UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Per, DECANA DE AMRICA

Facultad de Ciencias Biolgicas
E.A.P Gentica y Biotecnologa

INFORME DE PRCTICA DE LABORATORIO DE BIOLOGA DEL DESARROLLO

PRCTICA: FERTILIZACIN Y DESARROLLO TEMPRANO DEL ERIZO DE MAR, EXOGASTRULACIN


PROFESOR: Fernando Retuerto Prieto

ALUMNO: Erick Figueroa Ildefonso Cdigo: 11100021





HORARIO de PRCTICAS:


DIA: mircoles
HORA: 1:00 pm 3:00 pm



LIMA-PER

2014


FERTILIZACIN Y DESARROLLO TEMPRANO DEL ERIZO DE MAR,
EXOGASTRULACIN

INTRODUCCIN

El presente trabajo se centra en el anlisis y seguimiento realizado de los estadios de
desarrollo embrionario del erizo de mar Tetrapygus niger desde la fecundacin del gameto
femenino hasta la formacin de la larva pluteus. En una prueba en paralelo se analiz el efecto
que produce una infusin de ua de gato (Uncaria tomentosa) en el proceso de desarrollo del
embrin; y la posible ocurrencia del fenmeno de exogastrulacin del embrin de la especie
en estudio.
La tcnica aplicada implica bsicamente el encuentro del ovocito con el espermatozoide fuera
del organismo femenino, realizndose este encuentro en el laboratorio. A diferencia de las
tcnicas de fecundacin in vitro que se realizan en la especie humana, en los animales estos
procedimientos estn dirigidos principalmente a poder desarrollar nuevas tecnologas a fin de
ampliar los conocimientos sobre los procesos involucrados en el complejo fenmeno de la
reproduccin, como tambin por otro lado implementar certeramente biotecnologas en los
animales domsticos, especialmente aquellos de importancia comercial, mejorando as la
eficiencia reproductiva y gentica de las especies.
En concreto, el erizo de mar es muy utilizado en estudios reproductivos ya que es fcil
obtener sus gametos y realizar fecundaciones, adems las etapas de desarrollo pueden ser
identificadas claramente.











MARCO TERICO

FECUNDACIN Y DESARROLLO TEMPRANO DEL ERIZO DE MAR
La liberacin de espermatozoides y los huevos al ambiente, conocido como desove libre, es un
mecanismo comn de reproduccin en organismos marinos. En la mayora de los animales de
desove libre, la fertilizacin ocurre en una columna de agua, seguida por el desarrollo de la
blstula, hacia blstula y finalmente a larva pluteus
(1)
.
El proceso de la fecundacin comienza con la interaccin del espermatozoide con el ovocito
maduro. La primera interaccin consiste en el contacto del espermatozoide con la cubierta
ms externa del ovocito, lo que desencadena una serie de reacciones, entre ellas la reaccin
del espermatozoide, lo que permite finalmente la incorporacin y dispersin del material
gentico al interior del ovocito.












En el caso de los erizos, la primera interaccin de los gametos ocurre en la cubierta de gelatina
externa del ovocito. Esta cubierta posee receptores especie especficos, que interactan con
los receptores de la membrana celular de los espermatozoides, gatillando la reaccin del
acrosoma. Con esto se desencadena una serie de eventos que llevan a la fusin de membrana
plasmtica del ovocito con la membrana interna del acrosoma. Luego se forma una capa de
fecundacin, la que evita la polispermia. Posteriormente el espermatozoide penetra hacia el
interior del ovocito para terminar en la fusin de ambos proncleos.
Luego de la fecundacin, la fusin de ambos gametos se da la formacin del cigoto, con lo que
se recupera el nmero original de cromosomas de la especie. Ocurrido esto se gatilla la
segmentacin, proceso mediante el cual, a partir de una clula nica se suceden una serie de
divisiones mitticas hasta llegar al estado de blstula. La segmentacin se inicia con la divisin
del ncleo quedando la clula huevo dividida en dos clulas hijas denominadas blastmeros;
cada uno de los cuales se dividir y dar lugar a 4 clulas, de este modo el nmero de
blastmeros aumenta de forma geomtrica. En esta etapa los blastmeros permanecen unidos
dando un aspecto al cigoto de una mora (estado de mrula)
(2)
.




Conforme las divisiones van transcurriendo, los blastmeros son ms pequeos. La blstula, el
ultimo estado de segmentacin, en el cual pueden encontrarse 64 blastmeros formando una
capa externa de clulas compactas entre s (blastodermo) y con una gran cavidad interna
(blastocele); el embrin toma la apariencia de una esfera hueca. La siguiente fase es la
gastrulacin, en la cual el blastodermo da origen a las capas germinales, el estado resultante se
llama gstrula.
Posteriormente la gstrula forma la larva, denominada larva pluteus; la que posee boca, ano
y tubo digestivo, su forma es cnica y se caracteriza por la presencia de 4 brazos o espinas
(3)
.

EXOGASTRULACIN
Existen sustancias qumicas que inducen a la exogastrulacin del embrin cuando se encuentra
en estadio de blstula; la exogastrulacin es un proceso anormal en el cual el mesodermo de la
gstrula y el endodermo no son internalizados; como resultado se forma una exogstrula. En
1893 Cut Herbst descubri que los embriones de erizos de mar pueden formar exogstrulas si
en el agua de mar en la cual se estn desarrollando, se adiciona sales de litio, y de esto modo
introdujo el fenmeno de exogastrulacin a la embriologa experimental. El tratamiento con
iones de litio tambin provoca la exogastrulacin en embriones de anfibios
(4)
.



MATERIALES Y MTODOS
Del alumno
Erizos de mar (Tetrapygus niger)

Agua de mar

Lminas portaobjetos y cubreobjetos

Del laboratorio
Beakers

Pipetas Pasteur

Lmina excavada

Papel filtro

Embudos de vidrio

Microscopio

A. OBTENCIN DE GAMETOS
En los erizos de mar, como en otros equinodermos, los sexos se encuentran separados. En la
naturaleza; los gametos se descargan en el agua y de este modo el espermatozoide nada hasta
el ovulo.
No es posible distinguir externamente los sexos del erizo de mar.
Un mtodo que permite obtener los gametos es inyectando pequeas cantidades de KCl en el
celoma del erizo.
Las gnadas de los erizos se encuentran ubicados en la superficie aboral interna; y se
distinguen entre s por el color. Los huevos de Tetrapygus niger son granates y el esperma de
color cremoso.
Para obtener las gnadas, se coloco los erizos adultos en placas Petri y se procedi a
cortar la regin aboral que contiene las gnadas; obtenidas las gnadas de cada se les
coloco en placas Petri.

Previamente se debe contar con agua de mar, la cual se filtra con ayuda de un embudo
de vidrio y papel filtro.
En un beaker con agua de mar filtrada se introducen las gnadas femeninas de erizo;
para que se liberen los gametos femeninos se realiza una agitacin dentro del agua; se
considera que los gametos se liberaron cuando la solucin se torna de color rojizo.

Para la obtencin de los gametos masculinos, a las gnadas del erizo de mar macho, se
le aplico una pequea cantidad de agua de mar; para que los espermatozoides estn
en movimiento en esta. Estos espermatozoides, que estn activos, a diferencia de los
huevos, son viables solo por un tiempo limitado en agua de mar.

B. FERTILIZACIN
Para que ocurra la fecundacin del huevo por parte del espermatozoide, ambos gametos debe
entrar en contacto en el agua de mar filtrada; para esto se necesita una pequea cantidad de
la suspensin de espermatozoides y de la suspensin de huevos.
La mezcla resultante se coloca en una lmina portaobjetos excavada, y se llevo a observar.
Al ser la fecundacin un proceso rpido, al microscopio podr observarse al huevo ya
fecundado, y rodeado por el halo de fecundacin caracterstico.















Erizo de mar
Gnada femenina
Gnada masculina
Gameto femenino antes de la
fecundacin
C. EXOGASTRULACIN
Se han encontrado diferentes agentes qumico que conducen a la animalizacin o
vegetalizacin del embrin de erizo de mar. En esta prctica embriones en desarrollo
temprano, en etapa de blstula; fueron sometidos a dos concentraciones de esencia de ua de
gato y dos de t.
Tubo 1a: 20 uL de Esencia de ua de gato.

Tubo 1b: 40 uL de Esencia de ua de gato.

Tubo 3a: 20 uL de Esencia de t.

Tubo 3b: 40 uL de Esencia de t.


A estas soluciones se les adiciono 3ml de la suspensin de embriones que se encontraban en
estado de blstula.
Se realizaron monitoreos del desarrollo embrionario, as mismo se hizo un monitoreo de las
muestras sometidas a los agentes qumicos que produciran una exogastrulacin del embrin.


Soluciones de t y ua de gato
Suspensin de embriones
de erizo de mar
Embriones en estadio
de blstula
RESULTADOS
Luego de ocurrida la fecundacin, se llevaron a cabo conteos del nmero de clulas
encontradas; diferencindolas en estadios de desarrollo embrionario; esto fue segn como
sigue:
La fecundacin se llevo a cabo el da mircoles 23 de abril alrededor de la 1:48pm.









El primero conteo se llevo a cabo el mismo da a las 3:45pm. El segundo conteo se
realiz el segundo da cerca de las 5:30 pm.

En el primero se llego a visualizar embriones de hasta 4 blastmeros; en cambio en el segundo
ya pudo contabilizarse 8 blastmeros.








En el tercer conteo, que se llevo el da jueves 24 de abril alrededor de las 9:00 am, ya
se visualizaban embriones en estadio de blstula y gstrula.

En los conteos posteriores; los cuales fueron llevados a cabo a intervalos de cerca de 2
hora, hasta las 3pm de la tarde de ese da fue evidente la variacin del nmero de
blstulas con respecto al nmero de gstrulas, las segundas iban en aumento
gradualmente y las blstulas su porcentaje iba disminuyendo en los campos analizados
conforme transcurra el tiempo.

En los ltimos 2 conteos llevados a cabo el da viernes 24 de abril; se observo que casi
el total de embriones a considerar en el conteo se encontraban en estado de gstrula;
as mismo pudieron encontrarse algunos embriones en estado de prisma.






















Embriones en estado de blstula y gstrula
Embriones en estado de prisma Embriones en estado de gstrula
Tabla de conteo de embriones en diferentes das y horas




SD: embrin sin dividirse
Se indica con nmeros el nmero de blastmeros en los embriones.
*Entre los embriones contados se encontraron algunos que tenan nmeros impares de
blastmeros.


0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2 3 4 5 6 7
Variacin de estadio de embrin vs Tiempo
S D
2
4
8
blstula
gstrula
prisma
Tiempo Clulas sin dividir
(1 clula)
2 clulas 4 clulas 8 clulas blstula gstrula prisma
T1 44.55% 53.47% 1.98% - - - -
T2 16.67% 3.33% 26.67% 53.33% - - -
T3 - - - - 70.59% 29.41% -
T4 - - - - 32.00% 68.00% -
T5 - - - - 14.04% 85.96% -
T6 - - - - 28.00% 72.00% -
T7 - - - - - 57.14% 42.86%
T8 Se visualiz presencia de gstrula
En lo que respecta a la prueba de exogastrulacin, esta no fue observada. El efecto visualizado
en las suspensiones de embriones tratados con mayor concentracin de esencia de ua de
gato, fue dao a nivel embrionario en estadio de blstula.

























Embriones de erizo de mar en estado de blstula que sufrieron
dao por la exposicin a la solucin de ua de gato
DISCUSIN DE LOS RESULTADOS
Inmediatamente despus de estimulada la fecundacin del erizo de mar; se observ al
microscopio, los cambios instantneos que sufra el gameto femenino; como fue la formacin
del halo de fecundacin; ocurrido este evento se tiene en consideracin que el ovulo est
desarrollando los procesos involucrados para la prevencin de la polispermia; al microscopio
se pude verificar debido a que se observaron espermatozoides adheridos a la superficie de
este gameto
(5)
. Estos procesos involucrados incluyen la activacin de los grnulos corticales,
este es un bloqueo mecnico para la polispermia ms lento que llega a ser activo cerca de un
minuto despus de la primera fusin exitosa entre el espermatozoide y el gameto femenino.
Debajo de la membrana celular del vulo del erizo de mar se encuentran cerca de 15.000
grnulos corticales, cada uno de aproximadamente 1 m de dimetro. Al producirse el ingreso
del contenido del espermatozoide, estos grnulos corticales se fusionan con la membrana
celular del gameto femenino recin fecundado y liberan sus contenidos en el espacio entre la
membrana celular y el material fibroso de las protenas de la membrana vitelina.
Conforme las horas fueron avanzando y se realizaban los monitoreos a intervalos de tiempo,
se observaron las clulas realizando clivajes; las clulas de 2, 4 y 8 blastmeros observadas se
observaron dentro de las siguientes primeras 4 horas del mismo da de la fecundacin;
conforme el tiempo transcurri la proporcin de embriones en distintos estadio variaba;
disminuyendo los de estadios iniciales (1 , 2 blastmeros) y los de estadios siguientes (4, 8 16
blastmeros) , productos del clivaje de los anteriores, iba incrementndose en proporcin en
la suspensin analizada.
Dentro de la suspensin analizada s encontraron embriones que tenan nmero impar de
blastmeros; esto se debera a que estos embriones murieron antes de completar su clivaje
dejando el embrin con el nmero de blastmeros incompletos.
En los estadios ms avanzados que se analizaron tambin pudo encontrarse una variacin
proporcional entre las blstulas y gstrulas presentes en la suspensin de embriones, el
nmero de blstulas en un inicio fue mayor al de gstrulas lo que se explicaba con el hecho de
que estas provendran de los embriones que continuaron con su desarrollo que estuvieron
clivando el da anterior, y que finalmente se diferenciaron en el blastodermo y blastocele; este
tipo de embriones se les reconoca por el movimiento de rotacin sobre su eje; al ser estas de
forma casi esfrica; a diferencia de las gstrulas su movimiento es en tirabuzn.
El nmero de gstrulas conforme avanzaba el tiempo iba en aumento y el de blstulas en
decrecimiento, esto nos indica que las blstulas estn diferencindose a gstrulas. Esto se
observ en los ltimos monitoreos; en uno de estos ltimos monitoreos pudo distinguirse que
algunos embriones empezaban a adquirir la forma de prisma.
En revisiones posteriores se hubiera esperado encontrar larva pluteus producto de la
diferenciacin del embrin en prisma, lo que no se pudo realizar en esta prctica.
Los efectos observados en las blstulas sometidas a soluciones de ua de gato (altas
concentraciones), sufrieron dao; no ocurri exogastrulacin.
CUESTIONARIO

1. Explique el fenmeno de la aglutinacin
La aglutinacin de los vulos sin capa gelatinosa es mediada por la bindina, esta es una
protena acrosmica que se encarga del reconocimiento en los erizos de mar. Esta es capaz de
unirse a los vulos sin capa gelatinosa de la misma especie; esta interaccin es relativamente
especfica de especie.
La bindina est localizada especficamente sobre el proceso acrosmico; lugar donde estara
para el reconocimiento entre vulo y espermatozoide. Existen estudios que demostraron que
las bindinas de especies de erizo de mar estrechamente relacionadas son en efecto diferentes.

2. Existen cambios fisiolgicos internos en el huevo luego de la fecundacin?
Luego de la fusin entre el espermatozoide y el ovulo del erizo de mar se activa los bloqueos
de la polispermia: el rpido, iniciado por el ingreso de sodio a la clula; y el bloqueo lento,
iniciado por la liberacin de Ca
2+
intracelular; esta activacin interna del cigoto es dependiente
de la concentracin de Ca
2+
dentro del cigoto; esta liberacin que es causante de la liberacin
de los grnulos corticales es tambin responsable del reingreso del cigoto al ciclo celular y de
la reactivacin de la sntesis de protenas en el cigoto. Los niveles de Ca
2+
en el cigoto se
incrementan desde 0.1 a 1 M, en la mayora de las especies se produce como una onda o
sucesiones de ondas que se mueven a travs del cigoto comenzando en el sitio de fusin del
espermatozoide con el gameto femenino.

3. Si desearamos estudiar la accin de una sustancia animalizante. Qu sustancia
propondra? Cmo realizara el experimento?
Se podra utilizar sulfocianuro de sodio tiene efecto animalizante, es decir, cuando un huevo
de erizo de mar se pone en presencia de esta sustancia, se obtendr un sistema que estar
muy animalizado; esto se verificara por al presencia de una blstula hiperciliada; estos e
explicara porque esta sustancia qumica inhibe el gradiente vegetativo y potencia el gradiente
animal, se puede decir que se potencia el metabolismo glucdico, que predominara en el
hemisferio animal, en contraste en el hemisferio vegetativo predomina el metabolismo de las
protenas.
Para realizar el experimento se tomaran embriones recin fecundados, y se le cambiara el
medio a uno que contenga esta sustancia (sulfocianuro de sodio) y seguir un monitoreo en
bsqueda de cambios en la formacin de la blstula.

4. Qu sucedera si tratamos huevos de erizo de mar con actinomicina D? Esto
influira en la organizacin del huevo?
Se conoce que las fases iniciales del desarrollo embrionario de organismos como el erizo de
mar est regido casi por completo por informacin presente en el vulo antes de ser
fecundado. Es por ello que si embriones de erizo de mar expuestos durante tiempo suficiente a
actinomicina D, para inhibir la sntesis de RNA sin bloquear la de la DNA, se desarrollan
normalmente durante las fases iniciales , sin cambiar su programa de sntesis proteica. Esto se
debe a que un ovulo no fecundado contiene una gran cantidad de mRNAs enmascarados por
protenas, de forma que se impide su asociacin con los ribosomas que tambin estn
presentes. Tras la fecundacin, de alguna manera este mRNA es desenmascarado de forma
controlada, y comienza a dirigir la sntesis proteica. El desarrollo del embrin puede, por tanto,
comenzar inmediatamente despus de la fecundacin, sin tener que esperar a la produccin
de mRNAs de origen paterno
(9)
.


REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS


(1) Ivan Fuentes y Claudio Barros, Larval development and metamorphosis of cultured
Tetrapygus niger (Echinodermata Echinoidea): an uncommon form of echinoplutei

(2) http://valoraciencia.ucn.cl/guia/10-profe-erizo.pdf

(3) Scott F. Gilbert, Biologa del desarrollo

(4) Frank J. Dye, Dictionary of Developmental Biology and Embryology

(5) http://cursosvirtuales.cfe.edu.uy/semipresencial/file.php/1/01/Primero/8113Organiza
cion%20celular%20y%20tisular/paginas/unidades/unidad_3/temas/Unidad35/anexos/
anexo2.pdf

(6) M. F. Barker, Echinoderms 2000: Proceedings of the 10th International Conference,
Dunedin

(7) T. Yanagisawa, Biology of Echinodermata

(8) http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1440-169X.1956.tb00058.x/pdf

(9) http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r60761.PDF