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LES ME,'CANISMES IM'OLE.

CU ILAIRES FON DAM ENTAUX D,E LA GENETIQUE



OUS <lyons droit au Chapitre 3 les multiples aptitudes. des proreines, 'lui peuvenr [ouer dans les cellules le role de machineries rnoleculaires et de regulateurs, de catalyseurs er de constituanes srructuraux. Dans ce chapitre, nous all\0115 nous - eresser aux acides nncl~i,qllcs. Ces macromolecules (1) portent

- rmation dctermhtant 13 sequence d'acides nmines, et par

·equent la structure et la foocrion de routes les proteines de [a

ule, (2) entrent dans la composition des rructures cellulaires !>lelectionnent et alignem les acides amines dans l'ordre correct ours de 13 fonnarlon d'une chaine polypeptidique et (3) carat de nombreuses reactions chimiques Iondamenrales dans les

ales, entre autres la formation des liaisons peptidiques entre Irs antilles au cours de la syruhes:e proteique,

L'aride desoxyribonuc1eique (ADl'-J) conrlent teure I'informanecessaire pour construire les eellules et les tissus d'nn orgae .. La replicatione acre de cerro information chez n'importe e espece lui garantit une continuize genetigue d'une generaa I'autre ct est essentiellc au develcppement normal d'un idu, Uinforrnation presents dans I'ADN est nrganisee en

5 de I'heredite, que I'on appelle des genes. Ceux-ci dererrni. res caracteres propres a un crganisme, Au cours du procesdetranscriprion, l'information stockee dans l'ADNcstc:opiee

la forme d'acide rihonueleique (ARN),. qui intervienr a. trois e:lIUX dans Ia synrhese des proteines,

L"ARN messager (ARNm) pone les instructions eonrenucs lement dans I'ADN, qui specificne I'ordre correct des. acides nes au cours de la synthese proteique, L'assernblage sequeruiel remarquablernent precis des acides amines en proteines III Lieu cours de 13 traduction de l'ARNm. Pendant ce processus, Pin-

smation de I' ARNm est interpreree par lID deuxieme type -ilL'\! appele ARN de transfert (ARNt) a l'aide d'une troisieme

-te d'ARN, l'ARN ribosomial (ARNe) et des proreines qui lui

associees, A. mesure que les acides amincs corrects sent

Una mi<:rograplttie eleetronique d'un A.DN [fIecheverte)en tours. de transcrip.tionen ARN (fleehe rouge). 10, L. Miller, Jr. & Barbara R. Beatty, Oak Ridge Netional taboratorv.l

apportes par les ARNt a. Ia sequence en cours cI'lHongariol1, ils sont associes les uns aux autres par des liaisons pepridiqucs afin de former des proteines,

La decouverte de In structure de l'ADN en 1953 et plus tard, de la fa~.(lL1 dent J'ADN commande la synrhese d'ARNqui se poursuit par I'assernblage des proteines - ce que: 1'011 appelle le dogme central - furent des avaneees considerables qui marquerent Ie debut de la blologie moleculaire, Cependanr, la representation simpliIice du dogme central par AD . ~ ARN·~ proteine ne refleee pas Je role exact des proreines 3.UCOLI.rs de la synrhese des acides nucleiques. De plus, comme nous Ie venom; dans des chapirres ulterieurs, Ies proreines assumenr une grande responsabilite dans la regulIJtiol1 de l'expression des genes, le processus par lequel l'informarioo codee dans l' ADN esr decodce pour former les differentes proniines propres a chaque type cellulaire,

SECTIONS

4.1 La structure des addes nuelelques

4 .. 2 Latranserlptlen desgenes codant des prob!ines at la formation de 11.'A'RNm fonction.nel

4 .. 3 Le control'e de I'expression des gimes chez les procaryotes

4.4 L.es tr·o.is )'oles de Ii'ARN dans la traduction

4 .. 5 La. synthese des proteines sur les rlbesemes, etape paretape

4.6 La rep.lic:ation de IIWDN

4.7 Les virus: des parasites du systeme genetique des eellules

1011

102 CHAPITRE 4 • Les mecanisrnes moleculaires fo.ndamentaux de la genetlque

Virus flARN

•••• rNTP

09

ARNm

Facteurs de

• traduction

ARNt

FIGURE 4-1 Une vue d'ensemble des quatre processus genetlquas moleculairesfondamentaul!. Dans ca chapitre, nous parlerons des trois processus qui conduisent a la production de proteines (:0-:111) at de la rilplication de I'ADN til) Les virus utilissnt la machinerie cellulaire de l'hote, c'est POUfQUOI ils ant [oua un rOle important dans l'etude de ces processus, Au COUfS de (a transcription par I'ARN polvrnerase c'un gene codant une proteine {D), Ie code fI quatre bases de I'ADN speciflant la sequence d'acldas arnines d'une proteins est copie en un ARN messager pracursaur (pre·ARNm) par polvrnerlsatiort de monomeres de rlbonucleoslcee triphosphate (rNTP). La retrait de certaines sequences at d'autres rnodiflcations du pre-ARNm (II). collectivement designes sous Ie flam de maturation de tARN, produisent un ARNm toncnonnel, qui est transports dans Ie cytoplasme. Au cours de la

Dans ce chapitre nOLL~ allons d'abord considerer la structure Iondamentalc et les proprieres de I'AD et de I'ARN, Plus loin, nous traitcrons des pr CeSSl!5 elementaires resume dans la Figure 4.1 ; 13 transcription de I'ADN en ARN prccurseurs, la maturation de ces precuraeurs -en molecules foncdonoelles d'ARN, la traduction des ARNm en proreines etla replication de I'ADN. Ce faisant, nous comparerons la trucrure de genes chez Ics procaryote er les eucaryore et nous decrirons Ie onrrole de 13 transcription chez. les batteries. Ceci nous pcrrnettra ensuite au Chapitre 11, d'exarniner les mecanisrncs plus complexes du conrrole de la transcription chez Ies eucaryotes. Aprcs avoir decrit brievement le role respectif des AR m, ARNr er ARNr au cours dc la synthese proreique nous detaillerons les constiruanr er les ctapes biochirniques de la traduction. Nous envisagerons egalemcnr au niveau mole ulairc les problemes potenriels lor de

----- --- =-

~ - -

traduction (8)) Ie code il quatre bases de l'ARNm est dEicodE§ dans le II langage » des protslnes. corrstitus de- 20 acides amines, Les ribosomes, las machineries rnacrornelaculairss qui traduisent le ccee d'ARNm, sent ccnstrtves de deux sous-unltes assernbleas dans Ie nucleole a partir des ARN ribosomiaux (ARNri et de multiples protemes (;} gauche). Apres leur transport vers Ie cvtoplasrne, les sous-unltes ribosomiales s'associent a un ARNm et execetent la synthiise protaique avec I'aide d'ARN de transfer! (ARNtJ et de dlfferents facteurs de traduction. Au cours de la replication de I'ADN (II) qui se produrt uniquement dans les cellules 58 praparant a se diviser; les rnonorneres de desoxyribonucleosides triphosphate (dNTP) sent polvmsnses pour former deux copies identlques de cheque molecule d'ADN chrornosornique. Chaque cellule fille recoit I'une des deux copies.

la replication de l'AnN et la machinerie cellulaire cornplexe garantissanr une copie fidele du materiel geuerique, La dernier section de ce chapitre PIe entera des informations clementaire-> sur les virus, qui sonr des organisrnes modele irnportants pou etudier la ynthese macromolcculaire et d'autres processus cellulaires.

01 La structure des acIdes nucleiques

D'un paine de YtIC chimique, l'AD er l'ARN se ressemblenr beaucoup. Leur structure primaire est Iormec de potymeres lincaire constitues de monomere appeles nucleorides, La longueur d ARN eellulaire varie d'une centaine it plusieurs milliers nucleotide. Les molecules d'AD cellula ire peuvent conren

plusieur entaines .. de millions de nucleotides. es grandes unites . ill ,a so iee.~ a des proteines, peuvent etre marquees par des orants er examinees a l'aide d'un mi ro cope photoniquc ous forme de chromosomes ainsi appeles en raison de 13 possibilite Ie colorer.

n brin d'aeide nucleique est un pol)'mere lineaire qui ssede une orientation definie

L' et I'ARN sour constitues tous deux de seulemem quarre

~;c:oriJcs differe.nrs, Comme uou 1'0.\1011:. VL/ aLI Chapitre 2, tous ucleoridc OnT formes d'une ba e organique lib': a un ucre i.i carboncs qui possedc un groupement phosphate fixe a son me .-. Dans I'ARN, lc ucre erie ribo e ; dans I'ADN ll s'agit desoxyribose (voir Figure 2-14). Les nucleotides utilises pour [a nrhese cit: I' ADN er de I' AR l contienncnt cinq basel> differcntes,

Ib)

&tnlmite 3'

o I

O-p=O

I

o

I

H2C~5'. 0 C

H H

H H

3'

o H I

-o-p=o

1

o

I

H2~O~

HPH

o H I o-p=o

I

o

I

H2~O~

H'PH

OH H

5' C-A-G 3'

::..tremit 5'

C A G

[3' 13' 13'

P~OH 5' 5' 5'

n

, 1'10- er

lson ospheer

GURE 4.2 Les f'tlJfes8ntations a ternatives d'un brin d'aclde ucleique ill'ustrant son orientation chimique. La figure presents un . ., unique d'ADN contenant ssuiernent trois bases; la cytosine (C), adenine IAl at la guanfne 16). (a) La structure chimique rnontre un -ouparnent hydroxyle au niveau de I'extrem·lte 3' et un groupement sphate au niveau de rextrermte 5'. Remarquez egalsmanl que deux

a sons phosphoester relient des nucleotides adjaeents : on designs t! eralernent ce doublet sous Ie terme de liaison phosphodiester. IbJ '}.ms la representation du hsut. les sucres sont figures par des traits vertIcaUX et les liaisons phosphodlester par des lignes obliques. Les

SsS sont indlquees par leurs sbreviaticos 6 une lettre Dans la representanon la plus simple (en bas). seules les bases sent mdiquees. Par convention, una sequence polvnucleotioiquaest toulours serite dans Ie sens 5' _ 3' (de gauche a droileJ sauf indication contra ire.

4.1 • La structure des acides nuclelques 103

Les bases adenine (A) et guanine (G) ont de purin comporranr une pairc de noyaux couples. Les ba es c)'tosine (C), thymine (T) et uracile (U) sont de pyrimidine a un seul cycle (voir Figure lIS). l'ADN et I'A onr trois de ces bases en cornrnun : A, Get C. T cependanr n'cst presenre que dans I'ADN er U seulernenr dans 1"ARN. (Ces abreviarions a une lettre pour les bases sonr cuurarnment utilisees pour designer reus les nucleotides constituanr les polymeres d'acidcs nucleiques.)

Uu brin d acidc nuclcique possede un squeleue 00 titue d'unires pentose phosphate repC-teeS, : partir desquelles les bases puriques er pyrirnidiques 'crcndcnt, sous la forme de groupemcnts lateraux, Tout comrne un polypeptide, un brio d'acide nucleique possede line orientation chimique: l'extn!mite S' presente un groupernenr hydroxyle ou pho phate sur Ie carbone 5' de son dernier sucre. L'e 'tremite 3' quanr II elle possede habitucllcmerit un groupement hydroxyie all niveau du carbone 3' de son dernier sucre (Figure 4-2). Cetre orientation, ajouree au deroulement de 181 synrhcse dans le sens S' vers 3' fait que par convention Ie sequences polynucleoridiques sont ecrite~ et lues dan Ie sen S' -+ 3' (de gauche a droite). Par exernple, la equence AUG e r supposee ctre (S')AUG(3'). Comme nous Ie verrons, l'orienration 5' _ 3' d'un brin d'acide nucleique est une propriete importame de 181 molecule. La. liaison chimique entre des nucleotide adjacents, couramment appelee liai on phosphodiestcr, est compo ee en reaJite de deux liai. (In phosphoester, l'une du cote S' du phosphate er l'aurre du core 3',

La seque.nce linea ire de nucleorides associes par des liaisons pho phodiesrer constirue la structure primaire des acidcs nucleiques, Cornme Ies polypeptides, les polynucleoridcs penvenr "enrouler ct se replier en conformations tridimensionnclles, stabilisees par des liai ons non covalcntcs, Bien que 181 structure primaire des AD- et de ARN oit generalement imilaire, leur conformations tridimensionnelles soot rres differentes. Ces diffe· ren es structurales ont e seruielle pour que ccs deux types d'acides nucleiques rernplis nr leur fonctions specifiques.

L'AON natif est une double nelice formee de brins antlparalleles complernentaires

L'ere moderne de la biologic moleeulaire debuts en 1953, lorsque James D. WatSon et Francis 11. Crick proposerent la tructure en double helice de I'ADN. Leur hypothese, basee sur des analy es de diagrammes de diffraction aux rayons X couplee a 1a construetion rigoureuse d'un modele, sc rcvela correcte, C'est elle qui nous a perrnis de comprendre le mode d . fooctionnement de I' AD en tanr que materiel genetique,

L' ADN est constirue de deux brin polynucleotidiques a 50- cie , qui s'enroulenr l'un auteur de l'autre pour former une double helice, Les deux squelettes sucre-phosphate ont a l'exrerieur de la double hcliccer les bases se projetrent vers I'imer.ieur. Les bases adjacentes dans un meme brio s'empilent les ones sur les autrcs dans des plans paralieles (Figure 4-3a). L'orienration des deux brill est antiparallile, c'est-a-dire que leurs sens 5' _ 3' sont opposes. Les deux brin colncidenr grace it la formation de paire de bases entre eux : A 'apparic avec T par deux liaisons hydrogene er G avec C par trois liai ens hydrogene (Figure 4-3b). Certe cornplcmentarite entre Ie pair de bases esr une consequence de la taillc, la forme et la crnposirion chimique des ba e , La presence de ces milliers de liai ons hydrogene dans une double helice d' AD contribue forternent a sa stabilite, Les interactions-de van

104 CHAPITRE 4 • Las mecarrismes rnoleculalres fondamentaux de la genetique

[a]

Petit sillon

FIG,URE 4-3 La double helice d'ADN. (a) Un modele compact de I'AON 8 qui est la forme la plus caurante d'AON dans les cellules. les bases (ombrage clair) S9 projenent vers l'interleur a partir des squelanes sucre-phosphate (rouge at bleu vrf) de Cheque brin, mais leurs groupements lateraux sont accesslbles depuis Ie grand et Ie petit sillons. Les fleches indiquent Ie sans 5' 3' de cheque brin. les liaisons hydrogeme entre les bases sont au cerme de Ie structure. Le grand

dcr Waals ct It: liaison hydrophobcs entre les paires de bases adjacentes verticalement srabilisent encore davanrage Ia structure en double helice.

Dan' I'ADN narurel, A s'apparie toujours avec T et G avec C par le biais de liai oris hydrogcnc, formant des paircs de base. A.T et G.C COmIDe Ie rnontre la Figure 4-3b. Ces a. sociations entre une purine et unc pyrimidine plus petite sont souvenr appelees paires de bases de Watson-Crick. D ux brins polynucleotidiques lou de regions de eu -ci) dans Ie que! les nucleotides forment ces paires de bases sont dies complementaires. Toutefois, en theorie et dans des AnN synrhetiques, d'aurres paires de bases peuvent etre Ionnees. Par ex emple, tine guanine (purine) pourrait rheoriquernenr etablir de liaisons hydrogene avec une thymine (pyrimidine) ne provoquant qu une faible deformation de I'helice. L'espace disponible dan, l'helice devrait egalernent perrnettre l'appariernenr entre Ics deux pyrimidines, cytosine et thymine. Bien que l'on ne rencontre generaleme t pas de paires de bases G-T et C·T dans I'ADN, les paires de bases G.U ant assez couranres dans les regions en double helicc qui e formenr dans les ARN par ailleurs imple brin.

Dans les cellules, la plus grande parri de I'ADN e t au forme d helice droite, Le diagramme de diffraction aux rayons X de I'AD indique que les bases empilee sont regulieremem

(b)

et Ie petit sillons sont alig.nes grace a des donneurs et des accepteu potsntlels de liaisons hydrogeme (en [eune). (b) La structure chlmlq de la double hellce d'AON, Ce schema eclare mantre les deux squelettas sucre-phosphate et les liaisons hydrogene entre les caires - bases de type Watson-Crick A·T at G·C.IParue (al d'apres R. Wing er a 1980. Nature 287.755: partie (b) d'apres R. E Dickerson. 1983. SCI. Am. 249, g.t

espacees de 0,36 om le long de l'axc de I'helice, L'hellcc effectu un tour complet tous lcs 3,6 11m, c'est-a-dire qu'elle contienr environ 10,5 paires de bn e par tour. C'e r Cf' que l'on appelle , [orme B de I'ADN qui csr la forme norrnalernent prcsente dans plupart des segment d'ADN cellulaire. ur la partie exrerne d !'ADN de forme H, les cspaces entre les brins cntrelaces creenr deux ilIons helicoidaux de largcur climreme, appeles grand sillo et petit sillcn (voir Figure 4-3;1). Par con equent, le atornes qui depa ent de ces ba es dans les sillons om acccssibles de l'exrerieur de l'helice, formanr ainsi deux urfaces de liaison. Les proreines de liaison a I D pcuvent « lire" la sequence de ba dan I'ADN double hrin en se placanr all contact des atomes d grand Oll du petit sillon,

En plus de la forme B predominante, trois autres tructur .... d'ADN ont ere decrites. Deux d'entre elles sonr cornparees d !'ADN B dans la Figure 4-4. Dans des conditions de tre faible humidite la tructure cri tallographique de I'ADN B sc change en tonne A. Des helices ARN-AD-N ct AR N-ARN existent SOLIS cene forme dans les cellules ct in vitro. De courres molecules d'ADt-. con tituees d'UIlC altemancc de nucleorides purine-pyrimidine (en particulier des G ct des C) adoprenr une configuration alternanve en heli e gauche. Cette tructure C t app J 'c ADN Z ar les bases sembl at former on zigzag IOfsqu'OI1 les rcgarde de COte. Certains

clement . .; uggerent que de I'AD Z pourrait Crre present dans lcs cellules, merne si l'on ignore on role evenruel. .,nfil1, une structure triple-brin d'AD~ est creee lorsque des polyrnercs synthetiques

(a] ADN B

rb)ADN A

(cl ADN Z

FIGURE 4-4 Des modeles de structures connues dans I'ADN. Las squelettes sucre-phosphate des deux orins, qui sont a l'exterieur dans toutes Ies strvctures, SOn! indiquBs en rouge et en bleu. Les bases (omhrages clairsl sont oriaotees veTS ,'Interieur. lalla 'forme 8 de /'ADN comprend ~ 10,5 paires de bases par tour d'helca. Des paires de bases adjacentes ernoltsss les unes sur las auues sont dlstantes de 0,36 nrn, (bl La forme A plus compacte de I'ADN possede 11 paires de bases par tour, qui sont tres lncllnses par rapport li "axe de l'helice. (c) L'ADN Z

nul UIIU JtlU81~ ~!liM ~~U~~ .

Pn;;Jt6ino doo lI.s.ioQIl b. I ... battu TATA

,FIGURE 4·5 La courbure de I'ADN resultant de' 18 n .. lsen d'ulle protelne. Le domaine Cvterrrnnal conserve de la proteina de liaison a la bette ATA rrBP) se fixe dans Ie petit sillon, au niveau de sequences specifiques d'ADN. riches en A at T, deroulant la double helice at lui imposant Una forte eourbure. La transcription de la plupart des genes eucaryotes necessits la participation de la TBP, IAdapts de D. B, Nlkolov &

S. K. Burley, 1997, Proc, Natl, Acad. Sci, USA 94:15,1

4.1 • La structure des acldes nuclelques lOS

de poiY(A) et de polyde o. y{ ) ont melanges dans un rube a c sai. De plus des segments homopolyrneriques d'AD~ consntues de resides C er T dans un brin et de residus A er G dans l'autre peuvent former une structure a trois brins en se Ham a des fragmerits correspondaurs de poly (C+ T) synrherique, De relies structures ne se forrneor probablcmenr pas naturellement dan lcs eellules mais pourraicnt servir d'agenrs rherapeuriques,

Les modifications de loin les plus irnportantes dans 101 strucrure standard de !'ADN de forme B resulrenr de la fixation d'une proreine 3 des sequence pecifique d'AD . Bien que la rnultitude de liaisons hydrogene ct hydrophone" entre les ba e a urc line cerraine srabilirc a I'ADN, la double helice est flexible Ie long de

on axe longitudinal. Au contrairc de l'helice a des proreines (voir Figure 3-3) it n'y a pas de liaisons hydrogene paralleles a l'axe de l'hclice d'ADN. Ccrre proprictc penner n j'ADN de se plier (DrSqu'ilestcomplexe a nne proteine de liaison a. l'ADN (Figure 4-5). La courburc de I'ADN est essenrielle it I'ernpaquetage dense de I'ADN Suus forme de chromarine, qui est Ie complexe AD - proreine SOllS la forme duquel on trouve l'ADN nuclcaire dans les cellulcs eucaryotes [Chapitre 10).

Les brins d'ADN peuvent se separer' de rnaniere reversible

Au cours de la replicarion et de la transcription de I' ADN, lcs brins de 13 double helice doivent e eparer pour permertre aux parties internes de bases de s'apparier avec [es bases des nudeo[ides a polyrneriser en nouvelle chaines polynucleoridiques. Nous deerirons plus loin le rnecani mes cellula ires qui eparenr puis reassocienr les brins d'AD ' au cours de 13 replication er de la transcriprion. Dans cette partie, nous traiterons des Iacreurs

influCll!am la -r= ella rea~~o~lation ot~ brin~ U'~D In

uitro,

Lc deroulement N la . epaJ'3tion des brins d'AD ,que 1'011

.:::.ppellp d_e.ndt-ur~h.t"l'ri nil ... fUQ;t\n .. (,.",..!-tjn_g t:"n .:1n,f";1 ; ... ). f'€'\.'IVC1'l.C CtrC provoques expeeimenralcmcnt en clc\rant fa rcmpcrature clans une solution d'ADN. L'augmentation de l'energie therrnique provoqLle I'accroisser-rent de l'agirarion moleculaire, ce qui finit par rompre les liaisons hydrogcnc et lcs autres forces srabilisanr Ia double helice. Les brim. se epa rent alors et s'eloigncnr l'un de l'autre en raison de In repul ion electro rtarique des quclctres desoxyribosc-pho phate charges negativement dans chacun d'cux, Lorsqu'elle est voisine de la temperature de denaturarion une legerc augmenrarion de la temperature du milieu entraine la pcrtc rapide et quasirnent imultanee des multiples interactions faibles mainrcnanr lcs brins ensemble sur toure Ie longueur des molecules d'ADN. Ceci provoque un changement brusque de l'absorption des rayons ultraviclers (Figure 4-6a).

L.1. temperature de fusion, Tm, it laquelle les brins d'ADN e separent dependde plusieurs facteurs. Les molecules contenant une forte proportion de paires G-e se denarurenr a des temperatures plus elevees, car les trois liaisons hydrogene dans lcs paires G·e rendeut ces paires de base plus stables que les paircs A-T qui n'en cornporrent que deux. De ce fait, on peut estirner le pourcentagc de paires G-e dan. un echantillon d ADN d'apres on Tm (Figure 4-6bl. La concenrration ionique influence egalemcm Ie T", car les groupemenrs phosphate charges negarivement dans les

deux brins sont proteges par les ions posicifs. Si I.a concentration

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Trn (OC) 106 CHAPITRE 4 • Les mecarusrnes moleculaires fondamentaux de la genMique

(a)

1,0

E

·c

o <0 N

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,QJ

'E

~ 0,75

Temperature laC)

FIGURE EXPERIMENTALE 4-6 La temperature it laquelle un ADN se denature augmente avec la proportion de palres G·C qu'il contiient, la) La fusion d'un ADN double brin peut etre suivie par l'absorption de rayons ultraviolets a 260 nrn, Lorsque des r~gion.s d'AON double brin sa saparent, l'absorption de la lurntere par cas regions double quasiment. La temperature a laqualle la rnoltie des bases d'un

ionique est faible, cette protection diminuc, ce qui augmente les forces de repulsion entre les deux brins er abaisse Ie Tn,' Les agents destabilisant les liaison, hydrogene, rels que le formam ide ou l'uree, abai enr egalement lc T rn- Enfin, les pl I extremes entrainenr la denaturation de I' AD ' it faible temperature. A pH bas (acide), Ies ba 'cs sont proronec et done hargees positiverncnr, ce qui provoque leur repulsion. A pH eleve (alcalin), le bases perdent leurs protons er se chargent negativernenr, se repoussant une fois encore en raison de leur charge similaire,

Lt:S molecule d'ADN simple brin creees par la denaruradon se courbent de £a~nn aleatoire, san structure organiscc. En abaissane 13 temperature, en augmenrant la ccnccnrration ionique ou en ncutralisant le pH, Ie deux brio cornplementaires se rcassocient en une double helice parfaite, Vampleur d'une telle renaturation depend du temps, de la concentration d' ADN et de la concentration ionique, Deux brins non ccrnplemcnraires d'AD rcstenr a I'etat de structures non organisee et ne e renaturent pas. Une chose importanre est qu'ils n'empechent pas deux brins complerncnraire cl'ADN de e [TOUVer et de se renarurer, La denaturation et la renaturation de PAD ant a la base de l'hybridarion des acides nucleique , une technique rres utile pour etudier la ressernblance entre deux -ecbanrillons a'ADN et pour detecrer et isoler des molecules specifiqucs a'ADN dans Wl melange con tenant de nombreu e sequence differentes d'ADN (voir Figure 9·16).

Un grand nombre de molecules d'AON sont circulaires

De nornbreux ADN genomiqucs procaryotes et AnN virau soar de molecules circulaires, On observe egalerncnr des molecules circulaires d'AD dans le mitochondries, qui sam presentcs dans presque to utes les cellules eucaryotes ainsi que dans lcs

echantrllon d'ADN double bnn sont oenaturaes est appetee Trn (temperature de tusion), L'absorpticn de iumism par un ADN simple brio change beaucoup moins a mssure que la temperature auqments. Ib) La T'Oi est fonction du contenu en G.C de I' ADN ; plus le pourcentage de G + C est important, plus Ie Tm8St sieve.

chloroplastcs que 1'0n trouve chez Ies planres ct certains eucaryotes unicellulaires.

hacun de' deux brins d'une molecule circulaire d' AD forrnc une rrncrure ferrnee ans extremire libre. Le deroulemerrr local d'une molecule circulaire d'ADN qui se produir au cours de 13 replication, induit unc contrainte de torsion dans Ie resre de la molecule car les exrrernites des brim ne peuvenr ruurner librernenr. Par consequent, la molecule d'AD 'enroule sur ellememe, cornme un elastiqllc cnrorrille, formant des supertonrs (Figure 4-7bj. En d'autres tcrrne , lorsqu'une partie de l'helice d'ADN est deroulee, Ie restc de la molecule est uperenroule. Les cellules bactericnnes er eucaryores po edcnc cependanr line enzyme, la topoisomerase 1, capable de relacher les contrainres de torsion qui apparais ent dans les molecule, d' AD cellulaire au cours de la replication ou d'autrcs processu s, Cctte enzyme c fixe a !'AD au niveau de sites aleatoires er romp! une liaison phosphodiester dans un brin. UI1C telle cassure simple brin dans J'ADN s'appelle une coupure (nick en anglais). Une extrcmhe du brin coupe tourne auteur du brill intact, ce qui upprirne les upertours (Figure 4-7a). Enfin, la rnfrne enzyme relic les deux cxtrernires du brio secrionne. Un autre type d'cuzyrne, 13 topoisomerasa Il, rompt les deux brins d'UD ADN double brin, puis Ie ressoude, Cr.ke a ce mecanisme, certe enzyme pcur supprirncr les conrraintes de tor ion er lier ensemble deux molecules circulaires d'AD comme les maillons d'une chaine.

Bien que I'ADN nu Icaire eucaryore soit lineaire de longue boucles d ADN sont rnainrenues par endrolr dans les chromosomes [Chapitre 10). Ceo pcut provoquer l'apparition d'une ontraintc de torsion et la formation consecutive de superrours au cours de la replication de I'ADN nucleaire. Comme dans les cdlu! bacteriennes, des molecules abondanres de ropoisomerases r dans les noyaux eucaryote supprirnent dans l'AD nucleaire, le conrrainres de torsion qui apparaitraienr en l'absence de certe enzyme.

- - - - -

differents types d'ARN presentent des

rmations variees en liaison avec leurs fonctions me nous l'avcns die precedcmrnenr, la structure prirnaire de res emble a celle de I' AD a dell exceptions pres: Ie sucre nrre dans la composition de I'ARN, le ribo e, possedc un

pernent hydroxylc en position 2' (voir figure 2-14b) et la thy. dans 1'ADN est rernplacee par de l'uracile dans l'AR . Le pcment hydroxyle sur Ie C2 du ribose rend ]'ARN chimiqueplus labile (instable) que J'ADN et cousrinre un grcupernent ique rcacrif irnplique dans la catalyse par l'inrcnncdinire de :\. 11 rai on de certe labilite I'ARN est clive en 1110110- [ides par une solution lcaline, e qui n'est pas le as de . A l'instar de J'ADN, J'ARN est till long polynucleotide qui

• ~rrt: double u simple brin, lincairc ou circulaire, U peur egant former une helice hybridc avec un b-in d'ADN. Commc I'avons vu plus haut, lcs doubles helices ARN-ARN et ADN. om une conformation cornpacte cornme la forme A de " [voir Figure 4-4bl.

u contra ire de I' AD qui exisre essentiellement sous forme iuble helice tres longue, la plupart des ARN cellulaires sont

pie brins er presenrent de multiples conformation

~ e 4-8). La diversite des tnilles et des conformations des dif. types d'ARN leur permet de rernplir des fonction specidans une cellule. Les stru tures secondaires les plu simple. les ARN imple brin apparaissent par appariement de bases plbnentaires. Des" boucle en cpingle a cheveux » se ferment

appariement des bases er sont longue de =0 5 a 10 nucleotides une, Des trucrures « tigc-boucle » resultenr de l'appariement

)

,/

..d"

4.1 • La structure des ac.ides nucleiques 107

FIGURE EXPERIMENTALE "'"7 Les supertours d'ADN peuvent itre $upprimes par Ie clivage de l'un des hrlns, !a) Une rnlcroqrapfua electroruque de I'ADN viral de SV40. Lorsque I'ADN circulalre du Virus SV40 est isola et separe des proteines qUI lui sont assoeises. I'ADN double brin est daroula at adopts alors pour compenser, une configuration suoerenroulee, (b) Si I'ADN supsrenroule est coupe (c'est-a-dire sl l'un des brins est clive). les brins peuvent se deroutsr, ce qui entraine la perte d'un superteur. La topoisomerase I catalvse cette reaction at ressoude egalement les extrernues creees par la ceupure. Tous les supertours dans un ADN isole de SV40 peuvent eva suppnrnes grace a racnon sequantlalls de eerte enzyme, ce qui produit une conformation en cercla rel!lehe. Pour plus de clerte, les formes des molecules du bas ont ete sirnplifiees.

de bases separces de 10 a plusieurs centaines de nucleotides. Ce reploicrncnrs simples pcuvcnr cooperer pour former de tru rures tertia ires plus complexes, dont l'une s'appelle le « pseudo-nceud ".

Comme nou Ie verrons plus. en detail ulrerieuremenr, lc molecules cl'AR t adoptent en elution line architecture tridimensionnelle bien definie, esseutielle pour la sYllthe. e proreique. Les molecules plus grande d'ARNr prescntent egalemr;:nt des structures nidimensicnnelles precises, reliees par des partie intermediaires plus flexibles, Des structures secondaire er terriaires ODr egalemenr ere' observees dans l'ARNm, en partieulier pre des exrrernl[e des moleeul .. A l'evidence done, le molecules d' ARN res ernblent aux proreines par le fait qu'elles possedenr des dornaines structure relies par de egrncnts flcxibles moins trueturds .

Les dum ines replies d molecules d'ARN onr non seulcrnenr analogues aux helicc a et aux feuillers f? presents dans lc proreines, mai ils possedent egalement dans certains ca des proprietes catalytiques, On appelle ribozymes ces ARN catalytiquc . Bien que les rihozyrnes scient w~neralemenr assode a des proreines qui stahilisent leur structure, e'esr I'ARN qui jouc le role de caralyseur, Certains rinozymes, caralysenr des reactions d'epis age. II s'agit d'un processus remarquable au cours duquel une equence interne d'un AR est toupee puis retiree er lcs deux ex[remites ainsi creees sam reunies, e process liS sc deroule lors de la formation de Ia majoriee des molecules d'ARNm Ionctionnel dans les cellule euearyotes, ainsi que chez certaine bacreries et archaeba tcries, Certains I\RN ont mcme capable d 'auto-epissage; l'acrivire catalytique ham alon irucc dan la equence qui e t retiree. Te rnecanisrnes d'epis. age er d'auto-epi age scram discutc en detail

(b) Structure tertiaire

108 CHAPITRE 4 • Les mecanismes rnoleculaires fondarnentaux de la genetique

FIGURE 4-8 Las structures secondaire at (a) Structure secondaire tertiaire de I'ARN. (a) Des structures tigB-

boucle. des epingles a chevaux er d'autras

structures secondaires peuvent se termer

par appariement de bases appurtenant a des

segments cornplernentaires eloignes dans une rnerne molecule d'ARN. Dans les structures tige-boucle, la boucle simple bnn au milieu de la tlge helico'idale double brir peut stre longue de centames. voire de rrnlhers de nucieoudes. Les boucles en apingle a che-

vaux au contraire ant un coude qui peut ne contenir que quatre nucleotides. Ib) Des psaudc-nceuos. un type de structure tertiaire de I'ARN, sont formes a la suite de t'mteraction de boucles de structure secondaire, grace a I'appariement de bases complementaires (en vert at en blaul. Seules les bases appariees sont figurees Un schema de structure secondaire est presente a droite. IPartie (b) adaptee de P J. A. Michiels et ai, 2D01, J. Mol. Biol,310'11091

.J /BOUcleen \epingle' 81 cheveux

Tige en double hetica

Structure tige-boucle

au Chapirre 12. Comme nou le verrons plus loin dans ce chapitre, l' ARNr joue un role catalytiquc lors de la formation des liaisons pepridiques aucours de la synthe 'e proreique,

Dans c chapitre, nous nous couccnrrerons sur Ie rille de l'ARNm, l'ARNt et j'ARNr dans l'exprcssion de. genes. Dans des chapitres ulrcrieurs, nous rcncontrerons d'autres ARN, souvenr asso ies a des proreines, qui participent a d'autres Ioncrions cellulaires,

CONCEPTS CLES DE LA SECTION 4.'11 La structure des, acides nudeiques

• L'acidc desoxyribonuclcique (ADN) est Ie materiel Senetique. 11 porte l'inforrnarion neces aire pour specifier les sequences d'acides arnines des proteines, Il se transcrit en plusieurs types d'acidc ribonuclei Jue (ARN), qui cornprennent I'ARN messager (ARNm), !'ARN de transferr (ARNt) et I'ARN ribosomial (ARNr), intervenant dan' la synthese des proreincs (voir Figure 4.1).

• L'ADN cr I'ARN sonttous deux de longs polymeres non ramifies consritues de nucleorides. Ceux-ci sonr forme d'un pento e pho phoryle lie :'i une base organique, qui est oit une Pl1- rille, soit une pyrimidine.

• Les purines, adenine (A) et guanine (G) er la cytosine (C) qui csr une pyrimidine sonr pre rente 11 la foi dans I' A DN er l'AR . La thymine (T), LUlC pyrimidine prcscnte dans I'ADN, est remplacee dan t'ARN par l'uracilc (U), une autre pyrimidine.

• Les nucleorides adjaccnrs dans un polynucleotide sont relies par des liaison. phosphodiester Le brin complcr present une orientation definie , l'extremire 5' porte U11 groupernent hydroxyle lJU phosphate libre sur lc carbone 5' du sucreet I'exIn!mite 3', un groupemenr hydro yle Iibre sur Ie carbone 3' du sucre (voir Figure 4-2).

• L' AD narurcl (ADN B) conticnt deux brins polynucleotidiques complemcntaires er anriparalleles. lis ont enroule r!!gulie-If'mc>nr /'1111 amour de l'autre, formant ainsi urte double helice droire, Les base' onr ii I'interieur de cclle-ci er le deux squclettes sucre-phospbare, i'i I exrerieur (voir Figure 4-3).

Boucle 1

3'

'd

d lige 2

oucle 2

lige 1

J

5' Pseude-nceud

L'upparicmenr des bases entre les brins er les interactions hydrophobes entre des ha es adjaccntes dan I rneme brin rabiIi em certc structure native.

• Le bas es prescnrcs dans le acidc nucleiques peuvent interagir par le biais de liaison hydrogene, Les paires de bases 5t01ndard de Watson-Crick sonr G- (dans I ADN er I' RN), A-T (dans I'ADN) ct A-U {dan l'ARN}. Lappariernent des bases stabilise les tructurcs tridimeusionnelles natives de I'ADN cr de I'ARN.

• La liaison de proteine a I AD peut defonner sa . rructure helicoldale provoquanr une courbure locale ou Ie deroulement de la molecule d ADN.

• La chaleur eutraine la separation (denaturation) des brin d'ADN. Lc temperature de fusion Tm de I'AD T augmentc avec le pourcenragc de paire de bases ,.C. Dans des conditions adequates, lcs brim cornplemcnraires scpares d'acides nucleiques peuvcnr se renarurer,

Le molecules circulsires d'ADN peuvenr etre cnroulecs ur elles-rnemes, formant alors des supertour (voir Figure 4-7). Des enzymes appelees topoisomerases peuvcnr reldchcr les contrainres de torsion et supprirner les superrours des molecules circulaire d'ADN.

• Les A1 N cellulaires sent des polynucleorides simple brin donr certains ferment des structures econdaire ct tertiaire bien definies (voir Figure 4-8). Ll e iste de AR ,appele ribozymes, qui posscdent une aetivitc catalytique,

If I La transcription des genescodant des protelnes et la formation de PARNm fonetionnel

La definition clcmentaire d'un gene est" une un ire d'ADN qui conrienr I',information nece saire pour pecificr la synrhese d'une scule chaine polypeptidiquc ou d'un ARN fonctionnel (tel qu'un

1... - - -- ~~ - - - - - - .

, "

4.2· La transcription des genes codant des proteines et la formation de l'ARNm fonctionnel 109

ARNt} », La grande majorite des genes portent I'information perrnertant la synthese des molecules de proreines et ce ont les copies d'ARN de Ct!S gimes codant des pmteill(!s qui constituent les mole-

ule J'ARNm des cellule, Les molecules d'ADN des petits virus ne conticnnenr que quelquc genes, tandts que la molecule unique de chacun des chromosomes des vegctalllc et animaux supericurs peut comporter plusieurs rnilliers de genes,

All cours de la ynthese d'I\RN, Ie langage ii quatre ba es de I' '\DN contenant A, G, er rest simplernenr copie au transcrit dan: le langagc a quaere ba 'e~ de I' ~ qui est idenrique, a l'e - eprion de T qui est remplacce par U, Au conrraire, au cour de la nIDi: e proteique, le langage a quarrc bases de I'AD ct de :\R est traduit dans le langagc des proreines, qui comporre 20 cide amines, Dans cettc section, nous 110US inrdresseron a la for-

arion des ARNm foncrionnel a partir de genes codanr des prozeme (voir Figure 4-1, ctape 1). Un processus similaire abourir .t precurseurs des ARNr er des ARt\t codes par des genes ~ "\R ret d'ARNt, Ce precurseurs sont ensuirc modifies p ur

rmer des ARNr et ARNr foncriounels (Chapitrc 12).

n brin matrice d'ADN est transcrit par I'ARN Iymerase en une chaine cemplementalre d'ARN

u cour de la rranscriprion de I'ADN, un brin d'ADN sert de ice (de modele), determinant l'ordre dans lequcl lc 11\0no-re de ribonucleosides triphosphate (rNTP) sont po.lyrneriscs ar former une chaine complerncnraire d'ARN, Lcs bases du n rnatrice J'ADN r'apparienr avec Irs rNTP entrants cornpleenraires qui sonr cusuite relies I~ uns aux autres P:Jf une reacn de polymerisation catalysee pal' unc ARN polymera e. La .1, merisarion implique l'attaquc nuclcophile de I'oxyg~nc en 3' la haine d'ARN en conrs dc ymbe e sur le phosphate a du urseur nucleotidiquc qui doit etre ajoute ensuit . Ceci aboutit formation d'unc liaison phosphodiester er a la liberation de

-phospbate (PPj), En raison de cc rnecani me les mol' cul s ;-.; ont reujours synrherisees dans le sens 5'~J' (figure 4-91. D'UI] point de vue energcriquc, la reaction est nerremcnr en ur de l'addirion de ribonuclemides a la chaine d' ARN enCOUfS

'elonganon, car la liaison riche en energie entre les phosphates 0: 'de rnonorneres de rNTP est rernplacee par une liaison phosJie rer d'energie plus foible entre lc nucleoridcs. L'equilibr de reaction est encore davanrage deplace ver l'clongarion de la

nc par la pyrophosphatase, une enzyme qui caralyse Ie clivagc

u PP1 libere, en deux molecule de pho phare inorganique, C.ornme les deux brins cl'ADN, l'orientation du brin rnarricc d'ADN et celle du hrin d'ARN en cours de synthese qui lui est apparie soot opposces,

Par convention, Ie sire all nivcau duquel I' ARN polymerar e commence la rranscriprion CSt rturnerote par -+- 1. En aval designc lc

en dans lequel LIn brill marrice d'AD csr rranscrlt (ou un hrin d' ARNm traduit}. Par consequent, une sequence en aval est orionree vers l'extr4!mite 3' en parrant du ite de debut de In transcripcion, lor qu'on considere le brin d'AD de meme p larit' que I'ARN rranscrir. En amonr de igne le sen inverse. us position nucleoridiques en aval dan la sequence d'AD a partir d'un sire de depart sent indiquees par un sigrie positif (+) ; celles qui sont en amont, par un signe negarif H.

3'

-I Base

Brin d'ARN en cours de synttll~se 5'~3'

o

5'

I O-P=O I

I~ase 00

H H

H H

Oil 0

I O-P=O I

o

Base

3' H

OH OH

\ POlym~isation 0 0

~1Ia. lip II"{

O-P-O-P-O-p-O

I I I

o 0- 0-

OH

rNTP entrant

FIGURE 4-9 La polymeris81ion des ribonucleotides par rARN polymerase au cours de la transcription, Le ribonucleotide qUI don ette ajoute a I'extremite 3' d'un brin d'ARN en cours d'elonqanon es 6\lecifie par l'auoariernent entre la base suivante dans le hrin rnatnce d'ADN at Ie ribonucleoside tnphosphate (rNTP) entrant complemental' reo Une liaison phosphodiester est creee lorsqua I'ARN polymerase catalvse une reaction entre Ie 3' 0 du brin el1 COUFS de svnthese et Ie phosphate er: d\m rNTP apparie correctement. Les brins d'ARN sont toulours synthl!tises dans Ie sens 5' _ 3' et ont una onentaticn rnverS6 de celie des brins d'ADN qUI leur servent de matrice.

Les etapes de la transc.ription Lor de la tran: criptiou, l'AR polymerase rcrnplit plusieurs foncrions disrincte > omme Ie decrit la Figure 4-) O. Au COUfS tie I 'initiation de la transcription, I' ARN polymerase reconnait un site specifique de l'ADN double brin, que l'on appelle un prcmoteur, er s'y fixe (e[ape I), us ARN

B r i

n

m a

~ -jBasej

i e e

d

.

A D

N -IBase

~IBase

5'

110 CHAPITRE 4 • l.es rnecanisrnes moleculalres fondamentaux de la genetlque

FIGURE 4·1'il' Las trois ,etapes de la transcrip' tion. Au cours de l'irtltiauon de la transcription, I'ARN polymerase forme una bulle de trartscripticn et commence la polvrnerisation de rlbonuclectldes (rNTP) au ruveau du site de debut de Ie transcription. qUI 8St SltUB dans la region promorrice. Une fois la r(~gion d'ADN transcrite. las brlns separes se rsessoclsnt en una double helice, dep!acant I'ARN naissant a I'exception de son extremita 3' L'extrerrute 5' du brin d'ARN quirte I'ARN polymerase an passarrt par un canal dans l'enzvrne La terminaison S8 produit lerscue la polymerase rencantre une sequence spscifique de terrrunaison (site d'arr€!tl. Voir Ie texte pour plus de details.

Site de debul sur Ie brin matrlcs

SUe d'arret sur Ie brin matrlce

AAN polymmsa

;INIITIIATION

01 La polymerase se fixe

- - a la sequence prcmotriee dans I'ADN double brin.

g Complexe ferma"

Promoteur

II La polymera.se separe !ss deux brins d'ADN pres elu site de debut de Ie transcriplion, formant une bulle de transcription.

ee Com,plexe ouvert ..

.. ~~~~~~~~~5' S'

transcriptien

La polymerase catalyse III. liaison phosphodiester entre les deux

premiers rNTP.

ELON.GATION

La poly,merase avance dans Ie sans 3'-45' du brin malrioe, separanl Jes deux brins d'AD.NI et ajoutant des rNTP a I'AAN naissant

II

TEFIMINAISON

III

Au nlveau du sr!e d'arret de la transcription,

III. polymerase libera I'ARN tarmine at se dis-socle de I'ADN

iBrin d'AHN termine

polymerases nuclealres ODt besoin de. differcnts facteurs proreiq ues, a ppeles facreurs gcneraux de la transcription, pour les aider a. localiser les promoteurs ct.at inirier la transcription. Apres s'etr.e fiX'ec it un promceeur, II' A RN polymerase separe Ies hrins d' ADN afln de rendre les bases du brin matrice disponibles pour s'apparieravec les ribonucleosides triphosphate qu'elle polyrnerisera ensemble. Les ARN polymerases cellulaires separent environ 1.4 paires de bases d' ADN auteur du site de debut de la transcriprion, qui est sirue Sur le brin matrice dans la region du promoteor (erape 2). L'initiatt!'ln de 13 transcription est considerce cornme terminee lorsque les deux premiers ribonucleotides d'IHlC chaine d'ARN sent assembles par une liaison phosphndiesrer (erape 3).

Aprcs 13 polymerisarion de plusieurs ribomrcleotides, I'AR polymerase sc dissocie de l' ADN promoteur et des facteurs generaux de: la transcription .. Au coors del'etapc d'elDngatir}1l dr,/ brin; l'ARN polymerase se deplace d'une base a Ia lois Ie long de l'ADN rnarrice, ouvrant I'ADN double brin devanr elle dans Ie sens de SOD deplace.ment et hybridant les brins derriere elle (figure 4-10,

crape 4). Les ribonucleorides sonr ajoures un par un a partir de l'extreruite 3' de la chaine d'ARN en cours de synrbese (lIaLmmte) pendant l'clongarion du brin par la polymerase. L'cnzyme maintiem urie region dena,turee d'envimn [4 paires de bases, appelee ImrIe de transcription. Environ .8 nucleorides au niveau de I.'ex.trt!mite. 3' du brin naissanr cl'ARN resrent apparies au brin marrice d'AD dans 13 bulle de transcription. Le cornplexe d'elongation, comprenant l'ARN polymerase, J'ADN matrice et le brill d'A1\N naissanr esr d'une stabilite remnrqnable, Par exemple, I'MW polymerase transcric les plus longs genes cunnus de mammiferes, contenant = 2 xl 06 paires de bases, sans se dissocier de 13 matrice d'ADN ni libeeer l'ARNnaissanr. Puisquela s)'nrhese d'ARN se deroule 11 une viresse voisine de 1000 nucleotides par minute a 37"C, le cornplcxe d'6longation doi:r rester intact pendant plus de 24 heures pour garantir La synrhese continue de I'AR.N.

Au eoars de la terminaison de la rranscriptiou qui est la dec" niere erape de 13 synthi:se d' ARN" la molecule terminee d'ARN au. ,ttallscritprimalre, e t liberee de I'ARN polymerase. Cette

4.2 • La transcription des genes codant des protelnes et la formation de l'ARNm fonc:tionnel 1111

rniere e dissocie alms de I'ADN rnatri e (Figure 4-10, crape 5). sequences specifiques dans le brin matricc d' ADN signalent it polymerase lice de terminer la transcription. Une fois Jibe-ee, \'ARN polyrneras est libre de transcrire une nouvelle fo;, le ne au un autre gene.

structure des ARN polymerases Lc ARN polyrnerases des :terics. archaehacterics et cellules eu aryote se rc emblem UCOllP, tam d'un POlM de vue structural que fonctionnel, Les polymerases bacreriennes sonrconstituees de deux grosses

s-unites apparentees ((5 et (f), de deux copies d'unc sous-unire petite (a) et d'unc copie d'unc cinquierne sons-unite (w) qui r essentielle ni pour la transcription ni pour la viabilite des eelrnai stabilise l'enzyme ee participe it l'assernblage de scs -unite . Les ARN polymerase' des eucaryotes et des archaezenes possedcnt plusieurs petites sous-unites supplerncntaires

Un modele courant de "ARN polvmerase bactenne Ihie iI un promoteur. Cette structure correspond ill la molecule

polymerase telle qu'elle 9St scnematisee dans I't'ltape ~ de la e 4-10. La sous-urute f?,' est en orange, la sous-unlts f3 en vert. On ~.' voir une partie de I'une des deux sous-unttes Ct. en bleu : la sous-e IDest en gris. Les brins matrrce d'ADN et complernentaire du brin

.. 'ce sont ligures respecuvement par des rubans gris et rose. Un Ion ;;- au niveau du centre actif est represents par une sphere grise. Les ...,bres indiqusnt les positions de 18 sequence d'AD'N par rapport au e de debut de la transcription. Les nombres posltifs I+l vent dans Ie s de le transcription et les nombres negatifs H dans Ie sens inver- 'Aunablement comrnumque par R. H. Ebnght. Waksman lnstiune.l

associees a cc cornple e central, que DOU decrirons au Chapirre 1 L Les representations schernatiques de fa transcription monrrcnr generalement l'ARN polymera e liee a 'One molecule non courbcc d'AnN comrne dans la Figure 4-10, Pourtanr, d'apres le modele usuel de I 'interaction entre I'ARN polymerase bacrericnne et I'ADN prumoteur; l'ADN se courbe forternent apres son entree dans l'cnzyrne (Figure 4-J 1).

L'organisation des genes diflere dans I'ADN procaryote et dans I'ADN eucaryote

Maim nant que nous avons dccrit le deroulement de la tran cription, IlOUS allons considerer rapidemenr l'organis3rion a grande echellc de I'information dans ['ADN et la facon donr celle-ci impo-

e des contrainres a la synthese d'ARN pour que le transfert d'information. e. deroule sans accroc, Ces dcrnieres annecs, le 'equeu«age des genomes complets de plusieurs urgauismes a revele non seulernent des variations irnportanre dans le nombre de gimes codanr de prorelnes, rnais egalernent de differences d'organisation entre procaryotes et eucaryotes.

L'arrangcment I~ plus courant des genes codant de protcines chez rous les procaryote presence une logiquc interessante; les gene destin's ~ la meme fonction rnerabolique, com me la ynthese de l'acide amine tryptophane, sont le plus souvenr contigus dans ['ADN. On appellc operon un tel arrangement de gene en un groupement foncrionnel, car il opere eomme une unite il partir d'un prornoteur unique. La transcription d'un operon produit un brin continu d'ARNm qui pone Ie messagcspecifianr une srrie de protein apparentees (Figure 4-12a). Chaque portion de l'ARNm rcpresenre l'unite [le gene) codant l'une des proteines de la serie, Dans ['ADN procaryote, les genes sont etroitement cmpaquetes er ne sont separes que par quelques segments non codants, L'ADN est rranscrir dirccternent en un ARNm olineairc, traduit ensuite en proreine,

Ce regroupement economique des genes destines a line merne foncrion merabolique n'existc pas chez les cucaryotes, memc chez les lcvures les plus simples dont le rnerabolisme s'apparenre il celui des bacteries, Au lieu de cela, Ies genes cucaryote dont les produits sent impliques dans la meme voie metabolique sont souvenr separes physiquement dans J'ADN. En e£fet, ces genes sonr generalement situes sur des chromosome distincts. Chaque gene esr transcrit it partir de son propre promoreur, procluisanr un ARNm qui est generalemenr traduir en un seul polypeptide (Figure 4-12b).

Lor que les cbercheurs comparcrcnt pour la premiere fois lcs sequences nuclcetidiques drs AR m eucaryote d'organisrnes pluricellulaires avec les sequences d' ADN qui lcs codaienr, ils eurent Ia surprise de voir que la sequence inimerrompue d'un AR rn donne codant une proreine etait fragmentec (discontinue) dans la partie correspond ante de I'ADN. lis conclurcnt que le gene eucaryote etait forme de fragments de sequence codante, lcs exons, epares par des fragments ne codant pas de proteine, Ics iatrons, Cetre decouverte etonnante impliquait que le long transcrir primaire de depart - In copie d'ARN de la sequence enriere d'ADN trans rit - devair ctre coupee en plusieurs endroirs pour enlever les intton , puis soigneusemenr rcforrnee pour produire de nornbreux ARNm eucaryotcs,

Bien que les introns scient courants chez les eucaryotes pluricellulaires, il sour extrernernent rares chez les bacterie er

(b} Eucaryotes

112 CHAPITRE 4 • Les mecanisrnes moleculaires fondamentaux de la genetique

(a) Procarvotes

Genome d' E. coli

Operon tm

t

Site de debut de la svnthess

de l'ARNm de trp

~ Transcription

ARNm de trp 5' +

3'

t

t

t

t

Sites de debut de

la synthase protelqus

! Traduction

Protelnes

E - D

- C

-s

-A

-

fiGURE 4-12 La comparaison del"organis8tion des gelles, de la transcription et de la traduction chez les pmcaryotes at les euearyotas. (al t'operon tryptophane (trp) est un segment connnu du chromosome d' E. coli, contenant cinq genes (en bleu) qui codent les enzymes necessatras a la synthase s6Quentielle du tryptophane, l.operon complet est transcrit a partir d'un promoteur an un long ARNm tro continu (en rouge), La traduction de est ARNm commence au niveau de cmq sites difterents. produisaru cinq proteines (en vert). L'ordre des genes dans la genome bacterien est parallsle a la fonction ssquenrlelle

archacbacteries er chez de nornbreux cucaryorcs unicellulaires tels que la levure de boulanger, Toutcfois, Ics introns sonr presents dans I'ADN de virus qui infectcnr lcs cellules eucaryotes, En effer la presence d'introns fur decouverte inhialcmenr chez ce type de virus, dont l'ADN est transcrit par le enzyme de la cellule hate.

Les ARNm precurseurs eucaryotes subissent une maturation pour former des ARNm fonctionnels

Dans les cellulcs procaryores, qui ont depourvues de noyau, la traduction d'un ARNm en protdine peut commencer it partir de l'extremite J de l'ARNm, mfime lorsque l'extremite 3' est encurc en cours de ~ynthcsc par J'ARN polyrnera e. En d'autres termer la transcription ct la traduction peuvenr se produire simulranemcnr chez les procaryotes. Dan lcs cellules eucaryotes cependanr, le noyau est non eulernent separe du cytoplasrne dans lequel se deroule In traduction, mail> les transcrirs prirnaires des genes codanr des proteines sour des ARNm precur eurs (pre-ARNm) qui doivent subir plu ieurs modifications. L'ensemble de ccs modifications est dfsigne par Ie terme de maturation de I'ARN er aboutir a UJl ARNm foncrionnel (voir Figure 4·1, etape 2) .. et AR[ rn doit

Chromosomes de levure

TRP1

IV =~pF====l

TRP2

V ====CF=: t

TRP4 kb
P 1550
580 TRP5

VII ====!p~==

910

TRP3

XI 0==== t

680

I Transcription et

t maturation de I' ARN

ARNm

de trp t

rr r

! Traduction

3 Protsinas _

2 5

- -

4

-

-

des protelnes ccdses dans la voie de biosvnthese du tryptophane. (bl Les cinq genes codant les enzymes nscsssaires a la synthase du tryptophens chez la levure (Saccharomyces cerevisiae) sont SitU9S sur quatre chromosomes differents, Chaque gene est transcnt a partir de son propre prornoteur pour former un transcrit primaire qui subrt une maturation en un ARNm fonctionnel codan1 une proteins unique. Las longueurs des chromosomes de levure sont indlquees en ilobases (103 bases).

ensuite fitrc exporre dans le cytoplasrnc avant d'etre traduit en proteine. Par consequent, 13 transcription er la traduction nc pcuvent pas sc dcrouler imulranemenr dans les ccllules eucaryores.

Tous Ies pre.ARt\'Ol cucaryores ont modifies initialernenr all niveau de leurs deux exrremites et ces modification onr censervees dans les ARNm .. Des que I'extremitc 5' de 13 chaine d'ARN naissanr atreint Ia surface de I'ARN polymerase H, plusieurs enzymes agissenr sur Ile en synthetisant la wi{{e. 5', un 7-methylguanylate relic au nucleotide terminal par une liaison 5',5' triphosphate inhahituelle (Figure 4-13). La coiffe protege un ARNm d'une degradation cnzyrnatique er aide on exportation dans lc cytoplasmc, De plus, un factcur protelque necessaire au debut de la transcription dans le cytoplasme e fixe a celle-ci,

La maturation au niveau de I'extremite 3' d'un prc-AR.1'\Jm irnplique Ie livage par line endonuclease pour creer un g.roupement hydroxy Ie 3' libre auquel de multiple! residus d'acide adenylique sont ajollteS un par un par line enzyme appclcc po/yeA) po617f1(!rase. La queue de P(I/y(ll) resurrante contient 100 a 250 bases. Elle est plus courte chez les levures et les invertebres que chez le vertebres, La poly(A} polymerase fait partie d'un eomplexe de proteines capables de localiser un transcrir et de Ie diver

4,2 • La transcription des genes codant des proteines et la formation de l'ARNm fonctionnel 113

,JU niveau d'un site spccifique, puis d'aj uter le nornbre correct de dus A au cours d'un processus qui ne necessire pas de marricc, La dcrniere crape de In maturation de nornbreuscs molecules erentes u'AR m eucaryote est 1'6pissage de I'ARN. 11 s'agit du .i~e interne d'un transcrit pour exciscr les inrrons qu'il em, uivi de 13 ligature des cxonscodanrs. La Figure 4-14 urne les etapes fondamencales de la maturation des ARNm

'n'ores ['exemple eranr celui du gene de 1:;1 p-glohine, Nous merons au Chapitre Ilia machinerie cellula ire neces saire ii ~e de rARNrn, de 1,'ARNt et de l'AR r;

\RNm eucaryotes nctionnel conservent apre rnaturade regions non codantes appelees rex{ons 11011 traduites en

N

~

N

7·MithylguanylBte

,..'"

o I

o P=Q

I

°

I

o P=Q Liaison 5'-.5'

I

o

I

O-p=O

I

°

5"

.p;o~;r"

iH~

/0 0 CH:I

~O-P=O

if

1(:0;1ase2

liHIi

/0 0~CH3

o-p=o

I

-IGURE 4-13 ta structure de 18 coiNe methvh~e de "ARNm eucaote. Les caracteristlquas chimiques speciliques sent la liaison 5'-/5' 7-methylguanylate au nucleotide Initial de la molecule d'ARNm et Ie pement methyle sur I'hydroxyle 2' ou ribose du premier nucleotide ase 1) Ces deux elements se retrouvent dans toutes les cellules anta es et dans les cellules des vegetaux suparieurs. Les levures ne possecent pas de groupement rnethvle sur Ie nucleotide 1. Le ribose sur Ie

:JXieme nucleotide (base 2) est egalement rnsthvle chez les vertses. !Voir A,J, Shatkin. 1976, Ce/l9:645.1

ADN genomique de p-globine

31

32

105

106 147

Site de debut de la synthase d'ARN

Site poly(A)

Transcrit 5' .. ----------------= 3' primaire d'ARN

1 Clivage en 3' et addition d'une queue de poly(A)

-

Exon

-------------!AI"

1 /

Queue

de poly(A)

_(). n

• -(A)n

-

lntron

UTR

() () J Excision des introns, ¥ 1 ligature des exons

ARNm de ~-globine

--------oo(All1

147

FIGURE 4-14 Une lIue d'ensemble de la maturation de, I'ARN pour produire un ARNm fonctionnel chez las eucary01n. Le gene de la B-globine conttsnt trois axons codant des proteines (region codante, en rouge) at deux introns lnterrnediaires non cedents (en oleu) Les in Irons interrompent la sequence cedent des proteines entre las codons specifiarrt les acides amines 31 et 32 et 105 et 106, La transcription des gimes eucarvotes codant des protelnes commence avant la sequence specifiant Ie premier acids amine at s'etend au-deia de la sequence codant Ie darnler acide amine, produisant ainsi des regions non codantes (en gnsJ aux extremites du transerit pnrnaire. Ces regions non traduitas {UTR) son conservees au cours de la meturancn. La coltfa en 5' (m7Gppp) est aioutea au cours de la formation du transcnt onmaire d'ARN, qui s'atend au-dela du site poly(A), Apres un cl1vage au niveau du site poly(Al st l'addltlon de multiples resldus A au ruveau de l'extremlte' 3', I'epissage retire les introns at reunit les exons. Les pel:! s nombres indiquent les positions dans 18 sequence de 147 acides amines de 18 B-globine,

S' et en 3' (UTR pour untranslated regions en anglai ) ;) chaque cxtremire. Dans le ARNm de mammiferes, j'UTR 5' peut erre longue de cent nucleoridcs ou plu er ('UTR 3', de plusieurs kilnbases. Les ARNm procaryorcs possedenr souvent aussi de UTR 5' ct 3' rnais celles-ci sont bcaucoup plus courtes que dans lc t\R m cucaryotes, Ellcs comportcnt en effet generaleroeI11 moin de 10 11 ucleotides.

l'epissage alternatif de I'ARN augmente Ie nombre de proteines exprimees a partir d'un seul gene eucaryote

Au contraire des genes de bacteries er d'archaebacteries, la grande rnajorite des genes d'eucaryotcs pluricellulaires uperieurs conricnnent de multiple~ inrrons. Commc ncus l'avons VlI au Chapirrc J,

5'

3'

'14 CHAPITRE 4 • l.es mecanismes mor~cura:res {ondamentaux de la gen~t1que

AANm de fibronectine dans les fihroblastes

ARNm de

fibronectine dans 6'

les Mpatocytes

FIGURE 4-15 L'epissage specifique des types cellulatres. du preARNm de la fibreneetine dans les fibroblastes at les hepatocytes. Le gene de la flbronecune. long de ~ 75 kb (en haul) connent de rnultlples eXOnS Les exons EIIiB et EIiIA len vert) codent des dornames de liaison pour des protaines specifiquas sltuees a la surface des

de nornbreuses proreincs d'eucaryotes supcricurs possedenr une structure tertiaire a multiples dornaines (voir Figure 3-8). Des domaines proteiques individuels repetf:s sonr souvent codes par un exon OU un petit nornbre d'exons codant des sequences d'acides amine. identiques 01,1 presque. On suppose quc ces repetitions d'exons resultent cit: multiples duplications accidenrelles d'un fragment d' AD present entre deu sires, dan des introns adjacenrs, Ceci aboutit ii I'insertion d'une seric d'exons reperes, sdparcs par des inrrons, cnrre Ies deux introns d'originc. La presence de rnulriple introns dans de uombreux genes eucaryotcs permer l'cxpression d'un grand nombre de proteines apparentccs a partir d'un seul gene, grace a un epissage alternarif. Chez les Eucaryotes superieurs, l'epis age altcrnatif esr un mecanisme important pour que des 'types cellulaircs disrincrs produisenr di fferentes formes

d'une proteine appelees isoformes, ,

La fibroncctine, une proteinc d'sdherence exrracellulaire a domaines multiple presence chez les mammiferes ollie un bon exemple d'epi sage altcrnarif (Figure 4-15). Le gene de la fibrenecrine com pone de nombreux exons, groupes en plusieurs regions correspondant aux domaines specifiques de la proteine, Les fibroblastc produisenr des ARNm de fibroneerine contenant les exons HllA et ElIlB. es e rnns eadem des cquences d'acides arnines qui se fixent errolrerncnt nux proteines de In membrane plasmique des fibroblastes. En consequence cette isoformc de la fibronecrine fair adherer les fibroblastes a la rnatrice extra-

ellulaire, L'epissage alternarif du transcrit prirnaire de la fibrenectine dans les bepatocyres (le type cellulaire principal du foie) produit de ARNm depourvus des exons ElUA et EIlIB. Pour me raison, la fibronectine secretce dans le sang par les hepatocyte n'adhere pas fortcment aux fibrohlasres ni Q In plupart des autre types cellula ires, ce qui leur perrnet de circuler dans Ie sang. Au ,COL1tS dela formation des caillots sauguins cependanr, les domaines de liaison a la fibrine de la fibronectine des hepatocyres se fixenr a la fibrinc, qui est I'Wl des principaux constituanr de caillots. La fibronecrine liee irueragir alors avec les integrines presenres sur les membrane de' plnquettes sanguines activee circulames, ce qui agrandit le caillot,

Plu de 20 isoformes differentes de fibronecrioe ant ete identifiees, CMCLlne cront codee par un ARNrn differenr, produit par lin epissage altcmarif et consritue d'une cornbinaison unique d'exons du gene de la fibronectine. Le . equencage recent d'un grand

- -==-----=---

- ._~~. 4-

. -

3'

fibroblastes. L'ARNm de la fibronectina produit dans les librcblestes comprend les exons ElIIA et El1lB, tandis que CBS exons sent excises de l'ARNm de la fibronectine dans les hepatocvtes. Dans ee schema, les introns (!ignes noires] ne sont pas cessmes a I"echelle ; la plupan d'entre eux sont bien plus longs que n'irnporte quel exon.

nombre d'ARNm i oles a partir de differents tissus er la cornparai 'on de leurs sequences avec I'ADN gcnomique a montre que pres de 60 % de l'em emble des genes humains eraienr exprimes SOllS la forme d'ARNm produirs par un cpis age alternatif, A l'evidence, I'epissage ahernarif de I'ARN aboutit ii une Forte augmenration du nornbre de proreines codees par Ies genome des urganismes pluricellulaires superieurs,

CONCEPTS CLES DE LA SECTION 4.2 La transcription des genes codant des proteines et la formation de l'ARNm fondionnel

• La transcription de I'AD esr realisee par I'ARN polyrncra e, qui ajoure un par un, des ribonucleorides a l'exrremire 3' d'une chaine J'ARN naissant (voir Figure 4-10), La equence du brin marrice d'ADN determine l'ordre dam lequel le ribonucleotides sam polymcrises pour former une chaine d'ARN.

• Au cours de l'iniriarion de la transcription, l'ARN polymerase se fixe a un ire spccifiquc de I'ADN (Ie prorncteur), separe loealernenr les deux brim d'ADN pour reveler Ie brin rnatrice non apparie et polymerise res deux premiers nucleorides.

• Pendant I'elongation du brin, l'AR. polymerase e dcplace le long de I' ADN, en separant Ie uris apri:s Ie autre de segments d' ADN et en ajoutanr des nucleorides au brin d'ARN en cnurs d'elongation.

• Lor que I'ARN polymerase atteinr une equeuce de tcrrninai-

(111 dans I'AD ,I'enzyme intcrrornpt la trail riprion, ce qui aboutit a la liberation de I'ARN acheve et i la dissociation de l'enzyrne du brin matrice d'AD .

• Dans I'ADN procaryote, plusieurs genes codant des protcines sonr ouvent regroupes en une region fonctionnelle, un operon, qui est transcrit a partir d'un prornotcur unique en un AR In codant de multiples proreines avec de fonctions apparcnrees (voir Figure 4-12a). La traduction d'un ARNm bactcrien peur commencer avanr memc 13 fin de sa synthese.

• Dans l'ADN eucaryote, chaquc gene codanr une proteine est trans rir a partir de son proprc prornoteur; Le rranscrir prirnaire initial conuenr rres souvenr des region. non codantes (inrrons) dispersees entre des regions codantes (exons),

• Les transcrits prirnaires eucaryores doivenr subir nne maturation pour donner lieu i'i des ARN fonctionnels. Au COUfS de la maturation, les extrernires de presque toLLS les rranscrits primaires produits a partir de genes codanr des proteines sonr modifiees par I'addition d'une co.i£feen 5' et d'une queue de poly(A} en 3'. Lcs rranscrlcs de genes contenant des inrrons peuvent subir un epissage, qui est le rerrair des introns er Ill, reunion des exons (vuir Figure 4-14).

• Les domalnes individuels de proteines ii multiples dumaines presentes chez les eucaryotes superieurs sont souvent codes par des exons uniques au peu nornbrcu r, Des isoformes distinrres de ces proreines sent frcquenlLllcm exprimees dans des types cellulaires disrincrs a la suite de l'epissage alternatif des exons.

le contro.le de I'expression des gimes chez les procaryotes

~u~ [astructure er (a fonction d'une cellule sam detcrminees r les proteines qu'elle contient, le controle de l'expression des esr un aspect fondamental de la biologie moleculaire de ia ule, Plus generalement, la " decision '" d'initier La rranscriprinn

~e codant une proteine particuliere est Ie principal meeanisde controle de la production de 13 proreine codee dans une eel_ Ell conrroianr "initiation de la transcription, une cellule peut r Ie type de proteines qu'elle produir er la viresse de ccrre

~ e",e. Lorsque Ia transcription d'un gene est repl'imee, R~n1 et 13 ()U les proteine.~ codees qui lui correspondent sent foses a de faibles conccntrarions. A l'inverse, lersque la . riprion d'un gene est t1ctivee, l'ARNm er laou les protdines correspondaures sont produirs ;l des concentrations bien elevees,

Chez In plupart des bscteries et des autres organismes U!1iulaires, l'expression des genes est forternent regulee afin que la lule puisse ajuster sa maehinerie enzymatique et ses composants mu.::ruraux aux changements nutririonncls ct physiques de son .rronoemenr .. Par consequent en temps normal, une cellule baccrnenne synthetise a tout moment uniquement les proteines necesres a sa survie dans des conditions particulieres, parmi celles de

ensemble de son proteomc. Chez lcs organismcs pluriccllulaires, Ie coutrole de l'expresslou des, genes porreprincipalemenr sur I'ex~Iilssion du bon gene all. moment oportun dans la cellule adequa'c:. au cours du developpement embryclogique et de b differenClarion des rissus, NUllS allons decrire ici les caracreristiques 'ondamentales du contrdle de If], transcription chez les hacteries, en prenanr comme cxemple central l'opcron lac chez. E. coli. De nombreux processus idcF.ltiques,aiJ1Si que d'a utres processus difrerems. sont impliqlJcs dans Ie conrrole de la tJl"ansc.ription cbez les eucaryot~s, dont nous parh:rons au Cbapitre 11.

Che7, E. coli, environ La moitie des genes sont regroupes en operons cadam chacoD des enzymes impHqllces dans une voie merabolique parti.cllliere, all desproreines qui in:reragissenr pour forrner LIlle seLtie proteille a multiples SOLls-ttnites. Par exemple, I'operon trp mentionne pillS haur code cinq enzymes IlIkessaires a In bins)'llt'hese du tryptophane (voir Figure 4-1.2.). De mcme, l'operon lac code trois cm:ymes impliquees dans ie metabolismc au lacto~e> un Sucre. present dans Ie lait. Puisqu'un operon bacrcr,ien cst

4.3 • Le contn5!e de I'expresslon des gol::nes chez les procaryotes 115

transcrit en un seul ARNm i'l partir d'un site de debut de la transcription, COLlS les genes d'un operon sonr rigl.lles de fatroll coerdonnee, c'est-a-dire ctu'ils sont rous actives ou n'!primes de Ia rnerne fa~on,

La transcription des operolls, cornme celle des, genes isoles, eSI contr6lec par I'inreracrion entre l'ARN polymerase er des. represseurs ou actiuateurs proreiques specifiqnes. Pour initicr la transcription cependanr, .I'ARN polymerase cI'E. coli doit Btre associee avec l'un des quelques [acteur« (J (sigm.a) qui [ouenr le role de facteurs d'iniriation. ILl' plus courant d'cnrre eux chez II'S bacteeies est <10.

I!initiation de la transcription de !'operon lac peut etre reprimee au activee

Lorsque E. coli se trcuvc dans unenvironnemenr depourvu de lactose, la symhese de I'ARNm de lac est .eprimee. afin que l'energie de la cellule nc soir pas gaspillee en synthetisanr des enzymes non urilisables, Dans un environnernenr contenant a la fois du lactose er du glucose, Ies cellules d'E, coli metabolisent preferentiellement lc glucose, qui est la molecule centrale du metabolisme des glucides, Le lactose est merabolise it un raux el·eve seulernenr lorsque Ie milieu contienr do. lactose et tres peu de glucose, Cer ajusternenr rnerabolique est realise par la repress;(]n de la transcription de I'operon lac j.USljU'I!, ce que clu lactose soir present, cr par la synthese de faiblcs quantlres d'ARNm de lac seulement, jusqu'iJ, ce que ,13 concentration cyrosolique de glucose arteigne un taux tres faible. La. transcription de l'operort lac dac.ns des conditions diFfecentes estcontrclec par lc !E:p.resseur lac ec la proteine activatricc des catabolitcs (CAP)., chacun se fixant a nne sequence specifique d'AnN dans la region de cantrall' de 13 transcription de lac (Figure 4-16, (111 haul).

Pour que la transcription de I'operon lac commence, la SOllSunite if!1 de ['ARN polymerase doit se fixer au promoreur lac, qui 51: trouve [usre en amont du site de debut de la tran criprion, En l'absence de lactose, Ia liaison clu represseur lac it une sequence appelee l'operateur /a,e qui englobe le site de debut de la transcription, bloque l'lniriation de Ia transcription par la polymerase (Figure 4-16a). En presence de lactose,il se fixe ii des sires specifiques de liaison dans chaque sous-unitc du represseur recramerique lac, provoquanr un changement conformationnel de Ia proteine ; celle-d Sf dissocie alors de l'opew.n lac. Des 10(s, La polymerase peut initier la transcription de l'operon lac, Ccpendant, lorsque le milieu eontient egalement du glucose, le raux d'initiation de la transcription (c'cst-s-diec le nombre de fois par minute au des molecules differcntes de polymerase inltient la transcriptien] est tres faible, ce qui aboutir a la synthese de petites quantites seulemenr d' ARNm lac er des proteines codees par I'operon lac (Figure 4-16b).

Une fois Ie glucose dispam dll milieu ec done La clune de sa cOllccnmnion intracellulaire, Les ,cellules d'E. colI feJilondent en synthetisant de I'AMP cyclique, AMPc (voir Figure 3-27b). tmsque la concentration d'AMPc augmente, c:elui-ci ~e fixe a un site present dans ,cheque sous-unite de In prot.cillc dim6rique CAp, em::rainam Ul1 chBilgemcnt de conformatiOI~ qui pcrmcr iii la prottine de se fixer au site CAP dans In region de conrr61e de In rranscription de lac. Le complcXcc CAP-AMPc lie interagit avec In polymerase llxee all, promotellr, ce qui stimule £ortemenc Ie taux

promoteurs [aibles. Uoperon lac par exemple possede un promoreur faiblc, 00 raux bas d'initiation CSt encore reduit par le represseur lac er netrement augmenre par l'acrivateur AMPc-CAP.

116 CHAPITRE 4 • Les rnecanismes rnoleculaires fondamentaux de la genetlque

+1 (sile d'initiation de Is transcription) Prornoteurl -v--'-r--------I~a-cZ~.--------~

Site CAP

Operateur

Genes de controle de la transcription chez E. coti

(a)

-lactose +glucose (AMPc faible)

lacZ

Pas de transcription del'ARNm

[b)

+ lactose

+ glucose (AMPc faible)

Transcription faible

lacZ

(e)

cAMP -,

+ lactose -glucose (AMPe eleva)

{acZ

Transcription forte

FIGURE 4-16 La regulation de la transcription iii partir de J'operol1 lac dIE. coli. (En haUl) La region de connote de la-transcrfption. consn!Uee de ~ 100 palres de bases cornprand trois regions de fixation pour des proteines : Ie site CAP. qui fixe la proteine acrvatrice des catabolrtes, Ie promoteur laoauquel se lie Ie cornplexe ARN polymerase-01° et l'operatsur lao, qui fixe Ie represseur lac. La gene Jacl, Ie premier des trOIS genes de l'operon, est represente a drone, (e) En "absence de lactose, tres peu d'ARNm de lac sorrt produits car Ie represseur lac sa fixe ~ l'coarateur, inhlbant alnsi l'initiafiort de la transcription par I'ARN polymerase-01°. Ib) En presence de glucose at de lactose, Ie rapresseur lac fixe du lactose et se dissocia de l'operatsur, ce qui permetal'ARN polymerasa-a7Q d'iniuer 18 transcription 8 un tauxfaible. (c) La transcription maxima Is de I'operon lao a lieu en presence de lactose at en l'abssnoe de glucose. Dans cette situation, l'AMPa augmente an reoonss a 18 concentration falble de glucose et forme Ie cornplexe CAP-AM Pc. qui se fixe au site CAP, au niveau duquel II interagit avec I'ARN polymerase pour stirnular Ie taux d'initiatton de la transcription,

d'iniriation de la rran cription, ette activation conduit a la synthese de concentrations elcvecli< d'ARNm de lac er ce faisanr, des enzymes c dees par l'ope ron lac (Figure 4-16c).

Bien que les promoteun de different. genes d'E. coli presenrenr une hornologie considerable, leurs sequence.') exactes sent differente. Le prornoteur determine la frcquence intrinseque a laquelle Wl complcxe ARN polymerase-a initie la transcription d'un gene en I'absence d'un rcpresseur au d'un activateur proreique. Lc promoteurs resporu ables d'un raux cleve d'initiation de la transcription snnt appcles promoteurs forts. Ceux qui entrainent un Iaiblc raux d'iniriation de la transcription sont de

De petites molecules regulent I'expression de nombreux genes bacterlens par Ie biais de represseurs qui se flxent a I'ADN

La trans ription de la plupart des genes d' E, coli e t n!gulee par de<~ processus qui rcssernblent il. ceux decrits pour l'operon lac. Le mecanisme general met en jeu un represseur pccifique qui se fixe it la region de l'operareur d'un gene OU d'un operon, bloquanr ainsi l'initiation de 1:1 transcription. line (00 plusieurs] petite molecule appelee inducteur se fixe au repro seur, onrrolant ainsi on activite de liaison a l' ADN er Jane le raux de tran cription

pour l'adaptcr aux besoins de la cellule.

Par excrnple, lor que la concentration de tryptophane dans le milieu et Ie cytosol esr eJevec, In cellule ne synthetise pa les enzymes codees dans l'operon trp, La liai on du tryptophane au repre seur trp provoque un changement conformarionnel qui permer a la proteine de se fixer a l'operareur trp, reprimanr aiusi l'cxpres iion de enzymes qui synthetiscnt le tryptophane, A l'inverse, lor que la concentration de tryptophane dans le milieu er Ie cytosol, est faible, lc tryptophane se dissocie du represseur trp, cntrainant un changemcnc conformaricnnel de la proteine qui sc di socie aloes de l'operateur trp et p rmct la tran cription de l'operon trp, Dans le cas dc l'operon lac, 1,1 liaison au represseur lac de l'inducreur; le lac rose, reduit la fixation du represscur a l'operateur, ce qui conduit a l'inination de la transcription.

Des protcines activarrices specifiques, relies que CAP pour l'operon lac, controlent cgalernent la transcription de quelques genes bacteriens mais pas de tous, Ces activatcur se fixenr ii I'ADN conjointement avec I'ARN polymerase, stimulant la transcription a partir d'un prornoteur pecifique. L'activite de liai on a l'ADque possede UI1 acrivateur est modulee en fonccion des bcsoins cellulaires par la fixation de petites molecule pecifiques (com me I'AMPc:) qUI alterent la conformation de l'activateur.

La transcription par ItARN polymerase-~ est contr6lee par des activateurs qui sa fixent loin du ptomoteur

La pluparr des promoreurs d'E. coli intcragissenr avec l'AJU polyrncrasc-e/", la forme principals de l' mzyme bacterienne. La transcription de certains groupes de genes cependant est assuree par lcs ARN polymerase d'E. coli contenanr l'un des quelques facreurs sigma alrernarif qui reconnaissenr des sequences consensus prornctrices dif£crentes de celles recormues par ifo, Tous sauf un onr une sequence apparentee a celle tie 0-7°. L'iniriation de la transcription par Ics ARN polymera es com nant ce facteur < de type cl° e t regulcc par des reprcsseurs et des acrivateurs qui se fixenr it rADN pres de la region J~ liaison de la polymerase, ressemblant en cela a l'iniriation par Ie complexe d"°-ARN polymcra c lui-merne.

La sequence d'un Iacteur . igma d'E, coli, cf4, esr tres diffcrente de cclle de tous les aurres facteurs de type ,j'o. La transcription des gene par les R polymerascs contenanr a~4 e r rcguJee

uniqucrncnr par de activateurs dont les ires de liai on dans I' DN, appeles arnplificateurs (enht11/cers en anglais) som genera. I rnent sirues a 80-160 paires de base en arnont do sire de debut de la rranscription, Merne lorsque Ie arnplificareur ont distants de plus d'une kilobase du site de debut de la transcription, les activareurs avec d4 pcuvcnt acriver la transcription. -

L'acrivatcur a cr'4 le rnieux caracterise - Ia proteine NrrC proreine C rEgulatrice de l'azore) - stirnule la tran cription a partir du prornoteur du gene ginA. C gen c de une enzyme, la lurarnine ynthcrasc, qui synrherise l'acide amine glutamine a partir d'acide glurarniquc ct d'ammoniaque. [ARN polymera e- 4 e f e all promoteur gin mais deroul Ies brins d'ADN et ini··f la tran criprion eulernent apres avoir etc acrivee par NtrC, line [cine dimerique, r tre a Son tour, est regulee par une proteine a c appelee NrrB. En reponse au concentrations raible de e.uramine, NrrB phosphoryle la trC dimerique, qui se fixe ensuiun arnplificareur ell amont du promoreur gInA. La NtrC

NtrC

ARN polymerase-ITS<!

NtrC

ARN polymerase-<T54

GURE EXPERIMENTALE 4-17 La formation de boucles, dans I'AON perrnet una interaction entre II NtrC lieeet la polymerase-cf4. la) Une micrographle electronique d'un fragment de restnction d'ADN avec un dirnera phosphorvle de NtrC lie a la region amplifieatrice pres d'une extremite at I'ARN polvrnerase-o'" liee au orornoteur de ginA pres de l'autre extremhe, (b) Une rrucroqrephte electronique de la rnerne preparation man rant la liaison des dirneres de NtrC el de I'ARN polymerase-d'" I'un :J I'autre, avec I'ADN mtermedierre formam une bouefe entre aUI<. {D'awes W. Su 81 et., 1990, Ptoo: Natl Acad. Sci. uSAB7:5505 . eimebremern communique par S. Kul6~l.l

4.3 • La contrele de l'expresslon des genes chez las procaryotes 117

pho phorylee liee a l'arnplificatcur stimule ensuire la polyrnera ed4 liee au prornotcur, pour separer les brins d'AD er iniricr la transcription. Des etudes de microscopic eJectronique ont mnntre que la NttC phosphorylee lice au amplificateurs er 13 polymera-

c-d4 liee au promoteur inreragisseur direcremenr, formant une boucle clans l'ADNt:ntre les ires de liaison (Figure 4-17). Comme nous lc verrons au Chapitre J1, ce rnecani me d'activation ressemble 1I.D peu au mecanisme predominant de I'activation de 13 transcription chez les eucaryotes.

NrrC possede nne activite ATPa ique et l'hydroly e d'ATP est neces aire a l'acrivarion de 13 polyrnera e-cr~'1 lie par la Ntr pho sphorylce, La preuve de ceci est doonee par des mutant donr la NtrC est defecrueu e p ur l'hydrolyse d' ATP et qui ont rou[ours incapables de stimuler le deroulemenr des hrin. d'ADN pear 13 polyrnerase-o'" au niveau d'un sire de debut de la tram cription, On suppose que I'hydroly e d'.ATP foumit l'energie necessnire a la denaturation des brins J'ADN. A. l'inverse, la polymerase-o/? n'a pa besoin d'hydroly e d'i\TP pour separer les brim au niveau du site d debut de 13 transcription.

De nombreuses reponses bacteriennes sont controlees par des sjstemes regulateurs a deux composants

Comme 110U~ venon de Ie voir, Ie conrrole du gene gl~IA d' Eo coli depend de deux proteines, Ntr ,et trB. De [cis systemes regulateurs 9 deux composants contrfilent de multiples rI!ponses des hacreries aux changements dans leur envircnnement, Un autre exemple implique les proteines PhoR et PhoB d'E. coli, qui regulent la tran cription en rcponsc a la concentration de phosphate libre. PhoR est une proreine tran rnernbranaire siruee dans 13 membrane (plasmique) interne, dont Ie domaine peripla rnique fixe Ie phosphate avec une affinite moderee er dont Ie domaine cytosolique pos edc une activite proteine kinas ; Phob csr une proteinc cytosolique,

Le pores proteiques de grande iaille dans la membrane externe d'E. coli permcttcnr aux ions de diffuser Iibrement entre l'environncmsnr externe et I'espace periplasmique, En consequence lorsquc 18 conccnrraricn de phosphate chute dans l'cnvironnemeru, cllc chute egalement dans l'e pace periplasmique, entrainant la dissociation du phosphate depui le domaine periplasmique de PhoR, comme le monrre 1:.1 Figure 4-18. Ceci provo que un changernenr conforrnationnel dans l domaine cyropla miquc de Pholt qui declenchc son acrivite de proteinc kinase, La proteinc PhoR activee tran fere initialcrncnr un phosphate r de I TP vers nne chaine latera Ie d'histidine dan Ie dornaine kinase de Phok., Le meme phosphate est en uite transfcrc a un.e chaine: larerale d'acide aspartique dans Phob, convertissanr ainsi PhoR en un activateur de la transcription actif La PhoB active, phosphorylee, induir ensuire In transcription de plusieurs gene~ qui aident In cellule a supporter de faibles concentracions de phosphate.

De nombreui es 3L1treS repon: es bacteriennes som regulees par dcu proreines ayant une certaine homologie avec Ph Ret Phob. Dan chacun de ccs sy teme regulareurs, unc prorcine ervanr de capreur appelcc proteine capteur, conricnr lin domaine tran metteur homologue du dornaine proreine kinase de PhoR. Le domaine rran meneur de 13 prorcine capreur est regule pal' un se unci domaine proteiquc unique (commc lc dornaine peripla ·mique de PhoR) qui percoit le changements de l'environncmcnt. La secon-

118, (HAPITRE 4 • les rnecanisrnes rnoleculalres fondamentaux de la gen<hique

FIGURE 4·18 La systeme 'r,egulateur i! deux cernpesante PhoR/PhoB, chez E. con. En reponse aux concentrations falbles de phosphate dans l'environnement at dans l'espacs periplasrnlcue, un ion phosphate sa dlssccls du domalna parlplasrnlque de 18 protslns captaur PhoR inactive. Cect provoQue un changement conformationnel qui active un domaine proteins kinase transmetteur dans la region cytosolique de PhoR. Le domaine transmetteur active transfers un phosphate 'y de j'ATP vsrs une histldina conserves presente dans Ie domaine transmetteur. Ce phosphate est ensulte transfere a un acids aspartique dans Ie domains racspteur du reg,uJateur de reponse PboB. Una PhoR actives peut phosphoryler plusisurs protslrres PhoS. Las proteinss PhoB phosphcrvlees activent ensulte la transcription is partir des genes codant des proteinaSe qUI aident 181 cellule 11 repondrs a una ecnesrttration faible da phosphate, y cornpris phoA, phoS, phoE at ugpB.

®

de proteine, appcleeregulateur de ri:ponse. eontient un domaine recepteur pri:seorant une homologie avec la regiOll de rboB phosphoryh!e par la PhoR activee, Le domaine nkcpteUI du r.egllla~e\lf de reponse est associe a lin second dornaine qui determine I a foncrion de Iaproreine. L'activire de ce second domaine foncriormel est regulee par la phosphorylarina du domaine Icocpteur. Bieri que reus Ies domaines transmerteurs soienr homologucs (commc Ie som les domaines recepteurs), le domalne trausmetteur d'une pro[Cinc capteur specifique phosphoryle uniquctnent les dornaines recepreurs des regulateurs speci£iques. de reponsc, permcrtarrt des reponses specifiques adaptees aux changements dans l'environnemerit. Rernarquez que Ies proteines NtrB et NrrC, dam nous avons parl'e plus haut, Ioncrionnenrcommcdes capteurs et des regulareurs de reponse respectivement, dans le systerne rcgulateur it deux composauts qui conrrole la transcription de glllA. Des systernes regula[,eurs a deux compos ants histidyl-asparryl existent aussichez les planres,

CONCEP'TS CLES DE LA SECTION 4.3 le c.ontrOle de Pexpresslen des gimes chez les procaryotes

• L'expression des genes chez Ies procaryotes et les euearyotes est rcgulec principaloment par des rneeanismes qui contrdlent I'initiation de la transcription.

• La liaison a Lin prornoteur, de la sous-uniteo d'une ARN polymerase, est la premiere crape de l'initiation de la transcription chez E. coli.

Espace periplasmique

Cytoplasme

Membrane interne (cytoplasmique)

Memllr,ana externe

• La sequence nucleotidique d'un promoteur determine sa force, c'est-a-dire la frequence a Iaquelle differemes molecules d'ARN polymerase peuvent se fixer et initier la transcription en une rninute.

a Les represseuss sont des proteines qui se fixent ii. des seqrucnccs operarrices qui englohenr ou sont proches des promoreurs. La liaison d'un represseur a un operateLlr inhibe l'inlriarion de la transcription.

• L'acrivite de [iaisun a PAnN de la plupart des represseurs hacteri"t'lls est rnodulee pa.r de petites molecules effectrices (indueteurs]. Ceci permer aux cellules bacreriennes de reguler la transcription de genes speclliques en reponse aux changements de concentration de differents nutriments dans l'cnvironnement,

• l'operon lac et quelques autres genes bacteriens sont ega lement n~gules par des proteines activatrices qui se fixenr a proximite des promoreurs er augmenrent le taux d'iniuarion de Ia rranscription par I'ARN polymerase.

• Le principal facteur sigma chez E. coli est dO, mais plusieurs autres facreurs sigma rnoiru abondants existent egalement, ehaCWl reconnaissant des sequences promotrices consensus diffefemes.

• L'initiation de la transcription par routes les A11:.N polymerases d'E, coli, sauf celle qui contienneru tf4, pem ctre regnlee par des repress!!urs et des activateurs qui se fixent pres du site de debut de la transcription (voir Figure 4-16).

• Les genes transcrits par !'ARN polymerase-cf4 sour regules

par des acrivareur qui se fixent a des amplilicateurs sirues "" 100 paires de bases en amant du sire de debut de Ia transcription.

Lorsque l'activarcur ct I' ARN polymerase-rr'" interagissenr, ',-\DN present entre leur sites de liaison forme une boucle (voir .gure 4-17).

Dans Ie systemes regulareurs a deux cornposants, une pro,..- ne ert de capteur, enregistrant la concentration des nutriau d'autres constituanrs dans i'envi.ronoement. Dans des nditions appropriees, le phosphate r d'un An' est transferc

bord a line histidine dans la proreine capteur puis it un acide 'que dans unc seconde proteinc, lc rcgulareur de reponse. ~Iateur de reponsc phosphoryle se fixe ensuite a des sere regularrices dan I'ADN, tirnulant ou reprimsl1t alors c:anscnpcon de genes specifiques (voir Figure 4-18).

les t~o;s roles de I'ARN da.ns duction

rADN con rienne l'inferrnatiort necessaire a [a syurhcse ~;C;qJ.Ilt er que l'ARNm transmette les instruction codees dans , la plupart des activites biologiques sont execurees par des ~:ti'mt~-. Comme nous I'avons vu au Chapitre 3, l'ordre lineaire amines dans chaque proteine determine a structure triionnclle et 0.0 activite, Pour certe raison, I'assemblage des a:mines suivant un ordre correct, tel qu'il est code dans

'_ esc essentiel a la production de proteines foncrionnelles er u fonctlonnernenr correct des cellules cr des organismes, traduction est l'enscrnble cit! processus au COUfS duquel la ce nucleotidique d'un ARNm est utili ee pour diriger et

... les acides amines en line chaine polypepridique (voir 4-1, erape 3). DaDS Its cellules eucaryotes, la synthese proderoule dans le cytoplasmc, au trois types de molecules ~ travaillent conjoinrement pour remplir des fonctions diftes mais complernenraire (Figure 4-19) :

'_\RN messager (ARNm) porte l'information genetique rite a partir de l'ADN sous la forme d'une seric de aces de trois nucleotides, appelees codons, qui speci- 1 chacune un acide amine parriculier.

_ eARN de tran ferr (ARNt) est l'elernenr central pour le .dllffragc des COdOl1S de I' ARNm. Chaque type d'acide e possede son proprc sou -groupc d'ARNt. cux-ci

enr l'acide amine et Ie transporrent jusqu a I'extrernire . ne chaine polypeptidique en cours d'elongarion, si Ie 00 uivant dans ['ARNm l'exige. L'ARNt correct avec I'acide amine qui lui est fixe, est selectionne a chaque etape, ;'IT chaque molecule specifique d'ARNt com porte une

sequence de trois nucleotides appelec anticodon, qui peut "appar ier avec son codon cotnplemenraire dans l'ARNm.

_ L'ARN ribosomial (ARNr) 'a socie avec un groupe de rordine pour former des ribosomes. Ces structures com-

ple-ee , qui sc deplacent le long d'unc molecule d'ARNm, caraly enr l'a sernblage de acides amine en chaines polypepridique . Elles fixent egalement les ARNt et differentes proteines accessoire necessaires a la synthese proteique. Lc

4.4 • les trois rOles de I'ARN dans la traduction 119

ARNt4 sortant

Deplacemen1 du ribosome ----+-

FIGURE 4-19 Les trois roles de I'ARN dans la synthase des proteines. L'ARN mossager (ARNml est trad\.lit en pfoteina par I'action conjuquea de I'ARN de transfert (ARNt) at du ribosome, qui est constitue de nombreuses proteines at de deux molecules principales d'ARN rlbosomial (ARNr) (non representees lcl). Remarquez I'appanement des bases entre les anticodons des ARNt at las codons cornolernentalres dans J'ARNm. La formation d'une liaison peptldique entre Ie groupement amine N de l'aa·ARNt entrant et du C carboxy-terminal sur la chatne protelque naissante (en violet) est catelvsee par run des ARNr. aa = aeide amine: R = groupement lateral. (Adapts do A. J. f. Griffiths er al., 1999. Analyse glfmetiql.)e modeme. W. H. Freeman and Company Traduction De Boeck 2001.1

ribo ornes ont constirues d'une grande et d'une petite sousunites, chacune comprenant sa ou ses proprcs molecules d'ARNr.

Ces troistypes d'ARN participent 11 la traduction dans tomes les cellules, ~o cffet, le developpcment de trois AR distincts foncnonnellemcnr fur probablement ['clement moleculaire determinant de l'apparition de la vie. Le lien entre la rrucrure de cbaque ARN et sa cache specifiquc est decrit dans certe section et la synrhese proteique grace au travail concerto des trois types d'ARl avec leurs facteurs prorciques associes, csr detaillee dans Ja section suivante. Puisque la traduction est essentielle a la synthese protcique, on parle souvenr indifferernmenr de l'UD ou l'autre processus. Toutefois, les chaine. polypeptidiques resultant de la traduction suhissenr un reploiernent post-traductionnel cr souvent d'aurres changements (cornme des modifications chimiques OU une association avec d'autres chaines) necessaires a la production de proteines matures foncnonnelles [Chapitre 3).

L'ARN messager porte I'information provenant de I'ADN. selon un code genl!tique a trois lett res

Comme 1l0US l'avons vu preccdcrnrnern, le rode genetique utilise par les cellules est un code a triplets. Chaque sequence de trois nucleorides ou codon e t ~ luc ,. a partir d'un point de depart specific dans l'ARNm. Parmi lcs 64 cedens possibles du code genetique, 61 specifient de acides arnines distincts et trois sonr des

120 CHAPrTRE 4 • Les rnecanlsrnes moleculalres fondarnentaux de la g~nfWque

TABLEAU 4-'

Le code genetique (de I'ARN vers les acides amines]"

Premiere Troisicme
position position
('xtremite ~') (Extrcmite 3')
Deuxierne position
U C A G
Pile Ser Tyr ys U
Phe Ser Tyr Cys
U
leu er top Srap A
Leu Ser top Trp G
Leu Pro Hi Arg U
Leu 1)£0 His Arg C
C
Leu Pro Gln Arg A
Leu (Met)" Pro GIn Arg G
Ile Thr ASD er U
lie Thr Asa Ser C
A
IIe Thr Lys Atg
Met (debut) Thr Lys Arg G
Val Ala Asp Gly U
Val Ala Asp Gly C
G
Val Ala Glu Gly A
Val (Mer)" Ala Giu Gly G
*AU est g';ncral~lJ1cnr It: cod n iniriatcur ; GtlG rode habiruellemenr 13 valine er CUG 13 leucine. rnais dans de r:Jres cas, CC5 CHdoDS peuvcnr
egalement coder 13 rnerhionine pour inirier une chaine prnreique .. cedens stop, Le Tableau 4-1 montre qucla plupart de acides amines ont derermines par plusieurs codons .. euls deux -In methionine er le tryptophane - ant specifi6, pat un saul codon. A l'inverse, l.a leucine, In serine ct l'argininc ant code' chacun par six cedens diffcrcnts, n dit que les differeDts codons d'un acide amine donne sonr ynonymes, Le code lui-rnerne est dit degenere, ce qui signifie que plu ieurs codons peuv 11t specifier le meme acide amine.

La ynrhe e de toures les chaine' p lypcpridique dan. les eelrules procaryores et eucaryotes commence avec le rnerne acide amine. In methionine. Dan la pluparr des ARNm, le codon de depart (iHitiatelclr) specifianr cette methionine amino-rerminale, est AUG. Dan quelques ARNm bacreriens, GUG est utilise cornme codun iniriarcur et UG occa ionnellernent cornrne codon initiareur pour la methionine chez les cucaryore . Le troi codon

AA, UCA et UAG ne pecifienr aucun acide amine. Cc ant de codons stop (de lerminais(m) qui rnarquenr l'extrem.itc carboxyterminate des chaines polypepridique dan presque routes les

cellule. La sequence de codons qui 'erend entre ill' codon initiatcur specifiquc et un codon stop est appeh!c cadre de lecture. Cerre ·equence lincaire precise de ribonucleotides organi es par groupes de trois dans I' ARNm, specific la sequence lineaire des acides amines de la chaine polyp pridique carr pond ante et 'ignale ega lemenr les sites de debut er de fin de la chaine.

Lc code genetique crant un code a triplet. sans ponctuarion ni chevauchernenr un ARNm particulier devrait theoriquernent pouvoir etrc rraduir uivant troi cadre de lecture d.iStU1C['. 00 a d'ailleurs rnonrre que certain ARNm conrcnaient des informations chevaucbanre qui pouvaient etre traduites uivant plusieurs cadres de lecture, produisant aloe de polypeptides differcnts (Figure 4-20). Tourefois, 13 grande majorite des ARNm nc peut erre lue que uivant un cadre de lecture, car [es codon top rencentres dans les deux. autres cadres po sible achevenr la traduction avant la production d'une protcine fonctionnelle. Un autre arrangement codanr inhabiruel peut sc produire a La uite d'un decalag« dll cadre de lecture. Dans e cas, la rnachinerie de

Cadre 1

5' ~ IUGullUUAI [eGA] IAuulA- ARNm

Polvpeptide

Cadre 2

5' - .. GtcuuJIGuultu~cl[GAAJ@@--

FIGURE 4-20 Un exemple de la fa~on dont Ie' code genetiql.le - un code' de triplets, sans pllnctuation ni chevauchement - peld i!1re lu suivant differentscadres de lecture. Si la traduction de la sequence d'ARNm presentee commence au niveau de deux: sites dlfferents de debut de la transcriptien, situas en amont (non representssl, alms deux cadres de lecture chevauchants sorrt possibles. Dans cet exemple, les codons som decales d'une base vers la drolte sUI v ant Ie cadre de lectu(e du bas. Dans ce cas, la rnerne sequence nucleotidique speefis des acides arnines distincts au cours de la traduction. Bien que rares. des examples de tels chsvauchernents ont ete dacouverts dans des genes viraux et cellutaires de procarvetes et d'eucaryotes. II est tMoriquement possible pour !'AANm d'avoir un troisierne cadre de lecture.

ynthe c proreiquc pcur lire quarre nucleorides pour specifier un acidc amine pui pour uivre sa lecture par triplets, ou bien ne lire que deu bases puis lire rOUI les triplets suivants, selon le nouveau adre de lecture jusqu'a 13 terminaison de la chaine, Ccs decalages du cadre de lecture ne sont pas couranrs, mais (In en connait quelques douzaines de cas.

La signification de chaque cod nest la rneme chez presque rous les organismes connus - ce qui. est un argument flirt en faveur d'une erigine unique de la vie sur terre. Neanrnoins, Ie code generique differe pour quelques codons dans de nornbreuses mitochondries, chez les prorozoaires cilies cr chez les acetabula ires (des planrcs unicellulaires), Comme lc monrre le Tableau 4-2, 1a plupart de ces hangerncnts impliquent la lecture des odons top habitucls comme des codons d'acides aminzs et non lc rernplacemenr d'un acide amine par un autre. Ces exceptions au code general viennent probablerncnr de developpemenu ulrerieurs dan I'evolucion, Cela signific que Ie code n'a pas Cl!~ fixe une fois pour

TABLEAU 4-2

4.4 • Les trois roles de I'ARN dans fa traduction 121

routes, rnerne 'il n'a pas wlere de changements massifs apres son apparition au cours de I'evolution.

La structure repliee de l'ARNt favorise sa fonction de decodeur

La traduction [ou lc decodage) du langage a quarre mrcleotides de I' ADI C( de l'ARNm vers le langagc ii vingr acides amines des proreincs fait appel au ARNt et au enzymes. ppelee aminoacyiAR.Nt synthetases. Pour parriciper a la yntbe e proreique, une molecule d'ARNt doit ct:~blir une liaison chimique riche en cncrgie a ec un acide amine particuliez, formanr ainsi un aminoacyl-AlcNt. Lanticodon dans I'AR Jt s'apparie ensuire a ec un codon de l'ARNm, de sorre que l'acide amine active peur ecre ajoure a la chaine polypeptidique naissante (Figure 4-21).

Quelque 30 a 40 ARNt different om ete identifies dans le ccllules hactericnnes et [usqu'n 50 ou '100 dans les cellules animales ou vegetalcs. Par consequent, I~ nombre d'ARNt dan' la plupart des cellules est superieur au nomhre d'acides amines utilises au cour de la synthese proteique (20) et differc cgale.ment du nornbre de eodons specifianr de acides amines dans le code gen~rique (61). De ce fait, de nornbreux acides amines possedent plusieurs A RNt au que! se fixer (ee qui e plique pourquoi i! peut y avnir plus d'ARNr qlle d'acides amine ). De plus, de nombreux ARNt peuvent s'apparier avec plus d'UD codon (ce qui explique pourquoi il'peur y avoir plus de codons que d RNr),

La fonction des molecules d'ARNr, qui SOot longue de 70 a 80 nucleoridcs, depend de leur structures tridirnen ionnelles precises, En solution, tomes les molecule d'ARNt e replierrt en un arrangement irnilaire tige-boucle qui ressernble a line feuille de trefle, lorsqu'on les dessine en deux dimensions (Figure 4-22a). Le: quatre tiges ont de courte helices doubles stabilisee par de appariements de type 'Watson-Crick. Trois de~ quarre tiges possedent des boucles ii leur exrrernitc longues de sept a huir bases, tandis que la tige restanrc sans bou lc contienr les exrremltes 3' er 5' de la chaine. Les trois nucleotidcs constituanr l'anticodon sonr situes au centre de la boucle du milieu. dans une position accessible qui facilire l'appariernent codon-anticodon. Dans tous Ie.~ ARNe, I'extrcmite 3' de la :tige acreptrice de l'acide amine, sans

Les exceptions connues au code genetique universel

Codoll

Code universe!

Code inhabiruel"

UGA UG

top

Trp Thr GIn

Leu

AA,UAG UGA

Srop Stop

Cys

Organisrnes conccrnei

Mycoplasme • spiroplasmes mirochondries de nornhreuses c. pcces

Mirochondries de levures

Acerabulaires Tetrahymena, paramecies etc.

Euplores

"Le «cod ... inhabirucl» est utilise dans les genes nucleaires des mg;Jl1iSn1CS indiques er dans les genes mirochondrlaux lorsque c'esr precise. ~CllfIH 1::: S. O,~(lW;l er al., 1991, M!cyohiol. Rev. -6:22:1.

122 CHAPITRE 4 • les mecanlsrnes moleculalres fondamentaux de la .genetique

liaison ester riche en energie

H a / I II HzN-C-C-O

6H2 I

6

Liaison de Phs 11 l'ARNtphe

7"'\\

ATP AMP

+PPI

H 0

I II

H2N-C-C-O

6Hz I

L'ARNtPhese 6~

fixe au codon UUU A

ARNt spacifique de Phe (ARNtPhe)

AM Aminoacyl-ARNt

FIGURE 4·21 Le processus de decodag8 en deux stapes, pour traduire les sequences d'scides nueleiquss de l'ARNm en sequences d'scides amines dans les proteilles. Etape : Une amlnoacyl-ARNt synthetase couple d'abord 1.111 acide amine specifique. par una liaison ester riche en energle (en )aunel it l'hvdroxvle 2' au 3'

boucle, pm~cJe fa equence eGA, qui e r I plus souvenr ajoutee aprc 13 fin de la synrhe . er de fa maturation de l·ARNt. Dans la plupart des ARNt. plusieur bases soot egalcmt'nt modifiee apre leur synthese. En trois dimension, la molecule repliee d' ARNr a une Forme de L ; la boucle de l'anticodon et la tige acceprrice forrnent les exrrernire de deu bras [Figure 4-22b),

Un appariement non standard se produit souvent entre les codons et les anticodons

i un appariemenr e .acr de type Watson-Crick erair exigI: entre les codons et le anricodons, 1 s cellules dcvraienr contenir e acrement 61 sortes differentc d' ARNe, nne pour chaque codon

(a)

= dlhvdrouridlne CD= inosine

(!) '" rlbothvrnidine ® = pseudouridins m .. !jroupement

m6thyle

FIGURE 4·22 La structure des ARNt, (a) Bien que la sequence nucleotrdique exacte varie d'un ARNt a I 'autre, tous les ARNt sa rephsnt en une conformation a quatre tlgas anpanees et trois boucles. La sequence CCA ill I'extremlte 3' est pr~sente egalemem dans tous les ARNt La liaison d'un aeide amine au A en 3' produit un ernlnoecviARNt. Une partie des resides A, C, G et U est modifiee dans la plupart des ARNt (voir en cadre). La cihvdroundine (0) est presque toujours prasente dans Ie boucle 0 ; de meme, la nbothymidine m et la pseudouridine ('PJ sent presque toujours pressntes dans la boucle "['\fICG, L'ARNt pour !'alanine de levure, represents ICI, conueru egalement d'autres bases modifiaes. Le triplet a l'extrernrte de la boucle de l'antrcodcn s'apparie avec Ie codon correspondant dans I'ARNrn. (b) Un mod~le tndirnensicnnel cu squelerte gen~ralise de tous las ARNl. Remarquez la forme de L de la molecule.

Resultllt net:

Phe est selection nee par son codon

5' 3'

ARNm

de l'adenoSlne terminale dans I'ARNt correspondant.Etepe fJ : Une sequence de trois bases dans I'ARNt (I'anticodon) s'apparie ensuite avec un codon dans l'ARNm speci\fal1t I'aeide amine attache. $1 une erreur survient dans l'uns OU I'autre etape, I'acide amine arrone peut ette incorpore dans une chaine polypeptidique. Phe = phenylalanine.

pecifiant un acide amine. ornme nous I'avons vu plus haut cependanr, de nombreusc ccllules possedcnr rnuins de 61 ARNt. L'e plication de ce nornbrc inferi~llr reside dan la pcssihilire pour un merne anticodon d'ARNt de rcconnsitre plu ieurs, rnai pas uecessairemenr rous, les codons corrcspondane a un acide amine. Cene reconnaissance clargie est permise par l'appariement non

randard entre des ba c itue au niveau des positions dire de (lottcmcllt, c'e t-a-dirc, au niveau dc 18 rroi ierne base (en 3') dans Ie codon J'ARNrn ct de 13 premiere base corre pondantc (en 5 ) dans son anncodon d'ARNt,

Les premiere et deuxieme bases d'un codon ferment presque rouiours des al pariernents standard de type Wntson-Crick avec les rroisiernc er deuxieme bases respecrivcment, de l'anri odon

(b)

Boucle rWCG

lige acceptrlee

3'

de I'anticodon

respondant. Neanmoins, quatre interactions non standard peu- 1( e former entre le bases presenres au pc itions de Herre-nr, La pel ire de base G-U est particulierernent importance, car rrespondance structurale est presque aussi bonne que pour In

e standard G-C. Pal' con equent, UD anticodon donne dans r avec un G en premiere position (de flotrerncnr) peut s'ap-

r alice lc deux co dons corrcspondants qui possedent une 'dine (C au U) en rroisiemc position (Figure 4-23). Par pie, les codons phenylalanine UUU er ue (5' 4 3') one d U1C recormus par I'AR t dont l'anueodon est GAA

- :1'). En realire, n'importc quelle paire de codons de type yr ( , '" n'importe quclle base; Pyr = pyrimidine) code tin acide amine cr est decodee par un cui ARNt avec G eo uere position (flortante) de l'anticodcn,

Bien que l'adenine soit rarerncnr prcscnte en position flottan...aIlS l'anticodon, de nombreux ARNt de planres et d'animaux

ARNt
3
5'
Si ces bases sont en
premiere position lflottante)
de I'anticodon
C A G U
1 2 G U C A C alors I' ARNt peut
= ARNm 3' U G A reconnaitre Jes codons
U dans l'ARNm ayant ces .
bases en troisieme position Si CBS bases sont en trois em _ position lflonante) du codon d'unARNm

C A G U

- ARNm 3' 12

G U C A alors Ie codon peut etre

I lUG raconnu par un ARNt ayant

I ces bases en premiere position de "anticodon

S'

3

ARNt

URE 4·23 L'appariement non standard ceden-entlccdon aU au de la position de' fl'ottement. La base en trolsierna pOSition

rantel du codon d'un ARNm, forme souvant un appariement non -rd avec la base en premiere position (flottante) d'un anticodon t. L'appariement tlottant permet II un ARNt de reconnaTtre urs codons d'ARNm {en hautJ. Inversement, il cermet II un codon

e reconnu par plusieurs sortes d'ARNt (en basI. qui portent tous erne acide amine. Aemarquez qu'un ARNt avec J (inosine) en - n flottante peut .. lire >I Is'epcaner avec) trois codons differents ~ un ARNt avec G au U en position de fJottement peut lire deux . Bien que A puisse theoriquement occuper la position flottante - a-mcodor, on ne l'v trouve quasiment [arnals dans la nature.

4.4 • Les trois roles de l'ARN dans la traduction 123

contiennent ii cctte po iition de l'ino ine, un produit de amine de l'adcnine. 'ina ine p ur former des paircs de ba es nun standard avec A, C ct U. Un ARNt po sedam une inosine en po irion de Hortcmenr peut done reconnaitre les codons correspondants dans l'ARNm avec A, C ou U en troisierne position (Ilorranre) (voir Figure 4-23l Pour ceree raison, lcs ARNt contenanr de l'inosine sont abondammem utilises dans la traduction des codons synonymes specifianr un merne acide amine, Par exemple, quaere des six codons specifianr la leucine (CUA, CUC, UU et UUAl . om reconnus par le rnerne ARNt avec l'aruicodon 3'·GAl-5'. L'inosine en position de flortement forme des appariernenrs non randard avec 13 rroisieme base de quarre codons, Dans le c.."l du codon UVA, une paire non tandard .U e forme egalcmcnt entre la position 3 de l'anticodon er la position 1 du codon.

Les amino3ql.ARNt synthetases activent des acides arnines en les liant covalemment aux ARNt

La reconnai ance par un ARNt particulier, du au de codon pecifiant un aeide amine donne, est en fait la deuxierne erape du decodage du message genetique, La premiere etape, 13 fixation de l'acide amine approprie it un ARNt t catalysee par une aminoacyl-Al 't synthetase specifique. Chacunc des 20 syntherases differemes reconnait /171 acide amine ct tOilS ses AR. Tt iscaccepteurs ou appare11tes. C enzymes.de couplage licnr un acide amine a l'extrernirc libre 2' Oll 3' hydroxyle de l'adenosine presente au niveaude l'extremite 3' des molecules d'ARNt,au cours d'une reaction necessitant de \'ATP:. Dans cerre reaction, l'acide ('Imine est lie a. l'ARNt par une liaison richc en energic j on dir alors qu'il est active. L:energie de cettc liaison permer ensuite la formation des liai ens peptidique entre les acides amines adjae nts d'une chaine polypeptidique en cours d elongation. L'equilibre de la reaction d aminoacyJation est encore deplace vers l'activation de l'acide amine par l'hydroly e de la liaison phosphoanhydride riche en energie dans lc pyrophosphate libef(! (voir Figure 4-21).

Certains acides amines am une structure si proche que les aminoa.cyl.ARNt synthetases commettent parfois de erreurs, Elles sont toutefois corrigees par les enzymes elles-mernes, qui possedent une activite de correction d'epreuves (proofreading en anglais) verifiant la correspondance dans leur poche de liai on pour les acides amine .. Si le mauvais acide amine est fixe Ii un ARNt. la synthetase liee caralyse le retrair de cer acide amine de \'ARJ.'Jt. ene fonction essentielle garantit l'apport par un ARNt, d l'acldeamlne correct a la machinerie de synthese proteiquc. Le taux global d'erreur lor de la traduction chez E. coli est tres faible, de l'ordre de I pour 50 000 codons, une preuve de l'importance de l'acrivite correctrice des am.inoacyl-ARNt ynrhetases.

Les ribosomes synthetisent les proit!ines

i les nornbreux compo. ants impliquesdans [a traduction des ARNm devaient interagir librement en solution, la probahilite de collisions simultanees entre eux serait si faible que la polyrnerisarion des acides arnines erair rres lente. L'efficacite de Ia traduction est nerternent accrue par 13 liai on de I'ARNm et de chaque aminoaeyl-ARNr all cornplexe i\RN-proteine le plus abondanr dan la cellule, le ribosome, qui dirige I'elongation d'un polypeptid a une vitesse de 3 it 5 acide amincs par seconde. Les petites proreine de 100 a 200 acides arnines sont done Iabriquees ell une

- - -- -=-----=---- -----------

perire ou -unite ribosomiale contient une eule molecule d'ARNr" que 1'011 appelle Ie petit ARNr. La grande ous-urute conrienc une molecule de grand ARNr et une molecule d'ARNr 5 ,plu une molecule supplernentaire d'ARNr - ,!lS chez les verrebres, Lcs longueurs des molecules d'ARNr, lat qaantite de proteine Jan chaqu ous-unite et done les tail Ie des sons-unites different dans les cellule bacteriennes et le cellules eucaryote . Le ribo orne assemble a un coefficient de sedimentation de 70S chez le bactedes er de 80S chez les vertebres. Mais, plu que les difference" les re semblance rtrucrurale er foncrionnelles entre les ribosome' de routes les e pece ont interessanres, Certe coherence esr un autre argument C[I faveur d'une origine commune clans l'evolution, des can tituants elemenraires de cellule. vivante .

n connair de ormais le equcnces de petit et grand AR r de plusieur milliers d'ergani me . Bien que le sequences nucleotidiques primaires de ce AR:-.Jr varienr considerablement, en theoric les memes partie tie chaque TYpe d'ARNr peuvenr former des structures appariees tige-boucle, ce qui donnerait aux A RNr de rous les organismes une structure rridimensionnclle similaire. Les veri tables trucrures rridirnen ionnelles des AR...'\Jr bacrerien de Tbermus tbermopbilus am recemmenr erc detemlinee par la cri - rallographie aux rayons X du ribosome 70S. Les multiple

124 CHAPITRE 4 • Les mecanismes rnoleculaires fondarnentaux de la genetique

minute ou moins. La titine, la plus grande proteine connue, c t quanr a ellc synth6tisee en 2 a 3 heures, 00 In rrouve dan les muscle et elle cornporre en iron 0 000 acide amincs, La rnachinerie cellula ire qui accornplir cette tache dolt done etre preci e et per everante.

Les ribosomes furenr decouvcns par microscopie .clecrronique,

ou la forme de petites particulcs di cretes riche en ARN dan des cellule qui ccretaient de grande quantires de proteines. Cependant, leur role dan la synrhese protei que 01: fur pas rcconnu avant que de preparations relarivernenr pures de ribo orne aienr pu me obrenue . Des experiences de marquage radioactif ill vitro ur des preparation de ce type montrerent que les acidcs amines radioacrifs eraiellt d'abord incorpores dans des chaine polypeptidique en c ur d'elongarion associees a des ribo OIDC , avant d'apparairre dan les chaines terminees.

Un ribosome e t consritue de troi (chez les bacreries) ou quarre (chez les eucaryoies) molecule differenres d'ARNr et iu - qu'it 83 proteines, II est organise en une grande et line petite sousunites (Figure 4-24). Les sous-unltcs ribosorniales et les molecule. d'ARNr ont genera!emenr designees par leur nomhre d'unites

vedberg IS) une me ure de la vite:. e de edimentarion de particui en su pen ion centrifugee dan des condition standard. La

ARNr

165 (1500 rNTI

70S

+

TotaJ : 21

"S~;'8S 28S: 5,85

(4800 rNT, 160 rNT)

+

Total; 50

5S (120 rNT)

+.

Total: 33

18S (1900 rNT)

40S

FIGURE 4-24 La structure generale des ribosomes chez Iss procaryote! at las eucaryQ\flis. Dans toures las cellules, cheque ribosome est ocnstitue d'une grande et d'une petite sous-unites. Les deux sous-unites contiennent des ARNr (en rouge) de longueurs distlnctes, alnsi qu'un ensemble de proteines qui leur est proprs. Tous Iss ribosomes cornportsrrt deux molecules pnncipales d'ARNr

Ribosomes assembles

80S

tARNr 23S et 16S chez les baetarias : ARNr 285 at 185 chez las vertebres) st un ARNr 55. La grande sous-unite des ribosomes de vertebres possede egalement un ARNr 5,8S apparle a I'ARNr 28S. Le nombre de ribonuclsctldes (rNT) dans chaque type d'ARNr est lndiqua,

4.5 • La synthese des protelnes sur les ribosomes, etape pat etape 125

proteines ribosomiales, om associees avec la surface des ARNr er sonr pOUT la plupart bien plus petites que ceux-ci, Bien que Ie nornbrc de molecules de proteines dan Ies ribosomes excede netremcnr le nombre de molecules d'ARN, ces derniers constituent environ 60 % de la masse d'un ribo orne,

Au COUT de la traduction, un ribosome se deplace le long dune chaine d'ARN, intcragissant avec differenrs facteurs proreique er ARNt et subissant tres probahlernent des changements conforrnarionnels importanrs. En depit de la cornplexire du ribosome, de grands progres ont etc accomplis dans la derermination de la tructure globale des ribosomes bacrerien et dans l'identification de divers sites reactifs. Le etudes par cristallographic aux rayons X du ribosome 70S de T. thcmnopbi[us par exernple, am re\'cle non. eulernenr les dimension cr la forme globs Ie de sousunites ribosorniales, mais ont egalcment permis de localiser les posirions de' ARNt lies au riho orne au cour de i'clongation d'une chaine proreiquc ualssanre, De plus, des techniques chirniques puissantes telles que 13 prise d'empreintes ({ootprinting en anglais), dec rite au Chapitrc 11, ant ete utilisees pour identifier des sequences nucleoridiques specifiques clans des ARNr qui se fixeru it une proteine ou a un autre ARN. Quelque 40 ans environ apre 13 decouverte des ribosomes, leur structure globale et leur foncrioonement au cours de la synrhese proteique om enfin ete elucides cornme nous le verrons dans la section suivanre.

CONCEPTS CLES DE LA SECTION 4.4 Les trois roles de f'ARN dans la traduction

• L'information genetique est rranscrite de J'AD vets I'AID m

DUS la forme d'un code de triplets, degenere, non chevauchant er sa ns poncrua rion,

• Chaque acidc amine est code par une ou plu ieurs equences de trois nucleorides (codon) dan l'ARNm. Chaque codon specific un acide amine, mai Ia plupart des acides arnines sonr code par de multiples codons (voir Tableau 4-1).

• Le codon AUG specifiant la methionine e [ le codon initiarem Ie plus courant au niveau de I'extremite Nli.z-rerminale d'une chaine proteique. Trois codons (UM, UAC ct DCA) servent de codons stop et ne specifienr aucun acide amine.

• Un cadre de lecture, qui est la sequenceininterrompue des codons dans I ARNm it partir d'un codon specifiquc de depart [usqu'a un codon stop, est traduit en une sequence lineaire d'acides amines d'une chaine polypcptidique,

• Le decodage de la sequence nucleotidique de l'ARNm en equence d'acides amine d'une proreine depend des ARNt er des arninoacyl-ARNt syntherases,

• Taus les AR It possedent unc structure rridirrrcnsionnelle 51- milaire qui comporte un bras accepteur pour fixer un acide amine specifique er une structure tige-boucle avec une sequence anticodon de trois bases a ses extremites (voir Figure 4-22). L'anticodon peut s'apparier avec le codon qui lui correspond dan I'ARl"1m.

En raison d'interaction non standard, un ARNt peur s'apparicr avec plusieurs codon. d' ARNm ; inversement, un codon donne peut 'apparier avec de multiples ARNt. Dans chaque ca ccpendant, eul l'acide amine correct peut etre inserc dans

une chaine polypeptidique en cours d'elongarion.

• Chacune de 20 aminoacyl-ARNt synrhera: es reconnalt un scul acide amine er le lie covalemment a l'un de ses ARNt isoaccepreurs, formam un aminoacyl- RNr (voir Figure 4-21). Cette reaction active l'acide amine, lui perrnerrant ainsi de parriciper a la formation d'une liaison pepridique.

.1e5 ribosomes procaryote et eucaryotes - le gros complexes ribonucleoproreiques dan lesquels se default' 13 traduction - sam consritues d'une petite et dune grande sous-unires (voir Figure 4-24). Chaque sons-unite onrient de nombreu es proteine diffcrenre et une molecule principals d' ARl r (petite ou grande). La grande sons-unite coaiporte egalemenr un ARNr 5 dans le bacterie et deu ARNr acccs aires chez les euearyotes (5 cr 5,85 chez les vertebras).

• Des .ARNr analogues appartenant a de nomhreuses especes differentes Sf: replicnr en conforrnarions tridimensionnelles tres sernblables conrenanr de nombreuses structure tigc-bou Ie et des sites de liaison pour de proteines, des AR [m er des AR r. Des proteines riboserniales sent associees a la peripherie des AR.Nr qui sent bien plus grands qu'ellc .

III La synthese des proteines sur les ribosomes, etape par et.ape

Nous avons inrroduit dans les sections precedentes les participant majeurs iii 1[1 synthe~e proteique : I'ARNm, II'S AR 'r arninoacyles et le ribo .ornes coruenant Ie grand et Ie petit ARNe. .Nous allons rnaintenanr considerer en detail Ia fa~on dont ces composants som agences pour executer les evenements biochimiques conduisanr a 13 Formation de chaines polypeptidiques sur les ribosomes. Commc pour la transcription, le processus complexc de la traducrion pent erre divlse en trois etapes - l'initiation, l'elcngationet la termlnaison - que IlOUS allons ccnsiderer ue essivemcnr. t ous limiterons notre description ii la traduction dans les cellule eucaryores, !DaIS le mecanisme de la traduction est fondamenralemenr le meme dans routes Ies ccllules.

Le methionyl.ARNljMet reconnait Ie codon initiateur AUG

Comme nous l'avon dir plu: tot, Ie codon AUG specifianr la methionine sert de codon. de depart dan. la grande majerire de ARNm. Un aspect critique de l'initiarion de latraduction esr le debut d'e la synthese proteique au niveau do codon de depart, afin de definir le cadre de lecture correct pour l'ARNm complet. Le. procaryote et les eucaryote contiennenr taus deux, deux ARNt differents pour la methionine : l'ARNtjM.oC, capable d'initier la synthese proteique er l'ARNtMcr pour importer la merhionine eulement dan la chaine en cours de ynthese, La, me me arninoacylARNt synthetase (MetRS) charge Ies deux ARNr avec de fa methionine, Mais seu/le Met-ARNt;M<' (c'est-a-dire la methionine activee anachee a l'ARNtjMct) peur e lier au site approprie sur la petite sons-unite ribosorniale, le site P pour commencer la synthese d'unechaine polypeptidique, Le Mer-ARNtMe~ habiruel er tous les autres AR t charges se fi em uniquemenr a l'aurre site du ribosome, Ie site A, cornme nou le decrirons plus loin.

126 CHAPITRE 4 • Les rnecanismes moleculaires fondamentaux de la genetique

L'initiation de la traduction se produit gemkalement pres du codon AUG Ie plus proche de I'extn!mite S' d'un ARNm

Au califs de la premiere etapt: d la traduction, un ribosome s'a - semble, en se complezanr avec un ARNm ct 'Ull AR t initiateur Active, qui e r PO. itionne correctement au niveau du codon initiateur, 1-1: petites et grandes sous-unires ribo orniales qui ne om pas acriverncnr engagees dans la tr duction ionr maintcnncs 3 I'e art grace it d ux Iacrcur d'initiation, appeles elF3 er eIF6 eh z les eucaryotes. Un complexe de pre-initiation de Ia rradu rion est forme lor que Ie cornplcxe ou -unire 40 -elF3 est lie par elF lA et un cornplexe ternaire forme du Mct-ARNtiMe" de elF2 et de ,TP (Figure 4-25, erape I). Les cellulcs pcuvcnt reguler la synthe e proteique en phosphorylant un residu ~erine sur Ie faeteur erF2 'lie au GOP; le eomplexe phosphoryle est incapable d'cchangcr Je GDl) lie conrre du GTP et ne peut done fixer le Mct-ARN[jMrt, ce qui inhibe 190 synthese proteique.

Au ours de J'initiation de la traduction, la colffe en 5' d'un AI m a traduire est Iiee par la ou -unite eI:F4E du cornplcxe de liai on de la coiffe, clF4. Le complexe ARNm-eIF4 s'associc ensuire au complexe de pre-initiation par une intern tion de la ousunite cU':4 et de elF3. formanr le complexe d'initiation (Figure 4-25, etape 2). Le cornplexe d'lniriarion glisse probablement alors le long de l'ARNII'l associe, pendant que l'activite helicase de eTF4A utilise l'energie provenant de l'hydrolyse d'AT]>, pour deroulcr 13 structure secondaire de PAR . Le glissement s'arrete lor que l'aneicodon de l,'ARNtjMe, reccnnait Ie codon initiateur, qui est le premier AUG en aval de I"extremire 5' dans la plupart des ARNm euearyote (erape 3). ·b recounais ane du codon initiareur provoque l'hydroly e du GTP associe a eJF2. une crape irreversible qui empeche Ie gli sement de se poursuivre, La 'election du codon A G initiateur est Iacilitee par Ics nucleotides pecifiques environnanr appeles sequence de Kozak. du nom de

Marilyn Kozak qui l'a definie : (5 ) A i.\lKiG (3'). Le A PIece.dant AUG (ell gras) et Ie G qui le uit immediatemear SOIlt [es nucleotides qui affectent le plus l'efficacire de l'iniriation de la traduetion. Uoe fois la petite ous-unlre ribosorniale lice a SOil MetA.RNt/'"<t correcternent po lrionnee ur Ie codon initiateur, I'union avec 13 grande suus-unite ribosomiale (60 ) term inc la formation d'un ribosome 80S. Ceci necessire l'action d'un autre facteur

FIGURE 4-25 L'initiation de Ia traduction chez les eucaryotes. (Encadrs) Lorsqu'un ribosome se di5SOCIe tJ la fin de la traduction, les sous-unites 405 et 60S s'associent aux tacteurs d'initla'tion elF3 et e1F6, tormant des complexes capables d'initier un nouveau cycle de traduction. Etapas D at fAi ; t'addltion sequsntislle des composents indlques au cornplaxs sous-unlte 40S-e1F3 forme Ie cornolexe d'illitiation Etape l§J : La ghssement Ie long de l'ARNm, du complexe d'[rutiatlon assode conduit au posrtionnement de la petite sous-uruts et du Met-ARNtIMo, qui lui est lie, au niveau du codon de depart. ttape

, . L'associatton avec ta grande sous-unite (60S) forme un ribosome 80S capable de traduire l'ARNm. Deux facteurs d'initiation, elF2 latape

) et elF5 (elape !II sent des protsines qui fixent du GTP et cent Ie GTP lie est hydrolyse au eours de I'initiation de la traduction. La moment preCIS auquel chaque Iactsur d'lnJtiation est hMre n'a pas encore ete bien caracterise. Voir Ie texte pour les details IAdapte de R. Mendez & J. D. Richter. 2001. Nature Rev. Mol. Cel18iol. 2:521.)

r ,IF3

y y

elF1A

eIF2-GTP + Met-tRNAiMet (complexe ternaire)

Compl'exe de pre-initiation

.. 1/ elF4 (cornplexe de liaison tala colffe] + ARNm

Met -GTP

----(AAAln

Complexe d'linitiatiol'1

Deroulement de

I a siructu re secondaire. ghssement at reconnarssr nee du sue d'in itiation

ATIP' ADP + PI

eIF1A, elF3, complexe e1F4, eIF2·GDP + PI

SOUS.-Unite. 60S-elF6, eIFS.GTP

II

e1F6, elF5-GDP + PI

Ribosome 80S

-:r:--,;---~-~--_---

I

I I .

, 1 ... , _

4.5 • La synthese des proteines sur les ribosomes, etape par etape 127

elF5) er l'hydrolyse d'un GTI qui lui esc associe (ctape 4). Le ~(}uplage de la reaction de reunion et de l'hydrolyse de GTP rend erre etape irreversible, de sorte que Ie sees-unites ribosomiales peuvent pill se dissocier avant que l'ARNm soit rraduit et la nthese proteique rerminee, Comme DOllS le verrons plus loin, au urs de I'elongation de 101 chaine, Ie polypeptide naissanr reste che a l'ARNt au niveau du site P du ribo orne.

L..1 mschinerie de synehese proteique de eucaryotes commenla traduction de Ia plupart des AR.Nm cellulaires a 100 nucleoenviron de l'extremite portant 1a coiffe 5', comme nous n de le decrire, Cependanr, certains ARNm cellulaires

riennenr un site d'entree interne pour Ie ribosome (IRES pour (T71(1i ribosome entry site en anglais] sil;Ue rres loin en ava I de tremire 5'. De plus, la traduction de ertains ARNm viraux urvus de coiffe en 5' est initiee au niveau des [RES par la chinerie cellulaire des cellules eucaryores infectees, Certains des ~ ur d'initiation de la traduction qui. assistent le glissernent du orne a partir d'une coiffe en 5' sont necessaires pour localiser odon de depart AUG interne. On ignore cependant la facon .. e dam un IRES est reconnu. De resultats recents indiquenr -ertain.lRES e repllenr en une structure d'ARN qui se fixe a 01 ierne site du ribosome, Ie site E, positionnanr alors dans le r un codon AUG interne proche.

cours de I'elongation de la chaine, chaque noacyl.ARNt entrant passe par trois sites sornlaux

implexe eucaryote ribosome 80S.Met-ARNtj''vfc, correcternent nne est mainrenaut pret a commencer l'addition equentie1- a ides amines par 1::1 traduction de I' ARNm suivant le cadre kaure correct. Comme c'esc le cas pour l'initiation, un groupe

roteines spcciales, appelee facteurs d'elongarion (EF pour gation factor en anglais est ne essaire pour executor Ie prod'elongarion de la chaine. Les era pes des de l'elcngation • l'enrree successive de chaque aminoacyl-ARNt, la formation

GURE 4-26 Le cycle d'elongation de la chaine peptidyl au cours a traduction chez. res eucaryotes. Une fois Ie ribosome 80S ernble, avec Ie Met-ARNt,MeI dans son site P (en haut), un complaxe are portant Ie deuxierna ecide amine (aa2) code par I' ARNm se fixe

5 ~e A {etape II,). Apres un changement de conforma1ion dans Ie some, induit par I'hydrolyse du GTP du complexe EFl u'GTP (etape e grand ARNr catalyse la formation d'une liaison peptidique entre

• at aa2 lelape· I). L'hydrolyse du GTP de EF2·GTP pravoque un 're changement conformationnel dans Ie ribosome qui provoque la arlslocation d'une longueur egale a un codon Ie long de l'AANm at _ ace l'ARNtiMel non acyle [uscu'au site E et l'ARNt lie au peptide ::.:squ'au site PIe-tape EI). Le cycle peut recommencer avec la liaison

,. complexe ternaire portant aa3 au site A desormals ouvert. Dans oeuxierne cycle d'elongatlon et les suivants, I' ARNt au niveau du site =: es ejecte au cours de I'etape 16 a la suite du changement de formation induit par I' hydrolyse du GTP de EF 1 u·GTP. Voir Ie texte r les details. IAdaph~ de K. H. Nlerhaus at al., 2000 in R. A Garrett et al .. The Ribosome : Structure. Function, Anribiotics. and Ce/lular toterectoo», Press. p. 319.1

d'une liaison peptidique at Ie deplacemenr, ou translocation, du ribo orne un codon a la foi~ Ie long de I'ARNm.

A. la fin de l'initiarion de la traduction, comme nous l'avons VUI precedemmenr, Ie Mec-ARNt,"M est fixe au site P sur le ribosome 80S assemble (Figure 4-26 ell haut). Certe region du ribosome

Ribosome 80S

Entree de y.

l'aa-ARNt au

slts A

Hydrolyse de GTP, changement

co nfor m atio nne I du ribosome

Formation de a I,

la liaison 5iII

peptidique

Translocation du ribosome

I~ EF20GTP

I, ~. EF2oGDP.,. PI

128 CHAPITRE 4 • Les mecanlsrnes moleculalres fondamentaux dela g~netique

s'appelle Ie site P car I'ARNE fie chirniquement a 13 chaine polypeptidique naissante est situe Ia. Le deuxieme amilloacyl-ARNt est conduit jusqu'au ribosome sous la forme d'un cornplexe ternaiec enassocia tion a vee Eft a,GTP et se lie a u site A, a insi a ppele car e'est lii ou se fixe l'aminoacyl-ARNr (etape n. Si I'anticodon de l'aminoacyl-ARNt ell trant (le denxierne] s'apparie correcternenc avec le deuxieme codon de l'ARNm, Je GTP dans Ie complexe EF1a·GTP est hydrolyse. L'hydrolyse deGTP entraine un changemerit de conformation dans Ie ribosome, 'lui conduit a 13 liaison etroite de l'amilloacyl-AIq-l't dans Ie site A et it 13 liberationdu complexe Ef1a,GDP resultant (trape 2). Ce changernent conferrnationnel posirionne egalement I'exrremire 3' aminoaeylee de l'ARNt dans le site A, tres pres de I.'extremire 3' du Mer-ARNtjM., dans le site P,. :t:hydmlyse de GTP et done 1a fixatiolletroire, n'a pas lieu si I'anticodon de l'aminoacyl-ARNt entrant ae pent s'apparier avec le codon present dans le site A. Dans ce cas, le cornplexe ternaire diffuse au loin, laissanr vide Ie site A qui peur alors s'associer avec d'autres complexes aminoacyl ARNt-EFl,a-GTP; jusqu'a ce qu'un ARNt corrcctemenr apparie soit lie. Ce phenomene contribue a la fidc!itcavec laquelle l'aminoacyl-ARNt COl;'teet est charge dans le site A. Avec le Met-ARNtjMcr dans le site F etle deuxierne aminoaeyl-ARNtetroitement lie au site A, legroupemenr a: amine du deuxieme acide amine reagit avec la methionine « actives " (liee a Pester). sur I'ARNt initiateur, formant alors nneliaison peptidique (Figure 4-26, crape 3 ; voir Figures 4-19 et 4·21), Cette reaction de type pep.tidylt.ransferase est caralysee par Ie grand ARNe. q ui oriente pn§cisement Ies aromes en interaction, cequi permer Ie derculemenr de la reaction. Les proprietes catalytiques du grand ARNr chez les bacteries ont ete Qemontrees par lc retrair meticuleux de la majorire des proteines des grandes SOLlSunites ribosomiales, L'ARNr 23S bacterien quasirnerir pur est capable de catalyser une reaction peptidy1t:ransferase entre des analogues d'ARNtarn1noacylC et Ie peptidyl-ARNt. D'autrcs arguments en faveur elu role catalytique du grand ARNrl'ors de la synrhese proteique viennent d'etudes crisrallographiques montrant qu'ancune proteine ne se trouve pre.s du she de synthese pe la liaison peptidique dans la Structure crisralline de la grande sous-unire bacteeierme.

Apres la synthese de la liaison peptidique, le ribosome subir unetranslocarion Ie long de l'ARNm sur une distance egaJe a un codon. Cctte etape de translocation est permise par l'hydrolyse du GTI? du complexe EF2'GTP euearyore. A la suite de eerre rranslocation, Ii' ARNtlM~\ desormais sans sa methionine activee, est conduit vers le site E (exit, sortie en anglais) du ribosome. Pendant ce temps, Ie deuxierne ARNt, a present lie covalernmenr a un dipeptide [un peptidyl-ARNt) est depJ.ace vers Ie site P (.Figure 4-26, etape 4). La translocation ramene done In conformation du ribosome dans un etat dans lequel le sire A est ouverr et capable d'accepter un autre ARNt arninoacy:le· eomplexe avec Efta·GTP, pour commencer un nouveau cycle d'elongation de La chaine,

La repetition du cyde d'elongation decrit dans la Figure 4-26 conduit a. J'addidon des acides amines un par un a J'cxtremite G-terminale du polypeptide en COUtS de synthese suivant les instructions de la sequence d'ARNm, iusqu'a ee qu'un codon stop apparaisse, Dans Ies cycles ulrerieurs, .Ie changement conformstionnel qui se produit lars de l'lhape 2. ejecte l'ARNt non aeyIe du site E. A. rnesure que la chaine polypeptidique naissante s'allonge,

elle passe par un canal dans la grande soas-unite ribosorniale, sortant par un endroit situe a I'oppose du c(Jte qui inreragit avec la petite sous-unite (Figure 4-27).

Les positions des ARNt lies aux sites A, P er E sent visibles dans 13 structure cristalline du ribosome bacterien detenninee recernrnenr (Figure 4-28), L'appariel1lenr des bases est egalemcnr visible entre les ARNr darn lcs sites A er P' avec leurs cedens respectus dans I'ARNm [voir Figure 4-28, en arriere-plan). VII hybride ARN-ARN de seulemenr trois paires de bases n'est pas stable

(8)

50S

30S

70S

(b)

Polypeptide

3:'

fiGURE 4-27 Un modele ilfaible resolution dll ribosome 70S d'E. coli. (a). l.es photopraphies du haut rnontrant des images prlsas par microsoopie cryoelec:tranique des ribosomes 70S d'E. coli et des sous-unites 5DS et 305. Les photographies du bas prssentent des rnodalss obtsrws par svnthsse de plusieurs dizaines d'images crises seton la mflma orientation. (b) Un modele du ribosome 70S elabore ;!l partir d'images lnforrnatlquss at d'etudes de pontaga chimique. Trois ARNt sant superposes cans las sites A (en rosa), P [en vert) at E [en jaune). La chaine polypeptjdique naissante est anfouie dans un tunnel dans :18 grande sous-unita ribosomiale, qui commence pres de Ia tige acceptrice de l'ARNt dans le site P. lVoir I, 5. Gabashvlll at aI., 2000, Cell 10()":537 : almablament communique par J, Fran~.l

45 • La synthese des proteines sur les ribosomes, etape par etape 129

GURE 4-28 La structure du ribosome 70S de T. thermophilus. qu'elle a ate determinee par cristallographis alll( rayons X. ~ Un modele du ribosome complet vu du cOte schematrse dans 18 re 4-26, avec 18 grande sous-unlte au-dessus et 101 petite sous-unita

J-dessous. Les ARNt presents dans les sites A (en blsul, P (en jaunel E len vert) sont visibles a t'interface entre las sous-unitss, avec leurs les de I'anticodon qui polntent vers Ie bas dans la petite sous-units. ..,R r 165 est en bleu clair. l'ARNr 238 en violet. l'ARNr 58 en rose, -tl m en rouge, les petites proteines ribosomialesen gris fonce et grosses proteines ribosorniales en gris clair, Remarquez la position

- protsines rlbosorniales, essentlellement a la surface ou ribosome, es ARNr, principalement a l'lnterieur. (b) Une vue de la grande sous'e tournee de 90" par rapport a l'axe horizontal de la vue en la). qui rrre la face irrteraqissant avec la petrta sous-unite. Les boucles de

<; des conditions physiologiques, Cependant, de multiples ... actions entre Ies grand et petit ARNr er les domaines gene_ .• I..\. des ARNr [comme les boucles D ct TlPCG) stabilisent les , t dans les sites A et P, tandis que d'autres interactions ARNderecrenr les appariernents corrects codon-anticodon, ce qui sure une lecture correcte du code genetique,

traduction est terrninee par des facteurs de

tion lorsqu'un codon stop est atteint

derniere erape de la traduction comme I initiation et l'elongan, necessite des signaux molecclaires hautement specifiques qui dent du destin du complcxe ARNm-ribosome-peptidyl-AR .t. In a decouvert deux types de proteines spedfiques, les facteus de . • arion ou facteurs de relargage (RF pour release factors en nglais). Le eRFl eucaryote, dent la forme ressemble a celle de

R t, intervient apparemrnent en e fixant au site A du ribosome t en rccormaissanr directemenr les codons stop. Comrne certains s facreurs d'initiation er d'elongarion traite . precedernment, le euxieme facteur de liberation eucaryote, eRF3 est one proteine qui fixe du GTP: Le complexe eRF3·GTP agir de concert avec eRrl pou.r declencher Ie clivage du pepridyJ-ARNt, liberant ainsi

(c1305

l'anticodon des ARNt pointent vers Ie lecteur. Dans Ie ribosome intact, elles s'stendant dans 18 petite sees-unite au les anticodons des ARNt dans les sites A et P s'apparient avec las codons dans I'ARNm. (c) Une vue de face de la petite scus-unlte en Interaction avec la grande sousunite representee en (bl. lei. les boucles de I'anticodon des ARNt pointent vers l'arriere de la page. Les boucles T'fCG et les tiges acceptrices s'etsncent hors de la page et les extremites 3' CCA des ARNt dans les sites A at P pointent vers Ie bas. Remarquez l'opposition strctte entre les riges acceptrices des ARNt dans les sites A et P. qui perrnettsnt au groupement amine de l'ARNt aeyle dans Ie site A de reagir avec Ie C carboxy-terminal du peptidyl-ARNt dans Ie site P (voir Figure 4-19). Dans Ie ribosome intact elles sont sltuees dans ls centre peptidvltransferase de Ie grande sous-unlte, IAdapte de M. M. YU$UPOV at a/ .. 2001. Science 292:883.]

190 chaine prcreique terrninee (Figure 4-29). Les bacreries possedent deux meteors de liberation (RFl er RF2) analogues fonerionnellement a eRPl et un Iacteur de liaison de GTP (RE3) analogue aeRF3.

Apres sa liberation du ribosome, une proteine neosynthetisee adopte en SI! repliant sa conformation tridimensionnelle native, un processus facilite par d'autres proreines appelees chaperons (Chapitre 3). D'autres facteurs de liberation provoquenr ensuite la dissociation du ribosome, liberant ses sons-unites l'ARNm et I' ARNt terminal pour un nouveau cycle de traduction.

Nous pnuvons maintenant voir qu'une au plusieur proteine fixant clUJ GTP participenr a chaque crape de la traduction. Ces proteines appartiennenr ii. la uperfamille GTPasi.que des proreines de commutation qui alrement entre une forme active' lii:e' a du GTP et une forme inactive liee a du GDP (voir Figure 3-29). On suppo e que I'bydrolyse du GTP lie provoque des changements conformationnels dans la GTPa e elle-rnerne ou dans d'autrcs proteines associees, essentielles a divers processus moleculaires complexes. Au cours de I'inlriarion de la traduction par exemple, l'hydrolyse de eIF2·GTP en elF2,GDP empeche la poursuite du glissement du complexe d'iniriation Ie long de I'AR m une fois le site de depart rencontre, et perrnet l'association de la grande so us-

130 CHAPITRE 4 • Les mecanismes moleculaires fondamenlaux de la genetique

3'

r ,RF1 .. R"oGrp

Clivage du

peptidyl-ARNt eRF1 t eRF3-GDP + PI

FIGURE 4-2.9 La terminaison de 18 traduction chez les eucaryotes. l.orsqu'un ribosome portant une chaine proreique naissante attaint un codon stop tUM. UGA ou UAG). Ie facteur de liberation eRF1 pen1:ltre dans Ie complexe nbosomial, probablement au niveau ou a cOle du site A avec eRF3·GTP. L'hydrolyse du GTP lie s'accompaqne du cIi.vage de 18 cha1ne peptidique et de I'ARM dans Ie site P, at da la liberation des ARNtet de deux sous-unltss ribosomlales.

unite ribosorniale a la petite (voir Figure 4-25, etape 3). De meme, I'hydrolyse de EF2·GTP en EE2·CDP au cours de l'elongation de la chaine conduit a la translocation du ribosome le long de l'ARNm (voir igure 4-26, ctape 4).

Les polysomes et Ie recyclage rap.ide des ribosomes augmentent l'efficacite de la traduction

Comme nous I'avons dir plus haur, la traduction d'une seule molecule d' R [m eucaryote cn nne proteine de taille moyenne dernande 30 a 60 secondes. Deux phenomene augmentent de facon

ignificativc la viresse totale a laquelle les cellules peuvent synrheti er une protltne ; Ja traduction simultanee d'une me me molecule d'ARNm par de multiples ribosomes et le reeyclage rapide des OUS-WUtl!S ribosorniales une fois derachees de l'extrcrnire 3' d'un

AR rn, La traduction simultanee d'un ARNrn par de multiples ribosomes s'observe facilernenr au microscope electronique er par de analy e de sedimentation, revelant que I ARNm est fixe a de nomhreux ribosomes portant des chaines polypeptidrques naissantes de longueur croissante. Ces structures, que 1'011 appclle polyribosomes ou polysomes sont apparues circulaires dans les micrographies electrolliques de certains rissus. Des etudes ulterieures de cellules de levure ont permis d'expliquer la forme cireulaire des polysomes er de suggerer I'origine du recyclage efficace des ribo omes ,

Ces etude ont revclc que les multiples copie d'une proreine cytosolique presente dan les cellules eucaryores, la proteine de liaison au poly(A) (PABPI). peuvent lnteragir a 13 fois avec la queue de poly(A) d'un ARNm et la sous-unite 4G du facteur eJJ-4 de levure, De plus la sous-unite 4E du facteur cIF4 de levure sc fixe a l'exw!mire S' d'un AHNm, A ls suite de ccs interactions, les deux extr6mites d'une molecule d'ARNm peuvent etre ponrees par des proteines intermediaires, formant ainsi un ARNm circulaire (Figure 4-30). Les deux exrrernires d un polysome etant relativemenr proches l'une de l'autre, lcs sou -unires ribosorniales qui e derachent de l'extremite 3 sonr po itirmnees pre de l'e:ru:emite 5" ce qui facilite la reinitiation par I'interaction de la ous-unite 40S avec Ie facteur elf4lie a In r.:oiffe en 5'. Le mecanisme cyclique decrit dans la Figure 4-31, qui pent se produire dans de nombreuses cellules eucaryores, perrnet sans doute d'accelerer le recyc1age des ribosomes et done d'augmemer l'efficacite de In I;ynthese proteique.

FIGURE EXPERIMENTALE 4-30 L'ARNm eucaryote forme una structure circulaire grace ill li'interaction de trois proteioes. En presence de la proteins I de liaison au polvlel purifiee (PABPll. de elF4E et eIF4G. les ARNm eucaryotes forment des structures circuleres, visibles ici par micrographia electrooiqua en champ de farce. Dans ces structures, les interactions proteme-protelns at proteine-ARNm torment un pant entre les extremites 6' et 3' de I'ARNm cornrne Ie scharnatise la Figure 4-31. tAimablement communique par A. Sachs.]

- - - ------ -~--~---- -

~

CEPTS CLES DE LA SECTION 4.5 synthese sequentielle des proteil!les sur les, ribosomes

arrni Ie deux ARNt de la methionine presents dans routes ~ Jules, ieul I'un d'eux (AR..l~tj.\'l") intervient dan' l'initia-

e la traduction,

que etape de la traduction - initiation, elongation de la e er terrninaison - necessire des facreurs proreiques spe- 1.1 donr des proreines qui fixent du GTP et hydrolysent Ie '1 qui leur est lie en GDP lorsqu'une etape est terminee.

u cours de I'initiation, IcS rous-unnes ribo omiales s assernI a proxirnite du site de debut de la traduction d'une mod'ARNrn avec I'AR t porranr la methionine aminonale (Mct-AR t,.\'Iet) apparie all codon iniriareur re4-25l.

"elongation de la chalne com porte un cycle repetc de quatre ; La fixarion lache d'un aminoacyl-ARNt entrant au site u ribo orne, la liais on ttroitc de l'aminoacyl-ARNt correct J(C A, accornpagnee de la liberation de Il'ARNr utili e aurant nor. du sire E ; le transferr de If! chaine peptidyl en d'elongation vers l'acide amine entrant, catalyse par le d AR r ct enfin 13 translocation du ribosome vers le couivanr, ce qui deplace done le pcptidyl-ARNt du site A Ie sit e P et l'ARNt desormais non acylc du site P vers Ie

E (voir igure 4-26).

rs de chaque cycle d'elongation de la chaine, Ie ribosome II deu changements conformationnel percus par les proemf qui fixent du 'TP. Le premier changemenr permet la liai-

etroite de J'aminoacyl-ARNt en tram au site A er I'ejection I.JJ ARNt hor du ire E, er le d uxierne conduit a la translo-

• La terminaison de 13 traduction est assuree par deux type de : ceeurs de terminaison : ceux qui reconnaisscrrr les cedens stop ceux qui d'clenchent I'hydrolyse du pepridyl-ARNr {voir Fiare 4-29}.

• I 'efficacite de la ynrhese prordique est accrue par la traducn .irnuhanee d'un rueme ARNm par de multiples ribosomes.

4.6 • La replication de I'ADN 131

FIGURE 4-31 Un modele de ta synthitse proteique sur les polvsomes elrculaires et du recyclage des sous-unltes ribosomiale5. De multiples ribosomes individuels peuvent traduire simuftanernenr un ARNm eucarvots, represente lei sous une forme circulaire stabilissa par des interactions entre des p.otelnas /iees aux extrernites 3' at 5', Lorsqu'un ribosome acheva la traduction at sa drssocie de l'axtrern'te 3', les sous-unrtes ssparees peuvent rapidamant 59 retrouvar pres de /a cOIHe en 5' (m7G} at initler un nouveau cycle de svnthese,

Darn les cellules eucaryores, de interactions ayant de prorcines comrne lntermediair s rapprochcnr les deu extrcrnite d'un polysome l'une de l'autre, ce qui perrner un recyclage rapid des sous-unite ribosomiales er augrnente encore l'cfficacite de la syuthe e proteique (voir Figure 4-31).

tIl La replication de I'ADN.

Maintenant qu no us avons vu comment l'inforrnation genetique codee dan les sequences nucleoridiques de J'ADN est rraduite en

tructures proreiques qui accompli .senr In plupart des Ioncrions cellulaires, nous pouvons apprecier la necessire d'une copie preciS!! des equcnces d'AD au COUfS de la replication de celui-ci (voir Figure 4-1, crape 4). L'appariement normal des bases dans la

rructure en. double helice de l'AD uggera ii. ~ arson et Crick

que les nouveaux brins d'ADN etaicnr syntherises en utili 'ant les brins e istants (parental/x) ornme des matrices pour la formation des nouveaux brin (brins fils) complernentaire de brins parenraux.

Ce modele d'appariement avec une matrice pouvair theoriqucmenr etre produit par un mecanisme conseruatif ou semiconseruan]. Selon Ie mecanisme conservarif, les deux brins fils d'AD ferment un nouvel ADN double brin (duplex) et Ie duplex parental teste inracr. elon Ie mecanisme emi-conscrvarif les brin parentaux sonr separes definitiveroenr cr chacun forme Ull duplex ave le brin fils auquel il 'apparie. De. preuve it'rCfutables du me auisme erni-con servatif de la replication de I'ADN purent erre app nee par une experience de ormais cia sique, realisee par

M. Me el on er W. F. rahl, decrite dans la Figure 4,32.

La co pie d'une rnatricc d'ADN ell un brill cornplementaire e t done une caracteristique commune ii. la replication de PAD et a la rran cription de I' ADN en ARN. Dan lcs deux cas, I'informarion portee par la matrice est censer vee, Chez certains virus, le molecules simples brins d' ARN ervent de matrices a la ynthesc de hrin complemenraires d'ARN ou d'ADN. Cepcndant, dans La grande rnajorire de.'> cas,l'ARN et ['AD ccllulaires sour synrherises a partir d'An double brin pcecxv tanto

132 CHAPITRE 4 • Les mecanismes moleculaires fondamentaux de' la genetique

(a) Riisultats predlts

Mecanisme semi-conservatif

Mecanisme conservatif

Apras doublement dans du 14N

Nouveau

Brins parentaux svnthetlses avec du loN

Apres II n deuxh!lme doublement

dans du '~N

H H

L l

L L

l l

l

F1GURE EXPERIMENTALE 4-32 L'experience de MeselsonStohl a montre que I'ADN se replique par UII mecanisme semi:conservatlf, Dans cette experience, des cellules d' E. coli sont d'abord mises an culture sur un milieu contenant des sels d'ammonjum prepares a partir o'azote « lourd )) (H pour heavy en englais) (16N) jusqu'a ce que I'ADN cellulaire soit marque. Apres Ie transfert des cellules sur un milieu contenant I'lsotope c( Jeger » [L pour light en anqlais) normal Il4Nt, les echantillons sent prsleves perfodiqosrnent des cultures et I'ADN de chacun est analyse par une centrifugation en gradient de densita a I'equilibre (voir Figure 5-371. Cene technique permet de saparer les duplex louro-leurd (H-H), leger-leger IL~U et 10urd~Jeger (HL) en bandes distinctes. la} La composition attendue des molecules filles doubles brins synthetisees a partir d'ADN marque au 15N apres Ie transfert des cellules d'E. coli sur un milieu contenant du 14N, SI la replication d'ADN se deroule suivant un mecanisme conservatif ou serni-conssrvetif. Les brins lourds parentaux (H) sont en rouge et les brins legers (Lt, svnthetises apres Ie transfert sur un milieu contenant du ldN, sont en bleu. Remarquez que Ie mecanisme conservatif ne produit 8IJCUn ADN H-L et que Ie mecanisme serni-consarvatlf ne produit jamais d'ADN H-H maisdonne lieu a de I'ADN H-L au cours de la dsuxieme duplication et des duplications suivantes. Apras des cycles supplernentalres de replication, les brins marques au l6N (H) provenant des ADN onginaux sent dilues, de sorts que la grande rnaiorite de I'ADN

Les ADN polymerases ant besoin d'une amorce pour initier la eplication

Comme l' ARN I'ADN est synthetise a partir de desoxynucleosidcs 5'-ttipho phare precurseurs (dNTP), Comme dans fa synthese d'ARN egalement, la synthese d'ADN a roujours lieu dan le sens

H H

->.

H L L H

L

Generation

Melange de 0 et 1,9

MePangel de 0 et 4,1

(Ib) Resultats reels

Densite-

o

0,3

0,7

1,0

1,1

1,5

1,9

2,5

3,0

4,1

L L H-L H-H

Densite-+

est constituee de duplex L-L avec les deux mscanlsmes. (b) Las distributions de bandes obtenues dans la rea lite avec I'ADN sournls a uns centrifugation en gradient de dsnsite a I'equliibre avant et eorss Ie transfertdes cellules d' E. coli marquees au laN vers un milieu contenant du ldN. Les bandes d'ADN sont visualisees so us lumiare UV puis photopraphiaes. Les traces a gauche sont une mesure de la densite du Signal photographique at done de la concentration d'ADN, correspondent aux cel1ules centrifuqees de gauche a droite, La nombre de generations (Ie plus ill gauche) qUI suit Ie transfen sur Ie miheu contenant du l4N a ete determine d'apres la concentration des callules d' E, coli dans la culture, Cette valeur correspond au nombre de cvcles de replication de I'ADN qui ont eu lIeu au moment du prelevernent de I'echantillon, Apr6s una generation, rout I'ADN extrait est de I'ADN de uensue H-L. Apres 1,9 generations, environ la mortis de I'ADN est de I'ADN H-L at I'autre rnoitie. de I'ADN L·L, La fraction d'ADN constituee de duplex L-L augments avec Ie nombre de generations; aucun duplex H-H n'apparait jamais. Ces resultats correspondent aux resultats preons pour Ie mecanisme de replication serni-conservarif decrit en (a). Les deux csllules csntrituqees du bas contiennent des melanges d'ADN HH et d'ADN isola apres 1,9 et 4,1 generations afin de montrer clalremen les positions des ADN H~H, H~L at L-L dans Ie gradiant de densite IPartie (b) d'apres M. Meselson & W. F Stahl, 1958, Ptoc. Nst]. Acad. Sci. USA 44:671,]

5' -+ 3'car I'allongernenr de la chaine resulre cit: la formation d'unc liaison phosphoester entre !'oxygene 3' d'un brin naissanr ct le phosphate a d'un d -P ( oir Figure 4-9), Comme nous l'avons dit plus tOt, LIne ARN polymerase peur trouver un site approrri~ d'initiation de la transcription sur un duplex d'AD er inirier la synthcse d'un ARN complementaire au brin rnarrice d'AD . (voir

Figure 4-10). A l'inverse, les AD polymerases sont incapables d'initicr de nOllo la synthese d'une chaine. En effet, ellesont besoin d'un courr brin d'ARN ou d'ADN preexistant, appele amerce, pour commencer la synrhese d'une chaine. A partir d'une amerce appariee au brin rnatrice, une ADN polymerase ajoure desdesoxynucleotides au groupement hydroxyle libre a l'extremite 3' de l'amorce, en respeetant la sequence du brin matrice ;

Amerce

5' \

3' IIIIII /'

BriD rnatricc

3'

II I I II I III 5'

Lorsque l'amorce est un fragment d'ARN, Ie brin fils forme est constitue d'ARN au niveau de l'extremite 5' er d'AD a l'extremite 3'.

L'AON double brin est detoule et les brins fils sont formes au niveau de la fourche de replication de 'ADN

Pour que l'ADN double brin serve de rnatrice au cours de la replication, les deux brins enrrelaccs doivent erre deroules afin de rendre Ies bases disponibles pour un appariemenr avec les bases des d TP polymeri es en brins fils. e deroulemeut de brins parentaux d'AD est assure par des helicases specifiques et commence au niveau de egments uniqucs dans une molecule d' ADN,

ppeles origines de replication ou simplemenr origines. Les "equt:nce~ nucleoridiques des origines de replication d'organisrrres lIfferents varient considerablemenr, bien qu'elles contiennent g;eneraJement des sequences riches en A·T. Une fois que le helicase om deroule l'ADN parental au niveau de l'origine de replicarion, une ARN polymera e speciali ee appelee primase ynrhetise une courre amerce d'AR complernentaire des brins matrices d~rouJes, Vamorce, toujours appariee a son boo d'ADN com plemenraire est ensuite allongee par une ADN polymerase, formant 3lD. i un nouveau brin fils.

La region d'ADN au niveau de laquelle es proteines se groupent pour realiser la synthese des brins fil e t appelee fourche de replication, au fourche d'elongation. A me sure de l'avancec de la repli arion, la fourche de replication et les proteine associees -',HoigneTlr de I'origine. Cornrnc nous l'avons note precedernrnent,

deroulemenr local de I'ADN double brill produit une contra inte de rorsion qui est soulagee pat la ropoisornera e 1. Pow- que Ies AD polymerases se deplacenr le long du duplex d'ADNet le copient, l'helicasc doit derouler sequentiellernent Ie duplex et Ia ropolsornerase doit supprimer les supertours qui, e forment,

La fourche de replication rencontre deux prohlerncs resultant des proprietes de I'ADN : les deux brins du duplex parental d'ADN sont antiparalleles er les ADN polymerases (de meme que Ie ARN polyrnerases) peuvent ajouter des nucleorides aux nouveaux brins en COULS d'elongation uniquement dans Ie sens 5'43', La, synthase d'un brio fils, appele brim preecee, peut se derouler de fa~n continue a partir d'une amerce unique d'ARN dans le sens 5'-+ 3', qui 'est le meme sens que celui du deplacement de fa fourche de replication (Figure 4-33). Le probleme vient de la synthese de l'autre brio fils, appele brin tardif.

La croissance de ce brin tardif devant se derouler, EUe aussi,

4.6 • La replication de I'ADN 133

5' 3'

- Site de re.union

5'

Sans de deplaeernent de Ja fourche

FIGURE 4·33 Une representation schernatique de la synthese d'ADN SUI Isquelle ligurent Ie brln precoce et Ie brin btrdif au niveau d'une fourche de, replication, Les nucleotides sent alcutes par una ADN polymerase dans Ie ssns 5'-+ 3' (indique par la pointe des flechss) ill chaque brin fils en cours d'elongation. Le brin preeoce est syntMtise de facon continue a partir d'une amorce unique d'ARN (en rouge) au niveau de son extrernits 5', Le brin tardif est svnthetiss de facon discontinue a partir de multiples amorces d'ARN, formess perioclquernent au fur et a mesure du deroulement d'une nouvelle legion du duplex parental. L'elonqation de ces amerces produit inltialement des fragments d'Okazaki. Lorsque chaqua fragment approche de l'arnorce precedente, eelte-ci est snlevee et les fragments sent reunis. La repetition de ce processus aboutit a la svnthsse du brin tardif cornplei.

dans lc sens 5'----" 3', la copie de son brin matrice doir d'une facon ou d'une autre, se derouler dans le sens inverse de celui du deplacement de la fourche de replication. Une cellule rcmedie au probleme ell synthetisaut U11e nouvelle amerce routes les quelques centaines de bases environ sur Ie econd brin parental, a rnesure que le brin est expose gcace au deroulement par l'helicasc, Chacune de ces amerces, appariee a son brin rnatrice, est allongee dans le sens .5' -4 3', formam des fragments discontinu appeles fragments d'Okazaki d'apres leur decouvreur Reiji Okazaki (voir Figure 4-33), lJamorce d'ARN de chaque fragment d'Okazaki est retiree puis remplacee par une chaine d'ADN syntheti ee a partir du fragment d'Okazaki voisin, Enfin une enzyme, l'ADN ligase reunir les fragments adjacents.

L'helicase, la primase, les ADN polyrnerases et d'autres proteines participent a la r~plication de I'ADN

La comprehension detaillee des proreines eucaryotes qui participent a la replication de l'ADN a nertement progresse gra.ce .a des etudes de petits ADN viraux en particulier I'ADN de SV40, le genome circulaire d'un petit virus infecrant les singes. La FigULC 4-34 deceit le multiples proreine qui coordonnent la copie de I'ADN de SV40 au niveau de Ia fourche de replication. Le proteines assemblees au niveau de la fourche de replication illustrenr elles aussi Ie concept de machineries rnoleculaire inrroduit au Chapitre 3. Ces complexes a cornposants multiple perrnerrenr a la cellule de reali er une sequence d'cvenements pour executer des functions ceiluJaires complexes.

'34 CHAPITRE 4 • Les rnecanlsrnes moleculaires fondamentaux de la genetique

(al Fourche de replication de I'ADN de SV40

5'

Brin prscoce

FIGURE 4-34 Un modele d'une fourche de replication de I'ADN de SV40 et des protelnes assemblees. (e) Un hexamare de I'antigene grand T (U) une proteins wale, joua Ie rOle d'Mlicase en dsroulant les brins parentaux d'ADN. De multiples copies de la protsine helerotrimerlque RPA sa tlxem a des regions simples brins da la rnstrice parentale, dsroulee par I'antigene grand T (6). La brin precoce est synthe1ise par un complexe forme de I'ADN polymerase 11 (Pol 8), de PCNA at de Rfc ( J. Les amorces pour la svnthese cu orln tardif [an rouge, I'ARN ; en bleu clair, I'ADNI sent svntbatlsees par un complexe forme de I'ADN polymerase a (Pol a} at de la primase (10), L'extremite 3' de cheque amerce svnthetisee par Ie complexe Pol a-primase est ensuite liee par un complexe PCNA-Rfc-Pol 6, qui allonge l'amorce et svnthetise la plus grande partie de cheque fragment d'Okazaki (-). Voir Ie exte pour les details. (bl Les trois

Dans la machinerie moleculairc qui replique "ADN de SV40, un hexamere d'une proreme virale appefe' alftigt!1re grand TderouIe Ie brins parcntaux au ni eau d'une fourche de replication, Toutes Je autres proreine impliquees dans la replication de I'ADN de SV40 sent [ournies par la cellule hOre. us amerces des brio fils preco e er tardif sont ynrhetisees par un complexe forme d'une primase qui synthetise une courre amerce d'ARN ct d'unc

Brin tardlf

5'

(b) peNA

5'

sous-unrtes de PCNA, presentees dans des couleurs differentes, forment une structure circulalre avec un orifice central par leQuel passe I'ADN double brin. Un schema d'ADN est rnontre au milieu d'un modele en ruban du trirnere de PCNA. (ci La grande sous-uoite de RPA contlent deux domaines qui flxent de l' ADN sImple brin, A gauche, les deux domaines de liaison ~ I'ADN de RPA sent representes perpendiculairernem au squelette d'ADN [Ie squelette est en blanc avec des bases en bleu). Hernarquee que Ie brin unique d' ADN est allonge avec ses bases exposees, en une conformation optimals pour la replication par une ADN polymerase. A droite, la representation est vue du dsssus de I'ADN simple brin, revetarn la faeon dont les orlns fJ de RPA entourent I'ADN. [Partie la) adaptee de S. J. Flint 81 st., 2000. Virology, Molecular Biology, PathogeneSIs, and comro; ASM Press; partie fbI d'apres J. M. Gulbis III al., 1996. Cllr187:297 ; partie (e) d'apres A. BochlcarSIi et al., 1997 NaM8 385: 176.]

ADN polym.erase a (Pol a) qui allonge l'amorce d'ARc avec de d60 ynucleotid« , Iormenr une amorce mixtc ADN-ARN.

t'amorce e r alloogee en un bria fils d'AD par I'A DN polymerase () (Pol 8) qui com met moins d'errcurs au cours de la copie du hrin rnarrlce que Pol a. Pol 8 forme un cornplexe ave Ric (facteur de replication ) er PC 'A (anrigene nucleaire de la preliferation cellulaire) qui ddplacc Ie cornplexe prima e-Pol a: apresla

ynthcse de l'amorce. Comme l'illustre la Figure 4-34b, PCNA e t une proteine hornotrimerique qui possede un orifice central par lequel passe le duplex fils cl'ADN, erapechanr ainsi le cornplexe PCNA-Rfc-Pol 8 de se dissocierde la matrice,

Apres 1a separation de !' AD parental en deux matrices

imple brins au niveau de In fourche de replication, de multiples opies de la proreine heterotrimerique RPA (prorcine de replicanon l, s'y fixent (Figure 4-34c). [a fixation des R PA rnainrient 1a matricc dan' un conforrnation uniformc optimalc pour qu'ellc ir copiee par Ies AnN polyrnerases. Les proteines RPA liees one

elogees des brins parentaux par Pol a et Pol 8, a rnesure qu'elle nthetisenr les brins complementaires apparies aux brim paren-

Plusieurs proteines eucaryores intervenant dans la replication j I'ADN ne sont pas representees dans la Figure 4-34. Une ropomerase 'associe a I' ADN parental derriere l'helicase pour supnmer la ccnrrainre de torsion cr6';c par le deroulemenr des hrins " renraux, La ribonuclease H et FEN 1 retirent les ribonucleotides au niveau des extremites 5' des fragments d'Okazaki ; ils sonr itc remplaces par des desoxynucleotide ajoutes par I' AD erase 8loIsqu'elle allonge le fragment d'Okazaki en arnonr,

- fragments d'Okazaki successifs sont reunis par I'WN ligase

- t: ' des liaisons phospho ester standard 5' ~ 3'.

replication de I'ADN se deroule gene.ralement dans deux sens it partir de chaque origine

mme I'indiquent res Figures 4·33 er 4<34, ICS deux brins paren..eX d'AD exposes par un deroulernent local au niveau d'une IU'Che de replication sent copies en brins fils. En theorie, la replion de I' AD a partir d'une origine devrait impliqucr une .irche de replication se deplacant dans un seul sens. Ou bien, .:1..'>;; fourches de replication pourraiear s'assembler au nivcau une meme origine et se deplacer en ens inverse, conduisanr a la

~ . sance bidireaionnelle des deux brins fils. Plusieur types 'experiences, dont celle illustree dans 13 Figure 4-35, ont fourni • - element en, faveur d'unc elongation bidirectionnelle des brins. Le con ens us general est que route IC$ cellule procaryores et ocaryotes utilisent un mecanisme bidirectionnel de replication de

':\0 . Dans le cas de l'ADN de SV40, la replication est initiee

la fixation de deux helicases hexameriques de l'antigene grand -, au niveau de l'origine unique de V40 er par l'assernblage d ,JlUtres proteines pour former deux fourchcs de replication. elles-ci s'eloignenr alors en sen invers de I origine de SV40 er la mrne e de brins precoces er tardifs a lieu all niveau des deux urches, Comme I.e montre la Figure 4-36, [a fourche de replican de gauche execute la synthese d'ADN ver la gauche; de . erne, La fourche de replication de droite poursuit 13 synthase d' ADN vers La droite.

Au contra ire de l'ADN de SV40, les molecules d'AD. row" rnosornique eucaryore comportenr de multiples origines de replication separees de dizaines yoke de centaines de kilobases, Une proreine a six sons-unites appelee ORC (Cornplexc de Reconnaissance de l'Origine) se fixe a chaque origine et s'associe a d'autres proreines neccssaires pour charger de helica es hcxameriques cellulaires constituees de six proteine M'CM homologues. Deux helicases MCM opposees separent les brins parenraux au niveau d'une originc er des protcines RPA sc fixent a I ADN simple brin resultant. On suppose que la bynthese des

4 .. 6 • La replication de I'ADN 135

Site de restrictio n

Origine pour EcoRI

o E,oRI

Chromosome viral circulalre

c

Bulle de .21

. /' replication 1~

I----<~ I ~~

1 i.u~1

,(I) ~

CI).Q oQ) oQ)

8~1

~11

FIGURE EXPERIMENTALE 4-35 Une mlcrographie electronlque d'un ADN de SV40 en COUfS de replication montra Ie croissance bidirectionnelle des brlns d'ADN il pal1ir d'l,me Drigins . L'ADN viral en cours de replication dans des cellules infectees par SV40 a ete coupe par I'enzyme de restriction EeaRl, qui reconnait un site dans I'ADN clrculairs. Les micrographies electroniques d'echantlllons traites ont rnontre una collection de molecules ccupess avec des « bulles I) de replication de longueur croissante, dont Ie milieu est a distance constante de chaqua extrsrnite des molecules coupses. Cette decouverte s'accorde avec une elongation bidirectionneUe de la chaine a partir d'une origine commune situee au centre de la bulle, comme 1'11- lustrent les schemes correspondants. IVoIr G" C, Faraed et et.. 1972. J. Viro/ 10;484 ; photopraphies aimablement comrnuruquees par N. P. Salzman .. 1

amerces er les eta pes uivante de la replication de I' ADN cellulaire sent analogues a celles de 13 replication de ['ADN de SV40 (voir Figures 4-34 et 4-36)_

La replication de I' ADN cellulaire er d'autres evenements conduisaur a la proliferation des cellules sonr finerncnr regules, ce qui perrnet In production du nombre approprie de cellules dans chaque tissu au cours du dcveloppernenr et durant route la vie d'un organisme, Comme pour 1a transcription de la plupart des genes, le controle de l'etape d'initiarion est le mecanisme principal de regulation de la replication de ['ADN cellulaire, L'activation de I activite helie-ase des MCM, necessaire pour initier 13 replication

FIGURE 4-36 Le mecanisme bidirectionnel de la replication d'ADN. La fourche de replication de gauche est ici comparable a Ie fourche de replication decrite dans la Figure 4-34. qui rnorrtreeqalernent d'autres proteines que I'antigene grand T. (En hautl Deux grandes helicases hexarnartques d'antigene grand T sa fixent d'abord en sans inverse a I'origine de replication. ttape D : En utllisant I'energie fournie par I'hydrolyse d'ATP, les helicases se depl'acent en sens inverse, dsroutant I'ADN parental et produisant des matrices simples brins auxquelles se fixent des prctsmes RPA Etape II: Les complexes primase-Pol a svnthatisent de courtas amorces apparlees avec chacun des brins parantaux saperes. Etape IJ: Les complexes peNA-RfcPolo remplacent les complexes primase-Pol a et allongent les courtes amorces. svothensent les brins precoces (en vert toncel au niveau de cheque fourche de replication. ftape .11: Les helleases continuant a derouter lee brins parentaux et des protsines RPA se fixent aux regions simples brins nouvellement sxposees. Etape 1,;1: Les complexes peNA-Rlc-Pol a corrtlnusm a allonger les brins precoces. Etape 1m:

Les complexes prirnase-Pol a synthetisent des amorces pour la synthase des brins tardifs au niveau de chaque fourche de replication. ttape .1: Les complexes peNA-Rfc-Pol a d~placent les complexes primase-Pol a et allongent les fragments d'Okazaki des brins tardifs (en vert clair) qui, pour finir, sent ligatures aux extrernttes 5' des brins precoces. Le site de ligature est represarrte par un cercle. La replication se poursuit en continuant Ie deroulernent des brins parentaux at la svnthese des brins precoces et tardifs com me dans les eta pes II a D. Bien que representss comme des etepes distinctes pour des raisons de simpllcite, Ie deroulernent at la synthese des brins precoces et tardifs ont lieu snnultanernent.

136 CHAPITRE 4 • Les mecanisrnes rnoleculalres fondamentaux de la genetique

Helicases

IIloeroulement

1J1s~nthe~e de I'amorce du brin precoce

111 Allongement du btin precoce

IIloeroulement

-

II! Allongement du brin precoce

•. lsynthese de I'amorce du brin tardlf

IJ 1 Aliongement du brin tardlf

ligature des fragments

de I' ADN cellulaire, est regulee par des proteine kinases speerfiques appelees kinases dependant des cyclines au cours de la phase S (ou kinases cycline-dependantes de la phase S). D'autres kinases cycline-dependantes regulent d'autres aspects de la proliferation cellulaire, y compris le pr essus complcxe de la mitosc par lequel une cellule eucaryote e divise en deux ccllules fillcs, Nous rrairerons au Chapirre 21 des differcnts mecanismes regulateurs qui determinenr lc taux de division ccllulaire,

CONCEPTS CLES DE LA SECTION 4.6 La replication de I'ADN

• Chsque brin d'un duplex parental d' ADN serr de matrice pour la synthese d'un brin fil et reste apparie au nouveau hrin, formam un duplex fils (mecanisme semi-conservatif). Les nouveaux brim sont synthcrises dans Ie sens 5'_ 3'.

La replication commence au niveau d'une sequence appelee origine de replication. Chaque molecule d'ADN chromosomique eucaryore conrienr de multiples origines de replication.

• Les ADN polymerases, au contraire des ARN polymerases, ne peuvent derouler les brins des duplex d'ADN et ne ont pas capables d'initier la synthese des nouveaux brins, complementaires des brins marrice .

Au niveau d'une fourche de replication, un brin fil (le brill precoce) est allonge de facon continue. I.:autre brin fils (le brin tardif est forme d'une serie de fragments d'Okazaki disconrinu , a partir d'arnorces synthetisees rourcs les quelques cenraine de nucleotides (Figure 4-33) ..

• Les ribonucleotides presents .al.'extremitc 5' de chaque fragment d'Okazaki sont retires et remplaces par I'elongation de l'extrernire 3' du fragment d'Okazaki suivant. Enfin, les fragments d'Okazaki adjacents onr reunis par I'ADN ligase.

• Le helicases utilisent l'energie liberee a partir de l'hydroly e d'ATP pour separer Ie brins parcnraux d'AD (matrices). La prima e ynrhetise une courre amerce d'ARN, qui rcste appa· riee a I'AD matrice, Cclle-ci est initialernent allongee au niveau de I'extremite 3' par I'ADN polymerase a (Pol a), formant ainsi un court brin flIs AR (S')-AD P').

=--=-~------ -

J ...

I- La plus grande partie de I'AD des cellules eucaryotes est synthetisee par Pol ~, qui prend lc relais de Polo: et poursuit l'elongation du brill fils dans Ie sens 5' ~ 3'. Pol S reste as 0-

ciee de fa~on stable a la matrice en se fixant alia proteine Rfc ui lie a son [Our rCNA, une proteinc tri.merique encerclant DN double brim fils (voir Figure 4-34).

• La replication de \'ADN se produit generaiernenr grace a un mecanisme bidirectionnel au cours duquel deux fourches de re-

·-arion se forment au niveau d'unc origine et se deplacenr en inverse, les deux brins matrices etanr copies au niveau de ue fourche (Figure 4-36).

ynrhe e de I'ADN eucaryote in uiuo est regulee grace au 61e de I'activitc des helicases MCM qui initient la replicad'ADN au niveau d'origincs multiples, espacees Ie. long de n- cnrornosomique.

les virus: des parasites du systeme enetique des cellules

virus ne peuvent se reproduire par eux-rnemes. TIs doivent _ nionner la machinerie de la cellule hote pour synthetiscr proteines et dans certains cas, repliquer leur genome. Les . it ARN, qui d'ordinaire se repliquent dans le cytoplasmc de cdluJe bote possedent un genome constitue d'ARN. Les virus a • quam a. eux, se repliquent genera.lement dans le noyau de la hike er ont un genome compose d'ADN (voir Figure 4-1). .. flames viraux peuvent eIre simple ali double brin selon le

oe virus considere. La particu!e virale complete, que ron e un virion, est constituee de l'acide nucleique et d'une cnveproteique externe. Les virus lcs plu simples contiennenr - ez d'ARN OU d'ADN pour coder quatre proteines ; le mplexes posse dent de quai coder 100 a 200 proteines .. En leur importance evidente cornme sources de rnaladi , le peuvenr eIre des outils de recherche extremement utile pour e des processus biologiques [ondarnentaux.

plupart des gammes d'hotes des virus sont . ees

surface d'un virion cornporte de nembreu es copies d'un type proteine, Celles-ci se hem specifiquemeur it de multiple es d'un recepteur proteiquc situees a La surface d'nne cellule

- c. Ccrtc interaction determine la gamme d'hotes - l'ensemble

~ types cellulaires suscepribles d'erre infectes par un virus - er que Ie debut de l'infcctien. La plupan: des virus out UIlC mmc d'hotes assez limitee.

Les virus qui infecrenr uniquement des bacteries sont des ctcriophages. ou, plus sirnplement, des phages. Les virus qui -tcctent des cellules animales ou vcgctales sont generalcment ignes par les termes de virus animaux ou virus vegetaux.

uelques virus peuvenr e developpcr a la fois dam les planres et in ecre qui s'en nourris enr, Ces insectes tres mobile servenr

e vecteur pour le transferr des virus enrre des plantes hates senblcs, Le gammes d'hotes etcndues sonr egalernenr caracterisque de terrains virus srricremenr animaux, tels que Ie virus de la stomatite vesicu.laire, qui sc dcve\llPpe chez des insectes vectcur et cbc7. oe nombrellX types de mammiferes. La plupart des virU5

4.7 • Les virus: des parasites du systerne genetique des cellules 137

animaux cependant restcnr dans la rnerne serie evolutivc er cerrains (comme le poliovirus) infectenr des especes etroirement apparenrees telles que les primates. La gamme de cellules hotes de certains virus animaux est rcstreinre a un nombre encore plus lirnire de types cellulaires, car seules ces cellules possedenr des recepteurs de surface auxquels les virions pcuvent se fixer .

Les capsides viraJes sont des successions regujjeres d'un ou de quelques types de proteines

L'acide nucleique d'un virion est enferrne a l'interieur d'une enveloppe proteique all capside, constitucc de multiples copies d'une proteine ou de quelques proteines differentes, chacune eranr codec par un seul gene viral. En raison de cette structure, un virus est capable de codeJ; route I'information necessaire a I" fabrication d'une capside relativement grande avec un petit nombre de genes. Cerre utilisation efficaee de I'inforrnarion genetique est importante, puisque seule une quantire limitee d'ARN ou d'ADN et don.c un nombre restreint de genes, peut tenir dan une capside de virion. On appelle nucleocapside une capside et l'acide nuclcique qu'elle contient.

La nature a rrouve deux moyens elementaire pour arranger les nombreuses sous-unites proteiques de la capside er lc genome viral en une nucleocapside, Chez certains virus, de multiples copies d'une rnerne proteine de la caps ide formenr unesrructure helical'dale qui renferme et protege J'ARN ou I'ADN viral, situe dans le sillon de l'helice au sein du canal forme par la proreine ... us virus possedanr une relle nucleocapside helicoidale, rels que [e virus de Ia rnosarque du rabac, ont une forme de baguette. L'autretype Structural important est construit sur la base de l'icosaedre, un objet solide approxirnarivcmenr spherique constitue de 20 faces idenriques, qui ont chacune la forme d'un triangle: equilateral.

Le nombre et l'arrangement des proteines de l'enveloppe chez les virus icosaedriques, ou quasi-spberiques different quelque peu en fonction de leur taille. hez les petits virus de ce type, chacune des 20 faces triangulaires est constituee de trois sous-unite proreiques Idenriques, cequi fait un total de 60 sous-unites par capside. "Ioutes les sous-unites proreiques sent en contact equivaletu les unes avec les autres (figure 4-37a). Chez les grands virus quasisphcriques, chaque face de l'icosaedre est constiruee de plus de trois sons-unites. Pour cette raison, Ics contacts entre les sousunites qui ne sont pas aux sommets soot quasi-equivalents (Figure 4-37b). Des modeles de plusieurs virus quasi-sphcriques, obtenus par microscopie cryoelectronique, sont presenres dans la Figure 4-37. Chez le virus plus petits (cornme le poliovirus), les sillons qui encerclent cha un des sommers de la structure icosaedrique interagissent avec les recepreurs pre ems iii la surface des cellules hotel> au cours de I'infection. Chez les virus plus gros (cornme les adenovirus), de tongues p.rot.emes en forme de fibres qui. s,(hendenr it partir de Ja nucleocapside inreragissent avec les recepteurs presents a la surface des cellules hotes.

Chez de nornbrcux bacteriophage it AnN, I'ADN viral est situe dans une .. tete" icosaedrique arrachee iii une .. queue" en forme de baguette. Au cour de I'infection, les proteines virales presences a I'extremire de la queue se fixem aux recepieurs de la cellule hote., puis l'AD viral gagne le cytoplasme de la cellule hote en passant par la queue.

Chez cerraim virus,. I'arrangement symerrique de la nucleocapside ·est recollverr d'une membranecxterne eu enveloppe

138 CHAPITRE 4 • les mecanlsmes moleculalres fondamentaux de la genetique

(a) Petits virus lcosaednques

SV40

10 nm L-J

Poliovirus

L- __

CPMV

FIGURE 4-37 La structure des virus quasi-spherlq:ues [iCOS8,' edriquesl, La forme reells des sous-unites proraiques de cas virus n'est pas un triangle plat comme Ie montrent las schemes, mais l'aspect global lorsoue les sous-unitss sont assemblees est grossleremem celui d'une structure spherique avec des faces triangulatres. Les modetes tndnnensionnele sont tous presenres au marne grossissemanto (a) Chsz las virus quasi-spheriques les plus simples et les plus petits, rois sous-urutes protsiques identiques de Ja capsids forment chaque face triangulaire (en rougel de I'icosaedre (scMma), Les sousunites sont orqarusees selon une symetrie d'ordre cmq au niveau de chaque sammet. Des rnodsles de trois de cas virus sont presentes : Ie poliovirus, un vnus humain a ARN, Ie virus de la mosarcue laune du nleba (CPMVl, un virus vegetal a ARN et Ie virus simien 40 (SV40), un virus ,~ ADN du singe. (bl Chez certains virus plus grands de ce type, cheque face triangulaire est ccnsnruee de six sous-unltes, Les sousunites aux sommets conserverrt une svrnetrie d'ordra cino, mais cellss qui constituent les surfaces interrnedlaires presentent une svrnetrie d'ordre six. Un modele d'adanovtrus. un virus humain a ADN. revele sa tailla nettement superieure ~ celie des virus de la partie (a] et montra las fibres (en vert) qui sa fixent aux rsceoteurs des cellules hotes. IVOlf P. L Stewart at st., 1997, EMBO J. 16: 1189. Models of CPMV, poliovirus. and SV40 Almablement communique par T, S. Baker: modele d'adenovirus aimablemenl communique par P l. Srawart.l

FIGURE EXPERIMENT ALE 4..38 Des spIcu.es de proteines lIirales saillent a 'a surface d'un virion du virus de la grIppe. las VIrUS de ta gnppe sont entoures d'une enveloppe constituee d'une bicouche phospholipidique at de proteines virales enchassees, Les grands spicules vislbles dans cette micrographie electronique d'un virion de la grippe apparent grace a un rnarquaqe negatlf sont ccnsmues de neuraminidase, une protelne tetrarnerique. ou d'h6magglutlnine, une proteine Inmenque (voir Figure 3-7). A l'interieur se trouve la nucleoeapaide h8tico'idale. IAlmablemem commuJ'jlqu~ par A. He I sruus & J, White.]

(b) Un grand virus icosaBdrique

consotuee principalement d'une bicoucbe phospholipidique, rnais contenant egalemem unc OU deu sortes de glycoproreines codces par le virus (figure 4-38). Lc phospholipides presents dans l'cnveloppe virale ressemblent ~ ceux de la membrane plasmiqnc d'une cellule hon: inlectet:. L'enveloppe virale est en fair crt:ee par un bourgeonnement de certe membrane, mais contient de nombreu es glycoprcteincs viralcs, COnliTIC nous Ie verrons un peu plu loin.

Les virus peuvent etre clones et eomptes par un

dosage des plages de lyse .

Le nornbrc de particules virales infecrieuses dans un echantillon peat crre quam:i£ie par un dosage des p/agc de lyse. Ce dosage est rcalise ell cukivsnr un echalltillol'l dilu« de psrticules virsles sur une boite de culture recouverte de cellules hores, puis en comptanr I nombre de lesions locale appelees plllges de lyse qui se developpenr (Figure 4-39). Une plage de lyse apparait sur la culture des qu'un virion infecte une cellule, Le VtrUS se replique ensuirc dans cerre cellule hote puis lyse (rornpr) la cellule, liberanr ainsi de nombreux virions fils qui infecrent les cellules voisiaes de 13 culture. Apres quelques cycles d'infcction, it y a suffisammcnt de cellules

a)

Una couena continue de cellulas hotes sensibles, ilia surface d'une boite de culture

j A. ddition d'une suspension diluee contenant des virus; apres I'infection, la couche de

cellules est recouverte d'agar . incubation •

~ Plage de lyse

a9ue plage de lyse marque la lyse des cellules. mee par une particule virale (l'agar limite les placements. de sorte que Ie virus

peut infecter que des cellules contiquss}

pour qu'apparais e une zone claire, dans fa couche resranre lhiles noninfectees,

ui que rous les virions fils d'une plage de lyse proviennenr merne virus parental. ils constituent un done viral. Ce type age des plages de Iy. e est courarnmenr utilise pour les virus

rien er animaux. Lcs viru vegetilu peuvent etre analyses facon voisine en comptanr lcs lesion locales ur les feuilles plante inoculee ave de. viru . L'analy e de mutant viraux, on i. ole regulierement lor de dosage de pi ages de lyse a

ment c ntribue a la comprehension actuelle des proces u

. ulaires Eondamentaux. Les do ages de plages de lyse sonr ement csscntiels pour isoler des clones de bacteriophages A. zant des fragments d'ADN cellulaire, comme nons le verrons apirre 9.

cycles de croissance des virus Iytiques tissent a 'a mort des cellules hates

que le details varient d'un rype de virus a l'aurre, les virus a I -tique passent par les memes etapcs generales:

'ad orption - Le virion interagir avec une cellule hote la liaison de multiple opies d'une proteine de la capa. des recepteurs pecifiques presents a la surface de la lule hore.

~. L'enrree - Le genome viral traverse la membrane plasIqu . Dans lc cas des vim anirnau et vegetaux, des proe virale penerrenr egalement dans la cellule hote.

. La replication - Le ARNm viraux ont produits a l'ai~ de la rnachinerie de tran cripti n de la cellule hore

iru a AD ) ou par d enzyme virales (- iru a ARN). Pour les deux type de virus lcs ARNm virau sont traduit par la machinerie de rraducti n de la cellule hore. a

reduction de multiple copies du genome viral est assurec

4.7 • Les virus: des parasites du systerne genetique des cellules 139

F'GU~E E?,-PER1MENTAlE 4-39 Un dosage des plages de lyse ~etermme Ie nambre de particules infectieuses dans une suspen~lon v.i~ale. (~) Chaque leSion. ou plaga de lyse, qui 58 developpe Iii au un vinon unique lntecte Inltialement une seule cellule, constitue un clone viral pur. Ib) La bolte da culture eclairee par en dessous montre des Pla~es de lyse forrnees par 113 bacrencphaqe A. etala sur E. co/r. Ie) Una bOite de cuhure preserrtant des plages de lyse produites par un pcllovlrus eta Ie sur des cellules HeLa. [Partie (0) atrnablemant cornmuniquee par Barbara Morris. partie (c) de E. S. Luria e1 al .. 1978. General Virology, 3' ed., Wiley, p 261

par des proteines virales eule OU avec l'alde de proteines de la cellule hore,

4. L'assemblage - Les proteines virale et les genomes l'cplique s'asso ient pour former de virions fils.

5. La liberation - Les cellules infcctees peuvenr se mrnpre brusquement (lyse) en liberanr en une fois t us Ie virus neosynthetise ou hi 11 e de inr' grer progressivemenr,

a vee une liberation lente des virions.

La Figure 4-40 illustrc k cycle \ydque du hal..1:eriul'\'flge T4, un virus a ADN dcpourvu d'enveloppc qui infecre E. coli.I,e proreines de [a capside virale sont generalement sYJ1thetisC;es en granch:s quanritcs car de nornbreu es copies en sent neccssaires pour l'a semblage de chaque virion fils, nviron 100 a 100 vjrjons fils de T4 sont produit et libercs par la Iy e de chaque cellule infectee.

Le cycle lyrique c [ un pel] plus complique pour le viru a A N qui infecrent Ies cellulcs eucaryotes. Chez. la plupart de ces viru , lc genome d'ADN esr tran porte (avec quelques proteines a sociee ) dan Ie noyau de la ellule. Une fois a l'interieur de celui-ci, I' ADN viral est tran 'air en ARN par la rnachinerie de transcription de la cellule hote. La maturation du r.ranscrit primairc d' ARN viral par Ie enzymes de la cellule bote aboutir a I' ARNm viral, qui est transporre [usqu'au cyroplasme et tradult en prme.ines virales par les ribosomes de In cellule hote l'ARNr et 'Ies facteurs de traduction. Les proteines viralcs sonr cnsuite rransportee vers lc noyau, dan lcquel certaines d'entre elles rcpliquem directement I'AD Viral ou irnpo cnt aux proreines cellulaire de le faire comme dans le cas de V40 decrit dans la ecnon pri:cedente. L'assemblage de proreines de In capside avec I'ADN viral qui viene d'etre replique a lieu dans le noyau, aboutissant a la producrion de centaincs, voire de rnilliers de virion fils.

La plupart de virus vegeraux er anirnaux po edant un genome d'ARN n'onc pas besoin de fonctions nucleaire pour leur

Lyse/Liberation ~ Adsorptionfinjection

~VldO""b~

140 CHAPITRE 4 • Les mecanisrnes rnoleculalres fondamentaux de la genetique

F'IGURE 440 La cycle Ilvtique de replica· tion du bacteriophage T4 d'E. cofj, un virus nu [nen 9llveloppe) avec un genome double brin d'ADI\I. Apres I'interaction des protsines de I'enveloppe virale situaes a l'extrl3mite de la queue de T4, avec les racepteurs proteiquas spscifiques presents a I'extarieur de la cellule hOte, Ie genome viral est injects dans l'hOte (!Hape U). Les enzymes de la cellule Mte transcrivent ensuite les genes vrraux " precoces " en ARNm PUIS Ies traduisent en proteines " precoces" [etape iii). Les proreines precoces repliquent l'liDN viral et lnduissnt l'exoression des proternss virales (! tardives n par les enzymes de la cellule hOte (lltape IJJ. Parmi las protelnes virales tardivas se trouverrt les proteines de la capside, les orotemes d'assemblage et les enzymes qui degradent I'ADN de Ie cellule h6te, fournissant ainsi les nuclaotides nscessaees a la synthase de davantage d'ADN viral. Les virions fils sent assembles dans la cellule hHape Ell et liberes lalape 141 lorsque les protemes vireles tvsont la cellule. les virus qui viennant d'etre liberes debutent un autre cycle d'jnfection dans de nouvelles ceflules hOtes.

Blcouche Iipidique ARN .gi1nomlque

Chromosome dOE coli

I /

ADN deT4

t Expression

des protelnes virales precoces

Replication de l'ADN viral Expression des proteines virales tardives

• Protslne de la nucleocepsice Prolelna de la matrlcs

,..l. Glvcoprotelne de liaison au recopteur • ARN polymerase virale

Bourgeonnement ~I

~rption

,n::tt A.'$sociation avec Ill' la membrane

Membrane

Recepteur de la cellule

tt /-du virus __ I

Cytosol

Goigi

Transport ~

Synthese de la mat rice et de la nucleocapside

'E!

.It Assemblage des I \ capsides filles

~ EnGlocytose

Endosome

Replication

Transcription

Liberation

replication [yrique. Chez certains de ces virus, nne enzyme virale qui penetrcdans l'hote au cours de l'etape d'entree transcrit l'ARN genomique en plusicurs AR m dan le cytoplasme de la cellule. CAR m est rraduit directemenr en proteines virales par la rnachinerie de traduction de 101 cellule hote. Une ou plusieurs de ces proreines syndleruent ensuire des copies supplernentaircs du genome viral d' AR . Enfin, les genomes fils soar assembles cn virions fils dan Ie cytoplasrne, avec les proreines neo ynthetisee de [a capside.

Apres la synrhese de cenraines ou merne de milliers de nouveaux virions, la plupart des ccllules baereriennes infectee et cerraines cellules vegerale ou animates infecrees sont Iysees, liberanr alors simulranemenr rous les virions, Neanrnoins, l'infecriou de nombreu es cellules par des virus anirnaux au vegetau n'entraine pa de ly. e. All lieu de cela, la cellule hOfe morre libcre les virion progressivernenr, au fur et a mesure de sa degradation.

Cornme nons l'avons note plus haur, les virus anirnau a enveIoppc sont eruoures d'une membrane phospholipidique extcrne derivce de la membrane plasmique des cellules hotes et contenant d'abondantes glycoprotdines virales, Les processus d'adsorption er de liberation des virus enveloppes different fortement des memes processus chez les viru nus (non enveloppes). Pour il!ustrer la replication lytique des vim erweloppes, ccnsiderons Ie virus de la rage ; sa nucleocapside est constituee d'un genome d'ARN simple brin entoure de multiples copies d'une proteine de la nucleocap ide. omme d'autres virus lyriques a AR ,Ies virion de la rage sent repliques dans le cytoplasrne et n'onr pas besoin des

<III FIGURE 4-41 Le cycle Iytlque de replication du virus de larage, un virus enveloppacontenent un genome simple brin d'ARN. Les constituents structuraux de ce virus sent representes en haut. Remarquez 101 nucleocapslds helicoTdale plutdt qu'lcosaedrique. Apres l'adsorption du virus Sur de multiples copies d'une protelna membrana ire spacifique de l'hOte (etape Dl. 18 cellule ['engloutit dans un endosome etape fA). Une proteine celJulaire sltuee dans la membrane de reneesome pornps des ions W du cytosol vers I'interieur de I'endosome. La OOISSEl resultante du pH de I'endosome induit un changement de conformation dans la glycoprotiline virale, ce qui conduit a la 'fusion de

enveloppe virale et de la membrane de la bicouche lipidique da I'endosome, pUIS a la liberation de la nucleocapside dans Ie cytosol (atapes Ii] at 19). Une ARN polymerase virals utilise des ribonucieosides trlphosohate du cytosol pour repllquer Ie genome o"ARN viral (etape III et pour synthetiser des ARNm viraux (etape GI), L'un des ARNm viraux code la glycoproteine transmembranaire virale, qui est inseree dans la membrane du reticulum endoplasmique (RE) au fur at a masure de sa synIflese sur les ribosomes du RE (stape 6). Un glucide est ajoute au grand domaine rsplia dans la lurniare du RE et est modifie a rnesure que la membrane et la glycoproteine associse traversent l'apparail de Golgi (lltape 13). Les vesiculas portant la glycoprotelne mature fusionnent avec a membrane plasrniqtsa de I'hote, deposant I a glycoproteine virale il la surface de la cellule, avec son grand domaine de liaison des recepteurs depassant hors de celle-ci (etape (!J). Pendant ce temps, d'autres ARNm ,,!raux sont tradults sur des ribosomes de la cellule hOte en proteines de la nucleocapslde, de la matrice et en ARN polymerase virale (etape

). Ces protelnes sont assernblees avac I'ARN genomique viral repllque (en rouge vif) en nucleocapsides fitles (atape III) qui s'associerrt ensuite au domalne cytosollque des glycoproUiines transmemoranelres vlrales de la membrane plasmique (erape 161. La membrane plasmique sa replie auteur de la nucleocapslde, formant un Ii bourgeon " qui fin;t par se detacher (etape III).

4.7 • les virus: des parasites du systems gerretique des cellules 141

FIGURE EXPERIMENTAlE 4-42 Les virions fils de virus enveloppes sent liberes par un bourgeonnement iI partir des callules infectees. Dans carte micrographie electronlque d'une cellule infectee par Ie virus de la rougeole. les bourgeons de virions sont nettement vlsibles sous la forme de saillies e la surface de la cellule. Le virus de la roupeole est un virus snveloppe 11 genome d'ARN avec une nucleocapsice helico'idale. cornrna Ie virus de la rage, qui se replique de la fa con illustree par la Ftgure 4-41. ID'apres A. Levine. 1991. Viruses. Scientific American Llbrary,P. 22.1

enzymes nude-aires de la cellule hOte. La Pigare 4-41 monrre un virus de la rage adsorbe par endocytose et 13 liberation des virions fa" qui se produit par bourgeonnement a partir de la membrane plasrnique de la cellule hote, Les virions crees par bourgeonnemenr SOl1t bien visibles sur lesrnicrographies elecrronigucs des cellule infecrees, comrne l'illustre la Figure 4-42. Des dizaincs de rnillien de virions fils bourgeonnent a partir d'une cellule hate infectee avant la mort de celle-d,

I!ADN viral est integre dans Ie genome de la ceJiule hate lars de certains cycles non I)'tiques de croissance viraux

Certains virus bacteriens, appcles phages temperes, sent capables d'etablir une association non lytique avec leurs cellules hores, sans tuer eelles-ci, Par exemple, lor qu'ua bacteriophage A. infecre une cellule d'E. coli, I'ADN viral peut ctre rnregre dan' le chromosome de la cellule hote au lieu d'erre replique indepcndammenr, L'ADN viral inregre" appe.le pmphage, est replique comme line partie de I'AD de la cellule d'une generation de cellule hOte a 13 suivantc, On appelle ce phenornene la Iysogenie. Dans certaines conditions, I'ADN du prophage est active, ce qui entraine son excision du chromosome de la cellule hotc, son engagement dans lc cycle lyriqnc ct la production consecutive des virions fils, suivie de leur liberation.

Transeriptase

142 CHAPITRE 4 • Les mecanismes moleculaires fondamentaux de la genetique

ARN genomique sb

Provirus

Transport vers Ie noyau et integration

------

FIGURE 4-43 Le cycle de vie des retrovirus. Les retrovirus possedent un genome constltue de deux copies ldentlques d'ARN simple brin at d'une enveloppe externe. E.tape D :

Aprils I'interaction des glycoproteines virales de I'enveloppe avec una protelne membrana ire specifique appartenant ilia cellule hOte, I'enveloppe du retrovirus tusionne directement avec la membrane plasrnique, ee qUI permet I'entree de la nucleocapslde dans Ie cytoplasms de ia cellule, Etape 6: La transcriptase inverse virale et d'autres proteines copient Ie genome viral d'ARN simple brin (sb) en un ADN double brin (db), Etape ID '

Les genomcs de nornbreux virus anirnau peuvent egalement s'integn:r dan' le genome de la cellule hote, Les plus importants sont probablement Ies ,retrovirus, qui. sont des virus enveloppes dent le genome est constitue de deux brins identiques d'ARN. On appelle ce virusrelrovirus car leur genome dARN sert de matrice pour la formation d'une molecule d'ADN -Ie ens inverse du flux habiruel d'infcrmation generique par rapport a la transcription plus courante de I' AnN en ARN. Dans Ie cycle de vic des retroviru (Figure 4-43), UIlC enzyme vi.rale appelee transcripta e inverse copie tout d'abord le genome d>ARN viral en un ADN simple brin complemenrairc de I'ARN du virion. La meme enzyme catalyse ensuite la synthese d'un brio complernentaire u'ADN. (Cerre reaction complexe est detaiUec au Chapitre 1,0, dans lequel IlOUS, rraiterons de parasites intracellulaires errohemenr apparentes appele retrorransposens.] L'AD double brin resultant est integre dans J'ADN chromosomique de la cellule infecree, Enfin, I' ADN inregre appele provirus, est transcrit en ARN par la proprc machineri dela cellule pui traduir en prorcincs viralcs ou ernpaquete dans les proreines de l'enveloppe des virions, pour former des virions fils. Ceux-ci sont liben:s par bourgeonnement de la membrane de la cellule haec. La pluparr de retrovirus n ruent pas leurs cellules hotes. De ce fait, les cellules infecrees on! capables d'engendrer des cellules filles avec de l'AD proviral

:rran.scriPtion J. mverse T

ADN viral

L'ADN db viral est transports dans Ie novau et Integra dans I'un des nombrsux sites possibles de I'ADN chromosomique de la cellule hOte_ Pour des raisons de simplicM. seul un chromosome de \a cellule hOle est represente, Etape EJ : L'ADN viral integre (provirus) est transom par I'ARN polymerase de la cellule note, produisant des AANm len rouge tonce) et des molecules d'ARN genomique (en rouge clair), La machinerie de la cellule hOte traduit les ARNm viraux en glycoproMines et protelnes de la nucleooepside. Etape m : Les virions fils s'assernblent ensuite et sont Iiberes par bourgeonnement com me l'illustre la Figure 4-41 .

illtegn~. Ce cellules filles continuent Ii transcrirc I'ADN proviral er Ii former des virions fil. par bourgeonnement.

Certains retrovirus conricnnent des ge-nes re ponsables de cancer (oncogelles); les cellules infectees par ces retrovirus Ont alor transformee en cellule tumorales. L'erude de retroviru on ogenes (la pluparr etanr de. viru qui touchent Ie oi eaux et les ouri) ont fourni de nombreuse informations sur les processu qui conduisenr a la tran - formation d'une cellule norma Ie en cellule cancercu e (Chapitre 23).

Parmi Ies retrovirus hurnains connus, on trouve Ie Vll:US de la leuccmie humaine des cellules T(HILV) qui provoque line form de lcucemie, ainsi que le virus de l'immunodeficience humaine (VIH) qui provoque le syndrome irnmunodeficitaire acquis (SIDA). Ces deux viru ne peuvent infeeter que des rypes ccllulaire pecifiques, principalement certaines cellule du sy terne imrnunitaire et, dans Je ca du VIH, certains neurones du systeme nerveux central er des cellules gliales, eules ces cellules pas edent les recepreurs de surface interagis ant avec les proreines de l'enveIoppe virale, ce qui explique la specificite des virus de ee Type. Au contra ire de la pluparr des autres retrovirus, le VIH finit par ruer scs cellules hotes. La mort d'un grand nornbre de cellules du

ysteme irnmunitairc qui s'en uir abourit a I deficience des reactions imrnunitaires, caracteristique du SlDA.

, ertains vires a ADN peuvenr egalement s'integrer dans U(1 chromosome de la cellule hOle. Citons par exernple les papillomavirus (HPV) qui provoqucnr lc plus sou vent des vermes et d'aurres lesions benigne.~ de la peau .. Lcs gcnomes de certains serorypes HPV cependant, s'jntegrent ceca ionnellerncnr dan J'ADN chrornosornique de eellules epithelia le eervicales infectees, provoQuant alors un cancer du col de l'uteru . Le test de Papanicolaou permer de derccter des cellule !lUX stades precoces du proces us de transformation inirie par l'integration de HPY, ce qui pcrmer un traitement efficace, I

CONCEPTS CLES DE LA SECTION 4.7 Le:s vi;rus : les parasites du s,ysteme genetiquecellulair,e

• Le: virus sent de petits parasites capables de se repliquer uniquemenr dans des ccllulcs hores, Les genomes viraux peuvent etre onstirues soit d'ADN (virus a ADN), soir d'ARN (viru~ a ARN) et peuvent eere simple ou double brio.

La capsidc qui entoure le genome viral, est constiruee de rnulnple copies d'une ou d'un petit nornbre de protEine ccdees par Ie virus. Certains virus possedent egalemenr une enveloppe c terne, qui ressemble a la membrane plasmique mais conticnt de proreines rransrncmbranaires virales,

La pluparr des virus anirnaux et vegetaux a ADN ant besoin des enzymes nuelcaires de Itt cellule hote pour assurer la trans-

ription du genome viral en ARNm et la production de genomes ill . A l'inverse, la plupart des virus a ARN cadent des enzymes capables de transcrire le genome d ARN en ARNm viral et de nroduire de nouvelles copie du genome d'ARN.

• Le: ribosomes, lcs ARNt et les facteurs de traduction de la cellule hote sonr utilises pour la synthese de mutes [es protein rirales dans les ccllules infectees,

• t:infccrion virale lytique comprend les pha: es d'adsorption, d'enrree, de synthesedes proteines virales et des genom.es fils (replicat:inn), I'assemblage des virions fils er la liberation de cenraines voire de millicrs de virions, conduisanr a 13 mort de la cellule hote (voir Figure 4-40). La liberation des virus enveloppes se produit par un bourgeonnement de 13 membrane pIa - mique de la cellule hote (voir Figure 4-41).

• L'infecrion non Iytique a lieu Jor que le genome viral est int~gre dans I' ADN de la cellule hore er ne conduit generalernent pas a la mort cellulalre,

• Les retrovirus sonr des virus animaux enveloppes contenant un genome d'ARN simple brill. Apres l'entree dans une cellule hate, la transcriptase inverse,. unc enzyme virale contenue dans le viriou.convertir Ie genome viral d'ARN en .ADN double brin, qui s'inregre dans I'ADN chrornosornique (voir Figure 4-43) ..

• Au contraire des infections par d'autres retrovirus l'infection par Ie V1H finit par tuer Ies cellules hote , provoquant une cleficience des reactions immunitaires, caracteristique du SlDA.

• I.cs virus rurnoraux, qui contiennenr des oncogenes, peuvcnr avoir un genome constitue d'ARN (cornme le virus de la leucernie hUll1aine des cellules T) ou d'AD (comme les papillomavirus humains). Dans Ie cas de ces virus,.I'imegration du

Perspectives pour Ie futur 143

genome viral dans Ie chromosome d'une cellule hote peut provoquer I" transformation de 1101 cellule en cellule rumorale,

PERSPECTIVES POUR LE FUTUR

Dans ce chapirrc, nous avon d'abord considere 1101 structure elementaire de I'ADN er de I' ARN, puis decrit les aspect fondamenraux de la transcription de I' ADN par les ARN polymers: es. Les AR.N polymerases eucaryotes eronr presentees plu ell detail au Chapitre 11, ainsi que les facteur a socics necessaires a l'initiation de la transcription dans les ccllulcs cucaryores er !lUX interactions avec les Iacteurs regulateurs de la transcription qui en controlent l'crape d'initiation. Nous avons ensuire aborde Ie code generique einsi que le role de l'ARNt ct de la rnachineric de synthese proteique, le ribosome, dans le decodage de l'informadon en ARNm, pour pcrmcrtre un assemblage precis des chaines proteiqlles. Les mecanisrncs de regulation de lasynthese proreiquc

cront traires au Chapitre 12. Enfin, nous avon considcre les details moleculaires sous-jacents a la replication exacte de I'AD ' necessaire a la divi ion des cellule .. Le Chapitre 21 traitc des rnccanismes de regulation de la replication de I,'ADN d'une cellule ct de coordination de cctrc replication d'ADN ave Ie proce .. u cornplcxe de la mire c qui reparrir equirablement les molecules filles d'ADN entre les cellnles filles.

Ces processus cellulaires elemcntaircs constituent les fondernenrs de la biologic moleeulaire de la cellule. Notre comprehension actuelle de ccs cvenemems repose sur de mulriplcs rcsultats c perimentanx et nc sera probablement pas rnodificc en profondeur dans I'avenir, Tourcfois, nous allons certainemenr comprendre de mieux en mieux ces mecanisme avec la decouverre de derails supplemenraires concernant Je. structures et les intera - rions des rnachinerie moleculaires impliquees, La determination, ces dernieres annees, de la structure tridimensionnelle des AR polyrnera es, des sous-unlres ribosomlales er des proreines de replication de l'ADN a perrnis aux chcrcheurs de concevoir des approches experimentales plus adaprees pour reveler le foncrionnernent moleculaire de ces macromolecules. Cerre comprehension detailJee permcttra sans doure d'imaginer de nouveau • medicaments plus efficaces pour traiter les maladies humaincs, Par exernple, 13 structure a haute resolution des ribosomes, recernmenr elucidee, permet de rnieux comprendre cornrnent les anribiotiqucs inhibenr la synthese proreique bacterienne sans affcctcr [a fonction des ribosomes de mammiferes. Ces nouvelle connaissanccs pourraienr permertre de conccvoir des anribioziques encore plu efficaces. De meme, rnieux comprcndre les mecanismes de regulation de la transcription de gene hurnains specifiques pourrait permettre d'imaginer des strategies rherapcuriques capables de reduire ou d'empecherdes reponses immunitaires inadaprecs conduisam a de multiples scleroses er arrhrites, il 13 division cellulaire anarchique caracterisrique du zancer ainsi qu'a d'autres pro CSSLIS pathologiques,

Une grande partie de la recherche hioiogique actuelle porte Sur la facon donr les interactions moleculaires detent [ell cellulcs d'une capa ire de prise de deci ion er de proprietes specifiques. Pour cctte raison, plusieurs des hapirres suivants decrivenr Ie connaissanccs actuelles sur la facon donr de relies interactions regulent la rransc.ription er la ··ynthcsc proreique chez les organi. mes

.~[eme irnmunitaire qui s'ensuit aboutit ii la deficience des reacn immunitaires, caracrcrisrique du SIDA.

Certains vim a ADN peuvent cgalerneor s'inregrer dans un ... hrornosorne Ut' la cellule hote. Circus par exemple les papillomaI'\JS (HPV) qui provoquenr lc plus souvent des verrues et d'a utres

-~ions benignes de la peau, Les genomt's de certains serotypes HPV cependant, s'integren; eccasionnellement dans I'ADN chrosomique de cellulcs cpitheliales cervicales infectees, provot alar un cancer du col de I'utenl!>. Le test de Papanicolaou rmcr de detecter de' cellule' aux stades precoces du proce u -ransforrnarion inirie par l'integration de HPV, cc qui perrnet rrairernent efficace, I

CO CEPT'S CLES DE LA SECTION 4.7 tes virus: les parasites dus)!,steme genetique cellulaire

• Les virus sam de petits parasites capables de se repliquer uniiemenr dans des cellules notes. Les genomes viraux peuvenr

ore constitues soit d'ADN (virus a ADN) soit d'ARN (virus a R ) et peuvenr cue imple ou double brin.

• La capside, qui enroure lc genome viral, est constituee de rowi . copies d'une ou d'un petit nornbre de proreines codees par le virus. Certain virus possedent egalement IDle envcloppe e terne, qui. ressemble a la membrane plasrnique mais conticnt e proreines transmernbranaires virales.

...a plupart des virus animaux et vegetaux it ADN ont besein enzymes nucleaires de la cellule hate pour assurer la transprion du genome viral en ARNm erla production de genomes l'inverse, la pluparr des virus a ARN cadent des enzyme ca. able- de rranscrire lc genome d'ARN en ARNm viral et de

uire de nouvelles copies du genome d'ARN.

Les ribosome , les AR. r er les facteurs de traduction de la ule hore sont utilises pour la yuthese de routes les proreincs ale dans les cellules infectee .

L'infccrion virale lyrique comprend les phases d'adsorprion, CTIt1ree, de synthese des proreincs virales ct des genornes fils • lication), I'assernblage des virions fils et Ia liberation de ceo- 111:\ voire de rnilliers de virions conduisant a la mort de la . lule bore (voir figure 4-40). La liberation des virus envelopse produir par un bourgeonnement de la membrane plasique dcla cellule nOte (voir Figure 4-41).

L'infection non lytique a lieu lorsque le genome viral est in-

:re dans I'ADN de la cellule bote er ue conduit gcneralement a la mort eellulaire.

Le: retrovirus soot des virus animaux enveloppes contenant un genome d'ARN simple brin. Apres l'entJ'ee dans une cellule hore, la transcriptase inverse, unc enzyme virale coutcnue dans le virion, converrir le genome viral d' ARN en ADN double brin,. qui s'integre dans PAD chrornoscrnique (voir Figure 4-43).

• Au contraire des infections par d'autres retrovirus, l'infection par Ie V1H finir par tuer les cellules hoees, provoquant une deficience des reactions imrnuniraire , caracteristiquc du SlDA.

• Le virus rurnoraux, qui conriennenr des oncogenes, peuvent avoir un genome constitue d'AR (comme le virus de la leucernie humaine de cellules T) ou d'AD' (comme les papillomavirus humains}. Dans It: cas de ce virus, I'integration du

Perspectives pour Ie futur 143

genome viral dans Ie chromo orne d'une cellule hote PC\l[ provoqu.er la transformation de la cellule en cellule turnorale.

PERSPECTIVES POUR LE FUTUR

Dans ce chapitre, nous avons d'abord cnnsiderc la structure t!lementaire de l' ADN er de I' ARN, puis decrit les aspects fondarnenraux de la transcription de I'ADN par les ARN polymerases. Les ARN polymerascs eucaryores seront presentees plus en detail au Chapitre 11, ainsi que les Iacreurs associes neces saires ii l'iniriation de In transcription dans res cellules eucaryotes er aUK inrerac[ions avec les facteurs rcgularcurs de la transcription qui en controlenr I'ctape d'initlarion. Nous avons cnsuirc aborde 1e code gelletique ainsi que le role de l'ARNt ett de la rnachinerie de synrhese.protcique, Ie ribosome, dans lc dccodage de I'informarion en ARNm, pour perrnertre un assemblage precis des chaines proteiques. Les rnecanisrnes de regulation de 13 synthase prorcique seront traites au Chapitre 12. Enfin, nous avons considere les details moleculaires ous-iaccnrs a la replication exacte de I'ADN, ncccssaire a la division des ccllules. Lc Chapitre 21 rraire de mecanisrnes de regula.tion de la replication de J'ADN d'une cellule et de coordination de cette rep~ieation d' ADN avec le processus complexe de la mire e qui repartir equirablemem les molecules filles d' AD entre les ccllules filles .

Ces processus cellulaires e.lementaircs constituent les fondcrnents de la biologic moleculairc de la cellule. otre comprehension actuelle de ces evenemellts repose sur de multiples rc ultats experirnentaux er ne sera probablernent pas modifice en profondeur dans l'avcni r, Tourefois, nous allons certainemenr comprendre de mieux en rnieux ce rnecanismes avec la de ouverte de details supplementaires concernant les structures er les interactions des machineries rnoleculaires impliquees. La dctermin:ltiun, ce derniercs annees, de la structure tridimensionnelle des ARN polyrnerases, des sous-unires ribosorniales et des proteines de replication de l'ADN a permis aux cbercheurs de concevoir des approches experimenrales plus adaptees pour revelerle Ioncrionnement rnoleculaire de ces macromolecules, Cetre comprehension deraillee permettra sans doure d'imaginer de nouveaux medicaments plus efficaces pour rraiter les maladies humaines. Par exernple, la structure a haute resolution des ribosomes, rccemmenr elucidee, permet de rnieux cornprendre comment les antibiotiqucs inhibent la synrhese proteique bacterienne sans aHecter [a Ionctlon des ribosomes de mammiferes. Ce nouvelles connaissances pourraient permertre de concevoir des anribiotiques encore plus effi(aces. De merne, mieu cornprendre lcs mecanismes de regulation de In transcription de genes humains specifiques pourrait permettre d'imaginer des strategies rherapeutiques capables de reduire ou d'ernpecher des reponses irnmunitaires inadaptees conduisant a de multiples clero es et arrhrites, a la division cellulaire anarchique caracteristique du cancer ainsi qll'a d'aurrcs processus pathologiques.

Ilne grande partie de la recherche biologique actuelle porte ur la fa~on dont lcs interaction moleculaircs docent lcs cellules d'une capacite de prise de decision et de proprieres spccifiques. Pour certe raison, plusieur des chapitre suivants decrivenr les connais-

ances actuelles sur la fal';on donr de relles interactions regulenr la transcription et la synthese protciqut: chez les organismes

6. En 'rudiant la fonction d'un gene humain du recepteur d'UD factcur de croissanc pecifique, on a decouvert d u types de protcines synrhetisees a partir de ce gene. Une proreine conrenanr un domaine rransmembraneire reconnait it'S facteurs de croissance a la surface de cellules et stimule alor une voie de sign lisation specifique en aval. A l'lnverse, une proreineapparentee, plus petite, e r ecreree hor de 13 cellule et se fixc au facreur de croi san e circulant dan le ang, inhibant alors La voie de ignalisarion ell aval. Imaginez comment la cellule peur syntheri cr des proreines si different s.

7. Dccrivez Ie evcncmenrs moleculairc qui se produisenr au tli~ veau de I'operon lac lor que de cellules d'E, coli om transren!cs d'un milieu conrcnantdu glucose vers un mill u conrenant du lactose.

8. a concentrarion de phosphate libre affeete .1131 transcription de certains genes d' E. coli. Decrivez le mecanisme rni en JCIJ.

9. Cornparez La selection du site de dcbur de La traduction dans les ARNrn de bacrcri ,d'cllcarYQ[C Cl de poliovirus,

10. Qu'esr-ce qui preuve 1131 presence d'une activite peptidyl transferase dans I'AR; r 23S de la grande ous-unire rihosomiale ?

11. Comment une mutation dans le gene J de la proteine de liaison au poly(A) affecre-r-elle La tradu tion ? En quoi une micrographic clOt; ronique des polyribo ornes de ee muram differerait-eHe de la mi rographie correspondant a ta situation normale ?

12. Quclle caracteri rique de I'ADN ncccssite qu'une "ynthcsc de J'ADN soir en partie discontinue? De quelle facon les fragment. d'Okazaki et ['AD ligase sonr-ils utilise: par la cellule?

13. Quel gene est specifique des retrovirus .? Pourquoi [a proteine codee par ce geneest-elle absolumenr necessaire au deroulernenr du cycle de vie des retrovirus et non de celui des autres virus?

144 CHAPITRE 4 • les mecanisrnes rnoleculaires fondamentaux de la genetique

pluriceilulaires et comment cerre regulation donne aux cellules la capacite de sc specialiser er de former de organes complexes. D'autres chapitres trairerons des intern tions proteine-proreine a l'origine de la construction d'organites cellulaires pedalisi: et leur determination de la forme er du deplacement des cellules. Lcs avancees rapides de la biologic moleculaire ces derniere annccs lais em esperer que dans pcu de temps, nOLLS comprendrons cornmenr la regul tion de la foncrion de cellules peciali ees, de leur forme et de leur rnobilite, couplce avec la regulation de la replication et de 13 mort cellulaires (apoprose) aboutissent a la eroi sance d'organismes complexes rels que les arbres et leg. et.e!;. humains.

I MOTS CLl~S

AD poJymcrases133 Amerce 133

A nricodon 119

ARN de transfcrt (ARNr)

119

A11N messagcr (ARNm) 119

AR polymerase 109 ARN ribosornial (ARNr)

119

Brin precoce 133

Brin tardif 133

Cadre de lecture 120

ode genetique 119 Codons 119 Complernentaire 104 Dosage de plage de lyse

138

Double heliec 103 Enveloppe (virale) 137

Exons 111

Fourche de replication 133

Fragments d'Okazaki 133

Introns 111

Liaison phosphodiesrer 103

peron 111

Paires de bases Watson-Crick 103Polyri.bosomes

130

Promoteur 109

Ribosomes 119

Transcrir prirnaire 110 Transcriptase inverse

142

Transcription f 01

Traduction 1 01

I REV SIONS

1. Que sonr les paires de ba es Watson-Crick? Pourquoi sontelles importanres ?

2.. La proteine de liaison a la boite TATA se fixe au petit sillon de J'ADN, ce qui provoque la courbure de l'hellce d'ADN (voir Figure 4-5). Quelle propriete de l'ADN permer it la pro[eme de liaison a la boite TATA de reconnaitre la double helice d'ADN ?

3. La preparation d'.AD I plasmidique (circulaire, double brin] en vue d'un scquencage irnplique l'appariement d'unc courte amerce d'ADN oligonucleoridique simple brin avec l'un des brins de La rnatrjce plasrnidique. On le fait habituellemcnt ell chauffant I'ADN pia rnidique et I'amorce it 90'C, puis en abaissanr rre lerrtemenr la temperature [usqu'a .25" . Pourquoi ce prorccole fonctionne-r-il ?

4. Quelle difference exi tant entre l'ARN et l' AD permet d'expliquer la stabilire plu importanre de I AD ? Quelles en ont Ie con equences ur la fonction remplie par l'AD ?

Quelles sent les principales differences dans Ia ynthesc er la structure des ARNm procaryores et eucaryotes ?

I ANAlYSEZ LES RESUlTATS SUIVANTS

La ASA a identifie un nouveau microbe present sur, lars er vous dernandc de determiner le code genetiquc decet organisrne, Pour cela, vous Isolez un extrair de ce microbe contenant tons Ie cornposants necessaires a la synthese proreique, sauf de I' ARNm. Des ARNm synthetiques S011t ajoutes It cet exrrair er on analyse les polypeptides resultant

ARNm synthritiques

Polypeptides resultants

AAAAAAAAAAAAAAAA CACACACACACACA.A

Lysine-Lysine-Ly une ere,

Th reon i n e-I Iisrld ineThreonine-Histidine etc.

AA AA AACAACAACA

Th reonine-Threon ineTh reonine etc.

Glutamine-GlutamineGlutamine etc.

sparagine-A paragineAsparagine etc.

partir de ces donnees, que pouvez-vous conclure sur le code erique de ce microbe? QueHeest lil: sequence de \a bouclede aancndon d\m ARNtpmtant une threonine ? &1 '10M dc-cou~Cl. que ce microbecontiear 61 ARNr differents, que pourriezpenser de la fide,ute de la traduction chez. cet organisme ?

REFERENCES

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