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Biologia Molecular da
03 04 2009
Embriognese
Anlise gentica da embriognese
No desenvolvimento embrionrio a formao de padres um
paradigma dominante. Estudo de mutantes
Dois tipos:
Embries com mutaes letais
No se chega a saber se estes mutantes apresentam deficincias em
importantes genes reguladores do desenvolvimento ou em simples funes
metablicas.
Embries com mutaes na formao de padres
Alguns genes (em reduzido n) fundamentais para a formao de um padro so
reguladores primordiais, situados no topo da pirmide reguladora, que controlam
t f d t i d i d d b i
2
aspectos fundamentais da organizao do corpo do embrio.
Mutaes na formao de um padro, geralmente no interferem com o
desenvolvimento do embrio, mas produzem plntulas com um fentipo
reconhecvel que reflecte o defeito do embrio.
2
Embries com mutaes letais
raspberry
Os mutantes raspberry (rasp)
interrompem o desenvolvimento
no estado de embrio globular,
antes da formao dos
primrdios dos rgos.
No entanto estes embries
3
No entanto, estes embries
parecem mostrar histognese
normal (diferenciao celular
especfica) mesmo na ausncia de
morfognese.
Embries com mutaes letais (cont.)
twin
Em virtude da ntima associao do Em virtude da ntima associao do
embrio com o suspensor, qual ser
o efeito de mutaes embrionrias
letais no desenvolvimento do
suspensor?
Quando o embrio interrompe o
desenvolvimento o suspensor
alarga e as clulas do suspensor
formam um embrio adicional.
O t t t i f d i b i
4
O mutante twin forma dois embries
em tandem.
Admite-se que uma mutao que
interfere com o efeito repressor
normal do embrio sobre o
suspensor.
3
Mutante sus
desenvolvem embries adicionais
5
sus e twin
OsprodutosdosgenesSUS eTWN iniciamtrajectos desinalizaonecessrios
aodesenvolvimentonormaldoembrioeidentidadedosuspensor.
Mutantessus etwn 2modelosnaespecificaodosuspensor:
A.activao deumprogramaespecficoparasuspensor
B.represso deumprogramaembriognico nosuspensor
Mutaes que originam defeitos no
desenvolvimento do pro-embrio permitem que o
suspensor adquira caractersticas de pro-embrio
(ex: raspberry1, sus1) e, no extremo, originar um
novo embrio (ex: twn1).
Estas observaes indicam que o suspensor
tem potencial para seguir um trajecto de
pro-embrio e que o pro-embrio envia um
sinal inibidor ao suspensor para o
defeitonaproduodesinalnoembrio
(Schwartz et al. 1994)
manter no estado diferenciado.
Em alternativa, , tambm, possvel que haja
um equilbrio delicado de reguladores de
crescimento em todo o embrio de modo a
manter o desenvolvimento do suspensor e do
pro-embrio.
defeitonapercepo dosinalpelosuspensor
4
Inter-aco embrio - suspensor
A actividade do produto do gene SUS impede o desenvolvimento embrionrio
do suspensor.
7
Suspensor structure and size vary widely in flowering plants.
Suspensors range from a single cell in orchids to a massive collection of cells in the Phaseolus coccineus. Suspensors can also
contain tiers of multi-nucleated cells that form a syncytium (Figure 1b). Many suspensors have giant basal cells at their micropylar end,
that is the site of maximum metabolic activity.
(T Kawashima, Robert B. Goldberg 2010.The suspensor: not just suspending the embryo. Trends in Plant Science 15 (1): 23-30)
8
5
Importncia do suspensor
Culturas in vitro de embries
com e sem suspensores
demonstraram que, para
completo desenvolvimento
embrionrio, o suspensor
essencial no estado de
embrio cordiforme mas
9
embrio cordiforme mas
no nos estados seguintes.
Plant embryos are supported by a temporary organ called a suspensor that connects embryos to
surrounding nutrient-providing tissues. The suspensor dies early in embryonic development due to
the actions of a protein pair that antagonistically balance each other, one being a pro-death
cathepsin protease called NtCP14, the other an anti-death protease inhibitor called NtCYS.
Whereas NtCP14 (cathepsin H-
like protease) is pro-death,
NtCYS is anti-death.
NtCYS encodes a kind of protein
Choi CQ (2013) The Fate of the Plant Embryo's Suspensor: Balancing Life and Death. PLoS Biol 11(9): e1001656.
doi:10.1371/journal.pbio.1001656
http://www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.1001656
C S e codes a d o p o e
known as a cystatin, which
typically inhibit enzymes known
as cysteine proteases.
6
The model for the regulation of suspensor PCD by the antagonistic action of NtCYS and NtCP14.
When the suspensor ceases to
grow, NtCYS expression is
d l t d l di t
Zhao P, Zhou X-m, Zhang L-y, Wang W, et al. (2013) A Bipartite Molecular Module Controls Cell Death Activation in the Basal Cell
Lineage of Plant Embryos. PLoS Biol 11(9): e1001655. doi:10.1371/journal.pbio.1001655
http://www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.1001655
downregulated, leading to
increased NtCP14 activity and to
the initiation of PCD
Mutaes na formao de padres
I. Mutantes sem eixo de polaridade
gnom (gn)
Deficincias no estabelecimento do eixo de polaridade
do embrio embries esfricos sem polos apical e
basal.
Deficincia no desenvolvimento inicial, a 1 diviso do
zigoto mais ou menos simtrica origina duas clulas
~ semelhantes.
Sabe-se que GNOM actua nas fases iniciais do
desenvolvimento. - A mutao neste gene episttica
relativamente s mutaes que se traduzem em
12
e at a e te s utaes que se t adu e e
supresso de segmentos (v. adiante).
Uma mutao episttica relativamente a outra se ocorre
num gene que actua a montante (desse outro gene).
7
Transporte de auxina durante
a Embriognese inicial
13
Transporte polar de auxina - protenas PIN
(efluxo auxina)
Modelo para o funcionamento de GNOM
A protena GNOM est associada face
citoslica dos endossomas e medeia, em
ARF, na substituio de GDP por GTP.
Por sua vez ARF-GTP recruta para a
membrana, uma coat protein que eleva a
concentrao de PIN1 nos locais de
formao de vesculas de transporte.
As vesculas que transportam PIN1 so
endereadas para o domnio basal da
membrana citoplasmtica.
PIN1 subsequentemente internalizada e
reciclada para os endossomas.
A protena GNOM necessria para a
14
A protena GNOM necessria para a
reciclagem de componentes de
transporte de auxina e as ARF-GEFs
(guanine-nucleotide exchange factors)
regulam trajectos especficos de trnsito de
endossomas .
Cell,Vol.112,141145,January24,2003
8
II. Mutaes por supresso de segmentos do eixo de polaridade
(Mutantes sem determinados segmentos ao longo do eixo apical-basal)
Arabidopsis silvestre
monopteros mutante com
supresso do segmento basal do
embrio, portanto sem hipoctilo e
sem meristema apical radicular
(RAM).
15
O fentipo mp surge nas fases iniciais
do desenvolvimento mas a seguir a
gnom.
II. Mutaes por supresso de segmentos do eixo de
polaridade (cont.)
Nos mutantes monopteros - todas
as clulas do proembrio se
comportamcomo clulas da camada comportam como clulas da camada
superior. As clulas da camada
inferior permanecem isodiamtricas
e no formam fiadas de clulas.
Adicionalmente a clula superior do
suspensor no forma a hipfise.
A mutao parece consistir numa
menor taxa de transporte de auxina
16
menor taxa de transporte de auxina
que por sua vez impede, em parte, a
definio do eixo longitudinal.
MP (MONOPTEROS); transcription factor
Sinnimos:
ARF5, Auxin Response Factor 5, At1g19850, Auxin-
responsive protein IAA24, F6F9_10, F6F9.10, IAA24,
INDOLEACETIC ACID 24, TRANSCRIPTION FACTOR
IAA24, Transcription factor MONOPTEROS
9
gurke regio apical
anormal
Fentipos mutantes
sempicecaulinar esemcotildones mas
comraz comestruturaradial normal
anormal
fackel embrio no estado
globular c/ regio central
anormal
monopteros pr-embrio
com regio basal anormal
comraz comestruturaradial normal
semhipoctio, comcotildones ligados
directamenteraz
semhipoctilo esemraz, mas com
cotildones epicecaulinar
17
gnom diviso mais ou
menos simtrica do zigoto,
desenvolvimento apical-
basal afectado
semraz esemcotildones (aestruturaque
germinaesfricasempolaridadeaxial)
(Apical-basal)
O desenvolvimento axial requer a expresso de genes especficos
Considerando que os fentipos mutantes definem 3 regies ao longo do eixo (apical,
18
Considerando que os fentipos mutantes definem 3 regies ao longo do eixo (apical,
central e basal) assume-se que as 3 regies so essenciais para a formao do padro
apical-basal.
Os genes GURKE, FACKEL, MONOPTEROS e GNOM so necessrios para o
establecimento do padro axial do embrio, mas no esto envolvidos na determinao
dos tipos fundamentais de tecidos nem no controlo da diferenciao celular. (Os mutantes
gnom tm epiderme, tecido fundamental e tecidos vasculares mas sem organizao).
A participao do gene GNOM um pr-requisito para que se manifestem os efeitos dos
outros genes. GN episttico relativamente a MP, quando o gene GN est inactivo, o
gene MP no pode actuar.
10
Formao do padro radial
Histognese da
endoderme
Especificao do
Centro Quiescente e
das Clulas-me das Clulas me
19
25/03/2014
Mapa da origem embrionria do
pice radicular
Anlise anatmica e clonal
(Scheres et al. 1994)
Promeristema constituido por
clulas provenientes de cada uma
das 2 clulas (apical e basal)
resultantes da 1 div. do zigoto.
Clula basal centro quiescente e
regio da columela e coifa;
20
regio da columela e coifa;
Clula apical resto do
promeristema e corpo da planta.
11
Formao do padro radial embrio
globular
A partir do estado embrio globular
Limitesclonaisentreasdescendentesdasclulasfilhasapicalebasaldozigotoe
osdomniosapicalecentraldoembrio.
estabelece-se o Padro radial:
uma camada externa protodrmica e
um conjunto interno de clulas grandes,
que se diferencia:
na regio de tecido fundamental que
envolve o
cilindro de tecidos vasculares
Durante a embriognese as clulas que
21
Durante a embriognese as clulas que
originam os 3 tipos bsicos de tecidos
so separadas por barreiras clonais
distintas e a arquitectura do
promeristema forma-se no estado
cordiforme.
Manuteno do padro radial
Durante o desenvolvimento
embrionrio e ps-embrionrio o
eixo radial, em todas as partes da
planta, est sob o mesmo
mecanismo de controlo.
Mutaes em determinados genes tm
efeitos semelhantes no desenvolvimento
do padro radial
da radcula,
do hipoctilo,
da raiz e
do caule.
22
O padro radial da radcula mantm-
se nas razes ps-embrionrias
(camada externa epidrmica, camada de
crtex, endoderme, pericclo e no centro
tecidos vasculares).
12
Informao posicional -
Sinais intercelulares
Mutaes que alteram o padro radial
Nos mutantes (por perda de funo) scr e shr no ocorrem
divises assimtricas nas clulas filhas das iniciais do cortex-
23
divises assimtricas nas clulas filhas das iniciais do cortex-
endoderme; apresentam uma camada de tecido fundamental no
local das duas camadas normais (cortex e endoderme).
Contudo, diferem:
Mutante scr (.: s SHR) 1 camada com caractersticas mistas
de cortex e endoderme;
Mutante shr (.: s SCR, mas c/ expresso diminuda) 1
camada s com caractersticas de crtex (s/ endoderme)
(wooden leg (wol) tecidos vasculares alterados)
I. Sinalizao radial
24
SHR expressa-se no procmbio do embrio globular e induz a expresso de SCR no meristema fundamental
do embrio cordiforme.
SCR necessrio para a diviso periclinal do meristema fundamental em crtex e endoderme.
Nos mutantes scarecrow (scr ) falta uma camada de tecido fundamental por no ocorrer uma diviso
assimtrica chave no meristema fundamental que originaria a camada cortical e a endoderme. Surge, assim,
uma camada celular mutante com caractersticas de endoderme e de cortex.
13
Sinalizao radial e histognese da endoderme
Normalmente cada inicial
cortical (meristema fundamental)
divide-se transversalmente
mantendo uma inicial cortical e
originando uma clula derivada;
esta clula derivada divide se esta clula derivada divide-se
assimetricamente no plano
periclinal originando uma clula
cortical externa e uma clula
endodrmica interna.
Nos mutantes scr a clula
derivada continua a dividir-se
transversalmente em vez de
periclinalmente de modo que os
mutantes ficam com 1 camada
de tecido fundamental com
25
de tecido fundamental com
caractersticas de cortex e
endoderme.
O gene SCR intervm no
processo de diviso, no
determina o destino das clulas.
Os genes SCR e SHR so transcritos
em camadas mutuamente exclusivas
mas adjacentes.
SHR transcrito em todo o estele,
incluindo as iniciais do estele e
periciclo periciclo.
Pelo contrrio SCR transcrito nas
iniciais do cortex-endoderme, suas
derivadas e na endoderme, assim
como no Centro Quiescente (QC).
SHR controla a diferenciao da
endoderme (camada onde no
transcrito).
A protena SHR activa a transcrio
de SCR que essencial para a
diviso celular assimtrica das
26
diviso celular assimtrica das
clulas filhas das iniciais do
cortex/endoderme...
14
SCARECROW (SCR) blocks SHR movement by
sequestering it into the nucleus
SCR determines SHR subcellular
localization and its range of movement.
(A) SCR transcript levels in two independent ( ) p p
SCR RNAi lines (SCRi-1 and SCRi-2), relative
to that in WT, as determined by RT-QPCR.
(B) Root lengths of the SCR RNAi lines and
WT 6 days after germination. Error bars in (A)
and (B) indicate SD.
(C) Confocal images of 6-day-old roots of WT,
scr-1, SCRi-1, and SCRi-2 seedlings, showing
their structure [propidiumiodide (PI) staining],
an endodermal marker expression
(pSCR::GFP), and SHR-GFP localization
(pSHR::SHR-GFP). The insets in the bottom
panels are enlarged images of the framed
areas. C, cortex; E, endodermis; M, mutant cell
layer; S, supernumerary cell layers. Scale
bars, 10 mm
An Evolutionarily Conserved Mechanism Delimiting SHR
Movement Defines a Single Layer of Endodermis in Plants.
Hongchang Cui, et al. Science 316, 421 (2007); DOI:
10.1126/science.1139531
The SHR Pathway Is Essential for Stem Cell
Specification and Radial Patterning of the Root
(A) Schematic of a transverse section showing
Arabidopsis root anatomy. Cei, cortex-endodermis
initials; Ceid, cortex-endodermis initial daughters;
Cor, cortex; Crc, columella root cap; Cri, columella
root cap initials; End, endodermis; Epi, epidermis;
Eri, epidermis-root cap initials; Lrc, lateral root cap;
Per, pericycle; QC, quiescent center; Ste, stele;
Vas, vascular cylinder.
(B) Diagram of the cell divisions that form
endodermis and cortex. The color code is as in (A).
The two arrowheads indicate the transverse
division of the Cei and the longitudinal division of
the Ceid.
(C) The SHR and SCR domain. The SHR protein
(left) is present in the stele, the endodermis, the
shr scr
( ) p , ,
QC, the Cei, and the Ceid.
SCR (right) is transcribed specifically in the QC,
the Cei, and the Ceid.
(DF) Confocal section of roots from 5-d-old wild-
type (D), shr-2 (E), and scr-4 (F). Cor, cortex; End,
endodermis; Mut, mutant layer. Scale bars: 25 m
Levesque MP, Vernoux T, Busch W, Cui H, et al. (2006) Whole-Genome Analysis of the SHORT-ROOT Developmental Pathway in Arabidopsis.
PLoS Biol 4(5): e143. doi:10.1371/journal.pbio.0040143
http://www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.0040143
15
Models for SHR Function in Root Development
(A) The interaction of SHR with various coregulators
ll f h i i f ifi di d fi i allows for the activation of specific direct targets defining
five functional subdomains in the SHR domain: the QC,
the early endodermis, the late endodermis, the early
stele, and the late stele. The spatial specificity of the
different direct targets allows SHR to function in QC
specification, CEI asymmetric cell division, early and late
endodermal specification, but also early and late stele
specification. The gene name was indicated in black or in
gray when the expression was inferred from RNA in situ
hybridization or digital in situ data, respectively. The stars
indicate genes for which binding to the promoter region
was demonstrated by ChIP-QRT-PCR.
(B) Global model of the SHR developmental pathway (B) Global model of the SHR developmental pathway.
SHR controls root development through the regulation of
three interconnected modules: a transcription regulator
module, a hormonal module, and a signaling module.
The interactions between these three modules determine
the developmental output of the pathway on stem cell
niche specification, radial patterning, and stele
development.
Levesque MP, Vernoux T, Busch W, Cui H, et al. (2006) Whole-Genome Analysis of the SHORT-ROOT Developmental Pathway in Arabidopsis.
PLoS Biol 4(5): e143. doi:10.1371/journal.pbio.0040143
http://www.plosbiology.org/article/info:doi/10.1371/journal.pbio.0040143
Leituras adicionais
30
16
Roots with reduced SHR activity show ectopic periclinal cell divisions in the endodermis
Roots with reduced SHR activity show ectopic periclinal cell divisions in the endodermis.
(A, C, E, and G) Toluidine blue stained transverse cross-sections through 5-d-old roots; genotypes as indicated.
(B, D, F, and H) Longitudinal confocal cross-sections through the root meristems of wild-type and mutant individuals; genotypes as indicated.
Arrows point to precocious divisions. Region in the blue dashed box is magnified in the Inset. E, endodermis; C, cortex; and G, ground tissue.
(IL) Wild-type and mutant roots (as indicated) expressing pCYCD6;1:GFP-GUS. Arrows point to precocious periclinal cell divisions.
2012 by National Academy of Sciences Koizumi K et al. PNAS 2012;109:13010-13015
A reduction in SHR precedes cell division
(A and B) SHR-GFP in 14-d-old roots. Numbers in A
indicate the endodermal-to-stele ratios of SHR-GFP
fluorescence. White circles outline nuclei of recently
divided endodermal cells, whereas yellow encircles
those that are next in line to divide. (B) To eliminate the
stele from the calculation of SHR-GFP levels in the
d d i th fl i t it i tl endodermis, the fluorescence intensity in recently
divided endodermal cells like E1 were compared with
those that are in line to divide, E2. This comparison
yielded an average ratio of 2.4.
(C and D) Transfer of the shr-2 roots expressing
pSHR:SHR-GR from dex-containing medium to
standard MS medium lacking dex resulted in periclinal
cell divisions in the endodermis (arrows). Small white
numbers indicate the ground tissue layers relative to
the stele.
(E) Reduction in the movement of SHR-GFP in the
pWOL:icalsm line resulted in periclinal cell divisions
(arrows) and (F) activation of expression of
2012 by National Academy of Sciences Koizumi K et al. PNAS 2012;109:13010-13015
(arrows) and (F) activation of expression of
pCYCD6;1:GFP-GUS in the endodermis. In E the white
arrowhead E1 points to the nucleus of a divided
endodermal cell, whereas the yellow E2 and orange E3
arrowheads point to undivided cells.
(G) Expression of pSHR:SCR-mTFP in wild-type roots
inhibits the movement of SHR-GFP and the formation
of separate endodermis and cortex.
E, endodermis; C, cortex; and G, ground tissue
throughout.
17
The SHORT-ROOT protein acts as a mobile, dosedependent
signal in patterning the ground tissue
A key question in developmental biology is how cellular patterns are created and
maintained. During the formation of the Arabidopsis root, the endodermis, middle cortex
(MC), and cortex are produced by periclinal cell divisions that occur at different positions
and at different times in root development. The endodermis and cortex arise continuously
from the periclinal divisions of cells that surround the quiescent center (QC) at the tip of the
root. The MC arises between days 7 and 14 from periclinal divisions of the endodermis. The
divisions that produce the middle cortex begin in the basal region of the root meristem away
from the QC and then spread apically and circumferentially around the root. Although the
transcription factor SHORT-ROOT (SHR) is required for both of these divisions, the
mechanism that determines where and when SHR acts to promote cell division along the
longitudinal axis of the root is unknown; SHR is present along the entire length of the root
tip, but only promotes periclinal divisions at specific sites.
Th b d f th SHR t i h d i ll th t d l d The abundance of the SHR protein changes dynamically as the root develops, and
the pattern of cell division within the endodermis is sensitive to the dose of this protein: high
levels of SHR prevent the formation of the MC, whereas intermediate levels of SHR
promote MC formation. These results provide a mechanism for the longitudinal patterning of
the endodermis, and represent the first example in plants of a mobile transcription factor
whose function (activator or repressor) depends upon concentration.
Koizumi K et al. PNAS 2012;109:13010-13015