APLICACIN DE HONGOS LIGNINOLTICOS AL BLANQUEO DE

PASTAS AL SULFATO. SELECCIN DE HONGOS

LIGNINOLTICOS PARA LA PRODUCCIN DE CALDOS
ENZIMTICOS


Ricardo A. Silva Soto
1
, Aldo E. Gonzlez Becerra
2
y J. Carlos Villar Gutirrez
3
1
Chile. Dpto. de Ingeniera de la Madera. Facultad de CC. Forestales. Universidad de Chile
2
Espaa. Centro de Investigaciones Biolgicas, Velzquez 144, 28006 Madrid. aldo@cib.csic.es
3
Espaa. Laboratorios de Pasta y Papel. INIA. Ctra. de La Corua Km 7, 28040 Madrid. villar@inia.es



Resumen

Este trabajo forma parte de un proyecto ms amplio, cuyo objetivo es mejorar el
blanqueo de la pasta al sulfato mediante la utilizacin de enzimas ligninolticas producidas por
hongos basidiomicetos. La primera etapa, cuyos resultados se presentan aqu, consiste en
evaluar el potencial de una seleccin hongos de pudricin blanca para producir caldos
enzimticos con alta actividad de las enzimas presentes. Para ello se ha partido de las
siguientes cepas de basidiomicetos: Trametes sp. (CECT 20.197), Coriolopsis gallica,
Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Trametes subectypus y Heterobasidion
annosum, con las que se ha realizado un estudio de las cinticas y se ha medido la actividad
de las enzimas ligninolticas Lacasa (LAC), Lignina Peroxidasa (LiP) y Manganeso
Peroxidasa (MnP) a diferentes concentraciones de nitrgeno. Se ha elegido este factor
porque tiene un efecto crtico sobre los tipos y cantidades de las enzimas producidas. Los
resultados no mostraron actividad LiP con ninguna de las cepas bajo las condiciones
ensayadas, mientras que la actividad LAC es especialmente destacada en Heterobasidion
annosum, Trametes sp. y Coriolopsis gallica. Los valores mximos se obtuvieron, en general,
con la concentracin 10 mM de N
2
. Los niveles detectados de actividad MnP resultaron bajos y
se obtuvieron con las cepas Trametes sp., Coriolopsis gallica y Trametes versicolor y a las
menores concentraciones de nitrgeno.


Palabras clave: basidiomicetos, pasta al sulfato, blanqueo, enzimas ligninolticas



Introduccin

En la investigacin relacionada con la produccin de pasta de papel, el proceso de
blanqueo ha sido quizs uno de los ms dinmicos, debido, en parte, a exigencias
medioambientales cada vez ms estrictas y que han limitado progresivamente el vertido de
compuestos organoclorados. Por esta causa, se ha eliminado progresivamente el uso de cloro
gaseoso en el blanqueo, a la vez que se han introducido nuevos agentes como el oxgeno, el
ozono y el agua oxigenada. Entre las propuestas que hoy en da se investigan, encaminadas a
reducir la carga contaminante del blanqueo de pasta al sulfato, cabe citar el pretratamiento de
la pasta con enzimas ligninolticas producidas por hongos basidiomicetos de pudricin blanca.
Los estudios con estos hongos estn dirigidos a seleccionar las cepas ms adecuadas y a
evaluar el efecto de las caractersticas fisiolgicas y de las condiciones de cultivo que afectan
directamente a la expresin de genes que codifican para stas enzimas. Se establecern as
condiciones de cultivo orientadas a la produccin de concentrados enzimticos, donde se
optimizar la o las enzimas de inters para el tratamiento de pastas.


Puesto que no se conoce en profundidad cual es el conjunto de enzimas involucradas
en la deslignificacin por hongos, el estudio que aqu se plantea utiliza una parte de los caldos
producidos en el tiempo por las diferentes cepas (1), para su aplicacin en la deslignificacin
de pasta kraft. Se evitan as etapas intermedias de purificacin de las enzimas que encarecen
su potencial aplicacin industrial y que pueden dejar fuera enzimas cuya accin an no se
conozca, pero que podran ser una parte importante de los mecanismos de deslignificacin (2).

El objetivo fijado en el presente estudio es evaluar el efecto de la concentracin de
nitrgeno (3, 4) sobre la produccin de enzimas con actividades LAC, LiP y MnP y establecer
as los hongos y condiciones de cultivo ptimas que posibiliten, en una etapa posterior, su uso
en el blanqueo de pasta al sulfato.


Metodologa

i) Hongos Cultivados

Los hongos empleados en el estudio corresponden a los basidiomicetos:
- Trametes sp. (CECT 20.197)
- Coriolopsis gallica
- Phanerochaete chrysosporium (BKM 1767-F)
- Trametes versicolor
- Trametes subectypus (IJFM B 1166)
- Heterobasidion annosum

ii) Preparacin de Preinculos y Medios de Cultivo Definitivos

Cepas de los hongos antes mencionados fueron sembradas en placas Petri sobre un
sustrato de Agar-extracto de Malta al 2%. Tras 10 das de incubacin se procedi a generar
preinculos de cada uno de ellos, vaciando en cada caso una placa a un matraz con 100 ml de
agua destilada y esterilizada. Los matraces se mantienen en agitacin a 250 r.p.m. durante 48
horas. Tras este tiempo se toman 15 ml del preinculo, que se vierten en matraces con 135 ml
de medio Kirk (5) en el que se ha modificado la concentracin de la fuente de nitrgeno. Esta
modificacin se ha realizado preparando un medio Kirk base, es decir sin tartrato de amonio,
sobre el que se adiciona despus el tartrato amnico en cinco concentraciones distintas: 0,5
mM, 1,0 mM (Kirk estndar) 5 mM, 10 mM y 15 mM. Finalmente, los matraces de inoculo
definitivos se mantienen en agitacin a 110 r.p.m. durante toda la cintica.

iii) Evaluacin de la Actividad Enzimtica

La presencia y actividad de las enzimas lacasa (6), lignina peroxidasa (7) y
manganeso peroxidasa (8) se evalu por espectrofotometra U.V. de acuerdo a los protocolos
normales existentes para tales efectos. Las mediciones se realizaron diariamente a partir del
da siguiente a las inoculaciones definitivas, y se extendieron como mnimo hasta el da 16,
amplindose el intervalo en aquellos casos en que el grado de actividad se considero an
importante.

La experimentacin se ha desarrollado en dos etapas, en una primera se probaron los
hongos: Trametes sp., Coriolopsis gallica, Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor y
Trametes subectypus y solo tres concentraciones de la fuente de nitrgeno: 0,5, 1 y 10mM.
Posteriormente se introduce el hongo Heterobasidion annosum y se completan las cinticas
con dos nuevas concentraciones de nitrgeno: 5 y 15 mM, para cubrir un intervalo ms amplio
de condiciones.


Resultados

Los resultados de las cinticas realizadas en la primera fase, para los cinco primeros
hongos, muestran solo actividad LAC y MnP. Cabe destacar que, en las condiciones


experimentales empleadas, ninguno de los hongos mostr actividad LiP, La actividad LAC es
especialmente importante en Trametes sp. (Figura 1) y en Coriolopsis gallica y Trametes
subectypus, con mximos de actividad entre 75 y 150 mU/ml, valores que se producen entre
los das 12 y 20. En todos los casos hay una clara dependencia de la actividad con la cantidad
de nitrgeno y todos los mximos se obtuvieron para la concentracin de 10 mM.


Los niveles detectados de MnP fueron siempre muy bajos y con variaciones bruscas de
un da a otro, lo que cuestiona la fiabilidad de estos datos. Tan solo en las cepas Trametes sp.
(Figura 2), Coriolopsis gallica y Trametes versicolor hay algn indicio de este tipo de actividad,
mientras que para Phanerochaete chrysosporium y Trametes subectypus no se dect actividad
alguna. A diferencia de la actividad LAC, en los casos de posible actividad MnP sta siempre
fue detectada a bajas concentraciones de nitrgeno.



Figura 1: LAC en Trametes sp. (I-62)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Da
A
c
t
i
v
i
d
a
d


[
m
U
/
m
l
]
Kirk 0,5xN2 Kirk 1xN2 Kirk 10xN2
Figura 2: MnP en Trametes sp. (I-62)
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Da
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
Kirk 0,5xN2 Kirk 1xN2 Kirk 10xN2


Phanerochaete chrysosporium no mostr presencia de ninguna de las tres enzimas
evaluadas, al menos en las condiciones empleadas en este estudio. Estos resultados, en el
caso de lacasa, se ajustan a lo recogido en la bibliografa, que indica que la produccin de esta
enzima en P. chrysosporium slo se detecta en condiciones muy particulares y con la
presencia de algn inductor (9). Respecto a la no deteccin de MnP, es muy probable que la
concentracin de H
2
O
2
empleada para su cuantificacin sea demasiado baja, ya que como es
sabido, la actividad de esta enzima, como tambin de LiP, es dependiente de la concentracin
de perxido.

A la vista de los resultados de esta primera etapa se plantea la posibilidad de seguir
aumentando la dosis de nitrgeno en el medio Kirk, para comprobar si provoca un nuevo
aumento en la cantidad de LAC producida con los hongos Trametes sp., Coriolopsis gallica y
Trametes subectypus. Asimismo, se completa la cintica con concentraciones de nitrgeno
intermedias para tener una visin ms completa de la influencia de este parmetro. Se
introduce tambin un sexto hongo: Heterobasidion annosum, el que en estudios previos ha
dado resultados prometedores.

Nuevamente se observa la presencia de LAC y, en menor medida, de MnP en las
mismas cepas que mostraron esta actividad en la primera fase: Trametes sp., Coriolopsis
gallica, Trametes versicolor y Trametes subectypus. Se observa tambin idntica dependencia
de la actividad LAC con la concentracin de nitrgeno del medio Kirk, aunque para ninguna de
estas cepas, salvo quiz Trametes versicolor, el aumento de la concentracin de nitrgeno
hasta 15 mM ha supuesto un aumento de la actividad LAC respecto a la concentracin 10 mM
ensayada en la serie precedente de experimentos.

Figura 3. LAC en Trametes sp. I-62
0
50
100
150
200
250
300
350
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Dia
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
0,5xN2 1xN2 5xN2 10xN2 15xN2
Figura 4. MnP en Tramentes sp. I-62
0
10
20
30
40
50
60
70
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Dia
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
0,5XN2 1xN2 5xN2 10xN2 15xN2


La mayor actividad LAC la produce en esta etapa Heterobasidiom annosum, con un
valor un 30% superior a la que tiene Trametes sp., que es el que le sigue en actividad; y
nuevamente se produce el valor mximo para la concentracin de nitrgeno 10mM. La
actividad MnP se mantiene en niveles similares a los encontrados en la primera serie de
experimentos y no ha sido detectada en la cepa Heterobasidiom annosum. Como en la serie
anterior, en ningn caso se ha detectado actividad LiP.

Por ltimo, se ha probado si los compuestos HBT, xilidina y cido tnico tienen algn
efecto como inductores de la actividad LAC (10,11) en las dos cepas con mayor actividad en
esta enzima: Heterobasidiom annosum y Trametes sp. Slo se dispone de los resultados con la
ltima cepa, los que han mostrado que todos estos compuestos inducen la produccin de LAC,
con incrementos en la actividad de 165% (HBT), 254% (xilidina) y 214% (cido tnico) respecto
al valor mximo obtenido sin inductores. De todos estos compuestos, el cido tnico es el nico
que no es txico y presenta resultados casi equiparables a la xilidina. Por estas razones, en la
etapa de produccin de enzimas que sigue a este estudio se ha elegido la cepa Trametes sp., y
las siguientes condciones de cultivo: concentracin de nitrgeno 10mM en el medio de Kirk y
adicin de cido tnico como inductor a una concentracin de 400 mM.




Figura 5. LAC en Coriolopsis gallica
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Da
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
0,5xN2 1xN2 5xN2 10xN2 15xN2
Figura 6. LAC en Trametes versicolor
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Da
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
0,5xN2 1xN2 5xN2 10xN2 15xN2



Como consecuencias de todo lo expuesto anteriormente se puede concluir que:

A partir de las cepas estudiadas se pueden producir caldos enzimticos con actividad LAC
en cantidad suficiente para su uso en bioblanqueo.
La actividad LAC es especialmente alta para las cepas Heterobasidiom annosum y
Trametes sp., y cultivadas en un medio Kirk alcanza el mximo de actividad a una
concentracin de nitrgeno de 10mM.
No se ha detectado actividad LiP y solo muy baja actividad de MnP.
La actividad LAC puede potenciarse mediante el empleo de inductores. Los ensayados
HBT, xilidina y cido tnico consiguen aumentar la actividad LAC en Trametes sp. hasta en
un 250%. Se recomienda el empleo de cido tnico, un compuesto no txico que consigue
mejoras en la actividad del 214% respecto al valor mximo obtenido sin inductor.


Figura 7. LAC en Trametes subectypus
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Dia
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
0,5xN2 1xN2 5xN2 10xN2 15xN2
Figura 8. LAC en Heterobasidion annosum
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Dia
A
c
t
i
v
i
d
a
d

[
m
U
/
m
l
]
0,5xN2 1xN2 5xN2 10xN2 15xN2


Referencias

1. Broda, P, PRJ Birch, PR Brooks, and PFG Sims (1996) Lignocellulose degradation by
Phanerochaete chrysosporium: Gene families and gene expression for a complex process.
Molecular Microbiology 19: 923-932.

2. Leonowicz A, Matuszewska A, Luterek J, Ziegenhagen D, Wojtas-Wasilewska M, Nam-
Seok Ch, and Hofrichter M. (1999) Biodegradation of lignin by White Rot Fungi. Fungal
Genetics and Biology 27: 175-185.

3. Cullen D (1997) Recent advances on the molecular genetics of ligninolytic fungi. J
Biotechnol 53: 273-289

4. Reddy CA and DSouza TM (1994) Physiology and Molecular Biology of the lignin
peroxidases of Phanerochaete chrysosporium FEMS Microbiol. Rev. 13: 137-152

5. Kirk, T. K., S. Croan, M. Tien, K. E. Murtagh, and R. L. Farrell. 1986. Production of multiple
ligninases by Phanerochaete chrysosporium, effect of the selected growth conditions and
the use of a mutant strain. Enzyme Microb. Technol. 8:27-32.

6. Wolfenden, B., S., and R. L. Willson. 1982. Radical-cations as reference chromogens in
kinetic studies of one-electron transfer reactions: pulse radiolysis studies of 2,2-azinobis-
(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate). J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1982:805-812.

7. Tien, M., and T. K. Kirk. 1983. Lignin degrading enzyme from Phanerochaete
chrysosporium: purification, characterization and catalytic properties of a unique H2O2-
requiring oxygenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:2280-2284.

8. Paszczynski, A., R. L. Crawford, and V.-B Huynh. 1988. Manganese peroxidase of
Phanerochaete chrysosporium: purification. Methods Enzymol. 161:264-270.

9. Srinivasan C, DSouza TM, Boominathan K, and Reddy CA (1995) Demonstration of
Laccase in the White Rot Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium BKM-F1767. Appl.
Environ Microbiol 61: 4274-4277.

10. Collins, P. J., and A. D. W. Dobson. 1997. Regulation of laccase gene transcription in
Trametes versicolor. Appl. Environ.Microbiol.63:3444-3450

11. Carbajo, J.M., Junca, H., Terrn, M.C., Yage, S., Zapico, E. and Gonzlez, A.E. (2000)
Tannic Acid as Inductor of a Laccase Gene in the White-Rot Fungus Coriolopsis gallica (En
preparacin).