CRef biotechnologies 2004/2005 Marc GENSSE

SEPARATION DES ACIDES AMINES PAR ELECTROPHORESE SUR PAPIER

Dure : 3H


I. Objectifs :
On se propose de sparer par lectrophorse les acides amins d'un mlange : Proline
(pHi=6,30), Lysine (pHi =9,74) et Aspartate (pHi =2,98).
Durant cette sance, nous mettrons donc en uvre une technique de sparation des
constituants d'un mlange diffrente de la CCM (technique qui aura dj t aborde
lors de l'tude des glucides), ce qui permettra de comparer les avantages et les
inconvnients de ces 2 techniques ainsi que la notion du caractre amphotre des
acides amins (qui sera vue dans la partie cours).
Les objectifs annexes sont :
o Utilisation de la verrerie de laboratoire.
o Sensibilisation aux dangers dans le labo de Biochimie et la toxicit des ractifs.


II. Matriel et ractifs

Ractifs Prparation Rpartition Noter
Tampon Tris-
Barbital pH 6,3
Achet dj prt l'emploi
Flacon de 1L/cuve
d'lectrophorse
Tp lectrophorse
Ractif la
ninhydrine
Peut tre prpar la veille et
conserver +4C en flacon brun.
Ninhydrine1 g
Ethanol196 mL
Acide thanoque4 mL


Flacon de 100 mL/
cuve
d'lectrophorse
Ninhydrine
Lysine 20 g/L
+ Proline 20
g/L + Ac.
aspartique 20
g/L
L'acide aspartique se dissout en
gnral mal dans l'eau. Il est
possible d'ajouter un peu d'HCl
pour le dissoudre puis de ramener
le pH 6,3

Flacon de 20
mL/classe
Mlange d'acides
amins

Matriel Quantit/lve
Papier Wathman N3 ou 4 1 feuille/classe
Papier filtre 1 feuille/lve
Becher de 50 mL 1
Cuves lectrophorse + gnrateurs 1 cuve/3 lves
Applicateur pour lectrophorse ou lame de verre pour
microscope
1/classe
Eprouvette de 100 mL 1/classe
Bac plat de contenance 100 mL pour immerger les
bandes de Wathman 2,5x16 cm
1/classe
Pince 1
Gants 1 gant/lve
Hotte 90C 1/classe

III. Technique/Manipulation/Mode opratoire

1. Prparation de la cuve d'lectrophorse
Remplir chaque demi-cuve jusqu'au trait repre avec du tampon Tris-barbital pH 6,30.
Couper une bande de papier Whatman de 2,5 cm X 16 cm ; tracer un trait vertical au
crayon (trs lger) au niveau duquel sera fait le dpt.
Immerger la bande dans le tampon pH 6,3 puis l'essorer entre 2 feuilles de papier-filtre.
Tendre la bande sur le chevalet, comme sur le schma ci-dessous :


Dpt
Cathode (+)
Anode (-)
Compartiments
contenant le tampon
..
..


2. Dpt du mlange d'acides amines
Dposer sur la bande le mlange l'aide d'une lame de microscope ou d'un applicateur.

3. Migration lectrophortique
Brancher le gnrateur, et appliquer une tension continue de 150 V pendant 1h30.
L'intensit doit se situer entre 12 et 21 mA.
Aprs 1h30, couper le courant, dbrancher le gnrateur, retirer la bande et la scher
l'air.

4. Coloration de la bande
Sous la hotte, appliquer l'aide d'un pinceau la ninhvdrine sur la bande pose sur du
papier-filtre en vitant tout contact avec les doigts l'aide d'une pince et port de GANTS
obligatoire.
Mettre l'tuve 90C en surveillant l'apparition de la coloration (2-3 min).

5. Compte-rendu
Rsultats
o Coller la bande d'lectrophorse colore, en y indiquant le sens des lectrodes
par un (+) et un , leur nom, l'endroit du dpt et la coloration effectue.
o Refaire un schma montrant la position des lectrodes ainsi que des 3 tches
colores.
Interprtation
o Sachant qu'un acide amin a une charge quand le pH de la solution est > son
pHi et qu'inversement, il a une charge (+) quand le pH de la solution est < son
pHi, donner la position des 3 amins la justifiant.
o Que remarque-t-on pour la proline ?
Conclusion
o A quoi sert cette technique ? Comparaison avec la chromatographie sur couche
mince
IV. Exploitation pdagogique
Schma de la cuve d'lectrophorse
o Position des 3 acides amins


Proline
Lysine
Aspartate
Cathode (+)
Anode (-)
Compartiments
contenant le tampon

On remarque que la proline n'a pas boug car son pHi =pH de la solution alors que la lysine a
migr vers l'anode (pHi >pH de la solution) et que l'acide aspartique a migr vers la cathode
(pHi <pH de la solution).

Couleur des acides amins
Avec la ninhydrine, tous les acides amins sont colors en violet, sauf la proline (et
l'hydroxyproline) qui sont colors en jaune.

Toxicit des ractifs
o Dcrire la nature du danger rencontr :
Ninhydrine (hydrate de trictohydrindne) : ractif cancrigne donc videmment manipuler
avec prcautions et ne pas jeter l'vier !

Comparaison avec la CCM
La CCM est une technique de sparation des molcules en fonction de leur affinit relative pour
un support solide et un liquide (chromatographie de partage). Elle a un pouvoir rsolutif assez
faible, surtout pour les grosses molcules.
L'lectrophorse possde un pouvoir rsolutif beaucoup plus important mais ne marche que
pour des molcules charges.
La conclusion est donc qu'il n'existe pas une technique universelle de sparation des molcules
mais qu'il faut adapter la technique en fonction du but recherch.

Remarque : ce TP peut tre ralis l'identique avec des bandes d'actates de cellulose, qui donnent un rsultat
beaucoup plus joli ; elles sont videmment plus chres !