AMILASE

Metode Uji Enzim Amilase

B. Deteksi enzim amilase (Laloknam et. al, 2009)
1. 50 l filtrat sampel ditambahkan pada lubang-lubang dalam starch agar (2.0 % agar dan 1%
pati, pH 7.0).
2. Diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit.
3. Larutan iodin ditambahkan pada agar sehingga terlihat daerah terang yang terbentuk.
4. Diameter daerah terang di sekitar lubang-lubang pada agar diukur.
5. Dapat pula diukur aktivitas amilase berdasarkan selisih antara diameter daerah terang
disekitar lubang dengan diameter lubang pada agar.










C. Uji aktivitas enzim amilase
AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007)
1. 1 ml filtrat enzim hasil ekstraksi ditambahkan dengan 1 ml larutan substrat/ pati (soluble
starch).
2. Diinkubasi selama 3 menit pada suhu optimum 30
0
C.
3. Ditambah dengan 2 ml DNS (3,5 dinitro salicilic acid) kemudian dipanaskan sampai
mendidih, didinginkan cepat pada air mengalir dan ditambah 20 ml aquades.
4. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.


Aktivitas enzim alfa-amilase = C x 1/T x 1 unit/1 mikromol

dimana:
C = konsentrasi maltosa per ml ekstrak enzim (mikromol)
T = waktu inkubasi (menit)
1 unit enzim -amilase = besarnya aktivitas enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1
mikromol maltosa per menit per ml enzim

Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993)
1. Ke dalam tabung-tabung percobaan (sampel dan blanko), dimasukkan 2 ml larutan substrat
pati dalam buffer asetat pH 6,0 ditempatkan pada penangas air dengan temperatur 37
0
C
selama 5 menit.
2. Campuran ditambah 0,05 ml larutan enzim memakai pipet, dikocok beberapa lama, lalu
diinkubasi pada temperatur 37
0
C selama 15 menit.
3. Setelah campuran diinkubasi, dengan segera ditambahkan 20 ml aquades dan 1,0 ml larutan
I
2
0,008 N.
4. Campuran dikocok beberapa lama hingga tercampur sempurna.
5. Dibiarkan 10 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm.
* Larutan substrat yang digunakan mengandung 0,2 gr Amilosa, 15mM NaCl dan 20 mM
buffer asetat pH 6,0.
* Perhitungan memakai satuan Street-Close/ 100 ml.
* Satu satuan S.C. = jumlah enzim yang dapat menghidrolisis 20 mikromol amilosa dalam
waktu 15 menit pH 6,0 dengan temperatur 37
0
C.






Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009)
1. Gelatinisasi larutan pati yang digunakan untuk substrat.
- Sebanyak 40 ml larutan pati 1% (Soluble starch) ditambahkan dalam 50 ml air medidih di
gelas beaker sambil diaduk.
- Larutan kemudian didinginkan hingga mencapai suhu ruang.
- Ditambah dengan aquades hingga volume tepat 100 ml.
2. Pembuatan larutan baku/ standar (stock solution)
- Larutan gelatinisasi pati diambil sebanyak 1 ml.
- Ditambah aquades hingga volume tepat 100 ml kemudian dihomogenkan.
3. Pembuatan Kurva Standar dan Uji Amilase
- Larutan baku diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan dalam 3 tabung reaksi.
- Ditambah 3 ml buffer fosfat 0,1 M pH 5,6.
- Ditambah 1,5 ml ekstrak amilase dan campuran diinkubasi pada suhu 37C.
- Setelah diinkubasi, campuran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan pada tabung reaksi
yang berisi 3 ml HCl 10% untuk menghentikan reaksi.
- Ditambah 3 ml indikator (larutan iodin kalium iodida).
- Absorbansi diukur pada panjang gelombang 620 nm.
- Prosedur diulang (dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit.
- Jumlah pati yang terhidrolisis dalam satu satuan waktu diukur dengan kurva standar pati
(substrat) antara konsentrasi dengan absorbansi.

C. Analisa Prosedur
Aktivitas alfa-amilase secara umum ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati,
biasanya dari penurunan kadar pati yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan
menggunakan substrat jenuh. Hilangnya substrat dapat diukur dengan pengurangan derajat
pewarnaan iodium terhadap substrat. Pati yang mengandung amilosa bereaksi dengan iodium
menghasilkan warna biru, sedangkan dekstrin bereaksi dengan iodium berwana coklat.
Keaktifan alfa-amilase juga dapat dinyatakan dengan pengukuran viskositas dan jumlah
produksi yang terbentuk. Laju hidrolisis akan meningkat bila polimerisasi menurun dan laju
hidrolisis akan lebih cepat pada rantai lurus (Winarno, 1986).
Metode untuk analisa enzim amilase di atas memiliki prinsip yang sama, yaitu
mengukur hasil hidrolisis pati (substrat) atau sisa substrat setelah kontak dengan enzim
amilase dalam waktu tertentu.
1. Analisa
2. Analisa Prosedur Deteksi Enzim Amilase:
Prinsip utama dalam mendeteksi keberadaan enzim amilase adalah hidrolisis pati (starch)
yang ditandai dengan daerah terang pada agar di sekitar lubang yang telah ditetesi sampel.
Starch agar yang dibuat mengandung pati yang merupakan karbohidrat kompleks. Enzim
amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula
dan pati. Amilase dapat mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida
yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa. Enzim amilase
pada sampel akan menghidrolisis pati pada agar. Hal ini dapat diketahui dengan terlihatnya
daerah terang pada starch agar. Penambahan larutan iodin pada agar bertujuan untuk
memperjelas daerah terang yang terbentuk. Aktivitas enzim amilase masing-masing sampel
juga dapat ditentukan dengan perbandingan diameter daerah terang yang terbentuk pada agar.
3. Analisa Prosedur Uji Aktivitas Enzim Amilase:
AOAC (1995) dalam Suarni dan Rauf (2007)
Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada
filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati
menjadi monosakarida dalam waktu 3 menit dan suhu optimum 30
o
C. Reaksi kemudian
dihentikan dengan penambahan DNS (3,5 dinitro salicilic acid). Selain itu reagen DNS (3,5
dinitro salicilic acid) akan bereaksi dengan gula pereduksi hasil hidrolisis dan mengakibatkan
terbentuknya warna tertentu. Sampel kemudian didihkan agar reagen DNS dapat bekerja
dengan cepat, setelah itu didinginkan dengan air mengalir. Penambahan 20 ml akuades untuk
pengenceran sampel. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 550 nm. Metode ini
terlebih dahulu membuat kurva standar glukosa antara konsentrasi glukosa dalam berbagai
macam konsentrasi dan absorbansi. Kemudian konsentrasi sampel yang didapat melalui
kurva standar dimasukkan ke dalam rumus untuk mendapatkan aktivitas enzim amilase.
Metode Bernfeld (1955) dalam Soeka dan Eddy (1993)
Pengukuran aktivitas enzim dimulai dengan menambahkan substrat yaitu pati (starch) pada
filtrat enzim. Enzim amilase yang terdapat pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati
menjadi monosakarida dalam waktu 5 menit dan suhu optimum 37
o
C. Penambahan akuades
sebanyak 20 ml bertujuan untuk mengencerkan sampel. Setelah itu, ditambahkan larutan I
2
.
Larutan I
2
akan bereaksi dengan sisa pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim amilase dan
menghasilkan warna biru. Semakin banyak pati yang tersisa berarti aktivitas enzim amilase
semakin kecil, dengan ditandai dengan degradasi warna biru. Absorbansi sampel kemudian
diukur pada panjang gelombang 620 nm. Aktivitas enzim diukur dengan memasukkan nilai
absorbansi ke dalam rumus, dengan satuan aktivitas enzim adalah S.C. (Street-Close).
Metode Caraway-Somogyi iodin/kalium iodida (IKI) (1959) dalam Afiukwa, et. al (2009)
Tahap pertama metode ini adalah gelatinisasi atau likuifikasi pati sehingga menghasilkan
larutan starch yang baku. Larutan ini kemudian digunakan sebagai substrat dalam
mereaksikan dengan sampel yang mengandung enzim amilase. Enzim amilase yang terdapat
pada sampel akan bereaksi dan menghidrolisis pati menjadi monosakarida dalam waktu
tertentu dan suhu optimum 37
o
C. Reaksi ini kemudian dhentikan dengan menambahkan
larutan HCl 10%. Setelah itu ditambahkan indikator iodin-kalium iodida. Menurut Teodoro
dan Meire (2000), larutan indikator dibuat dengan 0,05% iodin dalam 0. 5% KI. Sisa pati
yang tidak terhidrolisis akan bereaksi dengan indikator sehingga menghasilkan warna
tertentu. Absorbansi sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 620 nm. Proses
tersebut merupakan pengukuran pada jam ke-0. Langkah pengujian aktivitas enzim diulang
(dari proses penambahan HCl 10%) setiap 15 menit selama 60 menit. Jumlah pati yang
terhidrolisis dalam satu satuan waktu kemudian diukur dengan kurva standar pati (substrat)
antara konsentrasi dengan absorbansi.

Uji Aktivitas Protease
Uji aktivitas protease berdasarkan
metode Kunitz. 0,5 mL substrat kasein
0,5% dan 1 mL aqudes dimasukkan ke
dalam tabung sampel dan kontrol,
kemudian diinkubasi selama 5 menit pada
suhu 35
o
C. 4,3 mL TCA
3,5%
ditambahkan pada tabung kontrol, dan
0,1 mL larutan enzim ditambahkan pada
tabung sampel. Inkubasi dilanjutkan
selama 30 menit. Lalu reaksi enzimatik
pada tabung sampel dihentikan dengan
menambah 4,3 mL TCA 3,5%.
Aktivitas
enzim ditetapkan dengan mengukur
absorbansi produk hasil reaksi pada

275 nm.