede ser mortal para un lactante si la madre contrae varicela entre los cinco das antes y los dos das despus del parto. Cuando la varicela se presenta en una mujer ms de 5 das antes del parto y la edad gestacional es de 28 semanas o ms, la gravedad de la enfermedad del neonato se modifica por la transferencia pasiva transplacentaria de anticuerpos IgG anti-virus varicela-zoster.
El diagnstico de varicela o zoster se basa generalmente en la anamnesis y el examen fsico del paciente. Las caractersticas de las lesiones y su localizacin son suficientes para el diagnstico,
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pero se recomienda la confirmacin del laboratorio en algunas poblaciones especiales como los inmunocomprometidos, ya que el virus puede causar complicaciones mortales debido a que el curso de la infeccin puede ser diferente del inmunocompetente. El VVZ puede aislarse a partir de raspados de la base de las vesculas durante los 3 a 4 primeros das de la lesin, pero raras veces a partir de otros sitios, entre ellos, las secreciones del tracto respiratorio. Mtodos directos Dentro de los mtodos directos para su diagnstico: Cultivo del VVZ: la recuperacin del virus en cultivos celulares insume tiempo, es costosa y su disponibilidad es limitada. Slo las muestras muy precoces contienen virus infecciosos. La muestra debera ser inoculada lo ms rpidamente posible en fibroblastos humanos (MRC5). El efecto citoptico se produce a nivel del ncleo y es caracterstico, se desarrolla en 3 a 7 das, se pueden detectar los antgenos en el cultivo celular por medio de anticuerpos monoclonales marcados con un fluorocromo o una inmunoperoxidasa. Demostracin de los antgenos del VVZ por inmunofluorescencia. Microscopa electrnica del lquido vesicular: esto muestra la presencia de partculas virales de tipo herpes pero no identifica el VVZ. PCR: tcnica altamente sensible, ha demostrado ser efectiva en la identificacin del VVZ en el LCR de pacientes con enfermedades neurolgicas y en biopsias de lesiones de pacientes HIV. Mtodos indirectos Pueden ser utilizados para completar los exmenes precedentes y en todos los casos donde la muestra cutnea no ha podido ser obtenida. Las tcnicas de aglutinacin en partculas de ltex, inmunofluorescencia y ELISA son las ms utilizadas. Un aumento significativo de los anticuerpos IgG sricos contra la varicela ( 4 veces el ttulo inicial) detectado por cualquiera de las pruebas serolgicas convencionales, puede confirmar en forma retrospectiva el diagnstico. No fiable en personas inmunocomprometidas.
TRATAMIENTO
Las medidas de higiene son importantes para prevenir la sobreinfeccin: bao diario, uas cortas y limpias, aplicacin tpica de drogas antipruriginosas. Para descender la temperatura se recomienda usar acetaminofn, evitando el uso de salicilatos que aumentan el riesgo de sndrome de Reye. La varicela y el herpes zoster pueden tratarse con aciclovir valaciclovir, famciclovir y foscarnet, por va intravenosa u oral. La decisin de administrar un tratamiento y la duracin de ste debe tomarse teniendo en cuenta factores especficos del husped, la magnitud de la infeccin y la respuesta inicial a la terapia. En los huspedes inmunocompetentes la mayor parte de la replicacin viral ha cesado a las 72 horas despus de la aparicin del exantema, la duracin es mayor en los huspedes inmunocomprometidos. El aciclovir oral no se recomienda para el uso sistemtico en nios sanos con varicela. Debe considerarse en pacientes sanos con riesgo ms elevado de varicela moderada a grave, como los pacientes mayores de 12 aos, los pacientes con trastornos cutneos o pulmonares crnicos, los que reciben tratamiento crnico con salicilatos y los pacientes que reciben series cortas, intermitentes de corticoesteroides, o por va inhalatoria. En los pacientes inmunocomprometidos se recomienda el tratamiento intravenoso. El tratamiento iniciado precozmente en el curso de la enfermedad, especialmente
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dentro de las 24 horas del comienzo del exantema, tiene eficacia mxima. El valaciclovir y famciclovir han sido aprobados para el tratamiento del herpes zoster en adultos, pero no se dispone de frmulas peditricas. Las infecciones resistentes al aciclovir deben ser tratadas con foscarnet parenteral.
PREVENCIN
Inmunizacin pasiva Las personas susceptibles con riesgo elevado de desarrollar una varicela grave deben recibir inmunoglobulina anti-VVZ (VZIG) dentro de las 96 horas postexposicin, para lograr la eficacia mxima se la debe administrar lo antes posible. Inmunizacin activa La vacuna contra la varicela es un preparado de virus vivos atenuados de la cepa Oka salvaje, propagada y atenuada en forma seriada. El producto contiene cantidades mnimas de neomicina y gelatina. Fue aprobada en marzo 1995 por la FDA (Food and Drug Administration) de Estados Unidos, para el uso en personas sanas de 12 meses de edad o mayores que no hayan tenido varicela. Integra nuestro esquema nacional de vacunacin desde el ao 1999. Dosis: se administra por va subcutnea en dosis nica 0.5 ml entre los 12 meses y 13 aos de edad. Por encima de sa edad se recomiendan dos dosis separadas entre s de cuatro a ocho semanas. Indicaciones: a partir de los 12 meses de edad se recomienda a todos los que no hayan padecido la enfermedad, excepto las embarazadas. De forma particular en nios con leucemia linfoblstica (luego de un ao de remisin), tumores slidos malignos, enfermedades crnicas y en programa de transplante de acuerdo a los protocolos respectivos. Presenta las mismas contraindicaciones que para cualquier vacuna a virus vivo atenuado (ver captulo 32, Inmunoprofilaxis. Vacunas). Inmunogenicidad: ms del 95 % de los nios sanos inmunizados de 12 meses a 12 aos desarrollan una respuesta inmune humoral y mediada por clulas contra el VVZ, despus de una sola dosis de vacuna contra varicela. En las personas de 13 aos y mayores las tasas de seroconversin son del 78 al 82% despus de una dosis y del 99 % luego de dos dosis.
Citomegalovirus (CMV)
INTRODUCCIN
Citomegalovirus humano pertenece a la subfamilia betaherpesvirinae. Su nombre deriva de la observacin que las clulas infectadas aumentan de tamao en forma manifiesta y, concomitantemente, presentan inclusiones intranucleares y una voluminosa inclusin intracitoplasmtica en la concaviadad del ncleo y pericentriolar. Estas clulas fueron observadas en 1904 en los rganos de lactantes nacidos muertos. CMV humano fue aislado por primera vez de las glndulas salivales humanas y el trmino citomegalovirus se propuso para reemplazar al de virus de las glndulas salivales o cytomegalic inclusion disease virus en 1960. Su importancia radica en que la infeccin es comn en todas las poblaciones y la enfermedad vara desde la infeccin subclnica, hasta el desarrollo de una mononucleosis infecciosa. En los inmunocomprometidos CMV produce enfermedad severa en el pulmn, hgado, rin, y corazn, sobretodo en pacientes receptores de trasplantes de rganos. En pacientes con SIDA CMV es el patgeno viral ms comn.
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CARACTERSTICAS DEL VIRUS
Se caracteriza por una alta especificad de husped, un ciclo de replicacin largo y, como todo herpesvirus, CMV tiene la habilidad de establecer infeccin latente en el husped luego de la infeccin primaria. El mecanismo exacto que establece la latencia an no se conoce exactamente pero se sabe que polimorfonucleares, linfocitos T, clulas endoteliales vasculares, clulas epiteliales renales y glndulas salivales alojan el virus en un estado no replicativo o de replicacin muy lenta. La reactivacin de su estado de latencia puede ocurrir luego de inmunosupresin, otras enfermedades, o luego del uso de agentes quimioteraputicos.
ESTRUCTURA
Es un virus de alrededor de 200 nm de dimetro con una cpside icosadrica constituda por 162 capsmeros, un tegumento y una envoltura. El genoma de ADN es el ms largo y complejo de los genomas de Herpesviridae, con una molcula de ADN lineal, bicatenaria con 240.000 pb y un peso molecular de 230 millones Da. El genoma ha sido secuenciado completamente y codifica para 230 protenas, entre las cuales, muchas juegan un rol en la modulacin de la respuesta inmune del husped. Algunas previenen que las molculas HLA 1 celulares alcancen la superficie de la clula, de sta manera no hay asociacin entre las molculas HLA 1 y los glicoprotenas virales en la superficie de la clula no siendo destruida sta clula infectada por los linfocitos T CD8, permitiendo al genoma de CMV permanecer en la clula infectada. No todas las protenas han sido identificadas y an no se conoce la funcin de muchas de ellas. Todos los genomas de los CMV humanos tienen por lo menos un 90% de homologa entre ellos, pero todas las cepas tienen perfiles de restriccin diferentes que constituyen marcadores epidemiolgicos. Ciertas regiones de genoma del CMV tienen homologa con secuencias del ADN celular. Tambin codifica una ADN polimerasa que es un blanco para las drogas antivirales. La cpside est constituida por 2 protenas principales, una mayor de 153 Kd y una menor 34 Kd, y 2 protena pequeas de 28 y 11 Kd. Posee una protena bsica 52 Kd ligada al ADN y una protena de 38 Kd presente nicamente en las partculas no infecciosas, que contribuye al ensamblaje de las partculas virales. Estas protenas se organizan en 162 cpsomeros. El tegumento est constituido por 5 protenas fosforiladas de las cuales dos son muy inmunognicas: 150 y pp 65, sta ltima es importante para el diagnstico de CMV, y puede ser detectada en las clulas infectadas de los pacientes por IF o inmunoperoxidasa. Glicoprotenas de envoltura: resultan del clivaje de una poliprotena precursora presente en las clulas infectadas pero ausente en los viriones. Estas glicoprotenas portan los eptopes inductores de anticuerpos neutralizantes. An no se conoce el receptor celular que sirve para la adsorcin viral. La penetracin a la clula est mediada por un proceso de endocitosis. Luego se produce la replicacin del virus, ocurre en el ncleo de la clula y las largas inclusiones intranucleares que se observan en las clulas infectadas de pacientes corresponden a agregados de nucleoprotenas que se estn produciendo.
MULTIPLICACIN
La multiplicacin del CMV humano es dependiente del tipo celular In vitro: el fibroblasto embrionario humano es la nica clula sensible y productiva. In vivo: ya mencionamos que numerosos tipos celulares son infectados. El ciclo de replicacin es de 96 a 120 horas. Se observan sucesivamente: Transcripcin de ARN mensajeros muy precoces, traducidos en protenas muy precoces,
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antignicas (IEA, inmediate early antigen) que regulan las transcripciones ulteriores. Los ARN mensajeros precoces se traducen en protenas precoces antignicas (EA: early antigen), ellas estn implicadas en el efecto citoptico, estimulan la sntesis de ADN, ARN, y de protenas en la clula infectada. Entre ellas se encuentra la ADN polimerasa. La replicacin del ADN comienza a las 12 horas de iniciada la infeccin. Los ARN mensajeros tardos son transcriptos en protenas tardas antignicas (LA: late antigen) de las cuales la mayora son protenas y glicoprotenas de estructura. Las nucleocpsides virales aparecen en el ncleo a las 48 horas postinfeccin, luego se envuelven en la hoja interna de la membrana nuclear al migrar al citoplasma. En el citoplasma adquieren las protenas de tegumento, cuya sntesis en exceso en los sacos del aparato de Golgi, forman los cuerpos densos. La clula se destruye al cuarto o quinto da.
EPIDEMIOLOGA
El CMV es altamente especfico de especie y se sabe que slo las cepas humanas causan enfermedad en el hombre. Este virus es ubicuo y se transmite horizontalmente por contacto directo de una persona con otra, cuyas secreciones (orina, saliva, semen, lgrimas y leche) contienen el virus, verticalmente de la madre al hijo antes, durante o despus del nacimiento, y por medio de transfusiones de sangre infectada. Las infecciones no presentan caractersticas estacionales. Puede ocurrir infeccin primaria como secundaria por CMV. La infeccin primaria ocurre en pacientes seronegativos, es decir que nunca estuvieron infectados con CMV. La infeccin secundaria ocurre cuando se reactiva del estado latente el virus o cuando ocurre una reinfeccin en una persona inmune seropositiva para CMV. Adultos y nios pueden ser infectados con mltiples cepas. Se ha demostrado que pacientes con SIDA tienen diferentes cepas presentes a la vez en la orina. La manifestacin clnica por CMV puede resultar tanto de la infeccin primaria como de la secundaria, aunque en la primoinfeccin generalmente el virus se replica a un nivel ms alto y la enfermedad es ms severa. Si bien es probable que la transmisin horizontal sea el resultado de la contaminacin con saliva o de la transmisin sexual, el contacto con orina infectada tambin puede tener importancia. Las personas seropositivas sanas albergan CMV latentes en los leucocitos y los tejidos, por lo tanto, las transfusiones de sangre y los trasplantes de rganos pueden transmitir el virus. El CMV latente se reactiva con frecuencia en las personas inmunosuprimidas y puede producir enfermedad si la inmunosupresin es severa. Aunque la infeccin del feto in tero puede ocurrir despus de la primoinfeccin de la madre, o despus de la reactivacin de la infeccin materna durante el embarazo, la secuelas son mucho ms frecuentes en los lactantes infectados como resultado de la primoinfeccin materna.
Las caractersticas clnicas de la infeccin a CMV dependen del individuo, de su grado de inmunocompetencia, de circunstancias intercurrentes y del modo de contagio. Las infecciones graves se observan en los fetos y en los recin nacidos, en pacientes con colagenopatas, diabticos, con hemopatas o con cncer, esplenectomizados, receptores de trasplantes, tratamientos inmunosupresores y en las inmunodepresiones congnitas o adquiridas. Primoinfeccin En la mayora de los casos no tiene traduccin clnica o se acompaa de sintomatologa banal como un sndrome gripal. Puede existir diarrea, artralgias, eritema y una esplenomegalia una de cada tres veces. Se observa un sndrome mononuclesido sin aglutininas heterfilas con
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una leucocitosis aumentada o normal, una inversin de la frmula leucocitaria, la presencia de clulas atpicas mononucleares basfilas y, a veces, una anemia hemoltica o una trombopenia. El 50% de los sndromes mononuclesidos que cursan sin aglutininas heterfilas son debidos a CMV. Muy a menudo las transaminasas estn moderadamente aumentadas. La afectacin clnica de un rgano es excepcional en el sujeto inmunocompetente (neumopata, miocarditis, hepatitis, ulceraciones gastrointestinales, meningoencefalitis, polirradiculoneuritis). La curacin lleva de tres a cuatro semanas, la normalizacin de los signos biolgicos y la desaparicin de la fatiga son muy lentas. La excrecin viral en la orina es prolongada. En la infeccin a CMV se notan anomalas inmunopatolgicas: las grandes clulas mononucleares son los linfocitos T8 activados y la relacin T4/T8 est invertida, por aumento de los T8 ms que por disminucin de los T4 durante varias semanas. Los test de hipersensibilidad retardada son negativos. La sensibilidad a las infecciones intercurrentes est aumentada, los anticuerpos antinucleares anti-msculo liso, las aglutininas fras, las crioglobulinas, el factor reumatoideo, y los complejos inmunes circulantes, tambin pueden ser detectados. Infeccin postransfusional El CMV es responsable del 70% de los sndromes mononuclesidos que sobrevienen 3 a 4 semanas luego de transfusiones abundantes en un receptor no inmunizado e inmunocompetente. La infeccin puede ser grave en el recin nacido, en particular el prematuro hijo de madre seronegativa y exanguinotransfundido con sangre de donante seropositivo. La probabilidad de la infeccin es de 50% y representa una de las causas de neuropatas mortales observadas al mes de vida. Infeccin en la mujer embarazada e infeccin perinatal La infeccin congnita presenta un espectro de manifestaciones pero habitualmente es asintomtica. En algunos lactantes con infeccin congnita que parecen asintomticos al nacer, posteriormente se detecta una prdida auditiva o discapacidad para el aprendizaje. Aproximadamente el 5% de los lactantes con infeccin congnita por CMV tienen un compromiso profundo con retardo del crecimiento intrauterino, ictericia neonatal, prpura, hepatoesplenomegalia, microcefalia, dao enceflico, calcificaciones intracerebrales y retinitis. Aproximadamente el 15% de los lactantes nacidos despus de la infeccin primaria de sus madres, presentarn una o ms secuelas de la infeccin intrauterina. La infeccin adquirida al nacer o poco tiempo despus, a partir de secreciones cervicales maternas o de leche humana, habitualmente no se asocia con enfermedad clnica. Infeccin por CMV en receptores de trasplantes de rganos Se puede tratar de: Primoinfeccin: sujetos seronegativos que reciben un rgano de un donante seropositivo. Un 70 a 90% de los trasplantados renales en esta situacin desarrollan primoinfeccin. Reactivacin: se trata de un receptor seropositivo antes del trasplante, que reactiva los virus endgenos y latentes a causa de la inmunosupresin. Sobreinfeccin: receptor seropositivo sobreinfectado por la cepa del donante seropositivo. Los sujetos trasplantados pueden tambin ser infectados por el CMV transmitido en el curso de una transfusin sangunea. La incidencia de la enfermedad no es la misma en los tres casos citados: 60% en pacientes con primoinfeccin, 20% en caso de reactivacin y 40% en caso de sobreinfeccin. Entre los sntomas ms frecuentes citamos: fiebre prolongada, neutro-
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penia, trombocitopenia, toque digestivo y coriorretinitis. Ms raramente pueden desarrollar neumopata intersticial, que es la ms frecuente de las formas graves de infeccin por CMV en el paciente trasplantado. A mayor inmunosupresin mayor riesgo de enfermedad grave. Hay una correlacin entre el rechazo al trasplante renal, la aparicin de una reaccin de injerto contra husped y la aparicin de una infeccin por CMV. Infeccin por CMV en VIH positivos La gran inmunodepresin causada por la infeccin por el VIH resulta en un defecto en la inmunidad celular, que predispone a muchas infecciones, incluida la del CMV. Los pacientes infectados por el VIH-1 con recuentos de CD4 menores de 100 clulas/mm3 tienen un riesgo aumentado de desarrollar enfermedad severa por CMV. CMV es uno de los agentes oportunistas virales ms frecuentes en los pacientes con SIDA. La retinitis por CMV es por lejos la forma ms comn de enfermedad cuando el conteo de CD4 es menor de 50 clulas/mm3 pudiendo llevar a la ceguera en 4 a 6 meses.
Mtodos directos La infeccin por CMV se pone en evidencia en el microscopio ptico por las preparaciones citolgicas o histolgicas. Se pueden observar: clulas gigantes con una inclusin intranuclear en ojo de pescado, en las orinas de los recin nacidos afectados de citomegalia generalizada, en los lquidos amniticos, en los lavados bronquioalveolares y en las biopsias de rganos. Este mtodo diagnstico es carente de sensibilidad. Aislamiento en cultivo celular: es el mtodo gold standard. El aislamiento del virus se puede realizar en la lnea diploide de fibroblastos humanos embrionarios (MRC5) a partir de muestras transportadas en un medio para el mantenimiento de la viabilidad viral. Estas muestras pueden ser orina, sangre, aspirados nasales o bronquiales, lavados bronquioalveolares y lquido cefalorraqudeo. La presencia de CMV se puede revelar por la aparicin de un efecto citoptico caracterstico: focos de clulas ovales voluminosas refringentes de crecimiento lento segn el eje mayor de los fibroblastos, aunque las lesiones celulares no son visibles antes de las dos o tres semanas. Se puede realizar la bsqueda de antgenos con anticuerpos monoclonales anticitomegalovirus marcados con un fluorocromo o con enzimas, esto permite detectar la presencia del virus antes de la aparicin del efecto citoptico. La sensibilidad del mtodo aumenta cuatro veces por centrifugacin de la muestra sobre los cultivos celulares. Deteccin directa de antgenos por inmunomarcado: la sensibilidad y especificidad del examen microscpico puede ser aumentada por el empleo de anticuerpos anti-CMV detectando los antgenos de CMV intranucleares por un mtodo inmunocitoqumico. La deteccin de antgenos de CMV intracelulares por las tcnicas de IF o inmunoperoxidasa son realizables a partir de muestras de orina, de aspirados bronquiales, de lavados bronquioalveolares, de los leucocitos y de las biopsias. Deteccin de genomas de CMV por hibridacin molecular. Recientemente se dispone de sondas muy especficas as como sistemas de marcacin no radiactivos. PCR, tcnica altamente sensible y especfica, til para la deteccin de la infeccin an cuando esta persista en forma latente. Esta tcnica se encuentra disponible en los laboratorios especializados. Presenta utilidad tambin para los estudios de epidemiologa molecular, es decir, determinar si la cepa del virus que circula en un grupo determinado corresponde o no a un mismo perfil de restriccin.
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Mtodos indirectos Se puede realizar por: ELISA, IF, o fijacin del complemento buscando IgM e IgG antiCMV. Las inmunoglobulinas G anti-CMV pueden testimoniar el estado de un portador latente del virus, permiten reconocer el estado inmunitario distinguiendo los sujetos seropositivos. Estos anticuerpos aumentan en las infecciones primarias y en las recidivas. La bsqueda de IgM anti-CMV demuestra, en general, una infeccin viral activa. Son detectables en infecciones primarias, a veces en recidivas y pueden faltar en los sujetos inmunodeprimidos o ser inespecficos.
INDICACIN DE EXMENES
El diagnstico de una primoinfeccin se confirma por la seroconversin de anticuerpos IgG o la aparicin de IgM anti-CMV en un paciente virmico o excretor. El diagnstico de infeccin latente para buscar individuos potencialmente transmisores se basa en la presencia de anticuerpos IgG sricos o totales. Todo donante seropositivo es considerado a priori como un transmisor potencial. El diagnstico de infeccin congnita se basa en la obtencin de muestras dentro de las tres semanas posteriores al nacimiento. El aislamiento del virus se considera diagnstico. La diferenciacin entre infeccin intrauterina y perinatal es difcil, posteriormente en la infancia, a menos que se presenten manifestaciones clnicas de la primera como por ejemplo: coriorretinitis o ventriculitis. Una prueba para anticuerpos IgM anti-CMV positiva en suero durante la primera infancia es sugestiva pero no diagnstica, y resulta menos til posteriormente.
PREVENCIN
No existe una vacuna contra el CMV. Al asistir a los pacientes, dado que puede haber infecciones asintomticas, deben emplearse los procedimientos de control de infecciones como el lavado cuidadoso de las manos y otras prcticas higinicas. Es prudencial prevenir la exposicin de los pacientes gravemente inmunocomprometidos a casos reconocidos de infeccin por CMV. Se ha desarrollado la inmunoglobulina anti-CMV para la profilaxis de la enfermedad en los pacientes seronegativos receptores de trasplantes. La transmisin del CMV por transfusin sangunea ha sido prcticamente eliminada por el uso de donantes seronegativos para CMV, por la congelacin de los glbulos rojos con glicerol antes de su administracin, por la eliminacin de la capa leucocitaria o por la filtracin para eliminar los glbulos blancos. La pasteurizacin o la congelacin de la leche humana donada pueden reducir la probabilidad de transmisin del CMV. El tratamiento de los receptores de trasplantes con aciclovir o ganciclovir al comienzo de la viremia por CMV puede prevenir una enfermedad grave.
TRATAMIENTO
El ganciclovir es un anlogo nucleosdico de la guanina que se fosforila a una forma activa por las quinasas celulares, inhibiendo en forma competitiva la incorporacin del nucletido fisiolgico en la cadena de ADN viral, disminuyendo de este modo la replicacin viral, pero no suprimindola totalmente. Inhibe mucho ms la ADN polimerasa viral que la ADN polimerasa celular y se fosforila 10 veces ms en las clulas infectadas por CMV que en las clulas no infectadas. Es beneficioso para tratar la retinitis causada por la infeccin adquirida o recidivante por CMV en pacientes infectados por el VIH. Tambin puede ser til en otros tipos de compromiso orgnico por CMV. Se ha informado que la combinacin de inmuno-
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globulina intravenosa anti-CMV y ganciclovir intravenoso es sinrgica para el tratamiento de la neumona por CMV. El foscarnet tambin ha sido aprobado para el tratamiento de la retinitis por CMV y es una droga alternativa.
Virus de Epstein-Barr (VEB)

INTRODUCCIN
El virus de Epstein-Barr es el agente de la mononucleosis infecciosa. Induce linfomas en los pacientes inmunodeprimidos y se asocia a dos tumores: el linfoma de Burkitt y el carcinoma rinofarngeo indiferenciado. En 1958 Burkitt describi un linfoma maligno en frica, en la cual la distribucin geogrfica pareca orientar a una transmisin por vectores y por virus. En 1964 Epstein y colaboradores cultivaron in vitro clulas de linfoma de Burkitt y descubrieron partculas virales de tipo herpes al visualizarlas al microscopio electrnico. En 1966 W. y G Henle utilizaron como antgenos las clulas infectadas detectando anticuerpos elevados en los sueros de pacientes con linfoma de Burkitt. Esos antgenos tambin fueron reconocidos por anticuerpos existentes en el suero de pacientes que haban padecido una mononucleosis infecciosa. Los mismos autores encontraron que alrededor del 90% de los habitantes de Estados Unidos posean esos anticuerpos anti-VEB. Estudios seroepidemiolgicos tambin sugirieron la relacin entre el VEB y el carcinoma rinofarngeo indiferenciado. La capacidad de este virus de inmortalizar linfocitos B in vitro y de inducir linfomas en primates llev a considerar al VEB como un potencial agente oncognico en el hombre. Estudios ms recientes lo han relacionado con una gran variedad de cnceres linfoides.
ESTRUCTURA
Posee la morfologa y estructura general de los miembros de la familia Herpesviridae. Pertenece a la subfamilia gammaherpesvirinae. Su genoma est compuesto por un ADN doble cadena con alrededor de 172.000 pb y codifica alrededor de 80 protenas.
MULTIPLICACIN
El rango de huspedes del virus es limitado. In vitro el cultivo del virus ha sido descrito principalmente en linfocitos B y clulas epiteliales nasofarngeas humanas. El virus generalmente no produce un efecto citoptico en las clulas infectadas. Luego de la infeccin por VEB los linfocitos que contienen el genoma del VEB son capaces de un crecimiento continuo in vitro: transformacin o inmortalizacin. Se ha confirmado al VEB como un virus oncognico, debido a la deteccin de antgenos virales por IF dentro del ncleo de clulas transformadas, o por hibridacin del ADN celular con ADN del VEB purificado. Los receptores para el VEB se pueden demostrar en linfocitos B y en las clulas epiteliales nasofarngeas humanas. Los receptores para el VEB estn presentes tambin en una pequea cantidad en los linfocitos no B no T. El receptor del linfocito B es el antgeno CD21 o CR21 que puede unirse al VEB y al componente C3d del complemento. La partcula viral se adsorbe por su glicoprotena de envoltura gp350/300 a los mencionados receptores; fusionndose la envoltura viral y la membrana plasmtica externa de la clula, penetrando la nucleocpside dentro del citoplasma. Luego de la decapsidacin el complejo nucleoprotico es transportado al ncleo donde va a comenzar la sntesis viral. La falta de expresin del receptor CD21 en las clulas epiteliales hace pensar que un receptor de alternativa es responsable de la infeccin de las mismas.
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En suma, en la replicacin del VEB se pueden observar dos situaciones: Una infeccin que conduce a un ciclo replicativo terminando en la produccin de nuevos viriones y la lisis celular. Proliferacin celular continua donde slo los genes virales de latencia son expresados.
Nomenclatura de los antigenos del VEB EBNA antgenos nucleares de VEB LMP protenas de membrana latentes EA antgenos tempranos VCA antgenos de la cpside viral LMA antgenos de la membrana tardos
Luego de la unin al receptor el virus penetra a los linfocitos B susceptibles. Antes de la deteccin de las protenas sintetizadas por el virus, los EBNA (antgenos nucleares del VEB) pueden detectarse en el ncleo de las clulas infectadas. En las clulas transformadas provenientes de pacientes con mononucleosis infecciosa o linfoma de Burkitt, parte del ADN puede ser incorporado al ADN de la clula husped, aunque la mayora del ADN permanezca en forma circular no integrada, conocida como episoma. La integracin lineal del ADN del VEB en el ADN de la clula husped puede ser aumentada por la estimulacin de mitgenos de las clulas B, como el lipopolisacrido de las bacterias en el momento de la transformacin. La clula husped gana la capacidad de inmortalizacin cuando el virus se presenta integrado, o en forma de episoma, o en una combinacin de las 2 formas. La inmortalizacin de los linfocitos B es un proceso complejo que requiere una interaccin coordinada entre los productos de los genes celulares y virales. La infeccin latente de las clulas B por VEB est determinada por la unin de la protena EBNA-1 a un promotor viral llamado oriP . EBNA-1 interacciona con EBNA-2, la cual a su vez activa la produccin de tres protenas de membrana latentes del VEB (LMP-1, 2A, y 2B), as como tambin, varios productos de genes de la clula B (CD21, CD23 y c-fgr). LMP-1 activa la produccin de varias protenas de adhesin celular as como tambin un factor de crecimiento autcrino de clulas B (CD23). LMP1 puede jugar un rol importante en la transformacin oncognica de las clulas, evitando la apoptosis (muerte celular programada). En el ciclo ltico, a diferencia del anterior, luego de la sntesis de las protenas muy precoces, que corresponden a los genes de latencia viral, constitudas por los EBNA y LMP , se sintetizan las protenas llamadas precoces (antgenos EA), que son fundamentalmente las enzimas necesarias para la replicacin del ADN viral, entran en juego y van a permitir la produccin de nuevos genomas virales. Por ltimo se transcriben los genes tardos que incluyen a las protenas de estructura (VCA: antgenos de la cpside viral; y LMA: antgeno de membrana tardos). La nucleocpside ensamblada en el ncleo sale por brotacin, a travs de las membranas nucleares o intracitoplasmticas, y el virin terminado en el citoplasma abandona la clula produciendo la lisis celular. Esta produccin viral, consecuencia de la lisis celular, se produce fundamentalmente in vivo en las clulas epiteliales de la orofaringe y de las glndulas salivales.
EPIDEMIOLOGA
Los seres humanos constituyen la nica fuente del VEB. En la mayora de los casos la infeccin por VEB es asintomtica, infectando a ms del 95% de los individuos adultos. La primoinfeccin es tanto ms precoz cuanto ms precarias son las condiciones socioeconmicas. En
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estos casos, la edad ms frecuente es entre 1 y 4 aos. En los pases desarrollados slo el 50% de los nios de 5 aos poseen anticuerpos, y la primoinfeccin se retarda a menudo hasta la adolescencia o se ve en el adulto joven. Alrededor de la mitad de estas infecciones primarias tardas (luego de los 15 aos) son infecciones sintomticas en las que la forma comn es la mononucleosis infecciosa. Esta se ve a menudo entre los 15 y 30 aos y en menor grado en el nio, pero existe tambin en el adulto y en la persona aosa. En los individuos infectados el virus se encuentra en la saliva, pudiendo excretarse all por mucho tiempo luego de la curacin. La excrecin intermitente dura de por vida. Es un virus muy frgil que necesita para su transmisin un contacto estrecho entre los individuos, por ejemplo por intermedio de la saliva. En el nio la transmisin se hace a partir de la madre u otros nios por los objetos cubiertos de saliva o por el beso. En el adulto joven el contagio se produce muchas veces a partir del beso, motivo por el cual la enfermedad se conoce con el nombre de enfermedad del beso. El virus puede ser transmitido tambin por transfusiones sanguneas y por concentrados globulares.
FISIOPATOLOGA
El virus penetra a nivel de la orofaringe donde se multiplica, afectando rpidamente a los linfocitos de la sangre circulante. Este perodo corresponde al de incubacin que dura entre 30 y 50 das. Los linfocitos B infectados expresan los antgenos del virus provocando una reaccin importante de linfocitos T que va a destruir especficamente a los linfocitos B infectados. Estos linfocitos T activados constituyen la mayor parte de los linfocitos atpicos circulantes. Esta respuesta inmune mediada por clulas explica algunos de los signos clnicos observados en la mononucleosis infecciosa (MI), como las adenopatas, angina, etc. La MI es una enfermedad linfoproliferativa generalizada y transitoria, en general benigna, que afecta a todos los tejidos linfoides, en particular las amgdalas, los ganglios y el bazo. Luego de una infeccin sintomtica la inmunidad contra una reinfeccin es duradera, lo mismo que luego de una infeccin inaparente. El virus persiste en forma latente a nivel de la cavidad bucal (excrecin crnica de viriones en la saliva) fuente posible a partir de la cual los linfocitos B se infectaran y se inmortalizaran regularmente.
La MI se manifiesta tpicamente por fiebre, faringitis exudativa, linfadenopatas, hepatoesplenomegalia y linfocitosis atpica. El espectro de enfermedades es variable e incluye desde la infeccin asintomtica hasta la infeccin fatal. Las complicaciones del sistema nervioso central incluyen: meningitis asptica, encefalitis, y sndrome de Guillain-Barr. Las complicaciones raras incluyen ruptura esplnica, trombocitopenia, agranulocitosis, anemia hemoltica, sndrome hemofagocitario, orquitis y miocarditis. Si evoluciona sin complicaciones la curacin se puede dar en dos a tres semanas. La infeccin puede ser muy grave en los nios que padecen dficit inmunitarios. Dicha infeccin puede causar linfomas no Hodgkinianos y ms raramente neumona intersticial, en el curso de inmunodepresin adquiridas como los trasplantes de rganos y el SIDA. Linfoma de Burkitt En las zonas endmicas como frica se ha descrito en nios entre 3 y 10 aos con localizacin anatmica fundamentalmente a nivel maxilar o abdominal. Esto se debe a la proliferacin cancerosa de una clona de linfocitos B que a menudo contienen el genoma del VEB. Los
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criterios de asociacin de este tumor con el VEB se basan en: La presencia del ADN viral y del antgeno EBNA en las clulas cancerosas. Deteccin de anticuerpos humorales a ttulos elevados contra los antgenos VCA y EA. En zonas endmicas el linfoma de Burkitt est asociado al VEB en el 96% de los casos. En las zonas no endmicas como Europa o Estados Unidos, el VEB est asociado slo en el 15% de los casos, siendo los linfomas de Burkitt en sujetos con VIH el 50% de los casos en estas regiones. Carcinoma rinofarngeo Tambin se ha detectado ADN viral y el antgeno EBNA en las clulas cancerosas y ttulos elevados de anticuerpos VCA y EA. El carcinoma de cavum, en su forma histolgica diferenciada, est asociado en un 100% de los casos a VEB.
No especfico Si bien el VEB es la causa ms frecuente de la MI, otros agentes como CMV, Toxoplasma gondii y adenovirus pueden causarla. El aumento absoluto de linfocitos atpicos en la segunda semana de la MI es un hallazgo caracterstico, pero no especfico. Si bien el aislamiento del VEB a partir de las secreciones orofarngeas es posible, las tcnicas para llevar a cabo este procedimiento por lo general no se encuentran disponibles en los laboratorios de diagnstico convencional y el aislamiento viral no indica necesariamente infeccin aguda, por lo tanto, el diagnstico depende de las pruebas serolgicas. Las pruebas inespecficas para anticuerpos heterfilos entre ellas la prueba de Paul Bunell y la reaccin de aglutinacin en portaobjetos son los mtodos disponibles con mayor frecuencia. Los anticuerpos heterfilos aparecen en un 60 - 80 % de las MI. Estos anticuerpos heterfilos aglutinan glbulos rojos de carnero, de caballo y de buey. Para eliminar del suero anticuerpos heterfilos no asociados a la MI debe absorberse el suero antes de la bsqueda de estos anticuerpos, lo que constituye la prueba de Paul Bunell. Estos anticuerpos son IgM, aumentan en dos a cuatro semanas y desaparecen en uno a tres meses. Se observan con ms frecuencia en el adolescente o en el adulto joven que en el nio pequeo. En la prctica se realiza de entrada una reaccin cualitativa en lmina: el Monospot test. En general no se observan falsos negativos debido a la tcnica. Los falsos positivos son controlados por la reaccin cuantitativa de Paul Bunell. Si luego de la absorcin el ttulo es superior a 1/56 significa que es una MI reciente. Especfico Deteccin de anticuerpos contra los diferentes antgenos del VEB. Existen mltiples pruebas serolgicas especficas para detectar los anticuerpos contra el VEB. La prueba que se realiza ms a menudo es la deteccin de anticuerpos contra el antgeno de la cpside viral (VCA). Debido a que los anticuerpos IgG contra el VCA aparecen en ttulos elevados poco tiempo despus del comienzo de la infeccin, la realizacin de pruebas en muestras de suero de fase aguda y de convalecencia, para anticuerpos anti-VCA, puede no ser til para establecer la presencia de infeccin. La realizacin de pruebas para detectar anticuerpos IgM anti-VCA y para detectar anticuerpos contra antgenos tempranos (EA) es til para identificar infecciones recientes. Dado que los anticuerpos sricos contra el antgeno nuclear del VEB (EBNA) no estn presentes hasta varias semanas a meses despus del comienzo de la infeccin, una prueba de anticuerpos anti-EBNA positiva excluye la infeccin
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aguda. Estas pruebas son particularmente tiles para evaluar a los pacientes que tienen una MI con anticuerpos heterfilos negativos, en estos pacientes estn indicadas las pruebas para identificar a otros agentes virales, especialmente CMV. En los estudios de investigacin la hibridacin de ADN in situ o la PCR pueden determinar la presencia de VEB y pueden implicarlo en un sndrome determinado como una linfoproliferacin.
Perfil serolgico durante la infeccin por VEB Infeccin IgG anti-VCA IgM anti-VCA Sin infeccin previa Infeccin aguda + + Infeccin reciente + +/Infeccin pasada + -
Anti-EA +/+/-
Anti-EBNA +/+
PREVENCIN
No existe vacuna disponible contra este virus

TRATAMIENTO
Incluye medidas de sostn como el reposo en la fase aguda de la enfermedad, evitar deportes con contacto fsico hasta que el paciente se haya recuperado totalmente de la MI y ya no se palpe el bazo. Se considera el uso de corticosteroides en casos con complicaciones, como marcada inflamacin de las amgdalas con obstruccin de la va area, esplenomegalia masiva, miocarditis, anemia hemoltica y sndrome hemofagocitario. Aunque el aciclovir tiene actividad antiviral in vitro contra el VEB, no se han demostrado los beneficios clnicos del tratamiento, con la posible excepcin de los pacientes infectados por VIH que tienen una leucoplaquia pilosa.
Herpesvirus humano tipo 6 (HHV-6)

HISTORIA
En 1986, los investigadores del instituto nacional de cncer de los Estados Unidos (NCI) Salahuddin, Gallo y colaboradores, aslan un nuevo virus herptico al que denominaron Human B Lymphotropic Virus (HBLV), que luego cambi su nombre a HHV-6. El primer aislamiento fue realizado en base a monocitos perifricos de seis pacientes con diferentes enfermedades linfoproliferativas, y solo en uno de estos enfermos la causa fue SIDA. La edad de los pacientes era entre los 17 y 66 aos. Todos presentaban anticuerpos IgG especficos contra el virus aislado 1:40 por inmunofluorescencia. La morfologa del virus aislado era muy semejante a la de los virus herpticos conocidos, pero diferentes a la de todos los ya conocidos, causantes de enfermedad en el hombre o en los animales. El nombre Human B Lymphotropic Virus sugiere la semejanza del virus a los HTLV I y II, porque presentaba tropismo limitado hacia los linfocitos B, al cabo de un ao, el aislamiento de nuevas cepas, de frica sobre todo, mostraron que su espectro de clulas husped comprenda tambin a las clulas T. Adems, sus caractersticas genmicas tambin lo clasificaban como un virus herptico.
TAXONOMA
Las clasificaciones modernas de los virus se basan en criterios genmicos. Este virus presentaba un genoma semejante al de los virus herpticos, lo que permiti hibridaciones cruzadas que sugirieron similitud al virus herptico tipo 1 y varicela, lo que favoreci la idea de incluirlo
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dentro de la subfamilia alfaherpesvirinae. Aislados posteriores no presentaban este genoma, pero conservaban criterios para pertenecer a la misma especie que haba establecido el NCI. Posteriormente, se hallan semejanzas con el genoma del CMV, lo que hizo que el HBLV fuera colocado, al igual que el CMV, en la subfamilia de los betaherpesvirinae. Recientemente, otro virus herptico denominado Human T cells lymphotropic Virus (VHH-7) se uni a los precedentes en esta misma familia beta, porque tena elementos genmicos semejantes al VHH-6 y otros virus herpticos. Estudios con enzimas de restriccin demuestran que existen dos grupos que difieren molecularmente, sin embargo, presentan una homologa en el resto del ADN del 94 a 96% entre ambas variantes de grupo, reconocindose formalmente dos variantes de herpesvirus 6 : A y B. Los herpesvirus 6 variante B causan rosola infantil o exantema sbito, mientras que la variante A se ha aislado ms frecuentemente en pacientes con sarcoma de Kaposi y pacientes con SIDA. Ambas variantes han sido aisladas en individuos inmunocomprometidos. No existen mtodos serolgicos para diferenciar ambas variantes.
CULTIVO
Estudios in vitro mostraron su crecimiento en clulas de diverso origen, incluyendo clulas T, monocitos, macrfagos, megacariocitos, clulas gliales embrionarias. Sin embargo in vivo su rango de clulas es limitado, pero la mayora poseen marcadores de clulas T.
ESTRUCTURA
El virin maduro del VHH-6 presenta la misma morfologa que el de los virus herpticos. El virin extracelular posee un dimetro de 160-210 nm y un tegumento nucleocapsideo constituido por 162 capsmeros. La nucleocpside tiene aproximadamente 90-110 nm de dimetro, exhibe una simetra icosadrica visible con coloracin negativa, contiene 162 capsmeros y rodea un core de aproximadamente 60 nm de dimetro. Las partculas virales maduras se acumulan en el interior de las vacuolas citoplsmicas, desde donde son expulsadas a la superficie de las clulas infectadas. En el citoplasma, la cpside est rodeada por distintos tegumentos de espesor uniforme (20-40 nm). El tegumento es la caracterstica morfolgica ms llamativa del virin del VHH-6, comparado en los otros virus herpticos, es un componente de partculas sin envoltura libres en el citoplasma, partculas encapsuladas contenidas dentro de vacuolas citoplsmicas, y partculas extracelulares, entre otras. En contraste, esta estructura est ausente en partculas citoplasmticas libres del herpes simple tipo 1 y no es bien demarcada en el CMV.
EPIDEMIOLOGA
El hombre sera el nico husped natural y un husped particularmente frecuente. Estudios serolgicos demuestran que el virus infecta a casi todas las personas alrededor de los dos aos de edad. Varios estudios demuestran una seroprevalencia de aproximadamente 86% a los 13 meses de edad en la poblacin y de cerca de 95% en nios mayores, sin diferencias segn sexo, raza, condiciones socioeconmicas o pas. Luego de la primoinfeccin el virus persiste en el organismo. Por tcnicas de biologa molecular PCR o hibridacin in situ, el genoma viral se ha encontrado en las glndulas salivales, los linfocitos y los monocitos circulantes. Se ha encontrado el virus en la saliva de personas sanas, ms raramente en su sangre. La transmisin del virus es por va oral por contacto con saliva y secreciones respiratorias. El pico de prevalencia de la infeccin es entre los 6 meses y los 24 meses de edad, siendo menos frecuente luego de los 3 aos de edad. La transmisin del virus por los productos sanguneos
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o los transplantes de rganos no parece ser una eventualidad muy frecuente y que requiera de medidas de prevencin especiales.
PATOGENIA
El hallazgo del virus en las glndulas salivales plantean la hiptesis de una replicacin primaria del virus a nivel de las mismas, desde donde se disemina por va hematgena e infecta linfocitos susceptibles y probablemente otros tejidos del organismo (nervioso, heptico, renales).
Las principales manifestaciones clnicas de la infeccin primaria en los nios menores de 3 aos son variables. Estas manifestaciones incluyen la rosola (exantema sbito, sexta enfermedad), aproximadamente en el 20 % de los nios, una enfermedad febril indiferenciada sin erupcin cutnea ni signos de localizacin y otras enfermedades febriles agudas, a menudo acompaada de linfadenopatas cervicales y occipitales posteriores, signos gastrointestinales o respiratorios y membranas timpnicas inflamadas. La fiebre es caractersticamente alta (>39.5 C) y dura de 3 a 7 das. En la rosola la fiebre es seguida por una erupcin cutnea maculopapular eritematosa que dura horas a das. En alrededor de 10 a 15 % de las infecciones primarias se presentan convulsiones durante el perodo febril. Otros sntomas neurolgicos como encefalitis son raros. El virus persiste y puede reactivarse, en realidad no estn claras las circunstancias clnicas y las manifestaciones de la reactivacin en las personas sanas. La enfermedad asociada con reactivacin se ha descrito principalmente en huspedes inmunosuprimidos en asociacin con manifestaciones como fiebre, hepatitis, supresin de la mdula sea, neumona y encefalitis. En los adultos las manifestaciones clnicas en la infeccin primaria son raras, pero puede presentarse con linfadenopatas, sndrome mononuclesido y hepatitis. Las analogas con CMV han conducido a considerar al HHV-6 como agente de infecciones graves en los sujetos inmunodeprimidos. Se ha visto ascenso de anticuerpos luego de los transplantes y se ha interpretado como un signo de reactivacin viral consecutiva a la inmunodepresin. Produce enfermedades febriles prologadas en pacientes con SIDA. Se ha relacionado al HHV-6 con la patogenia de la sarcoidosis, del sndrome de Sjorgen, esclerosis mltiple y como posible agente del sndrome de fatiga crnica, en lo que an quedan dudas con respecto, no solo a su etiologa, sino a la definicin precisa de la enfermedad, que se caracteriza a grandes rasgos, por una fatiga prolongada luego de un episodio agudo viral.
PRUEBAS DIAGNSTICAS
En la actualidad el diagnstico de infeccin primaria por HHV-6 exige el uso de tcnicas de investigacin para aislar el virus a partir de sangre perifrica y para demostrar la seroconversin. Una elevacin de cuatro veces en los ttulos de anticuerpos sricos, solamente, no indica necesariamente una infeccin nueva, dado que tambin puede ocurrir una elevacin del ttulo con la reactivacin y en asociacin con otras infecciones. Se estn desarrollando ensayos comerciales para la deteccin de anticuerpos y antgenos y de PCR para detectar ADN de HHV-6 pero hasta ahora ninguno de stos ensayos muestra aptitud para diferenciar de manera confiable la infeccin primaria de la persistencia o la reactivacin viral.
TRATAMIENTO
El tratamiento es de sostn. En el caso de los pacientes inmunocomprometidos con enfermedad grave por HHV-6 algunos expertos recomiendan una serie de ganciclovir.
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En 1990 fue aislado ste virus de clulas mononucleares de sangre perifrica de un individuo sano. Pertenece a la subfamilia betaherpesvirinae. Su epidemiologa y su secuencia de ADN han sido definidas, pero an resta por saber qu enfermedades causa en el humano y si existe necesidad de tratamiento. Infecta persistentemente a linfocitos T CD4 y glndulas salivales, y el virus es generalmente excretado en la saliva. Posee poca homologa de ADN con HHV-6 pero suficiente similitud antignica como para causar reacciones serolgicas cruzadas.
EPIDEMIOLOGA
HHV-7 infecta a casi toda la poblacin alrededor de los 5 aos de edad, detectndose anticuerpos anti-HHV-7 en el 80 a 90% de la poblacin.
DIAGNSTICO
Los siguientes mtodos pueden ser utilizados para determinar una infeccin primaria o una reactivacin por HHV-7. Mtodos directos Aislamiento del HHV-7 de la saliva, clulas mononucleares perifricas, LCR, suero o plasma, cultivndolo en clulas mononucleares del cordn estimuladas con un mitgeno (fiitohemaglutinina). El efecto citoptico y la deteccin de antgenos virales por IF utilizando anticuerpos monoclonales anti-HHV-7, permiten detectar infeccin de las clulas de cultivo. Deteccin de ADN por PCR en sangre o LCR. Deteccin de antgenos virales de HHV-7 en tejidos por inmunohistoqumica. Mtodos indirectos Deteccin de anticuerpos anti-HHV-7 IgM e IgG por IF o ELISA en suero o plasma.
Puede causar exantema sbito y un sndrome mononuclesido. Las complicaciones asociadas al HHV-7 son hemiplejia, sugestiva de enfermedad en el sistema nervioso central, y en los transplantados que padecen enfermedad por CMV puede agravar los sntomas del paciente y causar una encefalitis. Datos recientes clasifican al virus HHV-7 en dos variantes, 1 y 2.
TRATAMIENTO
Los compuestos antivirales anti-HHV-7 ms efectivos son foscarnet y cidovir.

El conocimiento de la historia natural y de la biologa del HHV-8 es limitado, pero se est avanzando en su conocimiento. Aunque una etiologa viral para el sarcoma de Kaposi (SK) se postul en 1970, llev varias dcadas hasta que Chang y colaboradores descubrieran HHV-8 en tejidos de sarcoma de Kaposi. Sarcoma de Kaposi clsico es una enfermedad neoplsica maligna rara que ocurre principalmente en adultos del este de Europa y Mediterrneo, pero puede ocurrir tambin en nios. Sarcoma de Kaposi es endmico en las poblaciones indgenas negras del este de frica. En Estados Unidos afecta principalmente a hombres homosexuales
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infectados por el virus VIH-1. El ADN del HHV-8 puede ser detectado en casi todas las formas de sarcoma de Kaposi, inclusive la forma clsica mediterrnea, SK endmico, SK postransplante y SK asociado al SIDA.
CLASIFICACIN
Pertenece a la subfamilia gammaherpesvirinae.

EPIDEMIOLOGA
Se conoce poco acerca de la epidemiologa y transmisin del HHV-8, sin embargo, se ha informado que ste se encuentra en forma latente en clulas mononucleares de sangre perifricas y de tejido linfoide de personas inmunocomprometidas y de algunas personas sanas, lo que sugiere que la transmisin pueda ser a travs de la sangre o secreciones.
PATOGENIA
Los sitios de replicacin y persistencia en el organismo no son conocidos pero el ADN viral ha sido detectado en la saliva y semen. Los mecanismos por los cuales el HHV-8 puede promover el desarrollo del sarcoma de Kaposi y otros desordenes neoplsicos involucran genes que codifican protenas y citocinas que regulan el ciclo celular.
El sarcoma de Kaposi est caracterizado por la aparicin de uno o ms ndulos pigmentados, multicntricos, de color marrn rojizo en la piel, mucosas, o en los rganos, particularmente en el pulmn o va biliar. En otros trastornos linfoproliferativos que se ven en pacientes VIH positivos, se ha encontrado en genoma de HHV-8 como la enfermedad de Castleman`s multicntrica. Existe un alto riesgo de sarcoma de Kaposi en pacientes transplantados debido a su nivel de inmunosupresin. La infeccin por el HHV-8 puede ser causa de fracaso de transplante.
Figura 3. Lesiones de sarcoma de Kaposi en la espalda de un paciente con Sida
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TRATAMIENTO
Diversos ensayos demuestran que es sensible a cidofovir, moderadamente sensible al foscarnet y ganciclovir, e insensible al aciclovir. Pero no se conoce ningn tratamiento eficaz.
Bibliografa
1. 2. 3. 4. 5. 6. Pickering Larry K., Peter Georges. Red Book. Enfermedades Infecciosas en Pediatra. Edicin 25. Elk Groove Village, Illinois. Editorial Mdica Panamericana, 2001. Pg: 187-191; 601-603; 584-597. Atencin Peditrica. Pautas de diagnstico, tratamiento y prevencin. 5 edicin. Montevideo. Oficina del Libro AEM. 2000. Temas de Bacteriologa y Virologa para CEFA. Montevideo. Librera Mdica Editorial, 2001. Tomo I. Murray Patrick R. Manual of Clinical Microbiology. 7th Edition. Washington DC. American Society for Microbiology, 1999. Pg. 888-927. Rhoda L. Ashley, Anna Wald. Genital Herpes: Review of the epidemic and potential use of type specific serology.( Clinical Microbiology Reviews) 1999 Jan. Vol. 12, N 1. Pag 1-8. Koelle David M., Corey Lawrence. Recent progress in Herpes Simplex virus inmunobiology and vaccine research. (Clinical Microbiology Reviews) 2003 Jan. Vol 16, N 1. Pag 96-113.
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Agentes de infecciones emergentes, Hantavirus, dengue, BSE

Dres. R. Vignoli, E. Calvelo, H. Chiparelli, F. Schelotto, E. Ingold, A. del Monte, J. Campione
Virosis emergentes de importancia regional: virus Hanta y Dengue

A nivel mundial en los ltimos aos se asiste al surgimiento de nuevas enfermedades infecciosas, producidas en algunos casos por nuevos agentes etiolgicos; en otros casos se reconocen nuevas presentaciones clnicas producidas por variantes de microorganismos ya conocidos. A estos agentes infecciosos nuevos o renovados se los denomina genricamente patgenos emergentes o reemergentes. La emergencia de estos agentes se atribuye a las modificaciones naturales o artificiales de los ecosistemas, los movimientos demogrficos y los cambios climticos, que ponen al hombre en contacto con nuevos seres, que a su vez cambian en funcin de su interaccin con huspedes variados. Nos ocuparemos en este caso de dos de ellos: virus Hanta y virus Dengue, debido a su importancia regional y local. Abordaremos tambin brevemente las enfermedades prinicas.
Hantavirus
Denominado de esta manera por haberse reconocido los primeros casos a orillas del ro Hantang, durante la guerra de Corea en 1951, el gnero Hantavirus pertenece a la familia Bunyaviridae. Est integrado por virus de reservorio animal, transmitidos por roedores. Se reconocen dos grupos de Hantavirus que se asocian a dos presentaciones clnicas diferentes: los Hantavirus del viejo mundo, predominantes en Asia y Europa, y los del nuevo mundo, predominantes en Amrica. Los primeros incluyen las especies Hantaan (HTN), Puumala (PUU), Seoul (SEO), Prospect Hill (PH) y Dobrava. Estos producen un cuadro conocido como fiebre hemorrgica con sndrome renal (FHSR) y son responsables de unos 100.000 casos anuales fundamentalmente en Asia (sobre todo en China y Corea), aunque tambin se han detectado en Europa, especialmente en Alemania, Francia, Blgica, Holanda y Rusia. Las alteraciones hematolgicas y renales de esta entidad son de intensidad variable segn los brotes y los virus involucrados, presentando una mortalidad que oscila entre el 1 y 35%. Los segundos fueron reconocidos por primera vez en Mayo de 1993 en la regin de Cuatro Esquinas al sudoeste de Estados Unidos, donde se juntan los estados de Nuevo Mexico, Arizona, Colorado y Utah. All se realiz el primer diagnstico de un brote de enfermedad febril asociada con insuficiencia respiratoria aguda, shock y una mortalidad del 60 a 80%. Su agente etiolgico, en principio desconocido, fue identificado ms tarde como una especie
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nueva de Hantavirus denominada inicialmente virus sin nombre, o Convict Creek o Muerto canyon, y que hoy se conoce con el nombre de Four corners Hantavirus. Se denomin a esta presentacin sndrome pulmonar por Hantavirus (SPH). Comenz as el estudio de los Hantavirus del nuevo mundo. Para el ao 1995 se haban identificado ms de 100 casos a lo largo de 26 estados de Estados Unidos, y se reconocieron los primeros brotes en Chile y Argentina. Ese mismo ao se describe una nueva especie de Hantavirus en Argentina denominada Andes, que en 1996 produce un gran brote de SPH; el estudio de este brote aporta por primera vez evidencia epidemiolgica de transmisin persona a persona. En 1997 se diagnostican los primeros cuatro casos de SPH en nuestro pas, uno de los cuales fue producido por una cepa filogenticamente relacionada con la cepa Andes. Hasta el 30 de Junio de 2002 se confirmaron oficialmente en Uruguay 38 casos (espordicos) de SPH, mientras que en otros pases de Sudamrica se han registrado cientos de casos: en Argentina, en Chile y tambin en Paraguay y Brasil. En Estados Unidos se confirmaron 209 casos desde 1993 a 1998, con una mortalidad que oscil entre el 40 y 60%. En Uruguay, como en otros pases, la letalidad fue descendiendo (en el perodo 1997-2002 fue globalmente del 21%).
ASPECTOS MICROBIOLGICOS DE HANTAVIRUS
Ubicacin taxonmica Pertenece a la familia Bunyaviridae, dentro de la que se reconocen cinco gneros: Hantaan, Bunyavirus, Phlebovirus, Nairovirus y Tospovirus. El gnero Hantavirus cuenta hasta el momento con 14 especies o tipos reconocidos y varios ms en estudio, dentro de los cuales se encuentra el tipo Andes. Se identifican y clasifican actualmente en genotipos por la composicin y secuencia de su ARN. Los genotipos reconocidos en la regin son llamados Andes, Orn, Lechiguana, Bermejo, Laguna negra y otros. Morfologa y estructura Posee una forma oval o esfrica de 80 a 120 nm de dametro. Se trata de un virus envuelto, con cpside helicoidal cuyo genoma es RNA monocatenario de polaridad negativa, trisegmentado, circular. Cada segmento se encuentra cerrado en forma no covalente a travs de extremos 5-3complementarios (figura 1). Envoltura Es obtenida por brotamiento en el aparato de Golgi de las clulas eucariotas. Todos los Hantavirus insertan dos protenas virales en sta, denominadas G1 y G2. Estas protenas se prolongan ms all de la superficie, observndose al microscopio electrnico como proyecciones de 5 a 10 nm de longitud, hexagonales o pentagonales. A travs de G1 y G2 se produce la adherencia y fusin de las membranas viral y celular. Hacia estos antgenos pueden producirse anticuerpos tipo especficos neutralizantes que protegen contra la reinfeccin. Nucleocpside Est constituda por el genoma y la cpside. Cada virin contiene tres nucleocpsides formadas por uno de los segmentos de RNA y la protena N. Cada segmento se denomina de acuerdo a su tamao: L, M y S por grande, medio y pequeo. El L codifica la transcriptasa viral o RNA polimerasa RNA dependiente. El M codifica tres protenas: G1 y G2 y una protena no estructural denominada NEm. El segmento S por su parte codifica dos: la protena de la
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Figura 1. a) Modelo de partcula de Hantavirus. b) Microfotografa de Hantavirus

nucleocpside o N y una segunda protena no estructural, NES. Las cpsides estn constituidas por la protena N. En base a ella es posible detectar anticuerpos gnero especficos.
CICLO VIRAL
Luego de su adhesin a travs de las glicoprotenas G1 y G2, se produce la endocitosis de la partcula viral. Dentro de la vescula endoctica se produce la fusin de la envoltura viral con la membrana vesicular, lo que posibilita la internalizacin del virus. El virus se replica en el citoplasma de las clulas infectadas. Una vez que ocurre la transcripcin del RNA genmico se produce la sntesis proteica. Las protenas son dirigidas al retculo endoplsmico rugoso, donde ocurre la encapsidacin. Las nucleocpsides as formadas emigran al aparato de Golgi donde adquieren la envoltura por brotamiento.
PROPIEDADES FSICAS
El hecho de que Hantavirus sea un virus envuelto, lo hace susceptible a la mayora de los desinfectantes y detergentes de uso domstico, incluidas las soluciones diluidas de hipoclorito de sodio y el alcohol etlico al 70 %. Por otra parte, su labilidad a las radiaciones UV ocasiona su rpida inactivacin en ambientes ventilados con exposicin al sol. El virus es inactivado a temperaturas superiores a 37 C, mientras que permanece estable a 4 C hasta 12 horas. Igualmente se inactiva en condiciones de pH extremas y con altas concentraciones salinas.
PATOGENIA
El estudio histopatolgico de autopsias de pulmones de pacientes fallecidos por SPH demuestra: Neumonitis intersticial, caracterizada por congestin, infiltrado intersticial de clulas mononucleares agrandadas (inmunoblastos). Edema intraalveolar, septal y peribronquial. Membrana hialina focal. Ausencia o evidencias mnimas de: a) restos celulares, b) neutrfilos, c) injuria epitelial y d) inclusiones virales, hongos o bacterias con tinciones especficas. Estas evidencias sugieren un mecanismo de patogenicidad relacionada a aumento de la permeabilidad vascular, lo que produce edema pulmonar, generando un cuadro clnico similar al conocido como sndrome de distrs respiratorio del adulto. Se produce as insufi-
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ciencia respiratoria, lo que conduce en sus etapas finales a falla cardiovascular, con shock cardiognico y muerte. Dado que no se producen lesiones tisulares, es sumamente importante mantener las condiciones vitales de los pacientes durante el perodo de estado de la infeccin, ya que superada esta etapa se puede producir una recuperacin prcticamente completa. Dada la antigedad del cuadro, es mucho mas conocida la patogenia de la fiebre hemorragpara con sndrome renal, la que se describir brevemente (el estudiante interesado deber consultar algn texto especializado). En estos casos la invasin vrica y la formacin de inmunocomplejos circulantes produciran lesin renal tubular, vascular y fenmenos hemorragparos. As, la lesin tubular conduce a insuficiencia renal aguda mientras que la lesin vascular genera edema retroperitoneal y shock cardiovascular.
EPIDEMIOLOGA
Distribucin geogrfica Los Hantavirus estn distribuidos por todo el mundo, y probablemente la prevalencia real de la infeccin producida por ellos supera los casos notificados. Se comunican anualmente un nmero aproximado de entre 150.000 a 200.000 casos de FHSR en todo el mundo, correspondiendo ms de la mitad a China; por otro lado se han reportado ms de 1000 casos de SPH en Amrica de 1993 a 2002. Reservorio El principal reservorio son los roedores, ya sean salvajes o aquellos en contacto con seres humanos, incluyendo tambin animales de experimentacin, que portan el virus de forma asintomtica, y lo transmiten por va horizontal. El gnero Hantaan es el nico gnero de la familia Bunyaviridae que no se transmite a travs de mosquitos, moscas u otros artrpodos. Se acepta que cada especie de Hantavirus se mantiene en un tipo particular de roedor (tabla 1) y sera en parte la distribucin del vector lo que determina la distribucin geogrfica de cada virus. Este aspecto complica las medidas de prevencin, puesto que cada zona presenta un grupo particular de especies de ratones y stos a su vez determinados tipos de Hantavirus. En nuestro pas se estn realizando trabajos de bsqueda de vectores entre el Ministerio de Salud Pblica (MSP) y la Facultad de Ciencias. Todos los roedores identificados como portadores pertenecan a la especie Oligoryzomys flavescens y portaban virus del genotipo Andes Central Plata, parecido a virus circulantes en la zona central de la provincia de Buenos Aires, y asociado a la mayora de los casos estudiados en el sur de nuestro pas. Un segundo tipo de virus (Lechiguana), recuperado de una infeccin humana en la zona del litoral y emparentado con cepas de la costa argentina adyacente, no ha sido todava identificado en animales. Ecologa Los brotes de Hantavirus han sido asociados: 1. a cambios estacionales de ao en ao debidos por ejemplo a factores climticos; 2. a cambios a lo largo del tiempo en las dinmicas de poblaciones de roedores, por ejemplo debido a competencia interespecies y a la presencia de depredadores; 3. a intervenciones humanas: dentro de este punto se encuentra la alteracin de ecosistemas aumentando el contacto entre los roedores y el hombre. La teora actual de la extensin de Hantavirus en Amrica es que no emerge como se crey en 1993 por una mutacin viral sino de un trastorno ecolgico del tipo de los mencionados.
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La evidencia que avala esta teora es la deteccin de anticuerpos especficos anti-virus FC (Four Corners) en sueros congelados provenientes de pacientes fallecidos en 1959 y 1975 con sintomatologa compatible con SPH. En nuestro pas, la despoblacin rural ha modificado la vegetacin y acercado a O. flavescens al peridomicilio y los bordes de caminos.
MECANISMOS DE TRANSMISIN Y FACTORES DE RIESGO
La infeccin en humanos en general se produce por aspiracin de aerosoles contaminados a partir de saliva, orina y materias fecales de roedores contaminados. No obstante, el contagio interhumano ha sido demostrado en Argentina y luego en Chile, en personal de salud o contactos muy estrechos. El riesgo de contagio es mximo sobre el fin del perodo de incubacin. Se comunica tambin la posibilidad de contagio a travs de heridas y mordeduras de ratones infectados. Dentro de los factores de riesgo se encuentran: 1. Trabajos de granja, rurales en general. 2. Actividades de limpieza o ingreso a habitaciones cerradas con alta probabilidad de presencia de ratones, como galpones, cabaas, garajes, graneros, etc. 3. Zonas de alta poblacin de roedores.
DIAGNSTICO DE SPH
El diagnstico es clnico, epidemiolgico, radiolgico y microbiolgico. La sospecha basada en datos epidemiolgicos es fundamental para lograr un diagnstico precoz del cual puede depender la sobrevida. La enfermedad se presenta habitualmente en el adulto o el joven. Es menos frecuente en nios, y en stos suele ser de curso ms benigno. Diagnstico clnico: la infeccin puede ser asintomtica, o con escasas manifestaciones. Cuando tiene expresin clnica, el perodo de incubacin de la enfermedad a partir del contagio es de 2 a 4 semanas: entre 12 y 27 das, habitualmente entre 15 y 20. Los pacientes suelen presentar en la etapa prodrmica fiebre, mialgias y escalofros, asocindose frecuentemente, nuseas, vmitos, cefaleas, diarreas y malestar general. En ocasiones se acompaan de respiracin suspirosa, vrtigo, artralgias, dolor precordial o del dorso del trax, dolor abdominal y lumbar, sudoracin y tos. Raramente comienzan con rinorrea. Al examen fsico pueden presentar: a nivel pleuropulmonar taquipnea, y estertores crepitantes; en piel y mucosas: inyeccin conjuntival, petequias cutneas y microvesculas en el paladar; en lo cardiovascular: taquicardia. El cuadro clnico prodrmico dura entre 3 y 6 das, tras lo cual se alcanza el perodo de estado que en su forma ms grave se presenta con complicaciones cardiorrespiratorias, disnea, hipoventilacin, severa inestabilidad hemodinmica y shock, con una duracin promedio de 7 a 10 das. Es sta una etapa crtica para el paciente, debido al alto ndice de mortalidad; una vez superada, comienza la etapa de convalecencia. Las manifestaciones hemorragparas y de afectacin renal pueden acompaar en algunos casos al SPH. El examen radiogrfico de trax revela en forma temprana infiltrados bilaterales simtricos intersticiales, que pueden mostrar patrones de lquido intraalveolar. Estas imgenes son compatibles con las observadas en las enfermedades que se acompaan de distrs respiratorio del adulto. Exmenes complementarios de laboratorio: en el hemograma se observa leucocitosis con desviacin a la izquierda, neutrofilia con formas inmaduras circulantes (metamielocitos),
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linfocitos atpicos en sangre perifrica, hematocrito aumentado y plaquetopenia. Parte del aumento del nmero de clulas encontrado se debe a hemoconcentracin, debido a la prdida de lquido extracelular (plasma) al espacio insterticial, fundamentalmente pulmonar. Se debe poner especial atencin a este hecho, ya que la principal medida para mejorar esto es la reposicin de lquidos, que sin embargo puede aumentar el edema intersticial y alveolar en el SPH o del espacio retroperitoneal en la FHSR, agravando el estado del paciente. Tambin pueden encontrarse hipoproteinemia y aumentos de la dehidrogenasa lctica, transaminasas, CPK, amilasa o creatinina en sangre. En suma, se sugiere el estudio etiolgico para Hantavirus a un paciente que estando sano instale los siguientes sntomas y signos: 1. Fiebre y mialgias severas. 2. Sndrome de distrs respiratorio, con disnea, taquipnea, edema pulmonar no cardiognico, e infiltrados bilaterales sin imgenes de condensacin lobar o segmentarias. 3. Hipotensin o shock. 4. Neutrofilia con plaquetopenia. Se excluirn de esta categora aquellos pacientes inmunodeprimidos, politraumatizados o con sepsis, que de por s pueden presentar manifestaciones cutneas o mucosas de tipo hemorrgico, o alteraciones de la funcin renal por diferentes causas. Ante una situacin clnica como la descrita se deber tomar una muestra de 10 ml de sangre, sin anticoagulante, en tubo seco y estril y guardarla en la heladera a 4-8 grados centgrados (no congelar) hasta su envo a la divisin laboratorios del MSP (8 de Octubre 2720, telfono: 4872616- 4872516). Se debe llenar una ficha con la informacin clnico-epidemiolgica necesaria para efectuar el examen. Los recursos para el diagnstico son limitados y se debe restringir el uso a aquellos casos que lo justifiquen.
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO (DIAGNSTICO ETIOLGICO)
Los primeros diagnsticos de SPH utilizaban hantavirus adaptados a cultivo, de las especies SEO, PUU, PH, y HTN como antgenos para la deteccin de anticuerpos contra Hantavirus FC. Estos antgenos heterlogos, si bien fueron tiles, se mostraban subptimos para la deteccin de anticuerpos contra dicha especie. La utilizacin de RT-PCR (ver captulo 4, Gentica bacteriana) se mostr sensible para la deteccin de FC RNA tanto de autopsia como de clulas
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Figura 3. Estudio de Western blot para la deteccin de anticuerpos de tipo IgG en muestras de sangre de pacientes y roedores. Se utiliz una dilucin 1:500 de suero frente a un Western Blot que contena cantidades equimolares de protena N recombinante de los siguientes Hantavirus: 1) Bayou; 2) Muleshoe; 3) Puumala; 4) Rio Mamor; 5) Seoul; y 6) Sin Nombre. El resultado de estos sueros fue verificado posteriormente, mediante la realizacin de RT-PCR y anlisis de secuencia: (A) paciente x, positivo para Bayou virus; (B) Suero de Oryzomys palustris positivo para Bayou virus- (C) Suero positivo de ratn para el virus Sin Nombre; (D), Control negativo. Los anticuerpos unidos a los antgenos en fase slida fueron detectados mediante fosfatasa alkalina conjugada a anti IgG humana en el paciente A y con anti -Peromyscus leucopus IgG en los casos B a D. La flecha indica la migracin del antgeno viral completo T7N,~55kDa.
mononucleares de sangre perifrica de pacientes vivos. Adems, los antgenos virales podan detectarse en secciones de tejido por inmunotinciones, usando anticuerpos monoclonales contra PUU. Para desarrollar un diagnstico rpido con capacidad para detectar anticuerpos anti-FC se produjeron antgenos recombinantes utilizando las secuencias codificantes de protena N y la glicoprotena G1. Mientras la deteccin de la protena N se muestra inespecfica, ya que existen reacciones cruzadas entre numerosas especies, la proteina G1 es especfica, mantenindose conservada en cada especie. Como tcnicas indirectas para el diagnstico rpido de hantavirus tanto en humanos como en ratones, se cuenta con ELISA y Western Blot que utilizan nicamente la protena N, y un Western Blot que utiliza ambas protenas, N y G1.
DIAGNSTICO PRCTICO DE LABORATORIO
El diagnstico se realiza actualmente por investigacin de anticuerpos IgM en suero mediante ELISA de captura, utilizando antgeno N recombinante de virus Andes y de una mezcla de otros virus. El ascenso de los anticuerpos IgM especficos coincide con el comienzo del cuadro clnico, por lo cual el diagnstico por ELISA es sencillo y eficaz. Como estudios complementarios se puede practicar ELISA para IgG con tcnica similar, o ensayo en formato de tiras de Western Blot. El estudio microbiolgico se completa habitualmente con la amplificacin por RT-PCR del genoma viral en sangre o suero, y la determinacin de su secuencia con fines taxonmicos y epidemiolgicos.
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Tabla 1. Hantavirus encontrados en el Nuevo Mundo

Virusa Sigmodontinae associated Sin Nombre Enfermedadb Huesped conocido o Localizacin sospechado Aislamiento de Virus
SPH
Monongahela New York Blue River Bayou Black Creek Canal Muleshoe Cao Delgadito Andes Oran Lechiguanas Bermejo
SPH SPH
SPH SPH
SPH SPH SPH
Peromyscus maniculatus (forma de pradera) P. maniculatus (forma de bosque) P. leucopus (haplotipo este) P. leucopus (haplotipo SW/NW) Oryzomys palustris Sigmodon hispidus (forma del este) S. hispidus (forma del oeste) S. alstoni Oligoryzomys longicaudatus O. longicaudatus O. flavescens O. chacoensis Desconocido Akadon azarae Bolomys obscurus Calomys laucha Unknown O. microtis Reithrodontomys megalotis R. mexicanus
Oeste y Centro de U.S.A y Canad Este de U.S.A y Canad Este de U.S.A Centro de U.S.A Sudoeste de U.S.A Florida Sur de U.S.A Venezuela Argentina y Chile Noroeste de Argentina Central Argentina Noroeste de Argentina Central Argentina Central Argentina Central Argentina Paraguay y Bolivia Brasil Bolivia y Peru Oeste de U.S.A y Mexico Costa Rica
N S N S S N S S N N N
Hu39694 SPH Pergamino Maciel Laguna Negra SPH Juquitiba SPH Rio Mamore El Moro Canyon Rio Segundo Arvicolinae associated Prospect Hill Bloodland Lake Prospect Hill-like Isla Vista
N N S N S N N
Microtus pennsylvanicus M. ochrogaster M. pennsyl./ montanus/ ochrogaster M. californicus
N. America N. America N. America Oeste de U.S.A y Mexico
S N N N
Murinae associated Seoul HFRS Rattus norvegicus Todo el mundo S Los tipos o especies principales estn en negrita e incluidos debajo de las subfamilias de roedores con las cuales estn asociados; las lneas virales definidas y relacionadas genticamente que pueden representar especies adicionales o subespecies estn incluidas debajo de los tipos y especies virales. bHPS = hantavirus pulmonary syndrome; HFRS = hemorrhagic fever with renal syndrome.
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MANEJO DEL PACIENTE CON SNDROME PULMONAR POR HANTAVIRUS
Instalacin en forma muy temprana de cuidados en terapia intensiva. Evitar episodios de hipoxia, especialmente durante el traslado a la unidad de cuidados intensivos. Ventilacin asistida temprana. Monitoreo cuidadoso de la oxigenacin, del balance de lquidos y la tensin arterial. Cateterizacin arterial. Uso de agentes inotrpicos en forma temprana. Como ya fue dicho el manejo cuidadoso de la reposicin hdrica es fundamental. Para disminuir los efectos de la infeccin, se han realizado estudios con ribavirina, con resultados hasta el momento no concluyentes.
PREVENCIN
Hasta el momento no se cuenta con una vacuna efectiva contra la infeccin por Hantavirus, y dado que la incidencia mundial de esos procesos es relativamente baja, es difcil que el tema despierte el inters de empresas financiadoras, por lo que las principales medidas de prevencin son conductuales y estn dirigidas a la eliminacin de los factores de riesgo comentados en la seccin de epidemiologa. Control de la poblacin de roedores Prevenir el acceso de roedores a las viviendas: cierre de grietas y orificios, corte de pasto en un radio de 30 metros, eliminacin de acceso a los alimentos, uso de trampas para la captura. Reduccin de las poblaciones de roedores, actuando sobre sus parmetros ambientales de vida y reproduccin, y sobre sus depredadores. Cuidados en la limpieza de lugares cerrados con evidencias de presencia de roedores Se deber ventilar ampliamente los lugares cerrados por largo tiempo, y las zonas expuestas deben ser rociadas con desinfectantes de uso general para casas habitacin o simplemente con hipoclorito de sodio, evitando en todo momento la aerosolizacin de las partculas y el polvo depositado en el piso y ambientes. Se deber tener especial cuidado en la puesta en marcha de ventiladores y de aparatos de aire acondicionado cuyos filtros o conductos puedan haber tenido contacto con polvo contaminado, roedores o excretas de los mismos. Lavado de manos, tapabocas, desinfeccin de fomites, instrumental, etc. Dada la evidencia epidemiolgica presentada por los investigadores regionales acerca de la transmisin interhumana, las personas expuestas a enfermos con HPS, y en especial el personal de salud, debe tomar las precauciones requeridas para evitar la infeccin cruzada.
AUTOEVALUACIN
Historia 1: E.R, bancario 48 aos. Habitante de zona rural en las afueras de Montevideo. Motivo de consulta: cansancio muscular y dolores musculares intensos con fiebre de 39 C. Habiendo recibido tratamiento acorde a una gripe intensa el paciente evoluciona desfavorablemente hasta ser internado en CTI a causa de una insuficiencia respiratoria. Tras hacer un paro cardiaco, comienza a evolucionar positivamente hasta restablecerse por completo.
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Historia 2: Paciente de 25 aos que en forma repentina presenta fiebre de 39.6 C, dolor ocular, inyeccin conjuntival, mialgias, diarrea y vmitos. Seis das despus del inicio de la enfermedad su estado se agrava, presentando un cuadro de fracaso renal agudo, motivo por el que es hospitalizado. El paciente refiere haber trabajado en un granero donde haba ratas. Las pruebas de laboratorio demuestran una intensa trombocitopenia, microhematuria, elevacin de la creatinina srica y de las transaminasas. De los sndromes descritos en el texto Cules cree usted que corresponden a estos casos? Nombre por lo menos dos especies de Hantavirus que causen cada uno de estos sndromes Describa brevemente las caractersticas estructurales de estos virus. Cul es el vector de la infeccin causada por Hantavirus? Cules son las conductas o situaciones de riesgo de adquirir infeccin por Hantavirus? Nombre dos mtodos de diagnstico microbiolgico de estos virus. Describa por lo menos tres medidas preventivas de la enfermedad pulmonar por Hantavirus.
Dengue
INTRODUCCIN
El dengue es hoy da una de las ms importantes arbovirosis que afecta al hombre y constituye un serio problema de salud pblica en el mundo, especialmente en la mayora de los pases tropicales, donde las condiciones del medio ambiente favorecen el desarrollo y la proliferacin de Aedes aegypti, el principal mosquito vector.
HISTORIA
Los primeros relatos histricos sobre el dengue mencionan a la isla de Java en 1779 y a Filadelfia (Estados Unidos) en 1780, como los primeros lugares donde se reconocieron brotes de la enfermedad. En Amrica, los relatos sobre esta dolencia datan de ms de 200 aos. En el siglo pasado ocurrieron grandes epidemias, coincidiendo con la intensificacin del transporte comercial entre los puertos de la regin del Caribe y el Sur de los Estados Unidos, con el resto del mundo. En 1953, en Trinidad, se aisl por primera vez el agente causal, de tipo 2, a partir de casos no epidmicos. La primera epidemia de Dengue clsico en Amrica comprobada por laboratorio, ocurri en la regin del Caribe y en Venezuela en 1963, y se asoci al serotipo Den-3. En 1977, el serotipo Den-1 fue introducido en Amrica por Jamaica, y se disemin por la mayora de las islas del Caribe causando epidemias. El serotipo Den-4 fue introducido en 1981, y desde entonces los tipos 1, 2 y 4 se transmitieron simultneamente en muchos pases donde Aedes aegypti estaba presente. En el Caribe cocirculan actualmente varios serotipos de Dengue, incluyendo el Den-3, reintroducido desde 1994 a partir de Nicaragua, que difundi progresivamente en poblaciones extensamente susceptibles a esta variante. La epidemia de fiebre hemorrgica de Dengue asociada al serotipo Den-2, que afect a Cuba en 1981, fue la primera ocurrida fuera de las regiones del sudeste asitico y el Pacfico occidental. Este hecho ha sido considerado el evento ms importante en la historia del Dengue
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en Amrica. Dicha epidemia fue precedida por otra en el ao 1977, con casos clnicos de presentacin benigna ocasionados por el serotipo Den-1, que permaneci endmicamente por 4 aos. En Amrica del Sur, la enfermedad se ha extendido en Per, Venezuela, Brasil y en casi todos los pases excepto Uruguay. En Brasil se han registrado miles de casos de Dengue 1 desde 1981, de Dengue 2 desde 1990, y de Dengue 3 desde 2001, configurndose un problema serio y creciente de Salud Pblica. La incidencia de manifestaciones graves en la epidemia de Dengue y fiebre hemorrgica de Dengue en Ro, 1991, no fue muy elevada, pero s lo ha sido en 2002 y 2003, tras la difusin de Dengue 3. Se han producido extensas epidemias de Dengue hemorrgico en Venezuela, en 1997 de nuevo en Cuba, en Per, Bolivia y otros pases. Se ha observado en los ltimos aos en Amrica un notorio aumento global de la circulacin del virus del Dengue, as como tambin de la incidencia de casos de fiebre hemorrgica de Dengue. El aumento de esta actividad se atribuye a varios factores: El Dengue es una enfermedad fundamentalmente urbana, donde el combate del vector (principal medida de control) depende de la mano de obra, y enfrenta serias dificultades operacionales en las grandes ciudades cuando se intenta poner en juego en forma sistemtica. El proceso creciente de urbanizacin, con aumento de la densidad poblacional en las grandes ciudades, genera mayor posibilidad de transmisin del virus. La produccin cada vez mayor de recipientes descartables provee abundantes criaderos potenciales del vector. El aumento de los viajes areos y del transporte en general en los ltimos 20 aos proporciona un mecanismo ideal para el traslado del virus entre los centros poblacionales. La reinfestacin de la mayor parte de Amrica tropical por Aedes aegypti, su resistencia a los insecticidas y la ausencia de una vacuna eficaz para el ser humano completan el cuadro favorable a la difusin de la infeccin.
ASPECTOS CLNICOS
La infeccin por Dengue causa una enfermedad cuyo espectro incluye desde formas clnicamente inaparentes hasta cuadros graves de hemorragia y shock, que pueden finalizar con la muerte del paciente. Dengue clsico Las primeras manifestaciones clnicas son de inicio abrupto tras 2-7 das de incubacin. Se caracterizan por fiebre elevada (39-40 C), cefaleas, mialgias intensas generalizadas y artralgias con dolor cervical y lumbar, anorexia, gran astenia, nuseas, vmitos y dolor abdominal. Los sntomas respiratorios (tos, rinitis, faringitis) son frecuentes. Se puede presentar una erupcin cutnea mculopapular, que aparece al comienzo de la fiebre o coincide con un segundo pico febril a los 3-5 das. Pueden observarse poliadenopatas, granulocitopenia, linfocitosis relativa y trombopenia. Algunos de los aspectos clnicos dependen fundamentalmente de la edad del paciente. El dolor abdominal generalizado ha sido observado ms frecuentemente en nios. En adultos, al final del perodo febril se pueden presentar manifestaciones hemorrgicas, como epistaxis, petequias, gingivorragias, y en casos ms raros hematemesis, melenas o hematurias. Si bien el Dengue clsico es usualmente benigno y autolimitado, se asocia con gran debilidad fsica y algunas veces con una convalecencia prolongada, pudiendo estar presentes las manifesta-
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ciones hemorrgicas, que no son exclusivas de la entidad clnica llamada fiebre hemorrgica de Dengue. La enfermedad cursa con viremia precoz y breve (desde un da antes de los sntomas hasta 3-5 das despus, aproximadamente) lesiones de engrosamiento endotelial, edema e infiltracin mononuclear en torno a los pequeos vasos. Fiebre hemorrgica de dengue Los sntomas iniciales son indistinguibles de los del Dengue clsico, pero evolucionan rpidamente las manifestaciones hemorrgicas, que son leves en la mayora de los casos (prueba del lazo positiva, petequias, epistaxis), pero pueden llegar a sufusiones hemorrgicas en la piel, el tubo digestivo, el sistema nervioso, el aparato urinario, o incluso las serosas, con derrame pleural. En los casos benignos o moderados, luego del descenso de la fiebre, el resto de los sntomas y signos retroceden. Generalmente los pacientes se recuperan espontneamente o luego de la terapia de reposicin hidroelectroltica (no hay terapia antiviral cuidadosamente evaluada). En los casos graves, rpidamente, o despus de un descenso de la fiebre entre el 3 y el 7 da, el estado del paciente empeora repentinamente, presentndose cianosis, taquipnea, hipotensin, hepatomegalia, hemorragias mltiples y falla circulatoria. La situacin es de corta duracin, pudiendo llevar a la muerte en 12 a 24 horas (1 a 10% de los casos), o a la rpida recuperacin luego del tratamiento antishock. Existe aumento de la permeabilidad vascular, hemoconcentracin, trombocitopenia, deplecin del fibringeno (y del factor VIII, factor XII, etc.) con concentracin elevada de sus productos de degradacin. Hay ascenso del tiempo de protrombina, tromboplastina y trombina. La albmina srica est disminuida, y se presentan albuminuria y leve ascenso de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). Las lesiones viscerales son edema, extravasacin sangunea, necrosis e infiltracin leucocitaria mononuclear.

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b) Viropexis
FAMILIA FLAVIVIRIDAE. RNA monocatenario de PMNHKIO6. Difieren de ALPHAVIRIDAE en la presencia de una protena matriz,en la falta de mRNAs intracelulares subgenmicos y en el brotamiento a partir del retculo endoplsmico. Son hemoglutinantes citoplsmicos.
Figura 7 - Virus Dengue : su ingreso a la clula.

5 +
3 (1) ntr ntr AAA
protenas virales
(2)
Se piensa que este cuadro resulta de una respuesta inmunopatolgica a una segunda infeccin, con un serotipo viral diferente del primero. La infeccin con un determinado serotipo protege en forma estable contra la reinfeccin con el serotipo homlogo, y transitoriamente contra otros serotipos. Pero al cabo de algunos meses la accin de esos anticuerpos puede producir un efecto inverso de facilitacin del dao. El nuevo serotipo viral forma complejos con anticuerpos preexistentes ya no neutralizantes y va receptores Fc gana acceso a monocitos, en los cuales se multiplica fcilmente y se disemina ampliamente.
AGENTE ETIOLGICO
El agente causal es un virus de la familia Flaviviridae: arbovi(4) rus (arthropod-borne) similar + al de la fiebre amarilla. Son virus envueltos, (por tanto, sensibles a la destruccin por Genoma Flaviviral agentes fsicos y qumicos), ( 10,862nt) de 40-50 nm de dimetro, 5 118nt 10,233NT 511nt 3 con cpside icosahdrica y Estructurales no estructurales CAP genoma de RNA monocaProcesamiento cotranslacional tenario, no segmentado, de ? polaridad positiva. ste opera directamente como mRNA NS5 C prM E NS1 NS2A NS2B NS3 ng4a NS4B COLGI protease? policistrnico. Signalese-like cleavage site El virus adhiere a las clupr M Cleavage after two basic residues las eucariotas, ingresa a ellas Novel cleavage specificity? por viropexis, se replica en el citoplasma y se ensambla en Figura 8 - El genoma Flaviviral y su expresin. el retculo endoplasmtico. Su genoma codifica una poliprotena que es luego procesada en 10 polipptidos: 3 estructurales (una protena de nucleocpside C, una membranosa prM y una glicoprotena de envoltura E, hemaglutinante, de adherencia) y 7 no estructurales, de los cuales destacamos NS1, que puede inducir, como E, respuesta inmune protectora.
+ (3)
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Se reconocen por variacin de la protena E cuatro tipos antignicos (llamados DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) sobre la base de ensayos de neutralizacin del efecto citoptico. Existe heterogeneidad de cepas dentro de cada tipo, que se correlaciona con variedad de secuencias de RNA, cuya identificacin en prM, E y NS1 tiene utilidad epidemiolgica. Las posibilidades de amplia variacin y supervivencia de estos virus son, sin embargo, menores que para otros virus RNA, a causa de su estricta adaptacin a dos hospederos diferentes.
ASPECTOS EPIDEMIOLGICOS
Vectores y reservorios Los vectores del Dengue son los mosquitos del gnero Aedes, y la especie ms importante en la transmisin es el Aedes aegypti. Otro vector de importancia epidemiolgica es el Aedes albopictus, de gran distribucin en Brasil. Es el vector de mantenimiento de la enfermedad en Asia, que ha sido introducido en Amrica y ha difundido en varios pases. Ambos vectores pertenecen al subgnero Stegomya. En otras zonas del planeta hay otras especies que actan como vectores. Aedes aegypti son artrpodos de clase Insecta, orden Diptera, familia Culicidae y subfamilia Culicinae, que incluye los gneros Aedes y Culex. Los huevos de Aedes y Culex no presentan los flotadores caractersticos de la subfamilia Anophelinae, transmisores de la malaria. Los de Aedes son depositados individualmente, y los de Culex en grupos flotantes. Las larvas de estos gneros cuelgan suspendidas diagonalmente de la superficie del agua, y no paralelas como en los anofelinos. Las larvas de mosquitos se colectan para obtener un registro positivo a falta de especmenes adultos, para realizar una identificacin ms precisa y sencilla que con stos, o para realizar estudios de infeccin y transmisin experimental. El adulto de Aedes aegypti, transmisor del Dengue y la fiebre amarilla, tiene un dorso marcado con bandas de color plateado o amarillo blanquecino sobre fondo oscuro, y un dibujo caracterstico en forma de lira en el dorso del trax. Las patas estn conspicuamente
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bandeadas, y el ltimo artejo de las patas posteriores es blanco. El abdomen de la hembra tiende a ser puntiagudo. Este gnero est extensamente distribuido dentro de los lmites de las latitudes 40N y 40S, pero es altamente susceptible a temperaturas extremas y a climas clidos secos. Los adultos pierden actividad por desecacin, o debajo de 12-14 C. Vuelan pocos metros, y pican de da o de noche en habitaciones de la vivienda junto a la que nacen. Cada hembra deposita relativamente pocos huevos (140 aproximadamente) durante una oviposicin (puede haber 2 o ms). Lo hace en colecciones de agua naturales o artificiales peridomiciliarias (charcos, tanques, cubiertas, recipientes descartables diversos, preferentemente de color oscuro) o en hoyos y cavidades de rboles y rocas. Los huevos pueden soportar la desecacin durante un ao, y eclosionar tras unos cuatro das de humedad. El vector fue erradicado de Amrica del Sur a mediados de siglo, pero a partir de 1980 aproximadamente se ha ido reintroduciendo en la mayora de los pases, incluyendo Uruguay (1996-1997), por transporte desde zonas infestadas en recipientes de agua no formales (tanques, cubiertas) que contienen huevos o larvas. Con ellos, se reintrodujeron en la regin los virus que transportan y las enfermedades que producen. En Uruguay es posible encontrar el mosquito en varias ciudades, con mxima concentracin en Mercedes y Fray Bentos; pero no los virus Dengue ni la enfermedad que generan, a excepcin de 20-30 casos donde la infeccin fue adquirida en el exterior. Aedes aegypti est presente en Argentina, en Bolivia (con ndices de infeccin larvaria de 5%), en Paraguay y en Brasil junto con A. Albopictus, y tambin en Ecuador, Colombia, Per, Venezuela y otros. La magnitud actual del problema de Aedes aegypti es mucho mayor que durante la anterior campaa de erradicacin, en trminos de extensin, urbanizacin, volumen y unidades de agua almacenada a cielo abierto y contaminada. Todas las poblaciones del mosquito en Amrica son ahora resistentes al DDT, y algunas lo son a temefs, malathin y piretroides. La fuente de infeccin y el reservorio vertebrado es el hombre. El virus del Dengue persiste en la naturaleza gracias al ciclo de transmisin hombre-Aedes aegypti-hombre. Secundariamente, contribuyen otros fenmenos: La replicacin del virus en el tracto genital del vector hace que aquel pueda incorporarse a los huevos y la progenie. Se puede producir transmisin sexual de machos infectados a hembras. Existen ciclos selvticos de infeccin, que pueden involucrar a monos y contribuir, en menor escala, al mantenimiento y la transmisin del virus, junto con el ciclo horizontal principal hombre-mosquito-hombre.
MODO DE TRANSMISIN
La transmisin es indirecta, a travs de los vectores biolgicos mencionados. Se realiza por la picadura del mosquito hembra infectado. Las hembras se infectan cuando se alimentan de sangre contaminada, cuyas protenas requieren para el desarrollo de los huevos. El insecto pica durante el da, y est muy adaptado al ambiente urbano. No hay transmisin por contacto directo con una persona enferma, o con sus secreciones, ni tampoco por contacto con fuentes de agua o alimentos.
PERIODO DE TRANSMISIBILIDAD
El tiempo intrnseco de transmisibilidad corresponde al de la viremia de la persona infectada.
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Comienza un da antes del inicio de la fiebre, y puede extenderse hasta el sexto u octavo da de la enfermedad. En el mosquito hembra infectado, el virus se multiplica en el epitelio intestinal, ganglios nerviosos, cuerpo graso y glndulas salivales del insecto, el cual permanece infectado y asintomtico toda su vida, que puede durar semanas o meses en condiciones de hibernacin. Luego de 7 a 14 das (tiempo de incubacin extrnseco) puede infectar al hombre por nueva picadura.
SUSCEPTIBILIDAD E INMUNIDAD
La susceptibilidad es universal. Aunque todos los serotipos pueden estimular la formacin de anticuerpos grupo y tipo especficos, la inmunidad inducida por un serotipo es poco protectora contra otro serotipo, mientras que la inmunidad conferida por la infeccin del virus es permanente para el serotipo que caus la infeccin. La respuesta inmunolgica frente a la infeccin aguda por dengue puede ser primaria o secundaria. En la respuesta primaria, ocurrida en individuos no expuestos previamente a flavivirus, los ttulos se elevan lentamente y no son muy altos. La respuesta secundaria se observa en aquellas personas con una infeccin aguda por Dengue, pero con experiencia de infeccin previa con un flavivirus (dengue u otro). En este caso, los ttulos de anticuerpos se elevan rpidamente a niveles altos. El origen de la susceptibilidad individual o colectiva referida a la fiebre hemorrgica de Dengue no est totalmente aclarado. Hemos mencionado el planteo que atribuye principalmente el proceso a un fenmeno inmunopatolgico. Una hiptesis muy aceptada se refiere a la multicausalidad por varios factores: Factores individuales: menor de 15 aos, lactantes, adultos de sexo femenino, raza blanca, buen estado nutricional, coexistencia de enfermedades crnicas (diabetes, asma, etc.), preexistencia de anticuerpos e intensidad de la respuesta previa. Factores virales: virulencia de la cepa circulante Factores epidemiolgicos: existencia de una poblacin susceptible, presencia de un vector eficiente, alta densidad del vector, intervalo de tiempo apropiado entre dos infecciones por serotipos diferentes (3 meses a 5 aos) y amplia circulacin del virus.
DIAGNSTICO
El trabajo diagnstico de laboratorio en relacin al dengue tiene por finalidad: La confirmacin de la enfermedad. La identificacin de los serotipos circulantes. La determinacin de los niveles de transmisin de la infeccin por medio de encuestas seroepidemiolgicas. En las reas con epidemias estudiadas y en curso, o con elevada endemicidad, no es necesario el estudio de laboratorio de todos los casos, y la actividad de laboratorio se dirige a la vigilancia de la difusin en nuevas reas o de la aparicin de nuevos serotipos, a la confirmacin de los casos graves o fatales, y al apoyo a las encuestas seroepidemiolgicas. La confirmacin de laboratorio de un caso de Dengue se hace por: Aislamiento del virus o identificacin de sus antgenos o cidos nucleicos a partir del suero del paciente o en muestras de necropsia. Demostracin de seroconversin (aumento 4X o ms en los ttulos IgG o IgM) en sueros pareados con intervalo de 14 a 21 das, o deteccin de IgM especfica (a partir del sptimo da de enfermedad) en presencia de una situacin clnica y epidemiolgica compatible.
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El aislamiento viral se realiza a partir de sangre, derivados u otros tejidos en: Cultivos celulares eucariotas, que pueden ser de mosquito (clona C6/36 de A. albopictus) o de vertebrados. En estos ltimos, a diferencia de los primeros, es posible observar efecto citoptico a partir de los 5-14 das de inoculacin. En cualquier caso, la identificacin viral debe completarse sobre los cultivos por inmunofluorescencia, neutralizacin u otras reacciones. Ratones recin nacidos o mosquitos susceptibles, no vectores, por va intratorcica. La muestra de sangre para aislamiento viral debe ser obtenida entre el primero y el quinto da de la enfermedad, perodo de viremia. La investigacin de antgenos o cidos nucleicos virales por inmunofluorescencia, inmunohistoqumica, sondas marcadas o RT- PCR no se utiliza de rutina. Esta ltima, que es muy sensible y especfica, puede utilizarse para deteccin precoz. La investigacin de IgM especfica antiviral es un ensayo que se puede realizar precozmente, aunque no es altamente sensible ni especfico. Se realiza por ELISA de captura (MAC-ELISA) y puede ser positiva por 2 a 3 meses. La demostracin de seroconversin puede hacerse por inmunofluorescencia, fijacin de complemento, neutralizacin, inhibicin de la hemoaglutinacin (IH) o ELISA. El mtodo de referencia, sensible y especfico, es el de neutralizacin. En encuestas seroepidemiolgicas se utilizan el ELISA o la IH, que es un ensayo barato y sencillo, que detecta anticuerpos de aparicin precoz y persistencia prolongada. El MSP ha difundido en 2003 un instructivo para la vigilancia epidemiolgica y el diagnstico del dengue, que es necesario conocer. Vistas la difusin del vector, su ubicuidad, su resistencia, y las facilidades crecientes que provee la organizacin social actual para su persistencia, es ampliamente discutida la posibilidad de su erradicacin. Sin embargo la iniciativa est planteada, a instancias de Brasil, y debe involucrar el compromiso de los estados, la educacin y la participacin activa de la comunidad. Las acciones deben estar guiadas por encuestas y vigilancia de distribucin y prevalencia de los vectores. Es necesario el drenaje de aguas estancadas, la eliminacin de colecciones anormales peridomiciliarias, la proteccin de los depsitos de uso, y el control de las cargas y el transporte regional. El bloqueo del contacto personal y grupal puede favorecerse con mallas, repelentes e insecticidas. El uso de plaguicidas debe hacerse evitando el dao a la vida silvestre y los cultivos. Es posible estimular la presencia de depredadores (artrpodos, peces y otros seres vivos), y regular la vegetacin para proteger su accin. Se encuentran en ensayo las tcnicas de modificacin gentica de los mosquitos para orientar la prevalencia de poblaciones incompetentes para la transmisin de los virus. La vigilancia epidemiolgica debe incluir: el seguimiento del vector; el alerta ante afecciones febriles o exantemas sugestivos, y la asignacin y organizacin de recursos para estudios de laboratorio. Se investiga sobre posibles preparados inmunizantes (vacunas) basados en protena NS1 o en combinacin de serotipos de cepas atenuadas.
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Cuadro 2.
Enfermedad Kuru Sntomas tpicos Prdida de coordinacin, seguida de demencia Va de adquisicin Infeccin (probablemente por antropofagia) Distribucin Conocido solo en Nueva Guinea; 2600 casos desde 1957 Espordico: 1 caso por milln Sobrevida con la enfermedad 3 meses a un ao
CreutzfeldtJakob
Demencia, seguida Usualmente descode perdida de nocida (espordico) coordinacin
Aproximadamente 1 ao
10 a 15% por herenHereditaria: cia del gen mutado que codifica para la han sido idenprotena prionica PrP . tificadas 100 familias
GerstmannStrausslerScheinker Insomnio familiar fatal
Prdida de la coordinacin, seguida de demencia Trastornos del sueo y alteraciones de SNA, seguidos de insomnio y demencia
Infecciosa: han Raramente por infeccin (iatrogenia) sido identificados 160 casos Herencia de una Han sido De 2 a 6 aos mutacin en el gen identificadas PrP 50 familias. Herencia de una 9 familias han Aproximadamutacin en el gen sido identifimente 1 ao PrP cadas
Priones: agentes de encefalopatas transmisibles

INTRODUCCIN
Quizs la mejor definicin de un prin es proteinaeceous infectious particle, es decir partcula proteica infecciosa que carece de cido nucleico (S. Prusiner, 1997). La resistencia demostrada a los tratamientos qumicos y fsicos que normalmente inactivan a los virus y las bacterias, asociada a la falta de respuesta inmune humoral o celular detectable ubican a estos agentes en una categora aparte de estos microorganismos. Se cree que los priones son el resultado de alteraciones en la conformacin de la protena celular prinica normal (PrPc), transmitidas de individuo a individuo o genticamente; aunque se ha visto que tambin pueden causar enfermedades espordicas en las cuales ninguno de los orgenes citados se ven involucrados. Lo que es ms, existen indicios de que en las enfermedades prinicas podran estar involucrados otros agentes. Las formas ms comunes de enfermedades prinicas, todas fatales, se agrupan bajo la designacin de encefalopatas espongiformes transmisibles (EET). La presencia de mltiples vacuolas en el tejido cerebral se denomina cambio espongiforme. Todas las EET que involucran de forma exclusiva al sistema nervioso central (SNC) se caracterizan por un perodo de incubacin prolongado, seguido por un curso clnico progresivo de aproximadamente 1 ao cuyo desenlace es fatal. Estas enfermedades estn ampliamente difundidas en animales. Otra caracterstica que distingue a este tipo de afecciones es su capacidad de generar un estado de indiferencia inmunolgica, en el cual no existe reaccin inflamatoria ni respuesta
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inmune en los tejidos afectados (SNC). Los cambios histolgicos tpicos observados en todas las especies afectadas son: vacuolizacin y prdida neuronal, proliferacin e hipertrofia de los astrocitos y poca respuesta inflamatoria.
PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS
Los instrumentos de neurociruga y los electrodos cerebrales constituyen un medio para la transmisin de estos agentes; slo los procedimientos ms enrgicos de esterilizacin aseguran la no infecciosidad prinica de los mismos en caso de ser reutilizados. Los agentes causales son resistentes a los procedimientos de desinfeccin utilizados para destruir los virus, entre ellos el fomaldehdo, detergentes y radiaciones ionizantes. El autoclave a 134 C, o a 15 libras (1 atm. relativa, 121 C) durante 1 hora, en vez de 20 minutos como se usa normalmente, en forma combinada con la solucin de hipoclorito al 5% o el NaOH 1,0M se pueden emplear para la descontaminacin.
ESTRUCTURA
Las enfermedades prinicas resultan de la alteracin conformacional de la PrPc, una glicoprotena de la superficie celular expresada en el cerebro, mdula espinal y vsceras. Entre las enfermedades animales, la ms conocida es la enfermedad de scrapie detectada en cabras y ovejas, descripta por primera vez en 1732, caracterizada por prdida de coordinacin, debilidad muscular, irritabilidad y en algunos casos, desarrollo de un intenso prurito que lleva a los animales a perder tanto el pelo como la lana por lesiones de rascado (de ah su nombre). Se ha utilizado como prototipo de estudio de estos agentes al causante de esta enfermedad. PrPsc (protena prion del scrapie), es una isoforma de PrPc resistente a la proteasa K. Aun-
Figura 2. Evolucin temporal de la epidemia de encefalitis espongiforme bovina en el Reino Unido, 1986-2000, con las fechas de las principales intervenciones preventivas. La prohibicin sobre alimentacin animal con racin conteniendo carne y huesos de mamferos (marzo de 1996) extendi una prohibicin de 1994 que se refera slo a algunas especies de granja. SBO ban = specified bovine offals ban (prohibicin de consumo de cerebro, mdula, timo, bazo, amgdalas e intestinos de ganado mayor de 6 meses).
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que mucho se sabe del rol patognico de la PrPsc, su fisiopatologa es todava mal conocida, pero algunas lneas de investigacin sugieren que tendra participacin en el metabolismo del cobre. Estas partculas pueden ser susceptibles a los agentes que desnaturalizan las protenas, pero son resistentes a los que modifican los cidos nucleicos, lo que contribuye a confirmar que las protenas son el componente esencial de las partculas infectantes. Como argumentos a favor de que estas partculas infecciosas no son virus, tenemos que nunca han podido observarse al microscopio electrnico, ni cultivarse en ningn tipo celular, ni se han encontrado rastros de ADN o ARN mediante tcnicas de biologa molecular. El hombre (en el cromosoma 20) y algunos animales, codifican una protena PrPc (protena celular prinica) ntimamente relacionada con la PrPsc en cuanto a la secuencia de aminocidos, pero diferente en muchas de sus propiedades. Las diferencias en las modificaciones postraduccin hacen que las dos protenas se comporten de modo diferente. La PrPc normal consiste en 4 hlices (regiones en las que el esqueleto proteico est arrollado formando una hlice), mientras que la PrPsc contiene cadenas (regiones donde el esqueleto est completamente extendido) formando hojas plegadas . Se han propuesto muchas teoras para explicar la produccin de enfermedad por una protena aberrante. Stanley Prusiner (Premio Nobel 1997) sugiri un modelo actualmente aceptado, segn el cual la PrPsc se une a la PrPc normal presente en la superficie celular y hace que sea procesada en PrPsc, que despus se agrega para formar placas similares a amiloides en el cerebro. Existen adems otras enfermedades por depsitos de protenas amiloides distintas de la PrPsc (enfermedad de Alzheimer, amiloidosis secundaria y mieloma mltiple), en las cuales existe el mismo proceso de propagacin de configuracin molecular sin que por ello el nuevo material resulte infeccioso para otros individuos. La clula repone la PrPc consumida y el ciclo contina. El hecho de que estas placas se compongan de protenas del hesped explicara la falta de respuesta inmune frente a estos agentes en los pacientes con encefalopata espongiforme. Los efectos de la acumulacin en el cerebro de esta protena aberrante (PrPsc) son los responsables, posteriormente, de los sntomas de la enfermedad.
PrPsc Globular S Si Vesculas citoplasmticas Das PrPc Extendida No No Membrana plasmtica Horas
Estructura Resistencia a las proteasas Presencia de fibrillas de scrapie Localizacin en clulas Renovacin
ENCEFALOPATAS ESPONGIFORMES EN HUMANOS
Kuru Es una enfermedad prcticamente extinguida. Sus orgenes se remontan a los habitantes de la tribu Fore en la regin montaosa de Papua, Nueva Guinea. Fue la primera enfermedad humana familiar progresiva, degenerativa, que se demostr que era transmisible a animales. La enfermedad fue llamada kuru, que en lenguaje nativo significa temblor o miedo asociado al fro. La transmisin guardaba relacin con ceremonias y rituales funerarios desarrollados por estas tribus, en las que se vieron predominantemente afectados los nios y las mujeres. Posteriormente, los estudios de Gajdusek y Zigas, en 1957, demostraron que la transmisibilidad
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se relacionaba con la ingestin de fludos y tejidos corporales humanos, entre ellos el cerebro, conteniendo las concentraciones ms elevadas del agente causal. Entre el momento de la infeccin y la aparicin de los sntomas puede existir una latencia de hasta 30 aos. El cuadro clnico se caracteriza por su progresividad y corta duracin, ya que los pacientes mueren en menos de un ao de su inicio. Aparecen bruscamente ataxia cerebelosa, temblor fino caracterstico, y en pocos meses el paciente es incapaz de caminar o estar de pie. Adems presenta progresiva dificultad para el habla, llegando a ser ininteligible. En la etapa terminal, el deterioro mental y la dificultad en la deglucin, a lo que se agregan la incontinencia esfinteriana y las lceras de dcubito, llevan al paciente a la muerte.
ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB
Esta enfermedad esta distribuda en todo el mundo, afectado todas las razas as como a ambos sexos. Su edad media de presentacin es la sexta dcada de la vida. El cuadro clnico se caracteriza por trastornos sensitivos, confusin, nerviosismo, alteraciones de la memoria, tensin, trastornos del sueo que progresan en semanas o meses a demencia franca, y finalmente coma. Suelen evidenciarse hallazgos patolgicos en el EEG. En etapas avanzadas agrega crisis convulsivas y trastornos neurovegetativos, conduciendo a la muerte en 6 a 12 meses. Los tres tipos epidemiolgicos clsicos de ocurrencia de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) son: la forma espordica que comprende el 85-90% de los casos, teniendo una incidencia mundial de 1 por 1.000.000 al ao y cuya causa podra corresponder a mutaciones somticas espontneas (algunas muy bien caracterizadas); la hereditaria, 10-15% de los casos, asociada a mutacin en el gen PrP , y finalmente, la iatrognica, la ms rara, cuyo modo de transmisin sera por medio de tejidos transplantados contaminados como por ej. crnea, o por contacto con instrumental quirrgico como electrodos cerebrales, o bien mediante tratamientos en la dcada de 1980 con hormona de crecimiento extrada de hipfisis de seres humanos. En los ltimos aos, se ha descripto una nueva variante de enfermedad de CreutzfeldtJakob (nvECJ) que afecta a individuos ms jvenes, entre 15 y 44 aos, la cual se piensa se produce por ingesta de productos crnicos contaminados con el agente de la encefalopata espongiforme bovina (EEB). La protena prinica responsable de esta patologa (nvPrPsc) se diferencia de la protena que se encuentra en la ECJ espordica o familiar por predominar en forma di-glicosilada, mientras que en los casos espordicos predomina la forma monoglicosilada. Una joven de 13 aos en el Reino Unido fue el caso clnico fatal documentado ms precoz de esta enfermedad, que ha afectado a ms de 160 personas y que podra estar siendo incubada por muchas ms. El diagnstico se realiza con base en la clnica, la imagenologa de resonancia magntica y el electroencefalograma (EEG). La presencia de la protena llamada 14-3-3 en el lquido cefalorraqudeo (LCR) parece tener valor diagnstico. Todos los pacientes con nvECJ examinados hasta el momento son homocigticos para metionina en el codon polimrfico 129 del gen PrP en el cromosoma 20. Las personas con otro genotipo, que son la mayora, podran ser ms resistentes. La confirmacin diagnstica (en el hombre y animales) se hace slo por anatoma patolgica.
ENFERMEDAD DE GERSTMANN-STRAUSSLER-SCHEINKER
Dicha enfermedad tiene la particularidad de ser siempre familiar, siendo su cuadro clnico constitudo por trastornos de la marcha e inestabilidad, algunas veces acompaadas de dolores
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y parestesias en miembros inferiores. Lo caracterstico es la ataxia cerebelosa con alteraciones del habla y ausencia de reflejos osteotendinosos, evolucionando a la demencia. Su inicio es habitualmente a los 50 aos y la duracin entre 2 y 10 aos. Se han identificado tres formas que varan en cuanto al sitio de mutacin del gen PrP: atxica (donde existe sustitucin de citosina por timina; codificando entonces en vez de prolina, leucina); forma telenceflica o demencial y otra muy similar a la primera.
INSOMNIO FATAL FAMILIAR
Esta enfermedad se caracteriza por insomnio progresivo y degeneracin neuronal de los ncleos del tlamo, constituyendo la primera enfermedad degenerativa genticamente limitada a los ncleos del tlamo, la cual fue descripta por primera vez por Elio Lugaresi y colaboradores en Italia en 1986. Al igual que la ECJ podra presentarse bajo forma familiar o espordica. Esta enfermedad y un subtipo de la ECJ son dos entidades clnicas y patolgicamente distintas pero ligadas a una misma mutacin en el codn 178 del gen PrP que lleva a la sustitucin de cido asprtico por aspargina.
ENCEFALOPATAS ESPONGIFORMES EN ANIMALES
En animales han sido descriptas varias encefalopatas espongiformes: enfermedad temblorosa natural o Scrapie, anteriormente mencionada, caracterizada por mostrar en el cerebro ovino fibrillas asociadas a scrapie (FAS), en las que se hallaba el prin; encefalopata espongiforme del visn (la que se adquiere por el consumo de cadveres de animales contaminados); enfermedad de debilitamiento de rumiantes salvajes (en ciervos cautivos), encefalitis espongiforme felina, que afecta a los gatos, y finalmente la encefalopata espongiforme bovina, vulgarmente llamada mal de las vacas locas descripta en Inglaterra en 1986, despus que comenz a afectar bovinos en Gran Bretaa que desarrollaban incoordinacin, temblores y fotofobia. El prin causante de esta enfermedad puede saltar de una especie a otra afectando diferentes mamferos, a los que se agrega su ms reciente conquista: el hombre. La enfermedad, que se convirti en epidemia, se debi al consumo por el ganado vacuno de suplemento alimentario elaborado con base en harinas de carnes y huesos de ovejas muertas contaminadas con Scrapie, tras un perodo de incubacin estimado en 2 a 8 aos. Epidemiologa La encefalopata espongiforme bovina ha adquirido mayor trascendencia en los ltimos aos debido a la epidemia entre el ganado vacuno detectada en 1986 en Gran Bretaa. Este problema lejos de haber sido resuelto contina generando controversias en cuanto a las polticas de control sanitario por parte de las autoridades y las prdidas econmicas que implican a los pases involucrados. Sin dudas, Gran Bretaa es el pas ms gravemente afectado, con cifras que estiman que entre 200 y 300 terneros infectados con EEB llegan a las carniceras para ser consumidos cada ao, a pesar de las medidas adoptadas a partir de junio de 1989 en que se elimin del mercado la racin compuesta de desechos de ganado ovino y, por ley, slo se destinan para consumo humano los terneros menores de 30 meses de edad. En ese mismo ao, la Unin Europea prohibi al Reino Unido las exportaciones de ganado vacuno nacido antes de julio de 1988 y recin 7 aos ms tarde se prohibieron mundialmente las exportaciones de carne del Reino Unido, incluyendo otros productos como semen, embriones y materia prima usada en la manufactura de productos mdicos, cosmticos y farmacuticos.
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La descripcin de un grupo de casos de nvECJ en el Reino Unido relacionados en tiempo y espacio con una epidemia de EEB en bovinos se considera como el primer ejemplo de un brote epidmico de EET en seres humanos, y apunta a una clara posibilidad de transmisin interespecfica de priones, de bovinos al hombre. En las islas britnicas se informaron hasta el ao 2000 ms de 180.000 casos bovinos. En Suiza, Portugal y Francia, cientos. En Amrica se han informado casos en Canad, Estados Unidos e islas Malvinas. No hay casos reconocidos de enfermedad animal en el subcontinente sudamericano, ni en Uruguay. Los casos humanos de nvECJ informados en todo el mundo son hasta el momento ms de 160, localizados principalmente en el Reino Unido. El riesgo de adquirir esta enfermedad a partir de alimentos contaminados parece ser bajo, probablemente por existencia de una barrera entre especies que provee proteccin importante aunque incompleta. En pases como Nueva Zelandia, Canad y Estados Unidos se han adoptado medidas preventivas drsticas, excluyendo como donantes de sangre aquellos individuos que vivieron por perodos mayores a seis meses en Gran Bretaa entre los aos 1980 y 1996, debido a la vinculacin de la nvECJ con los linfocitos B1, ya que los procesos de filtracin no son 100% seguros. Se podra pensar que como en nuestro pas la alimentacin del ganado bovino y ovino es predominantemente en base a pastoreo y no con raciones de origen animal, no existir este tipo de enfermedad. Sin embargo la vigilancia podra fallar como en Europa, el diagnstico puede omitirse o los animales podran ser faenados en etapas ms tempranas, todo lo cual contribuira a subestimar el nmero de casos. Precisamente porque la enfermedad pudiera ser no tan ajena al Uruguay como se pretende, sera conveniente alertar contra el consumo de rganos del SNC de bovinos, ovinos o cualquier otro mamfero (debido a la extrema resistencia de los priones al calor, por los mtodos de coccin convencionales). En conclusin, estas patologas pertenecen a un grupo de afecciones del SNC del ser humano y algunos animales que los cientficos denominan enfermedades neurodegenerativas transmisibles. Todas comparten un perodo de incubacin prolongado, la aparicin en el cerebro de protenas amiloides y vacuolas, dando el caracterstico aspecto esponjoso, la produccin de temblores incontrolados y el mecanismo de transmisin potencial entre individuos.
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SECCIN
IV
Control de poblaciones microbianas

32. Inmunoprolaxis. Vacunas 33. Esterilizacin, desinfeccin y antisepsia 34. Principales grupos de antibiticos 35. Principales mecanismos de resistencia antibitica 36. Mtodos de estudio de la sensibilidad antibitica 37. Antivirales
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Inmunoprolaxis Vacunas
P. Barrios
Resea histrica e introduccin

Las enfermedades infecciosas continan siendo un importante problema para la salud. Histricamente, la inmunizacin profilctica contra las enfermedades infecciosas es el punto de arranque de la inmunologa, y constituye uno de los ms eficaces y espectaculares logros de la medicina. Enfermedades que fueron en otro tiempo verdaderos azotes de la humanidad, han quedado reducidas a casos espordicos e incluso uno de ellos, la viruela, se considera oficialmente erradicada del planeta. No se conoce con certeza cundo tuvieron lugar los primeros intentos de inmunizacin activa, pero se sabe que en el ao 1.000 a.C., en la India, se inoculaba a sujetos sanos material de las pstulas de enfermos con viruela, con objeto de obtener proteccin frente a la enfermedad. La infeccin transmitida con esta prctica, llamada variolizacin, era ms leve y con menor mortalidad que la infeccin adquirida de forma natural. El primer intento cientfico de vacunacin contra la viruela lo realiz en 1796 Edward Jenner, a quien puede considerarse el padre de la vacunologa, junto con Pasteur. El trmino vacunacin surge de los primeros intentos en desarrollar proteccin frente a patgenos para los cuales se utiliz el virus variola vaccinae. Jenner inocul a seres humanos el material de las vesculas de la variola vaccinae, una enfermedad del ganado vacuno producida por un Orthopoxvirus similar al virus de la viruela, y obtuvo proteccin de los inoculados frente a la viruela. Esto se llev a cabo en una poca en que se desconoca totalmente la naturaleza de las enfermedades infecciosas y de los procesos inmunolgicos. 100 aos ms tarde (1885) Pasteur enunci el principio general en que se basa la vacunacin. Las mdulas espinales desecadas de conejos infectados con el virus de la rabia y los bacilos de carbunco sometidos a calentamiento que prepar Pasteur, fueron los verdaderos predecesores de las vacunas actuales. Con todos estos logros, Pasteur demostr que era posible inmunizar frente a una enfermedad utilizando el microorganismo causante de la misma atenuado por varios procedimientos, a diferencia de Jenner, que haba utilizado un virus parecido pero distinto al de la enfermedad frente a la cual quera lograr proteccin. Pasteur tampoco tena un conocimiento claro de la memoria inmunitaria, ni de las funciones de los linfocitos, y tendra que transcurrir otro siglo ms para que estos fenmenos se conocieran. En al ao 1950 Hilary Koprowski administr una cepa atenuada de poliovirus a varias personas. En el ao 1954 comenz a administrarse la vacuna de poliovirus muertos creada por
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Salk, y en 1957 se dispuso de la vacuna oral de poliovirus atenuados creada por Sabin, que haba continuado las investigaciones de Koprowski. El mecanismo de la vacunacin se aclar con Burnet cuando enunci la teora de la seleccin clonal (1957) y cuando se descubrieron los linfocitos T y B (1965). Sin embargo, a pesar de los grandes avances que hemos logrado en la historia de la humanidad, estamos lejos de contar con una inmunoprofilaxis activa contra todas las enfermedades infecciosas trasmisibles existentes, debido a que no conocemos en muchos casos los determinantes antignicos y sus vas de inoculacin adecuadas para lograr una respuesta protectora, eficaz y duradera. El objetivo final de la inmunizacin es la erradicacin de la enfermedad; el objetivo inmediato es prevenir la enfermedad en los individuos o en los grupos. La erradicacin global de la viruela en 1977 y la eliminacin en Amrica desde 1991 de la poliomielitis causada por poliovirus salvajes, sirven como modelos de control de las enfermedades a travs de la inmunizacin. Ambos logros se obtuvieron gracias a la combinacin de un programa de inmunizacin eficaz con una vigilancia intensa y medidas eficaces de control de salud pblica en todo el mundo.
Tipos de inmunizacin
La inmunizacin o adquisicin de proteccin contra una enfermedad se puede lograr por medios pasivos y activos. Inmunizacin pasiva: consiste en la administracin de anticuerpos preformados, con actividad protectora. Puede ser adquirida natural o artificialmente. La inmunizacin pasiva natural es el caso de la transferencia de inmunoglobulinas desde la madre al feto a travs de la placenta (IgG) o de la leche materna (IgA). La inmunidad pasiva puede tambin ser adquirida artificialmente con la administracin de un suero rico en anticuerpos con actividad protectora conocida frente a determinado microorganismo o sus productos (por ejemplo suero con anticuerpos neutralizantes de una toxina bacteriana). La inmunizacin pasiva est indicada en personas con deficiencias en la sntesis de anticuerpos como resultado de defectos adquiridos o congnitos de los linfocitos B; tambin cuando una persona susceptible a una enfermedad est expuesta a ella, especialmente cuando corre un riesgo elevado de complicaciones por la enfermedad o cuando el tiempo no permite una proteccin suficiente por inmunizacin activa. Tambin es utilizada en teraputica, cuando ya existe la enfermedad y los anticuerpos podran mejorarla, o ayudar a suprimir los efectos de una toxina, o a suprimir la respuesta inflamatoria. Inmunizacin activa: al igual que la inmunizacin pasiva, esta puede ser adquirida natural o artificialmente. Lo primero ocurre por exposicin a diferentes patgenos que conducen a la infeccin clnica o subclnica, desarrollando una respuesta inmune protectora contra estos patgenos; lo segundo es lo que denominamos vacunacin. La vacunacin consiste en la administracin de un inmungeno, es decir un preparado antignico, capaz de estimular al sistema inmune produciendo una respuesta que resulta protectora frente al encuentro posterior con el agente patgeno contra el que se desea inmunizar. Estos preparados antignicos pueden estar compuestos de microorganismos enteros inactivados o atenuados, subunidades microbianas o productos modificados (por ejemplo un toxoide, un antgeno purificado o un antgeno producido por ingeniera gentica). Una vacuna entonces debe ser capaz de conferir en el individuo receptor un estado de inmunidad protectora (similarmente a lo que ocurre en la infeccin natural), sin producir enfermedad. La inmunizacin puede dar como resultado una actividad antitoxina, antiinvasora, neutra-
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lizante u otros tipos de respuesta humoral o celular protectora en el receptor. Algunas vacunas inducen alto grado de proteccin contra la enfermedad durante toda la vida, mientras que otras brindan proteccin parcial, siendo muy frecuente que deban administrarse varias dosis de refuerzo para permitir mantener la inmunidad adecuada.
Componentes de una vacuna

Una vacuna est compuesta en primer lugar por los antgenos inmunizantes activos, que en algunos casos consisten en un nico antgeno bien definido (por ejemplo polisacrido capsular neumoccico o toxoide tetnico o diftrico), y en otros casos constituyen mezclas antignicas complejas (por ejemplo vacunas a virus vivos o a bacterias inactivadas). Los microorganismos presentan una estructura antignica ms o menos compleja en funcin de su propia complejidad estructural. No todos los antgenos participan de la misma forma en la induccin de la respuesta inmune, y aunque la induzcan no todos provocan una respuesta de carcter protector. Aquellos antgenos microbianos que inducen respuestas que neutralizan el efecto patognico del microorganismo se denominan antgenos protectores. Muchas veces las vacunas contienen no solamente estos antgenos sino otros que provocan una serie de respuestas irrelevantes desde el punto de vista de la proteccin, pero que pueden ser responsables de reacciones adversas de la vacunacin (es el caso de las vacunas a microorganismos enteros). Los antgenos pueden encontrarse puros en suspensin acuosa pero tambin pueden formar parte de mezclas ms complejas, conteniendo componentes derivados del sistema biolgico en el cual se produce la vacuna (medio de cultivo, productos metablicos secretados, etc.). Estos componentes secundarios muchas veces contribuyen a que existan reacciones no deseadas, producto de la vacunacin. Muchas veces los preparados vacunales contienen adems conservadores, estabilizadores, antibiticos y adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta inmune frente a un antgeno dado, sin estar antignicamente relacionados con l. Las sales de aluminio constituyen el adyuvante permitido para vacunas de uso humano. Se utilizan mezcladas (en forma de hidrxido o de fosfato) con los preparados antignicos en la formulacin de vacunas. Este es el caso de las vacunas a toxoides (diftrico, tetnico), en las que las sales de aluminio transforman el toxoide soluble en un precipitado particulado de mayor inmunogenicidad. La bsqueda de nuevos adyuvantes potentes y seguros es un gran rea de investigacin en los laboratorios de desarrollo de vacunas de todo el mundo.
Principios de la vacunacin
Para inmunizar activamente a un individuo o una poblacin frente a un agente debemos elegir el inmungeno adecuado a administrar. Para ello es necesario conocer el agente infeccioso y su estructura, conocer sus mecanismos patognicos, determinar cual o cuales son los determinantes antignicos que confieren una respuesta protectora, determinar tipo y localizacin de la respuesta protectora, desarrollar una vacuna segura y efectiva, conocer la poblacin o los individuos que van a ser vacunados (si ya han estado expuestos, si ya fueron vacunados, si tienen anticuerpos sricos). El logro de una resistencia efectiva contra una infeccin o enfermedad, depender de que la vacuna posea ciertas propiedades. Algunos principios importantes son: Deben inducir el tipo de inmunidad que es relevante para proteger contra el patgeno en particular; por ejemplo la inmunidad a la tuberculosis requiere de una efectiva respuesta
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de clulas T, mientras que la inmunidad frente a la poliomielitis requiere una respuesta apropiada de tipo humoral. Debe inducir una respuesta inmune en el sitio adecuado: por ejemplo, para obtener proteccin contra Influenza o contra el clera es deseable la induccin de anticuerpos secretados de tipo IgA a nivel de las superficies mucosas. Debe inducir una respuesta inmune frente a los antgenos apropiados. Los microorganismos poseen muchos antgenos distintos. Durante la infeccin natural se desarrolla respuesta contra varios de estos antgenos, aunque la resistencia posterior a la infeccin depende de un pequeo nmero de eptopes, en general presentes en la superficie del microorganismo. Antgenos de superficie relevantes han sido caracterizados para muchas bacterias y virus, pero an queda mucho por conocer. La resistencia a algunas enfermedades infecciosas no depende de la inmunidad ante el agente infeccioso. Como en el caso del ttanos o de la difteria, la enfermedad es debida a la accin de toxinas. En estos casos la vacuna efectiva consistir en un preparado de toxina modificada de modo que pierda su actividad txica manteniendo su antigenicidad. Otras veces, la enfermedad natural no confiere inmunidad (debido a mecanismos de evasin del sistema inmune por parte del patgeno) como es el caso de varias infecciones parasitarias. La enfermedad debe justificar la vacunacin. Muchas enfermedades infecciosas producen en general cuadros leves que no representan un riesgo para la salud. Sin embargo, en ciertos individuos especialmente susceptibles pueden causar complicaciones graves. Es as que varias vacunas estn indicadas especialmente para ciertos grupos de riesgo. Es el caso de la vacuna contra Influenza para pacientes aosos o con enfermedad respiratoria crnica. Debe conferir proteccin a largo plazo. Muchas veces la duracin del efecto protector depende del tipo de infeccin. En el caso de infecciones sistmicas con perodos de incubacin prolongados, son suficientes niveles residuales de inmunidad para que la respuesta pueda ser amplificada en este perodo, permitiendo el control de la infeccin previo al cuadro clnico. Por el contrario en infecciones de incubacin breve (como es el caso de muchas infecciones de la superficie cutaneomucosa) si existe un bajo nivel de inmunidad frente a una exposicin al agente, este puede ser capaz de producir la enfermedad antes de que haya suficiente tiempo para montar una respuesta amplificada que controle la infeccin. Es as que es difcil inducir inmunidad de larga duracin contra Influenza virus, pero es ms fcil contra sarampin.
Clasificacin de las vacunas

Existen dos categoras generales de vacunas: las basadas en microorganismos vivos y aquellas compuestas por microorganismos inactivados o subunidades de los mismos. Las vacunas a microorganismos vivos consisten en preparados conteniendo bacterias o virus capaces de producir una infeccin y replicarse en los tejidos del receptor sin causar enfermedad actuando como inmungenos, es decir induciendo una respuesta inmune especfica contra el patgeno. Una vacuna inactivada consiste en un inmungeno que no es capaz de establecer una infeccin y por lo tanto no es mantenido o replicado en el individuo receptor. La decisin estratgica para el uso de una vacuna viva o una inactivada debe realizarse
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considerando la epidemiologa y la inmunobiologa de la infeccin natural, y por supuesto considerando tambin la factibilidad tcnica de las distintas aproximaciones.
VACUNAS INACTIVADAS
Existen distintos medios, tanto fsicos como qumicos, por los cuales se logra inactivar los microorganismos para evitar los efectos de la infeccin, pero se preserva su estructura antignica. Este tipo de vacunas tiene como principal ventaja la seguridad, ya que no implica riesgo de infeccin. Esto es una caracterstica que las hace idneas para su administracin en pacientes inmunodeprimidos. Algunas de sus desventajas son: necesitan una masa antignica mayor para estimular la respuesta adecuada; requieren la administracin peridica de dosis de refuerzo para mantener una inmunidad duradera; generalmente solo son capaces de producir una respuesta de tipo humoral, por lo que no son apropiadas para proteger contra aquellas enfermedades infecciosas para las cuales los mecanismos inmunes protectores son esencialmente mediados por clulas. Vacunas a microorganismos enteros inactivados Son preparados que se administran con el propsito de inducir la formacin de anticuerpos frente a muchos antgenos distintos, algunos de los cuales resultarn protectores. Las vacunas a bacterias enteras inactivadas fueron desarrolladas hace varias dcadas. Como ejemplo se encuentra la vacuna para prevenir la tos convulsa, que consiste en una suspensin de bacterias en fase I de Bordetella pertussis que fueron inactivadas por procedimientos qumicos (tratamiento con fenol o thimerosal). Estas primeras vacunas no eran sujetas a purificaciones muy estrictas, por lo que producan un nivel elevado de reactogenicidad. A medida que se fueron desarrrollando tcnicas bioqumicas de separacin y purificacin, este tipo de vacunas se fueron perfeccionando. Actualmente, la vacuna contra la tos convulsa es administrada a nios entre dos meses y cinco aos aunque est contraindicada en nios con enfermedad neurolgica evolutiva, reacciones de hipersensibilidad a la vacuna y convulsiones luego de recibir alguna dosis de la vacuna. Existen vacunas acelulares (compuestas por subunidades bacterianas purificadas) de B. pertussis que en nuestro pas no forman parte del esquema nacional de vacunacin pero estn disponibles en algunos laboratorios. En Japn y Estados Unidos hay estudios que demuestran disminucin de convulsiones asociadas a la vacuna pertussis con el uso de la vacuna acelular. Las vacunas a virus inactivados son en general muy bien toleradas, ya que el tipo de medios de cultivo utilizado para la propagacin viral, una vez libre de clulas resulta muy poco reactognico. Las partculas virales son inactivadas qumicamente (tipicamente con formalina), purificadas y administradas como vacunas con sales de aluminio como adyuvante. Esta estrategia clsica para las vacunas virales ha posibilitado la produccin de muchas vacunas eficaces y contina siendo la tecnologa de eleccin para la mayora de las vacunas virales.
Vacuna de Salk contra el virus de la polio (agente de la poliomielitis)
Existen tres poliovirus, tipos 1, 2 y 3. La poliomielitis es una enfermedad que puede cursar asintomtica o producir una meningitis asptica o una parlisis flcida asimtrica. Comienza con una infeccin a nivel de faringe e intestino que puede pasar desapercibida o paucisintomtica, pero que se puede diseminar por va hematgena para producir las formas ms graves. La inmunidad contra esta enfermedad se logra por inmunizacin o luego de la infeccin natural, pero la infeccin por poliovirus genera inmunidad de por vida solo contra el tipo de
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poliovirus causal (tipo 1, 2, o 3). Desde el ao 1991, Amrica est libre de la enfermedad paraltica causada por el virus salvaje. Contina siendo endmica en muchos pases de frica Central y sudeste asitico. Existen dos tipos de vacunas contra la poliomielitis: vacuna oral viva atenuada (OPV) desarrollada por el Dr. Albert Sabin en 1961 y que analizaremos con las vacunas a virus vivos atenuados, y la vacuna inactivada (IPV) desarrollada por el Dr .Jonas Salk en 1955. Ambas son altamente efectivas (eficacia de 90% a 100%) contra los tres tipos de poliovirus, pero existen diferencias significativas entre las dos. La vacuna de Salk es obtenida por inactivacin de los virus con formaldehdo; al ser inactivada y administrarse por inoculacin, no se replica a nivel gastrointestinal y no genera una respuesta de IgA secretoria local. Otras desventajas son su administracin parenteral y el costo mayor de la misma. Las ventajas son que se puede aplicar a pacientes inmunodeprimidos, permite (como las atenuadas) una proteccin de poblaciones (herd inmunity), tiene buena termoestabilidad, no genera poliomielitis paraltica por el virus vacunal como la de Sabin, que luego analizaremos.
Vacuna contra la influenza
La influenza es una enfermedad respiratoria aguda causada por un Myxovirus, virus Influenza, que provoca adems fiebre y sntomas sistmicos como artromialgias y cefaleas. En algunos casos (ancianos, enfermos cardiorrespiratorios) presenta un alto riesgo de complicaciones que se tratarn en el captulo correspondiente. La red de vigilancia epidemiolgica mundial de la Influenza fue establecida en 1952. La red comprende cuatro centros de colaboracin con la OMS (Atlanta, Londres, Melbourne, Tokio) y 112 instituciones en 83 pases, que estn reconocidas por la OMS como Centro Nacional de Influenza. En nuestro pas existe un Centro Nacional de Influenza que se encuentra localizado en los Laboratorios de Virologa del MSP , donde existe colaboracin de docentes del Depto. de Bacteriologa y Virologa del Instituto de Higiene, Facultad de Medicina. Los Centros Nacionales de Influenza reciben muestras de todo el pas, realizan el aislamiento del virus y estudios preliminares de caracterizacin antignica. Las cepas nuevas aisladas se envan a uno de los cuatro centros de colaboracin de la OMS para un estudio mayor de caracterizacin antignica y anlisis gentico. Segn sus resultados se realizan las recomendaciones anuales sobre composicin de la vacuna de Influenza para los hemisferios sur y norte. Las recomendaciones sobre composicin de la vacuna se realizan cada ao debido a que algunas cepas de virus Influenza que circulan en el hombre sufren permanentemente cambios antignicos que requieren la adaptacin de la frmula de la vacuna. Las vacunas contra la influenza son producidas en huevos embrionados. Son inmunognicas y seguras, y se asocian con efectos colaterales mnimos. Estas vacunas multivalentes contienen ms de un subtipo viral (de influenza A y B) y su composicin se modifica peridicamente teniendo en cuenta la expectativa de prevalencia de las cepas de virus Influenza. Existen vacunas a virus inactivados enteros, de subunidades y de virus fraccionados (split o subvirin), en la segunda modalidad los componentes del virus se pueden encontrar purificados. La vacuna utilizada en 2003 estaba constituida por las cepas recomendada por la OMS, e inclua tres cepas virales inactivadas: A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Panama/2007/99 (H3N2) y B/Hong Kong/330/2001. La OMS recomienda para el invierno 2004 en el hemisferio sur las siguientes cepas en la vacuna de influenza: A/New Caledonia/20/99(H1N1)-like virus A/Fujian/411/2002(H3N2)-like virus* B/Hong Kong/330/2001-like virus**
* A/Kumamoto/102/2002 and A/Wyoming/3/2003 are egg-grown A/Fujian/411/2002-like viruses. **Currently used vaccine viruses include B/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/2001, B/Hong Kong/1434/2002. B/ Brisbane/32/2002 is also available as a vaccine virus.
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La vacuna est indicada en individuos mayores de seis meses de edad, pero dirigida especialmente a personas con alto riesgo de complicaciones causadas por la gripe: Personas de ms de 60 aos. Pensionados en geritricos y otros establecimientos de cuidados prolongados, con condiciones mdicas crnicas, cualquiera sea su edad. Adultos y nios mayores de seis meses que presenten enfermedades cardacas o pulmonares crnicas, incluyendo nios con asma. Adultos y nios que requieran atencin mdica continua u hospitalizacin a causa de enfermedades metablicas crnicas (incluyendo la diabetes mellitus), insuficiencia renal, hemoglobinopatas o inmunosupresin por otras causas. Nios y adolescentes (6 meses a 18 aos) con un tratamiento prolongado con cido acetilsaliclico. Este tratamiento puede aumentar el riesgo de sndrome de Reye luego de la gripe. Mdicos, enfermeras u otras personas que pueden trasmitir la gripe a personas susceptibles o de alto riesgo. No hay acuerdo general sobre la administracin de la vacuna durante el embarazo. En embarazadas, la gripe implica un riesgo de complicaciones o muerte dos veces mayor que en mujeres de igual edad no gestantes. Est contraindicada en personas alrgicas al huevo o productos a base del mismo, desorden neurolgico activo y personas cursando enfermedad respiratoria aguda u otras enfermedades activas. Debido al surgimiento actual de la gripe aviar se estn ensayando vacunas contra la misma con reasociaciones de virus derivados de los virus influenza aviares.
Vacuna contra la hepatitis A
La hepatitis A es causada por un virus de la familia Picornaviridae que tiene la caracterstica de trasmitirse por la va fecal-oral, contaminando agua y alimentos; el virus persiste viable en bajas temperaturas por largo tiempo y es viable en materia fecal seca por semanas. La mayora de las infecciones en menores de cinco aos son asintomticas, pero al eliminar el virus por materia fecal diseminan el virus por la comunidad. En cambio los nios mayores, adolescentes y adultos, padecen la enfermedad en su forma sintomtica en ms del 75% de los casos. Hay cuatro vacunas disponibles, todas ellas de virus inactivados por formol y obtenidas en cultivos de tejidos; son altamente inmungenicas y confieren proteccin de larga duracin. Se recomienda la vacunacin a personas que viajan a zonas endmicas, homosexuales, pacientes con hepatopata crnica, drogadictos, trabajadores de la salud, manipuladores de alimentos. Vacunas a subunidades microbianas
Vacunas basadas en protenas purificadas
Para los patgenos que poseen eptopes protectores contenidos en polipptidos, el desarrollo de vacunas basadas en protenas purificadas puede ser la estrategia de eleccin, sobre todo en el caso de vacunas bacterianas, debido a la elevada reactogenicidad de estas vacunas a microorganismos enteros. Esta estrategia es posible gracias al avance en tcnicas inmunolgicas, genticas y bioqumicas que permitieron conocer la especificidad antignica para la produccin de anticuerpos protectores. Un ejemplo son las ya mencionadas vacunas acelulares contra la tos convulsa, que consisten en mezclas de dos, tres o cuatro antgenos proteicos diferentes. Muchas bacterias producen toxinas proteicas que son responsables de gran parte de la patognesis de la infeccin, por lo que en estos casos las toxinas bacterianas pueden ser utilizadas como vacunas. Las exotoxinas bacterianas al someterse al calor pierden su capacidad
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toxignica pero no su antigenicidad, denominndose toxoides. Ejemplos de vacunas basadas en toxoides son la vacuna contra la difteria (agente Corynebacterium diphteriae) y la vacuna contra el ttanos (agente Clostridium tetani). Actualmente se administran como parte de la vacuna pentavalente en cuatro dosis en el primer ao de vida. Se hacen refuerzos peridicos cada 10 aos con toxoide tetnico y diftrico combinados, para proteger contra el ttanos y minimizar el reservorio del agente de la difteria en la poblacin adulta. Es fundamental controlar que la embarazada est vacunada para prevenir el ttanos neonatal por transferencia pasiva trasplacentaria. La tecnologa del DNA recombinante permite actualmente producir protenas puras en gran cantidad para ser utilizadas como inmungenos; son las llamadas vacunas recombinantes. La primera vacuna recombinante aprobada para uso humano fue la vacuna contra la hepatitis B, que fue producida a fines de la dcada de los 70, cuando se logra clonar y secuenciar el genoma viral identificando el gen para el antgeno de superficie (HBsAg) y expresar este gen en una clula bacteriana. La estrategia para lograr esta expresin, implica construir un plsmido conteniendo un casette de expresin que sea capaz de replicarse con alto nmero de copias en una clula hospedadora, la cual expresar el polipptido de inters. En el caso de HBsAg, esto fue logrado clonando el gen en un plsmido portado por una levadura, obteniendo antgeno purificado que es administrado junto con sales de aluminio como adyuvante. La vacuna contra la hepatitis B, contiene dos polipptidos inmunizantes de HBsAg; integra el programa oficial de vacunaciones desde 1999, como componente de la vacuna pentavalente para nios. La vacuna monovalente est especialmente indicada en personal de salud, homosexuales, drogadictos, politransfundidos, dializados, convivientes con portadores de hepatitis B, portadores de enfermedad heptica crnica. Se recomienda a todos los adolescentes o preadolescentes alrededor de los 11 a 12 aos. Existen actualmente inmumerables actividades de investigacin y desarrollo en nuevas vacunas recombinantes para producir antgenos proteicos de calidad. Algunos de los logros obtenidos han permitido por ejemplo la produccin de toxoides estables altamente inmunognicos y purificados al punto de evitar reacciones adversas. Este es el caso del toxoide diftrico que se utiliza actualmente en la vacuna contra Haemophilus influenzae tipo b o del toxoide de B. pertrusis, componente de las nuevas vacunas acelulares contra la tos convulsa.
Vacunas a polisacridos capsulares
Muchas bacterias patgenas poseen una cpsula de naturaleza polisacardica que constituye un importante factor de virulencia. En la mayora de las infecciones causadas por este tipo de bacterias los anticuerpos dirigidos contra los polisacridos capsulares resultan protectores, lo cual los hace buenos candidatos a vacunas. Estos polisacridos estn costituidos por muchas unidades repetidas que varan entre las especies y subtipos antignicos dentro de una misma especie. El polisacrido que es sintetizado por la bacteria durante su crecimiento puede ser concentrado a partir del medio de cultivo. Estas preparaciones son en general inmunognicas en adultos y nios mayores de dos aos. La dificultad principal con este tipo de vacunas radica en que por ser los polisacridos antgenos independientes de clulas T, son muy pobres inmungenos en los nios pequeos y no son capaces de inducir memoria inmunolgica an en los adultos. Este inconveniente puede superarse conjugando los polisacridos de inters a una protena carrier. De esta manera los eptopes polisacardicos podrn ser reconocidos en un contexto de clulas T e inducir memoria inmunolgica. Esta es la estrategia utilizada para producir varias vacunas muy efectivas contra diversas enfermedades causadas por bacterias capsuladas. Algunos ejemplos son los siguientes.
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Vacuna anti Haemophilus influenzae tipo b: obtenida por la conjugacin de una protena con el antgeno capsular (PRP , poliribitolfosfato). H. influenzae causa meningitis, otitis media, sinusitis, epglotitis, artritis sptica, bacteriemia febril oculta, celulitis, neumonia, empiema y sepsis. Antes de la introduccin de esta vacuna conjugada H. influenza tipo b era el agente principal de meningitis en los nios menores de cinco aos, y causaba con frecuencia otras enfermedades invasivas como neumonias. Vacuna antineumoccica: Streptococcus pneumoniae es la causa ms frecuente de otitis media aguda y de infecciones bacterianas invasivas en nios. Es tambin el principal agente de neumonia en el adulto, y de otras afecciones invasivas como meningitis y sepsis. Luego de la introduccin de la vacuna conjugada anti H. influenzae tipo b, S. pneumoniae y N. meningitidis son las causas ms frecuentes de meningitis bacteriana en lactantes y nios pequeos. Se han identificado 90 serotipos capsulares de neumococo. La vacuna tradicional est compuesta por los antgenos capsulares purificados de 23 serotipos neumoccicos. Estos antgenos capsulares son los de los serotipos que producen el 88% de los casos de bacteriemia y meningitis en adultos, casi el 100% de los casos de bacteriemia y meningitis en nios y el 85% de los casos de otitis media aguda. Se recomienda a nios de dos aos o mayores con drepanocitosis, asplenia funcional o anatmica, sndrome nefrtico o insuficiencia renal crnica, cuadros asociados con inmunosupresin como trasplante de rganos, tratamiento con frmacos o terapia citorreductora, infeccin por VIH, derrames de LCR. En adultos est indicada en los que padecen drepanocitosis, enfermedad pulmonar obstructiva crnica, insuficiencia cardaca, diabetes, alcoholismo, cirrosis, y a mayores de 65 aos e inmunodeprimidos. En Estados Unidos se licenci una vacuna conjugada neumoccica heptavalente compuesta por siete polisacridos u oligoscaridos capsulares de los serotipos ms frecuentes que causan infecciones invasivas en los habitantes de Estados Unidos. Los serotipos vacunales son (4, 6 B, 9V, 14, 19 F, 18 C y 23 F) qumicamente conjugados al toxoide diftrico producido en forma recombinante. Esta vacuna resulta inmunognica en nios menores de dos aos. La investigacin epidemiolgica de los serotipos de neumococo circulantes en nuestra regin revela que una vacuna de este tipo protegera contra buena parte de las infecciones graves en nuestro medio, pero indica que lo ms apropiado sera una vacuna diseada con los serotipos de circulacin local. Vacuna antimeningoccica: la enfermedad invasiva meningoccica ocurre en forma endmica o epidmica en todo el mundo. Los serogrupos B y C son los ms frecuentes. Alrededor del 10% de los pacientes, en general nios o adultos jvenes, mueren. Desde 1960 se dispone de vacunas preparadas con polisacridos capsulares de Neisseria meningitidis de los serogrupos A y C para controlar los brotes o las epidemias. Ms adelante se dispuso de una vacuna cuatrivalente para los serogrupos A, C ,W-135 e Y. Estas vacunas son efectivas en mayores de dos aos. La vacuna bivalente A y C ha sido usada extensamente. Para N. meningitidis serogrupo B se han desarrollado vacunas con protenas de membrana externa, ya que el poliscarido capsular serogrupo B es poco inmunognico y adems presenta similitud con una glicoprotena neural humana. La ms utilizada para el control de epidemias en Amrica Latina es la preparada con la cepa B:4 P1:15. Su efectividad es de aproximadamente 80% en mayores de cuatro aos, y depende en buena parte de los tipos bacterianos circulantes (es mximamente efectiva para prevenir la infeccin con el tipo homlogo al de la vacuna). En edades menores su efectividad es variable segn los estudios. En nuestro pas se han utilizado en diversas oportunidades vacunas antimeningoccicas. En 1996, en la ltima epidemia por N. meningitidis serogrupo C se llev a cabo una campaa de vacunacin con la vacuna bivalente A + C. Debido a un aumento progresivo en los ltimos 4 aos de los casos por serogrupo B y a la difusin del tipo B:4 P1:15, se decidi vacunar a la poblacin de 4 a 19 aos con la
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vacuna antimeningoccica B-C desarrollada en el Instituto Finlay. Esta contiene la protena de membrana externa de la cepa B:4 P1:15, cerca de 1% de lipopoliscarido y fosfolpidos, adicionada con polisacrido capsular del serogrupo C e hidrxido de aluminio. No presenta efectos adversos graves.
VACUNAS A GRMENES VIVOS ATENUADOS
La atenuacin de una cepa, implica lograr que esta haya perdido totalmente la capacidad para causar enfermedad pero mantenga su capacidad infectiva e inmunognica. Este tipo de vacunas tiene la ventaja de que puede ser administrado por la va natural de la infeccin de manera de reproducir su ciclo. En general no requieren adyuvantes y es suficiente una pequea cantidad de antgeno para estimular tanto una respuesta de anticuerpos como mediada por clulas lo cual permite que confieran proteccin duradera. Tienen la desventaja de estar contraindicadas en individuos inmunodeprimidos y ser menos estables a travs del tiempo o requerir condiciones de almacenamiento ms exigentes. Para obtener cepas atenuadas es necesario reducir o anular la patogenicidad del microorganismo. Para esto un procedimiento emprico consiste en propagarlo repetidas veces en medios artificiales, tendiendo a seleccionar aquellas variantes mejor adaptadas para crecer en ese medio y no en los tejidos del husped natural. De esta manera, la atenuacin es un procedimiento a ciegas y debe ser probada posteriormente (ya sea en modelos animales cuando es posible o en voluntarios humanos). Hoy da, la atenuacin puede ser realizada de una forma ms racional. Por ejemplo se han producido mutantes del Virus Respiratorio Sincicial que crecen pobremente a 37 C pero son capaces de replicarse adecuadamente a 33 C (la temperatura del tracto respiratorio superior). Estos mutantes sensibles a la temperatura se multiplican en la mucosa nasal e inducen inmunidad, pero son incapaces de reproducirse en el tracto respiratorio inferior. Otra aproximacin radica en identificar los genes responsables de la virulencia y modificarlos por manipulacin gentica. Este es el caso de la vacuna contra herpes virus, que consiste en una cepa a la cual se ha eliminado el gen que codifica la glicoprotena H, que es esencial para la maduracin viral. En ausencia de este gen, la cepa vacunal solo puede establecer una infeccin abortiva que si bien no le permite replicarse en el husped, es suficiente para producir una respuesta inmune eficiente. Vacunas a virus vivo El requerimiento clave para la factibilidad de este tipo de vacunas es la capacidad del virus de propagarse eficientemente, de preferencia in vitro. El desarrollo de vacunas a virus vivos fue posible a partir de los aos 40, con el advenimiento de la tecnologa para cultivos celulares que permiten la propagacin viral in vitro. La estrategia clsica consiste en el pasaje del virus salvaje, obtenido de su husped natural a uno o ms tipos de lneas celulares, con el objeto de que pierda su potencial patgeno. Esta estrategia ha sido aplicada exitosamente para el desarrollo de un gran nmero de vacunas actualmente en uso. Algunos ejemplos son los siguientes. Vacuna antipoliomieltica de Sabin: es una vacuna trivalente que contiene los poliovirus I, II y III. Forma parte del esquema nacional de vacunacin administrndose a los dos, cuatro y seis meses con un refuerzo al ao. Vacuna triple viral: est constituda por los virus vivos superatenuados de sarampin, rubola y paperas. Tambin forma parte del esquema nacional de vacunacin y se administra al ao de vida y a los cinco aos se da una dosis de refuerzo.
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Vacuna antivaricela: es una vacuna a virus vivos atenuados cepa Oka. Desde 1999 se administra entre los 12 meses y 13 aos de edad a todo nio que no haya tenido varicela, y se recomienda, como la del sarampin, para el personal de salud. Otra alternativa para la obtencin de cepas virales atenuadas consiste en el aislamiento y cultivo de virus animales relacionados que causan una enfermedad similar a la humana en especies animales, pero que resulten inocuos para el hombre. El prototipo de este tipo de vacunas lo constituye la cepa vacunal de Vaccinia virus, agente de la viruela en el ganado, que fuera utilizado por Jenner para inmunizar contra la viruela humana causada por Variola virus. El programa de vacunacin contra la viruela que fue aplicado en todo el mundo, utiliz lotes de Vaccinia propagado en su mayor parte in vivo, conduciendo a la completa erradicacin de la enfermedad a mediados de los aos 70. Una estrategia ms moderna, aplicable a la atenuacin de virus de genoma segmentado, consiste en el desarrollo de cepas vacunales reordenadas que contengan los segmentos gnicos codificantes de las protenas de superficie inmunognicas, pero no los genes de virulencia responsables de la enfermedad humana. Esto puede lograrse coinfectando una lnea celular con dos o ms tipos virales y seleccionando las variantes de inters. Este es el caso de una vacuna desarrollada contra la infeccin por Rotavirus (cepas reordenadas de virus humanos y animales). La misma estrategia ha sido aplicada para la produccin de vacunas contra Influenza virus. Se encuentra disponible una vacuna contra la influenza A y B de aplicacin intranasal a virus vivos atenuados; se administra a nios y adolescentes entre 5 y 17 aos y adultos sanos entre 18 y 49 aos (Flumist). Presenta las mismas contraindicaciones que cualquier vacuna a virus vivos atenuados. Est adems contraindicada en asmticos, menores de 5 aos y mayores de 50 aos. Vacunas a bacterias vivas atenuadas No ha sido efectivo el desarrollo de vacunas a bacterias vivas atenuadas por medio de estrategias clsicas anlogas a la del pasaje repetido de virus en cultivos celulares, partiendo de cepas patgenas para el hombre. La nica vacuna a bacterias vivas en uso, obtenida por pasajes en cultivo, es la antituberculosa, que consiste en una cepa atenuada de Mycobacterium bovis (bacilo de Calmette y Guerin, BCG). Esta cepa fue obtenida a principios del siglo XX luego de 231 pasajes repetidos in vitro durante 13 aos. Actualmente, hay varias cepas de BCG disponibles (todas derivadas de la original) que son variables en cuanto a su tolerabilidad, inmunogenicidad y eficacia protectora en los ensayos clnicos, aunque han demostrado tener niveles aceptables de eficiencia luego de la administracin a mas de un billn de personas en todo el mundo. La vacunacin con BCG previene las formas graves de la tuberculosis pero no siempre la infeccin (ver captulo 22). Se administra en forma obligatoria a todos los nios al nacer y a los cinco aos, con excepcin de pacientes hijos de madres VIH positivas y nios con otras inmunodeficiencias; tampoco se administra a recin nacidos con peso inferior a 2500g. Con poca frecuencia (1% a 2% de los vacunados) la BCG puede provocar reacciones adversas locales como abscesos subcutneos y linfadenopatas que generalmente no son graves. Una complicacin rara es la ostetis que afecta la epifsis de los huesos largos; puede producirse hasta varios aos despus de la vacunacin. La enfermedad fatal diseminada se presenta rara vez en personas con sistemas inmunes gravemente deteriorados, por eso la vacuna est contraindicada en personas con inmunodeficiencias. Otra aproximacin para el desarrollo de vacunas a bacterias atenuadas, consiste en la obtencin de mutantes atenuadas por procedimientos qumicos o luz ultravioleta. Estos mtodos introducen mutaciones mltiples indefinidas, y permiten la seleccin de variantes atenuadas en
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la virulencia. La principal desventaja de esta aproximacin, consiste en el riesgo de reversin a la virulencia. Un ejemplo exitoso de este tipo de inmungenos es la vacuna contra la fiebre tifoidea, que consiste en una cepa de Salmonella typhi (Ty21a), que se administra oralmente y puede conservarse en forma liofilizada, siendo muy estable. Sin lugar a dudas, la aplicacin de tecnologa del DNA recombinante para la obtencin de cepas bacterianas atenuadas para su uso como vacunas es un rea de gran desarrollo. Esta estrategia implica identificar genes responsables de la virulencia bacteriana y eliminarlos. Muchas bacterias han sido modificadas de esta manera y han sido o estn siendo evaluadas como vacunas. Se ha volcado especial inters sobre los patgenos entricos (Salmonella, EPEC, Vibrio cholerae, Shigella y otros) para los cuales no se dispone en la mayora de los casos de vacunas efectivas, ya que el uso de cepas atenuadas permite la administracin oral induciendo respuestas locales en el tracto digestivo que resultan determinantes en la obtencin de proteccin.
OTROS TIPOS DE VACUNAS
En algunos casos es posible identificar eptopes peptdicos dentro de una protena que induzcan la produccin de anticuerpos neutralizantes. Estos eptopes pueden ser hoy da secuenciados y sintetizados qumicamente dando lugar a pptidos sintticos que pueden ser utilizados como vacunas. Este tipo de inmungenos han sido definidos para varios patgenos y estn siendo evaluados para su uso. Existen distintas maneras de utilizar pptidos como vacunas, ya sea administrando multmeros construdos con el pptido de inters de manera repetida, o conjugando o fusionando el pptido a una protena carrier. Preparados experimentales de este tipo, han demostrado que la presentacin inmunognica mejora sustancialmente los ttulos de anticuerpos neutralizantes en comparacin con el mismo eptope presentado en el contexto de la protena que lo contiene naturalmente. Una posibilidad que ofrece la disponibilidad de vacunas a microorganismos vivos atenuados, es la de utilizar estas cepas como vectores para la expresin de antgenos heterlogos, es decir antgenos de otros microorganismos, obteniendo as las llamadas vacunas multivalentes. Uno de los vectores en que ms se ha investigado para el desarrollo de este tipo de vacunas es la cepa vacunal de Vaccinia virus. Esta estrategia prometedora puede permitir el desarrollo de una vacuna que pueda ser efectiva para la prevencin de enfrermedades producidas por varios agentes infecciosos en un solo vector seguro, barato y relativamente estable. No podemos dejar de mencionar un nuevo campo de experimentacin que son las vacunas basadas en cidos nucleicos. Estas consisten en molculas de ADN recombinante que contienen uno o varios genes codificantes de antgenos especficos del virus o la bacteria correspondiente. Estas molculas se obtienen mediante la recombinacin de un plsmido con genes microbianos estructurales, colocando estos genes bajo el control de expresin de un promotor eucariota. El hecho de constituir ADN plasmdico, permite su produccin a gran escala a travs de la multiplicacin bacteriana in vitro y posterior purificacin de sus plsmidos. Una vez que el ADN purificado es administrado puede introducirse en las clulas de un tejido blanco, siendo capaz a travs de un proceso de replicacin normal, de expresar en la superficie celular protenas especficas del microorganismo. Este tipo de vacunas an no ha sido aprobado para su uso, ya que implica cuestionamientos ticos relativos a la seguridad a largo plazo del uso de ADN recombinante. Esiste la posibilidad de que el cido nucleico sea captado por tejidos diferentes al deseado, o de que pueda ser incorporado al genoma celular, teniendo consecuencias oncognicas. Cada vez existen ms variedades de vacunas; a medida que avanza la tecnologa y que ms
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Certificado esquema de vacunacin Edad en meses 0 BCG Penta Polio SRP Varicela DPT DT SRP= sarampin, rubola, paperas; DPT= difteria, pertussis, ttanos; DT= difteria, ttanos; Pentavalente: DPT + hepatitis B + H. influenzae Vacunas bacterianas disponibles Enfermedad - agente Difteria Corynebacterium diphteriae Ttanos Clostridium tetanii Tos ferina Bordetella pertussis Haemophilus influenzae tipo b Tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis A y C Neisseria meningitidis B y C Tipo de vacuna Toxoide Indicaciones 2, 4, 6 meses Va de administracin i.m. Revacunacin 12 meses, 5 y 12 aos 12 meses, 5, 12 aos y luego cada 10 aos 12 meses y 5 aos 12 meses 2 4 6 12 5 Edad en aos 12 Cada 10
Toxoide
2, 4, 6 meses
i.m.
Bacterias inactivadas
2, 4, 6 meses
i.m.
Conjugada, 2, 4, 6 meses polisacrido capsular + protena Bacterias vivas Recin nacido atenuadas Polisacrido capsular Polisacrido capsular Protenas de membrana externa + polisacrido capsular Bacterias muertas inactivadas Bacterias muertas
i.m.
s.c.
5 aos
Individuos en i.m. o s.c. riesgo (ver texto) Individuos en s.c. riesgo (ver texto) Ver texto
Clera Vibrio cholerae Fiebre tifoidea Salmonella typhi
Viajeros a zonas endmicas Viajeros a zonas endmicas
i.m. o s.c. i.m.
se conoce de los mecanismos patognicos de los microorganismos, as como de los mecanismos inmunes determinantes de la resistencia a las enfermedades infecciosas, se abren nuevas posibilidades. Tradicionalmente las vacunas fueron planteadas con el objetivo de prevenir las
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enfermedades infecciosas. Sin embargo, existe un nuevo concepto sobre la vacunacin, que tiene como objetivo la modulacin de la respuesta inmune, es decir que una vacuna sera un preparado que interviene de alguna manera modificando las funciones del sistema inmune, ya sea generando memoria inmunolgica para prevenir enfermedades o actuando sobre una patologa existente. Este nuevo concepto abre la posibilidad de utilizar vacunas no solo como medida profilctica de varios tipos de enfermedades sino tambin como teraputica. Un rea de gran inters y desarrollo lo constituye el de las vacunas aplicadas al tratamiento de las enfermedades malignas y autoinmunes.
Vacunas virales disponibles Enfermedad Sarampin Rubola Tipo de vacuna Virus vivos atenuados Virus vivos atenuados Virus vivos atenuados Virus inactivados Virus vivos atenuados Antgeno recombinante Indicaciones 12 meses 12 meses Mujeres seronegativas en edad frtil 12 meses 2, 4, 6 meses 2,4, 6 meses Va de adminis- Revacunacin tracin s.c. 5 aos s.c. 5 aos
Parotiditis Poliomielitis Poliomielitis Hepatitis B
s.c. i.m. v.o.
5 aos 12 meses 12 meses
Influenza
Varicela Hepatitis A
Rotavirus
Fiebre amarilla
2, 4, 6, 12 meses i.m. Personal de salud y grupos de riesgo (ver texto) Virus inactivados Toda persona mayor s.c. de 6 meses con riesgo aumentado de morbimortalidad por infeccin respiratoria Virus vivos 12 meses s.c. atenuados Virus inactivados Viajeros a zonas de alto i.m. riesgo, homosexuales, drogadictos, riesgo ocupacional, hepatopata. 2 dosis Recombinante 3 dosis separadas por 4 v.o. semanas empezando a las 6 semanas de vida Virus vivos Viajeros a zonas de s.c. atenuados riesgo 1 sola dosis
En discusin
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Esterilizacin, desinfeccin y antisepsia

R. Vignoli
no aprendes lo que te ensean sino lo que quieres aprender, pero...
Introduccin
Los procesos de esterilizacin o desinfeccin son diariamente llevados a cabo, no solamente en el laboratorio, donde son fundamentales para evitar la contaminacin de medios, cultivos, placas etc., sino tambin en otros mbitos tales como los hospitales, donde fallas en estos procedimientos aumentan la morbimortalidad de los pacientes. Pensemos lo que sucede en los quirfanos donde se deben desinfectar pisos, paredes y techos, esterilizar instrumental quirrgico e indumentaria del personal, y descontaminar el aire del ambiente. O en contraposicin, lo que sucedera si materiales como catteres, agujas, jeringas, empleados en maniobras mdicas diarias (extraccin de sangre, vas venosas, punciones lumbares, toracocentesis, etc.) fueran utilizados aunque fuera con niveles mnimos de contaminacin. Un ejemplo cotidiano donde debe prevalecer el mismo concepto de esterilidad es en la utilizacin de agujas para la realizacin de tatuajes. Conoce alguna enfermedad que se contagie por este medio? El estudiante de medicina en este momento debe rpidamente familiarizarse e interiorizarse con ciertos procesos de desinfeccin y antisepsia como la cutnea, previa a la administracin de un inyectable o durante la cura de una herida, la desinfeccin de un termmetro clnico o el lavado de manos. Parece imprescindible entonces, que el estudiante que se apresta a ingresar a la clnica en breve y que en este momento ya est en contacto con distintas poblaciones bacterianas, debe saber manejar en forma fluda la informacin que le permita discernir cuando es necesario desinfectar o esterilizar, y llevar a cabo el proceso correspondiente en forma satisfactoria con el conocimiento de los fundamentos de lo realizado. Comencemos por definir algunos trminos que utilizaremos. Esterilizacin: es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporos, y virus. Se entiende por muerte, la prdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo. Deberan estar includos dentro de esta definicin la eliminacin de estructuras como los priones? Se trata de un trmino absoluto, donde un objeto est estril o no lo est, sin rangos intermedios. Desinfeccin: es un trmino relativo, existen diversos niveles de desinfeccin, desde una
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esterilizacin qumica a una mnima reduccin del nmero de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se aplican nicamente a objetos inanimados. Antisepsia: es el proceso que por su baja toxicidad, se utiliza para la destruccin de microorganismos presentes sobre la superficie cutaneomucosa. Este trmino tampoco implica la destruccin de todas las formas de vida. Existen agentes como los alcoholes que son antispticos y desinfectantes a la vez. Dado que el tema que se est abordando son los mtodos para controlar o destruir distintas poblaciones bacterianas, es necesario saber previamente la cintica de dicha destruccin, es decir de que modo muere una poblacin y que parmetros inciden sobre este efecto.
Cintica de destruccin de las poblaciones bacterianas

Cuando una poblacin bacteriana es expuesta a un agente letal fsico o qumico, se produce una progresiva reduccin del nmero de sobrevivientes, de modo que la curva que representa el nmero de sobrevivientes en funcin del tiempo, tiene forma exponencial decreciente. (Figura 1a) Si graficamos la curva en una escala semilogartmica, obtenemos una recta como la de la Figura 1b. En la misma, la pendiente (negativa) representa la velocidad de muerte de la poblacin. Resulta claro que cuanto mayor sea el valor absoluto de la pendiente, los microorganismos morirn ms rpido. Este comportamiento debe tenerse presente siempre, ms an en las tcnicas de esterilizacin, donde el tiempo de exposicin al agente es fundamental para alcanzar el objetivo buscado. El efecto letal de un agente (como el fenol) cambia en relacin a las distintas cepas, incluso dentro de una misma especie bacteriana.
Figura 1. Representacin del nmero de sobrevivientes de una poblacin bacteriana en funcin del tiempo
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Existen tambin un conjunto de condiciones fundamentalmente ambientales que afectan la cintica de destruccin, dentro de las que se destacan: la concentracin del agente, el tiempo de exposicin, el pH del medio, la temperatura, la presencia de materiales extraos, la resistencia propia del microorganismo y el nmero inicial de la poblacin.
CONCENTRACIN DEL AGENTE
Si bien este aspecto vara segn el desinfectante y el microorganismo, existe una relacin inversamente proporcional entre concentracin y tiempo de exposicin. A mayores concentraciones de desinfectante, menor es el tiempo de exposicin para conseguir el mismo efecto. Tambin se modifica la cintica de muerte, como lo muestra el cambio de forma en la curva de sobrevivientes en funcin del tiempo, que se transforma muchas veces de exponencial a altas concentraciones (Figura 1a) en sigmoide para concentraciones intermedias (Figura 2). En estos casos existe un tiempo inicial de muerte muy lento que luego se acelera para volver a decaer al final. Este factor es tan crtico, que se sabe que concentraciones mnimas de casi cualquier desinfectante no solo no eliminan los microorganismos sino que permiten su desarrollo.
TIEMPO DE EXPOSICIN
Dada una concentracin de desinfectante, existe un tiempo mnimo de accin que hay que respetar para conseguir el efecto buscado. Para dar una idea grfica de esto, en la Figura 3 se representa el porcentaje de reduccin de la flora bacteriana residente en piel de brazos y manos en funcin del tiempo, para diferentes antispticos de uso ms o menos comn.
pH
Entre otras cosas determina el grado de ionizacin del agente, siendo en general la forma no disociada la que atraviesa mejor las paredes del microorganismo.
Figura 2. Representacin del comportamiento sigmoide de la cintica de destruccin para concentraciones intermedias de desinfectantes
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Figura 3. Representacin del nmero de sobrevivientes de la flora normal de manos y antebrazos en funcin del tiempo, para diferentes antispticos de uso comn.
TEMPERATURA
El aumento de la temperatura aumenta el poder bactericida del agente, siempre que no lo desnaturalice. As para temperaturas bajas, por lo general, por cada 10 C de incremento de esta, la tasa de mortalidad se duplica.
PRESENCIA DE MATERIALES EXTRAOS
La presencia de materia orgnica como mucus, pus, sangre, heces, etc., influye negativamente en la actividad de muchos desinfectantes, incluso llegando a inactivarlos. Por lo general forman cubiertas que impiden el contacto microorganismo-desinfectante, o se combinan con el agente formando compuestos inertes o menos activos. Por esto es esencial un buen lavado de la superficie, antes de intentar un proceso de desinfeccin o esterilizacin. Adems el lavado y arrastre tambin disminuye la poblacin de microorganismos sobre la cual acta el agente, contribuyendo a una ms rpida destruccin.
RESISTENCIA DE LOS MICROORGANISMOS
La eficacia de cada agente depende tambin de las propiedades caractersticas de cada microorganismo contra el cual se lo est aplicando. As, el tipo de pared, la presencia de esporos, la fase de desarrollo, etc., modifican la resistencia. Dentro de las formas vegetativas, es el gnero Mycobacterium spp. el ms resistente. Luego dentro de los grampositivos se destacan Staphylococcus y Enterococcus. Dentro de los gramnegativos Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, y Serratia son los ms resistentes. Son estos microorganismos (cocos grampositivos y bacilos gramnegativos), los ms frecuentes causantes de epidemias intrahospitalarias. Esto se
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debe en primer lugar a no practicar el lavado de manos tantas veces como sea necesario, y en segundo lugar (por lejos) a la mala utilizacin de desinfectantes y antispticos.
NMERO INICIAL DE LA POBLACIN
Finalmente el nmero de la poblacin bacteriana inicial es importante, porque a mayor nmero de microorganismos, mayor deber ser la concentracin del agente y su tiempo de exposicin al mismo. En este punto, al igual que en la remocin de materiales extraos, toma fundamental relevancia el lavado de manos, donde por arrastre se consigue una disminucin importante de la flora normal transitoria, mejorando as las condiciones de utilizacin del agente. A continuacin iremos viendo progresivamente el lavado de manos, la utilizacin de antispticos, desinfectantes, hasta llegar finalmente a la esterilizacin, qumica y fsica.
Las "cruzadas" bacterianas

Como se recordar, las bacterias tienen un aparato locomotor constituido fundamentalmente por flagelos, que les permiten movilizarse en medios lquidos pero no a travs de superficies slidas o vas areas. Por lo tanto, para que estos microorganismos vidos de colonizacin y conquista puedan trasladarse de un lugar (o una persona) a otro/a necesitan de un vehculo, de un transportador, de un vector mecnico. Algunas veces (pero no la mayora) las gotitas de pflugge cumplen con este cometido. Sin embargo, a nivel mundial los hospitales universitarios presentan un ndice de morbimortalidad superior (sobre todo causado por infecciones intrahospitalarias) que los hospitales no universitarios. (Ver captulo 15) Cuando los estudiantes arriban al hospital, ya sea durante el pasaje por las clnicas, o las guardias, su avidez por tocar, palpar y tactar, unido en ocasiones a la mala distribucin de las canillas o lo inapropiado de los jabones, y en el peor de los casos a la falta de ejemplo del mdico responsable del servicio, se les ofrece a los microorganismos un muy efectivo transportador: nuestras manos. De esta forma estos microorganismos (que muchas veces han adquirido resistencia tanto a desinfectantes como a antibiticos), pueden llegar por intermedio del estudiante a otros pacientes, que en general presentan distinto grado de inmunocompromiso y nivel ms alto de exposicin. Este fenmeno recibe el nombre de colonizacin cruzada y es responsable de la aparicin de mltiples brotes de infecciones hospitalarias por agentes como Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa multirresistentes, Staphylococcus aureus meticilino-aminoglucsidos resistentes (SAMAR) o Enterococcus vancomicinorresistentes, entre otros. Existe una medida sencilla, rpida y barata para evitar esta diseminacin de microorganismos: el lavado de manos. Para fundamentar la efectividad de tan simple medida, recordaremos algunos conceptos de flora normal. Existen dos tipos de flora: La flora residente, compuesta por microorganismos adaptados a cada nicho ecolgico en particular, capaz de unirse a los receptores cutaneomucosos de la zona, instalarse y multiplicarse en los mismos, permaneciendo all por largo tiempo y desarrollando una relacin de comensalismo o mutualismo con el husped. No es sobre esta que acta fundamentalmente el lavado de manos rutinario, ni es la gran responsable de colonizaciones cruzadas dentro del hospital. La flora transitoria, incluye microorganismos que llegan adheridos a deshechos orgnicos, que se depositan sobre la superficie cutaneomucosa pero no estn necesariamente adaptados a las condiciones ambientales zonales, no se unen a los receptores ni son capaces de sobrevivir en el lugar en forma prolongada.
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Estos son los principales causantes de dichas infecciones intrahospitalarias y el blanco fundamental del lavado de manos, que por el arrastre del agua y la accin del jabn reduce eficientemente esta flora. Pero no todos los procedimientos requieren las mismas exigencias con respecto a las tcnicas de lavado. As, para un contacto rutinario como tomar la presin, auscultar, etc., basta con un lavado vigoroso durante 10 segundos con agua y jabn. En otros casos deber agregarse el uso de algn antisptico, como ser: Antes de realizar procedimientos invasivos (aunque se utilicen guantes estriles) Antes y despus del contacto con heridas quirrgicas o traumticas Antes del contacto con pacientes especialmente susceptibles (inmunodeprimidos, recin nacidos, etc.) Luego de entrar en contacto con una fuente contaminada, como puede ser un paciente infectado o sus secreciones Antes y despus del contacto con un paciente de CTI Antes de cualquier procedimiento quirrgico
Tcnica del lavado de manos

1. Remocin de alhajas (anillos, pulseras, etc.) 2. Lavado vigoroso con agua y jabn durante 10 segundos y enjuagado con agua corriente. Para un contacto rutinario basta con estos dos pasos. Tras secarse con papel, se cierra la canilla con el mismo. Para un procedimiento invasivo o quirrgico se agrega adems: 3. Cepillado de uas (reservorio importante de microorganismos) 4. Cepillado de piel de manos y antebrazos (se remueve as la flora transitoria y parte de la residente) 5. Enjuague abundante con agua corriente (tener precaucin con los restos de jabn, que de quedar pueden inactivar los antispticos). 6. Aplicacin de un antisptico (los ms utilizados son alcohol al 70%, iodforos, alcohol iodado al 0.5% y clorohexidina al 4%) Corresponde ahora ingresar en el estudio de las propiedades de los antispticos y desinfectantes ms comnmente utilizados.
Clasificacin de los desinfectantes y antispticos

Para este ordenamiento no nos basaremos en su composicin qumica sino en dos criterios diferentes: el rango de actividad y efectividad sobre los microorganismos (nivel de desinfectante) y su mecanismo de accin. Trataremos de jerarquizar el primer punto, ya que en la prctica es el criterio fundamental para escoger un desinfectante.
AGENTES ANTIMICROBIANOS QUMICOS (DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS)
Introduccin Los desinfectantes (que los separamos de los antispticos por no utilizarse en piel y mucosas), tambin se diferencian de los antibiticos (ver cuadro 1). Nivel de los desinfectantes Estos son clasificados en tres niveles (alto, mediano y bajo), segn la intensidad de su actividad sobre bacterias y esporos, virus (lipdicos y no lipdicos), hongos y sus esporos, etc. a) Desinfectantes de alto nivel: se caracterizan por actuar inclusive sobre los esporos bacterianos
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Tabla 1. Caractersticas diferenciales entre desinfectantes y antispticos contra los antibiticos

Antibiticos 1) Pueden aplicarse sobre piel, mucosa y el medio interno 2) Tienden a ser selectivos para las clulas procariotas no actuando sobre eucariotas 3) Actan sobre microorganismos en multiplicacin activa, ya que interfieren con algn paso metablico. 4) Se necesitan pequeas cantidades para obtener el efecto deseado. 5) Actan especficamente sobre bacterias y no sobre hongos, virus u otros microorganismos Desinfectantes y Antispticos 1) No pueden utilizarse en el medio interno y los desinfectantes ni siquiera sobre piel o mucosas 2) No poseen selectividad, actuando sobre clulas procariotas y eucariotas, razn por la cual no pueden usarse sobre el medio interno. 3) Actan sobre microorganismos en cualquier estado metablico (en multiplicacin o no). 4) Se necesitan mayores concentraciones que los ATB para conseguir el efecto. 5) Son txicos para muchos tipos e microorganismos, por ej.: hongos, virus, etc.
(forma ms resistentes dentro de los microorganismos), produciendo una esterilizacin qumica si el tiempo de accin es el adecuado. Se utilizan sobre instrumentos mdicos o quirrgicos termosensibles. Son rpidamente efectivos sobre bacterias no esporuladas. Por lo general el nmero de esporos en el material a desinfectar es insignificante, por lo que la esterilizacin es rpida. Dentro de este grupo se encuentran xido de etileno, formaldehdo al 8% en alcohol al 70%, glutaraldehdo al 2%, perxido de hidrgeno. Todos estos son desinfectantes estrictos, no pudindose usar como antispticos. b) Desinfectantes de mediano nivel: si bien no destruyen esporos, s lo hacen con grmenes tipo M. tuberculosis, hongos y virus no lipdicos. Algunos agentes son compuestos clorados (hipoclorito de sodio), compuestos iodados (iodforos y alcohol iodado), compuestos fenlicos, alcoholes, clorohexidina. La mayora de estos son utilizados como desinfectantes y antispticos. c) Desinfectantes de bajo nivel: son aquellos que, actuando durante un tiempo razonable, no destruyen esporos, ni Mycobacterium, ni virus no lipdicos. Se incluyen compuestos de amonio cuaternario y compuestos mercuriales. En la prctica estos compuestos se utilizan para la limpieza domstica, mientras que estn prcticamente en desuso en los hospitales y laboratorios debido al empleo de tcticas ms agresivas para la desinfeccin. Por ese motivo, llegado el momento no se los describir sino que simplemente sern nombrados, de manera que el estudiante pueda tomar sus precauciones cuando se enfrente a ellos. La seleccin del agente o el procedimiento a utilizar depende en gran parte de las caractersticas del objeto, y de la probabilidad que tiene este de producir una infeccin si es utilizado estando contaminado. Se clasifican as en elementos crtico, semicrtico y no crtico. El nivel y tipo de desinfeccin que deber lograrse, va a depender de la categora a la que pertenezca el objeto, su naturaleza y su forma de uso. Elementos crticos: son los que se introducen directamente en el cuerpo, la sangre, o cualquier rea del organismo que suele ser estril (catteres, agujas hipodrmicas, equipos de hemodilisis, etc.). Evidentemente existe un altsimo riesgo de producir una infeccin si estos objetos se encuentran contaminados en el momento de su uso. El tratamiento para estos elementos deber ser esterilizacin, en lo posible por mtodos trmicos, radiaciones, o de lo contrario con un desinfectante de alto nivel, como xido de etileno, glutaraldehdo, cido peractico, etc., como sucede con los materiales descartables. Elementos semicrticos: estn en contacto con las mucosas intactas (que normalmente
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estn colonizadas por la flora normal) pero no la atraviesan. Encontramos en este grupo: termmetros (de uso rectal y oral), fibroscopios, tubos endotraqueales, broncoscopios, etc. Tambin la esterilizacin es lo ms aconsejable, pero se acepta una desinfeccin con agentes de alto o mediano nivel, siempre posterior a un cuidadoso lavado con agua y detergente. Elementos no crticos: se encuentran en contacto con la piel sana pero no con las mucosas. En condiciones normales poseen poca posibilidad de producir infecciones. Sin embargo, pueden funcionar como vectores mecnicos que transfieren grmenes de un paciente a otro, lo que favorece la aparicin de infecciones mediadas por colonizacin cruzada, ms graves en el caso de pacientes inmunodeprimidos. Estetoscopios, mscaras faciales y humidificadores, entre otros, son los objetos que se agrupan aqu. Se considera suficiente el lavado con agua y detergente, seguido de la aplicacin de un desinfectante de mediano nivel. Mecanismo de accin La mayora de los desinfectantes se los agrupa en tres categoras: los que lesionan la membrana celular, los inactivadores irreversibles de protenas y los que lesionan los cidos nucleicos. No obstante, algunos desinfectantes comparten ms de uno de estos mecanismos. Desinfectantes de alto nivel Por su mecanismo de accin, todos los que veremos aqu actan modificando en forma irreversible grupos funcionales de protenas o cidos nucleicos. Entre otros efectos, esto provoca inhibicin enzimtica, lo que lleva a la muerte celular. Los agentes que predominan en este grupo son los alquilantes (xido de etileno, formaldehdo, glutaraldehdo). Estos producen la alquilacin de protenas que contienen hidrgenos lbiles, los que se encuentran en los grupos carboxilo, hidroxilo, sulfhidrilo, amino y fenol. xido de etileno (ETO GAS) Este gas acta adems de lo dicho, a nivel de los cidos nucleicos, produciendo mutaciones tanto en bacterias como en tejidos humanos. Se utiliza ampliamente para la esterilizacin de instrumentos termolbiles como ser tubuladuras de polietileno (catteres, sondas), equipos electrnicos medicoquirrgicos, materiales biolgicos, drogas, etc. El equipo de esterilizacin, si bien es similar al autoclave que funciona por gravedad, es ms complejo y de manejo dificultoso. Es necesario controlar ciertos parmetros para asegurar un buen resultado. Estos son: a) composicin del gas se debe usar mezclas con fren o CO2 (12% xido de etileno 88% fren o CO2) ya que puro es altamente inflamable; b) grado de humedad (entre 40% y 80%); c) temperatura (52C a 58C); d) tiempo de exposicin (entre 3 y 6 hs). Cada ciclo de esterilizacin debe ser sometido a controles biolgicos con esporos de B. subtilis. Principales desventajas: es altamente txico, mutagnico y carcinognico para los tejidos; irrita los ojos y las mucosas. Por lo tanto, una vez finalizado el ciclo de esterilizacin, el gas debe evacuarse del equipo y eliminar por arrastre con aire filtrando los residuos que puedan haber quedado. Glutaraldehdo Se utiliza a temperatura ambiente en solucin al 2%. Es esporicida para tiempos de accin de 6 a 10 hs. Es el desinfectante ms utilizado en la esterilizacin de equipos de endoscopia y de tratamiento respiratorio, ya que no corroe metales y gomas, ni deteriora lentes. Desven-
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tajas: es txico para piel, mucosas y ojos; tambin desprende vapores txicos para el aparato respiratorio. Formaldehdo (formol) Se utiliza en forma gaseosa o lquida. En su estado gaseoso se usa para desinfectar ambientes, muebles y artculos termolbiles. En estado lquido (formalina), se obtiene comercialmente en solucin al 37%, y se utiliza para conservar tejidos frescos y para inactivar virus en la preparacin de vacunas, ya que interfiere poco en la actividad antignica microbiana. Desventajas: produce vapores altamente irritantes, txicos y carcinognicos, adems de tener escaso poder de penetracin. Por todo esto no se utiliza en el laboratorio como un desinfectante comn. Utilizado en concentraciones elevadas (37%) tiene accin esporicida; para la preparacin de vacunas se utiliza formalina al 0.2% o 0.4%. Adems de los agentes alquilantes, dentro de este grupo se encuentra el perxido de hidrgeno, que es un agente oxidante. Perxido de hidrgeno Adems de su mecanismo de accin como agente oxidante (ver ms adelante) este compuesto produce la formacin de radicales libres hidroxilos, que contribuyen a desestabilizar las molculas celulares. Utilizado en solucin al 3% es de escasa y breve actividad como antisptico, ya que es rpidamente inactivado por las enzimas catalasa, tanto de los microorganismos como tisulares. En soluciones estabilizadas al 10% acta como desinfectante de alto nivel. Se utiliza sobre dispositivos medicoquirrgicos, lentes de contacto de plstico blando, etc. Otra forma de utilizacin es en combinacin con cido peractico para esterilizar maquinarias (equipos de pasteurizacin). El perxido de hidrgeno en solucin al 30% y luego vaporizado, se utiliza para esterilizar superficies como cabinas de seguridad.
DESINFECTANTES DE MEDIANO NIVEL
Se destacan los que actan a nivel de protenas y cidos nucleicos (agentes oxidantes) y los que actan a nivel de la membrana citoplsmica; dentro de estos se encuentran compuestos fenlicos y los alcoholes. Agentes oxidantes Mecanismo de accin: oxidan los grupos sulfhidrilos (SH) a disulfuro (SS), lo que inactiva las enzimas que los poseen. Ya hablamos del perxido de hidrgeno, aqu hablaremos de los halgenos. Halgenos Dentro de estos elementos se encuentran el iodo y el cloro. Compuestos clorados Son los desinfectantes de mediano nivel ms econmicos, efectivos e inocuos para el hombre. Pueden presentarse como cloro puro, combinado con una sulfonamida (Cloramida T) o en sus formas ms utilizadas: hipoclorito de sodio (en solucin acuosa) o de calcio (en tabletas). El principio activo de todos es el mismo: la liberacin de cloro molecular, que en presencia de agua se combina con esta para formar cido hipocloroso, el cual es un fuerte agente oxidante a pH neutro o cido.
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Cl2 + H2O --- HClO + Cl- + HSi bien es de mediano nivel, el hipoclorito tiene una dbil accin esporicida. Adems es tuberculicida, bactericida para todas las formas vegetativas, destruye los virus envueltos (por ejemplo VIH) e incluso algunos desnudos (VHB). La estabilidad de estos productos depende entre otras cosas de: El pH: si bien acta mejor a pH neutro o cido, es ms estable a pH 8 La presencia de materia orgnica: es uno de los desinfectantes de mediano nivel que se inactiva ms drsticamente ante la presencia de sustancias como pus, sangre, heces, etc. La exposicin a la luz: las diluciones acuosas se degradan ms rpidamente que las soluciones concentradas. Por lo tanto, para conservar productos clorados, es necesario mantenerlos en recipientes opacos, sin materia orgnica, lo ms puro posible y a pH 8. Aun con todas estas precauciones, los productos as preparados deben renovarse al menos una vez al mes. La concentracin de cloro activo se mide en partes por milln (PPM) o gramos por litro (g/l), de modo que 1000 PPM=1 g/l, o lo que es lo mismo 1PPM = 1 mg/l. Las formas comerciales ms comunes tienen concentraciones de 40.000 PPM (Agua Jane, Sello Rojo, etc.) o 5.000 PPM (Electrn). Segn la cantidad de cloro activo y el uso que le vamos a dar, es la dilucin que debemos hacer: Chatas, violines o heridas muy sucias 5.000 PPM Bocales con pipetas contaminadas 2.500 PPM Mamaderas o heridas en general 1.000 PPM Frutas, verduras, vajilla, ropa blanca 250 PPM Potabilizacin del agua 2 PPM Para hacer la dilucin de una solucin concentrada de hipoclorito de sodio utilizamos la ecuacin V1 . C1 = V2 . C2 Ejemplo: se necesita preparar 1 l de solucin de hipoclorito de sodio que contenga 2.500 PPM de cloro activo para preparar un bocal. C1= 40.000 PPM V1= x C2= 2.500 PPM V2= 1.000 ml Entonces tenemos: 50.000 PPM . V1 = 2.500 PPM . 1.000 ml Despejando: V1 = 2.500 PPM . 1.000 ml / 50.000 PPM= 50 ml. Se deben tomar 50 ml de solucin concentrada y agregarle agua hasta completar 1 lt. Algunas equivalencias tiles son: 1 cucharada de sopa = 25 ml 1 cucharadita de te = 5 ml 1 gota = 0.05 ml Precauciones: las diluciones en agua tibia actan ms rpida e intensamente que en agua fra, pero se degradan pronto. No es recomendable combinar estas soluciones con detergentes, los cuales pueden inactivarlas (sobre todo los catinicos). No obstante, es aconsejable limpiar previamente con un detergente las superficies a desinfectar, para eliminar restos orgnicos.
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Compuestos de iodo En medicina se los utiliza en soluciones, tinturas o iodforos, como desinfectantes pero sobre todo como antispticos. Usos: preparacin preoperatoria, antisepsia quirrgica de manos, as como tambin de piel previo a inyecciones, parto, transfusiones, extraccin de sangre, etc. Como desinfectante se utiliza sobre termmetros clnicos, ampollas de dosis mltiples, sobre superficies, etc. Tanto las tinturas (2% de iodo + 2.4% de ioduro de sodio en solucin acuosa y alcohol), como las soluciones fuertes (5% de iodo + 10% de ioduro de potasio en solucin alcohlica), son inestables en presencia de materia orgnica y calor, manchan la ropa, tien piel y mucosas, desencadenan reacciones alrgicas y tienen mal olor; adems su uso prolongado corroe metales y altera plsticos. Por todo esto se prefiere la utilizacin de iodforos que son menos txicos e irritantes. Iodforos: esta forma de desinfectantes est constituida funcionalmente por tres componentes, un transportador o portador de iodo, el iodo disponible y el iodo libre. Transportador (carrier): es un solubilizante que acta como reservorio de iodo. Generalmente se utilizan para esto detergentes, de modo de limpiar la piel a la vez de liberar el halgeno. Tambin se utilizan otro tipo de agentes activos de superficie, como compuestos de amonio cuaternarios, polyvinylpyrrolidona (povidona), etc. Iodo disponible: es el iodo en solucin, generalmente al 1%. Conforma el reservorio de complejos de iodo, el que liberado en pequeas cantidades asegura una concentracin constante de iodo libre. No es el iodo que acta en la destruccin de los microorganismos. Iodo libre: es el activo, el de accin microbicida, se cuantifica en PPM y es el que le da el nivel de potencia a este desinfectante. As, los iodforos son capaces de destruir bacterias (includa M. tuberculosis), hongos y virus desnudos, no as los no lipdicos (Polio y Rotavirus). Si bien tienen cierta actividad esporicida, el tiempo de exposicin debe ser demasiado largo para darle esta utilidad. Ventajas (sobre otros compuestos iodados): mayor poder de penetracin, mayor tiempo de accin, menor produccin de reacciones adversas debido a la baja concentracin de iodo disponible (1%). Precauciones: dado que el iodo libre es muy difcil de medir, cuando sea necesario preparar un iodforo a partir de un compuesto concentrado, se deber seguir las instrucciones del fabricante estrictamente, ya que si producimos diluciones mayores o menores a las estipuladas, estaremos disminuyendo la cantidad de iodo libre. Alcohol iodado (iodo al 0.5% en alcohol etlico al 70%): posee un buen nivel antisptico, se utiliza para preparacin quirrgica de piel, sitios de puncin, desinfeccin de superficies. Reduce efectivamente la flora cutnea en un minuto. Agentes que lesionan la membrana citoplasmtica Hablaremos aqu de los compuestos fenlicos y los alcoholes, que se integran a los desinfectantes de mediano nivel. Mecanismo de accin: a nivel general, estos compuestos producen un desordenamiento estructural de la membrana citoplsmica, que interfiere con su funcionamiento normal. Esto provoca la prdida de pequeos metabolitos del medio intracelular y dificulta tanto el transporte activo como el metabolismo energtico. Compuestos fenlicos Agregan a la accin ya descrita, la activacin en forma irreversible de las oxidasas y deshidro-
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genasas que se encuentran unidas a la membrana. El fenol (cido carblico) como tal, ya no es utilizado ms que como patrn para comparar otros desinfectantes. Esto es debido a su alta toxicidad, carcinogenicidad y su poder corrosivo. La sustitucin de uno de los hidrgenos del ncleo fenlico por grupos funcionales tales como alquilo, difenilo, fenil y cloro, disminuye notablemente los efectos adversos y aumenta la actividad antibacteriana de estos compuestos. La unin de estos fenoles modificados a jabones aumenta an ms su accin, a la vez que los hidrosolubiliza. Dentro de las sustituciones ms utilizadas se encuentran los alquilo fenoles (cresoles) y los compuestos difenlicos (hexaclorofenol). Los compuestos fenlicos utilizados en las concentraciones adecuadas y con el tiempo suficiente son bactericidas, virucidas y fungicidas. El VIH es inactivado por una solucin fenlica al 0.5%, mientras que se necesita una solucin al 2% para inactivar hongos. Por lo general la concentracin utilizada oscila entre 2% y 5%. Cresoles Se los divide en tres grupos: orto, meta y paracresol, aunque suele utilizarse una mezcla de los tres denominada tricresol. Son derivados de la destilacin del alquitrn de hulla, son mezclados con jabn y se comercializan por ejemplo como Creolina. Esta se utiliza para desinfeccin ambiental (paredes, pisos, etc.). Hexaclorofenol Es un derivado halogenado con gran accin bactericida, fundamentalmente sobre bacterias grampositivas, sobre todo estreptococos y estafilococos. Posee accin persistente, hasta el punto que su mxima accin bactericida se manifiesta luego de varios das de uso consecutivo. Alcoholes (alcohol etlico) Se utilizan como desinfectantes y como antispticos. Mecanismo de accin: producen precipitacin y desnaturalizacin de protenas, tambin lesionan la membrana citoplsmica. La precipitacin y desnaturalizacin de protenas depende de la presencia de agua y materia orgnica. El alcohol etlico rectificado (95%) provoca gran deshidratacin en los microorganismos, de manera que impide su penetracin en los mismos. Por lo tanto, las concentraciones ms efectivas son las que oscilan entre el 60% y 80% en agua destilada, siendo la preparacin ms efectiva al 70%. Concentraciones por debajo del 50% no causan ningn efecto. La materia orgnica inactiva los alcoholes, por lo que se recomienda limpiar la superficie antes de desinfectar con alcohol. Las lesiones en la membrana citoplsmica se deben a que el alcohol penetra en la regin hidrocarbonada, desorganizando la estructura lipdica. El alcohol 70% es rpidamente bactericida sobre las formas vegetativas bacterianas tanto grampositivas como gramnegativas, es tuberculicida, fungicida y viricida, incluyendo a CMV, VIH, y VHB. No acta sobre esporos. Principales caractersticas: no tiene buena penetracin sobre materia orgnica, no esteriliza sino que desinfecta, se utiliza fundamentalmente para desinfectar materiales semicrticos y no crticos (termmetros clnicos, pinzas, limpieza de mesadas, etc.) y antisepsia de piel. A nivel de piel se utiliza para antisepsia de manos, previo a inyecciones, punciones venosas, etc. Los alcoholes se evaporan rpidamente, sin dejar residuos sobre las superficies tratadas. Esto es ventajoso cuando se aplica sobre la piel, ya que no mancha ni deja mal olor, pero es inconveniente cuando se aplica a objetos inanimados, ya que no se consiguen largos perodos de contacto entre el desinfectante y el objeto. Para esto deben ponerse los objetos en inmersin en un recipiente tapado.
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Para preparar las diluciones (por ejemplo de alcohol 70%) a partir de alcohol rectificado (95%), podemos utilizar la frmula: C1 . V1 = C2 . V2, de igual manera que para el hipoclorito de sodio. As, para preparar 100 ml de alcohol 70% tenemos: 95% . V1 = 70% . 100 ml Despejando V1 tenemos: V1 = 70% . 100 ml / 95% = 73.6 ml A esta cantidad se le agrega agua destilada hasta completar los 100 ml. Clorohexidina Se encuentra dentro de los antispticos ms utilizados a nivel hospitalario. Se trata de un compuesto fuertemente bsico, que en este estado es insoluble en agua y poco soluble en la mayora de los solventes orgnicos. Para solubilizarla se preparan distintas sales (la ms utilizada es el gluconato), donde se obtiene una concentracin de clorohexidina de hasta el 20%. Las preparaciones ms utilizadas contienen entre 0.5% y 4% de producto. Su pH ptimo de accin se encuentra entre 5.5 y 7. A pH 5 y 6 acta fundamentalmente sobre gramnegativos, mientras que a pH mayores acta tambin sobre grampositivos. Como el estudiante recordar, la flora normal de la piel est constituda fundamentalmente por microorganismos grampositivos, por lo tanto a pH neutro la clorohexidina se transforma en un excelente antisptico cutneo. Su espectro es bastante amplio, abarcando bacterias grampositivas y gramnegativas, hongos y levaduras. Es bacteriosttico (detiene el crecimiento pero no mata) para M. tuberculosis, mas no tiene actividad sobre esporos. Mecanismo de accin: su accin se debera a su unin a grupos negativamente cargados de las molculas celulares. Esto producira precipitacin de protenas y cidos nucleicos, inactivacin enzimtica y prdida irreversible del contenido citoplsmico. La clorohexidina no presenta absorcin cutnea significativa, por lo que prcticamente no tiene efectos adversos por esta va. Ocasionalmente produce sensibilizacin cutnea a nivel genital, las soluciones concentradas pueden producir hematurias cuando son utilizadas para lavado vesical; tambin puede producir ototoxicidad y causar irritacin de las conjuntivas y otros tejidos sensibles. Principales caractersticas: Acta en forma ms lenta que los alcoholes pero su efecto persiste ms tiempo Tiene efecto acumulativo Buena accin sobre bacterias grampositivas, gramnegativas y virus Baja toxicidad e irritabilidad Sus diluciones mantienen ms que los iodforos la actividad bactericida Al 4% es ideal para el lavado quirrgico de manos y preparacin prequirrgica de piel Esto ltimo se debe a las siguientes propiesdades: Acta rpidamente, reduciendo la flora transitoria en un 99% en 15 segundos y la residente en un 99.9% en 30 segundos (se recomiendan lavados de 2 minutos) Si bien tiene efecto inmediato con una sola aplicacin, presenta efecto acumulativo con el uso regular, de manera que va aumentando su accin bactericida de un lavado de manos a otro Tiene accin persistente: tanto las manos del cirujano como la piel que circunda la cisura deben mantenerse libres de grmenes durante la intervencin. El sobrecrecimiento de la flora normal en ambas partes es un hecho frecuente, por su gran afinidad por la piel (a la cual se adhiere), la clorohexidina evita esto, manteniendo por varias horas su accin. Las preparaciones ms utilizadas son las siguientes. Jabn quirrgico: constitudo por gluconato de clorohexidina al 4%, se utiliza en lavado
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quirrgico de manos, preparacin quirrgica de piel, antisepsia general de piel, lavado y antisepsia de heridas, preparacin de piel para procedimientos invasivos, etc. Solucin alcohlica: constituda por gluconato de clorohexidina al 0.5% en alcohol etlico al 70%, se utiliza en antisepsia general de piel, preparacin de piel para procedimientos invasivos, etc.
DESINFECTANTES DE BAJO NIVEL
Se encuentran aqu los compuestos de amonio cuaternarios y los compuestos mercuriales. Este tipo de agentes no deben usarse como antispticos, ni para desinfectar elementos semicrticos; tampoco deben utilizarse dentro de recipientes (vocales) para desinfectar por inmersin, puesto que muchos microorganismos (por ejemplo Pseudomonas spp.) son capaces de multiplicarse en estas condiciones; han habido incluso epidemias intrahospitalarias a partir del mal manejo de estos desinfectantes. Compuestos de amonio cuaternario (cloruro de benzalconio, Rocal, Zephiran, Tritn k12, etc.) Son agentes catinicos y actan a nivel de la membrana celular (agentes activos de superficie). Las principales aplicaciones se dan para la desinfeccin de tems no crticos y desinfeccin ambiental domstica. Compuestos mercuriales (Mertiolate, Mercuriocromo, Metafen, etc.) Son bacteriostticos, necesitando grandes concentraciones para alcanzar efectos bactericidas. Inhiben la actividad enzimtica por unin del mercurio con los grupos sulfhidrilo de las mismas. Estas sustancias estn fuera de uso debido a: Aumento por parte de los microorganismos de la resistencia al mercurio Poseen efectos txicos sobre tejidos y corrosivos sobre metales Son poco activos al pH de los lquidos corporales Se inactivan drsticamente con la presencia de materia orgnica Tcnicas de esterilizacin Para esto contamos con procedimientos fsicos y qumicos. Estos ltimos ya han sido vistos al considerar los desinfectantes de alto nivel. Los procedimientos fsicos se dividen en energticos y mecnicos. Dentro de los primeros se encuentran el calor y las radiaciones; dentro de los segundos, la filtracin. Destruccin de microorganismos mediante calor La energa trmica es la forma ms efectiva de esterilizacin. Esta puede utilizarse como calor hmedo o seco (ver cuadro 2). Calor hmedo Mecanismo de accin: al igual que los procesos de desinfeccin, la esterilizacin trmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no hay un nico mecanismo de accin, sino ms bien la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura. As, aunque el efecto final de la esterilizacin por calor hmedo a 121C es la desnaturalizacin y coagulacin de las protenas, son importantes otros
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mecanismos de destruccin que justifican la utilizacin de calor hmedo a temperaturas inferiores, como veremos ms adelante. El primer efecto letal sera la produccin de rupturas de cadena nica en el ADN que provocaran la muerte celular por activacin o liberacin de enzimas con actividad de endonucleasas. El punto crtico aqu, para la supervivencia de la clula sera su capacidad para reparar la lesin, funcin que depende del estado gentico y fisiolgico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agregara la prdida de la integridad funcional de la membrana citoplsmica, lo que producira interferencias en el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios y la sntesis proteica. Por ltimo, las temperaturas ms elevadas activaran ribonucleasas, que degradando el ARNr producen la prdida de viabilidad de las clulas expuestas. Las temperaturas a las cuales puede usarse el calor hmedo son: Por debajo de 100C Pasteurizacin
Tabla 2. Principales caractersticas de los mtodos de esterilizacin por autoclavado y Poupinell
Autoclave 121C 15-20 min Coagulacin y desnaturalizacin de protenas. Por difusin de vapor de agua. Vidrios, medios de cultivo, gomas, telas, algodn, guantes, algunos plsticos, etc. Medios con ciertos ATBs, azcares o protenas; polvos; vaselinas y aceites; metales oxidables; instrumentos mdicos termosensibles como broncoscopio, etc. Poupinell 160C 2 hs. Desnat. proteica, lesiones por oxidacin y toxicidad por producir aumento de electrolitos. Calentamiento por contigidad. Vidrios, instrumentos metlicos, polvos, aceites y vaselinas, etc. Gomas; plsticos; instrumentos termosensibles; medios con ATB, azcares y protenas; guantes; algodn; papeles.
Temp. requerida Tiempo Mec. de accin
Modo de accin Materiales esterilizables Materiales no esterilizables
Figura 4. Autoclave
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A 100C Ebullicin y tindalizacin Por encima de 100C Autoclavado Pasteurizacin: se utiliza para la destruccin de grmenes patgenos con resistencia trmica similar o inferior a M. tuberculosis, Brucella y Salmonella. Este no es un mtodo de esterilizacin sino de desinfeccin, donde no se destruyen ni esporos ni virus no lipdicos (como el VHA). Existen dos mtodos de pasteurizacin: o se calienta a 65C durante 30 minutos o a 72C durante 15 segundos. Luego ambas se enfran rpidamente a 10C. Esta tcnica se utiliza fundamentalmente en la descontaminacin de la leche. Ebullicin: consiste en mantener un objeto o sustancia en un bao a 100C durante 30 minutos. Aplicado as destruye la mayora de las formas vegetativas bacterianas, hongos y virus lipdicos (Herpesvirus y VIH). En cambio no es efectivo para la destruccin de esporos y virus no envueltos. La repeticin de este proceso durante tres das consecutivos, constituye la tindalizacin. Su fundamento terico est dado por la destruccin de las formas vegetetivas durante los perodos de ebullicin, permitiendo que los esporos germinen durante el reposo volvindose susceptibles al prximo calentamiento. Tampoco aqu se esteriliza. Autoclavado: utiliza vapor de agua a 121C durante 15 o 20 minutos. Esta temperatura se logra si se obtiene una presin de una atmsfera relativa (dos atmsferas absolutas), ya que el aumento de la presin provoca aumentos proporcionales en el punto de ebullicin del agua. Es el mecanismo de destruccin microbiana ms efectivo, y bien utilizado asegura la esterilizacin. El equipo que se utiliza es el autoclave, del cual existen distintos tipos, como ser: vertical de manejo manual, que opera por gravedad, de esterilizacin rpida. Autoclave vertical de manejo manual (figura 4): consta de dos recipientes cilndricos, uno externo con tapa de cierre hermtico que se asegura por mltiples tornillos, y uno interno donde se pone el material a esterilizar. El recipiente externo contiene adems una vlvula de seguridad, un manmetro o termmetro y una llave de salida o escape. La fuente de calor puede venir includa en el equipo, como una resistencia elctrica o se le suministra aparte, desde abajo, generalmente mediante gas. Dentro del recipiente externo se coloca agua destilada, la cual al llegar al punto de ebullicin producir el vapor que al entrar en contacto con los microorganismos, actuar como agente esterilizante. Los materiales se cargan dentro del recipiente interno, que al no tener tapa, permite una fluda entrada de vapor, pero evita el contacto de estos con el agua. El aire es mal conductor del calor, lo que impide llegar a las temperaturas necesarias, por lo que una vez cargado y cerrado el autoclave debe purgarse. Esto se consigue dejando la llave de escape abierta hasta que el vapor, por arrastre, elimine el aire contenido en el equipo. Se cierra la llave, se deja que la presin llegue a una atmsfera relativa (15 lbs.) y luego se cuenta el tiempo. Terminado el ciclo, se apaga la fuente de calor y se deja descender la temperatura. No debe abrirse la tapa hasta que la presin del sistema se iguale a la atmosfrica. Tampoco se debe provocar una liberacin brusca del vapor (abriendo la llave de escape), ya que si hay lquidos dentro del autoclave, alcanzarn rpidamente el estado de ebullicin y se derramarn, debido a que disminuye la presin pero no la temperatura. Existen tambin otros tipos de autoclaves, denominados equipos de esterilizacion rpida, que son automticos y consiguen un ciclo de esterilizacin en 20 minutos. Estos poseen una bomba de vaco que extrae rpidamente el aire del equipo reduciendo la presin. Cuando esta llega a 15 o 20 mmHg, se libera el vapor, que en estas condiciones se distribuye en forma homognea por todo el espacio en breves minutos. En estos autoclaves, se puede reducir el tiempo de esterilizacin a tres minutos, ya que se puede llevar la presin a 3 atmsferas absolutas (134C). La descompresin se logra permitiendo el ingreso de aire filtrado y precalentado. Algunos equipos permiten adems el secado final mediante vaco y reentrada de aire caliente.
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Mediante el autoclavado se pueden esterilizar una gran variedad de objetos y lquidos, siempre que no contengan antibiticos que pueden perder actividad, protenas que coagulen, azcares que se caramelicen, etc. As se esterilizan guantes, telas, algodn, papel, lquidos, filtros, algunos plsticos y gomas. Los lquidos a esterilizar deben estar fraccionados en frascos cerrados pero con la tapa de rosca floja, de modo que pueda salir el aire y entrar el vapor. Aquellos materiales que no se encuentren dentro de algn recipiente que los proteja de la recontaminacin al sacarlos del autoclave, debern ser envueltos con una doble capa de papel, de manera de formar pequeos paquetes; entre estos objetos se encuentran guantes, ropa, placas de Petri, pipetas, tubos de ensayo, etc. Se debe de tener cuidado de no sobrecargar el autoclave, de manera tal que los paquetes y frascos impidan el flujo libre del vapor. No se deben esterilizar por este mtodo equipos que resulten corrodos por el agua, como instrumentos metlicos. Tampoco polvos o aceites, ya que son impermeables al vapor. Calor seco Mecanismo de accin: es diferente al del calor hmedo. El calor seco (o desecacin en general) provoca desnaturalizacin de protenas, lesiones por oxidacin y efectos txicos por niveles elevados de electrolitos. La accin letal es el resultado del calor trasmitido desde el material con el cual los microorganismos estn en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea. Existen tres formas principales de esterilizacin por calor seco: flambeado, incineracin y mediante la utilizacin del horno Pasteur. Hablaremos solamente de esta ltima. Se necesita alcanzar mayor tiempo y temperatura que en el autoclave, debindose mantener un objeto a 160C durante 2 hs. El motivo de estos incrementos estara dado porque la ausencia de agua disminuira el nmero de grupos polares de las cadenas peptdicas, lo que dara mayor estabilidad a las molculas bacterianas, por lo que se requerira mayor energa para abrirlas. Horno Pasteur o Poupinell Consiste en un recinto metlico de doble pared con aislante entre ambas (para evitar la prdida de calor) y una puerta. La fuente de calor suele ser elctrica y est incorporada. Posee un ventilador que facilita la circulacin del aire caliente, para homogeneizar la temperatura. Un termmetro (con alcance mnimo de 200C) visible desde afuera, registra la temperatura del interior del recinto. Por calor seco se pueden esterilizar materiales de inyectables, vidrios, instrumentos quirrgicos y objetos metlicos, as como aceites, vaselinas y polvos, que como ya se ha dicho son impermeables al vapor. Precauciones: colocar paquetes pequeos y espaciados, para no interferir con la difusin del calor. La recarga del horno debe hacerse cuando este se encuentre fro, de lo contrario su interior alcanzar la temperatura antes que el material a esterilizar, por lo que se medir mal el tiempo. Controles de esterilizacin: existen tres tipos, fsicos, qumicos y biolgicos. Los controles fsicos estn relacionados al operario que realiza el procedimiento y la vigilancia de ciertos parmetros como presin, tiempo, temperatura, etc. Los controles qumicos consisten en tiras de papel con una sustancia que cambia de color al ser expuesta a la temperatura correspondiente. La ventaja de este mtodo es la rapidez con que se sabe el resultado, ya que es inmediato. La gran desventaja es que dice poco sobre el tiempo de exposicin, por lo que no asegura un procedimiento correcto. Estos controles deben utilizarse en todos los ciclos de esterilizacin. Los controles biolgicos consisten en exponer esporos bacterianos al ciclo de
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Figura 5. Trayectoria ondulante de un fotn. Lo comprendido dentro de la llave, corresponde a su longitud de onda
esterilizacin y luego verificar su viabilidad. Son los ms seguros. Dentro de una ampolla se encuentra un medio de cultivo apropiado para el desarrollo de las bacterias en estudio. Por fuera de esta, un tubo plstico, contiene una cinta de papel marcador de pH, impregnado con esporos de bacterias capaces de resistir temperaturas cercanas a los procesos realizados. Se utilizan esporos de Bacillus estearothermophilus en el autoclave y de B. subtilis en la poupinell. Este sistema se coloca dentro del paquete menos accesible, ya sea para el calor o el vapor. Finalizado el ciclo de esterilizacin, se rompe la ampolla (por presin manual sobre el tubo), esto pone en contacto el medio con los esporos y se incuba en un bao (a 60C para Bacillus estearothermophilus y a 37C para B. subtilis) durante ms de 48 hs. Si existen microorganismos viables, su metabolismo provocar un cambio de pH que har virar el color del marcador, revelando el fallo del procedimiento, por lo que deber volverse a esterilizar todo. Este tipo de controles debe realizarse peridicamente, o cuando se dude de la efectividad del procedimiento. Esterilizacin por radiaciones Con este fin pueden utilizarse tanto las radiaciones ultravioletas (UV) como las ionizantes y rayos infrarrojos. Como el estudiante recordar, con respecto a la naturaleza de la luz se acepta una combinacin entre la teora cuntica y la electromagntica. Es decir, que existe una partcula indivisible (denominada cuanto) constituda por un fotn que se desplaza a travs del espacio describiendo una trayectoria ondulatoria (figura 5). La energa de un fotn es inversamente proporcional a la longitud de onda de la radiacin, sabiendo que longitud de onda es la distancia que existe entre dos puntos correspondientes de la trayectoria ondulante. Parte de esta energa es absorbida por los sistemas biolgicos cuando estos son expuestos a las radiaciones. La fraccin de energa absorbida es directamente proporcional a la intensidad de la radiacin, al tiempo de exposicin a la misma y a un coeficiente de absorcin que es caracterstico de cada material. Veremos que sucede a nivel molecular cuando las radiaciones interactan con la materia. Cuando la radiacin incidente tiene energa suficiente puede elevar el nivel energtico de los electrones, hasta el punto de arrancarlos de su orbital (producindose ionizaciones). Si la energa es menor, los electrones aumentan su nivel de energa pero solo temporalmente, volviendo a su estado inicial luego de un perodo de tiempo. Este estado elevado de energa
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se denomina estado excitado. La molcula excitada podr transferir ese exceso de energa a otras, en forma de energa vibratoria (producindose calor); o disiparla en forma de radiacin electromagntica. Debido a la relativamente baja cantidad de energa que son capaces de transmitir los rayos UV, solo afectan a los electrones de los tomos perifricos de las molculas, producindose solo estados de excitacin. Las radiaciones ionizantes son las que pueden extraer electrones de sus orbitales. Los rayos infrarrojos solo pueden provocar energa vibratoria, por lo que solo generan calor. Hablaremos a continuacin solamente de las radiaciones UV, ya que son las ms utilizadas en nuestros laboratorios. No obstante, el estudiante debe saber que las radiaciones ionizantes son cada vez ms utilizadas en los laboratorios como tcnicas de esterilizacin de rutina, ya que los adelantos tecnolgicos han simplificado estos equipos y su manipulacin. Se utilizan para la esterilizacin de materiales descartables como jeringas, agujas, materiales para vas, etc. Radiaciones UV Mecanismo de accin: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorcin por el ADN y el resultante dao de este. As, provocan la formacin de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formacin de dmeros de pirimidina de tipo ciclobutano (figura 6). Esto produce distorsiones en la forma del ADN e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibicin de la sntesis de ADN y secundario a esto, inhibicin del crecimiento y la respiracin. Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con lmparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para grampositivos y gramnegativos. Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no penetran en slidos y lo hacen pobremente en lquidos. Esterilizacin por mtodos mecnicos: filtracin Es el mtodo usado en el laboratorio para esterilizar lquidos termolbiles. Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cermica y de steres de celulosa o membranas. Las membranas estn compuestas por steres de celulosa biolgicamente inertes. Los poros varan desde 0.025 m a 25 m de dimetro, siendo los de 0.22 m los ms utilizados ya que son lo suficientemente pequeos para detener a todas las bacterias. Con este mtodo se esterilizan azcares, urea, sueros, antibiticos, etc. Los filtros de membrana tambin se utilizan en microbiologa para otros propsitos. Dado que son inertes, proporcionan un buen medio para recoger microorganismos, por ejemplo para cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen de lquido. El mecanismo de accin es bastante simple: detienen todas las partculas que posean un tamao mayor que los poros. En realidad los poros quedan formados por los espacios que resultan de la superposisin de las fibras de las distintas capas que forman la membrana. As, algunas partculas de menor tamao son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por suma de partculas retenidas previamente, por lo cual el tamao del poro es un valor virtual definido por el tamao de la partcula retenida, ms que por un dimetro real y medible.
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Figura 6. Estructura de dos molculas de pirimidina (timina-timina) adyacentes de la misma cadena. A. Organizacin normal; B. organizacin luego de exposicin a rayos UV donde se puede ver el ciclo butano que se forma entre los carbonos 5 y 6 de ambas molculas.
Algunas recomendaciones al final del captulo

El mecanismo de esterilizacin ms efectivo es el autoclavado; siempre que sea posible, este debe ser el procedimiento a elegir. La etapa de purgado debe hacerse a temperaturas moderadas, ya que a altas temperaturas el vapor comienza a salir sin arrastrar al aire, lo que nos lleva a cerrar la llave de escape antes de tiempo. Los materiales que vienen esterilizados de origen y que son de un nico uso nunca debern ser reesterilizados ni reusados. En caso de tener que manejar material contaminado como ser instrumental y ropa luego de un acto quirrgico, este debe ser manejado con guantes y pasado por un proceso de autoclavado previo a la limpieza de restos orgnicos (con el fin de eliminar todos los microorganismos, salvo los que puedan estar protegidos por elementos como sangre, secreciones, restos necrticos, etc.); luego s, esterilizarlos definitivamente.
Ciclo decontaminacinlimpieza-esterilizacin Cuando se use un antisptico debern tenerse algunas precauciones:
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lavar la regin previamente para eliminar restos orgnicos; retirar con abundante agua cualquier residuo de jabn; secar la superficie, ya que se pueden provocar diluciones excesivas del producto (fundamentalmente en el caso de los iodforos y alcoholes), disminuyendo su actividad; dejarlo actuar un tiempo apropiado, se recomiendan dos minutos antes de realizar cualquier procedimiento. Con respecto al uso de jabones: estos debern quedar en lugares secos, ya que de estar sumergidos en agua, pueden transformarse en un reservorio de grmenes (sobre todo gramnegativos). Las jaboneras debern lavarse con frecuencia y los recipientes para jabn lquido debern removerse aproximadamente cada 15 das, tirando el contenido que les quede, limpindolos y agregndoles soluciones nuevas. Por ltimo pero no menos importante, la salud de los pacientes y del personal en cualquier servicio mdico depender en gran parte de la medida en que todos los integrantes del grupo de salud, incluyendo los estudiantes, trabajen siempre medularmente con el criterio de asepsia.
Bibliografa
Martin MA, Wenzel RP . Esterilizacin, desinfeccin y eliminacin de deshechos infecciosos. En: Mandell, Bennett, Dolin, Mandell, Douglas y Bennett. Enfermedades Infecciosas. Principios y prcticas. 4ta ed. Ed. Panamericana. 1995;2892-2900. Hernndez L, Malagn G, Silva J. Antisepsia. En: Malagn, Hernndez. Infecciones hospitalarias. Ed. Panamericana. 1995;185-227. Hernndez L, Silva J. Desinfeccin. En: Malagn, Hernndez. Infecciones hospitalarias. Ed. Panamericana; 1995;231-335. Arroyane ML. Esterilizacin. En: Malagn, Hernndez. Infecciones hospitalarias. Ed. Panamericana. 1995; 339-348. McDonnell G, Denver A. Antiseptics and desinfectants: activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews. 1999;12:1;147-179. Rutala WA. Selection and use of desinfectants in healthcare. En: Hospital Epidemiology and Infection Control. 2da ed. Lippincott Williams and Wilkins.1998;1161-1188. Keene JH. Sterilization and pasteurization. En: Hospital Epidemiology and Infection Control. 2da ed. Lippincott Williams and Wilkins. 1998;1161-1188.
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Principales grupos de antibiticos

V. Seija, R. Vignoli
Introduccin
Dos descubrimientos importantes sealaron el comienzo de una nueva era en la quimioterapia y revolucionaron el tratamiento de las enfermedades infecciosas. El primero fue el descubrimiento en 1935 de los efectos curativos del colorante rojo de Prontosil en las infecciones por estreptococos. Este fue el precursor de las sulfonamidas. El segundo descubrimiento fue el que dio inicio a la edad de oro de la antibioticoterapia, nos referimos al descubrimiento de la penicilina y su posterior desarrollo. Esta fue descubierta por Fleming en 1929 y en 1940 Florey, Chain y colaboradores demostraron y publicaron un informe acerca de su enorme potencia y la posibilidad de su extraccin de los sobrenadantes del cultivo del hongo Penicilium notatum. El conocimiento actual sobre los mecanismos de duplicacin de la bacteria y sobre los mecanismos de resistencia, hace esperar que cada vez ms los nuevos antimicrobianos sean sustancias puramente sintticas con gran especificidad por un sitio de accin previamente elegido y con una adecuada resistencia a la inactivacin por los mecanismos de resistencia antibitica. Este captulo se concentrar en algunas generalidades de los antibiticos y luego en las principales caractersticas de los grupos de antibiticos ms utilizados en la prctica clnica. No es nuestro objetivo sustituir los textos de farmacologa, complemento imprescindible para el conocimiento del tema antibiticos.
Definiciones
Antimicrobiano: molcula natural (producida por un organismo vivo, hongo o bacteria), sinttica o semisinttica, capaz de inducir la muerte o la detencin del crecimiento de bacterias, virus u hongos. Hoy en da no se utilizan molculas de origen natural, por lo cual no se establece ms la diferenciacin con quimioterpicos, trmino usado para referirse a las molculas de origen sinttico y sus derivados. Utilizaremos el trmino antibitico para referirnos al subgrupo de antimicrobianos con actividad antibacteriana. Los antibiticos constituyen un grupo heterogneo de sustancias con diferente comportamiento farmacocintico y farmacodinmico, ejercen una accin especifica sobre alguna estructura o funcin del microorganismo, tienen elevada potencia biolgica actuando a bajas concentraciones y la toxicidad es selectiva, con una mnima toxicidad para las clulas de nuestro organismo. El objetivo de la antibioticoterapia es controlar y disminuir el nmero
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de microorganismos viables, de modo que el sistema inmunolgico sea capaz de eliminar la totalidad de los mismos. De acuerdo a la interaccin germen-antibitico, estos frmacos pueden dividirse en: a) bactericidas: su accin es letal, llevando a la lisis bacteriana; b) bacteriostticos: a las concentraciones que alcanzan en el suero o tejidos impiden el desarrollo y multiplicacin bacteriana pero sin llegar a destruir las clulas. De hecho, cuando se retira el antibitico, el microorganismo se puede multiplicar de nuevo.
Clasificacin segn el espectro de accin

Amplio: aquellos antibiticos que son activos sobre un amplio nmero de especies y gneros diferentes. Reducido: antibiticos solo activos sobre un grupo reducido de especies.
Clasificacin segn el mecanismo de accin

Es el mecanismo por el cual un antibitico es capaz de inhibir el crecimiento o destruir una clula bacteriana (ver figura 1). Se dividen en inhibidores de la formacin de la pared bacteriana, inhibidores de la sntesis proteica, inhibidores de la duplicacin del ADN, inhibidores de la membrana citoplasmtica, inhibidores de vas metablicas.
Clasificacin segn farmacocintica y farmacodinamia

Por muchos aos la susceptibilidad bacteriana se ha medido a travs de pruebas in vitro, como la determinacin de la concentracin inhibitoria mnima (CIM). Este nmero luego era comparado con las concentraciones sricas o plasmticas del antibitico, alcanzadas con las dosis habituales del mismo. Esto no tiene en cuenta la farmacocintica o la farmacodinamia de cada antibitico en particular. Cada clase de antibitico es metabolizada en forma diferente por nuestro organismo. No es lo mismo un betalactmico, con escasa penetracin celular, que un macrlido que se concentra a nivel intracelular. Esto es lo que llamamos farmacocintica: absorcin, distribucin, eliminacin. Por otro lado est la farmacodinamia que intenta comprender las relaciones entre las drogas y sus efectos, tanto deseables (muerte bacteriana en nuestro caso) como indeseables. Los antibiticos pueden clasificarse de acuerdo a la forma en que producen la muerte o inhibicin bacteriana en antibiticos tiempo dependientes y concentracin dependientes. En el caso de los tiempo dependientes (betalactmicos y macrlidos) el xito de la teraputica viene dado por mantener concentraciones por encima de la CIM por el mayor tiempo posible interdosis (T por encima de CIM). En el caso de los concentracin dependientes el xito teraputico viene dado por lograr un buen pico srico de concentracin (Pico/CIM) o un buen rea bajo la curva (AUC/CIM), dependiendo de cada droga. (Ver figura 2)
Betalactmicos
Definicin: los betalactmicos son un grupo de antibiticos de origen natural o semisinttico que se caracterizan por poseer en su estructura un anillo betalactmico. Actan inhibiendo la ltima etapa de la sntesis de la pared celular bacteriana. Constituyen la familia ms numerosa
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Figura 1. Sitio de accin de los antimicrobianos
Figura 2. Parmetros farmacodinmicos AUC-rea bajo la curva. MIC-concentracin inhibitoria mnima. Serum concentration-concentracin srica. Time-tiempo. Cmax-concentracin srica mxima. Time above MIC-tiempo por encima de la CIM. Half-life-vida media
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de antimicrobianos y la ms utilizada en la prctica clnica. Se trata de compuestos de accin bactericida lenta, relativamente independiente de la concentracin plasmtica, que presentan escasa toxicidad y poseen un amplio margen teraputico. Su espectro se ha ido ampliando a lo largo de los aos por la incorporacin de nuevas molculas con mayor actividad frente a los bacilos gramnegativos; pero la progresiva aparicin de resistencias adquiridas ha limitado su uso emprico y su eficacia en determinadas situaciones. Clasificacin: el espectro de los betalactmicos incluye bacterias grampositivas, gramnegativas y espiroquetas. No son activos sobre los micoplasmas porque estos carecen de pared celular, ni sobre bacterias intracelulares como Chlamydia y Rickettsia. La resistencia natural de las micobacterias se debe a la produccin de betalactamasas, probablemente unida a una lenta penetracin por las caractersticas de la pared. Se pueden clasificar en cuatro grupos diferentes: penicilinas, cefalosporinas, monobactmicos y carbapenemes.
PENICILINAS
Son un grupo de antibiticos de origen natural y semisinttico que contienen el ncleo de cido 6-aminopenicilnico, que consiste en un anillo betalactmico unido a un anillo tiazolidnico. Los compuestos de origen natural son producidos por diferentes especies de Penicillum spp. Las penicilinas difieren unas de otras por sustituciones en la posicin 6 del anillo, donde cambios en la cadena lateral pueden inducir modificaciones en la actividad antibacteriana y en las propiedades farmacocinticas. De acuerdo a su origen y espectro de accin pueden clasificarse en (ver tabla 1): penicilinas naturales (G y V), penicilinas resistentes a las penicilinasas estafiloccicas (oxacilina, meticilina, dicloxacilina), aminopenicilinas (ampicilina, amoxicilina), carboxipenicilinas (carbenicilina, ticarcilina), ureidopenicilinas (piperacilina). El espectro antimicrobiano de la penicilina G abarca cocos grampositivos, cocos gramnegativos (Neisseria meningitidis) y bacilos grampositivos, tanto facultativos como anaerobios, as como espiroquetas y algunos bacilos gramnegativos anaerobios. La produccin de derivados semisintticos del cido 6-aminopenicilnico permiti disponer de preparados activos por va oral, con mayor resistencia a las betalactamasas y mayor capacidad de penetracin en las bacterias gramnegativas, como las aminopenicilinas y las penicilinas antiestafiloccicas. Las penicilinas antipseudomonas (carboxi y ureidopenicilinas) son estables frente a las betalactamasas cromosmicas propias de Pseudomonas pero no ante la presencia de betalactamasas plasmdicas. (Ver tabla 2) Farmacologa: la absorcin oral difiere en las diferentes penicilinas. La penicilina G no se absorbe bien mientras que la V resiste la inactivacin gstrica y se absorbe mucho mejor. La amoxicilina se absorbe mejor que la ampicilina (95% contra 40%). Las penicilinas antiestafiloccicas, oxacilina y dicloxacilina, son estables al cido gstrico y se absorben adecuadamente. La penicilina G benzatnica tiene una absorcin lenta desde su depsito intramuscular. Esto determina que los niveles sricos alcanzados sean bajos y por tanto solo es adecuada para el tratamiento de infecciones por grmenes extremadamente sensibles como Streptococcus pyogenes, y para el tratamiento de la sfilis. Las penicilinas se distribuyen en muchos compartimentos como pulmones, hgado, msculo, hueso y placenta. La penetracin en ojo, cerebro, LCR y prstata es pobre en ausencia de inflamacin. En la sangre los betalactmicos circulan como sustancias libres o unidas a las protenas plasmticas, relacionndose esta unin con la semivida del antibitico; solo la fraccin libre de la droga es activa y capaz de penetrar al espacio extracelular. Los betalactmicos son sustancias poco lipoflicas, su penetracin intra-
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Tabla 1.
Vas de utilizacin Penicilinas naturales Penicilina G IM IV Penicilina V VO Espectro antimicrobiano Streptococcus pneumoniae Streptococcus beta hemolticos Streptococcus bovis Streptococcus grupo viridans Pasteurella multocida Neisseria meningitidis Clostridium spp Treponema pallidum Aminopenicilinas Ampicilina Amoxicilina IM, IV VO Actinomyces Igual que anterior ms Enterococcus Listeria monocytogenes Haemophilus influenzae no productor de beta lactamasa Salmonella spp E.coli no productor de beta lactmasas Penicilinas antiestafilocccicas Cloxacilina Oxacilina Dicloxacilina Carboxipenicilinas Ticarcilina Ureidopenicilinas Piperacilina IM, IV IM, IV VO VO, IM, IV VO Ms activas contra la hidrlisis por beta lactamasas producidas por enterobacterias y Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Staphylococcus spp meticilino sensibles
celular es escasa, no alcanzando casi nunca concentraciones mayores del 25% al 50% de las concentraciones plasmticas. La excrecin es renal. Puede ser bloqueada con la administracin de probenecid, lo que prolongada la vida media srica.
CEFALOSPORINAS
Son productos de origen natural derivados de productos de la fermentacin del Cephalosporium acremonium. Contienen un ncleo constitudo por cido 7-aminocefalospornico formado por un anillo betalactmico unido a un anillo de dihidrotiazino. Modificaciones en la posicin 7 del cido 7-aminocefalospornico estn asociadas con la alteracin en su actividad antibacteriana y sustituciones en la posicin 3 estn asociadas a alteraciones en la farmacocintica y en los parmetros metablicos del agente. Se definen cuatro generaciones de cefalosporinas.
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Tabla 2.
Antibiticos Cefadroxil Cefazolina Cefalexina Cefradina Espectro antimicrobiano Staphylococcus spp meticilino sensibles Streptococcus pyogenes E. coli Proteus mirabilis Cefalosporinas de segunda generacin Cefuroxime Klebsiella spp Agregan actividad sobre Haemophilus influenzae Cefalosporinas de tercera generacin Cefotaxime Ceftriaxona Moraxella catarrhalis Enterobacterias N. gonorrhoeae, N. meningitidis Streptococcus pneumoniae Agrega cobertura sobre Pseudomonas aeruginosa
Cefalosporinas de primera generacin
Ceftazidime Cefoperazona Cefalosporinas de cuarta generacin Cefepime Cefpirome
Estable frente a beta lactamasas cromosmicas de clase 1
Las cefalosporinas de primera generacin son muy activas frente a los cocos grampositivos; en lneas generales, las sucesivas generaciones han perdido parte de esa actividad, en beneficio de una mayor actividad frente a bacilos gramnegativos, con algunas excepciones. Todas las cefalosporinas son inactivas frente a enterococos, estafilococos resistentes a la meticilina y Listeria monocytogenes. (Ver tabla 2) Farmacologa: la mayora de las cefalosporinas son de administracin parenteral, aunque existe un nmero creciente de formulaciones para va oral como la cefalexina, cefradina, cefadroxil, cefuroxime axetil y otras. La absorcin gastrointestinal de estos compuestos es buena. Se obtienen buenas concentraciones en lquidos biolgicos y suero. No se obtienen buenas concentraciones intracelulares. Cefotaxime, ceftriaxona, cefoperazona y cefepime entran en el LCR alcanzando altas concentraciones. Todas las cefalosporinas, excepto cefoperazona de excrecin biliar, se excretan primariamente por el rin. Ceftriaxona tiene la vida media ms larga (8 horas) lo que permite su administracin 1 o 2 veces al da, mientras las dems tienen un esquema de dosificacin cada 6 u 8 horas.
MONOBACTMICOS
Aztreonam, el nico monobactmico disponible para uso clnico, posee una excelente actividad sobre bacterias gramnegativas aerobias y facultativas. Por el contrario, carece de actividad frente a grampositivos y bacterias anaerobias.
CARBAPENEMES
Son una clase nica de betalactmicos que presentan el mayor espectro de actividad conocido dentro de este grupo de antibiticos. Imipenem es el primer carbapenem desarrollado para uso clnico. Es un derivado semisinttico producido por Steptomyces spp. Otros compuestos
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ms modernos son meropenem y ertapenem. Su actividad bactericida se extiende a cocos grampositivos incluyendo Staphylococcus spp. sensibles a meticilina, S. pneumoniae y otros Streptococcus. Solo carecen de actividad frente a los estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a betalactmicos, algunas especies de Pseudomonas y Stenotrophomonas maltophilia. Es activo sobre la mayora de aislamientos de enterobacterias y Haemophilus spp., incluyendo las cepas productoras de betalactamasas. Tiene una muy buena actividad anaerobicida, con excepcin de Clostridium difficille. En el caso de ertapenem, este no es activo sobre Pseudomonas aeruginosa. Farmacologa: estos compuestos son de administracin parenteral. Mediante la administracin intravenosa suelen alcanzarse con rapidez concentraciones plasmticas elevadas. Se distribuyen ampliamente. El imipenem sufre inactivacin por las hidroxipeptidasas renales, por ello se combina con cilastatina (inhibidor de hidroxipeptidasas) de manera de lograr concentraciones sricas adecuadas. Mecanismo de accin de betalactmicos: los antibiticos betalactmicos son agentes bactericidas que inhiben la sntesis de la pared celular bacteriana e inducen adems un efecto autoltico. La destruccin de la pared celular bacteriana se produce como consecuencia de la inhibicin de la ltima etapa de la sntesis del peptidoglicano. El peptidoglicano est constituido por largas cadenas de glcidos, formadas por la repeticin de molculas de cido N-acetilmurmico y N-acetilglucosamina. El cido murmico fija cadenas de tetrapptidos que se unen entre s para formar una malla, directamente (gramnegativos) o mediante un pentapptido (grampositivos). Los betalactmicos inhiben precisamente esta unin o transpeptidacin, ltima etapa de la sntesis de la pared celular. De este modo, la pared queda debilitada y puede romperse por la presin osmtica intracelular. Para que acten los betalactmicos es necesario que la bacteria se halle en fase de multiplicacin, ya que es cuando se sintetiza la pared celular. Los betalactmicos tambin actan activando una autolisina bacteriana endgena que destruye el peptidoglicano. La lisis se produce con concentraciones que superan entre 4 y 10 veces la CIM de un determinado microorganismo. Las bacterias que carecen de autolisina son inhibidas pero no destrudas, por lo que se dice que son tolerantes. Se define el fenmeno de tolerancia como la necesidad de una concentracin al menos 32 veces mayor a la CIM para que un antimicrobiano destruya una cepa bacteriana. Farmacodinamia: los betalactmicos son antibiticos de actividad bactericida lenta, relativamente independiente de la concentracin plasmtica alcanzada, siempre que esta exceda la CIM del agente causal. La actividad bactericida y probablemente la eficacia clnica, se relacionan mejor con el tiempo durante el cual dicha concentracin excede la CIM (T por encima de CIM). Para la mayora de las infecciones se considera adecuado que el tiempo que supera la CIM sea como mnimo del 40% del intervalo entre dosis; pero en pacientes neutropnicos o con meningitis es probable que sea mejor estar todo el tiempo por encima de la CIM. Estos parmetros indican que alargar los intervalos entre dosis puede llevar a fracasos teraputicos. Obviamente estas consideraciones no son vlidas en el caso de betalactmicos con semivida muy prolongada, que se administran cada 24 hs, como la ceftriaxona. La actividad bactericida de los betalactmicos disminuye cuanto mayor es el tamao del inculo bacteriano; este hecho es especialmente relevante en el tratamiento de los abscesos, donde adems las poblaciones bacterianas pueden hallarse en fase estacionaria. El efecto postantibitico (EPA) consiste en la accin residual del antibitico sobre la bacteria despus de descender las concentraciones teraputicas en la sangre y los tejidos por debajo de la CIM. En el caso de los antibiticos betalactmicos, el EPA es de corta duracin, con la
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excepcin de los carbapenemes, que presentan un EPA apreciable, tanto sobre grampositivos como sobre gramnegativos.
BETALACTMICOS ASOCIADOS A INHIBIDORES DE LAS BETALACTAMASAS
Los llamados inhibidores de las betalactamasas son molculas que contienen en su estructura un anillo betalactmico. No tienen casi ninguna accin antibitica, con la excepcin de sulbactam frente a Acinetobacter baumannii, pero presentan una gran afinidad por las betalactamasas. Estas son enzimas producidas por las bacterias que destruyen la actividad de determinados betalactmicos, de acuerdo al tipo de enzima. Los inhibidores son conocidos como inhibidores suicidas, debido a que una vez que se unen a la enzima la destruyen pero tambin son destrudos por esta. Hay tres en uso clnico: cido clavulnico, sulbactam y tazobactam. Estos inhibidores unidos a penicilinas o cefalosporinas recuperan la actividad perdida por estas como consecuencia de la produccin de betalactamasas. Estas betalactamasas deben ser susceptibles al inhibidor para que la combinacin sea efectiva. Por ejemplo, la beta lactamasa producida por Bacteroides fragilis es susceptible al sulbactam, por lo tanto la combinacin ampicilina/sulbactam es adecuada para tratar infecciones por este microorganismo. En cambio la betalactamasa cromosmica de Enterobacter cloacae no es susceptible a los inhibidores, por lo cual las combinaciones con inhibidores para tratar microorganismos productores de este tipo de enzimas no son tiles. En nuestro pas se encuentran disponibles: ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulnico, piperacilina/tazobactam y cefoperazona/sulbactam. Esta ltima es una cefalosporina asociada a un inhibidor. Efectos adversos de betalactmicos: los efectos adversos son poco frecuentes y generalmente de poca importancia clnica, ya que estos frmacos actan sobre sustratos enzimticos no presentes en las clulas eucariotas del hombre o de los animales. Poseen una cierta accin irritativa directa sobre el aparato digestivo y sobre el msculo o la vena, dependiendo de la va por la que se administran, pudiendo causar flebitis o miositis. Adems su estructura favorece la aparicin de manifestaciones de hipersensibilidad: exantemas, edemas, hemlisis y con muy baja frecuencia pueden producir shock anafilctico. La hipersensibilidad puede ser cruzada entre los betalactmicos, particularmente entre las penicilinas con carbapenemes y cefalosporinas (5% a 15%). Pueden causar acciones adversas por disbacteriosis, con colonizacin y superinfeccin por bacterias endgenas resistentes u hongos. Las disbacteriosis estn en relacin directa con la amplitud del espectro antibitico, con la dosis y con la concentracin del antibitico en las mucosas y la piel, colonizadas por flora normal. Por ejemplo, est muy bien estudiado que el uso de cefalosporinas de tercera generacin favorece la colonizacin intestinal por Enterococcus y enterobacterias multirresistentes. Pueden aparecer convulsiones y crisis mioclnicas si se utilizan dosis elevadas, sobre todo en pacientes con alteracin de la funcin renal. En este sentido, el imipenem posee una mayor capacidad irritativa sobre el sistema nervioso central que el resto de los betalactmicos. Indicaciones clnicas de betalactmicos: nos centraremos en las indicaciones de este tipo de antibiticos en infecciones comunitarias. Infeccin de piel y partes blandas: la penicilina V y amoxicilina pueden ser una opcin para las infecciones producidas por S. pyogenes (celulitis, erisipela, imptigo). En infecciones invasivas debe utilizarse penicilina G y en presencia de un sndrome de sepsis o shock txico debe aadirse clindamicina por el mecanismo de accin que tiene esta droga frente a poblaciones no replicativas e inhibe la sntesis proteica y por lo tanto la sntesis de toxinas.
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En el caso de las celulitis estafiloccicas pueden tratarse con una cefalosporina de primera generacin o una penicilina antiestafiloccica. Infecciones de las vas respiratorias: la penicilina benzatnica por va intramuscular en dosis nica o la amoxicilina va oral constituyen el tratamiento de eleccin de la faringitis estreptoccica. La amoxicilina adems, es un buen tratamiento emprico en casos de otitis media aguda. Otra opcin es amoxicilina/clavulnico cuando se trata de Moraxella catarralis o Haemophilus influenzae productor de betalactamasa. Amoxicilina/clavulnico es una opcin para el tratamiento emprico de los episodios de exacerbacin aguda de la bronquitis crnica, en el caso de ser necesario su tratamiento antibitico. La penicilina G o la amoxicilina por va oral son los antibiticos de eleccin para el tratamiento de la neumonia neumoccica producida por cepas con CIM inferior o igual a 4 g/ml, que son la inmensa mayora en nuestro pas. Endocarditis bacteriana: la penicilina es el antibitico de eleccin en la endocarditis causada por Streptococcus viridans. En general se asocia a gentamicina durante la primera fase del tratamiento. En la endocarditis enteroccica se administra ampicilina ms gentamicina empricamente, y luego de conocer la sensibilidad se debe ajustar el tratamiento. Infecciones del sistema nervioso central: en la actualidad, la ceftriaxona y el cefotaxime son los antibiticos de eleccin en el tratamiento de la mayora de pacientes con meningitis bacteriana de la comunidad. Para meningitis producidas por neumococos con sensibilidad disminuda o resistentes a las cefalosporinas de tercera generacin, debe emplearse dosis elevadas de cefotaxime (300 mg/kg/da), asociada a vancomicina. Infeccin intraabdominal: el cefotaxime es una buena opcin para el tratamiento de la peritonitis bacteriana espontnea, que suele presentarse en pacientes cirrticos con ascitis. La peritonitis secundaria es una infeccin polimicrobiana que suele incluir anaerobios y aerobios facultativos. La monoterapia con ampicilina/sulbactam constituye una opcin teraputica razonable en los casos de inicio en la comunidad. Infeccin urinaria: el uso de betalactmicos en este tipo de infecciones se reserva para pacientes embarazadas o en el caso de resistencia a otros antibiticos. Tambin se puede usar cefalosporinas de tercera generacin para el tratamiento emprico de los casos de pielonefritis, aunque en nuestro pas hay tendencia a usar quinolonas en este caso. Infecciones osteoarticulares: los betalactmicos son el tratamiento de eleccin de un buen nmero de artritis spticas; cefalosporinas de primera generacin en las artritis estafiloccicas, penicilina en las estreptoccicas y ceftriaxona en las gonoccicas. As, la oxacilina o las cefalosporinas de primera generacin son el tratamiento de eleccin en la osteomielitis estafiloccica.
Glicopptidos
Definicin y espectro de accin: se trata de antibiticos que actan sobre la pared bacteriana. Actualmente hay dos drogas en uso clnico: vancomicina y teicoplanina. La vancomicina es un antibitico bactericida de espectro reducido (solo acta sobre bacterias grampositivas), que se obtiene de Streptomyces orientales. Fue introducida en 1956 pero debido a su toxicidad fue relegada. Hoy en da es una opcin teraputica importante contra Staphylococcus meticilinorresistente de perfil hospitalario (SAMAR), Staphylococcus coagulasanegativos meticilinorresistentes, Corynebacterium JK (multirresistente) y Enterococcus resistente a los betalactmicos o a aminoglucsidos. La teicoplanina tiene una estructura similar a la vancomicina y un perfil de actividad tambin similar. Los glicopptidos son activos adems
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sobre Streptococcus, corinebacterias, Bacillus spp., algunos actinomicetales y Clostridium spp., includo Clostridium difficile. Mecanismo de accin: los glicopptidos inhiben la sntesis y el ensamblado de la segunda etapa del peptidoglicano de la pared celular mediante la formacin de un complejo con la porcin D-alanina-D-alanina del pentapptido precursor (Ver captulo 35). Adems daa los protoplastos alterando la permeabilidad de la membrana citoplasmtica y altera la sntesis de ARN. Sus mltiples mecanismos de accin contribuyen a la baja frecuencia de desarrollo de resistencia. Se une rpida y firmemente a las bacterias y ejerce su efecto bactericida sin un perodo de induccin, pero solo sobre microorganismos en multiplicacin activa. Farmacocintica y farmacodinamia: la vancomicina se absorbe poco si se administra por va oral. No se administra por va intramuscular por el intenso dolor que causa en el sitio de inyeccin. La vancomicina tiene un gran volumen de distribucin, alcanzando buenos niveles en fludos biolgicos como lquido pleural, ascitis y sinovial. Tiene una escasa penetracin intracelular. Tiene una penetracin variable a nivel del sistema central, aunque mejora cuando las meninges estn inflamadas. Sin embargo, no se recomienda como tratamiento nico para las meningitis bacterianas. Se puede administrar en forma intratecal en caso de ser necesario. La penetracin sea es similar en ambos compuestos (15% a 20%) pero los niveles de teicoplanina alcanzados en hueso son superiores a los de vancomicina. En las infecciones osteoarticulares que requieran tratamiento prolongado es preferible utilizar teicoplanina debido tambin a su menor toxicidad. Ambos glicopptidos se eliminan por va renal, por lo que debe ajustarse la dosis en el caso de insuficiencia renal. Efectos colaterales: la infusin rpida de vancomicina puede dar lugar a una reaccin caracterizada por eritema y prurito en cuello y parte alta del tronco. Esto puede evitarse administrando la droga por perfusin lenta. La aparicin de flebitis es frecuente cuando se administra por va perifrica. La nefrotoxidad de la vancomicina ha disminudo debido al uso de preparados ms purificados y a la monitorizacin del tratamiento. La vancomicina puede producir trombopenia o neutropenia que desaparece al suspender el tratamiento. La teicoplanina tiene efectos colaterales similares a la vancomicina pero de frecuencia mucho menor. Indicaciones clnicas: los glicopptidos deben ser frmacos de uso restringido, reservados para el mbito hospitalario. Se usarn en caso de sospecha o confirmacin de infecciones causadas por los grmenes multirresistentes antes mencionados.
Aminoglucsidos
Definicin: est definida por la presencia de dos o ms aminoazcares unidos por enlaces glucosdicos a un anillo aminociclitol. Segn los aminoazcares se clasifican en familias (ver tabla 4). En nuestro pas los aminoglucsidos disponibles son: gentamicina, amikacina y estreptomicina para uso parenteral. La tobramicina se encuentra disponible en presentacin para uso oftalmolgico. La espectinomicina no tiene aminoazcares, y a pesar de ser considerada muchas veces en el grupo, no es un verdadero aminoglucsido. Son altamente polares, policationes solubles en agua y generalmente estables al calor y cambios de pH entre 5 y 8. Espectro de accin: los aminoglucsidos generalmente son activos frente a los estafilococos, si bien Staphylococcus aureus y los estafilococos coagulasa negativos resistentes a la meticilina tambin lo suelen ser a los aminoglucsidos. Los enterococos son moderadamente resistentes a la gentamicina y la estreptomicina. La combinacin con penicilina, ampicilina o un glicopptido acta de forma sinrgica, excepto cuando las cepas son altamente resistentes a los aminoglucsidos. Los aminoglucsidos son activos frente a la mayora de especies de
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Tabla 3.
Familia Estreptomicina Kanamicina Miembros Estreptomicina Kanamicina Amicacina Tobramicina Gentamicina Neomicina Dibekacina Gentamicina Netilmicina Neomicina
Enterobacteriaceae y Pseudomonadaceae. La gentamicina, la tobramicina, la amikacina y la netilmicina tienen una actividad similar, con excepciones: la tobramicina es ms activa frente a P . aeruginosa, la gentamicina lo es frente a especies de Serratia y la netilmicina muestra menos actividad frente a P . aeruginosa. Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas maltophilia suelen ser resistentes a los aminoglucsidos. Los aminoglucsidos son inactivos frente a las bacterias anaerobias. Mecanismo de accin: los aminoglucsidos se unen de forma irreversible a la subunidad 30S del ribosoma, interfiriendo la lectura correcta del cdigo gentico con el consiguiente bloqueo de la sntesis proteica de la bacteria. La incorporacin de los aminoglucsidos en el interior de la bacteria, especialmente en los cocos grampositivos, es mayor al coadministrarse con antibiticos que inhiben la sntesis de la pared bacteriana, como son los betalactmicos y los glicopptidos. A pesar de los avances en el conocimiento de la forma de actuar de estos antibiticos, el mecanismo ltimo de la muerte de la bacteria (efecto bactericida) se desconoce, ya que no puede explicarse por la simple inhibicin de la sntesis de las protenas. Puede que el prolongado efecto postantibitico que presentan los aminoglucsidos refuerce su capacidad bactericida. Farmacocintica y farmacodinamia: la farmacocintica de los aminoglucsidos se caracteriza por su variabilidad entre un paciente y otro. Todos los aminoglucsidos comparten unos aspectos farmacocinticos similares, excepto en la dosis (la de amikacina es cuatro veces superior a la de gentamicina, tobramicina y netilmicina). Los aminoglucsidos presentan una escasa absorcin oral y necesitan administrarse por va parenteral. En general, los aminoglucsidos se administran por va intravenosa en perfusin durante 30 minutos. Cuando se emplea la va intramuscular, la concentracin plasmtica mxima tarda ms tiempo en alcanzarse y depende de la zona de inyeccin. Los aminoglucsidos en aerosol llegan mnimamente al torrente circulatorio. Los aminoglucsidos se distribuyen en el volumen extracelular. La alteracin del mismo, como sucede en caso de insuficiencia cardaca, ascitis, quemados o insuficiencia renal, obliga a modificar la dosis. La unin de los aminoglucsidos a las protenas plasmticas es escasa, por lo que su concentracin en los lquidos intersticiales se aproxima a la plasmtica. La vida media es de aproximadamente dos horas, pero puede sobrepasar las 24 horas en caso de alteracin de la funcin renal. Los aminoglucsidos son filtrados durante la hemodilisis, especialmente con los nuevos aparatos, por lo cual se deben administrar despus de la sesin de dilisis. Debido a su estructura polar, los aminoglucsidos penetran en pequea cantidad en el interior de las clulas, excepto en las del tbulo proximal renal, donde estos antibiticos alcanzan una concentracin superior a la plasmtica. Los amino-
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glucsidos atraviesan escasamente la barrera hematoenceflica. Las concentraciones en las secreciones bronquiales tras su administracin parenteral son bajas. La concentracin en el humor acuoso es similar a la plasmtica, si bien en el humor vtreo es menor, por lo que en el tratamiento de la vitritis por bacilos gramnegativos se recomienda la administracin intravtrea del aminoglucsido. Las concentraciones logradas en la bilis y la prstata son inferiores a la plasmtica. Las concentraciones alcanzadas en el hueso, el lquido sinovial y el lquido peritoneal son satisfactorias, pero en los lquidos purulentos son bajas, como consecuencia de la acidosis y la anaerobiosis local. Los aminoglucsidos se excretan sin metabolizar fundamentalmente por va renal (por filtrado glomerular), y en mnimas cantidades por la bilis. Tras la filtracin, estos frmacos se reabsorben en pequea cantidad en el tbulo proximal de la corteza renal, concentrndose en las clulas tubulares (la gentamicina en mayor medida que la amikacina y la tobramicina). La concentracin alcanzada en orina es 25 a 100 veces superior a la plasmtica y puede detectarse hasta semanas despus de completar el tratamiento. El efecto antibacteriano de los aminoglucsidos depende de la concentracin alcanzada, puesto que la capacidad bactericida est en relacin con la concentracin plasmtica, o lo que es lo mismo, a mayor concentracin, mayor poder bactericida. En este caso, el tiempo de exposicin de la bacteria al antibitico es poco importante para la muerte del microorganismo. La concentracin plasmtica mxima ptima necesaria para conseguir una actividad bactericida sobre los microorganismos debe ser al menos diez veces superior a la CIM, si bien otros autores prefieren emplear como parmetro farmacodinmico para explicar la actividad antibacteriana, el cociente del rea bajo la curva y la CIM. El efecto postantibitico consiste en la capacidad que tienen ciertos antibiticos, como los betalactmicos y los aminoglucsidos, de parar el crecimiento bacteriano despus de caer la concentracin srica del antibitico por debajo de la CIM. El efecto postantibitico de los aminoglucsidos ocurre tanto para los cocos grampositivos como para los bacilos gramnegativos y depende de los microorganismos, de la concentracin y de la duracin de la exposicin al aminoglucsido. Para los bacilos gramnegativos el efecto postantibitico oscila entre dos y cuatro horas, siendo ms prolongado in vivo que in vitro. Estas dos propiedades farmacodinmicas son las que permiten administrar el aminoglucsido a dosis elevadas e intervalos prolongados sin alterar su eficacia antibacteriana, y constituyen el sustento sobre el que se basa la administracin de los aminoglucsidos en una dosis nica diaria. Efectos adversos: los aminoglucsidos pueden causar nefrotoxicidad, ototoxicidad y bloqueo neuromuscular, y en menor medida exantemas cutneos, fiebre por antibiticos, depresin medular, anemia hemoltica y antagonismo del factor V de la coagulacin. La toxicidad renal ocurre en un 5% a 25% de los pacientes tratados con la pauta convencional. Todos los aminoglucsidos inducen nefrotoxicidad; el que ms la produce es la neomicina y el que menos la estreptomicina. En algunos estudios la tobramicina y la netilmicina se comportan con menos nefrotoxicidad respecto a la gentamicina, nunca con una diferencia clnicamente significativa. La nefrotoxicidad se debe a la inhibicin de las fosfolipasas de los lisosomas del tbulo proximal, lo que ocasiona una fosfolipoidosis con posterior disfuncin celular, necrosis y prdida de las enzimas epiteliales. La nefrotoxicidad aparece a los varios das de tratamiento y consiste en una disminucin del filtrado glomerular, cursando como fallo renal no oligrico leve a moderado y en ocasiones grave. Generalmente es reversible, si bien es la primera causa de morbilidad de los aminoglucsidos, con una prolongacin de la estancia hospitalaria y un aumento del coste del tratamiento. Los factores que contribuyen a la nefrotoxicidad son la hipotensin, la duracin prolongada del tratamiento, una enfermedad heptica asociada, concentraciones sricas elevadas y administracin conjunta de frmacos
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nefrotxicos, como glucopptidos, diurticos, amfotericina B y contrastes radiolgicos. La ototoxicidad es irreversible y puede afectar al nervio vestibular con alteraciones del equilibrio, sndrome vertiginoso y nistagmo, o al nervio auditivo con hipoacusia. La clnica de la ototoxicidad depende del aminoglucsido empleado: la gentamicina tiende a causar dao vestibular, la amikacina lesin auditiva y la tobramicina afecta a ambas estructuras de forma similar. La ototoxicidad se debe a la lenta eliminacin de los aminoglucsidos en el rgano de Corti coclear, puede ser unilateral o bilateral y puede suceder das o semanas despus de finalizar el tratamiento. La incidencia de ototoxicidad vara en los diferentes estudios (oscila entre el 3% y el 14%) debido a la dificultad para medirla. El bloqueo neuromuscular cursa con parlisis flcida, debilidad de la musculatura respiratoria y midriasis. Es una complicacin rara, pero supone un riesgo cuando la concentracin srica es muy elevada, como sucede tras la instilacin peritoneal o tras la administracin intravenosa rpida. Indicaciones clnicas: los aminoglucsidos son efectivos en el tratamiento de infecciones donde se sospecha la presencia de bacilos gramnegativos aerobios, incluyendo P . aeruginosa. En general este grupo de antibiticos se utiliza en combinacin con un betalactmico o un glicopptido ya que estas combinaciones son sinrgicas. Se ha demostrado en pacientes neutropnicos febriles falla teraputica con los aminoglucsidos en monoterapia, por lo cual se recomienda su uso combinado con betalactmicos o glicopptidos.
Macrlidos
Definicin: los macrlidos (eritromicina, claritromicina, azitromicina), las lincosaminas (lincomicina y clindamicina), los cetlidos y las estreptograminas son antibiticos que comparten un mecanismo de accin similar pero tienen estructura diferente (Ver figura 3). Nosotros nos centraremos exclusivamente a los macrlidos que son antibiticos semisintticos derivados de la eritromicina producida por Streptomyces eritreus. Clasificacin: los macrlidos se clasifican de acuerdo al nmero de carbonos: 14 carbonos (eritromicina y claritromicina), 15 carbonos (azitromicina) y 16 carbonos (espiramicina).
Figura 3.
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Mecanismo de accin: se unen a la subunidad 50S del ARN ribosmico en forma reversible. La unin se realiza mediante la formacin de puentes de hidrgeno entre diferentes radicales hidroxilo del macrlido y determinadas bases del ARNr. Esto provoca un bloqueo en las reacciones de transpeptidacin y traslocacin. Farmacocintica y farmacodinamia: el comportamiento farmacocintico es muy parecido entre los diferentes macrlidos. La eritromicina est disponible en preparaciones tpicas, intravenosas y por va oral. La claritromicina y azitromicina vienen en presentaciones va oral e intravenosa. La absorcin intestinal de eritromicina y azitromicina se ve disminuida en presencia de comida, por lo que su administracin debe ser alejada de las mismas. Con excepcin de azitromicina, todos se metabolizan en el hgado y sufren un efecto de primer paso que puede disminuir de manera significativa su biodisponibilidad. Los macrlidos con anillo de 14 tomos, pero no los de 15 y 16 tomos, emplean la va metablica del sistema enzimtico del citocromo P450, cuya actividad inhiben en mayor o menor grado. La vida media y el pico srico tienden a incrementarse si se administran dosis altas o mltiples, probablemente por saturacin del metabolismo heptico. Difunden a travs de la membrana debido a su carcter lipoflico y probablemente por la existencia de un transporte activo dependiente del calcio. La concentracin en el citoplasma celular es varias veces superior a la srica. Esto determina que no sean antibiticos adecuados cuando se sospecha una bacteriemia. La mayor parte del antibitico se acumula en los fagolisosomas debido al carcter cido de estos organelos. En medio cido el macrlido se ioniza (protonacin), la forma ionizada no difunde a travs de la membrana lipdica y queda atrapada en el fagolisosoma. La concentracin intracelular de azitromicina es particularmente elevada y persistente, en parte debido a que posee dos grupos bsicos en lugar de uno, como ocurre con el resto de macrlidos. Adems, a diferencia de otros macrlidos en los que la concentracin intracelular vara prcticamente de inmediato en relacin con las variaciones de concentracin extracelular, azitromicina mantiene concentraciones intracelulares elevadas durante ms de siete das despus de la ltima dosis, con una concentracin srica simultnea indetectable. Los macrlidos difunden escasamente a travs de las meninges, por lo cual no son adecuados para el tratamiento de meningitis. En general pasan a la saliva, a las secreciones bronquiales y a la leche materna, donde alcanzan concentraciones superiores al 50% de la srica, pero no difunden a los tejidos fetales. Se eliminan por va biliar en forma de metabolitos y de producto activo. La concentracin biliar es superior a la srica. No son adecuados para infecciones urinarias. Los macrlidos desarrollan una actividad antibacteriana lenta, predominantemente tiempo dependiente y con efecto EPA. La actividad se considera bacteriosttica frente a la mayora de microorganismos. Sin embargo, a concentraciones elevadas, en medio alcalino o frente a determinados microorganismos como S. pyogenes y S. pneumoniae, especialmente cuando se hallan en fase de crecimiento logartmico, pueden comportarse como bactericidas. Las CIM son sensiblemente inferiores a pH alcalino (=8) porque la forma no ionizada difunde mejor a travs de la membrana citoplasmtica. La adicin de suero reduce la CIM (aumenta la actividad) de algunos macrlidos, particularmente la de azitromicina y espiramicina y, en menor grado, la de claritromicina. Espectro de accin: la eritromicina presenta buena actividad sobre Streptococcus, Staphylococcus aureus, Corynebacterium spp., Listeria monocytogenes, Bordetella pertussis y Actinomyces. La claritromicina es ms activa que los dems macrlidos, mientras la azitromicina es menos activa sobre bacterias grampositivas. Claritromicina y azitromicina son activas adems sobre Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae. Los macrlidos tienen buena actividad sobre Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp. y ricketsias. Claritromicina y azitromicina tienen actividad sobre Mycobacterium avium.
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Efectos adversos: los efectos secundarios ms frecuentes de los macrlidos, y especialmente de eritromicina, son las molestias gastrointestinales (dolor abdominal, nuseas y vmitos) debidas a la actividad procintica de la misma eritromicina, y en especial de sus metabolitos formados en el medio cido del estmago. Se observan con mayor frecuencia en la poblacin menor de 40 aos, especialmente cuando el antibitico se administra por va intravenosa en perfusin rpida. La tolerancia digestiva del resto de macrlidos es superior a la de eritromicina. La administracin de eritromicina a recin nacidos puede producir estenosis hipertrfica del ploro (revierte al retirar la medicacin). Se han descrito casos de pancreatitis con el empleo de eritromicina y se ha sugerido una posible relacin con la produccin de un espasmo del esfnter de Oddi. Eritromicina por va intravenosa puede producir flebitis. Debe perfundirse a travs de una vena de gran calibre, lentamente (en 1 h) y diluda (250 ml de solucin salina). Una complicacin rara del uso de eritromicina es la hepatotoxicidad. Se observa en adultos, especialmente en la mujer embarazada y se manifiesta hacia la segunda semana de tratamiento en forma de hepatitis colestsica con fiebre, dolor abdominal, nuseas, vmitos y a veces eosinofilia. El cuadro cede al retirar el tratamiento. Puede presentarse con el empleo de cualquier formulacin de eritromicina, aunque parece ms frecuente con el estolato. Se ha observado ototoxicidad en forma de sordera y acufenos con el empleo de dosis altas de eritromicina, especialmente en la poblacin anciana o con insuficiencia renal o heptica, o con la administracin concomitante de otros frmacos potencialmente ototxicos. Se han descrito asimismo casos de ototoxicidad con el empleo de dosis altas de claritromicina y de azitromicina en el tratamiento de la infeccin por M. avium en pacientes con SIDA. Eritromicina (especialmente cuando se administra por va intravenosa) y en menor grado claritromicina, pueden ocasionar un alargamiento del intervalo QT. Indicaciones clnicas: los macrlidos estn indicados en pautas de tratamiento emprico de infecciones respiratorias y de piel y partes blandas adquiridas en la comunidad. En muchas de estas situaciones constituyen el tratamiento de eleccin como es el caso de la B. pertussis, mientras en otros casos constituyen el tratamiento de alternativa en pacientes alrgicos a la penicilina. Las recomendaciones para el tratamiento de la neumonia adquirida en la comunidad incluyen la claritromicina en el caso de neumonias que no requieren internacin, y la asociacin de un macrlido a un betalactmico en el caso de neumonias que requieren internacin con sospecha de grmenes atpicos. La claritromicina forma parte de los esquemas teraputicos de las infecciones por M. avium y Helicobacter pylori. La azitromicna en monodosis se ha mostrado eficaz en el tratamiento de la uretritis y cervicitis.
Quinolonas
Definicin: se trata de un grupo de antimicrobianos que derivan de una molcula bsica formada por una doble estructura de anillo que contiene un residuo N en la posicin 1. Diferentes sustituciones, incluyendo la inclusin de residuos de flor, han derivado desde el cido nalidxico hasta las quinolonas fluoradas. Las quinolonas son antibiticos bactericidas y actan inhibiendo la ADN girasa, enzima que cataliza el superenrollamiento del ADN cromosmico, que asegura una adecuada divisin celular. Clasificacin y espectro de actividad: al igual que las cefalosporinas, las quinolonas se clasifican en generaciones. Si se leen diferentes libros o artculos se encuentran clasificaciones diferentes. Nosotros adoptaremos la ms simple. Las quinolonas de primera generacin (cido nalidxico y cido pipemdico) tienen actividad sobre enterobacterias y son inactivas
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sobre grampositivos y anaerobios. Alcanzan concentraciones muy bajas en suero, su distribucin sistmica es baja y solo se usan para casos de infecciones urinarias bajas por su buena concentracin urinaria. Las de segunda generacin (norfloxacina y ciprofloxacina) son llamadas fluoradas, ya que incorporan un tomo de flor y presentan mucho mayor actividad sobre gramnegativos. La ciprofloxacina es la quinolona con mejor actividad sobre Pseudomonas aeruginosa. Tienen una moderada actividad sobre grampositivos, son activas sobre grmenes atpicos y no presentan actividad sobre anaerobios. En el caso de norfloxacina, las concentraciones en suero y tejidos son bajas, por lo que no se usa en infecciones sistmicas, siendo una buenea opcin en el caso de infecciones urinarias no complicadas. Las de tercera generacin (levofloxacina, gatifloxacina) retienen la actividad sobre gramnegativos y mejoran la actividad sobre grampositivos. Es importante su actividad sobre Streptococcus y especialmente sobre S. pneumoniae. Adems tienen una muy buena actividad sobre grmenes atpicos. Las de cuarta generacin (moxifloxacina, trovafloxacina) retienen actividad sobre gramnegativos y aumentan la actividad sobre grampositivos, especialmente S. aureus y Enterococcus. Adems agregan actividad sobre microorganismos anaerobios. Mecanismo de accin: las quinolonas interactan con dos sitios diferentes pero relacionados, dentro de la clula bacteriana: la ADN girasa y la topoisomerasa IV. La primera es ms sensible a la accin de las quinolonas en caso de grmenes gramnegativos, mientras en grampositivos la ms sensible es la topoisomerasa IV. Las quinolonas inhiben la sntesis de ADN y a concentraciones altas tambin la de ARN. Cuando interacciona con la ADN girasa, la inhibicin ocurre rpidamente, mientras que cuando interacciona con la topoisomera IV la inhibicin ocurre ms lentamente. Este efecto es debido a la habilidad de las quinolonas de estabilizar los complejos de ADN y topoisomeras II. Farmacocintica y farmacodinamia: las quinolonas son bien absorbidas luego de la administracin por va oral, mostrando una biodisponibilidad muy buena. Las concentraciones sricas alcanzadas con la administracin va oral son similares a las alcanzadas por va intravenosa. La comida no afecta la absorcin. Sin embargo, pueden interaccionar con cationes (calcio, aluminio, magnesio, etc.), lo que disminuye significativamente la absorcin. Las concentraciones sricas mximas son bajas en el caso del cido nalidxico, pipemdico y norfloxacina. La unin a protenas plasmticas es baja y la vida media plasmtica vara de 1,5 a 16 horas. La ciprofloxacina y quinolonas de tercera y cuarta generaciones se distribuyen ampliamente por el organismo, siendo el volumen de distribucin alto, lo que supone que alcanzan concentraciones intracelulares altas. Su concentracin en tejido prosttico, bilis, pulmn, rin y neutrfilos es superior a la srica. La eliminacin es mayoritariamente renal en cido pipemdico y levofloxacina, otras tienen eliminacin no renal (moxifloxacina) y otras presentan eliminacin por ambas vas (ciprofloxacina y norfloxacina). Las quinolonas exhiben actividad bactericida concentracin dependiente. El cociente entre concentracin inhibitoria mxima y CIM debe ser mayor a 10 para obtener la mayor eficacia clnica y evitar la aparicin de mutantes resistentes. Otro parmetro farmacodinmico utilizado es el rea bajo la curva sobre la CIM, que debe ser mayor a 125. Efectos adversos: los ms frecuentes son los gastrointestinales, que incluyen nuseas, anorexia, vmitos y dolor abdominal. Se han reportado en segundo lugar alteraciones a nivel del sistema nervioso central como cefaleas, insomnio y alteraciones del humor. Artropata y erosiones de los cartlagos en animales jvenes han determinado su uso restringido en nios.
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Sin embargo, se han utilizado en nios con fibrosis qustica donde raramente se han observado estos efectos, y cuando se han observado han sido reversibles. Otros efectos son mucho menos frecuentes. No ha sido establecido el uso seguro de las quinolonas durante el embarazo. No deben ser utilizadas durante la lactancia. Indicaciones clnicas: es importante que al utilizar una quinolona se recuerde que existe una relacin inversa entre la concentracin de quinolona y la seleccin de mutantes resistentes, por lo que al usar este tipo de antibiticos no se debera infradosificar para evitar la seleccin de resistencia. Infecciones urinarias: se utilizan para el tratamiento de las infecciones urinarias tanto bajas como altas. En las cistitis se utilizan quinolonas de primera generacin o norfloxacina. La ciprofloxacina o levofloxacina se reservan para el tratamiento de pielonefritis. Las fluorquinolonas se concentran en tejido prosttico, por lo cual son de eleccin en el tratamiento de las prostatitis. Enfermedades de transmisin sexual: la ciprofloxacina en monodosis es una opcin en el tratamiento de infecciones por Neisseria gonorrhoeae, pero no se ha mostrado eficaz en el tratamiento de infecciones por C. trachomatis, para las cuales se necesitan tratamientos de siete das. Enfermedades gastrointestinales: la ciprofloxacina tiene buena actividad sobre patgenos causantes de gastroenteritis (Salmonella, Shigella y otros), y en aquella minora de casos que requiere tratamiento se ha mostrado eficaz. Infecciones seas: las fluorquinolonas constituyen una opcin vlida en el tratamiento de las osteomielitis crnicas por su buena penetracin sea. En las causadas por S. aureus o P . aeruginosa puede aparecer resistencia intratratamiento, lo que lleva a la persistencia de la infeccin. Infecciones respiratorias: las quinolonas de tercera y cuarta generaciones son las que tienen buena actividad sobre S. pneumoniae y otros patgenos respiratorios de origen comunitario. Sin embargo, en nuestro pas su uso se desaconseja, ya que existen otras opciones antes de recurrir a estos frmacos caros y con un espectro tan amplio.
Bibliografa
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Principales mecanismos de resistencia antibitica

R. Vignoli, V. Seija
La resistencia bacteriana a los antibiticos es un tema amplio, que puede ser considerado desde distintos ngulos. Queremos resaltar tres perspectivas fundamentales, pues consideramos que el futuro mdico debe saber en todo momento a que nos estamos refiriendo en cada uno de ellos, para darle la interpretacin correcta a la informacin que habitualmente le llega a las manos, ya sea a travs de las comunicaciones cientficas, como de los informes del laboratorio. De este modo podemos referirnos a mecanismos de resistencia individuales, resistencia poblacional y resitencia poblacional en microorganismos que estn produciendo una infeccin. Resistencia individual: se refiere a la interaccin molecular entre una clula bacteriana con todo su arsenal gentico y metablico, y un antibitico determinado. Se estudian aqu las distintas herramientas con que cuenta una bacteria para evitar la accin del antibitico en cuestin. Al referirnos a arsenal gentico y metablico queremos sealar que no siempre es suficiente con que el microorganismo posea un gen que codifica un mecanismo de resistencia en particular. Ese gen o esos genes deben ser expresados en cantidad y calidad suficiente, y muchas veces deben interactuar distintos mecanismos de resistencia para alcanzar la sobrevida bacteriana. Como ejemplo se puede destacar la expresin en E. coli de su betalactamasa de clase C (tipo Amp-C). El gen que codifica para esta enzima capaz de romper distintos antibiticos betalactmicos (ver ms adelante) se encuentra naturalmente codificado en el cromosoma de dicha bacteria, sin embargo la expresin de esta enzima es mnima debido a que este microorganismo carece del promotor natural (Amp-R ). De este modo, si bien E. coli posee un gen capaz de producir un efectivo mecanismo de resistencia, su escasa expresin (asociada a la accin residual de algn promotor que se encuentre corriente arriba en el cromosoma bacteriano) hace que el microorganismo pueda comportarse como sensible a ampicilina. Resistencia poblacional: representa el comportamiento in vitro de un inculo bacteriano preestablecido (una poblacin bacteriana) enfrentado a determinada concentracin de un antibitico, por un perodo de tiempo determinado. Estos son los tipos de estudios que en general se realizan en el laboratorio clnico. Los resultados finales de estos estudios darn un informe de sensibilidad o resistencia, que son muy importantes para la orientacin teraputica del paciente, pero que no siempre coinciden con el xito teraputico. As, en un paciente que presenta una infeccin urinaria baja (cistitis) producida por una cepa de E. coli, en ocasiones puede obtenerse un tratamiento eficaz con ampicilina, pese a que los estudios in vitro muestran que es resistente a la misma. Esto es debido a que los betalactmicos se concentran
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ms de 100 veces en la vejiga que en el plasma, por lo que alcanzan niveles que exceden las posibilidades de resistencia bacteriana. En el otro extremo, un coco grampositivo como S. aureus o S. pneumoniae, que in vitro es sensible a eritromicina, no puede ser combatido con este antibitico si se encuentra produciendo una bacteriemia, debido a que los macrlidos alcanzan una concentracin plasmtica insuficiente. Resistencia poblacional en microorganismos que estn produciendo una infeccin: en este caso hablamos de eficacia teraputica y juegan otros factores, como el sitio de infeccin, las propiedades farmacocinticas del antibitico (donde se encuentran includas la dosis y el fraccionamiento diario del mismo), el estado inmunolgico del paciente, el tamao del inculo bacteriano, etc. La recuperacin del estado de salud del paciente, es el parmetro que determina la efectividad del tratamiento. Estos tres conceptos forman peldaos de una escalera que se debe transitar para alcanzar el objetivo final, que es la erradicacin de una enfermedad infecciosa de origen bacteriano, en un paciente en particular. Dado que los antibiticos van a actuar directamente sobre el microorganismo productor de la infeccin (y por defecto tambin contra la flora normal), parece lgico pretender que el estudiante de medicina deba entender las bases de la interaccin antibitico-microorganismo, para que ms adelante en la carrera pueda disear planes teraputicos con el menor costo posible. Solo por este captulo vamos a considerar que el nico costo en cuestin es la aparicin de resistencia bacteriana. Precisamente la interaccin antibitico-bacteria se refiere al juego entre los mecanismos de accin de los antibiticos y los mecanismos de resistencia bacterianos. El primer componente de este binomio ya fue analizado en el captulo 34, por lo que en esta instancia nos referiremos a los mecanismos de resistencia bacterianos a los antibiticos.
Tipos de resistencia
La resistencia antibitica puede ser natural (intrnseca) o adquirida. La resistencia natural es propia de cada familia, especie o grupo bacteriano. Por ejemplo, todos los grmenes gramnegativos son resistentes a la vancomicina, y esta situacin no es variable. La resistencia adquirida es variable y es adquirida por una cepa de una especie bacteriana. As, existen cepas de neumococo que han adquirido resistencia a la penicilina, cepas de Escherichia coli resistentes a la ampicilina, cepas de estafilococos resistentes a la meticilina. Esta resistencia adquirida es la que estudiamos en el laboratorio e informamos al clnico. La resistencia adquirida es la que puede llevar a un fracaso teraputico cuando se utiliza un antibitico supuestamente activo sobre el germen que produce la infeccin.
Gentica de la resistencia
Las bacterias son capaces de adquirir resistencia en funcin de su variabilidad gentica. Nuevos mecanismos de resistencia pueden ser adquiridos mediante mutacin o mediante transferencia de material gentico entre clulas bacterianas de especies relacionadas o diferentes. Estos genes de resistencia pueden estar codificados en el material gentico cromosmico o extracromosmico (plsmidos). Tener presente estos elementos tiene implicancias epidemiolgicas e incluso en algunos casos teraputicas, como se ver ms adelante.
SISTEMATIZACIN
La gran mayora de los mecanismos de resistencia pueden agruparse en tres categoras.
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Inactivacin enzimtica: el principal mecanismo de inactivacin es la hidrlisis, como sucede con las betalactamasas y los betalactmicos, pero tambin pueden ocurrir modificaciones no hidrolticas tales como las acetilaciones, adenilaciones o fosforilaciones inactivantes de aminoglucsidos. Modificaciones en el sitio blanco: existen diversas estrategias para alcanzar este objetivo. Destacaremos algunas como ser: modificaciones en el gen que codifica el propio blanco del antibitico, como por ejemplo las alteraciones en las PBP de Streptococcus pneumoniae que confiere resistencia a penicilina e incluso a ceftriaxona; la adquisicin de genes que codifiquen para sustitutos de los blancos originales, como PBP2 en Staphylococcus spp. meticilinorresistentes o la dihidrofolato reductasa alternativa en las cepas resistentes a trimetoprim. Alteraciones de la permeabilidad: se pueden incluir aqu tres tipos. 1. Alteraciones de las membranas bacterianas: se ve fundamentalmente en gramnegativos, donde la membrana externa de la envoltura celular rica en lpidos es impermeable a las sustancias hidroflicas. De este modo dichas sustancias quedan confinadas a la penetracin a travs de protenas transmembrana con funcin de porinas. Existen algunas molculas de antibitico, como penicilina y vancomicina, que por su tamao son incapaces de pasar a travs de las porinas de bacilos gramnegativos. La disminucin de la expresin de dichas porinas puede disminuir el flujo de llegada del antibitico al espacio periplsmico. Se considera que en este caso los niveles de resistencia alcanzados no suelen ser suficientes como para conferir resistencia absoluta a un antibitico. La ocurrencia simultnea de este mecanismo unido a otro, por ejemplo hidrlisis enzimtica (an en niveles discretos), s puede conferir altos niveles de resistencia y ocasionar fallos teraputicos. 2. Alteraciones en la entrada de antibiticos dependiente de energa, como ocurre en la primera etapa de ingreso de los aminoglucsidos. (Ver ms adelante) 3. Aumento de la salida de antibiticos: la resistencia por eflujo es un mecanismo inespecfico, que afecta a diferentes grupos de antibiticos como betalactmicos, quinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol. En gramnegativos estos sistemas en general se encuentran constitudos por tres protenas: una de alto peso molecular asociada a la membrana citoplasmtica, una con funcin de fusin de ambas membranas y una porina asociada a la membrana externa. Dentro de los mltiples sistemas de eflujo, los ms conocidos son Mex AB-Opr M, Mex CD-Opr J y Mex EF-OprN. Siendo Mex A, Mex C y Mex E protenas homlogas de aproximadamente 110 kD asociadas a la membrana citoplasmtica; Mex B, Mex D y Mex F protenas de aproximadamente 40 kD, responsables de la fusin de ambas membranas y por ltimo Opr M, J y N porinas de membrana externa de aproximadamente 50 kD. Estos sistemas as constitudos exportan molculas desde el citoplasma hacia fuera de la membrana externa. En grampositivos se trata de una protena transmembrana con funcin ATPasa que acta como bomba de eflujo. A continuacin se considerarn los mecanismos de resistencia de los grupos de antibiticos ms utilizados a nivel clnico.
MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIBITICOS QUE ACTAN SOBRE LA PARED BACTERIANA
La pared bacteriana presenta la doble caracterstica de ser una estructura vital para los microorganismos que la poseen y exclusiva de estos. De manera que el diseo o hallazgo de molculas
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de antibiticos que actan a este nivel, constituye una herramienta poderosa y segura para el combate de las infecciones bacterianas. Su principal funcin es de proteccin osmtica, permitiendo la sobrevida bacteriana en diversas condiciones de osmolaridad, incluyendo los cambios bruscos de un medio a otro. Esta funcin se lleva a cabo merced al peptidoglicano, que acta como una armadura o malla envolviendo la bacteria, ofrecindole rigidez y estabilidad. Sin embargo, para entender tanto el mecanismo de accin de los betalactmicos como sus mecanismos de resistencia, es necesario considerar no solo la estructura del peptidoglicn, sino tambin todo el mecanismo biosinttico del mismo, el cual se encuentra acoplado al crecimiento bacteriano y a la regulacin de diversos mecanismos de resistencia. Peptidoglican o murena Estructura: el peptidoglicn se puede dividir en dos regiones. 1. Un polmero de aminoazcares orientado en sentido transversal, compuesto por la unin cclica y repetitiva de un dmero de N acetilglucosamina (NacGlc) y cido N acetilmurmico (NacMur), mediado por uniones 1-4. 2. Una fraccin peptdica que est formada por un pentapptido que se encuentra unido covalentemente a la molcula del NacMur y que clsicamente se constituye por L-alanina (Lala)-D-glutmico-(Dglu) Ac mesodi aminopimlico(mDAP) (en bacilos gramnegativos) o L- Lysina(L-Lys) en grampositivos y un dipptido terminal D alanil-D-alanina (Dala-Dala). La estructura compuesta como NacGlc-NacMur pentapptido constituye el peptidoglicn precursor. (Figura 1) Entre las unidades peptdicas se produce el entrecruzamiento longitudinal que le otorga funcionalidad al polmero. Este entrecruzamiento se da de modo tal, que en bacilos gramnegativos se realiza mayoritariamente entre la Dala ubicada en la posicin cuatro y el mDAP . Mientras que los grampositivos utilizan un pentapptido de glicina, para unir Dala a Lys. Este entrecruzamiento tridimencional, le da la rigidez a la molcula de peptidoglicn, le permite
Figura 1. Esquema de los Componentes del Peptidoglican

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cumplir con sus funciones principales (mantenimiento de la presin osmtica, determinacin de la forma bacteriana y participacin en la elongacin y divisin celular). Biosntesis: la sntesis de esta estructura, se puede dividir en tres grandes pasos. 1. Intracitoplasmtico, dependiente de ATP donde se constituye el precursor NacGlc- NacMur pentapptido unido a UDP (uridin di fosfato). 2. La segunda etapa es intramembranal y consiste en la unin mediante un enlace de pirofosfato del precursor, a un lpido transportador (bactoprenol) y la transposicin hacia el espacio periplsmico. 3. La tercer y ltima etapa es periplsmica y consiste bsicamente en dos pasos, la elongacin del peptidoglicn preexistente y el entrecruzamiento de las cadenas peptdicas. Etapa citoplasmtica: una vez sintetizado el UDP-Nac-Mur como producto derivado de la reduccin del UDP-Nac-Glc, comienza la fase del ensamblaje del componente peptdico. Esto se produce mediante uniones secuenciales y consecutivas, mediadas por ligasas, que van agregando la L-alanina, luego el D-glutmico y como tercer paso el cido mesodiaminopimlico o la L-lisina respectivamente, si se trata de gramnegativos o grampositivos (figura 2). El ltimo dipptido (D-alanil-D-alanina) se introduce ya preformado. Si bien esto parece un detalle insignificante, es este dipptido el que interacta con las transpeptidasas o protenas de unin a penicilina (PBP) permitiendo el entrecruzamiento del peptidoglicn, es la estructura que simulan los betalactmicos para ejercer su efecto y es el sitio blanco de accin de los glicopptidos, como vancomicina. (Ver figura 2) El ingreso de alanina a la clula bacteriana se produce a travs de porinas especficas para dicho aminocido, que permiten el ingreso tanto de las formas D como L alanina. Una vez
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en el interior de la clula, una racemasa, convierte parte de las formas L en D, y finalmente una ligasa especfica produce los dipptidos D-ala-D-ala que completan el pentapptido. Este compuesto (UDP-Nac-Mur-pentapptido) que es hidrosoluble, se une a la cara interna de la membrana citoplasmtica, y mediante una unin dependiente de energa mediada por una translocasa I, se relaciona al lpido transportador denominado bactoprenol, dando comienzo a la etapa transmembrana (figura 3). Etapa transmembrana: de esta manera se genera el lpido I (que es la unin del bactoprenol a travs de un enlace de pirofosfato al Nac-Mur-penta). Con esta unin se consigue enmascarar la hidrosolubilidad del peptidoglicn, de manera que pueda atravesar la bicapa lipdica. La translocasa II es responsable del agregado del Nac-Glc, constituyndose as el lpido II (figura 3). La trasposicin del lpido II ocurre entonces de un modo an no dilucidado, promoviendo la colocacin del precursor del peptidoglicano, ahora asomando hacia el espacio periplsmico. Etapa periplsmica: fundamentalmente se producen tres pasos, la transglicosilacin, la separacin del lpido transportador y el entrecruzamiento peptdico (transpeptidacin). La
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primera y la ltima la realizan enzimas con actividad transglicosilasa y transpeptidasa (ms conocidas como PBP de Penicilin Binding Protein), que se encuentran ubicadas en la membrana citoplasmtica con su sitio activo hacia el espacio periplsmico. Las principales PBP denominadas en general PBP I, II y III (debido a que son las de mayor peso molecular), tienen en sus extremos carboxi y amino terminal las funciones transpeptidasas y transglicosilasas. Sin embargo, solo la funcin de transpeptidasa es inhibible por betalactmicos. La separacin del lpido II se produce por accin de una pirofosfatasa que rompe el enlace pirofosfato, dejando al bactoprenol libre para comenzar otra vez el ciclo (figura 3). Las transpeptidasas reconocen la estructura estereoqumica del dipptido Dala-Dala, y mediante clivaje de la ltima alanina liberan la energa necesaria para realizar el entrecruzamiento con el mDAP en gramnegativos o el puente peptdico intermediario de los grampositivos. La regulacin de este mecanismo de sntesis es de modo tal, que la inhibicin de la transpeptidacin inhibe todo el mecanismo de sntesis de pared.
MECANISMOS DE RESISTENCIA A BETALACTMICOS
Los tres grandes mecanismos ya descritos pueden ponerse en juego; trastornos en la permeabilidad, alteracin del sitio blanco de accin e hidrlisis enzimtica. Los trastornos de permeabilidad se corresponden fundamentalmente con la disminucin de la expresin de porinas. Como ya se ha dicho, no es un mecanismo que por s mismo promueva altos niveles de resistencia, pero puede ser muy importante en conjuncin con distintos tipos de betalactamasas. Modificacin del sitio blanco de accin: como ya fue dicho, el sitio blanco de los betalactmicos son las diferentes PBP . La informacin gentica de estas protenas se encuentra codificada en el genoma bacteriano y no en plsmidos. Sin embargo, elementos que regulan la expresin de esos genes s puede ser codificada en un plsmido. Pueden distinguirse distintas alternativas para que se produzca una PBP que presente menor afinidad por los antibiticos. La expresin de un gen alternativo, que codifique una PBP bsicamente distinta a la existente, es el caso de S. aureus meticilinorresistente, donde la expresin del gen mecA produce una PBP alternativa PBP2 que es menos afin a la totalidad de los betalactmicos. Con esto se quiere decir que la expresin del gen mecA genera la resistencia a la totalidad de los betalactmicos, independientemente de los resultados in vitro. Este sera el tpico caso donde la regulacin es mediada por plsmidos. Formacin de genes mosaico, por incorporacin de fragmentos de material gentico de otro microorganismo: este proceso generado por transformacin y recombinacin homloga, genera genes en parches, cuya secuencia queda constituda en parte por la informacin preexistente, y en parte por la recientemente adquirida. Ejemplos de esto son algunas de las PBP de S. pneumoniae resistente a penicilina y las PBP modificadas de Neisseria gonorrhoeae, donde se han detectado fragmentos con secuencias de alta homologa con las PBP de N. lactmica. Hidrlisis enzimtica: este mecanismo implica la inactivacin de los betalactmicos como consecuencia de la accin de enzimas que reciben el nombre de betalactamasas, y es el principal mecanismo de resistencia a betalactmicos. Estas enzimas son un claro ejemplo de la plasticidad de la gentica bacteriana. Probablemente originadas de un reducido grupo de enzimas cromosmicas, constituyen hoy una familia de protenas de gran disimilitud, que ha requerido numerosas clasificaciones con el intento de poderlas agrupar. Las evidencias disponibles tienden a asignarle en un comienzo, alguna funcin particular en la sntesis de pared, sobre todo en bacterias gramnegativas. Estas hiptesis surgen de experimentos realizados en Salmonella, la cual no codifica en su cromosoma betalactamasas de clase C. Cuando se
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introduce en una Salmonella un plsmido que codifica una betalactamasa de clase C (tpicamente cromosmica), se observan en el microorganismo alteracines morfolgicas, retardo en la velocidad de crecimiento y disminucin de su virulencia. Estas enzimas destruyen por hidrlisis, penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. La mayora de estas enzimas actan a travs de la formacin de un complejo acilpenicilina (merced a la presencia de una serina en la posicin 70) que se hidroliza rpidamente, regenerando la enzima. Estas enzimas forman parte de un amplio grupo de protenas denominadas serinproteasas.
Clasificacin de las betalactamasas

Basndose en datos de secuencia parcial del ADN de las betalactamasas, Ambler en 1980 propone clasificarlas en cuatro clases: A, B, C y D. Las enzimas de clase A, cuyo prototipo es la enzima TEM-1, (actualmente presente en ms del 50% de los aislamientos de enterobacterias en general), estn codificadas en plsmidos y su peso molecular oscila entre 25 y 30 kD, al igual que las de clase B y D. Las enzimas de clase C, estn generalmente codificadas en el cromosoma bacteriano y son tpicamente inducibles por betalactmicos. Se trata de protenas que presentan unos 100 aminocidos ms que la de los otros grupos, por lo que su peso molecular suele rondar los 40 kD o ms. En algunas especies, la regin reguladora del gen ha desaparecido, y en consecuencia la enzima se expresa constitutivamente. Las enzimas de clase B requieren zinc para su actividad y son consideradas por ello metalo betalactamasas. En general son plasmdicas, inhibibles por EDTA, incluyndose aqu las enzimas que confieren resistencia a los carbapenemes. Las enzimas de clase D constituyen un grupo reducido de enzimas plasmdicas, con actividad incrementada sobre oxacilina (OXA-1), inhibibles por iones cloruros y de forma variable por inhibidores del tipo cido clavulnico o sulbactam. Estas enzimas, al igual que lo observado en las enzimas de clase A, han ampliado su espectro de accin mediado por mutaciones puntuales a partir de enzimas con actividad reducida a penicilinas como es el caso de las OXA derivadas. En 1995 Bush, Jacob y Medeiros proponen una clasificacin funcional para las betalactamasas. Esta se basa en el peso molecular de la enzima, su punto isoelctrico (pI), el perfil de sustrato y la propiedad de ser inhibidas por la presencia de cido clavulnico o EDTA. En base a este esquema surgen cuatro grupos funcionales que se correlacionan bien con la clasificacin de Ambler, denominndose: 1, 2, 3 y 4. Las del grupo 1 corresponden a enzimas con accin cefalosporinasa, no inhibibles ni por cido clavulnico ni por EDTA, y que se correlacionan con las enzimas cromosmicas de bacilos gramnegativos de tipo AmpC. Las del grupo 2 estn constitudas por penicilinasas y cefalosporinasas inhibibles por cido clavulnico, y coinciden mayoritariamente con el tipo A de Ambler. Las del grupo 3 son inhibibles por EDTA pero no por cido clavulnico, se corresponden con las metaloenzimas de tipo B. Por ltimo, un grupo poco importante no descrito por Ambler, las del grupo 4, que incluye penicilinasas no inhibibles por cido clavulnico encontradas en Pseudomonas cepacia. Las betalactamasas son protenas globulares que presentan una masa 100 veces superior a su substrato. En este contexto, una vez que el antibitico ingresa al sitio activo, son muchas las interacciones qumicas que se producen entre ambas molculas. As, en las serin betalactamasas, el oxgeno con carga negativa del grupo carbonilo de los betalactmicos es atacado por los grupos amino (de carga positiva) de la serina 70 y una alanina que se encuentra
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Figura 4. Esquematizacin de Funcionamiento de las Serin -lactamasas. Se esquematiza la interaccin -lactamasa- -lactmico. La enzima esta representada por los extremos amino de la alanina 273 y la serina 70, as como el grupo hidroxilo de esta ltima. La primera interaccin E S es todava reversible y se representa por K+1 y K-1. Una vez que se produce la acilacin representado por K+2 la reaccin es irreversible. Cuando la enzima es activa sobre el sustrato, la reaccin culmina con la deacilacin (k+3), con la consiguiente liberacin del antibitico hidrolizado y la recuperacin de la actividad enzimtica. Sin embargo cuando la enzima no es capaz de hidrolizar al sustrato, la reaccin se detiene a este nivel, producindose la inactivacin de la misma. Esto es lo que ocurre con los inhibidores del tipo del Sulbactam o cido clavulnico

prxima. Se forma as mediante un enlace covalente irreversible, un complejo acilpenicilina (acilacin). Estas interacciones generan un efecto de tensin sobre el grupo carbonilo, que tiende a romper el grupo amida del anillo betalactmico. La ntima proximidad que se genera entre el grupo hidroxilo de la serina 70 y el grupo amida del anillo culmina la accin, generando la hidrlisis del betalactmico. La presencia de una molcula de agua en el sitio activo de estas enzimas produce la liberacin del antibitico (deacilacin), devolviendo la actividad enzimtica (figura 4).
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METALO BETALACTAMASAS (DE CLASE B)
Se trata de una familia de enzimas de gran diversidad gentica, con porcentajes de identidad de secuencia de entre el 20% y 40%. Sin embargo, se encuentra un motivo conservado dado por cuatro residuos de histidina (H), una aspargina (D) y una cistena (C), que se ubican segn una secuencia consenso HXHXD(X)55-74H(X)18-24C(X)37-41H, lo cual se corresponde a los ligandos con dos tomos de Zinc ++. El mecanismo de accin de estas enzimas difiere de las serin proteasas, ya que en este caso no se producen uniones covalentes entre la enzima y el sustrato. Aqu cada tomo de Zn++ acta polarizando distintas estructuras del anillo betalactmico. As el Zn++(1) acta polarizando el grupo carbonil de dicho anillo, produciendo un hueco oxianinico que favorece la hidrlisis. El Zn++(2) queda dispuesto prximo al N del anillo, lo que sugiere que interactuara con el grupo amida de modo de estabilizar el sustrato durante el ataque nucleoflico y favorecer luego el recambio de sustrato de la enzima. Desde el punto de vista mdico, existen dos aspectos importantes para clasificar las betalactamasas; ellos son la ubicacin de los genes (cromosmicos o plasmdicos) y el espectro de accin. En base a esta informacin se pueden realizar ciertas generalizaciones. Al referirnos a betalactamasas plasmdicas nos referiremos fundamentalmente a las de clase A, que son las serin enzimas que clsicamente se encuentran en plsmidos, mientras que las cromosmicas sern las de clase C. De todas maneras debe saberse que desde hace unos aos atrs no es infrecuente la deteccin de betalactamasas de clase C en plsmidos. Principales betalactamasas plasmdicas En los grampositivos son fundamentalmente penicilinasas, sin incluir accin sobre cefalosporinas. Las betalactamasas en bacilos gramnegativos, originalmente posean un espectro ms reducido de accin que las cromosmicas, pero eran ms eficaces. La presencia de una estructura a manera de compuerta (denominado bucle omega) relacionada con el ptimo enfrentamiento entre el anillo betalactmico y la molcula de agua ya mencionada, restringa a su vez la llegada al sitio activo de molculas ms grandes. Estas primeras enzimas denominadas betalactamasas de espectro ampliado (BLEA), tienen accin sobre penicilinas y cefalosporinas de primera generacin. El agregado de cadenas laterales grandes a nivel del carbono 7 del anillo cefalospornico, evita la entrada de estos antibiticos al sitio activo de las (BLEA) y define a las cefalosporinas de tercera generacin. Mutaciones generalmente en dos pasos, generaron la aparicin de betalactamasas de espectro expandido (BLEE), con accin sobre cefalosporinas de tercera generacin. (Ver figura 5) Para la generacin de una BLEE a partir de una BLEA, una primer mutacin implica la apertura del bucle omega, con la consiguiente prdida de la eficacia (disminucin de Vmax). Una segunda mutacin reajusta la molcula de agua al anillo betalactmico. La sustitucin de dos aminocidos es suficiente para producir estos cambios. Por lo dicho, las betalactamasas plasmdicas ofrecen al menos dos motivos de alerta: su fcil diseminacin inter e intraespecie, y su alta variabilidad con el consiguiente aumento del espectro de accin. La mayora de las transformaciones se dan a nivel intrahospitalario, donde las cepas pasan de paciente en paciente y las enzimas de germen en germen, hasta que las mutaciones ocurren. Otro elemento importante de las betalactamasas plasmdicas es su capacidad de interactuar con los inhibidores de betalactamasas tipo sulbactam. Estas molculas con anillo betalactmico pero casi sin actividad antibitica, tienen la capacidad de una vez acilados, interactuar con residuos enzimticos (arginina 244) que generan un total desenfoque entre la molcula de agua y el anillo betalactmico. El resultado es una actividad suicida donde se impide la
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Figura 5. Representacin esquemtica de la estructura de diferentes tipos de -lactamasas. A, B y C muestran una de las etapas evolutivas de una -lactamasa de clase A desde una BLEA a una BLEE en dos eventos de mutaciones puntuales. D: -lactamasa de clase C. La ausencia de bucle omega y de la estructura que contiene la arg 244, determinan su espectro de accin: cefalosporinasas no inhibibles por sulbactam, cido clavulnico o tazobactam.
A) BLEA B) Primer paso de mutacin.
ARG 244
ARG 244
Bucle omega
ARG 244
C) Segundo paso de mutacin. ( BLEE )
D) - Lactamasa de clase C
deacilacin. La estructura con la que actan los inhibidores no se encuentra presente en las betalactamasas cromosmicas. Betalactamasas cromosmicas: como ya se dijo no son inhibibles. La ausencia de bucle omega sella su perfil de actividad. No restringen la llegada de cefalosporinas, por lo tanto son cefalosporinasas, pero por la misma razn no son altamente eficientes. Confieren resistencia a cefalosporinas de segunda generacin, y dependiendo de su cantidad, tambin son capaces de conferir resistencia a cefalosporinas de tercera generacin. Su mecanismo de expresin est estrechamente relacionado a la sntesis y reciclaje del peptidoglicn, que acta a travs de un promotor que en condiciones normales se encuentra inhibido. La ausencia de dicho promotor, impide la expresin de la betalactamasa y es lo que sucede con E. coli, donde an teniendo el gen que la codifica, no es posible provocar su induccin. Resistencia a glicopptidos Se trata de mecanismos complejos que involucran por lo menos cinco genes, algunos de ellos sobrepuestos parcialmente. El efecto final es la sntesis de un peptidoglican que presenta un pentapptido que culmina en Dala-Dlactato (Dlac) o Dala-Dserina (Dser). Este producto no se une a vancomicina. Si bien las resistencias a vancomicina y teicoplanina pueden estar relacionadas, no se comprende tan bien la resistencia a este ltimo. Se describir por lo tanto la resistencia a vancomicina. Se trata de un mecanismo inducible, que requiere la presencia de este antibitico. Hasta el momento se conocen cinco fenotipos de resistencia, correspondientes a cinco
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grupos de genes distintos, denominados VanA a la E. Se explicar brevemente el funcionamiento del sisytema vanA, por ser el ms estudiado. Los otros fenotipos involucran algunas variantes menores. El mecanismo se pone en funcionamiento mediante un sistema de traduccin de seales de dos componentes: un pptido transmembrana denominado vanS y un segundo mensajero llamado vanR. vanS consiste en una histidinproteinquinasa, que contiene un residuo de histidina autofosforilable bajo un estmulo ambiental. No se sabe cual es el estmulo exacto, pero podra estar relacionado a la inactivacin de las transpeptidasas y transglicosilasas. Por lo tanto la vancomicina actuara de forma indirecta. Una vez fosforilada vanS, el grupo fosfato es traspasado a un residuo aspartato presente en vanR. VanR fosforilada posee un dominio de unin a ADN, donde acta como promotor del conjunto completo de genes del fenotipo VanA (figura 6). Adems de vanR y vanS, son necesarias tres protenas ms relacionadas con otros tantos genes. Estos son vanA, vanH y vanX. El gen vanA codifica una ligasa alternativa a la que normalmente genera el dipptido Dala-Dala. Esta nueva ligasa une Dala a un ligando inespecfico. Precisamente el gen vanH codifica una protena con actividad deshidrogenasa que suministra el ligando para vanA. VanH genera D lactato a partir de piruvato. Para que la sustitucin del dipptido sea efectiva, deben eliminarse los dipptidos Dala-Dala que continen formandose por va normal. VanX codifica una dd dipeptidasa que cliva los dipptidos Dala-Dala antes que se incorporen al precursor del peptidoglicn, pero no Dala-Dlactato. Estos cinco genes vanS, vanR, vanA, vanH y vanX, son imprescindibles para la produccin de la resistencia a vancomicina. Pueden encontrarse dos genes adicionales, vanY y vanZ. VanY codifica una ddcarboxipeptidasa que separa la ltima Dalanina del precursor ya formado, por lo que complementara la accin de vanX.
Figura 7. Organizacin de los genes responsables del genotipo Van A y funciones de las protenas correspondientes
?
VAN VAN S S VAN S
VAN R
P
dd dipeptidasa d- ala d-ala
van R
van S
van H
van A
van X
van Y
van Z
Ligasa Dala-- X
ddcarboxipeptidasa
Deshidrogenasa Piruvato - Lactato
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Por ltimo vanZ confiere resistencia a teicoplanina, por un mecanismo no dependiente de la modificacin del pentapptido, an desconocido. La codificacin de estos genes esta asociada a un trasposn, y se la encuentra tanto en el cromosoma como en plsmidos. Este tipo de resistencia se corresponde con cambios en el sitio blanco.
QUINOLONAS E INHIBICIN DE LA REPLICACIN DEL ADN
Mecanismo de resistencia: bsicamente son de dos tipos, por alteracin del sitio blanco y por alteracin de la permeabilidad. En los ltimos aos se ha descrito un mecanismo de resistencia plasmdico y trasmisible, que consiste en la accin de una protena producto del gen qnr, que actuara bloqueando el sitio blanco de accin. Las alteracines del sitio blanco se producen por mutacin espontnea a nivel cromosmico por alteracin de una de las subunidaddes de la enzima denominada A (la ADN girasa est constituda por dos subunidades A y dos subunidades B). Estas enzimas mutadas tienen menor afinidad por el antibitico. La aparicin de una mutacin puntual tiene una probabilidad de ocurrencia de 1x10-6 a 1x10-9 y es en s un fenmeno estocstico, independiente de la presencia de antibiticos. La presin de seleccin que ejercen estos, favorecen la diseminacin y prevalencia de aquellas cepas ms adaptadas a las condiciones que le impone el frmaco. Las alteraciones de premeabilidad incluyen la modificacin de expresin de porinas y un sistema de bombas de eflujo que promueve la excrecin del frmaco hacia el medio extracelular. Estas bombas descritas primero para grampositivos, tambin se hallan en gramnegativos asociadas a porinas de la membrana externa, lo que genera un canal directo entre el citoplasma y el exterior, evitando el espacio periplsmico. La energa de activacin depende de un contratransporte de protones, y como ya se ha dicho, constituyen un mecanismo inespecfico de multirresistencia, que incluye resistencia a tetraciclinas, eritromicina, cloranfenicol y quinolonas. Este sistema es habitualmente utilizado por las bactrerias para la exportacin de diversas sustancias como toxinas (por ejemplo hemolisinas) y siderforos.
AMINOGLUCSIDOS
Mecanismos de resistencia: los tres grandes mecanismos de resistencia ya nombrados son encontrados contra estos antibiticos. El ms importante es la inactivacin enzimtica, seguido por alteracin de la permeabilidad y lejos en tercer lugar, limitado a la estreptomicina y la espectinomicina, puede observarse una mutacin puntual en el sitio de accin de estos agentes, la protena de la subunidad 30s denominada protena S12. Inactivacin enzimtica: diversas enzimas pueden inactivar estos antibiticos por accin a distintos niveles. As, pueden acetilar, adenilar o fosforilar, por intermedio de acetiltransferasas, adeniltransferasas y fosfotransferasas. Estas enzimas tienen un perfil diferente de aminoglucsidos sobre los que actan, pero la presencia de ms de una enzima dificulta este anlisis, incluyendo la aparicin de enzimas bifuncionales como las presentes en enterococos que poseen actividad de acetil y fosforiltransferasas. Las enzimas pueden ser cromosmicas o plasmdicas y se expresan constitutivamente, independientemente de la presencia de antibitico. La inactivacion enzimtica se produce en el proceso de transporte del antibitico hacia el interior de la clula para alcanzar el ribosoma. La resistencia a cada aminoglucsido es el resultado del balance entre dos velocidades: la de captacin intracelular y la de inactivacin enzimtica. La velocidad de inactivacin depende de la afinidad de la enzima por el antibitico. La resistencia a los aminoglucsidos tiene una incidencia variable a nivel mundial, debido al predominio diferente de las enzimas inactivantes como consecuencia de la presin
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de seleccin ejercida por el uso de determinados aminoglucsidos. El predominio de enzimas que inactivan la estreptomicina y kanamicina ha llevado a desplazar el uso de estos frmacos. En general la mayor incidencia de resistencia se da en enterobacterias. Alteraciones de la permeabilidad: los aminoglucsidos entran a la clula bacteriana por un mecanismo complejo que implica la adherencia a molculas de carga negativa, como residuos del LPS, cabezas polares de fosfolpidos y protenas aninicas de membrana externa. Luego de esta adherencia por rearreglo del LPS se produce la entrada al espacio periplsmico del agente. Al llegar a la membrana citoplsmica se produce el ingreso al citoplasma, por un sistema de trasporte acoplado al gradiente protnico. Dicho gradiente depende de la actividad de las cadenas respiratorias aerobias, lo cual explica la inactividad de estos agentes frente a anaerobios. Precisamente las modificaciones de este gradiente electroqumico, dificultan la entrada del agente a la clula. Mutaciones cromosmicas espontneas, generan alteraciones de este potencial o de la cadena de electrones.
MACRLIDOS
Mecanismos de resistencia: bsicamente implican los grandes mecanismos ya mencionados. En bacilos gramnegativos donde el frmaco no es muy activo, se observan trastornos en la permeabilidad. El mecanismo de eflujo activo ya ha sido mencionado y es mediado por plsmidos. Dos tipos de alteraciones del sitio blanco pueden producir resistencia a macrlidos: a) mutaciones puntuales a nivel cromosmico de la protena L15; b) induccin de una enzima metilante que metila el ARNr 23s de la subunidad mayor, lo que altera la afinidad del receptor no solo por los macrlidos, sino tambin por lincomicinas y estreptograminas. Estos antibiticos son qumicamente diferentes pero comparten mecanismos de accin y de resistencia, as como cierto espectro de accin. Este mecanismo puede encontrarse asociado a plsmidos y trasposones. Por ltimo, se ha detectado inactivacin enzimtica por esterasas o fosfotransferasas fundamentalmente en enterobacterias, aunque se desconoce su importancia clnica.
Bibliografa
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Mtodos de estudio de la sensibilidad antibitica

R. Taroco, V. Seija, R. Vignoli
El estudio de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos es una de las funciones ms importantes de los laboratorios de microbiologa clnica. Dentro de los beneficios que presenta se encuentran: Dirigir la teraputica una vez que el germen es conocido Generar una base de datos que permita seleccionar los antibiticos a utilizar en un tratamiento emprico (aquel en que no conocemos el agente causal) Desarrollar polticas de uso de antimicrobianos Vigilar la aparicin de nuevos mecanismos de resistencia Detectar precozmente la diseminacin epidmica de una cepa, tanto a nivel hospitalario como comunitario Pero la determinacin de la sensibilidad a antimicrobianos no implica solo realizar un conjunto de tcnicas y medir los resultados. Es necesario saber interpretar los mismos y darles el significado que realmente tienen. Entre el mdico clnico que tiene en sus manos un paciente, y el microbilogo que entre las suyas tiene las placas con el microorganismo responsable de una infeccin, debe haber buena comunicacin, lo cual implica hablar el mismo idioma. Los parmetros que determinan los resultados de sensibilidad o resistencia, cada vez ms involucran informacin proveniente de ambos lados: el paciente y el microorganismo. En el captulo 34 se consideraron las caractersticas farmacocinticas y farmacodinmicas para los principales grupos de antibiticos, y en el 35, las diferentes estrategias bacterianas de supervivencia. En este captulo intentaremos desarrollar los diferentes mtodos de estudio y las bases de la interpretacin de los resultados obtenidos in vitro.
Clasificacin
Estos mtodos pueden clasificarse en mtodos cuantitativos y cualitativos. Mtodos cuantitativos son aquellos procedimientos que permiten determinar la concentracin inhibitoria mnima (CIM) y la concentracin bactericida mnima (CBM). Se define CIM como la mnima concentracin de antibitico que en un perodo de tiempo predeterminado, es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de un inculo bacteriano previamente estandarizado (concentracin conocida de grmenes). Se define como CBM la la mnima concentracin de un antibitico que en un perodo de tiempo predeterminado, es capaz de inducir la muerte in vitro del 99.9% de una poblacin bacteriana previamente
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estandarizada. La determinacin de la CIM puede realizarse por micro o macro dilucin en caldo, dilucin en agar o E-test (marca comercial). Mtodos cualitativos (disco difusin) son aquellos procedimientos que permiten clasificar directamente a un microorganismo como sensible o resistente. Este es uno de los mtodos ms utilizados en la prctica diaria y es el que los estudiantes podrn realizar durante el curso del CEFA.
Estandarizacin
Todos los mtodos de estudio por nosotros utilizados, estn estandarizados por el National Commitee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS), de manera que los resultados sean reproducibles y comparables. La realizacin de estos procedimientos requiere la utilizacin de cepas de control de calidad con resultados conocidos, de manera de saber si nuestra metodologa se realiz en forma correcta. Dentro de los parmetros a estandarizar se encuentran lo siguientes: a) El tipo de bacterias a estudiar, ya que no es lo mismo un microorganismo de crecimiento rpido que lento, exigente o no exigente, aerobio o anaerobio. Describiremos aqu los mtodos para el estudio de microorganismos no exigentes, de crecimiento rpido, capaces de crecer en aerobiosis. b) Los medios de cultivo para realizar las pruebas. De los medios disponibles se considera que tanto el agar como el caldo Mueller Hinton (MH) son los ms apropiados para las pruebas de sensibilidad de rutina dado que muestran buena reproducibilidad entre los diferentes lotes comerciales, son baratos, contienen bajo nivel de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclinas, son adecuados para la mayora de las bacterias patgenas en lo que a requerimientos nutricionales se refiere y existen suficientes datos recopilados que avalan su uso en las pruebas de sensibilidad. A pesar de estas cualidades, algunos parmetros del medio se deben controlar en cada lote de uso, como ser: pH: para cada lote debe ser controlado cuando se prepara el medio. El agar debe tener un pH 7,2-7,4 a temperatura ambiente. Si el pH es demasiado bajo ciertas drogas como aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos parecern menos activas, mientras otras como las tetraciclinas parecern tener mayor actividad. Si el pH es ms alto se podrn esperar los resultados opuestos. Humedad: si existe un exceso de humedad en la superficie del agar las placas deben ser incubadas a 35C durante 10 a 30 minutos antes de utilizarse. Las placas debern estar hmedas pero no mostrar gotas de agua en la superficie. Efecto de la timina o timidina: los medios que contienen un exceso de timina o timidina pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y triometoprim, produciendo alteraciones en las zonas de inhibicin del crecimiento bacteriano en la placa. Cantidad de cationes divalentes: la variacin de los cationes divalentes principalmente de Ca++ y Mg++, tambin afecta los resultados de antibiticos como tetraciclinas, aminoglucsidos, etc. El medio debe ser preparado segn las indicaciones del fabricante. Luego de preparado debe esterilizarse y cuando llega a una temperatura aproximada de 50 C debe ser repartido en las placas de Petri. El espesor del mismo debe oscilar entre 3 y 5 mm. Para esto se considera que aquellas placas de 150 mm de dimetro deben llevar 60 a 70 ml del medio, y las que
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tienen 100 mm de dimetro deben llevar 25 a 30 ml. Las placas que no se usan en el da pueden mantenerse en el refrigerador; aquellas con ms de siete das de preparacin no son adecuadas, salvo que sean envueltas en bolsas de plstico para evitar la desecacin, de lo contrario deben controlarse con los organismos de referencia. Debemos controlar la esterilidad de cada lote incubando al menos una de sus placas 24 hs o ms a 35C, verificando si hay o no crecimiento de algn microorganismo contaminante. c) El tiempo de incubacin: la mayora de los resultados deben leerse entre 18 y 20 horas, aunque para la lectura de la meticilinorresistencia en S. aureus debe incubarse 24 horas completas. d) La temperatura de incubacin, lo cual altera la velocidad de crecimiento bacteriano y su viabilidad. e) El estado de los antibiticos, su fecha de vencimiento si se trata de discos, o su potencia si se trata de antibitico como droga. Si bien estos parmetros pueden ser controlados fsicamente, es decir el operario puede controlar temperaturas, tiempos, estados de los medios, etc., los controles de calidad se realizan utilizando cepas conocidas. A continuacin destacaremos algunos de los mtodos antes mencionados.
Mtodo de disco difusin

Este es un mtodo cualitativo, que se caracteriza por ser fcilmente estandarizable y que est indicado para microorganismos no exigentes de crecimiento rpido. Partiendo de una muestra clnica siempre se debe realizar un cultivo puro para poder comenzar el estudio de la sensibilidad antibitica. Para esto se utiliza la tcnica de aislamiento en placas que contengan un medio adecuado para la cepa en estudio (al cual adems se le deben otorgar las condiciones atmosfricas especficas de esa cepa). El antibiograma por disco difusin basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores, es uno de los mtodos que el NCCLS recomienda para la determinacin de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos. Indicaciones: el antibiograma est indicado en las siguientes situaciones: Se asla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos ms habituales. En estudios epidemiolgicos, aunque hasta el momento no se halla descrito mecanismos de resistencia para dicho organismo. Cuando a pesar de conocerse la sensibilidad del germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin ( sensibilidad de S. pyogenes a eritromicina en pacientes alrgicos a la penicilina). En el estudio de nuevos antibiticos. Fundamento: el mtodo de disco difusin consiste en depositar en la superficie de una placa de agar MH previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel de filtro impregnados con los diferentes antibiticos. Tan pronto el disco impregnado en antibitico se pone en contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibitico difunde por el agar, formndose un gradiente de concentracin. Transcurridas 18 a 24 horas de incubacin, los discos pueden o no aparecer rodeados por una zona de inhibicin de crecimiento bacteriano. Materiales: suero fisiolgico estril o caldo de cultivo estril, hisopos estriles, pinzas estriles o dispensador, gradillas, descartador, ansa bacteriolgica, estufa de 35C.
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Discos de antibiticos: los discos deben mantenerse en el freezer o en el refrigerador para mantener la actividad del antibitico. Deben ser sacados una o dos horas antes de su uso. Debemos fijarnos siempre en la fecha de vencimiento antes de usarlos. Patrn de turbidez: para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de bario como estndar de turbidez que corresponde a un 0,5 del nefelmetro de Mc Farland. La densidad se corrobora con un espectrofotmetro. Luego de preparado el patrn de turbidez se distribuye en tubos de ensayo (4 a 6 ml por cada tubo). Estos deben ser guardados a temperatura ambiente y protegidos de la luz. Esta turbidez corresponde a 1.5 x 108 UFC/ml. Medio: placas de agar MH. Procedimiento (como preparar el inculo): existen dos formas bsicamente de como preparar el inculo. 1. Mtodo del medio de cultivo lquido o de Kirby-Bauer: con un asa bacteriolgica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo tipo morfolgico y se inocula en 4 a 5 ml de caldo apropiado, como caldo MH. Los cultivos de caldo se dejan incubar a 35C hasta que aparece una turbidez ligeramente visible (generalmente 2 a 5 hs). La turbidez se ajusta con suero fisiolgico estril o caldo para obtener una turbidez visualmente comparable a la de un estndar preparado previamente (llamado 0.5 de Mc Farland). Este estndar debe agitarse antes de usar y ser comparado en forma visual con el inculo preparado. Para ello se miran ambos tubos al mismo tiempo contra un fondo blanco con una lnea negra como contraste Este mtodo es recomendado cuando el cultivo tiene ms de 24 hs de incubacin. 2. Mtodo de suspensin directa de colonias o Kirby-Bauer modificado: se colocan entre 4 y 5 ml de suero fisiolgico estril en un tubo de ensayo. Se toma con un asa bacteriolgica tres o cuatro colonias morfolgicamente similares y se suspenden en el tubo hasta alcanzar una turbidez comparable a la solucin de Mc Farland 0.5. Luego de preparado el inculo bacteriano con la cepa en estudio se deben seguir los siguientes pasos: Introducir el hisopo estril en el inculo bacteriano preparado, de manera de embeberlo completamente. Antes de retirarlo se debe escurrir sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de lquido del mismo. Sembrar la placa de MH de manera de obtener un crecimiento confluente, para lo cual se estra con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repite el procedimiento rotando la placa 60 en dos oportunidades ms. Deben extremarse los cuidados en sembrar las placas de borde a borde, porque de lo contrario pueden haber problemas en la realizacin de las lecturas. Dejar secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos. Colocar los discos. Estos deben ser colocados con dispensador o pinza estril. Luego de estar sobre el agar se debe presionar los discos levemente para que queden adheridos al mismo. Deben estar a ms de 15 mm del borde de la placa y deben distriburse de manera de que no haya superposicin de los halos de inhibicin. En las placas de 150 mm no se colocarn ms de 12 discos, y en las placas de 100 mm no es aconsejable colocar ms de 6. Luego de colocados los discos las placas deben incubarse a 35C a 37C en grupos no mayores a cinco placas durante 18 hs. Para detectar la meticilinorresistencia las placas deben incubarse 24 hs completas. Las placas deben colocarse en forma invertida para que el agua condensada no caiga sobre el agar, lo que cambiara las condiciones del medio y por lo tanto no servira para la lectura de los halos.
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Ventajas: es un mtodo sencillo, barato y de fcil control y estandarizacin. Una ventaja adicional del mtodo y especficamente del medio, es que se le pueden realizar algunas modificaciones en cuanto a los requerimientos nutricionales para poder llevar a cabo el antibiograma con microorganismos exigentes o muy exigentes que necesitan ms nutrientes que los que este medio les puede ofrecer. Un ejemplo claro es S. pneumoniae, microorganismo exigente para el cual se puede hacer un agregado de sangre de oveja desfibrinada en una concentracin al 5%. Muchas veces estos agregados generan cambios conocidos en los halos de inhibicin del crecimiento bacteriano.
Control de calidad
Para proceder a la lectura de los antibiogramas debemos previamente asegurarnos que se cumpla un estricto control de calidad para supervisar la exactitud y fiabilidad de la metodologa. Esto se realiza debido a que existe un gran nmero de variables que pueden afectar los resultados dentro de las que se destacan: a) actividad de los discos (cuidar que no estn vencidos o que pierdan su carga por almacenamiento incorrecto); b) inadecuada composicin y espesor del medio; c) alteraciones en ms o en menos en el inculo (patrn de turbidez 0.5 de la escala de Mc Farland); d) problemas con el tiempo o temperatura de incubacin, etc. Para llevar a cabo eficientemente este control de calidad al mismo tiempo que se realiza el procedimiento para la cepa en estudio, se realiza para una cepa control. Las cepas control utilizadas sern las recomendadas por la NCCLS. Estas cepas son denominadas ATCC, una marca registrada (American Type Culture Collection). Estas son cepas conocidas, de las cuales se sabe su patrn de resistencia o sensibilidad. Se conocen y se han establecido los rangos de dimetros en el que debe estar la zona de inhibicin de crecimiento bacteriano si las condiciones del procedimiento son las adecuadas. Estos datos se encuentran en tablas de la NCCLS. Se debe verificar que los dimetros de inhibicin del crecimiento bacteriano de los discos de antibiticos entren dentro de los establecidos en las tablas, de lo contrario podremos concluir que existe alguna variable que est cambiando las condiciones en que debe ser realizado el procedimiento.
MEDICIN DE LOS HALOS E INTERPRETACIN DE LOS MISMOS
Luego de corroborar que las cepas ATCC se encuentran en rango procedemos a realizar la lectura de los antibiogramas. La lectura se realiza a travs de la medicin de los halos de inhibicin. Al igual que para las ATCC, existen tablas proporcionadas por la NCCLS que segn el dimetro del halo de inhibicin de crecimiento bacteriano, definen categoras de resistencia, sensibilidad y sensibilidad intermedia.
MTODO DE GRADIENTE ANTIBITICO (E-TEST)
Este es un mtodo cuantitativo. El principio de este mtodo es una expansin de la tcnica de difusin en disco. En el mtodo E-test podemos, mediante lectura directa, determinar la CIM. Consiste en una tira de plstico no poroso de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones. El protocolo para preparar el inculo es el mismo que para la difusin en disco. Siguiendo el mtodo de difusin, una vez inoculado la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de E-test sobre su
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superficie, producindose de forma inmediata una difusin del antibitico desde el soporte hasta el agar, crendose de este modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del antimicrobiano. Tras la incubacin de las placas, se puede observar una zona de inhibicin elipsoidal y simtrica. Despus de la incubacin la CIM ser el valor donde la elipse corta la tira. Las tiras deben conservarse a menos de 20C y deben estar protegidas de la humedad. Antes de usarse se deben atemperar a temperatura ambiente durante por lo menos 30 minutos. Las placas de Petri con el medio de MH y la forma de sembrado es la misma que en el mtodo de disco difusin. Luego se colocan las tiras sobre la superficie del agar. Se debe dejar absorber el inculo de 10 a 15 min para asegurar que la superficie del agar est completamente seca antes de aplicar las tiras. Debemos asegurarnos que la tira contacte completamente con la superficie del agar. No se deben mover las tiras una vez que han sido colocadas, ya que el antibitico empieza a difundir rpidamente. Cuando se usa una placa de Petri de 100 mm depositar solo una tira por placa y poner la tira en el centro de la placa, si se usa una de 150 mm no se deben colocar ms de 6 tiras. Se incuba durante 16 a 20 hs a 37C o segn los requerimientos ptimos de la cepa bacteriana en estudio. Si colocamos la tira al revs no se observa elipse de inhibicin, ya que el gradiente de concentraciones se sita solo sobre una de las caras de la tira. Se considera como un mtodo alternativo para el estudio cuantitativo de la sensibilidad antimicrobiana del que cabe destacar su sencillez y buena correlacin con la tcnica estndar de dilucin en agar para el estudio de la CIM, que se detalla ms adelante.
Mtodos de dilucin
Las primeras determinaciones se realizaron empleando una cantidad considerable de tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaban diluciones crecientes de antibiticos con el mismo fundamento que el descrito para el mtodo de dilucin en agar. Este procedimiento se denomin macrodilucin en caldo. Esta metodologa es muy engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realizacin. La aparicin de un sistema de inoculacin mltiple para placas de agar populariz el mtodo de dilucin en agar, en el que cada placa, con una cierta concentracin de antimicrobiano, permite inocular simultneamente un gran nmero de microorganismos. La utilizacin de micropipetas y de placas de microtitulacin facilit la utilizacin del mtodo de microdilucin en caldo; en la actualidad se han popularizado los mtodos automatizados comerciales de microdilucin en caldo, fcilmente integrables en sistemas semiautomticos de lectura e interpretacin de resultados, pero con el grave inconveniente del incremento de su costo. Dentro de estos describiremos la macrodilucin en caldo.
MACRODILUCIN EN CALDO
Las pruebas de dilucin han sido utilizadas durante aos. Los procedimientos iniciales eran realizados en tubos de ensayo grandes (13 por 100 mm) con volmenes de caldo de por lo menos 1 ml. Este mtodo fue estandarizado en la dcada de los aos 70 por el Estudio Cooperativo Internacional y luego la NCCLS public un estndar del mtodo. Este mtodo es llamado macrodilucin en caldo. A partir de los aos 60 se comenzaron a utilizar dispositivos serolgicos para dispensar y diluir. Esta miniaturizacin simple de la tcnica se conoci como microdilucin en caldo. Fundamentos: consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes concentraciones de
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Figura 1. Determinacin de la Concentracin inhibitoria mnima (CIM) y de la Concentracin Bactericida Mnima (CBM)
antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar el crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM (ver figura 1). Materiales y mtodos: en el mtodo de macrodilucin se emplea por cada combinacin de microorganismo con antimicrobiano, un juego de tubos. Habitualmente se prepara el juego de tubos con 1ml de caldo MH suplementado con Ca++ y Mg++ estril sin antimicrobiano. Para un pequeo nmero de pruebas se preparan diluciones al doble directamente en los tubos, del modo siguiente. Se colocan 2 ml de solucin de antibitico en el primer tubo de la serie de diluciones. En cada uno de los tubos restantes se aade 1 ml de caldo MH. Con una pipeta estril se transfiere 1 ml del primer tubo al segundo. Despus de mezclar el contenido del segundo tubo, se transfiere 1 ml con una pipeta diferente (en esta transferencia y en todas las sucesivas) al tercer tubo. El proceso contina hasta el penltimo tubo, al que se le quita 1 ml, que se descarta. El ltimo tubo no recibe solucin de antibitico y sirve de control de crecimiento. Las concentraciones finales de antibiticos en esta prueba son iguales a la mitad
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de la serie inicial de dilucin, debido al agregado de una concentracin igual de inculo en el caldo. Se prepara un inculo bacteriano que contenga 105 a 106 UFC/ml ajustando la turbidez de un caldo de cultivo al estndar y diluyendo luego a 1:200 en caldo. Aadir a cada tubo 1 ml del inculo ajustado. Incubar los tubos a 35C entre 16 y 20 horas.
LECTURA E INTERPRETACIN DE LA CIM
La CIM corresponde a la mnima concentracin de antibitico en donde no se observa desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en g/ml. Luego se debe recurrir, teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa cepa, a las tablas para definir segn los valores de CIM que en ellas aparecen si las cepas en estudio son sensibles o resistentes a un determinado antibitico.
Interpretacin de los estudios de sensibilidad antibitica

Los resultados de sensibilidad sern interpretados de acuerdo a las tablas de la NCCLS. Se definen tres categoras: resistente, intermedio y sensible. El resultado sensible significa que hay una alta probabilidad de que el paciente responda al tratamiento con el antibitico testado. El resultado resistente implica alta chance de falla teraputica. La categora intermedia puede tener varios significados. Con agentes que se puede administrar a altas dosis, puede significar que se deben utilizar altas dosis para que el tratamiento sea eficaz o que el agente puede ser eficaz si se concentra en el sitio de infeccin. Tambin puede representar una zona buffer que impide que cepas con sensibilidad borderline sean categorizadas como resistentes. Los breakpoints o puntos de quiebre son los valores de concentracin que permiten la categorizacin en sensible, resistente o intermedio. Para establecer el valor de estos breakpoints se utilizan cuatro fuentes: 1. La observacin de la distribucin de CIM que indica como se comportan la mayora de las cepas y si hay distribuciones anormales que pueden marcar la presencia de un mecanismo de resistencia. 2. Los parmetros farmacocinticos y farmacodinmicos que ya mencionamos en el captulo de antibiticos. 3. La respuesta clnica y bacteriolgica a la utilizacin del antibitico en cuestin. Se espera una tasa de respuesta favorable del 80% para que el organismo sea clasificado como sensible. 4. Una vez se establecen los breakpoints para CIM se deben elegir los breakpoints para la disco difusin. Esto se obtiene mediante una regresin lineal (ver figura 1).
Bibliografa
Ferraro, M. J. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eleventh Informational Supplement. Vol 21,.N 1 M100-S11 NCCLS. Ferraro, M.J. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Performance Standards for Antimicrobial Disks Susceptibility Tests. Approved Standard-Seventh Edition. Vol 20,.N 1 M2-A7 NCCLS. Ferraro, M.J. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-Fifth Edition. Vol 20, N 2, M7-A5 NCCLS.
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Antivirales
S. Mateos
El nmero de frmacos antivirales ha aumentado en forma extraordinaria en los ltimos 10 a 15 aos como una reaccin a la pandemia de la infeccin por VIH. Muchos antivirales por su mecanismo de accin interfieren en alguna de las fases de la infeccin y la replicacin; otros, como interferones y citoquinas, incitan acciones inmunomoduladoras y antiproliferativas en la clula husped. La clasificacin de los antivirales se puede realizar por su mecanismo de accin o su perfil de actividad, que es la forma en que lo trataremos. Todos interfieren en distintas etapas de la replicacin viral: Son anlogos de los cidos nucleicos: zidovudina, ganciclovir, vidaravina, aciclovir. Bloqueo de la adhesin y penetracin: amantadina, oseltamivir. Inhibicin de la sntesis de ADN: aciclovir, foscarnet. Inhibicin de la sntesis proteica: interferones. Alteracin de la fase de maduracin proteica: inhibidores de proteasa, inhibidores de glicosilacin.
Conceptos generales
Muchos compuestos muestran actividad antiviral in vitro pero tienen efectos txicos para la clula husped. Caractersticamente los frmacos ms eficaces actan inhibiendo la accin de alguna enzima viral especfica (polimerasa, transcriptasa). Los cambios en un cido nucleico pueden ser suficientes para ocasionar resistencia al producto antiviral, indicando que el frmaco posee un mecanismo de accin especfico. Los frmacos hasta ahora descritos inhiben la replicacin activa de manera que puede reanudarse la proliferacin de los virus despus de dejar de usar el frmaco; las respuestas inmunitarias y eficaces del husped son esenciales para la eliminacin o control de la infeccin. Puede surgir ineficacia clnica con antivirales en caso de virus farmacosensibles en pacientes fuertemente inmunodeficientes, por otro lado se ha visto que las variantes virales farmacorresistentes se observan con mayor frecuencia en pacientes inmunodeficientes con gran nmero de partculas virales en replicacin y que han recibido ciclos duraderos o repetidos de tratamiento antiviral, aunque los VIH son una excepcin. Los frmacos habitualmente no eliminan al virus latente o que no est en fase de replicacin. La eficacia clnica depende, entre otras cosas, de obtener concentraciones inhibitorias en el sitio de la infeccin. No se han estandarizado an los mtodos para medir la sensibilidad
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in vitro a compuestos antivirales y los resultados dependen del sistema de cuantificacin, del tipo celular, del inculo viral y del laboratorio. Por lo tanto, de casi todos los antivirales no se han definido relaciones ntidas entre concentraciones medicamentosas activas in vitro, las que se logran en sangre u otros lquidos corporales, y la respuesta clnica
Antirretrovirales
Los frmacos antirretrovirales no son curativos, al no erradicar la infeccin, pero pueden disminuir la carga viral y retrasar la depresin inmunolgica, para convertir la infeccin por VIH en una enfermedad crnica controlada, para lo cual el tratamiento debera ser potente e iniciarse de forma precoz. Bsicamente pueden diferenciarse dos grupos de frmacos antirretrovirales, segn su mecanismo de accin sobre el ciclo evolutivo del VIH: 1. Inhibidores de la transcriptasa inversa: evitan la sntesis de la cadena de ADN provrico. 2. Inhibidores de la proteasa: evitan la formacin de las protenas estructurales del VIH, necesarias para la formacin de la partcula vrica madura.
INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPTASA REVERSA (TR) ANLOGOS DE LOS NUCLESIDOS
El lugar donde actan estos frmacos es la TR, la cual resulta esencial en el ciclo replicativo del virus y es caracterstica de la familia Retroviridae. Cuando el virus penetra a la clula la TR produce una copia complementaria de ADN a expensas del ARN genmico viral, y luego cataliza una segunda copia positiva haciendo as que la informacin gentica vrica quede codificada en una doble hebra de ADN. Fueron los primeros frmacos utilizados en el tratamiento del VIH: zidovudina (AZT), didanosina (ddI), lamivudina (3TC), abacavir (ABC). Todos ellos necesitan para ser activos, sufrir tres fosforilaciones enzimticas por quinasas intracelulares. Su mecanismo de accin reside en su actividad como inhibidores competitivos de los nuclesidos trifosforilados intracelulares. Por un lado compiten por el lugar de unin de los nucletidos a la TR, por el otro al incorporarse a la cadena de ADN naciente, actan como terminadores de la misma, al impedir la unin de nuevos nuclesidos. La ADN polimerasa (alfa) de la clula de los mamferos requiere concentraciones mucho ms elevadas para inhibirse (2000 veces ms) que la TR, lo que explica en parte el efecto selectivo de los ITIAN sobre la enzima viral. No obstante, la ADN polimerasa (gama) presente en las mitocondrias pueden inhibirse a las concentraciones alcanzadas en las clulas, lo que justifica gran parte de la toxicidad de estos frmacos. Efectos adversos (AZT): anemia, neutropenia, cefalea, astenia e intolerancia digestiva. Tambin se han relacionado con la lipodistrofia. Inhibidores de la TR anlogos de nucletidos: nuevos frmacos que tambin inhiben la TR como terminadores de cadena, a diferencia de los anteriores, al estar monofosforilados sufriran una conversin mucho ms rpida a la forma activa y mostraran mayor potencia antivrica, dado que el paso limitante en la trifosforilacin de un nuclesido es tpicamente la adicin del primer fosfato. Actualmente el nico frmaco disponible de este grupo es Tenofovir.
INHIBIDORES DE LA TR NO ANLOGOS DE NUCLESIDOS (EFAVIRENZ, NEVIRAPINA)
Inhiben la TR de forma no competitiva y altamente eficaz mediante su unin a un lugar diferente al sitio de unin del cido nucleico, producen una disminucin de la actividad cataltica de la enzima dependiente de magnesio. El efecto adverso ms frecuente es el exantema cutneo.
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INHIBIDORES DE LA PROTEASA (IP)
Los IP revolucionaron con su aparicin en 1996 el tratamiento de la infeccin por VIH, provocando una disminucin espectacular de la morbimortalidad. En nuestro pas existen saquinavir (SQV), indinavir (IDV), ritonavir (RTV), etc. Son un grupo de frmacos con actividad sobre la aspartilo proteasa codificada por el virus. Tienen una estructura complementaria del sitio activo de la enzima y actan como inhibidores competitivos de la enzima. El principal inconveniente que tuvieron estos frmacos fue su baja biodisponibilidad (mala absorcin va oral, rpida excrecin o ambas), las interacciones farmacocinticas y su toxicidad. Durante el proceso de replicacin del VIH, los precursores generados a partir de los genes gag y pol son procesados para dar lugar a protenas funcionales ms pequeas como la TR, proteasa, integrasa, ARNasa y las protenas de la cpside. Por lo que su inhibicin da lugar a la formacin de viriones inmaduros, no infecciosos. Efectos adversos: son un grupo de frmacos relativamente mal tolerados. A corto plazo producen nefrolitiasis e intolerancia digestiva. A mediano y largo plazo producen intolerancia a la glucosa, osteonecrosis avascular e hiperlipidemia.
PAUTAS TERAPUTICAS
La meta principal del tratamiento es prolongar la vida del paciente y su calidad de vida. Esto se consigue idealmente a travs de distintos objetivos: Reduccin de la carga viral al nivel mnimo (<20 a 50 copias/ml) durante el mayor tiempo posible, para frenar la progresin de la enfermedad y prevenir la aparicin de resistencias. Reconstitucin del sistema inmune cuantitativamente (incremento de linfocitos CD4) y cualitativamente (recuperacin de la respuesta inmune especfica). Uso adecuado de los frmacos en pautas que permitan la supresin vrica sin detrimento de opciones teraputicas futuras de tratamiento, no presenten muchos efectos adversos y favorezcan la adherencia. Es fundamental antes de iniciar el tratamiento asegurarse de explicar las caractersticas del mismo y la importancia del cumplimiento. Una supresin insuficiente de la replicacin, deriva de pautas teraputicas inadecuadas o de la mala adherencia al tratamiento, lo que acabar originando la aparicin de cepas resistentes, estas ltimas constituyen la causa principal de fracaso teraputico. Se recomienda comenzar la terapia antirretroviral en aquellos pacientes que presenten sntomas asociados a la infeccin por VIH (fiebre inexplicada, muguet oral, sndrome constitucional, infecciones oportunistas), infeccin aguda o reciente (menos de seis meses tras la seroconversin), en mujeres embarazadas como profilaxis de la trasmisin perinatal o si el recuento de linfocitos CD4 es menor de 350/mm3. Si el recuento de CD4 se sita entre 350 y 500, puede considerarse el comienzo de la terapia si el nivel replicativo del virus es intermedio o alto (5000 a 30000 copias/ml). Cuando el recuento de CD4 es superior 500/mm3 la actitud es ms conservadora y generalmente no se ofrece tratamiento, salvo en casos de carga viral elevada (30000 a 50000 copias/ml). Con respecto a la indicacin segn carga viral, si esta es mayor de 30.000 copias/ml, generalmente se indica tratamiento independientemente de los CD4, aunque en estos casos el mismo puede retrasarse en funcin de las caractersticas particulares: elevado nmero de CD4, consumo activo de drogas, posible mala adherencia. Entre las ventajas del tratamiento precoz podran citarse, un control ms temprano de
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la replicacin viral, prevencin de la inmunodepresin progresiva, una mejor tolerancia a los frmacos, disminucin de la trasmisin del virus, prevencin de las resistencias y retraso en la progresin de la enfermedad. No obstante, esto puede obtenerse a un alto costo al empeorar significativamente la calidad de vida del paciente, adelantar la aparicin de resistencias, pudiendo favorecer la aparicin de efectos txicos a largo plazo y la trasmisin de cepas resistentes. Las pautas iniciales consisten habitualmente en la combinacin de 2 ITIAN con un IP .
Resistencia a los antirretrovricos

El genoma del VIH contiene aproximadamente 10.000 pares de bases, habindose estimado que la tasa de error de TR es de cerca de un nucletido por cada 10.000 copiados, por lo que en cada ciclo replicativo se producira una mutacin puntual. Teniendo en cuenta que diariamente se producen de 109 a 1010 viriones, esto significa que todas las mutaciones puntuales del genoma probablemente se generen cada da. La tasa de mutacin en el genoma es alta porque el mecanismo de transcripcin del ARN viral en ADN, mediado por la TR, no posee un mecanismo de correccin de errores. Lo ms frecuente es que el producto de una mutacin sea la sustitucin de un aminocido por otro en los productos proteicos, pero tambin son posibles otro tipo de mutaciones como deleciones o inserciones de nucletidos. Cuando no existe presin selectiva por parte de los frmacos, una poblacin viral est compuesta por diversas variantes genticas denominadas cuasiespecies. Algunas de estas variantes pueden ser naturalmente resistentes a un determinado nivel frente a un frmaco, en particular sin necesidad de que el virus haya sido expuesto al mismo. Las mutaciones particulares que confieren resistencia son cambios genticos que resultan en alteraciones de la estructura y funcin de protenas virales claves como la TR o la proteasa, por lo que pueden
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afectar a la capacidad de infectividad o replicacin del virus, hacindolo menos competitivo en comparacin con el virus salvaje; por esta razn las variantes naturales resistentes existen como una poblacin minoritaria. La presencia de frmacos antirretrovirales altera la presin selectiva sobre la poblacin viral. Aquellos virus mutantes que presenten algn grado de resistencia continuarn replicndose e incrementarn su poblacin con respecto a los ms sensibles. Con el tiempo estos mutantes que han escapado a la presin del sistema inmune y de los frmacos, acumularn mutaciones adicionales, las cuales incrementarn su resistencia y mejorarn su capacidad replicativa an en presencia de los frmacos. La frecuencia con la que aparece resistencia no solo depende de factores propios del virus como su alta tasa de replicacin, la elevada cantidad de virus en el organismo o la facilidad con la que aparecen mutaciones, sino tambin de las caractersticas del tratamiento. Existen frmacos para los que una nica mutacin en el genoma del virus les hace perder toda actividad, denominndose de baja barrera gentica (como los ITINAN), mientras que otros necesitan de varias para que se afecte significativamente su efectividad. De igual manera cuando un rgimen teraputico no suprime efectivamente la replicacin viral, por potencia inadecuada o mala adherencia del paciente, se est favoreciendo la aparicin de mutantes resistentes. Estos mutantes pueden mostrar resistencia cruzada con otros antirretrovricos del mismo grupo, aunque el paciente no lo haya tomado nunca. Por lo tanto un esquema eficaz de tratamiento debe incluir un nmero suficiente de frmacos (generalmente tres) que hagan muy improbable la seleccin de cepas mutantes naturales y que garantice una supresin completa, evitando la seleccin de cepas resistentes de nueva aparicin. Actualmente es posible obtener informacin acerca del patrn de mutaciones que presenta la poblacin vrica en un paciente determinado, gracias a las pruebas de resistencia genotpica y fenotpica. Las primeras se basan en la secuenciacin o hibridacin del genoma vrico para identificar mutaciones puntuales que podran alterar la sensibilidad del virus a los frmacos, mientras que las fenotpicas miden la sensibilidad del virus a los antirretrovirales directamente en cultivos celulares. Las pruebas genotpicas son ms rpidas, accesibles para los laboratorios y ms baratas. Sin embargo, solo proporcionan el patrn mutacional y no el grado de resistencia asociado al mismo, por lo que requieren una interpretacin experta. Por el contrario, los mtodos fenotpicos dan informacin cuantitativa in vitro del grado de resistencia del virus a los distintos frmacos. Sin embargo, son mtodos ms lentos y caros, requiriendo laboratorios especializados. Los resultados de estas pruebas deben de interpretarse en el contexto de la historia de tratamiento del paciente, la adherencia a las pautas teraputicas, la tolerancia a las mismas y la posible existencia de interacciones medicamentosas o problemas de absorcin de los frmacos. A pesar de sus limitaciones, estas pruebas han demostrado utilidad en la eleccin de pautas teraputicas de rescate, mejorando las tasas de respuesta al mismo cuando se usaron en el esquema de decisin. Entre sus indicaciones podran citarse: Infeccin primaria. Permitira detectar la trasmisin de cepas resistentes y optimizar el tratamiento para mantener la eficacia a largo plazo. Primer fallo teraputico. Permitira documentar los frmacos frente a los que se ha desarrollado resistencia. Mltiples fallos teraputicos. Se podra optimizar el nmero de frmacos activos en el nuevo rgimen, excluyendo aquellos con pocas probabilidades de respuesta. Embarazo. Se podra optimizar el tratamiento materno y la profilaxis de la infeccin en el neonato.
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Antivricos activos frente al virus Herpes

La familia Herpesviridae comprende una serie de virus ADN cuya capacidad biolgica ms notable es su capacidad de producir infecciones latentes. Tras la infeccin primaria, sintomtica o no, el virus permanecer latente en diversos tipos celulares o tejidos que les son propios a cada miembro de la familia. Desde aqu y sin que se conozcan bien los mecanismos ntimos y ltimos que desencadenan el fenmeno, se van a producir reactivaciones con replicacin y produccin de nuevas partculas virales. El aciclovir aprobado en 1982 fue el primer frmaco con una toxicidad reducida aprobado para su utilizacin en las infecciones por Herpes simple (HVS) y Varicela Zoster (VVZ). Este es el prototipo de un grupo de compuestos antivirales que son fosforilados dentro de la clula por una quinasa viral para volverse inhibidores de la sntesis de ADN del virus. Otro frmaco que utiliza este mecanismo es el ganciclovir (CMV). Mecanismo de accin: bloquea la sntesis de ADN viral y replicacin compitiendo con la desoxiguanosina trifosfato (dGTP) por la ADN polimerasa viral y siendo incorporado en el ADN viral. La afinidad del aciclovir por la ADN polimerasa viral es 200 veces mayor que por la ADN polimerasa de los mamferos. Adems de inactivar la accin de la ADN polimerasa viral, acta como terminador de cadena. Mecanismo de resistencia: se ha vinculado con alguno de los tres mecanismos siguientes: produccin nula o parcial de la timidinquinasa viral; alteracin de la especificidad del sustrato de la timidinquinasa; alteracin de la especificidad del sustrato o alteracin de la ADN polimerasa viral. Las alteraciones en las enzimas virales son causadas por mutaciones puntuales, inserciones o deleciones. El mecanismo de resistencia ms frecuente en cepas de HSV clnicas es la deficiente actividad de timidincinasa, son infrecuentes los mutantes de la ADN polimerasa Aplicaciones teraputicas: el aciclovir por va parenteral es el frmaco de eleccin para el tratamiento de las infecciones graves causadas por el virus de Herpes simple y la VVZ, que incluyen encefalitis y neumonitis. El aciclovir por va enteral es eficaz en las infecciones primarias por el HVS pero es menos eficaz en el tratamiento de las reactivaciones. La supresin crnica a largo plazo con aciclovir oral reduce la frecuencia de recurrencias sintomticas de herpes genital y la diseminacin asintomtica del virus. El tratamiento oral con aciclovir instaurado en las primeras 24 hs del inicio de la erupcin reduce la gravedad de la varicela y puede ser til para tratar el zster localizado, oftlmico o diseminado.
Antivirales activos frente a CMV

Ganciclovir: relacionado estructuralmente con aciclovir, inhibe la unin de la desoxiguanosina trifosfato a la ADN polimerasa, resultando en la inhibicin de la sntesis del ADN viral. Es activo frente al HSV y CMV, sin embargo el uso clnico est limitado por su toxicidad, se utiliza fundamentalmente por va parenteral, en el tratamiento de la coriorretinitis por CMV en paciente inmunodeprimidos. Su eficacia en al neumonia por CMV es discutible. Por va enteral se utiliza en la terapia de mantenimiento y profilaxis de retinitis por CMV. Toxicidad: puede producir nefrotoxicidad, alteraciones hematolgicas (anemia, neutropenia, trombocitopenia).
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Antivricos activos frente al virus de la hepatitis B

Lamivudina: adems de su uso como antirretroviral, ha sido aprobado por la FDA en el tratamiento de la hepatitis B crnica. Las asociaciones con interfern alfa y lamivudina no parecen dar lugar a tasas de respuestas superiores.
Antivricos activos frente al virus de la hepatitis C

Interfern alfa: los interferones (alfa, beta, gama) son potentes citoquinas con actividad antiviral, inmunomoduladoras y antiproliferativa. Casi todos los virus animales son sensibles a las acciones antivirales de los interferones, aunque muchos de los que tienen ADN son relativamente insensibles. Existen notables diferencias de potencia en diferentes virus y sistemas de cuantificacin. La actividad biolgica del interfern, por lo general, se mide en trminos de sus efectos antivirales en cultivos celulares y se expresa en unidades internacionales en relacin con estndares de referencia. Mecanismo de accin: los interferones despus de unirse a receptores celulares especficos inician la sntesis de ms de dos docenas de protenas que contribuyen a la resistencia contra el virus. Los efectos antivirales son mediados por la inhibicin de la penetracin o decapsidacin viral, la sntesis de ARNm, la traslocacin de protenas, ensamblado y liberacin de virus o de todas estas funciones juntas. El bloqueo de la sntesis proteica es su principal efecto inhibidor en muchos virus. Efectos adversos: sndrome influenza like, agranulocitosis, neurotoxicidad. La aparicin de anticuerpos neutralizantes luego de iniciado el tratamiento reduce su actividad. Aplicaciones teraputicas: se ha demostrado su utilidad en la infeccin por HCV. Actualmente el tratamiento es en combinacin con Ribavirina; esta asociacin se ha relacionado con tasas ms altas de respuesta. La Ribavirina es un anlogo del nuclosido purnico. Inhibe la replicacin de muy diversos virus, incluyendo virus influenza, VRS, adenovirus, VHC. Efectos adversos: es teratognica, oncognica, gonadotxica. La ribavirina en aerosol se a utilizado en Estados Unidos para tratar la bronquiolitis y neumonia por VRS en nios hospitalizados, en donde mejora los ndices de enfermedad, oxigenacin y reduce la excrecin de virus en lactantes hospitalizados.
Otros frmacos activos frente a virus respiratorios

Oseltamivir (TamifluR) y Zanamivir: antivirales selectivos frente al virus influenza A, est indicado en el tratamiento de la gripe en mayores de 18 aos. Mecanismo de accin: inhibe las neuraminidasas de los virus influenza A y B. Oseltamivir se administra por va enteral, mientras que la presentacin de Zanamivir es por va inhalatoria. Si el diagnstico especfico confirmado por laboratorio se establece dentro de las primeras 24 a 36 horas del inicio de los sntomas, se pueden indicar estos frmacos antivirales. Con este tratamiento se logra reducir la duracin de los sntomas en un 50% (2 o 3 das), disminuir la intensidad de los mismos y la trasmisin viral. En los pacientes con asma o EPOC se prefiere el uso del Olseltamivir, dado que el Zanamivir inhalatorio tiene riesgo potencial de producir broncoespasmo. La posologa del oseltamivir es de 75mg por va oral cada 12 horas durante 5 das. Palivisumab: es un anticuerpo monoclonal utilizado en la prevencin de la enfermedad por VRS en recin nacidos y nios de alto riesgo, se administra por va intramuscular una vez
680
por mes, al inicio del otoo hasta el final de la primavera. Est indicado en prematuros (< de 35 semanas) y menores de 2 aos con afecciones cardiopulmonares crnicas.
Bibliografa
Hardman J, Limbird L, Molinoff P , Ruddon R, Goodman A. Goodman&Gilman Las Bases Farmacolgicas de la Teraputica. 9ed. Mjico. Mc Graw-Hill Interamericana. 1996. Martn C, Blanco J, Tuset M, et al. Caractersticas de los Frmacos Antivricos. Medicine 2002; 8 ed: 38053814. Prez J. Frmacos Antirretrovricos. Medicine 2002; 8 ed: 3959-3969. Samuel C. Antiviral Actions of Interferons. CMR 14;2001: 778-809.
681

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Bacteriologa y Virologa Mdica

Seccin II. Principales procesos infecciosos

Seccin III. Etiopatogenia microbiolgica

Seccin IV. Control de poblaciones microbianas

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TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

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Morfologa y estructura de los virus

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Parvovirus 1000 nm Fig. 1

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A- Icosahedro desnudo B. Helicoidal desnudo

protmeros (protena) capsmeros (protena)

cido nucleico espculas (glicoprotenas) envoltorio (protenas y lpidos)

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Circular (simple y doble cadena)

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de. Generalmente, la liberacin de la partcula se produce al finalizar el brotamiento de la membrana celular.

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Morfologa y estructura bacteriana

Introduccin e importancia del tema

Definicin y ubicacin taxonmica

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TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

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Figura 8. Esquema comparativo de la estructura del flagelo en gramnegativas

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Figura 9. Esquema del proceso de esporulacin

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Fisiologa y metabolismo bacteriano