Transformacion de tabaco

1. Mantener el tabaco micropropagado en MS sin hormonas.

2. Al momento de transformar, las hojas se proceden a cortar como discos sin tomar las
nervaduras centrales.
3. Previamente se ha tenido preparada una placa con Agrobacterium tumefaciens; o bien se
rastrilla toda la placa, o se hace un preinoculo liquido y se siembran 100ul sobre una placa
de medio para crecer un csped de bacterias. El Agrobacterium tumefaciens en placa debe
tener 1 o 2 dias de vejez. No mas porque no debe crecer muy pastosa.
4. Los discos de hojas de tabaco se colocan sobre esta placa de Agrobacterium tumefaciens
con el envs hacia arriba (la parte superior de la hoja) en contacto con la bacteria. Luego
se pinchan con una aguja hipodrmica estril reiteradas veces.
5. Posteriormente se traspasan las hojas infectadas inmediatamente al medio 3 durante 2
dias, a baja iluminacin.
6. Pasados los 2 dias, las hojas cortadas se lavan en una solucin de MS liquido con 500
mg/L de cefotaxima.
7. Luego del lavado se pasan al medio 3KC. Este medio induce callos y brotes. Primero se
producen los callos a las 3 semanas y 2 semanas mas tarde salen los brotes.
8. Una vez que aparecen los brotes estos se pasan a un medio de enraizamiento: MS,
100mg/L kanamicina, 250mg/L cefotaxima.
9. De cada callo sacar solo 1 brote o brotes muy separados.