44(6):1421.

1982, Appl. Environ. Microbiol.

G J Stanlake and R K Finn

bacterium.
pentachlorophenol-degrading
of a
Isolation and characterization
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A P P L I E D A ND E NVI RONME NTA L MI C ROB I OL OG Y , D e c . 1 9 8 2 , p . 1 4 2 1 - 1 4 2 7
0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 2 / 1 2 1 4 2 1 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t C 1 9 8 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r Mi c r o b i o l o g y
Vo l . 4 4 , No . 6
I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f a P e n t a c h l o r o p h e n o l -
D e g r a d i n g B a c t e r i u m
G A RY J . S TA NL A KE * A ND R. K. FI NN
D e p a r t m e n t o f C h e m i c a l E n g i n e e r i n g , C o r n e l l U n i v e r s i t y , I t h a c a , Ne w Y o r k 1 4 8 5 3
Re c e i v e d 1 5 J u n e 1 9 8 2 / A c c e p t e d 2 4 A u g u s t 1 9 8 2
W i t h a n e w e n r i c h m e n t p r o t o c o l , p e n t a c h l o r o p h e n o l ( P C P ) - d e g r a d i n g b a c t e r i a
we r e i s o l a t e d f r o m s o i l , wa t e r , a n d s e wa g e . W h e n c h a r a c t e r i z e d , a l l i s o l a t e s we r e
r e l a t e d a n d s h a r e d c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g e n u s A r t h r o b a c t e r . G r o wt h r a t e s f o r
s t r a i n NC we r e d e t e r m i n e d f o r a n u m b e r o f s u b s t r a t e s , i n c l u d i n g P C P a n d 2 , 4 , 6 -
t r i c h l o r o p h e n o l . C h a n g e s i n P C P c o n c e n t r a t i o n a f f e c t e d g r o wt h r a t e a n d l e n g t h o f
t h e l a g p h a s e b u t n o t c e l l y i e l d . I n c r e a s i n g t h e p H f r o m 6 . 8 t o 7 . 8 d e c r e a s e d t h e
l e n g t h o f t h e l a g p h a s e f o r g r o wt h o n P C P . C e s s a t i o n o f g r o wt h , u p o n i n c r e m e n t a l
a d d i t i o n o f P C P , wa s f o u n d t o b e r e l a t e d t o a d e c r e a s e i n p H r a t h e r t h a n t o a
b u i l d u p o f a t o x i c m e t a b o l i t e . D e g r a d a t i o n o f P C P b y s t r a i n NC wa s s h o wn t o b e
c o m p l e t e .
P e n t a c h l o r o p h e n o l ( P C P ) i s a wi d e - s p e c t r u m
b i o c i d e wi t h a p p l i c a t i o n s i n a g r i c u l t u r e , i n d u s -
t r y , a n d p u b l i c h e a l t h ( 6 ) . I t i s c o n s i d e r e d t o b e
a n e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t b e c a u s e o f i t s b r o a d
t o x i c i t y a n d i t s p e r s i s t e n c e i n s o i l a n d s e wa g e ( 2 ,
1 8 , 2 0 ) . I n t h e U n i t e d S t a t e s , a p p r o x i m a t e l y 5 . 0
x 1 0 7 p o u n d s ( c a . 2 . 2 7 x 1 0 1 0 g ) i s p r o d u c e d
a n n u a l l y ( 2 2 ) . Th e p r i m a r y u s e o f P C P , a c c o u n t -
i n g f o r o v e r 8 0 % o f a l l P C P p r o d u c e d , i s a s a
wo o d p r e s e r v a t i v e ( 4 ) . E f f l u e n t s t h a t c o n t a i n
P C P a r i s e n o t o n l y f r o m i t s m a n u f a c t u r e b u t a l s o
f r o m i t s u s e i n wo o d t r e a t m e n t . A 1 9 7 4 s u r v e y
d i s c l o s e d t h a t o n l y 6 0 % o f t h e wo o d t r e a t m e n t
p l a n t s s u r v e y e d m e t wa t e r p o l l u t i o n s t a n d a r d s ,
a n d 1 7 % o f t h e p l a n t s r e l e a s e d t h e i r wa s t e wa t e r
wi t h o u t a n y t r e a t m e n t ( 2 6 ) . B y 1 9 8 3 , a l l p l a n t s
m u s t b e i n c o m p l i a n c e wi t h r e g u l a t i o n s r e s t r i c t -
i n g t h e r e l e a s e o f c h l o r i n a t e d p h e n o l s i n wa s t e -
wa t e r ( 2 3 ) .
On e m e t h o d o f r e m o v i n g c h l o r i n a t e d p h e n o l s ,
i n c l u d i n g P C P , f r o m wa s t e wa t e r i s b y m e a n s o f
b i o d e g r a d a t i o n i n a e r a t e d a q u e o u s s y s t e m s ( 1 4 ) .
I n p r a c t i c e , d i f f i c u l t i e s a r e o f t e n e n c o u n t e r e d i n
s u c h s y s t e m s d u e t o a p a u c i t y o f k n o wl e d g e
c o n c e r n i n g P C P - d e g r a d i n g p o p u l a t i o n s .
P a r t i a l o r c o m p l e t e d e g r a d a t i o n h a s b e e n o b -
s e r v e d i n s o i l ( 2 1 , 3 0 ) , c h i c k e n l i t t e r ( 1 3 ) , a n d
a d a p t e d s e wa g e ( 1 5 ) . Two b a c t e r i a l i s o l a t e s h a v e
b e e n s h o wn t o u t i l i z e P C P a s a s o l e s o u r c e o f
c a r b o n a n d e n e r g y : a c o r y n e f o r m b a c t e r i u m
i s o l a t e d b y C h u a n d Ki r s c h ( 9 ) a n d a p s e u d o m o -
n a d i s o l a t e d b y W a t a n a b e ( 2 9 ) .
I n t h e p r e s e n t s t u d y , P C P - d e g r a d i n g b a c t e r i a
we r e i s o l a t e d f r o m s o i l , wa t e r , a n d s e wa g e . Th e
d e g r a d e r s we r e c h a r a c t e r i z e d , a n d t h o s e k i n e t i c
p a r a m e t e r s a s s o c i a t e d wi t h g r o wt h r a t e , l e n g t h
o f t h e l a g p e r i o d , a n d t o x i c i t y we r e s t u d i e d .
Th e s e p a r a m e t e r s we r e c h o s e n f o r t h e i r s i g n i f i -
c a n c e i n a n y a p p l i c a t i o n o f b i o d e g r a d a t i o n t o t h e
r e m o v a l o f c h l o r i n a t e d p h e n o l s f r o m wa s t e wa t e r
o r o t h e r p o l l u t e d e n v i r o n m e n t s .
MA TE RI A L S A ND ME THOD S
Ha b i t a t s . Fo u r h a b i t a t s we r e s a m p l e d f o r t h e p r e s -
e n c e o f P C P - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s . Two o f t h e s e
h a b i t a t s we r e s o i l ( o n e s a m p l e wa s k n o wn t o b e
c o n t a m i n a t e d b y P C P ) , a n d t wo we r e a q u a t i c ( o n e
s a m p l e h a d a h i s t o r y o f P C P c o n t a m i n a t i o n ) . S o i l
s a m p l e s c o l l e c t e d 4 a n d 1 5 c m f r o m a u t i l i t y p o l e we r e
p o o l e d a n d l a b e l e d a s s t r a i n S 1 . Th e s o i l a r o u n d t h e
p o l e wa s c o l o r e d d a r k b r o wn b y t h e s e e p a g e o f p r e s e r -
v a t i v e f r o m t h e p o l e i n t o t h e s o i l . S o i l 4 c m f r o m t h e
p o l e wa s c o l o r e d d a r k b r o wn b y t h e s e e p a g e o f
p r e s e r v a t i v e f r o m t h e p o l e i n t o t h e s o i l . S o i l 4 c m f r o m
t h e p o l e c o n t a i n e d 7 6 , u g o f P C P p e r g o f s o i l . Th e
s e c o n d h a b i t a t c o n t a m i n a t e d wi t h P C P wa s Na y l o r ' s
Ru n C r e e k , Ha v e r f o r d , P a . Th i s s t r e a m wa s s a m p l e d
b y Fo u n t a i n e e t a l . i n 1 9 7 5 ( 1 6 ) . A s a m p l e c o l l e c t e d
f r o m t h e c r e e k a t Mo n o a Ro a d c o n t a i n e d 5 , u g o f P C P
p e r m l . Th i s s o u r c e wa s d e s i g n a t e d s t r a i n NC . S a m -
p l e s we r e - a l s o c o l l e c t e d f r o m h a b i t a t s wi t h n o h i s t o r i e s
o f P C P c o n t a m i n a t i o n . On e s a m p l e , s t r a i n S 2 , wa s
g a r d e n s o i l , a n d t h e o t h e r s a m p l e , s t r a i n RS , c o n s i s t e d
o f c l a r i f i e d r a w s e wa g e f r o m t h e I t h a c a , N. Y . , m u n i c i -
p a l t r e a t m e n t p l a n t .
I s o l a t i o n o f P C P d e g r a d e r s . A l l i s o l a t i o n s t e p s we r e
p e r f o r m e d i n m e d i a wi t h a m i n e r a l s a l t s ( MS ) b a s e o f
t h e f o l l o wi n g c o m p o s i t i o n ( i n g r a m s p e r l i t e r ) :
K2 HP O4 , 1 . 7 3 ; KH2 P O4 , 0 . 6 8 ; NH3 NO3 , 1 . 0 ;
Mg S O4 7 H2 O, 0 . 1 ; C a C I 2 * 2 H2 0 , 0 . 0 2 ;
Mn S O4 H2 O, 0 . 0 3 ; a n d Fe S O4 7 H2 O, 0 . 0 3 . Th e
c a l c i u m , m a n g a n e s e , a n d i r o n s a l t s we r e m a d e u p
s e p a r a t e l y a s a 1 0 0 x c o n c e n t r a t e , a c i d i f i e d , f i l t e r
s t e r i l i z e d , a n d a d d e d a f t e r a u t o c l a v i n g . Th e f i n a l p H o f
t h e MS b a s e wa s a d j u s t e d t o 7 . 4 wi t h a m m o n i u m
h y d r o x i d e .
Fo r i s o l a t i o n , Mc C l o s k e y - Ro t t - Fy t e r s o l u t i o n
( Mc C l o s k e y Va r n i s h C o . , P h i l a d e l p h i a , P a . ) o r P C P
1 4 2 1

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1 4 2 2 S TA NL A KE A ND FI NN
( 9 9 + % P C P ; A l d r i c h C h e m i c a l C o . , Mi l wa u k e e , W i s . )
s e r v e d a s t h e s o l e c a r b o n s o u r c e . Th e Mc C l o s k e y -
Ro t t - Fy t e r s o l u t i o n c o n s i s t e d o f 5 % P C P , 0 . 6 % o t h e r
c h l o r o p h e n o l s , a n d 9 4 % n o n a q u e o u s s o l v e n t . MS b a s e
p l u s 0 . 1 % Mc C l o s k e y - Ro t t - Fy t e r s o l u t i o n , a d d e d
wi t h o u t s t e r i l i z a t i o n , c o n t a i n e d 4 0 t o 5 0 , u g o f P C P p e r
m l a n d wa s d e s i g n a t e d a s c o m m e r c i a l P C P m e d i u m .
P C P , wh e n u s e d a s t h e c a r b o n s o u r c e , wa s f i r s t
c o n v e r t e d t o i t s s o d i u m s a l t b y b e i n g d i s s o l v e d i n 0 . 2
N Na OH. P o r t i o n s o f a s t o c k s o d i u m P C P s o l u t i o n
( 1 0 , 0 0 0 , u g / m l ) we r e t h e n a d d e d t o MS b a s e , b e f o r e o r
a f t e r a u t o c l a v i n g , a n d d e s i g n a t e d a s P C P m e d i u m .
I s o l a t i o n p r o c e d u r e . S a m p l e s we r e i n o c u l a t e d i n t o
c o m m e r c i a l P C P m e d i u m a n d i n c u b a t e d a t 3 0 C a t 2 0 0
r p m . C e l l g r o wt h wa s m o n i t o r e d b y m e a s u r i n g t h e
a b s o r b a n c e a t 6 0 0 n m , a n d P C P c o n t e n t wa s m o n i -
t o r e d b y m e a s u r i n g t h e a b s o r b a n c e a t 3 2 0 n m ( a n a l y t i -
c a l m e t h o d s ) . W h e n t h e P C P c o n t e n t d e c r e a s e d t o 1 t o
1 0 , u g / m l , a d d i t i o n a l Mc C l o s k e y - Ro t t - Fy t e r s o l u t i o n
wa s a d d e d t o b r i n g t h e P C P c o n t e n t o f t h e m e d i u m
b a c k u p t o 5 0 , u g / m l . A r e g i m e n o f r e g u l a r a d d i t i o n s o f
Mc C l o s k e y - Ro t t - Fy t e r s o l u t i o n a n d we e k l y t r a n s f e r s
t o f r e s h c o m m e r c i a l P C P m e d i u m wa s c a r r i e d o u t f o r 2
t o 4 we e k s . A t r a n s i t i o n wa s t h e n m a d e f r o m t h e
a d d i t i o n o f Mc C l o s k e y - Ro t t - Fy t e r s o l u t i o n t o t h e a d d i -
t i o n o f p u r e P C P , a n d t h e m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n o f
P C P i n t h e m e d i u m wa s r a i s e d t o 1 0 0 , u g / m l . W h e n t h e
c u l t u r e r e p e a t e d l y d e g r a d e d t h e P C P t h a t wa s a d d e d , a
1 0 % ( v o l / v o l ) i n o c u l u m wa s t r a n s f e r r e d t o P C P m e d i -
u m c o n t a i n i n g 1 0 0 j g o f P C P p e r m l a s t h e s o l e c a r b o n
s o u r c e . A s c h e d u l e f o r m o n i t o r i n g a n d f o r P C P a d d i -
t i o n s s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d a b o v e wa s f o l l o we d .
B a t c h c u l t u r e s g r o wi n g i n P C P m e d i u m we r e t r a n s -
f e r r e d t o a Ne w B r u n s wi c k S c i e n t i f i c C o . B i o f l o m o d e l
C - 3 0 c h e m o s t a t a n d a d a p t e d f r o m b a t c h t o c o n t i n u o u s
c u l t u r e . A t s t e a d y s t a t e , t h e i n f l u e n t P C P c o n c e n t r a -
t i o n wa s 5 0 0 , u g / m l , t h e d i l u t i o n r a t e wa s 0 . 0 1 6 h - ' , t h e
t e m p e r a t u r e wa s 3 0 C , a i r f l o w wa s 6 . 2 l i t e r s h - ' ,
a g i t a t i o n wa s 3 0 0 r p m , a n d t h e v o l u m e wa s 3 5 0 m l ; t h e
p H wa s m a i n t a i n e d a t 6 . 8 b y t h e a u t o m a t i c a d d i t i o n o f
1 N Na OH. P o r t i o n s we r e r e m o v e d d u r i n g s t e a d y -
s t a t e g r o wt h , d i l u t e d , a n d s u r f a c e p l a t e d o n Tr y p t i c a s e
s o y b r o t h ( TS B ) s o l i d i f i e d wi t h 1 . 5 % a g a r ( B B L Mi c r o -
b i o l o g y S y s t e m s , C o c k e y s v i l l e , Md . ) . P r e d o m i n a n t
c o l o n y t y p e s we r e p i c k e d a n d t e s t e d f o r P C P - d e g r a d -
i n g c a p a b i l i t y i n P C P b a t c h c u l t u r e s .
A n a l y t i c a l m e t h o d s . Th e a m o u n t o f P C P i n t h e
Na y l o r ' s Ru n C r e e k ( NC ) s a m p l e wa s d e t e r m i n e d b y
t h e m e t h o d o f Fo u n t a i n e e t a l . ( 1 6 ) . Th e a m o u n t o f
P C P i n t h e 4 - c m f r a c t i o n o f s a m p l e S 1 wa s d e t e r m i n e d
b y t h e f o l l o wi n g a s s a y . A - 5 g ( we t we i g h t ) s o i l s a m p l e
wa s e x t r a c t e d f o r 5 m i n i n a s e p a r a t o r y f u n n e l wi t h 5 0
m l o f a c i d i f i e d h e x a n e . Th e h e x a n e f r a c t i o n wa s f i l -
t e r e d a n d t h e n e x t r a c t e d wi t h 0 . 2 N Na OH. Th e
a q u e o u s p h a s e c o n t a i n e d P C P a s a p r e c i p i t a t e . Th e
h e x a n e f r a c t i o n wa s e x t r a c t e d a s e c o n d t i m e wi t h 0 . 5
N Na OH. Th e a q u e o u s p h a s e s we r e c o m b i n e d , t h e
p r e c i p i t a t e wa s d i s s o l v e d , a n d t h e a b s o r b a n c e o f t h e
s a m p l e wa s r e a d a t 3 2 0 n m .
A t a n a l k a l i n e p H, P C P i n i t s s o d i u m s a l t f o r m , h a s a
c h a r a c t e r i s t i c a b s o r b a n c e a t 3 2 0 n m ( 2 9 ) . S a m p l e s o f 5
m l we r e m a d e a l k a l i n e b y t h e a d d i t i o n o f 1 d r o p o f 1 0
N Na OH. S a m p l e s we r e t h e n c e n t r i f u g e d t o r e m o v e
c e l l s , a n d a b s o r b a n c e s we r e r e a d a t 3 2 0 a n d 3 6 0 n m
wi t h a B e c k m a n U V- Vi s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t e r . Th e
3 2 0 - n m a b s o r b a n c e m i n u s t h e 3 6 0 - n m a b s o r b a n c e
( b a c k g r o u n d ) wa s t h e n c o n v e r t e d t o m i c r o g r a m s o f
P C P p e r m i l l i l i t e r b y u s i n g a s t a n d a r d c u r v e .
C e l l d e n s i t i e s we r e d e t e r m i n e d b y r e a d i n g t h e a b s o r -
b a n c e o f 5 - m l s a m p l e s e i t h e r a t 4 3 0 n m wi t h a B a u s c h
a n d L o m b S p e c t r o n i c 2 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r o r a t 4 1 5
n m wi t h a B e c k m a n U V- Vi s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t e r .
A b s o r b a n c e r e a d i n g s we r e c o n v e r t e d t o d r y we i g h t s
b y u s i n g a s t a n d a r d c u r v e .
D e t e r m i n a t i o n o f t h e e x t e n t o f m i n e r a l i z a t i o n o f
P C P b y s t r a i n NC wa s c a r r i e d o u t i n a c h e m o s t a t wi t h
P C P a s t h e s o l e c a r b o n s o u r c e . Th e i n f l u e n t P C P
c o n c e n t r a t i o n wa s 5 2 5 , u g / m l , t h e e f f l u e n t P C P c o n c e n -
t r a t i o n wa s 1 7 p . g / m l , t h e d i l u t i o n r a t e wa s 0 . 0 4 5 h - 1 ,
a n d a l l o t h e r c o n d i t i o n s we r e a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d .
Th e c h l o r i d e c o n t e n t wa s d e t e r m i n e d b y s i l v e r n i t r a t e
t i t r a t i o n ( 1 0 ) . To t a l o r g a n i c c a r b o n c o n t e n t f o r c e l l - f r e e
i n f l u e n t a n d e f f l u e n t s a m p l e s wa s m o n i t o r e d wi t h a
B e c k m a n 2 1 5 A c a r b o n a n a l y z e r .
C h a r a c t e r i z a t i o n o f P C P d e g r a d e r s . P C P - d e g r a d i n g
i s o l a t e s a n d C h u a n d Ki r s c h ' s KC - 3 s t r a i n ( 9 ) we r e
c o m p a r e d a s t o t h e i r a b i l i t i e s t o a s s i m i l a t e v a r i o u s
c a r b o n s o u r c e s . C a r b o h y d r a t e s we r e u t i l i z e d a t a
c o n c e n t r a t i o n o f 3 0 0 , u g / m l i n MS b a s e . P h e n o l i c a n d
b e n z o i c c a r b o n s o u r c e s we r e t e s t e d a t a c o n c e n t r a t i o n
o f 2 0 0 , u g / m l i n MS b a s e . W h e n r e q u i r e d f o r g r o wt h , 2
, u g o f y e a s t e x t r a c t ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t ,
Mi c h . ) o r 0 . 2
j i g
o f b i o t i n ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t .
L o u i s , Mo . ) p e r m l wa s a d d e d . C e l l u l a r m o r p h o l o g y
a n d m o t i l i t y we r e d e t e r m i n e d a t v a r i o u s s t a g e s o f
g r o wt h i n TS B . C y t o c h r o m e o x i d a s e wa s a s s a y e d b y
t h e N, N- d i m e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e o x a l a t e ( D i f c o )
m e t h o d ( 1 7 ) . Th e c o l o r r e a c t i o n t o o k 3 m i n t o d e v e l o p .
Th e c e l l wa l l c o n s t i t u e n t s , d i a m i n o p i m e l i c a c i d a n d
a r a b i n o s e , we r e d e t e r m i n e d b y a s c e n d i n g p a p e r c h r o -
m a t o g r a p h y . C e l l s we r e g r o wn i n TS B a n d t h e n
wa s h e d t h r e e t i m e s . D i a m i n o p i m e l i c a c i d wa s d e t e r -
m i n e d wi t h wh o l e - c e l l h y d r o l y s a t e s b y t h e m e t h o d o f
B e c k e r e t a l . ( 5 ) . E s c h e r i c h i a c o l i a n d D L - c t - e - d i a m i n o -
p i m e l i c a c i d ( S i g m a ) s e r v e d a s p o s i t i v e c o n t r o l s . Fo r
d e t e r m i n a t i o n o f a r a b i n o s e , c e l l s we r e e x t r a c t e d f o r 1
h i n 0 . 1 N Na OH a t 1 0 0 C , wa s h e d , h y d r o l y z e d f o r 2 h
i n 2 N HC I a t 1 0 0 C , a n d t h e n d r i e d t o r e m o v e HC I ( 7 ) .
C h r o m a t o g r a p h s we r e r u n i n a b u t a n o l - l a c t i c a c i d -
wa t e r ( 4 : 1 : 5 ) s o l v e n t a n d d e v e l o p e d a t 7 0 C wi t h a n
a n i l i n e h y d r o g e n o x a l a t e d e v e l o p e r ( 2 4 ) . C o r y n e b a c t e -
r i u m r e n a l e a n d a r a b i n o s e ( Fi s h e r S c i e n t i f i c C o . ,
Ro c h e s t e r , N. Y . ) s e r v e d a s p o s i t i v e c o n t r o l s .
G r o wt h c o n d i t i o n s f o r a x e n i c c u l t u r e s t u d i e s . S t r a i n
NC wa s u s e d i n a l l s t u d i e s . E x p e r i m e n t s we r e c o n -
d u c t e d i n o n e - q u a r t e r - s t r e n g t h ( 7 . 5 g / l i t e r ) TS B o r
m e d i a wi t h MS b a s e a n d a d d e d c a r b o n s o u r c e s ( 5 0 t o
4 0 0 , u g / m l ) . P C P a n d 2 , 4 , 6 - t r i c h l o r o p h e n o l ( TC P ;
C h e m i c a l S e r v i c e , W e s t c h e s t e r , P a . ) we r e f i r s t c o n -
v e r t e d t o s o d i u m s a l t s f o r m b y b e i n g d i s s o l v e d i n 0 . 2 N
Na OH b e f o r e b e i n g a d d e d t o MS b a s e .
On e - l i t e r c r e a s e d f l a s k s wi t h wo r k i n g v o l u m e s o f
5 0 0 m l we r e i n c u b a t e d a t 3 0 C a n d 2 0 0 r p m . Th e p H
wa s c o n t r o l l e d t o wi t h i n 0 . 1 u n i t b y t h e m a n u a l a d d i -
t i o n o f Na OH wh i l e t h e e f f e c t o f p H o n g r o wt h r a t e
wa s s t u d i e d . A B i o f l o m o d e l C - 3 0 c h e m o s t a t , wi t h o u t
m e t e r e d a d d i t i o n o f n u t r i e n t , wa s u s e d a s a s t i r t a n k
wi t h p H c o n t r o l f o r g r o wt h o f t h e o r g a n i s m wi t h
s e l e c t i v e a d d i t i o n o f P C P .
P C P t o x i c i t y . Th e i n h i b i t i o n o f c e l l u l a r g r o wt h b y
P C P wa s s t u d i e d wi t h b a t c h c u l t u r e s . G l u c o s e o r
a c e t a t e wa s a d d e d t o MS b a s e t o g i v e a f i n a l c o n c e n -
t r a t i o n o f 3 0 0 , u g / m l . B i o t i n , wh e n r e q u i r e d , wa s a d d e d
t o g i v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 , u g / m l . P C P wa s
A P P L . E NVI RON. MI C ROB I OL .

o
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A
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1
3
,

2
0
1
4

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P E NTA C HL OROP HE NOL - D E G RA D I NG B A C TE RI U M 1 4 2 3
TA B L E 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f P C P - d e g r a d i n g b a c t e r i a l s t r a i n s b y g r o wt h o n v a r i o u s c a r b o n s o u r c e s
G r o wt h o n i n d i c a t e d c a r b o n s o u r c e
S t r a i n
Tr i c h l o r o -
G l u c o s e C e l l o b i o s e A c e t a t e S u c c i n a t e Ma l a t e C e l l u l o s e B e n z o a t e
b e n z o a t e
P h e n o l TC P P C P
KC - 3 + + + - -
NC + a +
+ +
S i + - +
+ b
+ +
RS + - + - - - - _ - + +
S 2 + - + _b - +
+
a
B i o t i n wa s r e q u i r e d f o r g r o wt h .
b
Y e a s t e x t r a c t wa s r e q u i r e d f o r g r o wt h .
a d d e d i n s o d i u m s a l t f o r m . I n c u b a t i o n wa s c a r r i e d o u t
a t 3 0 C a n d 2 0 0 r p m . Th e p H wa s a d j u s t e d t o 7 . 4 wi t h
Na OH o r HC I . S t r a i n NC o r a m i x e d p o p u l a t i o n o f s o i l
m i c r o o r g a n i s m s wa s u s e d a s t h e i n o c u l u m .
RE S U L TS
I s o l a t i o n o f P C P - d e g r a d i n g b a c t e r i a . C l o s e l y
r e l a t e d b a c t e r i a c a p a b l e o f d e g r a d i n g P C P we r e
i s o l a t e d f r o m b o t h a q u a t i c a n d s o i l h a b i t a t s . A
h i s t o r y o f p r i o r P C P e x p o s u r e wa s n o t r e q u i r e d
f o r t h e i s o l a t i o n o f P C P d e g r a d e r s .
Th e d e g r a d a t i o n o f P C P i n t h e c o m m e r c i a l
P C P m e d i u m c o m m e n c e d a f t e r a l a g o f 1 t o 2
we e k s . Th e r e wa s n o c o r r e l a t i o n o f P C P d e g r a -
d a t i o n wi t h t h e e x t e n t o f i n i t i a l b a c t e r i a l g r o wt h .
A f t e r t h e d e g r a d a t i o n o f t h e i n i t i a l l o a d o f P C P ,
s u b s e q u e n t a d d i t i o n s o f c o m m e r c i a l P C P m e d i -
u m r e s u l t e d i n d e g r a d a t i o n a f t e r l a g p e r i o d s o f
o n l y 1 t o 3 d a y s . Tr a n s f e r o f t h e m i x e d p o p u l a -
t i o n f r o m t h e c o m m e r c i a l P C P m e d i u m t o MS
b a s e wi t h p u r e P C P ( P C P m e d i u m ) r e s u l t e d i n
c o n t i n u e d P C P d e g r a d a t i o n . A t t e m p t s t o i s o l a t e
t h e P C P - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s f r o m t h e s e
b a t c h c u l t u r e s b y p l a t i n g o n TS B wi t h 1 . 5 % a g a r
we r e u n s u c c e s s f u l . B a c t e r i a wh i c h f a i l e d t o d e -
g r a d e P C P we r e s t i l l n u m e r i c a l l y p r e d o m i n a n t i n
t h e b a t c h c u l t u r e s s e v e r a l we e k s a f t e r t h e t r a n s -
f e r t o P C P m e d i u m e v e n t h o u g h t h e o n l y c a r b o n
s o u r c e a d d e d d u r i n g t h i s t i m e s p a n wa s P C P .
Mi x e d g r o wt h f r o m e a c h b a t c h c u l t u r e wa s
u s e d t o i n o c u l a t e a c h e m o s t a t . A t s t e a d y s t a t e ,
t h e c e l l d e n s i t y wa s 2 5 m g ( d r y we i g h t ) / l i t e r a t a
f e e d c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 0 , u g o f P C P p e r m l . A t
s t e a d y s t a t e , P C P - d e g r a d i n g b a c t e r i a p r e d o m i -
n a t e d n u m e r i c a l l y . I n o n e i n s t a n c e , t h e y a c -
c o u n t e d f o r 9 3 % o f t h e s t e a d y - s t a t e p o p u l a t i o n ;
h o we v e r , a f t e r 1 3 d a y s o f c h e m o s t a t i c g r o wt h ,
t h e p o p u l a t i o n r e m a i n e d m i x e d . W h e n t h e m i x e d
p o p u l a t i o n wa s p l a t e d o n TS B wi t h 1 . 5 % a g a r ,
s m a l l y e l l o w c o l o n i e s r o u t i n e l y p r e d o m i n a t e d
a f t e r 3 d a y s o f i n c u b a t i o n . Th e s e c o l o n i e s p o s -
s e s s e d t h e a b i l i t y t o u t i l i z e P C P a s a s o l e c a r b o n
s o u r c e .
C h a r a c t e r i z a t i o n o f P C P - d e g r a d i n g b a c t e r i a .
Fr o m e a c h h a b i t a t , a d i f f e r e n t s t r a i n o f P C P -
d e g r a d i n g b a c t e r i u m wa s i s o l a t e d . Th e s t r a i n s
c o u l d b e d i f f e r e n t i a t e d f r o m o n e a n o t h e r a n d
f r o m C h u a n d Ki r s c h ' s KC - 3 s t r a i n ( 9 ) b y n u t r i -
t i o n t e s t s ( Ta b l e 1 ) . W h e n g r o wn i n TS B , t h e
i s o l a t e s e x h i b i t e d a r u d i m e n t a r y c o c c u s - t o - r o d -
t o - c o c c u s c e l l c y c l e . Th e i s o l a t e s a n d t h e KC - 3
s t r a i n c o n t a i n e d d i a m i n o p i m e l i c a c i d b u t n o t
a r a b i n o s e i n t h e i r c e l l wa l l s ( Ta b l e 2 ) . Th e s e a r e
c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e g e n u s A r t h r o b a c t e r .
No P s e u d o m o n a s s p e c i e s c a p a b l e o f u t i l i z i n g
P C P a s a s o l e c a r b o n s o u r c e wa s i s o l a t e d . Th e
i s o l a t i o n t e c h n i q u e d i d n o t s e l e c t a g a i n s t p s e u -
d o m o n a d s s i n c e p s e u d o m o n a d s we r e p r e s e n t a t
TA B L E 2 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f
P C P - d e g r a d i n g
b a c t e r i a l s t r a i n s
b y p h y s i o l o g i c a l
a n d
m o r p h o l o g i c a l
c r i t e r i a
C h a r a c t e r i z a t i o n b y :
S t r a i n G r a m C e l l u l a r P i g m e n -
C o l o n y C o l o n y G l u c o s e
C a t a -
C y t o - D i a m i n o -
A r a b i -
a b ~ ~ ~ Mo t i l i t y " t i n d s i z e c o n s i s - f e r m e n - C c h r o m e p i m e l i c
s t a i n a m o r p h o l o g y t a t i o n ( m m ) d
t e n c y d
t a t i o n l a s e
o x i d a s e a c i d m
KC - 3 + . - Ro d s a n d c o c c i Y e l l o w 1 - 3
B u t y r o u s
-
+ + +
-
NC + . - Ro d s a n d c o c c i
-
Y e l l o w 1 - 2 C a s e o u s
-
+ + +
-
S i + , - Ro d s a n d c o c c i
-
Y e l l o w 1 - 2
B u t y r o u s
-
+ + +
-
RS + , - Ro d s a n d c o c c i + Y e l l o w 1 - 2
B u t y r o u s
-
+ + +
-
S 2 + . - Ro d s a n d c o c c i + Y e l l o w 1 - 2
B u t y r o u s - + +
+
a
E a r l y g r o wt h i n TS B wa s
p r e d o m i n a n t l y
G r a m
p o s i t i v e ( + ) ;
l a t e r
g r o wt h
wa s
p r e d o m i n a n t l y
G r a m
n e g a t i v e
( - ) .
b
G r o wt h i n TS B wa s a c c o m p a n i e d b y
a c o c c u s - t o - r o d - t o c o c c u s
c h a n g e
i n
m o r p h o l o g y .
C
Mo t i l i t y wa s d e t e r m i n e d b y p h a s e - c o n t r a s t
e x a m i n a t i o n o f we t m o u n t s
p r e p a r e d
f r o m TS B c u l t u r e s .
d
G r o wt h wa s o b s e r v e d o n p l a t e s c o n t a i n i n g
TS B wi t h 1 . 5 %
a g a r .
VOL . 4 4 , 1 9 8 2

o
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A
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1
3
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1
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1 4 2 4 S TA NL A KE A ND FI NN
TA B L E 3 . C o m p a r a t i v e g r o wt h r a t e s f o r s t r a i n NC
m e t a b o l i z i n g v a r i o u s s u b s t r a t e s
D o u b l i n g G o wt h r a t e
C e l l y i e l d
S u b s t r a t e a D o u b l i n g
G r o wt h t r a t e
( g p e r g o f
t i m e ( h ) ( h 1 )
~ s u b s t r a t e )
TS B ( 7 . 5 g / 2 . 5 0 . 2 8
l i t e r )
S o d i u m
a c e t a t e ( 5 0 0 3 . 0 0 . 2 3 0 . 2 1
, u g / m l )
TC P ( 1 5 0 p . g / 5 . 5 0 . 1 3 0 . 2 6
m l )
G l u c o s e ( 5 0 0 1 2 0 . 0 6 0 . 3 5
, u g / m l )
P C P ( 5 0 t o 3 0 0 7 - 1 4 0 . 1 - 0 . 0 5 b 0 . 1 5
, u g / m l )
a
p H, 7 . 1 t o 7 . 2 . I n i t i a l s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s a r e
g i v e n i n p a r e n t h e s e s .
b Th i s v a l u e v a r i e d wi t h P C P c o n c e n t r a t i o n .
a l l s t a g e s o f i s o l a t i o n u p t o a n d i n c l u d i n g c h e -
m o s t a t i c e n r i c h m e n t . Th e a b s e n c e o f P C P - d e -
g r a d i n g p s e u d o m o n a d s m u s t t h u s b e c o n s i d e r e d
t o b e a r e f l e c t i o n o f t h e h a b i t a t s s a m p l e d .
G r o wt h o f t h e i s o l a t e s i n c h e m i c a l l y d e f i n e d
m e d i u m wi t h P C P a s t h e s o l e c a r b o n s o u r c e wa s
p r i m a f a c i e e v i d e n c e o f a t l e a s t s o m e d i s s i m i l a -
t i o n a n d a s s i m i l a t i o n o f P C P . E v i d e n c e o f t h e
c o m p l e t e m i n e r a l i z a t i o n o f P C P wa s p r o v i d e d b y
c h e m o s t a t i c g r o wt h o f s t r a i n NC . A t s t e a d y
s t a t e i n P C P m e d i u m , 9 7 % o f t h e P C P a n d 8 9 %
o f t h e c a r b o n i n t h e m e d i u m d i s a p p e a r e d ,
wh e r e a s c h l o r i d e wa s r e l e a s e d i n t o t h e m e d i u m
i n a n a m o u n t wh i c h a c c o u n t e d f o r 9 5 % o f t h e
c h l o r i n e a d d e d a s P C P .
I n s h a k e r f l a s k s , g r o wt h r a t e s o f 0 . 0 5 t o 0 . 2 8
h - 1 we r e r e c o r d e d f o r a n u m b e r o f c a r b o n
s o u r c e s . Th e h i g h e s t g r o wt h r a t e wa s r e c o r d e d
-
0 . 1 2
w
c r 0 . 0 8
3 .
0 ~
I D
0 . 0 4
L
c n
0
I
, . . ~ ~ ~ ~
0 1 0 0 2 0 0 3 0 0
C ONC E NTRA TI ON P C P ( , a g / m l )
FI G . 1 . S p e c i f i c g r o wt h r a t e o f s t r a i n NC d e t e r -
m i n e d i n b a t c h c u l t u r e i n P C P m e d i u m a t a P C P
c o n c e n t r a t i o n o f 5 0 t o 3 0 0 , u g / m l . Fl a s k s we r e i n o c u l a t -
e d wi t h P C P - a d a p t e d c e l l s t o a n i n i t i a l a b s o r b a n c e o f
0 . 0 2 a t 6 0 0 n m . Th e i n i t i a l p H wa s 7 . 2 , t h e t e m p e r a t u r e
wa s 3 0 C , a n d a g i t a t i o n wa s 2 0 0 r p m .
1 ( ) 0
9 0
8 0
7 0
1 - 1
- i
6 0
5 0
4 0
3 0
2 0
1 0
o /
0
0
0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0
C ONC E NTRA TI ON P C P ( p g / m l )
FI G . 2 . E f f e c t o f P C P c o n c e n t r a t i o n o n l a g t i m e i n
b a t c h c u l t u r e . C o n d i t i o n s we r e a s d e s c r i b e d i n t h e
l e g e n d t o Fi g . 1 .
wi t h TS B , wh e r e a s t h e l o we s t g r o wt h r a t e s we r e
r e c o r d e d wh e n P C P o r g l u c o s e wa s t h e s o l e
c a r b o n s o u r c e ( Ta b l e 3 ) . A l t h o u g h g l u c o s e wa s
a s s o c i a t e d wi t h o n e o f t h e l o we s t g r o wt h r a t e s ,
i t s m e t a b o l i s m r e s u l t e d i n t h e h i g h e s t c e l l y i e l d
( y ) f o r a s o l e c a r b o n s o u r c e . Th e l o we s t c e l l
y i e l d wa s f o r P C P , b a s e d o n g r a m s o f c e l l s ( d r y
we i g h t ) p e r g r a m s o f P C P ( y
=
0 . 1 5 ) . Th i s l o w
c e l l y i e l d wa s t o a g r e a t e x t e n t a r e f l e c t i o n o f t h e
c h l o r i n e c o n t e n t o f P C P ( 6 6 . 5 6 % [ wt / wt ] ) , wh e n
b a s e d o n c a r b o n c o n t e n t o f P C P ( y
=
0 . 5 5 ) .
Th e e f f e c t s o f s u b s t r a t e ( P C P ) c o n c e n t r a t i o n
o n t h e g r o wt h r a t e , l e n g t h o f t h e l a g p h a s e , a n d
y i e l d we r e i n v e s t i g a t e d f o r s t r a i n NC g r o wn i n
b a t c h c u l t u r e . Fi g u r e 1 s h o ws t h e e f f e c t o f
i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f P C P o n t h e g r o wt h
r a t e o f s t r a i n NC . Th e g r o wt h r a t e i n c r e a s e d
wi t h i n c r e a s i n g P C P c o n c e n t r a t i o n u p t o 1 3 0
j i g / m l
( 4 . 9 x 1 0 - 4 M) . C o n c e n t r a t i o n s o f P C P
a b o v e t h i s l e v e l s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t h e
g r o wt h r a t e .
I n c r e a s e s i n P C P ( s u b s t r a t e ) c o n c e n t r a t i o n
r e s u l t e d i n d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l i n c r e a s e s i n l a g
t i m e ( Fi g . 2 ) . Th e s i z e o f t h e i n i t i a l i n o c u l u m
( 0 . 1 2 , 0 . 2 4 , o r 0 . 3 4 , u g / m l ) h a d n o d i s c e r n a b l e
e f f e c t o n t h e l e n g t h o f t h e l a g p e r i o d . Fi g u r e 3
A P P L . E NVI RON. MI C ROB I OL .

o
n

A
p
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i
l

1
3
,

2
0
1
4

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s
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d

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r
o
m

P E NTA C HL OROP HE NOL - D E G RA D I NG B A C TE RI U M 1 4 2 5
6 (
" .
%A
s o
4 0
3 0
2 0
1 0
0 5 0 1 0 0 1 S 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0
C ONC E NTRA TI ON P C P
( p g / m i )
FI G . 3 . D r y c e l l m a s s v e r s u s P C P c o n c e n t r a t i o n i n
b a t c h c u l t u r e a t y = 0 . 1 5 . C o n d i t i o n s we r e a s d e -
s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o Fi g . 1 .
s h o ws t h e r e l a t i o n s h i p b e t we e n f i n a l c e l l d e n s i t y
a n d i n i t i a l s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n . I n c r e a s e s i n
P C P c o n c e n t r a t i o n h a d n o e f f e c t o n c e l l y i e l d i n
b a t c h c u l t u r e .
p H a n d P C P t o x i c i t y . W h e n s t r a i n NC wa s
g r o wn i n a s h a k e r f l a s k wi t h r e p e a t e d a d d i t i o n s
o f P C P ( t o g i v e a m a x i m u m c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0
j i g / m l ) ,
t h e P C P wa s d e g r a d e d , t h e c e l l m a s s
i n c r e a s e d , a n d t h e p H d r o p p e d u n t i l a p o i n t wa s
r e a c h e d a t wh i c h P C P d e g r a d a t i o n c e a s e d . A t
t h a t p o i n t , a n a m o u n t o f P C P e q u i v a l e n t t o 6 0 0
, u g / m l h a d b e e n d e g r a d e d , t h e c e l l d e n s i t y wa s 5 0
j i g / m l ,
a n d t h e p H h a d f a l l e n t o 6 . 1 5 ( i n MS b a s e
p l u s g l u c o s e s t r a i n NC g r e w we l l a t a p H o f 6 . 0 ) .
A d j u s t m e n t o f t h e p H b a c k u p t o 7 . 1 r e s u l t e d i n
d e g r a d a t i o n o f t h e r e s i d u e P C P a n d o f s u b s e -
q u e n t a d d i t i o n s o f P C P . W h e n t h e s t r a i n wa s
g r o wn i n a s t i r t a n k wi t h c o n t r o l l e d p H ( 6 . 9 t o
7 . 1 ) , a n a m o u n t o f P C P c o m p a r a b l e t o a f i n a l
c o n c e n t r a t i o n o f 1 , 5 0 0
j i g / m l
wa s c o n s u m e d i n
i n c r e m e n t a l a d d i t i o n s o f 1 0 0 , u g / m l .
No e f f e c t o f p H ( 6 . 8 t o 7 . 8 ) o n c e l l y i e l d
a t a
P C P c o n c e n t r a t i o n o f 1 3 0 , u g / m l wa s o b s e r v e d
f o r s t r a i n NC . D e c r e a s i n g p H e x e r t e d a n i n f l u -
e n c e o n t h e d u r a t i o n o f t h e l a g p h a s e c o m p a r a b l e
wi t h t h a t o b s e r v e d f o r i n c r e a s i n g P C P c o n c e n -
t r a t i o n s .
On t h e p r e s u m p t i o n t h a t t o x i c i t y
i s r e l a t e d
o n l y t o t h e a c i d ( u n d i s s o c i a t e d )
f o r m o f
P C P ,
a
s e r i e s o f g r o wt h e x p e r i m e n t s wa s c o n d u c t e d a t
v a r i o u s p H l e v e l s a n d t o t a l P C P c o n c e n t r a t i o n s .
Th e r e s u l t s , s h o wn i n Ta b l e 4 , s u g g e s t e d
t h a t
c o n c e n t r a t i o n o f t h e f r e e a c i d f o r m o f P C P d i d
c o r r e l a t e wi t h t h e t o x i c e f f e c t . G r o wt h o f s t r a i n
NC wa s i n h i b i t e d b y c o n c e n t r a t i o n s o f u n d i s s o -
c i a t e d P C P a b o v e a p p r o x i m a t e l y
2
, g / m l .
S o m e b a c t e r i a i n c a p a b l e o f d e g r a d i n g P C P
we r e f o u n d t o b e m o r e r e s i s t a n t t o t h e t o x i c
e f f e c t o f P C P t h a n wa s s t r a i n NC . On e s u c h
o r g a n i s m i s o l a t e d f r o m MS b a s e p l u s g l u c o s e
a n d 4 0 0 , u g o f P C P p e r m l wa s a c y t o c h r o m e
o x i d a s e - n e g a t i v e b a c t e r i u m i d e n t i f i e d a s a m e m -
b e r o f t h e g e n u s A c i n e t o b a c t e r .
D I S C U S S I ON
P C P i s a r e c a l c i t r a n t ( 1 , 1 8 , 2 8 ) m o l e c u l e
c a p a b l e o f b e i n g b i o d e g r a d e d b y o n l y a l i m i t e d
n u m b e r o f b a c t e r i a ( 9 , 2 9 ) . B a s e d o n i t s s u s c e p t i -
b i l i t y t o b i o d e g r a d a t i o n , P C P wo u l d b e r e l a t e d t o
t h o s e c h e m i c a l s f o u n d i n A l e x a n d e r ' s c a t e g o r y
i v , n a m e l y " c h e m i c a l s t h a t a r e s u i t a b l e s u b -
s t r a t e s f o r p o p u l a t i o n s i n a x e n i c c u l t u r e o r i n
o n e o r m o r e m i c r o b i a l h a b i t a t s b u t wh i c h o c c a -
s i o n a l l y a r e q u i t e p e r s i s t e n t " ( 2 ) . Th e p e r s i s -
t e n c e o f P C P wo u l d t h e n b e d u e t o s u c h f a c t o r s
a s l a c k o f m i c r o o r g a n i s m s i n t h e h a b i t a t c a p a b l e
o f d e c o m p o s i n g P C P , t o o h i g h o r t o o l o w a P C P
c o n c e n t r a t i o n , t o o l o w a p H, o r a n a e r o b i c c o n d i -
t i o n s .
A l t h o u g h t h e n u m b e r o f s i t e s s a m p l e d wa s
s m a l l , i t i s s i g n i f i c a n t t h a t P C P - d e g r a d i n g b a c t e -
r i a we r e i s o l a t e d f r o m a l l s i t e s . Th e r e a p p e a r e d
t o b e n o i n d i c a t i o n o f s e l e c t i o n p r e s s u r e a f f o r d e d
b y p r i o r e x p o s u r e t o P C P f o r t h e i s o l a t i o n o f
P C P - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s . A l l s t r a i n s i s o -
l a t e d we r e s i m i l a r t o C h u a n d Ki r s c h ' s KC - 3
s t r a i n ( 9 ) a n d p o s s e s s e d c e l l wa l l c h a r a c t e r i s t i c s
c o m m o n t o t h e g e n u s A r t h r o b a c t e r . No P s e u d o -
m o n a s s p e c i e s c a p a b l e o f d e c o m p o s i n g P C P , a s
i s o l a t e d b y W a t a n a b e i n J a p a n ( 2 9 ) , wa s e n c o u n -
t e r e d .
B a s e d o n c e l l y i e l d , P C P p r o v e d t o b e a p o o r
s u b s t r a t e f o r t h e g r o wt h o f s t r a i n NC . To a
c e r t a i n e x t e n t , t h i s i s a r e f l e c t i o n o f t h e h i g h
c h l o r i n e c o n t e n t o f P C P , b u t e v e n b a s e d o n
c a r b o n we i g h t , t h e y i e l d o f P C P wa s l o we r t h a n
t h e y i e l d o f t h e c l o s e l y r e l a t e d TC P . Th e e f f e c t
TA B L E 4 . E f f e c t o f p H o n P C P t o x i c i t y f o r s t r a i n
NC
U n d i s s o c i a t e d
S o d i u m P C P
G r o wt h
P C P ( L g / m l ) '
a d d e d p H
( ~ L g / m I )
+ b 0 . 3 9 5 0 7 . 0
+ 0 . 7 9 1 0 0 7 . 0
+ 1 . 5 2 5 0 6 . 5
+ 1 . 5 8 2 0 0 7 . 0
+ , - 1 . 9 7 2 5 0 7 . 0
- 2 . 3 6 3 0 0 7 . 0
- 3 . 0 3 1 0 0 6 . 5
- 4 . 5 5 5 0 6 . 0
a
Th e a m o u n t o f u n d i s s o c i a t e d P C P wa s c a l c u l a t e d
f r o m t h e He n d e r s o n - Ha s s e l b a l c h e q u a t i o n : l o g ( s a l t /
a c i d ) = p H -
p Ka .
Th e
p Ka
o f P C P i s 5 . 0 .
b + , Tu r b i d i t y i n a l l t u b e s ; + , - , t u r b i d i t y i n 5 0 % o f
t h e t u b e s ; - , t u r b i d i t y i n n o n e o f t h e t u b e s .
VOL . 4 4 , 1 9 8 2

o
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1
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1 4 2 6 S TA NL A KE A ND FI NN
o f P C P c o n c e n t r a t i o n o n t h e l e n g t h o f t h e l a g
p h a s e a n d t h e e x p o n e n t i a l g r o wt h r a t e f o r s t r a i n
NC c a t a b o l i z i n g P C P wa s c h a r a c t e r i s t i c o f t o x i c
s u b s t r a t e c a t a b o l i s m ( 1 9 , 2 7 ) . On e m o d e l p r e -
d i c t s t h a t l a g t i m e c a n b e s h o r t e n e d b y i n c r e a s -
i n g t h e s i z e o f t h e i n i t i a l i n o c u l u m ( 3 ) . Ot h e r
e x p e r i m e n t a l r e s u l t s c o n f l i c t wi t h t h i s h y p o t h e -
s i s ( 2 5 ) . Fo r s t r a i n NC , t h e s i z e o f t h e i n i t i a l
i n o c u l u m h a d n o d i s c e r n a b l e e f f e c t o n t h e l e n g t h
o f t h e l a g p e r i o d . I n o c u l u m h i s t o r y , i . e . , m a i n t e -
n a n c e i n P C P m e d i u m o r TS B , h a d a p r o f o u n d
e f f e c t o n t h e l e n g t h o f t h e l a g p e r i o d . L a g
p e r i o d s we r e l o n g e r wh e n s t r a i n NC wa s m a i n -
t a i n e d i n m e d i a wi t h o u t P C P . G r o wt h o n a
n o n s e l e c t i v e m e d i u m m a y n o t o n l y i n c r e a s e t h e
l e n g t h o f t h e l a g p e r i o d b u t c a n r e s u l t i n l o s s o f
t h e a b i l i t y t o c a t a b o l i z e t h e s u b s t r a t e ( 8 ) .
P C P , a s a n i n d u s t r i a l wa s t e , i s p r i m a r i l y a s s o -
c i a t e d wi t h wo o d t r e a t m e n t p l a n t s ( 4 ) . B i o l o g i c a l
t r e a t m e n t o f t h e e f f l u e n t f r o m t h e s e p l a n t s i s
p r a c t i c e d ( 1 4 ) . I n c o r p o r a t i o n o f t h e f o l l o wi n g
p o i n t s wi l l h o p e f u l l y i m p r o v e t h e e f f i c i e n c y o f
P C P b i o d e g r a d a t i o n i n s u c h t r e a t m e n t s y s t e m s .
( i ) To d a t e , o n l y a l i m i t e d n u m b e r o f b a c t e r i a
h a v e b e e n f o u n d t o p o s s e s s t h e c a p a c i t y t o
m i n e r a l i z e P C P , a n d t h i s b a c t e r i a l m i n e r a l i z a -
t i o n o f P C P o c c u r s o n l y a e r o b i c a l l y . ( i i ) A s i g n i f -
i c a n t l a g , 1 0 o r m o r e h , o c c u r s b e f o r e P C P
m i n e r a l i z a t i o n c o m m e n c e s . Th e l e n g t h o f t h e l a g
p e r i o d i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e P C P c o n -
c e n t r a t i o n . B e c a u s e o f t h e e x t e n d e d l a g t i m e ,
c o n t i n u o u s c u l t u r e m e t h o d s wo u l d b e m o r e s u i t -
a b l e t o P C P b i o d e g r a d a t i o n t h a n b a t c h c u l t u r e
m e t h o d s . ( i i i ) B a c t e r i a c a p a b l e o f m i n e r a l i z i n g
P C P a r e t h e m s e l v e s s u s c e p t i b l e t o P C P t o x i c i t y .
( i v ) Y i e l d s a r e l o w wh e n b a c t e r i a u t i l i z e P C P a s
t h e s o l e c a r b o n s o u r c e . Th i s m a y n e c e s s i t a t e t h e
s p o r a d i c o r c o n t i n u o u s a d d i t i o n o f P C P - a d a p t e d
( l o g p h a s e i n P C P ) c e l l s t o t h e t r e a t m e n t s y s t e m .
( v ) C h a n g e s i n p H a f f e c t P C P t o x i c i t y . I n a d d i -
t i o n t o t h e p r e s e n t s t u d y wi t h b a c t e r i a , a n e f f e c t
o f p H o n P C P t o x i c i t y h a s b e e n s h o wn f o r f i s h
( 1 1 ) a n d f u n g i ( 1 2 ) . Th e r e f o r e , t h e p H s h o u l d b e
m a i n t a i n e d a t t h e h i g h e s t l e v e l p o s s i b l e c o m -
m e n s u r a t e wi t h a d e q u a t e b a c t e r i a l g r o wt h .
A C KNOW L E D G ME NTS
W e t h a n k E . J . Ki r s c h f o r p r o v i d i n g s t r a i n KC - 3 a n d He l e n
Ha l l e r a n d Ma r t i n A l e x a n d e r f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n .
Th i s wo r k wa s s u p p o r t e d b y Na t i o n a l S c i e n c e Fo u n d a t i o n
g r a n t E NV 7 5 - 1 9 7 9 7 .
L I TE RA TU RE C I TE D
1 . A l e x a n d e r , M. 1 9 6 5 . P e r s i s t e n c e a n d b i o l o g i c a l r e a c t i o n s
o f p e s t i c i d e s i n s o i l . S o i l S c i . S o c . A m . P r o c . 2 9 : 1 - 7 .
2 . A l e x a n d e r , M. 1 9 7 3 . No n b i o d e g r a d a b l e a n d o t h e r r e c a l c i -
t r a n t m o l e c u l e s . B i o t e c h n o l . B i o e n g . 1 5 : 6 1 1 - 6 4 7 .
3 . A n d r e ws , J . F. 1 9 6 8 . A m a t h e m a t i c a l m o d e l f o r t h e c o n -
t i n u o u s c u l t u r e o f m i c r o o r g a n i s m s u t i l i z i n g i n h i b i t o r y s u b -
s t r a t e s . B i o t e c h n o l . B i o e n g . 1 0 : 7 0 7 - 7 2 3 .
4 . A r s e n a u l t , R. D . 1 9 7 6 . P e n t a c h l o r o p h e n o l a n d c o n t a i n e d
c h l o r i n a t e d d i b e n z o d i o x i n s i n t h e e n v i r o n m e n t - a s t u d y
o f e n v i r o n m e n t a l f a t e , s t a b i l i t y a n d s i g n i f i c a n c e wh e n
u s e d i n wo o d p r e s e r v a t i o n . P r o c . A m . W o o d P r e s e r v .
A s s o c . 7 2 : 1 2 2 - 1 4 8 .
5 . B e c k e r , B . , M. P . L e c h e v a l i e r , R. E . G o r d o n , a n d H. A .
L e c h e v a l i e r . 1 9 6 4 . Ra p i d d i f f e r e n t i a t i o n b e t we e n No r c a r -
d i a a n d S t r e p t o m y c e s b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f wh o l e
c e l l h y d r o l y s a t e s . A p p I . Mi c r o b i o l . 1 2 : 4 2 1 - 4 2 3 .
6 . B e v e n u e , A . , a n d H. B e c k m a n . 1 9 6 7 . P e n t a c h l o r o p h e n o l : a
d i s c u s s i o n o f i t s p r o p e r t i e s a n d i t s o c c u r e n c e a s a r e s i d u e
i n h u m a n a n d a n i m a l t i s s u e s . Re s i d u e Re v . 1 9 : 8 3 - 1 3 4 .
7 . B o o n e , C . J . , a n d L . P i n e . 1 9 6 8 . Ra p i d m e t h o d f o r c h a r a c -
t e r i z a t i o n o f a c t i n o m y c e t e s b y c e l l wa l l c o m p o s i t i o n .
A p p l . Mi c r o b i o l . 1 6 : 2 7 9 - 2 8 4 .
8 . B r i o l o n , C . , W . B e c k m a n n , M. He l l wi g , a n d H. J . Kn a c k -
m u s s . 1 9 8 1 . E n r i c h m e n t a n d i s o l a t i o n o f n a p h t h a l e n e s u l -
f o n i c a c i d - u t i l i z i n g p s e u d o m o n a d s . A p p i . E n v i r o n . Mi c r o -
b i o l . 4 2 : 3 9 - 4 3 .
9 . C h u , J . P . , a n d E . J . Ki r s c h . 1 9 7 2 . Me t a b o l i s m o f p e n t a -
c h l o r o p h e n o l b y a n a x e n i c b a c t e r i a l c u l t u r e . A p p I . Mi c r o -
b i o l . 2 3 : 1 0 3 3 - 1 0 3 5 .
1 0 . C o x , G . W . 1 9 7 6 . L a b o r a t o r y m a n u a l o f g e n e r a l e c o l o g y ,
3 r d e d . , p . 2 0 2 - 2 0 4 . W i l l i a m C . B r o wn C o . , P u b l i s h e r s ,
D u b u q u e , I o wa .
1 1 . C r a n d a l l , C . A . , a n d C . J . G o o d n i g h t . 1 9 5 9 . Th e e f f e c t o f
v a r i o u s f a c t o r s o n t h e t o x i c i t y o f s o d i u m p e n t a c h l o r o -
p h e n a t e t o f i s h . L i m n o l . Oc e a n o g r . 4 : 5 3 - 5 6 .
1 2 . C s e r j e s i , A . J . 1 9 7 2 . D e t o x i f i c a t i o n o f c h l o r i n a t e d p h e -
n o l s . I n t . B i o d e t e r i o r . B u l l . 8 : 1 3 5 - 1 3 8 .
1 3 . C u r t i s , R. F. 1 9 7 2 . 2 , 3 , 4 , 6 - Te t r a c h l o r o a n i s o l e a s s o c i a -
t i o n wi t h m u s t y t a i n t i n c h i c k e n s a n d m i c r o b i o l o g i c a l
f o r m a t i o n . Na t u r e ( L o n d o n ) 2 3 5 : 2 2 3 - 2 2 4 .
1 4 . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y . 1 9 7 6 . Tr e a t i n g wo o d
p r e s e r v i n g p l a n t wa s t e wa t e r b y c h e m i c a l a n d b i o l o g i c a l
m e t h o d s . P u b l i c a t i o n n o . E P A - 6 0 0 / 2 - 7 6 - 2 3 7 . Te c h n i c a l
I n f o r m a t i o n S e r v i c e , S p r i n g f i e l d , Va .
1 5 . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y . 1 9 7 1 . B i o l o g i c a l t r e a t -
m e n t o f c o n t r i v e d a n d i n d u s t r i a l wa s t e wa t e r c o n t a i n i n g
p e n t a c h l o r o p h e n o l i c wa s t e s . P u b l i c a t i o n n o . E G K 0 6 / 7 1 .
W a t e r P o l l u t . C o n t r o l Re s . S e r . 1 2 1 3 0 .
1 6 . Fo u n t a i n e , J . E . , P . B . J o s h i p u r a , a n d P . N. Ke l i h e r . 1 9 7 5 .
S o m e o b s e r v a t i o n s r e g a r d i n g p e n t a c h l o r o p h e n o l l e v e l s i n
Ha v e r f o r d t o wn s h i p , P e n n . W a t e r Re s . 1 0 : 1 8 5 - 1 8 8 .
1 7 . G a b y , W . L . , a n d C . Ha r d l e y . 1 9 5 7 . P r a c t i c a l l a b t e s t f o r
t h e i d e n t i f i c a t i o n o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . J . B a c t e r i -
o l . 7 4 : 3 5 6 - 3 5 8 .
1 8 . He i d m a n , J . A . , D . F. Ki n c a n n o n , a n d A . F. G a u d y , J r .
1 9 6 7 . Me t a b o l i c r e s p o n s e o f a c t i v a t e d s l u d g e t o s o d i u m
p e n t a c h l o r o p h e n o l . P u r d u e U n i v . E n g . E x t . S e r . 1 2 9 : 6 6 1 -
6 7 4 .
1 9 . Hi l l , G . A . , a n d C . W . Ro b i n s o n . 1 9 7 5 . S u b s t r a t e i n h i b i -
t i o n k i n e t i c s : p h e n o l d e g r a d a t i o n b y P s e u d o m o n a s p u t i d a .
B i o t e c h n o l . B i o e n g . 1 7 : 1 5 9 9 - 1 6 1 5 .
2 0 . I n g o l s , R. S . , P . E . G a f f n e y , a n d P . S t e v e n s o n . 1 9 6 6 .
B i o l o g i c a l a c t i v i t y o f h a l o p h e n o l s . J . W a t e r P o l l u t . C o n -
t r o l Fe d . 3 8 : 6 2 9 - 6 3 5 .
2 1 . Ku wa t s u k a , S . , a n d M. I g a r a s h i . 1 9 7 5 . D e g r a d a t i o n o f
P C P i n s o i l s . I I . Th e r e l a t i o n s h i p b e t we e n t h e d e g r a d a t i o n
o f P C P a n d t h e p r o p e r t i e s o f s o i l s , a n d t h e i d e n t i f i c a t i o n o f
t h e d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o f P C P . S o i l S c i . P l a n t Nu t r .
( To k y o ) 2 1 : 4 0 5 - 4 1 4 .
2 2 . Mc E we n , F. L . , a n d G . R. S t e p h e n s o n . 1 9 7 9 . Th e u s e a n d
s i g n i f i c a n c e o f p e s t i c i d e s i n t h e e n v i r o n m e n t . J o h n W i l e y
& S o n s , I n c . , Ne w Y o r k .
2 3 . Mu l l i g a n , T. J . , a n d R. D . Fo x . 1 9 7 6 . Tr e a t m e n t o f i n d u s -
t r i a l wa s t e wa t e r s . C h e m . E n g . ( N. Y . ) 8 3 : 4 9 - 6 6 .
2 4 . Mu r r a y , I . G . , a n d A . G . J . P r o c t o r . 1 9 6 5 . P a p e r c h r o m a -
t o g r a p h y a s a n a i d i n t h e i d e n t i f i c a t i o n o f No r c a r d i a
s p e c i e s . J . G e n Mi c r o b i o l . 4 1 : 1 6 3 - 1 6 7 .
2 5 . P a m m e n t , N. B . , a n d R. J . Ha l l . 1 9 7 8 . A b s e n c e o f e x t e r -
n a l c a u s e o f l a g i n S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J . G e n .
Mi c r o b i o l . 1 0 5 : 2 9 7 - 3 0 4 .
2 6 . Th o m p s o n , W . S . 1 9 7 5 . S t a t u s o f p o l l u t i o n c o n t r o l i n t h e
wo o d p r e s e r v i n g i n d u s t r y i n 1 9 7 4 . P r o c . A m . W o o d
P r e s e r v . A s s o c . 7 1 : 9 7 - 1 0 4 .
2 7 . Ty l e r , J . E . , a n d R. K. Fi n n . 1 9 7 4 . G r o wt h r a t e s o f a
A P P L . E NVI RON. MI C ROB I OL .

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P E NTA C HL OROP HE NOL - D E G RA D I NG B A C TE RI U M 1 4 2 7
p s e u d o m o n a d o n 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i c a c i d a n d 2 , 4 -
d i c h l o r o p h e n o l . A p p l . Mi c r o b i o l . 2 8 : 1 8 1 - 1 8 4 .
2 8 . Ve l e - Mu z q u i z , R. , a n d P . Ka s p e r . 1 9 7 3 . E f f e c t o d e l p e n -
t a c h l o r o f e n o l s o b r e l a f l o r a m i c r o b i a n a d e s u e l o s s e l e c -
c i o n a d o s . Mi c r o b i o l . E s p . 2 6 : 2 1 - 2 9 .
2 9 . W a t a n a b e , I . 1 9 7 3 . I s o l a t i o n o f p e n t a c h l o r o p h e n o l d e c o m -
p o s i n g b a c t e r i a f r o m s o i l . S o i l S c i . P l a n t Nu t r . ( To k y o )
1 9 : 1 0 9 - 1 1 6 .
3 0 . W a t a n a b e , I . 1 9 7 5 . Fi e l d e x p e r i m e n t s t o i n v e s t i g a t e l o n g
t e r m e f f e c t s o f r e p e a t e d a p p l i c a t i o n o f P C P o n t h e m i c r o -
b i a l p r o p e r t i e s o f s o i l s ( p a r t 2 ) . D e g r a d a t i o n o f P C P i n s o i l .
Ni p p o n D o j o Hi r y o g a k u Z a s s h i 4 6 : 3 4 3 - 3 4 8 .
VOL . 4 4 , 1 9 8 2

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