UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SADE PBLICA

TCNICAS CELULARES E MOLECULARES APLICADAS S CINCIAS
BIOLGICAS E DA SADE



JONATHAN MILHOMENS DOS SANTOS LIMA




PREPARO HISTOLGICO E IMUNO- HISTOLGICO DE LMINAS PARA
EXAME MICROSCPICO

TCNICAS CITOLGICAS DE PREPARO DE LMINAS PARA EXAME
MICROSCPICO MTODO DE PAPANICOLAOU






GOINIA
2014
JONATHAN MILHOMENS DOS SANTOS LIMA




PREPARO HISTOLGICO E IMUNO- HISTOLGICO DE LMINAS PARA
EXAME MICROSCPICO

TCNICAS CITOLGICAS DE PREPARO DE LMINAS PARA EXAME
MICROSCPICO MTODO DE PAPANICOLAOU




Trabalho apresentado a Profa. Eneida Vencio, da
Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal de Gois, como requisito parcial para
obteno de nota na disciplina de Ncleo Livre
Tcnicas Celulares e Moleculares Aplicadas nas
Cincias Biolgicas e da Sade.






GOINIA
2014
PREPARO HISTOLGICO E
IMUNO- HISTOLGICO DE
LMINAS PARA EXAME
MICROSCPICO

As tcnicas histolgicas e imuno-
histolgicas visam preparao dos
tecidos destinados ao exame microscpico,
para fins de anlise estrutural e
identificao de tecidos, diagnstico de
doenas e at prognsticos de doenas
letais como o cncer. Este preparo se d
pela confeco de lminas delgadas do
tecido a ser estudado. Os procedimentos
utilizados para se obter as amostras de
tecidos preparadas histologicamente so: a
coleta do material, fixao, processamento,
microtomia e colorao. Cada uma dessas
etapas ser resumidamente descrita a
seguir. A descrio de um protocolo
padro de imuno-histoqumica, tambm
ser apresentada.

1 Coleta do material

Esta etapa consiste na remoo de
pequenas amostras de um organismo, ou
parte dele. O organismo no precisa estar
necessariamente morto (coleta durante a
necropsia), pois a coleta pode ser realizada
durante um procedimento cirrgico ou em
uma bipsia. Aps a coleta, o material
dever ser registrado em um livro
protocolo prprio da instituio em que o a
coleta foi realizada, de acordo com a
origem da amostra e os fins do
procedimento.

Figura 1. Coleta da amostra





2 Fixao


A fixao do material garante a
estabilidade bioqumica do tecido,
interrompendo os processos post mortem
(autlise) das clulas, que acabam por
degradar as estruturas intra e
extracelulares, estas, que devem estar
ntegras para serem analisadas.
Existem dois tipos de fixao
histolgica: qumica e fsica. A fixao
qumica mais utilizada (apesar de que um
tipo de fixao no exclui a necessidade do
outro), e geralmente dividida em duas
categorias: fixadores desnaturantes, que
precipitam as protenas do tecido, e
fixadores aditivos, que se ligam as
protenas, precipitando-as. A fixao
qumica consiste na imerso do tecido
(com no mximo 3 mm de espessura) em
soluo fixadora. Um dos agentes
fixadores mais comuns em histotecnologia
o formol, em funo do fcil acesso a
esse produto nos laboratrios, porm, os
resultados da fixao no so to
satisfatrios. Uma soluo tamponada de
formaldedo a 4% mostrou-se um eficiente
agente fixador e amplamente utilizada
para microscopia de luz.
A eficincia do agente fixador
depender de diversos fatores, como
temperatura, tempo de fixao, tipo de
agente fixador, pH do fixador,
concentrao do fixador e a origem do
tecido. Alguns tecidos, alm de serem
fixados, devem passar por processos de
descalcificao para que possam ser
seccionados, em funo da deposio
natural de minerais como clcio e fosfato
que deixam o tecido rgido e inflexvel,
como o tecido sseo.

3 Processamento

O processamento ou incluso do
material histolgico consiste na infiltrao
de substncias que garantam uma
consistncia rgida para o tecido, de modo
que este possa ser seccionado em camadas
delgadas pelo micrtomo. O
processamento da amostra se d em trs
etapas: desidratao, clarificao e
embebio.
A desidratao a remoo de toda
a gua do tecido, pois as substncias
utilizadas para incluso so, geralmente,
hidrofbicas. O agente desidratante mais
utilizado o lcool etlico por ser eficiente
e barato. Para uma desidratao adequada,
recomenda-se que o volume de agente
desidratante seja de no mnimo vinte vezes
o volume da amostra histolgica,
recomenda-se tambm agitao do
recipiente para que a gua se misture ao
lcool facilmente e ainda, que o lcool seja
renovado periodicamente para que a gua
seja eliminada mais rapidamente, sendo
que em cada renovao, o lcool esteja em
uma concentrao mais alta (70%, 80%,
95% e lcool absoluto, 1 hora de contato
para cada concentrao).
A clarificao ou diafanizao
remove o lcool dos tecidos, deixando-o
preparado para a etapa de incluso. Como
o material de incluso tambm no
homogeneamente miscvel em lcool, um
agente intermedirio deve ser utilizado
nesta etapa. O xilol um solvente orgnico
com volatilidade relativamente alta e
parcialmente miscvel no lcool,
substituindo completamente o lcool dos
tecidos de acordo com o tempo de
clarificao. Nesta etapa, o tecido adquire
transparncia de acordo com a infiltrao
do xilol, por isso chamada de etapa de
clarificao. Recomenda-se que haja ao
menos duas trocas da substncia
clarificadora nesta etapa (1 hora de contato
para cada renovao), alm de tomar o
cuidado de no deixar a amostra por muito
tempo em xilol, uma vez que este solvente
resseca o tecido ao ponto de danific-lo.
A embebio ou incluso o
processo de infiltrao do agente de
incluso (parafina ou resina plstica). A
parafina a substncia mais utilizada pela
eficincia e pelo custo. A amostra
histolgica (agora preenchida por xilol)
colocada em uma estufa de 58 a 60 C, ali,
o xilol que voltil evapora e d lugar a
parafina, que preenche o tecido.
Recomenda-se que se faam duas
passagens em parafina (1 hora para a
primeira passagem e 2 horas para a
segunda), mas tomando-se o cuidado de
no deixar o material por muito tempo na
estufa, pois o calor em tempo demasiado
trar danos irreversveis amostra. Aps a
embebio, os fragmentos sero colocados
em cassetes com parafina lquida,
formando blocos rgidos que podero ser
seccionados pelo micrtomo.

4 Microtomia

Para que o tecido seja analisado no
microscpio de luz, a amostra precisa ter
uma espessura, de rotina em laboratrios
de histotecnologia, de 4 a 6 m, esta
espessura permite que a luz da lmpada do
microscpico atravesse a lmina e o
tecido, gerando uma imagem da estrutura
do tecido. O aparelho que secciona as
amostras de forma to precisa o
micrtomo. Nesta etapa, os blocos de
parafina so seccionados e uma fita
segmentada com o tecido sai como
resultado. Esta fita dever ser coletada e os
cortes sero distendidos em banho-maria a
40 C, s ento ocorrer coleta ou
pescagem dos cortes, utilizando-se
lminas limpas e secas.

Figura 2. Micrtomo










Figura 3. Pescagem dos cortes







5 Colorao

Uma vez que aps o processamento
da amostra o tecido se torna transparente, a
colorao da pea se torna fundamental
para a anlise microscpica. A etapa de
colorao garante que determinadas
estruturas sejam diferenciadas no tecido e
a anlise microscpica seja a mais precisa
possvel. Os corantes so compostos
definidos na estrutura do anel benzeno,
que quando ligados um cromforo,
ganham cor. Assim, um composto
aromtico (corante) ligado a um cromforo
chama-se cromgeno. O cromgeno
precisa estar ligado um auxocromo para
que possa se ligar a elementos de tecidos.
O auxocromo determina o carter cido ou
bsico dos corantes, permitindo uma
seletividade de ligao no tecido.
Alm dos corantes, a tcnica de
colorao histoqumica utiliza ainda
substncias e tcnicas que auxiliam na
ao do corante. So as substncias
mordentes e a tcnica de diferenciao. Os
mordentes so elementos que se ligam
covalentemente ao corante e intermedeiam
a ligao do corante ao tecido. A tcnica
de diferenciao refere-se a remoo do
excesso de corante no tecido para uma
melhor visualizao de determinada
estrutura.
Aps a microtomia, a amostra deve
passar por processos que tornem o tecido
vivel para a colorao. Esses processos
sero resumidamente descritos a seguir.
a. Desparafinizao: a parafina dos
cortes deve ser retirada com o
auxlio do xilol.
b. Hidratao: um banho seriado com
concentraes decrescentes de lcool
(at gua destilada, caso o corantes
seja hidroflico).
c. Colorao: nesta etapa a amostra
imersa no corante escolhido. A
colorao HE (hematoxilina e
eosina) muitssimo utilizada em
procedimentos de colorao. A
hematoxilina um corante bsico e,
portanto, cora substncias cidas
como o DNA, deixando o ncleo
celular de cor arroxeada. A eosina
um corante cido, corando
substncias de carter bsico como
protenas, de um modo geral,
deixando as estruturas com um
aspecto rosa.
d. Desidratao: novamente, o banho
seriado de solues alcolicas at o
lcool absoluto. Esta etapa
necessria, pois na ltima etapa,
utiliza-se uma substncia seladora,
que no miscvel em gua.
e. Clarificao: mais uma vez o xilol
utilizado pela sua caracterstica
intermediria como solvente (entre
lcool e substncia seladora).
f. Montagem da lmina (selagem):
cobre-se o tecido com uma lamnula
de vidro selando-a ao tecido com
uma substncia vedante.

Figura 4. Tecido heptico.
Colorao HE.








Existem diversas coloraes
especiais para identificao de estruturas
teciduais. O Tricrmio de Masson uma
tcnica que evidencia fibras musculares e
colgeno, a colorao de Weigert
(resorcina e fucsina) para fibras do sistema
elstico, tcnicas que utilizam sais pesados
(como sais de prata) como a colorao de
Grocott, especfica para fungos, entre
outras.
Todo o procedimento, desde a
fixao at a observao da lmina em
microscpio, pode levar de 10 horas at
trs dias, dependendo do tamanho da
amostra tecidual, do tipo de fixador e do
meio de incluso utilizados.

6 Imuno-histoqumica

A imuno-histoqumica um
mtodo de anlise de tecidos por
microscopia que permite a identificao de
caractersticas patolgicas moleculares de
doenas. Tem muitas aplicaes, uma das
mais importantes no diagnstico e
prognstico de cncer, uma vez que a
imuno-histoqumica lana mo de
marcadores moleculares especficos para
cada tipo de tumor e seus estgios,
permitindo uma inferncia sobre o melhor
tratamento e a possvel evoluo da
doena.
Neste caso, aps a microtomia, a
amostra de tecido passar por processos
diferentes da histoqumica padro, pois em
alguns casos, em que se faz necessria a
identificao de elementos especficos,
como protenas, as tcnicas
histotecnolgicas fazem uso da capacidade
de molculas de se ligarem
especificamente a estes elementos
teciduais (anticorpos), assim, o protocolo
de montagem da lmina precedido por
mtodos que renem particularidades da
imunologia, da qumica e da histologia.
A tcnica imuno-histoqumica
utiliza o conceito imunolgico de
antgeno-anticorpo para detectar uma
determinada protena. H dois processos, o
direto (menos sensvel) e o indireto (mais
sensvel), para diagnstico, a tcnica
indireta bem mais interessante. Em uma
reao imuno-histoqumica indireta, um
anticorpo (anticorpo primrio) se ligar
protena de interesse (antgeno), e logo
aps, um anti-anticorpo (anticorpo
secundrio) associado a substncias
essenciais para a colorao, se ligar ao
anticorpo primrio, assim, quando o
substrato da reao for incubado, o
processo de colorao indicar a presena
ou ausncia da protena de interesse.
Durante o processo de fixao da
amostra, poder ocorrer formao de
pontes intermoleculares entre as estruturas
das clulas do tecido. Isso pode acabar
mascarando ou impedindo o antgeno de
interesse de se ligar com anticorpo, assim,
uma das etapas principais da tcnica a
recuperao gnica. Esta etapa se utilizar
de mtodos qumicos ou fsicos para
desfazer as pontes intermoleculares
eventualmente formadas.
Outra precauo a ser tomada vem
do mtodo de colorao na imuno-
histoqumica. Diferentemente da
histoqumica padro, esta tcnica utiliza
anticorpos marcados com alguma
substncia que possa exibir cor, se ativada.
Geralmente, o anticorpo se associa a
enzimas que podero ser ativadas em uma
etapa posterior, com um substrato que
sirva como cromgeno. Rotineiramente
utiliza-se o sistema peroxidase-DAB com
anticorpos associados ao sistema biotina-
estreptavidina-peroxidase, o substrato da
reao o perxido de hidrognio, ao final
da reao, o DAB reduzido formando um
precipitado castanho ou marrom. Neste
caso, um cuidado muito importante deve
ser tomado, antes da etapa de incubao
dos anticorpos. O tecido da amostra
precisa passar por um banho de perxido
de hidrognio para que a peroxidase
formada pelo processo de autlise celular
reaja antes da incubao, caso contrrio,
todo o tecido ficar marcado na cor
castanha (falso positivo), perdendo-se todo
o trabalho feito at ali.
necessrio tambm que haja um
controle de qualidade das reaes. Assim,
em um mesmo teste, deve haver um
controle positivo e um controle negativo.
No controle positivo h um material
contendo o antgeno de interesse, tendo
uma reao positiva como contraste para
uma possvel lmina negativa. No controle
negativo, o anticorpo primrio no estar
presente, logo as etapas subsequentes no
faro efeito algum e esse controle servir
como contraste para um possvel teste
positivo. Esse cuidado vai prevenir erros
de diagnstico, caso alguma etapa
apresente reconhecimento inespecfico dos
anticorpos.
Um protocolo de imuno-
histoqumica possui diversas etapas.
Lavagens, incubao overnight, banhos,
tamponamentos, etc. Tudo para garantir
que a prxima etapa do teste tenha um
desempenho adequado e preciso. Todo
cuidado extremamente necessrio, pois
esse mtodo bastante oneroso e
demorado.

Figura 5. Imuno-histoqumica
indireta











TCNICAS CITOLGICAS DE
PREPARO DE LMINAS PARA
EXAME MICROSCPICO
MTODO DE PAPANICOLAOU

As tcnicas citolgicas so o
conjunto de metodologias a que se
preciso submeter um determinado material
biolgico, para que este possa ser
analisado em microscopia. Dentre as
diversas tcnicas citolgicas, podem-se
destacar os preparos de lminas
citopatolgicas. Em citopatologia, as
clulas so observadas individualizadas ou
descamadas a partir de diferentes rgos
de diversas partes do organismo. O exame
colpocitopatolgico uma das tcnicas
citolgicas mais conhecidas, ele mtodo
conhecido como Papanicolaou, que
utilizado para deteco de tumores de colo
de tero. O exame Papanicolaou consiste
na coleta do material do colo uterino com
uma esptula especial. As clulas raspadas
do colo uterino so transferidas para uma
lmina, fixadas e examinadas por um
profissional de sade. As clulas so
analisadas pelo grau de displasia que
apresentam (quando houver). O cientista
que criou a tcnica, Dr. George
Papanicolaou, criou um sistema de
classificao citolgica e um mtodo de
colorao em 1942, que so utilizados at
hoje.
O mtodo de colorao possui as
seguintes etapas:
a. Hidratao: banhos alcolicos
seriados em concentraes
decrescentes, at gua.
b. Colorao nuclear: as clulas
recebem um corante aquoso
para os ncleos (hematoxilina
de Harris).
c. Desidratao: para colorao
citoplasmtica, as clulas
recebero corantes alcolicos,
necessitando de um banho
seriado de concentraes
crescentes de lcool.
d. Colorao citoplasmtica: uso
dos corantes G e EA-65, que
coram o citoplasma.
e. Desidratao, clarificao
(xilol) e selagem: mais um
banho seriado de concentraes
crescente de lcool para retirar
a gua, clarificao das clulas
com xilol para substituir o
lcool e selagem.

Quanto classificao do exame, o
Dr. Papanicolaou dividiu os critrios em
seis classes:
Classe 0: material insuficiente para
anlise.
Classe I ASC: clulas normais e tpicas.
Classe II ASC: clulas normais, com grau
de displasia discreto.
Classe III SIL: clulas com moderado
grau de displasia recomendao de
biopsia.
Classe IV Atipismo celular: alto grau de
displasia, tumor maligno recomendao
de biopsia.
Classe V Cncer: leso maligna,
carcinoma biopsia mandatria.


Figura 6. Exame Papanicolaou










Referncias

CAPUTO, L.; et al. Conceitos e
mtodos para a formao de profissionais
em laboratrios de sade. vol 2. 290 p. Rio
de Janeiro, 2010.

CAPUTO, L.; et al. Conceitos e
mtodos para a formao de profissionais
em laboratrios de sade. vol 4. 285 p. Rio
de Janeiro, 2010.

TIMM, L. Tcnicas rotineiras de
preparao e anlise de lminas
histolgicas. Caderno La Salle XI, vol 2. 1
ed. p. 231-239. Canoas, 2005.

JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J.
Histologia bsica. 8 ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1995.