Laboratorio de Anlisis Instrumental / Primavera 2010/ Prof.

Jorge Castillo
1

Aplicacin del Mtodo de Estndar Interno a la Cromatografa de Gases

Prof. Jorge Castillo R, 7 / Enero / 2010

Introduccin:

El mtodo del estndar interno debe su nombre a la forma como
se preparan las muestras a ser analizadas. El estndar interno es
una sustancia que se aade a todas las muestras y estndares en
cantidad conocida y a la vez en cantidad suficiente para poder ser
determinado sin problemas, Su adicin no debe de causar ningn
tipo de interferencia en el anlisis, y debe de proporcionar una seal
analtica similar al analito en el anlisis pero distinguible del mismo.
Adems el estndar interno No debe estar presente en la matriz en
estudio.

Los mtodos basados en la adicin de un estndar interno
generalmente se utilizan cuando el analista esta interesado en la
concentracin de uno o algunos de los componentes y el mtodo de
anlisis es susceptible a errores tanto sistemticos como al azar.

El mtodo esta basado en que cuando las seales del analito y
del estndar interno responden proporcionalmente a las fluctuaciones
del mtodo y del instrumental empleado, entonces la razn de estas
seales es independiente de tales fluctuaciones; De esta forma el
mtodo compensa por errores provenientes de la manipulacin de la
muestra por analizar.

Un ejemplo del mtodo lo encontramos en la determinacin
espectroscpica de sodio y potasio en suero sanguneo por emisin
atmica. El estndar interno es generalmente litio el cual tiene una
seal de emisin comparable al analito pero no se encuentra
naturalmente en la sangre; La emisin de litio ocurre a diferente
longitud de onda que el sodio y potasio por lo que se puede analizar
sin problemas de interferencias espectrales; adems su adicin en la
cantidad requerida no afecta la matriz en estudio (sangre) y no
interfiere qumicamente con el analito. Al llevar a cabo el anlisis de
la muestra se determina simultneamente la lectura de emisin de
sodio, potasio y litio, si en algn momento existe un error (fluctuacin)
en el anlisis, podemos esperar que el mismo afecte de manera
similar las lecturas del analito y del estndar interno y podamos
compensar el anlisis.

Factores de Respuesta:

Para aplicar el mtodo del estndar interno a la cromatografa
de gases debemos primeramente emplear correctamente los factores
de respuesta, por lo que se dar a continuacin una pequea
introduccin a la utilizacin y determinacin de los factores de
respuesta del detector al analito.

Tanto en cromatografa como en la gran mayora de las tcnicas
instrumentales de anlisis, es poco frecuente que todos los
componentes de una muestra tengan una misma respuesta en el
detector, es por esta razn que debemos emplear la misma sustancia
a analizar (analito) en forma pura para preparar los estndares en
una curva de calibracin, adems de tratar de mantener las mismas
condiciones del mtodo y del instrumental que sern empleados en el
anlisis para todas las muestras (estndar y desconocido)

Bsicamente los factores de respuesta se obtienen de la
siguiente relacin:
Ci = FiAi

As el factor de respuesta del detector (F) a una sustancia es
una constante que correlaciona el rea (A) con la concentracin (C).

Para ejemplificar los problemas que acarreara el NO considerar
los factores de respuesta en un anlisis cromatogrfico consideremos
el siguiente ejemplo:

Supongamos que inyectamos 1ul de una solucin desconocida
que contiene ambos disolventes A y B. Al inyectar esta mezcla en un
cromatgrafo de gases se separaron los componentes y se encontr
que el rea de A es igual al rea de B (500 u
2
). Los resultados se
pueden observar en la figura 1.

Basndonos simplemente en
las reas de los compuestos, sin
emplear los factores de respuesta,
podemos suponer que habr igual
cantidad (concentracin) del
compuesto A y del compuesto B en
la mezcla, 50% de cada uno. Sin
embargo podramos tener un error
relativamente grande ya que lo
normal es que los factores de
respuesta sean diferentes para cada uno de los compuestos.

Supongamos ahora que inyectamos 1ul de cada uno de los
compuestos A y B puros, empleando las mismas condiciones
cromatogrficas que la mezcla (figura 1) y que se obtienen las reas
mostradas en la (figura 2). Empleando estas reas calculemos ahora
los factores de respuesta:

FB = CB/AB = 100/1666.7 = 0.06
FA = CA/AA = 100/714.29 = 0.14

Como podr observar existe una
relacin inversa entre estos factores de
respuesta y el rea del pico
cromatogrfico; Entre mas pequeo
sea el factor mas grande ser el rea y
mayor la sensitividad del detector para
ese analito. Por lo tanto el detector
cromatogrfico ser mas sensitivo para
el compuesto B ya que produce la
mayor seal (rea) para el.

Empleando los factores de respuesta calculemos ahora la
verdadera concentracin de los componentes en la mezcla
desconocida (figura 1).

CA = AA*FA = (500)*(0.14) = 70%
CB = AB*FB = (500)*(0.06) = 30%

Por tanto, los errores en la determinacin son muy grandes: de
un 66.7% para A y 28.6% para B si se compara al 50% supuesto.

Mtodo del Estndar Interno

En el mtodo de estndar interno se emplea normalmente una
curva de calibracin (figura. 3) empleando una serie de soluciones
que contienen igual cantidad del estndar interno e incrementos en la
cantidad del analito. Se inyectan las soluciones y del cromatgrama
obtenemos el rea del analito
y el rea del estndar intern,
se calcula la relacion entre las
reas (Aanalito/AEst.Int.) y se
grfica contra la
concentracin de analito en
cada solucin. Finalmente se
interpola en la grfica
obtenida el valor de la razn
de reas de una muestra
desconocida, la cual debe
contener la misma cantidad
de estndar interno que los
patrones.


Por desgracia en el
experimento de laboratorio
(GC2) no tenemos el tiempo para realizar el anlisis de las soluciones
patrn requeridas por lo que solo empleamos un solo estndar
(patrn) y supondremos una relacin lineal entre la razn de reas y
Figura 1
Figura 2
Figura 3 Curva de Calibracin (Estndar Interno)
Laboratorio de Anlisis Instrumental / Primavera 2010/ Prof. Jorge Castillo
2

la concentracin de analito. El anlisis se efecta de la siguiente
manera:

Se prepara una solucin patrn de concentracin conocida tanto
del estndar interno como del analito, con lo que se establecer una
relacin entre sus concentraciones, en nuestro caso:

CA = CEi AA FA = AEi FEi FA = (AEi FEi )/AA

Ahora asignaremos al estndar interno un factor de respuesta
igual a la unidad (1.0) esto nos permitir calcular el factor FA en
funcin del estndar interno, de tal forma que el factor obtenido ser
un factor de respuesta relativo.

Una vez encontrado el valor del factor de respuesta relativo del
compuesto procederemos a analizar los datos del desconocido, el
cual debe contener una concentracin conocida del estndar interno
(CEiD). Emplearemos para ello las reas del analito (AAD) y del
estndar interno (AEiD) en la muestra del desconocido, para obtener la
concentracin del analito en el desconocido, se proceder de la
siguiente forma:

CAD = FAAAD y CEiD = FEiAEiD CAD/CEiD = (FAAAD)/(FEiAEiD)

CAD = (FA AAD CEiD )/ (FEi AEiD)

De esta forma se obtiene el valor de la concentracin del analito
en el desconocido (CAD).

Recuerde que en el experimento GC2 se calculan los factores
para cada inyeccin del patrn y luego estos se promedian; De igual
forma, la concentracin del analito se determina en cada inyeccin
del desconocido y luego se promedian.