Técnicas Microbiológicas

Reyna Alonso Luviano

 Diagnóstico Microbiológico

• Identificar el microorganismo causante de infección o

enfermedad. Se trata de conocer la causa de la
infección para proceder a su tratamiento y tomar
medidas necesarias.
• Parte de la información acumulada por el clínico
(historia clínica del paciente, síntomas y signos,
diagnóstico clínico probable)
•
Tipos de Diagnóstico
• Toma de muestra: Evitar contaminación
• Etiquetado de la muestra
• Transporte (medios de transporte)
• Procesamiento en el laboratorio de microbiología:
• Observación microscópica
• Aislamiento, cultivo, contaje…

 Microscopía

• Ayuda a valorar su propiedad e indicar la

naturaleza del agente patógeno.


• Las muestras pueden ser de dos tipos:

frotis secos (sobre un portaobjetos y se
fijan) y preparaciones húmedas.
•
 Tinción

• Hace posible estudiar sus características tales

como tamaño, forma, propiedades químicas y
estructuras.


• El índice de refracción de las bacterias es similar

al del fondo oscuro y es necesario incrementar
el contraste por el uso de tinciones
 Tinción Gram

• Tinción básica violeta, yodo, decoloración

con acetona y contratinción con carbol
fucsina o safranina. Hay gramvariables
(Gardnerella vaginalis) y las
micobacterias no se tiñen.
• Ácido-alcohol resistentes. Ácidos grasos de
cadena larga: propiedad de resistir la
decoloracíón con alcohol-ácido, después
de la tinción con colorantes básicos.


• Llamada tinción de Ziehl-Neelsen:

– Carbol fucsina caliente
– decoloración con ácido sulfúrico concentrado
y alcohol;
– Se contratiñen con malaquita verde o azul de
metileno.
 Las micobacterias aparecen rojas contra un
fondo verde o azul.
•
 Tinción Fenol auramina

• Frotis secos y secados con calor se tratan con

fenol de auramina
• Se decoloran con HCl al 1% en alcohol
metilado industrial, seguido de solución
diluida de permanganato de potasio.
• Los especímenesse observan bajo luz
ultravioleta con el objetivo de 40x y las
micobacterias brillan en tonos verdes y
amarillos contra un fondo oscuro.
•
 Acridina naranja y fluoresceína

• Usadas en miscroscopía de
fluorescencia.
• Acridina de naranja: usada para
demostrar bacterias que no se
diferenciaron bien con la
tinciónGram.
•
S. aureus
Gram+ S. pneumoniae Gram- (Neisseria
sicca)

BAAR Mycobacterium
bovis
 Cultivo
• Aislamiento, identificación y
determinación de la susceptibilidad
a antibióticos.
• Recolección por medio de hisopos
• La sangre se deposita en recipientes
especiales para probar la presencia
de bacterias
• El esputo y orina se recolectan en
contenedores estériles.
•
 Pruebas Bioquímicas

• Reacciones bioquímicas en la
identificación de bacterias. Pruebas
de fermentación, producción de
ácido sulfihídrico, utilización de
diversas sustancias & detección de
ciertas enzimas.
•
 Prueba de la catalasa

• Reducción del oxígeno a peróxido de

hidrógeno o superóxido


• Catalasa: medio de defensa



• La prueba consiste en añadir peróxido de

hidrógeno al agar, y si hay catalasa se
forman burbujas.
 Prueba de Citrato

• Capacidad de la bacteria para usar citrato

como única fuente de carbono.
• Citrato sódico, produce CO2+ Na =carbonato
sódico (compuesto básico).
• Indicador de pH detecta la presencia de este
compuesto tornándose azul.
•
 Prueba de la Coagulasa

• Diferenciar entre cepas patógenas & no

patógenas de Staphylococcus.
• Coagulación del plasma alrededor.
• Inoculación del espécimen en plasma, se
incuba a 37oC durante 1-4 hrs. Si es
positiva un coágulo en el tubo de ensayo.
•
 Prueba del indol

• Componente del triptófano.



• Cuando se rompe el triptófano se detecta la

presencia de indol con el reactivo de Kovac
(amarillo) y cuando reacciona con él,
produce color rojo en la superficie del tubo
de ensayo.
 Prueba Oxidasa

• Oxidación del citocromo c, el cual oxida el

reactivo oxidasa.
• El reactivo oxidado cambia de rosa, a morado
claro y después a morado oscuro de 10-30
segundos.
 Prueba de la ureasa

• Rompe enlaces carbono-nitrógeno y forma

CO2, NH3, y agua.
• Producida por los miembros del género
Proteus


• Si en el medio de urea se fracciona, se libera

amoniaco y aumenta el pH del medio, el
cual se detecta con un indicador que en el
medio básico es de color rosa.
•
Izq: S. Epidermis + Prueba de critrato negativo Prueba de indol positiva a
derecha: E. Fecalis - a la izquierda (E. coli); la izquierda (E . coli);
positivo a la derecha (E. negativo al centro (E.
aerogenes) aerogenes)

Prueba de oxidasa. E. coli a P. aeruginosa (oxidasa positiva )

la derecha; P. aeruginosa a a la izquierda y E. coli(oxidasa
la derecha negativa) a la derecha
Identificación de Bacterias
 Pruebas Automatizadas

• Vitek: Tarjeta delgada de plástico 30 pruebas

bioquímicas más un instrumento que lee la
tarjeta.
• Diferentes tipos de tarjetas, (Grampositivas y
gramnegativas).
• Inoculadas e incubadas. Escaneadas cada
hora hasta que las características
coinciden con alguna bacteria conocida.
•
• Monoscan: Diseñado para bacterias
gramnegativas
• Tablilla con diferentes orificios para pruebas
bioquímicas (26 para pruebas bioqimicas y
60 para susceptibilidad a antibióticos).
• Se incuban y escanean periódicamente
•
Vitek

Microscan
Prueba de Efectividad Antibióticos

• Método Kirby-Bauer:
Inóculo bacteriano incluye un número
conocido de bacterias para sembrar un
medio de cultivo (placa de Petri).
• Discos de papel impregnados con una
concentración determinada de
antibiótico.
• Placa incubada durante 24 horas para
permitir el crecimiento bacteriano
confluente
• El tamaño del halo de inhibición permite
determinar si el aislado clínico es
sensible o resistente a un antibiótico.
 Métodos Moleculares

• La infección debe representar un problema

clínico relevante en número de casos,
morbilidad y mortalidad.
• Segundo, que no sea capaz de ser
identificado con los métodos tradicionales
de microscopía.
•
 Aglutinación

• Se agrega una cepa del microorganismo al suero y se

incuba durante una hora a 37oC.


ELISA
l(Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas)
lno requiere de la formación del complejo antígeno-
anticuerpo.
lUnión covalente del reactivo del anticuerpo a una
enzima que cataliza la conversión de un sustrato
incoloro en un producto de reacción coloreado.
lMicroplacas con 96 celdillas que alojan una gran
cantidad de muestras
lLos resultados los genera y analiza un lector
automático
 Bibliografía
• Crocker, J; Burnett, D. La Ciencia del Diagnóstico de
Laboratorio. Segunda edición. Inglaterra: Mc Graw Hill,
2005. 538 p.
 

• Steve A, Strete, D. Microbiology, A Photographic Atlas for the

Laboratory. E.U.A., Canada: Benjamin Cummings, 2001.
193 p.
 

• P. R. MURRAY. Microbiología Médica. 2006. Mosby (Elsevier

Science).
 

• http://books.google.com.mx/books?
id=4OQXmnBnjH8C&pg=PA451&lpg=PA451&dq=tecnicas
+microbiologicas+basicas&source=bl&ots=5I5P6fuoGz&si
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