2012 Lyon 113

1
VETAGRO SUP
CAMPUS VETERINAIRE DE LYON

Anne 2012 - Thse n

COMPARAI SON DE DI FFERENTES COLORATI ONS POUR LA
MI SE EN EVI DENCE DES PROTOZOAI RES DANS LA
COPROSCOPI E DES RUMI NANTS

THESE

Prsente lUNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Mdecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 21 dcembre 2012
pour obtenir le grade de Docteur Vtrinaire

par

CHANUDET Jeanne
Ne le 10 mars 1987
Mcon (71)

2

3

LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT

4

5

REMERCIEMENTS

Au prsident de ma thse, Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLE,
Professeur lUniversit Claude Bernard de Lyon,
Pour mavoir fait lhonneur de prsider mon jury de thse, pour sa disponibilit,
Hommages respectueux.

A Monsieur le Professeur Lionel ZENNER,
Professeur VetAgro Sup, Campus vtrinaire de Lyon,
Pour avoir dirig ce travail, pour ses conseils aviss,
Sincres remerciements.

A Madame le Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI,
Matre de confrences VetAgro Sup, Campus vtrinaire de Lyon,
Pour son aide et pour avoir eu la gentillesse de juger cette thse et dtre mon deuxime
assesseur,
Sincre reconnaissance.

A Madame Marie-Thrse POIREL,
Technicienne au service de parasitologie de VetAgro Sup, Campus vtrinaire de Lyon,
Pour sa patience, sa disponibilit et ses prcieux conseils,
Sincre gratitude.

Au personnel des LVD et LDA contacts,
Pour leurs rponses et lintrt quils ont ports cette tude.

Aux leveurs et vtrinaires,
Pour leur aide indispensable la ralisation de ce travail.

6

A mes parents,
Pour tout lamour et le soutien que vous mapportez chaque jour,
Pour la confiance que vous mavez toujours accorde et la libert dans laquelle jai grandi,
Je suis fire dtre votre fille.

A mon frre Pierre,
La vie nous a malheureusement spars trop tt, mais je sais que tu resteras toujours mes
cts et dans mes penses,
Ma russite est aussi la tienne.

A mes grands-parents,
Ce que je suis aujourdhui, je vous le dois, merci.

A toute la famille Chanudet,
Pour ces rendez-vous caf au Tari le dimanche matin, et tous vos sourires.

A ma tante Odile,
Pour ton soutien pendant toutes ces annes.

A ma cousine Marie,
Grce toi, jai pu dcouvrir lEspagne o tu es comme un poisson dans leau.

A toute la famille Chamonard,
Pour tous ces souvenirs de vacances ensemble.

7

TABLE DES MATIERES

Table des illustrations ...................................................................................................................................................... 13
Table des figures .......................................................................................................................................................... 13
Table des tableaux ....................................................................................................................................................... 14
Introduction gnrale ....................................................................................................................................................... 17
Partie I : Partie bibliographique .................................................................................................................................... 19
Introduction .................................................................................................................................................................... 20
I. Les protozoaires et les diffrents tests diagnostiques en coproscopie ............................................... 21
A. Les principaux protozoaires dtectables en coproscopie .................................................................. 21
1. Cryptosporidium parvum ....................................................................................................................... 21
a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 21
b) Cycle ........................................................................................................................................................ 21
c) Morphologie .......................................................................................................................................... 22
d) Pathognie et signes cliniques.......................................................................................................... 23
2. Eimeria spp. ................................................................................................................................................ 23
a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 24
b) Cycle ........................................................................................................................................................ 24
c) Morphologie .......................................................................................................................................... 25
3. Giardia intestinalis ................................................................................................................................... 27
a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 27
b) Cycle ........................................................................................................................................................ 27
c) Morphologie .......................................................................................................................................... 28
4. Autres protozoaires .................................................................................................................................. 30
B. Les diffrents tests diagnostiques ralisables sur un chantillon de selles .................................. 32
1. Techniques microscopiques ................................................................................................................... 32
a) Examen direct des selles .................................................................................................................... 32
b) Examen des selles aprs coloration ................................................................................................ 32
2. Techniques immunologiques................................................................................................................. 33
8

a) Immunofluorescence directe ............................................................................................................ 33
b) ELISA ...................................................................................................................................................... 34
c) Immunochromatographie .................................................................................................................. 34
3. Technique de biologie molculaire : PCR ........................................................................................ 36
II. Prparation de lchantillon lexamen microscopique ........................................................................ 37
A. Les modalits de prlvement et conservation de lchantillon...................................................... 37
1. Techniques de prlvements ................................................................................................................. 37
2. Conservation des chantillons .............................................................................................................. 38
B. Matriel ncessaire la ralisation dun examen microscopique des selles ............................... 39
C. Mthodes de concentration des parasites ............................................................................................... 40
1. Mthodes physiques ................................................................................................................................. 40
a) Concentration par flottation .............................................................................................................. 40
b) Concentration par sdimentation ..................................................................................................... 42
2. Mthodes diphasiques ............................................................................................................................. 42
D. Ralisation et fixation du frottis ................................................................................................................ 45
1. Etalement des selles ................................................................................................................................. 45
2. Fixation des frottis .................................................................................................................................... 46
E. Lutage ................................................................................................................................................................ 48
F. Montage ............................................................................................................................................................ 49
III. Les diffrentes mthodes de coloration pour la dtection des protozoaires ................................ 50
A. Forme vgtative............................................................................................................................................ 50
1. Colorations entre lames et lamelles ..................................................................................................... 50
a) Mthode de Bailenger et Faraggi .................................................................................................... 51
b) MIF ou mthode de Sapero, Lawless et Strome ......................................................................... 51
2. Fixation coloration dun frottis humide ........................................................................................... 52
a) Technique en trois temps ................................................................................................................... 52
Mthodes lhmatoxyline ................................................................................... 52 i).
Trichrome (Gomori-Wheatley).............................................................................. 54 ii).
b) Techniques en un temps ..................................................................................................................... 54
3. Coloration dun frottis sec ...................................................................................................................... 55
a) Mthode de Brooke et Goldman ..................................................................................................... 55
b) Giemsa ..................................................................................................................................................... 56
B. Forme kystique ............................................................................................................................................... 57
9

1. Colorations entre lames et lamelles ..................................................................................................... 57
a) Mthode de Bailenger et Faraggi .................................................................................................... 57
b) MIF ........................................................................................................................................................... 57
c) Colorations iodes ............................................................................................................................... 58
d) Coloration au saccharose ................................................................................................................... 59
e) Mthode de Heine ................................................................................................................................ 60
f) Coloration ngative la nigrosine .................................................................................................. 61
2. Fixation coloration dun frottis humide ........................................................................................... 61
a) Techniques en trois temps ................................................................................................................. 61
Mthodes lhmatoxyline ................................................................................... 61 i).
Trichrome (Gomori-Wheatley).............................................................................. 62 ii).
b) Technique en 1 temps ......................................................................................................................... 62
3. Coloration dun frottis sec ...................................................................................................................... 62
a) Giemsa ..................................................................................................................................................... 63
b) Les mthodes de Ziehl-Neelsen....................................................................................................... 63
Mthode de Ziehl-Neelsen modifie par Henriksen .............................................. 63 i).
Autres modifications de la mthode de Ziehl-Neelsen .......................................... 65 ii).
c) Mthode de Brooke et Goldman ..................................................................................................... 65
d) Mthode fluorescence ..................................................................................................................... 66
Auramine-fuchsine carbolique .............................................................................. 66 i).
Auramine-phnol ................................................................................................... 67 ii).
Mpacrine .............................................................................................................. 67 iii).
Conclusion ...................................................................................................................................................................... 69
Partie II : Bilan sur les mthodes de diagnostic des protozoaires digestifs en France et tude
exprimentale comparative de techniques de coloration rapides pour la mise en vidence des
protozoaires intestinaux .................................................................................................................................................. 71
I. Introduction .......................................................................................................................................................... 72
II. Matriels et mthodes ....................................................................................................................................... 73
A. Recueil de donnes et dchantillons ...................................................................................................... 73
1. Modalits de contact ................................................................................................................................ 73
2. Zone et priode dtude .......................................................................................................................... 73
3. Collectes et modalits de prlvement des chantillons ............................................................... 74
B. Prparation du questionnaire et des chantillons ................................................................................. 75
1. Ralisation du questionnaire ................................................................................................................. 75
10

2. Prparation des chantillons en vue de la coloration ..................................................................... 75
3. Dilution des chantillons ........................................................................................................................ 76
C. Modalits de coloration et de lecture des prlvements .................................................................... 78
1. Coloration des prlvements ................................................................................................................. 78
a) La coloration par une solution de saccharose.............................................................................. 78
b) La mthode de Heine ou coloration la fuchsine ...................................................................... 79
c) La mthode de Ziehl-Neelsen modifie ........................................................................................ 79
d) La coloration au lugol ......................................................................................................................... 79
2. Lecture des lames...................................................................................................................................... 80
D. Etude statistique ............................................................................................................................................. 82
III. Rsultats ........................................................................................................................................................... 83
A. Enqute sur les mthodes de dtection des protozoaires en coproscopie en France ................ 83
1. Les colorations en routine lors danalyse coproscopique de jeunes bovins dans les
laboratoires dpartementaux ........................................................................................................................... 84
2. Les colorations lors de demande de recherche de Cryptosporidium ........................................ 84
3. Les colorations lors de demande de recherche de Giardia .......................................................... 86
4. Critres de choix des colorants par les laboratoires ....................................................................... 88
B. Comparaison de quatre techniques de coloration en coproscopie .................................................. 89
1. Comparaison de la sensibilit des colorants vis--vis de trois genres courants de
protozoaires .......................................................................................................................................................... 89
a) Comparaison pour le genre Cryptosporidium ............................................................................. 89
b) Comparaison pour le genre Giardia ............................................................................................... 94
c) Comparaison pour le genre Eimeria .............................................................................................. 97
2. Comparaison de la spcificit des colorants ..................................................................................... 99
a) Genre Cryptosporidium ...................................................................................................................... 99
b) Genre Giardia .................................................................................................................................... 101
c) Genre Eimeria .................................................................................................................................... 104
3. Comparaison de la mise en pratique des diffrentes techniques de coloration de formes
parasitaires de protozoaires .......................................................................................................................... 109
a) Temps de prparation ...................................................................................................................... 109
b) Cot des diffrentes techniques de coloration ......................................................................... 109
c) Facilit de lecture des diffrentes techniques ........................................................................... 110
11

4. Comparaison de diffrentes dures des tapes de la coloration de Ziehl-Neelsen modifie
111
IV. Discussion ..................................................................................................................................................... 113
A. Enqute sur les mthodes de dtections des protozoaires digestifs en France ........................ 113
B. Mthodologie ............................................................................................................................................... 116
C. Comparaison des 3 mthodes de coloration ....................................................................................... 118
1. Pour la recherche de C. parvum ........................................................................................................ 118
2. Pour la recherche de G. intestinalis .................................................................................................. 120
3. Pour la recherche dEimeria ............................................................................................................... 121
Conclusion gnrale ...................................................................................................................................................... 125
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................................................... 129
ANNEXES ....................................................................................................................................................................... 145
Annexe 1 : Les sites de prdilections, les priodes prpatentes des espces dEimeria chez les
bovins ............................................................................................................................................. 146
Annexe 2 : Les sites de prdilections et les priodes prpatentes des espces dEimeria chez les
ovins ............................................................................................................................................... 147
Annexe 3 : Les sites de prdilections et les priodes prpatentes des espces dEimeria chez les
caprins ............................................................................................................................................ 148
Annexe 4 : Schma et description de la morphologie des oocystes sporuls des espces dEimeria
prsentes chez les bovins ................................................................................................................ 149
prsentes chez les ovins .................................................................................................................. 151
prsentes chez les caprins ............................................................................................................... 153
Annexe 7 : Protocole de coloration par la mthode de Bailenger et Faraggi ................................. 155
Annexe 8 : Protocole de coloration par la mthode M.I.F. ............................................................ 156
Annexe 9 : Protocole de coloration de la technique dHeindenhain .............................................. 157
Annexe 10 : Protocole de la mthode de coloration de Trichrome de gomori-Weathley .............. 158
Annexe 11 : Protocole de la mthode de coloration au noir chlorazol de Kohn ............................ 159
Annexe 11 : Protocole de coloration par la mthode de Brooke et Goldman ................................ 160
Annexe 12 : Protocole de la mthode de coloration de Giemsa ..................................................... 161
Annexe 13 : Protocole de coloration au lugol ................................................................................ 162
Annexe 14 : Protocole de coloration au saccharose ....................................................................... 163
Annexe 15 : Protocole de coloration pour la mthode de Heine .................................................... 163
Annexe 16 : Protocole de la coloration ngative la nigrosine ..................................................... 164
12

Annexe 17 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifie par Henriksen et
Pohlenz ........................................................................................................................................... 165
Annexe 18 : Protocole de la technique de Ziehl-Neelsen modifie par Angus .............................. 166
Annexe 19 : Protocole de coloration de dimthylsulphoxyde-Ziehl-Neelsen ................................ 167
Annexe 20 : Protocole de coloration lauramine-fuchsine carbolique ........................................ 168
Annexe 21 : Protocole de coloration lauramine-phnol ............................................................. 169
Annexe 22 : Protocole de coloration la mpacrine ...................................................................... 170
Annexe 23 : Questionnaire envoy aux laboratoires ...................................................................... 171
Annexe 24 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifie choisie pour ltude
exprimentale ................................................................................................................................. 172

13

TABLE DES ILLUSTRATIONS

TABLE DES FIGURES

Figure 1 : Cycle parasitaire de Cryptosporidium parvum [Fayer et al. (1990)] ............................................ 22
Figure 2 : Cycle parasitaire du genre Eimeria.......................................................................................................... 25
Figure 3 : Paramtres cls de diagnostic morphologique dun oocyste de coccidie [Dorchies et al.
(2012)] .................................................................................................................................................................................. 26
Figure 4 : Cycle de Giardia intestinalis [ l'aide du site centers for Disease control and Prevention] ... 28
Figure 5 : Schmas dun trophozote et dun kyste de Giardia [Magne et al. (1996)] ................................ 29
Figure 6 : Schma dune tigette [Depierreux et al. (2001)] ................................................................................. 35
Figure 7 : Schma des tapes de la mthode de flottation [Beugnet (2000)] ................................................. 41
Figure 8 : Tubes aprs centrifugation lors dune mthode diphasique [OMS, 1997] .................................. 43
Figure 9 : Les trois tapes de ralisation dun frottis ............................................................................................. 45
Figure 10 : Rpartition des laboratoires dpartementaux ayant rpondu ........................................................ 83
Figure 11 : Part des laboratoires utilisant chaque colorant en routine ............................................................. 84
Figure 12 : Pourcentage dutilisation des colorants lors de recherche de C. parvum .................................. 85
Figure 13 : Tarifs de recherche de C. parvum pour des mthodes de colorations et pour des mthodes
immunologiques ................................................................................................................................................................ 86
Figure 14 : Pourcentage dutilisation des colorants lors de recherche spcifique de Giardia ................... 87
Figure 15 : Tarifs de recherche de kystes de giardia pour des mthodes de colorations et pour des
mthodes immunologiques ............................................................................................................................................ 87
Figure 16 : Critres de choix des laboratoires de leur mthode de coloration ............................................... 88
Figure 17 : Nombre dchantillons, dans chaque catgorie de semi-quantification de C. parvum, pour
les 4 mthodes de coloration ......................................................................................................................................... 91
Figure 18 : Nombre dchantillons, dans chaque catgorie de semi-quantification de kystes de giardia,
pour les 4 mthodes diagnostiques tudies ............................................................................................................. 96
Figure 19 : Nombre dchantillons dans chaque catgorie de quantit dEimeria pour les 4 mthodes
diagnostiques tudies ..................................................................................................................................................... 98
Figure 20 : Oocystes de C. parvum par la mthode de Ziehl-Neelsen modifie (objectif x40) ............... 99
Figure 21: Oocystes de C. parvum par dans une solution de saccharose (objectif x40) ......................... 100
Figure 22: Oocystes de C. parvum sur une lame colore par du lugol (objectif x40) .............................. 100
Figure 23 : Oocystes de C. parvum dans une solution de fuchsine (objectif x40) .................................... 101
Figure 24 : Kystes de giardia sur une lame non colore ( gauche) et dans une solution de saccharose
(objectif x40) ................................................................................................................................................................... 102
Figure 25 : Kystes de giardia colors par du lugol (objectif x40) .................................................................. 103
Figure 26 : Kystes de giardia et artefact colors par la mthode de Heine (objectif x40) ...................... 103
Figure 27 : Oocystes dEimeria photographis sur des lames non colores (objectif x40) ................... 105
Figure 28 : Oocystes dEimeria dans une solution de saccharose (objectif x40) ..................................... 106
Figure 29 : Oocystes dEimeria colors par le lugol (objectif x40) .............................................................. 107
Figure 30 : Oocystes dEimeria colors par la fuchsine (objectif x40) ....................................................... 108
14

TABLE DES TABLEAUX

Tableau I : Rsultats du nombre doocystes de Cryptosporidium parvum laide des 4 colorations .... 90
Tableau II : Rsultats du nombre doocystes de Cryptosporidium parvum laide des 4 colorations sur
des dilutions ........................................................................................................................................................................ 93
Tableau III: Rsultats du nombre de kystes de Giardia laide des 4 colorations ....................................... 95
Tableau IV: Rsultats du nombre doocystes dEimeria laide des 4 colorations ..................................... 97

15

TABLE DES ABREVIATIONS

ADN Acide dsoxyribonuclique
ARN Acide ribonuclique
CR
Corps rsiduel
C. parvum Cryptosporidium parvum
E. Eimeria
G. intestinalis Giardia intestinalis
LDA Laboratoire dpartemental danalyse
LVD Laboratoire vtrinaire dpartemental
MIF Merthiolate Iode Formol
PCR Raction de polymrase en chane
Z-N Ziehl-Neelsen

16

17

INTRODUCTION GENERALE

En mdecine vtrinaire, comme en mdecine humaine, les protozoaires digestifs sont
frquemment rencontrs. Ils ont une grande importance dun point de vue conomique et
sanitaire, par les signes cliniques provoqus mais aussi par leur aspect zoonotique important
pour certains.

Le diagnostic de protozoose digestive se fait souvent par coproscopie. Cest un acte
non invasif et le prlvement est facile raliser. De nombreux laboratoires sont qualifis
pour lanalyse des selles, des vtrinaires quips peuvent galement raliser cette analyse
directement au cabinet.
La coproscopie peut aussi tre utilise pour la ralisation de diagnostic dlevage dans
le but davoir un bilan de linfestation des protozoaires ainsi que des trmatodes et des
nmatodes.

Pour que cet examen puisse tre ralis en clientle, il faut que la technique utilise
soit rapide, demande peu de matriel, que les solutions ncessaires soient facile daccs et non
toxiques mais aussi que la ralisation et la lecture soit aise.

Pour la dtection des protozoaires digestifs, la principale difficult est la petite taille
des lments parasitaires. Ils sont donc parfois difficiles visualiser et peuvent tre facilement
confondus avec des dbris, des spores vgtales ou des levures. Il peut donc tre utile et
parfois indispensable dutiliser un colorant pour mettre en vidence ces lments parasitaires
dans les selles.

Dans un premier temps, les diffrentes tapes de la coproscopie, de la ralisation du
prlvement jusqu lobservation microscopique, vont tre dveloppes. Les lments
parasitaires de protozoaires et les diffrentes techniques permettant leur mise en vidence
vont tre cits et les mthodes de coloration permettant la mise en vidence de ces lments
parasitaires vont tre dcrites.
Dans un second temps, une enqute sur les mthodes de diagnostic des protozoaires en
laboratoires vtrinaires dpartementaux franais ayant t ralise pour ce travail sera
18

tudie permettant ainsi davoir un point de vue sur les diffrentes mthodes utilises
actuellement. Puis, trois mthodes de colorations rapides testes sur trois genres de
protozoaires majeurs chez les ruminants vont tre compares sur diffrents points de la
sensibilit leur mise en pratique.

19

PARTIE I : PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

20

INTRODUCTION

Le diagnostic de suspicion des infections par les protozoaires digestifs se fait de faon
clinique mais il est ncessaire de faire une analyse en laboratoire pour avoir le diagnostic de
certitude. Lanalyse de la prsence des protozoaires dans les selles est la recherche la plus
courante. Pour que le diagnostic soit correct, il faut que toutes les tapes de ces analyses se
droulent convenablement, du prlvement au choix de la technique utilise et sa ralisation.

Aujourdhui de nombreuses mthodes de diagnostic des protozoaires dans les selles sont
dveloppes. Dans cette partie bibliographique, il va tout dabord tre question des
protozoaires les plus couramment rencontrs en coproscopie chez les jeunes ruminants ainsi
que des diffrents types de techniques dveloppes pour la recherche de ces protozoaires. Par
la suite, les modes de prlvement et les tapes de prparation de lchantillon de selles en
vue dune coproscopie vont tre dtaills. En dernier lieu, les nombreuses techniques de
coloration de matire fcale pour la recherche des formes vgtatives et kystiques des
protozoaires vont tre exposes.

21

I. LES PROTOZOAIRES ET LES DIFFERENTS TESTS DIAGNOSTIQUES
EN COPROSCOPIE

A. LES PRINCIPAUX PROTOZOAIRES DETECTABLES EN COPROSCOPIE

Parmi les nombreux parasites dtects lors dune coproscopie chez les ruminants, nous
allons nous intresser plus spcialement aux protozoaires. Diffrents protozoaires sont
retrouvs dans les fces, sous une forme kystique ou vgtative.

1. Cryptosporidium parvum

Cryptosporidium parvum est un parasite rencontr frquemment chez lhomme et
lanimal. Il est reconnu depuis plus de 20 ans comme un agent majeur de diarrhe nonatale
chez les ruminants et donc associ des pertes conomiques importantes [Naciri et al.
(2000)]. Il a t identifi pour la premire fois par Tyzzer en 1907 [OHara et Chen (2011)].

a) Taxonomie
Ce parasite appartient au groupe des Sporozoaires, au phylum des Apicomplexa, il fait
partie de la classe des Coccidea et de lordre Eimeriida.
Le genre Cryptosporidium compte une vingtaine despces, 3 sont prsentes chez les
ruminants : C. andersoni, C. bovis et C. parvum, cette dernire est lespce majeure [Bowman
(2003), Fayer et al. (2005), Lindsat et al. (2000)]. C. parvum nest pas spcifique dune espce
(elle touche un grand nombre despces animales ainsi que lHomme) et sa rpartition est
mondiale.

b) Cycle
C. parvum est un parasite monoxne et son cycle est trs rapide, la priode prpatente est
de 4 jours.
Aprs lingestion doocystes par un hte, les 4 sporozotes contenus dans loocyste sont
librs au niveau de la bordure en brosse et vont sattacher aux cellules pithliales
22

intestinales. Le sporozote passe alors en position intracellulaire et devient un trophozote. Un
trophozote va donner plusieurs mrontes. Il existe 2 types de mrontes, les mrontes de type I
qui vont infecter dautres cellules pithliales (auto-infection), et les mrontes de type II qui
vont donner des macrogamontes et des microgamontes. La fusion dun microgamonte avec un
macrogamonte donne un zygote qui devient un oocyste. Les oocystes sont alors mis dans la
lumire intestinale. Deux types doocystes sont mis dans la lumire, des oocystes paroi fine
dont lexcystation se fait dans le tube digestif de lanimal (ce qui participe un phnomne
dauto-infection) et des oocystes paroi paisse qui sont une structure de rsistance dans le
milieu extrieur [OHandley et Olson (2006)].

Figure 1 : Cycle parasitaire de Cryptosporidium parvum [Fayer et al. (1990)]

c) Morphologie
Les oocystes de C. parvum sont difficiles voir dans les fces du fait de leur petite
taille et de leur absence de couleur.
Ils sont de forme ovode sphrode. Ils mesurent environ 5 m de longueur pour 4,5
m de largeur. La paroi des oocystes est paisse ce qui lui procure une grande rsistance dans
le milieu extrieur. Les 4 sporozotes, en demi-lune, situs dans les oocystes sont
difficilement discernables en microscopie optique, ils donnent au contenu des oocystes un
aspect granuleux [Beugnet et al. (2004)].

23

d) Pathognie et signes cliniques
Chez les ruminants, la prsence de ces parasites au niveau de la bordure en brosse
provoque des modifications morphologiques qui induisent une malabsorption et une mauvaise
digestion des aliments. Le mcanisme nest pas trs bien connu, mais la pntration du lactose
non digr dans le gros intestin favoriserait la croissance bactrienne et la formation dacides
gras libres volatiles. Cette accumulation de nutriments hypertrophiques non absorbs dans la
lumire du gros intestin provoquerait la diarrhe.
La diarrhe est galement due un phnomne dhyperscrtion dans la lumire
intestinale.

Les ruminants atteints de cryptosporidiose clinique, sont gs de 5 jours 3 semaines.
Les premiers signes sont souvent une anorexie et une apathie, la diarrhe survient
gnralement le lendemain. Les animaux prsentent alors une diarrhe aige aqueuse plutt
jauntre qui entraine un tat de dshydratation plus ou moins svre. En moyenne la dure de
la diarrhe est de 6 10 jours. Certains auteurs signalent que les cryptosporidies seules
nengendrent pas de diarrhe, celle-ci ne survient seulement que lorsque dautres agents
pathognes sont associs C. parvum [Naciri et al. (1999)].
Chez certains animaux, linfection par C. parvum provoquerait uniquement un
amaigrissement [OHandley et Olson (2006)].
Chez les chevreaux, la cryptosporidiose engendre une trs forte morbidit et la
mortalit est plus leve que chez les veaux et les agneaux.

2. Eimeria spp.

Les parasites du genre Eimeria sont responsables de la coccidiose. Cest une maladie
parasitaire trs frquente chez de nombreuses espces animales et sa rpartition est mondiale.

Son influence conomique est trs importante du fait de sa prvalence et de sa
morbidit. Une enqute ralise en 2006, montre que sur 10 levages tudis dans lAllier,
tous prsentent au moins 4 veaux excrteurs [Richard et al. (2006)]. En Vende, une autre
tude a t ralise sur des levages laitiers, 14 levages sur 15 prsentent des veaux
excrteurs [Denis et al. (2008)]. Limportance conomique de cette maladie est due aux pertes
24

occasionnes lors de coccidiose clinique chez les jeunes ruminants, mais galement lors de
coccidiose sub-clinique engendrant des retards de croissance [Chartier (2002)].

a) Taxonomie
Le genre Eimeria fait partie du phylum des Apicomplexa, et de lordre des Eimeriida
tout comme le genre Cryptosporidium.

Chez les bovins, il existe au moins 13 espces dEimeria, 11 sont retrouves chez les
ovins et 9 chez les caprins [Taylor et al. (2007)]. Chaque espce dEimeria prsente une
spcificit dhte trs stricte.
Toutes ces espces ne sont pas pathognes. Les espces E. zuernii, E. bovis sont les
plus pathognes chez les bovins [Navetat et al. (1996)], E. alabamensis lest galement. De
nombreuses espces de coccidies ne le sont pas comme E. auburnensis, E. brasiliensis, E.
bukidnonensis, E. canadensis, E. cylindrica, E. ellipsoidalis, E. pellita, E. subspherica et E.
wyomingensis.

Chez les ovins, les espces E. crandallis et E. ovinoidalis sont hautement pathognes
alors que les autres ne provoquent aucun signe clinique chez les agneaux.

Chez les caprins parmi les 9 espces de coccidies, 4 sont pathognes : E. caprina, E.
ninakohlyakimovae, E. christenseni et E. hirci.

b) Cycle
Le cycle est identique pour toutes les coccidies, seul le site de prdilection des
parasites change selon les espces dEimeria.
Suite lingestion doocystes sporuls, les sporozotes sont librs au niveau du
jjunum sous laction de la bile et de la trypsine. Ils vont alors pntrer dans les cellules
pithliales dans des sites de prdilection au niveau de lintestin ; ces sites sont diffrents
selon lespce dEimeria (voir annexes 1, 2 et 3). Cest ce niveau que se droule la
mrogonie (ou schizogonie), les mrozotes (ou schizozotes) alors forms font clater les
cellules dans lesquelles ils se trouvent et infectent dautres cellules voisines. Ces mrozotes
vont alors subir la gamogonie ce qui aboutit la formation des gamtes, puis la fusion de
25

ceux-ci donne un zygote et par la suite un oocyste non sporul. Loocyste est limin dans la
lumire du tube digestif donc dans les selles suite lclatement de la cellule dans laquelle il
est situ
La dure des cycles est diffrente selon lespce dEimeria, les priodes prpatentes
varient de 10 30 jours, (voir annexes 1, 2 et 3).

Dans certaines conditions dhumidit et de temprature, les oocystes sporulent, cest la
sporogonie, les oocystes contiennent alors 4 sporocystes contenant chacun 2 sporozotes.

Figure 2 : Cycle parasitaire du genre Eimeria

c) Morphologie
La morphologie des oocystes varie selon les espces ce qui permet leur diffrenciation.
Les oocystes coccidiens sont subsphriques. Leur taille est en gnral suprieure 10 m de
longueur pour 10 m de largeur [Beugnet et al. (2004)], elle nexcde pas 50 m de longueur
et 40 m de largeur [Taylor et al. (2007)]. Ils sont entours par une paroi relativement paisse.

26

Figure 3 : Paramtres cls de diagnostic morphologique dun oocyste de coccidie [Dorchies
et al. (2012)]
Les oocystes sporuls sont composs de 8 sporozotes. Etant donn labsence de
pouvoir pathogne de nombreuses espces de coccidies, il est utile de dterminer lespce
prsente, pour cela il existe des cls de diagnostic morphologique (voir annexe 4, 5 et 6).
Lidentification est possible grce la taille, la couleur, la forme, la prsence ou non de
micropyle ou de calotte micropylaire, ainsi que la forme des sporocystes dans les oocystes
sporuls [Daugcshies et Ditmtmar (2007)].

La destruction des cellules pithliales par les coccidies engendre souvent de la
diarrhe chez les animaux atteints.

En cas de faible infestation, seule une forme subclinique est prsente, les animaux
prsentent alors un retard de croissance. Les formes chroniques peuvent provoquer de
lanorexie et prdisposent aux infections secondaires. Linfection par les coccidies produit
une rponse immunitaire cellulaire et humorale protectrice.

Lors de plus forte infestation, les animaux ont une diarrhe profuse hmorragique avec
des preintes. Ils prsentent galement une perte dapptit, ils deviennent plus faibles et se
dshydratent. Il existe une forme nerveuse relativement frquente chez les veaux
lengraissement et plus rare chez les petits ruminants. Les animaux prsentent des
27

trmulations musculaires, de lincoordination, des convulsions et des pertes dquilibres
[Adjou et al. (2006)].

Les signes cliniques engendrs par les diffrentes espces de coccidies sont lgrement
diffrents. Lors dune infection par E. zuernii, les veaux prsentent une diarrhe hmorragique
noirtre avec du mucus, des preintes, de lanmie, ainsi que des troubles nerveux. Pour E.
bovis, la diarrhe est plus claire et nest pas hmorragique [Institut de llevage (2000)].

Les animaux atteints de coccidiose sont les jeunes ruminants, gs de 3 8 semaines
environ.

3. Giardia intestinalis

Ce parasite a t observ pour la premire fois en 1681 par Antony Van Leeuwenhoek
dans ses propres selles diarrhiques [Burke (1977)]. Il a t reconnu comme cause de diarrhe
chez lhomme depuis 1892. Tout comme C. parvum, il est de plus en plus tudi depuis les
annes 80 en raison de son potentiel zoonotique. En effet, il provoque de la diarrhe chez des
personnes immunodficientes atteintes par le virus de limmunodficience humaine.

a) Taxonomie
Le genre Giardia fait partie des Flagells, il appartient au phylum des
Sarcomastigophora, au subphylum Mastigophora, la classe des Zoomastigophora et lordre
des Diplomonadida [Magne et al. (1996)]. Lespce principale de ce genre est Giardia
intestinalis, elle est galement appele G. lamblia et G. duodenalis.
Ce parasite est retrouv chez de nombreuses espces de mammifres dans le monde
[Taylor et Webster (1998)].

b) Cycle
Suite lingestion dun kyste, des trophozotes sont librs dans le tube digestif de
lanimal hte. Ces trophozotes subissent alors une multiplication asexue par division binaire
et colonisent alors lintestin grle. Les trophozotes adhrent lpithlium grce un disque
28

ventral. Chez les ruminants, on retrouve les trophozotes sur toute la longueur de lintestin
mais ils sont plus nombreux au niveau du jjunum.
Puis les trophozotes senkystent et sont limins avec les fces [OHandley et Olson
(2006)].
La priode prpatente est en moyenne de 14 jours [Jokipii et Jokipii (1977)].

Figure 4 : Cycle de Giardia intestinalis [ l'aide du site centers for Disease control and
Prevention]

c) Morphologie
Le trophozote est piriforme. De face, il mesure 10 20 m de long sur 6 10 m de
large, on peut distinguer 2 noyaux lintrieur. De profil, il prsente une dpression au niveau
de la face ventrale : cest un disque dadhsion, il se prolonge par une extrmit effile et
quatre paires de flagelles (2 paires en position antrolatrale, une en position ventrale et une
paire postrieure). La face dorsale est convexe.

Les kystes sont ovodes ou elliptiques, ils mesurent 10 13 m de long sur 8 9 m
de large. Ils possdent 2 4 noyaux et contiennent des flagelles groups en un faisceau
rfringent dans laxe longitudinal [Magne et al. (1996)].

29

Figure 5 : Schmas dun trophozote et dun kyste de Giardia [Magne et al. (1996)]

La pathognie de G. intestinalis est discute, certains chercheurs comme Bjrkman et
Huentink ont montr que ce ntait pas une cause de diarrhe chez les ruminants [Bjrkman et
al. (2003), Huentink et al. (2001)]. En effet, dans une tude effectue en Vende, sur les 20
levages caprins tudis, des kystes de giardia ont t retrouvs dans toutes les fermes, il a
aussi t montr quil ny avait pas de relation entre la quantit de kystes excrts et une
diarrhe survenue chez les chevreaux en post-sevrage [Castro-Hermida et al. (2005)].

Des articles ont dcrit quil existait un lien entre linfection par des giardias et un
affaiblissement voir lapparition dune lgre diarrhe [Olson et al. (1997)]. Pour finir
certaines tudes ont mis en vidence un lien direct entre lexcrtion de Giardia dans les selles
et la prsence de diarrhe chez des veaux de moins de 3 mois [Xiao et al. (1993), OHandley
et al. (1999), St Jean et al. (1987)].

La plupart du temps laffection est asymptomatique. Cependant, lorsquelle est
symptomatique, elle est plutt chronique et provoque de la diarrhe, une perte de poids ainsi
quun affaiblissement [Taylor et Webster (1998)].
Lors de giardiose la diarrhe est muqueuse et fluide, lapptit et la prise de boisson
sont conservs [Pitel et al. (2005)].
La giardiose est considre par certains comme ntant pas une cause majeure de
diarrhe chez les ruminants et ayant un impact conomique faible [OHandley et Olson
(2006)].

30

4. Autres protozoaires

Il existe dautres protozoaires chez les ruminants, ceux-ci sont retrouvs de faon
moins frquente que les trois premiers genres tudis.

Le parasite Blastocystis hominis est responsable de diarrhe chez lhomme [Zierdt
(1991), Taylor et Webster (1998)], il est galement retrouv chez les ruminants. Sa taxonomie
est controverse, il a parfois t plac parmi les protozoaires, notamment par les travaux de
Zierdt en 1967. Grce aux avances en biologie molculaire, de plus rcentes tudes ont
rapproch le genre Blastocystis des Stramnopiles [cits par Tan (2004)].

Buxtonella sulcata est un protozoaire appartenant au phylum ciliophora [Taylor et al.
(2007)]. Ce parasite est un pathogne incertain, il pourrait tre la cause de colites ulcratives
et de diarrhes chez les bovins.

Il possde une forme vgtative, celle-ci est cilie, et se multiplie dans le colon. Elle
prsente 2 noyaux : un macronucleus rniforme et un micronucleus. Des vacuoles digestives
sont galement visibles. Sa taille est denviron 60 138 m de longueur pour 46 100 m de
large. Cette forme vgtative possde un grand nombre de cils courts sur tout son pourtour.
Comme pour le genre Giardia, la reproduction se fait par fission binaire.

Dans les matires fcales, la forme retrouve est la forme kystique. Les kystes sont de
forme ovale ronde et mesurent de 55 130 m, mais la taille des kystes diminue dans les
jours suivant lexcrtion. Ils sont de couleur jauntre et prsentent une double membrane. On
retrouve les deux noyaux prsents dans la forme vgtative mais le micronucleus est difficile
observer vu sa localisation dans la concavit du macronucleus [Dorchies et al. (2012)].

31

A retenir :
Les genres de protozoaires les plus frquents chez les jeunes ruminants sont
Cryptosporidium, Giardia et Eimeria.
Les genres Giardia et Cryptosporidium ont une grande importance par leur potentiel
zoonotique, ainsi que par leurs graves consquences sur les jeunes animaux ce qui provoque
de grandes pertes conomiques. La pathognie du genre Giardia reste cependant discute.
Ces protozoaires digestifs sont prsents chez de trs jeunes ruminants, partir de 7 jours pour
C. parvum, tandis quon ne retrouve le genre Eimeria qu partir de 3 semaines.
Pour le genre Eimeria, seul quelques espces sont pathognes, il est donc important de faire
un diagnostic despce lors de la prsence de coccidies dans les matires fcales.

Ces diffrents protozoaires pathognes chez les jeunes ruminants doivent tre
diagnostiqus afin dadministrer un traitement adapt aux animaux et de mettre en place des
mesures sanitaires pour liminer ou limiter ce problme dans llevage.

32

B. LES DIFFERENTS TESTS DIAGNOSTIQUES REALISABLES SUR UN ECHANTILLON
DE SELLES

Avant tout examen sur les selles, un examen macroscopique doit tre ralis. La
couleur, la consistance, la prsence ou non de mucus ou de vers de grande taille sont notes.

1. Techniques microscopiques

Lors dun examen coproscopique, il est important de faire systmatiquement un
examen direct des fces puis un examen aprs concentration et/ou coloration.

a) Examen direct des selles
Lexamen direct des selles est la mthode la plus simple et rapide. Elle permet
dtudier les caractres de mobilit des formes vgtatives de protozoaires lorsque les fces
sont fraiches (moins de 3 heures environ).
Une petite quantit de selles est mlange du srum physiologique sur une lame et
recouverte dune lamelle. Toute la lamelle est parcourue faible grossissement. Si un lment
est observ, un plus fort grossissement est alors utilis pour lidentifier. Par la suite, les zones
les plus minces du frottis sont galement observes au plus fort grossissement (objectif x 40).
Cette mthode a de nombreux avantages, elle est trs rapide et demande un minimum
dquipement. Une petite quantit de selles est suffisante, mais lexamen est par consquent
moins reprsentatif. La lecture peut parfois tre difficile tant donn la prsence de dbris
fcaux sur la lame [Hendrix (1998)].

b) Examen des selles aprs coloration
Lexamen microscopique des selles ncessite parfois une coloration surtout lors de
recherche de protozoaires dont la petite taille ne facilite pas leur observation. Les colorations
peuvent tre ralises aprs concentration ou non. Diffrentes colorations permettent la mise
en vidence des protozoaires digestifs dans leurs formes vgtatives ou kystiques. Les
colorations seront dtailles par la suite.

33

2. Techniques immunologiques

Les techniques immunologiques se sont vite dveloppes car celles-ci sont rapides et
faciles raliser en laboratoire et en clientle (immunochromatographie). Contrairement aux
colorations, les rsultats ne sont pas dpendants de loprateur [Diaz-Lee et al. (2011)].

a) Immunofluorescence directe
Limmunofluorescence directe est une technique de coloration utilisant des anticorps
monoclonaux, dirigs contre le parasite, auxquels est li un colorant fluorescent.
Il existe des kits commercialiss pour la dtection de Cryptosporidium et/ou de
Giardia [Tangtrongsup et Scorza (2010), Scorza et Tangtrongsup (2010)]. Une tape de
sdimentation ou de flottation est recommande avant lutilisation de ces kits pour concentrer
les parasites [Kehl et al. (1995)].

Cette technique est trs spcifique et permet lobtention de rsultats clairs et non
ambigus contrairement certaines colorations classiques [Baron et al. (1989), Alles et al.
(1995)]. En 1996, une tude ralise sur la dtection de Cryptosporidium dans des fces de
bovins et de porcs, a montr que limmunofluorescence est plus sensible quune mthode de
coloration Ziehl-Neelsen modifie [Qulez et al. (1996)].

Limmunofluorescence est trs facile lire mais ncessite un microscope
fluorescence. Elle nest donc pas ralisable dans tous les laboratoires ni dans une clinique
vtrinaire, mais elle est rapide et peu onreuse. Dans une tude, il a t montr quelle
prenait moins de temps aux techniciens quune coloration de Ziehl-Neelsen modifie par
Kinyoun ou quun test ELISA. De plus, le cot du test est infrieur celui des deux tests
ELISA tudis mais suprieur une coloration [Kehl et al. (1995)]. Une autre tude montre,
au contraire, que cette technique est longue lorsque la concentration de parasite est faible, et
quil semble judicieux de la coupler avec de la cytomtrie de flux permettant danalyser un
grand nombre dchantillons en peu de temps [Dixon et al. (1997)].

34

b) ELISA
Diffrents kits ELISA pour le diagnostic de C. parvum et G. intestinalis sont
commercialiss.

Certains tests ELISA pour la dtection de Giardia dtectent directement les antignes
de la paroi des lments parasitaires de Giardia et dautres, comme Prospect Giardia
Microplate Assay, permettent la dtection dune protine, la protine GSA 65. Cette protine
est produite par le parasite lors de sa multiplication et elle est mise dans les selles
indpendamment de lmission de kystes ou de trophozotes [Papini et Cardini (2006)].
Ce test a t valu comme tant moins cher que la recherche directe des parasites
dans les selles et que limmunofluorescence [Aldeen et al. (1995)]. Ces tests ELISA sont
rapides, sensibles et spcifiques et peuvent donc tre trs utiles pour confirmer le diagnostic
de giardiose, [Adiss et al. (1991)].

Pour les tests permettant la dtection de Cryptosporidium parvum, ce sont directement
les antignes de surface des oocystes qui sont recherchs. Des anticorps monoclonaux dirigs
contre ces antignes sont prsents au fond des puits, une dilution de selles est place dans ces
puits. Aprs incubation et rinage, des anticorps de dtection sont ajouts, puis un conjugu et
pour finir un substrat (avec un temps de lavage entre chaque tape) [Depierreux et al. (2001)].
Le rsultat peut alors tre lu.

Les tests ELISA permettent la confirmation dune suspicion de giardiose ou de
cryptosporidiose mme lorsque les parasites sont peu nombreux. Ils peuvent tre raliss par
un technicien non spcialis en parasitologie [Gaafar (2011)].

c) Immunochromatographie
Divers tests rapides existent, Certains ne recherchent quun seul lment parasitaire C.
parvum ou G. intestinalis. Dautres tests recherchent de faon combine Cryptosporidium et
Giardia ou C. parvum avec les virus rotavirus et coronavirus ainsi que la bactrie Escherichia
coli K99. Il nexiste pas de test immunochromatographique permettant la dtection des
coccidies.

35

Ces tests utilisent des anticorps monoclonaux dirigs contre des protines spcifiques
de la membrane ou de la paroi des oocystes, des kystes et des trophozotes. Pour gnrer un
signal visuel, dans certains tests, des microbilles de latex colores sont lies aux anticorps
monoclonaux [Papini et Cardini (2006)].

La plupart du temps ces tests sont sous forme de tigettes ou de plaquettes. Les tigettes
sont tremper dans lchantillon de selles puis mettre dans une solution tampon pour faire
migrer les antignes. Lors de tests sous forme de plaquettes [thermo scientific], il faut alors
effectuer une dilution des selles dans une solution, puis mettre quelques gouttes du mlange
dans les diffrents puits prsents et ajouter une solution tampon [Depierreux et al. (2001)]. La
lecture se fait facilement par lapparition ou non dun trait color dans une zone prcise.

Figure 6 : Schma dune tigette [Depierreux et al. (2001)]

Les diffrents tests rapides dimmunochromatographie prsentent des sensibilits et
des spcificits suprieures 94% [Garcia et Shimizu (1997)]. Par exemple pour le FASTest
Crypto-Giardia Strip du laboratoire allemand Megacor, la Sensibilit est de 96,7% pour C.
parvum et 97,2% pour G. duodenalis et la spcificit de 99,9% pour les deux parasites,
[Megacor]. Pour le kit dtectant les antignes de Cryptosporidium du laboratoire Kitvia, les
tudes montrent une sensibilit de 98% et une spcificit de 99% [KITVIA].

Cette technique est trs rapide et ne ncessite pas un technicien spcialis pour sa
ralisation. Aucun matriel supplmentaire nest ncessaire pour ces tests et la quantit de
selles ncessaire est trs faible [Gaafar (2011)].

36

3. Technique de biologie molculaire : PCR

La mthode de PCR (raction de polymrisation en chaine) amplifie lADN ou lARN
de certains protozoaires ce qui permet leur dtection. Il existe des kits de PCR commercialiss
pour la dtection de Cryptosporidium parvum ou Giardia intestinalis. Dans certains kits de
dtection de C. parvum, lARN amplifi nest pas prsent chez tous les gnotypes de C.
parvum (infectant les humains, les bovins), ce qui peut limiter la dtection de ce
protozoaire [Higgins et al. (2001)].

Cette technique de biologie molculaire une sensibilit quivalente aux mthodes
immunologiques pour la dtection de C. parvum, ces procds ne sont donc pas un apport
supplmentaire pour des examens coprologiques de routine [Bialek et al. (2002)]. La
dtection dacides nucliques libres ou doocystes non viables dans les fces, la contamination
des selles au moment du prlvement ou dans le laboratoire peuvent aboutir des faux
positifs [Fayer et al. (2000)].

En raison du cot de lanalyse, du temps de manipulation ainsi que de la technicit
ncessaire, les PCR sont essentiellement ralises pour la recherche [Paul et al. (2009)]. Elles
sont utilises pour lanalyse de selles humaines et animales mais galement pour la recherche
des protozoaires dans leau (Giardia, Cryptosporidium ou Eimeria). Elles permettent aussi la
ralisation danalyses gntiques des diverses espces et gnotypes de ces protozoaires [De
Waal (2012), Kawahara et al. (2010), Bertrand et al. (2004)].

A retenir :
De nombreuses techniques sont disponibles pour la dtection des protozoaires digetifs, les
techniques de PCR, dELISA et dimmunofluorescence ncessitent dtre effectues en
laboratoire. Les techniques dexamen microscopique et dimmunochromatographie peuvent
tre facilement ralises en laboratoire et dans les cabinets et cliniques vtrinaires.

Les diffrentes techniques permettant le diagnostic des protozoaires partir des selles
ncessitent une bonne collecte et une prparation de lchantillon. Pour lexamen
microscopique des matires fcales, il y a plusieurs tapes de prparation de lchantillon en
vue danalyse.
37

II. PREPARATION DE LECHANTILLON A LEXAMEN MICROSCOPIQUE

A. LES MODALITES DE PRELEVEMENT ET CONSERVATION DE LECHANTILLON

1. Techniques de prlvements

Le prlvement de selles est facile raliser, mais il est ncessaire de suivre certaines
rgles pour avoir un chantillon de bonne qualit.
Il est important de prendre des fces fraches pour avoir des lments parasitaires qui
nont pas volu et pour pouvoir observer des formes vgtatives de Giardia. Pour cela, il est
possible de stimuler la dfcation chez le veau ( laide dun thermomtre par exemple) ou
dutiliser une curette pour les chevreaux [Polack et al. (1983)]. Il faut viter de prendre des
fces sur le sol car celles-ci peuvent tre contamines par des nmatodes libres ou des larves
de diptres [Hendrix (1998)].

Si lon dsire faire un bilan parasitaire sur llevage, il est possible de faire un mlange
de 7 10 prlvements individuels pour diminuer le cot de lanalyse pour lleveur [Chartier
(2002)].

Il est recommand de prendre 10 20 g de selles par chantillon. Pour certaines
recherches de parasites, dont lexcrtion est intermittente comme pour la recherche de
cryptosporidies, il est conseill de faire plusieurs prlvements sur quelques jours.

Les selles doivent tre conditionnes dans un pot prlvement transparent avec un
couvercle, ferm hermtiquement, qui doit tre correctement identifi. La date du
prlvement, lidentification de lanimal, le nom de llevage et dautres informations comme
lge de lanimal et les symptmes de celui-ci doivent tre mentionnes sur le pot ou sur un
document daccompagnement.

38

2. Conservation des chantillons

Il est important de faire parvenir les chantillons au laboratoire le plus rapidement
possible. Lanalyse de fces fraiches (moins de trois heures) permet lobservation des formes
vgtatives de protozoaires qui sont dtruites dans le milieu extrieur. Elles sont alors trs
mobiles et facilement observables.
Mais ils peuvent galement tre conservs de diffrentes faons lorsquil est
impossible de faire parvenir lchantillon trs rapidement. Les chantillons, une fois prlevs
et conditionns dans des flacons hermtiques, peuvent se conserver plusieurs mois au
rfrigrateur une temprature de 4C.

Les prlvements peuvent galement tre conservs temprature ambiante dans du
bichromate de potassium 2,5% (il faut alors mettre 2 volumes de solution pour 1 volume de
fces). Les chantillons se conservent alors temprature ambiante pendant 120 jours
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].

Leau formole permet la conservation des ufs dhelminthes et des kystes de
protozoaires dans les selles mais les kystes de protozoaires perdent leur rfringence et les
noyaux se colorent plus difficilement. On utilise de leau formole 5% pour des selles
fermes et 10% pour des selles plus pteuses [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Si lon
utilise une plus grande quantit de formol cela entraine la destruction des kystes de giardia.

Une fois lchantillon correctement prlev et conserv au laboratoire, les
manipulations pour le prparer lexamen microscopique peuvent tre ralises.

39

B. MATERIEL NECESSAIRE A LA REALISATION DUN EXAMEN MICROSCOPIQUE
DES SELLES

Lexamen microscopique des selles ncessite peu de matriel.
Pour cet examen, il est ncessaire de disposer, au minimum, dun microscope optique
avec des objectifs allant de x4 x100 immersion (le plus souvent avec des objectifs x4, x10,
x40 et x100 immersion) [Beugnet et al. (2004)]. Un clairage classique est suffisant, mais
parfois le contraste de phase permet davoir une vision diffrente.

En ce qui concerne la verrerie, des lames porte-objet et des lamelles sont ncessaires.
Pour des mthodes de concentration il est ncessaire davoir un tamis ou une passoire th,
des verres pied, des pipettes pasteur, des agitateurs et des tubes [Rousset (1993)].

Pour acclrer certaines mthodes de concentration dans des liquides de flottation, une
centrifugeuse peut tre utilise. Il faut donc avoir des tubes de centrifugation correspondants.
Pour les techniques de coloration du matriel supplmentaire sera ncessaire pour la
ralisation des colorations (colorants, bcher ou flacons ferms parfois opaques). Certaines
colorations ncessitent un microscope fluorescence avec un filtre dfini.

40

C. METHODES DE CONCENTRATION DES PARASITES

Pour augmenter la sensibilit des tests, il est utile de concentrer les parasites dun
grand chantillon dans un petit volume. Diffrentes mthodes permettent la concentration des
protozoaires. La concentration permet galement de limiter les dbris fcaux sur le frottis.

1. Mthodes physiques

Deux types de mthodes physiques augmentent la quantit de parasites dans le frottis,
la mthode par flottation (ou flotaison) et la mthode par sdimentation. Les mthodes
physiques sont bases sur les diffrences de poids existant entre les parasites (ufs, kystes,
larves) et les dbris.

a) Concentration par flottation
La mthode de concentration par flottation repose sur la diffrence de densit entre les
ufs et le liquide. La densit des ufs est de 1,1 1,2. Pour condenser les ufs la surface
du liquide celui-ci doit avoir une densit suprieure celle des ufs [Hendrix (1998)].
Diffrents liquides de flottation sont utilisables, leurs densits sont diffrentes et varient de
1,18 1,44.

La procdure des techniques de flottation consiste mlanger une petite quantit de
fces dans le liquide de flottation choisi, dhomogniser la solution, puis de filtrer le mlange
dans un tamis (par exemple une petite passoire th). Un tube est rempli du mlange jusqu
ras bord et une lamelle est place sur le tube. Au bout dune dizaine de minutes environ, les
ufs sont remonts sur la lamelle. Une centrifugation est possible pour acclrer cette tape
[Beugnet (2000), Beugnet et al. (2004)].

41

Figure 7 : Schma des tapes de la mthode de flottation [Beugnet (2000)]

Le liquide le plus employ et recommand pour la concentration des oocystes de
Cryptosporidium est une solution de saccharose ou solution de Sheather. Cette technique est
galement appele technique dAnderson [Boufassa-Ouzrout et al. (1986), Mc Nabb et al.
(1985)]. Cette solution permet de runir la majorit des oocystes la surface du liquide et
permet une bonne purification du surnageant en liminant les levures et les oocystes
dgnrs et non viables [Kar et al. (2011)]. Cette technique permet la concentration et la
coloration des oocystes, mais le prlvement ne peut tre conserv longtemps car celle-ci
dforme les oocystes rapidement (une heure environ) [Broussard (2003)]. Une centrifugation
peut tre utile pour cette technique pour diminuer le temps de flottation car cette solution est
relativement paisse.

Les liquides de flottation couramment utiliss en coproscopie sont : le sulfate de
magnsium dont la densit est de 1,28 et le sulfate de zinc (d=1,18 1,39). Ces liquides sont
trs souvent employs car ils ncessitent peu de matriel.
Le sulfate de zinc est dune efficacit presque quivalente au saccharose pour
lensemble des ufs et kystes, mais il est considr comme idal pour la concentration des
42

kystes de giardia selon certains auteurs [Broussard (2003), Hendrix (1998)], car il est le plus
efficace pour leur concentration et ne provoque pas de dformation de ceux-ci.

Une solution base de NaCl (d=1,21) peut permettre de concentrer les parasites la
surface. Une tude a montr que cette solution est une des plus efficaces pour concentrer les
oocystes de Cryptosporidium parvum lorsquils sont prsents en faible quantit [Kuczynska et
Shelton (1999)]. Cependant, ce liquide est trs corrosif pour le matriel du laboratoire et
dforme les ufs dhelminthes, il forme galement des cristaux sur la lame (Hendrix, 1998).

Le iodo-mercurate de potassium (d=1,44) est un liquide de flottation qui tait utilis de
faon courante en coproscopie, mais ce liquide est trs polluant et corrosif. Il ncessite donc
des mesures de protection et de rcupration [Beugnet (2000), Golvan et Ambroise-Thomas
(1984)].

b) Concentration par sdimentation
Contrairement aux mthodes de flottation, la sdimentation utilise des liquides dont la
densit est infrieure celle des lments parasitaires mais suprieure celle des dbris.
Les mthodes de sdimentation sont moins ralises en routine que les mthodes de
flottation, car celles-ci demandent plus de temps et de nombreuses manipulations [Kuczynska
et Shelton (1999)].

Les techniques de sdimentation ne donnent pas un rsultat aussi clair que la
flottation, il y a souvent plus de dbris. Ces techniques ne sont pas efficaces pour la mise en
vidence des protozoaires digestifs sous leurs formes vgtatives comme kystiques [Golvan et
Ambroise-Thomas (1984)].

2. Mthodes diphasiques

Le principe de la mthode diphasique est de mettre lchantillon de selles en prsence
de deux phases non miscibles, une phase aqueuse et une phase organique (ther). Toutes les
mthodes diphasiques drivent de celle dcrite par Telemann en 1908. La concentration des
lments parasitaires dans le culot est due laction dissolvante de lther et la mise en jeu
43

des deux phases non miscibles qui ralisent pour les lments fcaux un coefficient de partage
dont la valeur nest pas fixe et dpend de sa balance hydrophile/lipophile [Anonyme].

Pour raliser cette technique, les selles sont mlanges avec une solution dtermine
puis le mlange est agit avec de lther, le tout est centrifug pour recueillir les ufs et les
kystes. On obtient quatre couches, au sommet lther puis les dbris ensuite le formol et pour
finir le culot contenant les lments parasitaires.

Figure 8 : Tubes aprs centrifugation lors dune mthode diphasique [OMS, 1997]

Il existe plusieurs mthodes diphasiques, la mthode de Telemann-Rivas est souvent
utilise comme mthode de routine en laboratoire, elle est simple et peu onreuse mais nest
pas toujours suffisante pour concentrer les ufs [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Elle
est, par exemple, moins performante que la flottation au saccharose pour la concentration des
cryptosporidies [Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].

La mthode de Ritchie, ou Ritchie simplifie permet de mettre en vidence les ufs
dhelminthes et les kystes de protozoaires, mais le culot est souvent trs abondant. Cette
technique suivie dune coloration de Kinyoun modifie froid est aussi efficace pour la
dtection de Cryptosporidies que la flottation et la coloration laide de la solution de
Sheather [Mc Nabb et al. (1985)].

La mthode de Blagg, Schloegel, Mansoer et Khalaf permet la concentration des
lments parasitaires contenus dans des prlvements fixs par le mercurothiolate-iode-formol
44

(MIF), les kystes de protozoaires sont alors colors par le MIF [Rousset (1993), Golvan et

A retenir :
Les techniques de concentration les plus utilises sont les techniques de flottation. Elles
permettent un rsultat clair avec peu de manipulation. Les liquides de flottation les plus
courants sont le sulfate de zinc, le sulfate de magnsium, le saccharose ou le chlorure de
sodium. Une centrifugation peut tre utilise pour acclrer la technique.

45

D. REALISATION ET FIXATION DU FROTTIS

1. Etalement des selles

Certaines colorations se font dans les tubes de sdimentation ou de flottation, dautres
se font de faon directe ou sur la lame. Pour toutes les colorations, il est ncessaire de raliser
un talement une tape du processus.

Le frottis consiste raliser un talement de fces le plus fin possible afin de pouvoir
identifier les lments parasitaires au microscope. Il est donc ncessaire davoir une texture de
selles assez liquide pour le raliser.
Si les selles sont liquides, une goutte de matire fcale est place sur une lame porte-
objet et ltalement est ralis directement.
Si les selles sont plus solides, il est ncessaire de les liqufier avec une solution. Pour
raliser un frottis simple on y ajoute alors une goutte de NaCl isotonique tidie dans lequel on
mlange des fces [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)].
Si lon souhaite faire une coloration directe (comme pour la mthode de Heine) on
ajoute alors une trs petite quantit de selles dans une goutte de fuchsine sur une lame [Adam
et al. (1971)]. Ensuite, ltalement du mlange se fait en le recouvrant dune lamelle ou
laide dune lame pour tirer le prlvement [Rousset (1993)].

Figure 9 : Les trois tapes de ralisation dun frottis
A : Dpt dune goutte de matire fcale ; B : Apposition dune lame 45 ; C : Mouvement
de translation lent et uniforme
46

Pour raliser un frottis, il faut apposer la lame au contact de la goutte de matire
fcale, pralablement pose sur une lame, avec un angle de 45, puis attendre que cette goutte
diffuse le long de la lame. Une fois que la goutte est rpartie sur le bord de la lame, on ralise
un mouvement de translation lent et uniforme, de la mme faon que pour la ralisation dun
frottis sanguin (voir figure 9).
Le frottis doit tre fin et lon doit pouvoir lire les caractres dun journal au travers de
celui-ci.

Si les oocystes ont t concentrs par une mthode de flottation, il nest pas ncessaire
deffectuer un frottis puisque les oocystes seront venus se coller la lamelle au sommet du
tube de centrifugation.

2. Fixation des frottis

Selon la coloration envisage par la suite, le frottis doit tre fix ou non. Il existe
diffrentes techniques de fixation, certaines colorations permettent galement la fixation.

Pour les techniques de coloration acido-rsistantes, le frottis est sch lair, puis la
lame est plonge dans du mthanol pur pendant 5 minutes environ pour la fixation [Bessieres
et al. (1995)].

Pour les colorations permanentes qui se droulent en plusieurs tapes ou les
colorations sur frottis fix et sec, le frottis est directement plong dans le fixateur sans tre
sch.
Plusieurs fixateurs peuvent tre utiliss comme le fixateur de Bouin, la solution de
Schaudinn actique ou la fixation PVA (PolyVinyl Alcool). Le choix du fixateur est
indpendant de la mthode, la solution de Schaudinn actique est gnralement prfre
[Bailenger (1982)].
Pour la fixation PVA, cela se passe en mme temps que le frottis, une petite quantit
de fces est mlange une goutte de la solution de fixation PVA, puis le mlange est tal, il
est alors sch et laiss une nuit 37C [Adam et al. (1971)].

47

Une fois le frottis ralis et fix, il peut tre color, la conservation de la prparation
aprs coloration peut tre de courte dure, cela est principalement d la dshydratation de la
prparation. Le lutage et le montage peuvent prolonger la dure de conservation pour
permettre une lecture diffre.

48

E. LUTAGE

Pour augmenter la conservation dune prparation microscopique (avec ou sans
coloration) pendant quelques jours, il peut tre utile deffectuer un lutage.
Le lutage permet dempcher lvaporation de leau contenue dans la prparation en
limitant les changes entre la prparation et le milieu extrieur.

Plusieurs techniques existent, certaines ont une efficacit limite comme le lutage la
vaseline qui ne conserve la prparation que quelques heures.
Le lutage au lut de Rondeau de Noyer est une technique ayant une bonne efficacit, les
lames peuvent se conserver plusieurs mois. Mais elle ncessite lutilisation dun fer luter et
la technique est relativement longue.
Le lutage au vernis ongles est la technique la plus utilise du fait de sa simplicit.
Une fois la lamelle pose sur la lame, le pourtour de la lamelle est sch laide dun papier
absorbant, puis du vernis est dpos sur les bords de la lamelle. Cette technique a une bonne
efficacit mais les formes vgtatives et kystiques se conservent mal [GOLVAN et Ambroise-
Thomas (1984)].

49

F. MONTAGE

Pour certaines techniques microscopiques de coloration, il est parfois ncessaire de
raliser un montage aprs la fixation et la coloration des frottis.
Les mthodes de montage utilises en coprologie sont les mmes que celles utilises
pour les pices histologiques. Il faut veiller ce que le frottis ne sche pas avant le montage.

Il existe deux grandes techniques de montage, la plus ancienne est le montage au
baume du Canada.
Pour cette technique, le frottis humide est dshydrat par de lalcool thylique titre
croissant : 60, 70, 80, 95 puis avec de lalcool absolu. Pour finir il est dshydrat par le
xylne ou le tolune. Le frottis est laiss une deux minutes dans chaque solution. Sur le
frottis encore imprgn de tolune, une lamelle avec une petite goutte de baume du Canada
sirupeux est dpose [Achir et Hamrioui (2001), Bailenger (1982)].
Une rsine de synthse peut galement tre utilise pour effectuer un montage comme
lEukitt. Cette rsine permet de fixer une lamelle sur le frottis et de pouvoir le conserver
pendant plusieurs annes.

Les tapes de la ralisation dun examen microscopique de fces ont donc t
expliques. Une fois les fces conserves ou le frottis ralis, une coloration peut tre
effectue. Ensuite la lame peut ventuellement tre lute ou monte. Selon llment
parasitaire cherch, diffrents colorants peuvent tre choisis.

50

III. LES DIFFERENTES METHODES DE COLORATION POUR LA
DETECTION DES PROTOZOAIRES

Les protozoaires sont de petites tailles, des colorations permettent donc de faciliter leur
recherche dans les selles. Les formes vgtatives ou kystiques ne sont pas colores par les
mmes mthodes.

A. FORME VEGETATIVE

La forme vgtative des protozoaires intestinaux est la forme flagelle, encore appele
trophozote. En ce qui concerne les protozoaires tudis, seule la forme vgtative de Giardia
intestinalis est retrouve dans les excrments des ruminants. Les trophozotes sont prsents
dans les glaires muqueuses et les selles liquides.
Cette forme est fragile dans le milieu extrieur, elle nest donc visualisable que sur des
fces fraiches. Diffrentes mthodes permettent de mettre en vidence les formes vgtatives
grce des colorants. Il y a des mthodes dont le colorant sapplique directement entre lames
et lamelles, dautres se font sur un frottis humide aprs fixation de celui-ci et pour finir,
certaines seffectuent sur un frottis pralablement sch.

1. Colorations entre lames et lamelles

Les colorations ralisables directement entre lames et lamelles comportent des
techniques simples et rapides, il est donc trs utile de les mettre systmatiquement en uvre
lorsque lexamen direct na pas permis lidentification des trophozotes.
Ces mthodes sont effectuer sur des selles contenant des trophozotes vivants.
Pour toutes ces mthodes, la technique est identique. Sur une lame, une goutte de
prparation fcale est mlange une petite goutte de ractif. Le tout est recouvert dune
lamelle puis observ au microscope.

51

a) Mthode de Bailenger et Faraggi
Cette technique, dcrite en 1972, permet de colorer toutes les formes parasitaires de
protozoaires.
Le ractif utilis est une solution compose dun mlange de violet cristal, de fuchsine
basique et de phnol (voir protocole en annexe 7). Cette solution se conserve correctement
mais elle doit tre place dans un flacon opaque ferm hermtiquement [Bailenger (1982)].
Une petite goutte du ractif est suffisante, cela permet la coloration dtre
progressive et de ne pas altrer les parasites, de plus une petite quantit de liquide permet de
ne pas diluer la prparation fcale.
Si le frottis est lutt (avec du vernis ongles ou de la colle cellulosique),
lidentification des trophozotes reste possible plusieurs jours aprs la coloration.

Aprs coloration, le cytoplasme et les cristallodes apparaissent de couleur rouge ros,
les structures nuclaires et les rudiments flagellaires sont colors en noir.
Cette mthode colore correctement les formes vgtatives et les dtails cytologiques
sont trs bons. De plus cette coloration est rapide et ncessite peu de manipulations.
Cette coloration peut galement se raliser en tube, la solution est mise dans un tube
hmolyse, puis une petite quantit de matire fcale y est ajoute. Aprs une trentaine de
minutes, la couche suprieure du sdiment peut tre prleve pour effectuer un frottis et
observe au microscope [Rousset (1993)].

b) MIF ou mthode de Sapero, Lawless et Strome
La mthode de Sapero, Lawless et Strome a t dcrite en 1951. Le sigle MIF
correspond Merthiolate Iode Formol, ce sont les principaux constituants des ractifs [Levine
(1973), Adam et al. (1971)].
Le colorant est compos par un mlange de lugol, de teinture de merthiolate et de
formol (voir protocole en annexe 8). Les proportions peuvent tre modifies car le lugol
saltre avec le temps, il peut alors tre ncessaire daugmenter la proportion de lugol pour
compenser sa dtrioration. Le mlange ainsi form ne se conserve pas plus de 8 heures.
La coloration se fait en deux phases. Tout dabord liode colore immdiatement les
trophozotes qui apparaissent alors vert-jaune jaune-brun. Au bout de quelques heures, les
membranes nuclaires sont colores en rouge fonc et le cytoplasme en rouge. La chromatine
52

nest pas colore mais est visible grce sa rfringence [Bailenger (1982), Golvan et

Le frottis, une fois color, peut se conserver pendant quelques heures, mais au-del les
parasites sont dtruits.
Cette coloration peut seffectuer entre lames et lamelles ou sur tube. La coloration
dans un tube hmolyse permet de conserver les fces si le tube est ferm hermtiquement
[Adam et al. (1971)].

Cette mthode est simple et peu cher, elle est galement rapide et permet la
conservation des fces (pour la coloration en tube).

2. Fixation coloration dun frottis humide

La fixation doit tre effectue le plus tt possible aprs la dfcation pour viter la
dgnrescence des trophozotes. Le frottis doit rester humide tout au long des manipulations,
il faut donc que celles-ci senchainent rapidement.

a) Technique en trois temps
Il y a un temps de fixation, un temps de coloration et pour finir un temps de
diffrenciation. Un frottis fcal est ralis, puis fix selon une des techniques dcrites
prcdemment dans le paragraphe Ralisation et fixation dun frottis . Aprs la phase de
coloration, les frottis sont monts en suivant la technique explique dans le paragraphe
montage au baume . Les techniques en trois temps sont rparties en deux catgories selon
la nature du colorant.

Mthodes lhmatoxyline i).
De nombreuses mthodes utilisant lhmatoxyline comme colorant ont t mises au
point. Lhmatoxyline seule na pas un grand pouvoir colorant, il est donc ncessaire
dutiliser un mordant [Levine (1973)]. Les mthodes utilisant lhmatoxyline comprennent
53

souvent trois tapes, la premire tape est le mordanage, puis il y a une tape de coloration et
pour finir une tape de diffrenciation.

La mthode de coloration la plus utilise et souvent juge comme une des meilleurs est
la mthode de Heindenhain ou mthode lhmatoxyline ferrique [Shetty et Prabhu (1988)].
Cette technique utilise laffinit des constituants nuclaires pour le fer, puis
lhmatoxyline apporte se combine avec le fer dj fix. Cela permet de faire ressortir les
structures nuclaires en noir sur un fond gris clair. Toutes les tapes de cette coloration sont
effectues dans une tuve 37C.
Le mordant utilis est une solution dalun de fer 3%, cette solution se conserve mal
temprature ambiante, mais elle se conserve trs bien au rfrigrateur (voir protocole en
annexe 9).
La solution de coloration se fait par une dilution au dixime dune solution mre. La
solution mre est constitue dune dissolution dhmatoxyline cristallise dans de lalcool
90. Une fois prpare, cette solution se conserve bien.
Pour finir, le diffrenciateur utilis est la solution de mordanage dilue. Cest le
temps le plus difficile de la coloration, il est donc ncessaire de suivre cette tape au
microscope, lorsque les structures nuclaires apparaissent nettes, le frottis peut tre lav pour
enlever lalun de fer [Bailenger (1982), Adam et al. (1971)].

Les lments parasitaires sont mis en vidence par leur couleur gris fonc voire noire
sur un fond gris clair.
Aprs montage, le frottis peut tre conserv. Cette mthode est la technique qui a
permis la description des protozoaires, mais elle est trs difficile excuter. Elle est longue et
assez dlicate, elle ne peut donc pas tre utilise en routine [Golvan et Ambroise-Thomas
(1984), Rousset (993)].

Les autres techniques utilisant lhmatoxyline sont lgrement diffrentes, elles
utilisent dautres solutions de mordanage ou de diffrenciation. La mthode de Thompkins et
Miller utilise une solution dacide phosphotungstique 2% comme diffrenciateur.
La mthode de Mallory utilise le lugol comme solution de mordanage. Puis le frottis
est color par une solution dhmatoxyline phosphotungstique, il ny alors pas dtape de
diffrenciation. Les noyaux apparaissent violet fonc et le cytoplasme des cellules est violet
clair [Bailenger (1982)].
54

Trichrome (Gomori-Wheatley) ii).
La coloration trichrome de Gomori a t applique par Weathley aux frottis fcaux en
1951.
Cette technique seffectue en deux temps.
Dans un premier temps le frottis est plong dans une solution colorante pendant une
dizaine de minutes. La solution colorante : le trichrome de Gomori, est un mlange de
chromotrope 2R, de vert lumire SF, dacide phosphotungstique et dacide actique
cristallisable (voir protocole en annexe 10).
Aprs ce premier temps de coloration, il y a un temps de rinage ou de diffrenciation.
Le rinage est effectu avec une solution dalcool actique et dacide actique pendant
quelques secondes [Bailenger (1982), Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Dautres
protocoles utilisent de leau distille pour le rinage [Adam et al. (1971)].

Aprs coloration, la chromatine apparait de couleur rouge et le cytoplasme apparait
vert teint de pourpre, ces lments sont donc mis en vidence par rapport au fond color en
vert.
.
Il y a une grande irrgularit des rsultats due la difficult dobtenir des produits
chimiques de qualit. Cependant, lorsque la coloration est russie, les rsultats des colorations
sont de trs bonne qualit. Cette technique est rapide et peut donner de trs bons rsultats. Elle
est relativement simple mettre en place et les ractifs utiliss se conservent facilement.
Cette coloration est souvent prfre dautre coloration comme lhmatoxyline
ferrique pour la coloration des flagells. Elle est recommande pour la recherche des formes
vgtatives comme kystiques [Garcia et al. (1979)].

b) Techniques en un temps
Pour les techniques en un temps, la fixation et la coloration se font simultanment. Les
manipulations sont donc simplifies et plus rapides. Cependant, les rsultats sont de moins
bonne qualit que ceux fournis par les techniques en trois temps.
Il existe plusieurs mthodes dont la fixation et la coloration se font simultanment
comme la mthode de Lawless ou celle de Noble. La plus utilise est la mthode de Kohn.

55

Gleason et Healy ont dcrit en 1965 la coloration de Kohn modifie pour la dtection
des protozoaires, cest la mthode de coloration au noir chlorazol de Kohn.
Le ractif utilis est un mlange de noir chlorazol, dalcool thylique, dalcool
mthylique, dacide actique, de phnol et dune solution aqueuse dacide phosphotungstique
(voir protocole en annexe 11). La maturation du ractif doit seffectuer la lumire pendant
plusieurs semaines avant la premire utilisation [Bailenger (1982)].

Les trophozotes apparaissent globalement gris. Les structures cellulaires sont colores
en vert fonc noir, le cytoplasme apparait incolore. Cela permet donc de mettre en vidence
les trophozotes sur un fond gristre [Levine (1973)].

Cette technique est facile raliser et relativement simple. La solution colorante est
stable et se conserve bien. Les colorations donnent des rsultats de bonne qualit [Bullock
(1980)]. Cette technique est cependant relativement longue (les frottis restent au contact du
colorant de 4 8 heures), mme si le temps de manipulation est court [Rousset (1993)].

3. Coloration dun frottis sec

Pour ces techniques le frottis est ralis, fix selon la technique de fixation choisie
puis sch lair ou dans une tuve 37C. Lorsque les frottis sont fixs et schs, ils
conservent leur colorabilit pendant longtemps. Les frottis peuvent donc tre raliss puis
expdis un laboratoire.

a) Mthode de Brooke et Goldman
Cette technique permet de colorer laide dune mthode de coloration dun frottis
humide, un frottis dj fix et sch. Ce frottis est plac dans un bain dalcool 70
additionn de quelques gouttes de lugol, puis il est plac dans de lalcool 50 (voir protocole
en annexe 11). Aprs cette succession de bains, le frottis peut alors tre color avec une des
techniques prcdemment dcrite (Hmatoxyline, Trichrome ou mthode Kohn [Bailenger
(1982)].

Cette mthode donne de bons rsultats lors de la dtection de trophozotes. Elle permet
de pouvoir fixer les frottis sil nest pas possible de les observer immdiatement et de les
56

colorer par la suite. Cependant, cette technique est bien plus longue et rajoute un certain
nombre de manipulations [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)].

b) Giemsa
Cette coloration est une mthode qui repose sur les diffrences de pntration du
dcolorant dans les organismes.
Pour la ralisation dune coloration de Giemsa, le frottis sec est fix puis color
laide de Giemsa rapide. La lame est alors observe au microscope optique laide des plus
forts grossissements et avec lobjectif immersion [Polack et al. (1983)].

Cette technique ne donne pas de trs bons rsultats pour lobservation des formes
vgtatives, elle nest donc pas utilise.

A retenir :
Les formes vgtatives sont rapidement dtruites dans les fces.
Quelques colorations permettent de les mettre en vidence, les plus utilises et les
plus efficaces sont la technique de MIF (qui permet aussi de concentrer et de conserver la
matire fcale si elle effectue sur tube), la mthode lhmatoxyline ferrique et la technique
au trichrome de Gomori-Weatley.

Les formes vgtatives et les formes kystiques ne sont pas colores par les mmes
techniques en raison de leur structure diffrente. Les colorants permettant la mise en vidence
des formes kystiques des protozoaires peuvent tre identiques ceux utiliss pour les
trophozotes mais dautres techniques ont galement t dveloppes.

57

B. FORME KYSTIQUE

La forme kystique est la forme de rsistance des protozoaires. On retrouve la forme
kystique des diffrents genres de protozoaires intestinaux dans les matires fcales des
ruminants. Cest la forme parasitaire retrouve dans les fces lors de coproscopies. Du fait de
la petite taille des kystes, il nest pas toujours vident de les visualiser en coprologie. Laction
de diffrentes solutions permettant la coloration mettent en vidence ces lments parasitaires.
Comme pour les mthodes utilises pour la forme vgtative, les mthodes de
coloration de la forme kystique sont classes en trois catgories, les colorations effectues
directement entre lames et lamelles, les colorations aprs fixation dun frottis humide et les
colorations sur un frottis sec.

1. Colorations entre lames et lamelles

Le principe de ces colorations est le mme que celui pour les colorations des formes
vgtatives. Mais les mthodes permettant la coloration des formes kystiques entre lames et
lamelles sont plus nombreuses. Toutes ces mthodes sont assez rapides.

a) Mthode de Bailenger et Faraggi
Cette mthode est la mme que celle dcrite pour les formes vgtatives. Elle permet
donc de colorer directement, sans fixation pralable, les formes kystiques et vgtatives des
protozoaires.

Les cytoplasmes et les cristallodes se colorent en rouge-ros et les structures
nuclaires ressortent en noir. Les rsultats obtenus avec cette technique sont aussi bons pour
les trophozotes que pour les kystes.

b) MIF
Cette mthode est la mme pour la coloration des kystes que pour celle des
trophozotes.
58

Les kystes apparaissent clairs avec des reflets verts sur un fond rose dans un premier
temps, puis la seconde coloration pntre lintrieur des kystes. Elle colore les membranes
nuclaires en rouge fonc et le cytoplasme en rouge [Rousset (1993)].

Cette mthode de coloration est simple, peu cher et rapide, elle donne de trs bons
rsultats pour la coloration des kystes de giardia [Thornton et al. (1983)). Cependant les
ractifs sont plus compliqus prparer que pour une coloration au lugol et les rsultats
semblent identiques [Bailenger (1982)].

La mthode de Sapero, Lawless et Strome, lorsquelle est ralise en tube, permet la
conservation mais galement la concentration des lments parasitaires comme les oocystes
du genre Cryptosporidium. Cette concentration nest pas de bonne qualit, la puret du
sdiment est de moins bonne que celle ralise par les autres mthodes de concentration
[Kvc et al. (2003), Badparva et al. (2009)].

c) Colorations iodes
Il existe de nombreux protocoles de coloration avec des ractifs iods (Solution iodo-
actique, Solution iode de Faust). Tous les ractifs iods drivent du lugol. La ralisation des
solutions rend les protocoles lgrement plus compliqus alors que les rsultats sont
semblables. Ils ne semblent donc pas plus avantageux que la coloration au lugol [Bailenger
(1982)].
Tous les ractifs iods se conservent mal, il est donc ncessaire de les renouveler
frquemment et de les conserver en respectant certaines mesures (flacon opaque et ferm
hermtiquement).

La technique de ralisation de la coloration au lugol est simple et courte (voir
protocole de coloration en annexe 13). La technique peut tre identique celle des autres
colorations entre lames et lamelles. Elle peut galement se faire sur un talement de fces
recouvert dune lamelle, une goutte de lugol est alors dpose au bord de la lamelle.
Lobservation au microscope se fait immdiatement.
Avec cette coloration, les trophozotes sont immobiliss et seule leur chromatine est
colore, cette technique ne permet donc pas la coloration de ceux-ci [Rousset (1993)].
59

Les kystes de giardia apparaissent jaune-orang sur un fond marron. La paroi des
kystes de flagells prend une teinte orange fonc et les structures internes sont soulignes. Les
kystes dgnrs sont colors en bleu [Bioforma (1998)]. Les oocystes du genre
Cryptosporidium apparaissent non colors sur un fond marron ce qui les diffrencie des
levures qui sont colores par le lugol [Garcia et al. (1983), ODonoghue (1995)]. Les lames
sont lire rapidement car les oocystes de cryptosporidies se colorent au bout de 15 minutes
environ.

Cette mthode met en vidence tous les kystes de protozoaires dans les matires
fcales, elle permet une bonne coloration des kystes de giardia, mais elle ne colore pas les
oocystes coccidiens [Hendrix (1998), Beugnet et al. (2004)].

Cette technique est rapide et simple, elle peut tre ralise aprs une observation de
matire fcale en routine. Elle permet surtout la mise en vidence des kystes de giardia. Elle
est donc souvent rserve lobservation de fces lors dune suspicion de giardiose.

d) Coloration au saccharose
La solution de saccharose ou solution de Sheather est utilise pour la concentration des
parasites par la technique de flottation mais elle peut galement tre utilise pour colorer une
lame. Un talement de fces peut tre ralis partir du surnageant issu dune flottation au
saccharose ou partir dun mlange dune goutte de saccharose et dune goutte de matire
fcale directement sur la lame [Beugnet et al. (2004)].
La solution de saccharose est ralise saturation (voir protocole de coloration en
annexe 14). Certains auteurs dcrivent galement la possibilit dutiliser du sirop de sucre
[MacPherson et McQueen (1993)].

La lame doit tre observe dans les 20 30 minutes suivant la coloration, les oocystes
se collabent aprs un certain temps dans cette solution et finissent par disparaitre.

Les oocystes de cryptosporidies apparaissent roses et sont rfringents, leur
morphologie est trs bien conserve si lobservation est faite rapidement [Garcia et al.
(1983)].
60

Des tudes ont montr que la sensibilit de ce test est identique celle dun test
ELISA sur un prlvement moyennement riche et trs riche en cryptosporidies [Robert et al.
(1990)].

Cette technique ne ncessite pas de matriel onreux et le ractif est facile trouver,
de plus ce ractif nest pas toxique et ne dtriore pas le matriel, mais elle ne permet pas la
conservation des lames et la lecture doit tre ralise immdiatement. La solution est trs
paisse, par consquent elle nest pas trs facile utiliser.
Cette coloration, ou montage au saccharose, est facile raliser et rapide. Elle est donc
recommande pour un examen rapide ou en routine sur des prlvements de fces de veaux
[Trotz-Williams et al. (2005)].

e) Mthode de Heine
Cette technique utilise la fuchsine (voir protocole de coloration en annexe 15), une
petite quantit de ractif est mlange une quantit gale de matire fcale sur une lame
[Beugnet et al. (2004)].
La lame doit tre observe, microscopie contraste de phase, dans les 15 minutes
suivant la coloration, car les oocystes perdent leur rfringence.

En microscopie optique, les oocystes de C. parvum apparaissent non colors mais
rfringents sur un fond rouge. Ils prsentent un point sombre central reprsentant le corps
rsiduel. Pour mieux les distinguer, il faut passer en microscopie contraste de phase, les
oocystes sont alors trs brillants sur fond noir. La rfringence des oocystes nexcde pas une
quinzaine de minutes [Khelef et al. (2002), Polack et al. (1983)].

Cette technique est simple, trs rapide et facile mettre en uvre. Elle fait partie des
mthodes les plus sensibles dans la dtection des oocystes de C. parvum. Pour bnficier des
qualits de cette coloration il est ncessaire davoir un microscope contraste de phase. Les
bulles dair apparaissent galement rfringentes ce qui complique la lecture de la lame
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986), Khelef et al. (2002), Polack et al. (1983)].

La coloration de Heine est trs rapide et sensible, elle est donc conseiller pour
orienter le diagnostic de cryptosporidiose.
61

f) Coloration ngative la nigrosine
Pour cette coloration, le ractif utilis est une solution de nigrosine 1% (voir
protocole en annexe 16).

Les oocystes de cryptosporidies ne sont pas colors par cette solution mais ils
deviennent brillants, la structure interne des oocystes est peu visible. Le fond est color en
noir, cest donc une coloration ngative. Les levures apparaissent presque semblables aux
oocystes, mais elles sont moins brillantes, plus petites et moins rondes [Boufassa-Ouzrout et
al. (1986), ODonoghue (1995)].

Cette technique prsente des rsultats comparables ceux obtenus avec une coloration
par une mthode de Ziehl-Neelsen modifie.

Elle est rapide, sensible, peu couteuse et assez facile interprter. Ce colorant
convient donc bien la dtection dorganismes ayant un faible pouvoir de coloration comme
les oocystes de cryptosporidies. Il peut ainsi tre utilis en routine [Pohjola (1984)].

2. Fixation coloration dun frottis humide

Les techniques permettant la fixation et la coloration dun frottis humide sont les
mmes pour les formes vgtatives que pour les formes kystiques des protozoaires.

a) Techniques en trois temps
Ces techniques en trois temps sont reprsentes essentiellement par les mthodes
lhmatoxyline et la mthode du trichrome de Gomori-Wheatley.

Mthodes lhmatoxyline i).
Comme pour la coloration des formes vgtatives, la mthode la plus utilise parmi les
mthodes lhmatoxyline est la mthode lhmatoxyline ferrique.
Les avantages et inconvnients de cette technique sont identiques pour la mise en
vidence des formes vgtatives comme kystiques.
62

Trichrome (Gomori-Wheatley) ii).
Certains auteurs recommandent la coloration par le trichrome pour la recherche des
formes kystiques et vgtatives de giardia [Garcia et al. (1979)]. En effet cette technique
colore bien les deux formes de giardia. Elle est dune sensibilit quivalente voir suprieure
celle de la mthode de MIF pour la dtection des kystes de giardia par exemple [Thornton et
al. (1983), Badparva et al. (2009)].

Par contre cette coloration est dcrite comme peu fiable pour la dtection des oocystes
de cryptosporidies qui sont mal colors et par consquent difficile retrouver sur les frottis de
fces [Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].

b) Technique en 1 temps
La principale mthode est la mthode de coloration au noir chlorazol de Kohn.
Le protocole est identique celui effectu pour la coloration des formes vgtatives.

Avec cette coloration, les kystes prennent une couleur bleu-gris vert-gris. Les
noyaux sont facilement observables et les contours de ceux-ci sont nets, les structures
cellulaires se dtachent en vert fonc noir sur le cytoplasme incolore. Les levures se colorent
en gris fonc noir [ODonoghue (1995)].
Cette technique est facile raliser mais elle est longue (mme si elle demande peu de
manipulations) [Rousset (1993)].

3. Coloration dun frottis sec

Pour ces diffrentes mthodes, tout comme pour celles utilises pour la dtection des
trophozotes, un frottis mince de fces est ralis puis sch lair. Par la suite il sera souvent
fix laide dalcool avant dtre color. Il y a diffrents types de mthodes, celles utilisant
les diffrents types de rsistance aux acides des diffrents lments prsents dans les fces
(Giemsa, Ziehl-Neelsen), la mthode de Brooke et Goldman et les mthodes par fluorescence.

63

a) Giemsa
Cette technique fut la premire coloration pour la dtection des oocystes de
Cryptosporidium parvum. Elle a t remplace par les techniques de Ziehl-Neelsen.

Grce cette coloration, les oocystes sont entours dun halo clair. Ils prsentent un
cytoplasme bleut granuleux avec un centre plus clair et jusqu 6 corpuscules rouge fonc.
Les levures sont galement colores en bleu, leur contenu est moins granuleux. La taille et la
forme sont donc les deux seuls lments permettant de diffrencier les levures des kystes
parasitaires [Polack et al. (1983), ODonoghue (1995)].

Cette technique est simple raliser et permet de conserver la morphologie des
lments parasitaires. De plus elle permet la conservation des lames colores.
Cette mthode ne donne pas de rsultat satisfaisant pour la dtection des
cryptosporidies. Le risque de confusion des kystes parasitaires avec les levures est important
et les lames sont difficiles lire tant donn le manque de contraste. Cette technique demande
donc plus de temps de lecture que dautres et un personnel plus expriment [Khelef et al.
(2002), Garcia et al. (1983), MacPherson et McQueen (1993)].

La coloration de Giemsa a t abandonne par les laboratoires car cette technique est
plus difficile lire quune coloration de Ziehl-Neelsen modifie.

b) Les mthodes de Ziehl-Neelsen
Il existe un grand nombre de mthodes de Ziehl-Neelsen, elles ont t modifies par
rapport la mthode de base pour tre plus rapide, plus pratique et pour en augmenter
lefficacit.

Mthode de Ziehl-Neelsen modifie par Henriksen i).
Cette mthode est la plus utilise par les laboratoires, elle est issue de la coloration de
Gram.
Les tapes de cette technique sont identiques pour toutes les mthodes de coloration de
Ziehl-Neelsen. Il y a une tape de fixation, puis une tape de coloration, une tape de
dcoloration et une dernire tape de recoloration.
64

Le protocole donn par Henriksen et Pohlenz (voir en annexe 17) dcrit la fixation du
frottis dans du mthanol ou de lthanol, puis il est sch et flamb la lame. La lame est
alors colore dans de la fuchsine puis dcolore avec une solution de diffrenciation (acide
sulfurique). Pour finir il est recolor avec une solution de vert de malachite [Henriksen et
Pohlenz (1981)]. Le frottis est ensuite observ au microscope optique.
Quelques modifications de ce protocole originel ont t ralises, lacide sulfurique
peut tre remplac par un mlange dacide chlorhydrique et dalcool et les dures daction des
diffrents produits peuvent tre modifies.

Cette mthode permet de mettre en vidence les oocystes qui prennent une couleur
rouge facilement distinguable sur le fond vert. Le cytoplasme de ceux-ci est daspect
granuleux avec le centre plus clair, 0 6 corpuscules apparaissant de couleur fonc sont
visibles lintrieur des kystes. Les autres coccidies apparaissent galement colores en rouge
tandis que les cellules, les bactries et les dbris le sont en vert [Polack et al. (1983),
Henriksen et Pohlenz (1981), Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]. Cependant, les oocystes ne
sont pas toujours colors de faon uniforme [Kar et al. (2011), Casemore (1991)]. Cette
technique est donc plus facile lire que la coloration par le Giemsa tant donn le plus grand
contraste de couleur et la distinction aise entre les levures et les lments parasitaires
La morphologie des oocystes est bien conserve et il ny a pas de risque de confusion
avec les levures ou les dbris fcaux ce qui rend lobservation des lames facile. Cette
technique est simple et dune trs bonne sensibilit. Certaines tudes montrent quil y a
seulement 5,5% de sensibilit de moins pour la dtection de Cryptosporidium parvum avec le
Ziehl-Neelsen modifie quavec limmunofluorescence [Kvc et al. (2003)].
Aprs coloration, les lames peuvent tre conserves et leur lecture peut se faire
quelques temps aprs, mais cette technique est relativement longue et demande plusieurs
manipulations. Elle est donc difficile utiliser en routine [Trotz-Williams et al. (2005),
Henriksen et Pohlenz (1981)].

Cette mthode de coloration de Ziehl-Neelsen modifi par Henriksen est la mthode
de rfrence pour la dtection des oocystes de Cryptosporidium du fait de sa sensibilit, de sa
facilit de lecture et de sa fiabilit [Garcia et al. (1983), Khelef et al. (2002)]. Elle permet
galement de visualiser les giardias, mais cette technique est relativement lente et par
consquent difficile utiliser dans les laboratoires pour des analyses de routine.
65

Autres modifications de la mthode de Ziehl-Neelsen ii).
Depuis la parution du protocole de coloration de Ziehl-Neelsen modifi par Henriksen,
dautres auteurs ont dcrit des modifications diffrentes.

Le temps de dcoloration peut tre diminu, ou le vert de malachite peut tre remplac
par du bleu de mthylne [Beugnet et al. (2004), Ortolani (2000)].

Certaines de ces modifications sont trs utilises, comme la modification apporte par
Angus (voir protocole en annexe 18) ou par Kinyoun. Ce dernier dcrit un temps plus court de
coloration la fuchsine et une dcoloration laide dun mlange dacide et dalcool. La
contre-coloration seffectue laide de bleu de mthylne.
Cette technique permet donc de diminuer le temps total de coloration et de limiter les
vapeurs inflammables car toutes les tapes se ralisent froid. La morphologie reste bien
conserve et les oocystes apparaissent toujours de couleur rouge mais sur un fond de couleur
bleu [Garcia et al. (1983), MacPherson et McQueen (1993)].

Une autre mthode de coloration de Ziehl-Neelsen modifie utilise un mlange de
fuchsine diamant et de dimethylsulphoxide comme solution colorante (voir protocole en
annexe 19). La contre-coloration se fait avec du vert de malachite aprs une dcoloration avec
de lacide actique.
Les oocystes sont de couleur rose brillant rose fuchsia ce qui ressort sur le fond vert
ple. Les levures sont, elles, colores en bleu-gris. La structure interne est bien conserve. Les
formes vgtatives sont partiellement colores par cette mthode, elles sont marron noires.
Cette technique permet une bonne coloration, elle est rapide, elle diminue le temps de
coloration par rapport la mthode dcrite par Henriksen et elle est facile lire. Par contre,
elle est instable et ncessite plusieurs manipulations [Pohjola et al. (1985), Bronsdon (1984)].

c) Mthode de Brooke et Goldman
La technique de Brooke et Goldman a dj t dcrite dans la partie sur les colorants
des formes vgtatives puisquelle permet de colorer les kystes et les trophozotes des
protozoaires.
66

Toutefois, lors de la ralisation de cette technique pour la mise en vidence de kystes,
ceux-ci sont moins visibles car ils perdent leur rfringence et subissent une distorsion.

Cette mthode nest donc pas privilgier pour la dtection des formes kystiques en
coproscopie.

d) Mthode fluorescence
Les mthodes fluorescence sont utilises pour avoir une vision rapide de
lchantillon et permettent dorienter le diagnostic. Tout comme les colorations de Ziehl-
Neelsen, le principe repose sur la rsistance la dcoloration des lments parasitaires
recherchs, mais le colorant utilis est un colorant fluorescent.

Les diffrents protocoles seffectuent donc en trois tapes, une tape de coloration
avec le colorant fluorescent, une tape de dcoloration et une dernire tape de contre-
coloration.
Ces techniques permettent une visualisation rapide des oocystes coccidiens puisque
ceux-ci sont alors colors en orange ou rose fluorescent sur un fond trs fonc [ODonoghue
(1995)]. Linconvnient majeur est la ncessit de disposer dun microscope fluorescence
Diffrents colorants fluorescents sont utiliss comme lAuramine-O, lauramine-
phnol, la mpacrine ou lacridine orange.

Auramine-fuchsine carbolique i).
Cette technique associe le principe de la coloration ngative avec celui de la coloration
par fluorescence.
Le colorant fluorescent utilis est de lauramine-phnol et la recoloration seffectue
avec de la fuchsine carbolique. Dans ce protocole (voir en annexe 20), il ny a pas dtape de
dcoloration [Casemore et al. (1984)].

Les oocystes ressortent alors du fond rouge-noir par leur aspect fluorescent. Cette
technique ne permet pas la coloration des formes vgtatives et kystiques de Giardia
[Harrington (2008)]. La morphologie des coccidies nest pas trs nette et en cas de doute, il
67

peut parfois tre ncessaire de recolorer la lame avec la mthode de Ziehl-Neelsen modifie
par Henriksen.

La coloration lauramine-fuchsine carbolique est rapide, simple et pratique pour
raliser un dpistage. Nanmoins, elle ncessite un microscope fluorescence et un contrle
laide dune autre coloration peut tre ncessaire [Beugnet et al. (2004), Casemore et al.
(1984), Casemore et al. (1985)].

Auramine-phnol ii).
Pour cette coloration, le colorant fluorescent est toujours lauramine-phnol, mais le
second colorant est une solution de permanganate de potassium (voir protocole en annexe 21).
La dcoloration entre les deux tapes est ralise laide dun mlange acide-alcool.

Les oocystes coccidiens sont clairement visibles, ils sont colors en jaune sur le fond
noir.

Lauramine-phnol a une plus grande affinit pour les oocystes que la fuchsine
carbolique, cest pour quoi cette coloration donne de meilleurs rsultats [Boufassa-Ouzrout et
al. (1986), Nichols et Thom (1984)].

Cette technique est utilise en routine dans de nombreux laboratoires, les lames
positives peuvent tre recolores par une autre technique comme celle de Giemsa ou de Ziehl-
Neelsen, mais cela nest pas forcment ncessaire [Casemore et al. (1984)].

Mpacrine iii).
Le protocole est identique celui de la coloration lauramine-phnol, mais le
colorant fluorescent utilis est la mpacrine (voir protocole en annexe 22). LAuramine-O
peut galement tre utilise comme colorant fluorescent, mais celle-ci est plus chre que la
mpacrine.
Les oocystes de cryptosporidies apparaissent sous forme de disques fluorescents trs
caractristiques qui sont mis en vidence par leur couleur sur fond noir. La morphologie des
68

lments parasitaires nest pas bien conserve. Les levures ne prennent pas la mpacrine donc
elles sont facilement discernables des oocyste de C. parvum.

Cette mthode est rapide et facile raliser, de plus elle est peu chre. Mais comme
pour toutes les autres colorations fluorescentes, elle ncessite un matriel particulier pas
toujours prsent dans tous les laboratoires [Ungureanu et Dontu (1992)].

Ces colorations ne sont pas spcifiques mais elles permettent de raliser un diagnostic
rapide sur un grand nombre de lames. La mthode est rapide, simple et peu chre, de plus la
lecture est aise, mais ces techniques demandent un matriel spcialis, des contrles qualits
rguliers et parfois une confirmation par une autre coloration de la prsence des oocystes
coccidiens [Hanscheid et al. (2008), Garcia et al. (1983)].
Il est donc recommand dutiliser une technique fluorescence pour tudier un grand
nombre de lames et de recolorer laide de la mthode de Ziehl-Neelsen modifie les lames
positives [MacPherson et McQueen (1993)].

A retenir :
Pour le diagnostic de cryptosporidiose, la technique de rfrence est la coloration de Ziehl-
Neelsen modifie. Elle donne de trs bons rsultats, cependant elle est assez longue. Dautres
techniques plus rapides sont alors rgulirement utilises en laboratoire ou en clinique
comme la coloration par le saccharose. Certains laboratoires utilisent une coloration
fluorescente ou la coloration de Heine pour orienter le diagnostic.
Pour la recherche de kystes de giardia, la coloration de choix est la coloration au lugol, la
coloration de Ziehl-Neelsen modifie permet galement ce diagnostic.

69

CONCLUSION

Chez les ruminants, trois genres de protozoaires digestifs sont principalement
rencontrs : Cryptosporidium, Giardia et Eimeria. Tous ont une forme kystique retrouve
dans les matires fcales, mais le genre Giardia prsente galement une forme flagelle. Pour
le genre Eimeria, il existe un grand nombre despces non pathognes. Il est donc utile
didentifier lespce ou les espces prsentes dans lchantillon.

Pour permettre un bon diagnostic, il est ncessaire de respecter certaines rgles de
prlvement et de conservation de lchantillon. Pour lobservation de formes vgtatives de
giardia, il faut une conservation rapide du prlvement ou un acheminement trs rapide (de
lordre de quelques heures) tandis que pour les autres lments parasitaires, lchantillon peut
tre expdi sous 2 3 jours sans conservation spciale. Lexamen des fces peut ncessiter
une concentration des lments parasitaires pour limiter les dbris et augmenter les chances de
retrouver les parasites. La mthode de flottation est la principale technique employe pour
cette tape. Pour la prparation de certaines colorations, un frottis fcal peut tre ncessaire, il
est alors raliser de faon rigoureuse pour permettre une bonne lecture.

Diffrents moyens de diagnostic existent pour la dtection des protozoaires digestifs
dans les matires fcales chez les ruminants. Les techniques immunologiques et de biologie
molculaire se dveloppent de plus en plus de nos jours, mais lexamen microscopique reste
un examen de choix et ralisable sans ncessiter de matriel spcialis. En ce qui concerne la
coproscopie, les mthodes de coloration permettant la mise en vidence des lments
parasitaires sont nombreuses et parfois assez spcifiques dun genre de parasite. Certains
colorants ne colorent pas toutes les formes parasitaires mais parfois seulement les formes
kystiques. Parmi les colorants prsents, les plus couramment utiliss sont les colorations
iodes pour la dtection de giardia, ainsi que les colorations de Ziehl-Neelsen modifies ou
les colorations rapides par la mthode de Heine ou le saccharose.

Dans la suite de ce travail, nous allons donc tudier le rsultat dune enqute ralise
sur les techniques de diagnostic utilises par les laboratoires en France ainsi quune
comparaison de la sensibilit, de la spcificit et de laspect pratique de diffrentes
colorations rapides des protozoaires intestinaux.
70

71

PARTIE II : BILAN SUR LES METHODES DE
DIAGNOSTIC DES PROTOZOAIRES DIGESTIFS EN
FRANCE ET ETUDE EXPERIMENTALE
COMPARATIVE DE TECHNIQUES DE COLORATION
RAPIDES POUR LA MISE EN EVIDENCE DES
PROTOZOAIRES INTESTINAUX

72

I. INTRODUCTION

Les protozoaires sont des parasites pathognes chez les jeunes bovins.
Cryptosporidium parvum affecte les veaux ds lge de 6 jours puis ils peuvent tre
contamins par Giardia intestinalis ou Eimeria sp.. Ils sont donc souvent recherchs pour
dterminer la cause de diarrhes ou de ralentissements de croissance en levage.
De nombreuses techniques coproscopiques peuvent tre utilises dans les laboratoires
ou en clinique vtrinaire pour la dtection des protozoaires dans les fces de bovins, quelles
soient immunologiques ou microscopiques.

Cette partie exprimentale a pour but de connaitre et de faire un bilan des diverses
techniques employes en France pour la recherche des protozoaires en coproscopie et de
comparer des mthodes de coloration rapide pour la dtection des 3 genres principaux de
protozoaires : Cryptosporidium, Giardia et Eimeria.

Afin de connaitre les techniques employes en France, les laboratoires vtrinaires
dpartementaux et les laboratoires dpartementaux danalyses ont t questionns. Ltude de
leurs rponses permet de raliser un tat des lieux des techniques actuellement utilises.

De nombreux examens coproscopiques ont t raliss laide de 3 mthodes de
coloration (Heine, Lugol et Saccharose). Ils ont t compars une coproscopie ralise
laide dune mthode de rfrence choisie : La mthode de Ziehl-Neelsen modifie pour C.
parvum et une coproscopie sans coloration pour les genres Giardia et Eimeria.

73

II. MATERIELS ET METHODES
A. RECUEIL DE DONNEES ET DECHANTILLONS

1. Modalits de contact

La liste des laboratoires et les coordonnes de ceux-ci ont t rcupres grce au site
internet des pages jaunes, lannuaire Roy ainsi quaux sites internet officiels des conseils
gnraux.
Les laboratoires ont t contacts par e-mail dans un premier temps. En cas dabsence
de rponse ou derreur dans les adresses e-mail, les laboratoires ont t contacts par fax.

Un questionnaire permettant une entre rapide des donnes a t envoy par e-mail en
pices jointes. Ce questionnaire a t ralis grce loutil de formulaire disponible sur le
logiciel Word. Cet outil a permis au personnel des laboratoires de pouvoir rpondre
rapidement aux questions grce des cases cocher et des zones dentre lors de
renseignements supplmentaires. Les rponses nous ont t transmises par e-mail ou par fax.
Un lien vers un site disposant du mme questionnaire leur a galement t envoy dans le
corps de le-mail. Ce site donne aux laboratoires la possibilit de rpondre directement en
ligne (http://www.mon-enquete-enligne.fr/index.php?sid=99725&lang=fr).

Lorsquaucune rponse na t obtenue aprs deux contacts par e-mail, le
questionnaire leur a t transmis par fax, avec un retour possible par e-mail, fax et tlphone.

Pour la rcupration des chantillons de fces, des leveurs laitiers et allaitants ont t
contacts. Des vtrinaires exerant en clientle rurale ainsi que le service de pathologie du
btail de VetAgro Sup nous ont permis de raliser des prlvements et nous ont fait parvenir
quelques chantillons de fces.

2. Zone et priode dtude

Les questionnaires ont t envoys aux LVD et LDA de France mtropolitaine. Les
envois se sont drouls sur 3 mois, les premiers contacts ont t pris partir de la fin du mois
74

de juin 2012. Les envois se sont poursuivis sur les mois de juillet et daot. La rception des
questionnaires sest principalement droule au cours des mois dt, mais les dernires
rponses sont arrives au dbut du mois de septembre.

Aprs la prise de contact avec des leveurs, des vtrinaires et le service de pathologie
du btail de VetAgro Sup, les fces ont t prleves sur des jeunes bovins laitiers et
allaitants. Les prlvements proviennent dlevages rpartis sur 3 dpartements : lAllier, la
Loire et le Rhne. La collecte des chantillons sest faite, de faon tale, sur une priode
dun mois et demi. Ces prlvements ont t raliss sur les mois de septembre et doctobre
2012.

3. Collectes et modalits de prlvement des chantillons

Les animaux prlevs sont de jeunes bovins, de 5 jours 3 mois venant dlevages laitiers
et dlevages allaitants. Certains veaux prsentaient des signes de diarrhes aiges, quelques
un prsentaient une diarrhe chronique. Les autres bovins ne montraient aucune anomalie
clinique.

Pour rcuprer des matires fcales, pour lchantillon, les bovins ont t stimuls pour
dfquer afin dobtenir des fces les plus fraiches possibles. Les selles sont alors prleves
puis mises dans des pots adapts. Ils sont ensuite placs directement au rfrigrateur avant et
aprs leur acheminement au laboratoire. En moyenne les analyses ont t ralises 2 jours
aprs lmission des selles.
Au total, 84 chantillons ont t obtenus, 30 chantillons ont t colors et analyss pour
la recherche de C. parvum, 27 ont t observs la recherche de kystes de G. intestinalis et 27
autres ont t utiliss pour comparer les mthodes de coloration pour le genre Eimeria.

75

B. PREPARATION DU QUESTIONNAIRE ET DES ECHANTILLONS

1. Ralisation du questionnaire

Cette enqute sur la coproscopie chez les ruminants a t mene pour deux thses, les
questionnaires comportent donc 2 parties, une sur les mthodes de flottation en coproscopie
(thse de doctorat vtrinaire de Fabienne RICHARD) et une partie sur la recherche des
protozoaires digestifs dans les fces.

La partie concernant la recherche des protozoaires intestinaux comporte 7 questions.
Les deux premires questions concernent le cot de la recherche de Giardia et celui de la
recherche de Cryptosporidium.
Deux autres questions concernent les colorations utilises en routine et lors dune
demande de recherche spcifique. La liste des colorants propose est Ziehl-Neelsen modifi,
Heine, Saccharose, Lugol, MIF. Ce sont les 5 techniques de colorations utilises les plus
frquemment, une zone dentre tait disponible en cas dutilisation dun colorant absent de la
liste.
La dure moyenne dune coloration leur est demande.
Dans cette enqute, nous demandons la ou les raisons du choix du ou des colorants
utiliss. Il y a 4 possibilits de rponse : le cot, la facilit de prparation, le type de parasite
recherch et la facilit de lecture.
En raison dun grand nombre de techniques de Ziehl-Neelsen modifies, la dernire
question de cette enqute porte sur les ractifs et les dures daction de ceux-ci lors
dutilisation dune technique de Ziehl-Neelsen (voir le questionnaire envoy aux laboratoires
en annexe).

2. Prparation des chantillons en vue de la coloration

Les prlvements issus de bovins gs de moins de 3 semaines nont pas t utiliss
pour la recherche des protozoaires du genre Eimeria, de mme les chantillons provenant de
bovins gs de plus de 5 semaines nont pas t utiliss pour la recherche de C. parvum.
Lors de la recherche de cryptosporidies, les mthodes de colorations compares
ncessitent une texture de selles assez liquide pour pouvoir tre correctement effectues.
Lorsque les fces sont trop solides, une petite quantit de celles-ci (environ 2g) est place
76

dans un verre pied. Du srum physiologique est alors ajout (environ 3 ml) afin dobtenir
un mlange de selles pteux. La quantit de srum physiologique est adapter en fonction de
la texture initiale des selles.
Pour une des techniques de coloration ralise pour la dtection des cryptosporidies,
un frottis fcal est ncessaire. Pour cela une goutte de fces ou une goutte du mlange de
fces avec du srum physiologique est prleve et dpose sur une lame. A laide dune autre
lame, la goutte est alors tale pour obtenir une mince couche de matire fcale homogne sur
la lame. Le frottis ainsi ralis est alors laiss lair ambiant pendant une heure environ
jusqu ce quil soit secs.

Lors de la comparaison des colorations pour la dtection des formes parasitaires des
genres Giardia et Eimeria, une mthode de flottation est effectue afin de concentrer les
lments parasitaires prsents.
Pour cela, 5 g de fces sont mlangs avec 20 ml dune solution de sulfate de zinc
(d=1,36). Le mlange est alors filtr laide dun tamis et dune gaze. Le filtrat est enfin plac
dans un tube centrifuger, le tube est compltement rempli jusqu ce que la solution forme
un mnisque surmontant le tube. Une lamelle est alors dpose sur le tube, lensemble est
plac ensuite dans la centrifugeuse. La centrifugation seffectue pendant 5 minutes 1500
tours par minute. A la fin de ltape de centrifugation, la lamelle est rcupre et pose sur
une lame porte-objet prsentant ou non une goutte dun colorant tudi.

3. Dilution des chantillons

Pour la ralisation de diffrentes dilutions dun chantillon riche en oocystes de C.
parvum, le nombre doocystes dans cet chantillon a t quantifi.
Une cellule de Malassez est ncessaire afin de raliser la quantification. Lpaisseur
des fces de veau ncessite une dilution pour pouvoir distinguer le quadrillage de la cellule.
200l de lchantillon initial est mlang 1800l de la solution de saccharose. Ce mlange
est alors agit afin dtre homognis. Avant que la solution ne se stabilise, une petite
quantit de la solution est prleve et dpose sur la cellule de Malassez.
77

Les oocystes sont compts sur tous les rectangles de la cellule de Malassez, puis la
moyenne par rectangle est effectue. Le volume dun rectangle tant de 1.10
-5
ml, le nombre
doocystes par ml est donc connu.
Lors des dilutions de lchantillon initial pour la comparaison des colorations de Heine
et de lugol, celui-ci est dilu dans du srum physiologique.
Pour chaque dilution, 100 l de fces sont dilues dans diffrents volumes de srum
physiologique selon la concentration voulue.
Pour la ralisation des colorations au saccharose, la dilution seffectue dans la solution
de saccharose.

78

C. MODALITES DE COLORATION ET DE LECTURE DES PRELEVEMENTS

1. Coloration des prlvements
Chaque chantillon est analys selon plusieurs procdures.
En vue de la comparaison des techniques de coloration pour la dtection de
Cryptosporidium parvum, les fces sont utilises directement et colores par 4 techniques
diffrentes. La mthode de Ziehl-Neelsen a t choisie comme mthode de rfrence en raison
de son importance historique. Les autres colorations testes sont les colorations par une
solution de saccharose, par la mthode de Heine (solution de fuchsine) et par une solution de
lugol.

En ce qui concerne la comparaison des colorants pour la recherche dlments
parasitaires des genres Giardia et Eimeria, un autre type de procdure est ralis. Une
concentration des fces est effectue par la mthode de flottation au sulfate de zinc. La
lamelle issue de cette concentration est alors place sur une goutte de colorant dpose sur
une lame.

a) La coloration par une solution de saccharose
Pour cette coloration, une solution de saccharose saturation est prpare. On mlange
environ 20g de saccharose dans 10 ml deau (voir protocole en annexe 14). Cette solution est
agite pendant plus dune heure jusqu la dissolution complte des derniers cristaux de
saccharose. La solution peut tre chauffe pour acclrer la dissolution.
Une goutte de saccharose est dpose sur une lame.
Pour lobservation directe de fces, une goutte de fces est mlange la goutte de
saccharose laide dune pipette pasteur ferme. Ensuite une lamelle est dpose sur le
mlange. Lobservation se fait immdiatement aprs la prparation, on regarde ltalement au
microscope optique laide des objectifs x10 et x 40.
Pour la coloration suite une mthode de concentration, la lamelle est alors pose
directement sur la goutte de saccharose. Lobservation se fait rapidement aprs la coloration.

79

b) La mthode de Heine ou coloration la fuchsine
Comme pour la technique de coloration avec la solution de saccharose, lors
dobservation directe, une petite quantit de fces est mlange une gale quantit de
fuchsine sur une lame. Elle est ensuite recouverte dune lamelle avant que le mlange ne
sche. De mme lors de lutilisation dune mthode de concentration, la lamelle est pose
directement sur une goutte de fuchsine dispose sur une lame.
Lobservation de la lame se fait rapidement aprs la coloration pour limiter les effets
dus la dshydratation du mlange. Cette technique a t souvent dcrite avec une
observation au microscope optique contraste de phase. Dans le cadre de cette tude,
lobservation sest effectue avec un microscope optique lobjectif x40.

c) La mthode de Ziehl-Neelsen modifie
Diffrentes solutions et colorants sont ncessaires pour la ralisation de cette
technique, le protocole choisi est celui dcrit par Beugnet [Beugnet et al. (2004)].
Un mlange dacide chlorhydrique 3% dans de lthanol 95 est ralis avant le
dbut des manipulations, ce mlange se conserve bien dans un flacon hermtique.
Le frottis sec est fix pendant 5 minutes avec de lthanol 95 puis lalcool restant
sur la lame est flamb. La lame est alors place dans un bain de fuchsine pendant 3 minutes
30. Puis elle est rince leau et dcolore laide du mlange acide-alcool par deux passages
rapides, un rinage leau est effectu aprs et entre les dcolorations. La recoloration se fait
dans un bain de vert de malachite 0,5% pendant 1 minute. La lame est ensuite rince et
sche (voir le protocole en annexe 24).
Lobservation se fait aprs schage de la lame lair ambiant. Les objectifs x10 et x40
sont utiliss.

d) La coloration au lugol
Une solution de lugol est prpare laide dun mlange diode et diodure de
potassium (voir annexe 13).
Un talement de fces est ralis en dposant une goutte de fces liquide ou dun
mlange fces-srum physiologique que lon recouvre dune lamelle. Avant que ltalement
80

ne se dessche, une goutte de lugol est dpose au bord de la lamelle. Le colorant migre alors
sous la lamelle et colore les lments.
Lors dune coloration dune lamelle aprs centrifugation, la technique est identique,
une petite quantit de lugol est place au bord de la lamelle.
Lobservation se fait dans la zone de progression du colorant, laide dun microscope
optique et dobjectifs x 10 et x 40.

2. Lecture des lames

La lecture des lames se fait plusieurs grossissements.
Pour la recherche des lments parasitaires du genre Eimeria, la lame est observe
laide de lobjectif x10. Toute la lame est parcourue et tous les parasites aperus sont observs
plus fort grossissement pour leur identification. Leur taille est mesure laide dun oculaire
micromtrique talonn sur le microscope. Tous les parasites du genre Eimeria sont alors
identifis et classs par espce, ils sont galement comptabiliss sur toute la lamelle.
Pour le genre Eimeria, lchantillon est qualifi de ngatif lorsquaucun parasite nest
observ sur la lamelle, prsence lorsque le nombre de parasites vu est compris entre 1 et 10,
positif entre 11 et 50, trs positif de 51 100 et fortement positif lorsque le nombre
doocystes est suprieur 100.

Pour la recherche des lments parasitaires du genre Giardia, la lame est observe
lobjectif x10, en cas dobservation dlments semblables des kystes, lobjectif x40 est
utilis.
Lors de la lecture dune lame la recherche doocystes de C. parvum, celle-ci est
observe lobjectif x40.

Les oocystes de C. parvum et les kystes de G. intestinalis, sont compts sur 25 champs
au plus fort grossissement, pris sur la diagonale de la lamelle.
En fonction de la quantit doocystes observs sur 25 champs lobjectif x 40, les
chantillons sont qualifis dune catgorie.
Pour C. parvum, un rsultat de prsence est rendu lorsquil y a de 1 5 oocystes,
positif (+) de 6 50, trs positif (++) de 51 100, fortement positif (+++) de 101 200 et trs
fortement positif (++++) au-del.
81

Pour G. intestinalis, la limite des catgories est diffrente. De 1 5 kystes vus dans les
25 champs cest une prsence (P), de 6 10 le prlvement est positif (+), de 11 20 il est
trs positif (++) et au-del de 20 il est fortement positif (+++).

Aprs la lecture de toute la lamelle, les lames sont limines. Les colorants employs
nont pas une toxicit chimique importante et les lames utilises (en verre) sont
potentiellement coupantes. Ces 2 critres justifient que les lames soient considres comme
des dchets dactivit de soins risques. Elles doivent donc tre conserves dans des
collecteurs adapts et limines en vue de leur incinration.

82

D. ETUDE STATISTIQUE

Les donnes tudies sont analyses laide doutils statistiques. En raison de donnes
provenant de lanalyse des mmes prlvements par des mthodes de coloration diffrentes et
de leur caractre non paramtrique, le test de rang de Wilcoxon est utilis pour leur analyse.
Les tests ont t raliss avec des tables de contingences reprsentant le nombre
doocyste de C. parvum sur 25 champs selon le colorant utilis. La quantit dlments
parasitaires est reprsent par 5 catgories (ngatif, prsence, +, ++, +++, et ++++), chaque
catgorie est associ un chiffre (1 pour ngatif, 2 pour prsence etc.).
Pour les tables de contingences pour les genres Giardia et Eimeria, celles-ci sont
ralises avec le nombre de kystes de giardia observs sur 25 champs ou le nombre
doocystes dEimeria vus sur la lame.
Le logiciel de statistique R a t utilis pour raliser les diffrents tests des rangs de
Wilcoxon pour tous les colorants et tous les genres de protozoaires.

83

III. RESULTATS
A. ENQUETE SUR LES METHODES DE DETECTION DES PROTOZOAIRES EN
COPROSCOPIE EN FRANCE

Sur les 73 questionnaires envoys aux LVD et LDA de France mtropolitaine, 49
laboratoires ont rpondu. Parmi ces rponses, 3 laboratoires nous ont informs quils ne
ralisent plus danalyse concernant la parasitologie.
Les laboratoires ont utilis diffrents moyens pour nous rpondre, 16 laboratoires ont
choisi de nous rpondre grce au questionnaire en ligne, 14 ont rpondu par lintermdiaire du
fax et 16 par e-mail.

Figure 10 : Rpartition des laboratoires dpartementaux ayant rpondu

Pour la dtection des protozoaires dans les selles chez les jeunes bovins, 91,3% des
laboratoires interrogs utilisent une mthode de coloration pour Giardia intestinalis et
Cryptosporidium parvum. Certains laboratoires utilisent les tests immunologiques pour la
recherche des formes parasitaires de Giardia et de Cryptosporidium. 21,7% des laboratoires
ayant rpondu, utilisent ce type de test pour la dtection des kystes de giardia ou des oocystes
de C. parvum.

84

1. Les colorations en routine lors danalyse coproscopique de jeunes bovins
dans les laboratoires dpartementaux

Aprs tude des rponses des LDA et LVD, la coloration la plus frquemment utilise
par les laboratoires dpartementaux est la coloration de Ziehl-Neelsen modifie, puisque
60,6% des laboratoires utilisant une coloration, emploient cette technique pour leurs analyses
coproscopiques. En seconde place on retrouve la coloration de Heine, qui est effectue par
36,4% des laboratoires, suivie de la mthode de coloration au lugol (27,3%). Les techniques
de MIF et de coloration par une solution de saccharose sont des colorations moins utilises.

Figure 11 : Part des laboratoires utilisant chaque colorant en routine

Les laboratoires utilisant des colorations signalent mettre en moyenne 18 minutes pour
raliser la technique de coloration permettant la recherche des lments parasitaires de
protozoaires dans les selles.

2. Les colorations lors de demande de recherche de Cryptosporidium

Daprs les rponses des laboratoires recherchant les cryptosporidies, 95,6% dentre
eux utilisent une technique de coloration pour la recherche des oocystes de C. parvum. Un
autre type de mthode diagnostique est galement employ, les mthodes immunologiques
sont utilises par prs de 9% des laboratoires pour la recherche de ce genre de protozoaire.

Z-N modifi
60,60%
Heine
36,40%
Lugol
27,30%
M.I.F.
18,20%
Saccharose
12,10%
85

La moiti des laboratoires employant une technique de coloration pour leur diagnostic
utilise la mthode historique de Ziehl-Neelsen modifie. Au vu des rponses sur les
protocoles raliss de Ziehl-Neelsen modifie, la plupart des laboratoires utilisent un
protocole diffrent. Parmi les 17 laboratoires nous ayant indiqu leur protocole, seuls 2
protocoles sont communs 2 laboratoires chacun. 13 protocoles diffrents ont donc t dcrits
par les laboratoires, avec des nuances dans la dure de chaque tape, le type de dcolorant et
de recolorant. 11 laboratoires utilisent de lacide sulfurique pour ltape de coloration et 5
emploient un mlange dacide chlorhydrique et dthanol 3%. De mme pour ltape de
recoloration, 13 recolorent les lames laide de vert de malachite ( des concentrations
diffrentes), 3 laboratoires utilisent le bleu de mthylne. Les temps de coloration la
fuchsine phnique varient de 5 60 minutes.

La technique de Heine est la seconde coloration la plus utilise pour la recherche de C.
parvum chez les ruminants, en effet 36% des laboratoires notifient son application dans le
questionnaire. La dernire coloration utilise est la technique de coloration par une solution de
saccharose. Aucune autre coloration nest utilise pour ce diagnostic dans les laboratoires
ayant rpondu nos questions.

Figure 12 : Pourcentage dutilisation des colorants lors de recherche de C. parvum

Le tarif dun examen coproscopique pour la recherche des lments parasitaires du
genre Cryptosporidium est en moyenne de 9,59 . Le tarif varie de 3 20 avec une moyenne
de 9,11 lors dun diagnostic laide dune coloration. Ce tarif varie de 7,65 20,74 et la
moyenne slve 15,10 lors dutilisation dune technique immunologique.
Z-N
modifi
50% Heine
36,10%
Saccharose
13,90%
86

Figure 13 : Tarifs de recherche de C. parvum pour des mthodes de colorations et pour des
mthodes immunologiques

Les laboratoires utilisant la technique de Ziehl-Neelsen modifie pour le diagnostic de
cryptosporidiose notifient une dure moyenne de la technique de coloration de 24 minutes.
Elle est de 15 minutes pour le saccharose et de 9,5 minutes pour la technique dcrite par
Heine.

3. Les colorations lors de demande de recherche de Giardia

Les rponses au questionnaire montrent que prs de 85% des LVD et LDA ralisent le
diagnostic de la giardiose lors de demande spcifique. Plus de la moiti de ces laboratoires
utilisent un colorant pour la recherche des kystes de giardia. Un quart des laboratoires
dpartementaux recherchant ce genre de protozoaire utilise une technique immunologique
pour le diagnostic.
Seul 2 colorants ont t notifis dans le questionnaire, les colorations cites font toutes
les deux partie des colorations iodes. La technique la plus utilise est la coloration au lugol,
en effet cette technique est employe dans plus de 56% des laboratoires. Lautre mthode
employe est celle de MIF,
9
22
8
0
1
0
1
0
2
1
[3-7[ [7-11[ [11-15[ [15-19[ [19-23[
Coloration
Immunologie
87

Figure 14 : Pourcentage dutilisation des colorants lors de recherche spcifique de Giardia

Le tarif pour une recherche de G. intestinalis dans les selles est en moyenne de 13,21
. Lors de diagnostic par une technique de coloration, les tarifs schelonnent de 5 25
avec un tarif moyen de 11,18 . Les tarifs varient de 6,50 30,50 et la moyenne passe
18,96 lorsque la mthode utilise est immunologique.

Figure 15 : Tarifs de recherche de kystes de giardia pour des mthodes de colorations et pour
des mthodes immunologiques

Les laboratoires ayant rpondu utiliser la coloration de MIF pour la recherche des
kystes de giardia, mettent environ 25 minutes pour raliser cette technique. Le temps de
ralisation de la coloration au lugol est dapproximativement 4 minutes 40 en moyenne.

Lugol
56,25%
MIF
43,75%
1
7
15
5
1 1
0 0 0
1
0
4
1 1
2
1
Coloration
Immunologie
88

4. Critres de choix des colorants par les laboratoires

Au sein de lenqute, il a t demand aux LVD et LDA de nous prciser quels sont
leurs critres de choix de leur technique de coloration.
Les deux critres qui savrent tre les plus importants sont le type de parasite
recherch (selon les hypothses diagnostiques et lge de lanimal) et la facilit de lecture de
la lame (69% et 66,7% respectivement). La facilit de ralisation du protocole est un critre
qui a t cit dans un peu moins de 40% des rponses reues. Pour finir la slection du
colorant par son cot est le dernier critre choisi, seul 28,6% des laboratoires utilisant une
technique de coloration pour le diagnostic lont mentionn.

Figure 16 : Critres de choix des laboratoires de leur mthode de coloration

69%
66,70%
38,10%
28,60%
Parasites
recherchs
Facilit de
lecture
Facilit de
prparation
Cot
89

B. COMPARAISON DE QUATRE TECHNIQUES DE COLORATION EN COPROSCOPIE

1. Comparaison de la sensibilit des colorants vis--vis de trois genres
courants de protozoaires

Afin de comparer la sensibilit de 3 techniques de coloration rapide, des chantillons
de fces ont t observs avec 4 mthodes. Les 3 techniques qui sont la coloration au
saccharose, la coloration la fuchsine ou coloration de Heine et la coloration au lugol, ont t
compares une mthode de rfrence.

a) Comparaison pour le genre Cryptosporidium
Pour tester la sensibilit des colorants pour la mise en vidence des oocystes de C.
parvum, les 3 techniques ont t compares une technique de rfrence : la mthode de
Ziehl-Neelsen modifie.
Les rsultats sont nots dans le tableau I.

90

Tableau I : Rsultats du nombre doocystes de Cryptosporidium parvum laide des 4
colorations
Echantillons Z-N modifie Heine Lugol Saccharose
1 - - - -
2 - - - -
3 - - - -
4 - - - P
5 - P - +
6 - + - +
7 P - - P
8 P P - P
9 P P P +
10 + P P +
11 + P P ++
12 + + - +
13 + + P +
14 + ++ P +++
15 + ++ + +++
16 + + + ++
17 ++ P P ++
18 ++ + P ++
19 ++ + + ++
20 ++ ++ + ++
21 ++ ++ ++ +++
22 ++ ++ ++ +++
23 +++ ++ ++ +
24 +++ ++ ++ ++
25 +++ ++ ++ ++
26 +++ ++ ++ +++
27 +++ ++ + +++
28 +++ ++ ++ +++
29 ++++ +++ + ++++
30 ++++ ++ ++ ++++

- = aucun parasite sur la lame, P = prsence (de 1 5 parasites sur 25 champs) ; + (de 6 50
parasites sur 25 champs) ; ++ (de 51 100 parasites sur 25 champs) ; +++ (>100 parasites sur
25 champs)

Les techniques de coloration de Ziehl-Neelsen modifie et de montage au saccharose
donnent des rsultats suprieurs aux colorations la fuchsine et au lugol. En effet cest dans
ces mthodes de coloration que lon retrouve le plus grand nombre dchantillons fortement et
trs fortement positifs. Les techniques de Heine et au lugol possdent les plus grands nombres
de rsultats ngatifs ou de prsence, parmi ces deux techniques, la mthode de Heine parait
91

tre plus efficace au vu de son plus grand nombre de rsultats trs positifs et fortement
positifs.

Figure 17 : Nombre dchantillons, dans chaque catgorie de semi-quantification de C.
parvum, pour les 4 mthodes de coloration

En analysant les donnes grce au test des rangs de Wilcoxon, une diffrence
significative est observe entre la mthode de Ziehl-Neelsen modifie et la coloration au lugol
(p<0 ,01) ainsi quavec la coloration de Heine (p<0,05).
Il ny a pas de diffrence significative entre la technique de Ziehl-Neelsen modifie et
celle au saccharose (p=0,07).
0
2
4
6
8
10
12
14
Z-N modifie
0
2
4
6
8
10
12
14
Saccharose
0
2
4
6
8
10
12
14
Lugol
0
2
4
6
8
10
12
14
Heine
92

Il existe une diffrence entre les techniques de coloration au saccharose et celle au
lugol et la fuchsine. Avec laide des statistiques, on peut voir que les diffrences sont
significatives (p<0 ,01 pour le lugol et la mthode de Heine).
Le test des rangs de Wilcoxon appliqu pour les techniques de Heine et au lugol
montre une diffrence significative entre celles-ci (p<0 ,01).

Pour la recherche des oocystes de C. parvum, les mthodes de coloration de Ziehl-
Neelsen modifie et au saccharose sont significativement plus sensibles que les colorations de
Heine et au lugol. Parmi ces dernires, la coloration de Heine est significativement plus
sensible que le lugol.

Pour apprcier la limite de dtection des colorations au saccharose, au lugol et la
fuchsine, des dilutions dun chantillon positif ont t ralises. Lchantillon initial a t
quantifi laide dune cellule de Malassez 4,175.10
6
oocystes de C. parvum par ml.
Chaque dilution a t teste 5 fois pour chaque mthode de coloration et les rsultats
ont t reports dans le tableau II.

93

Tableau II : Rsultats du nombre doocystes de Cryptosporidium parvum laide des 4
colorations sur des dilutions
dilution Concentration Saccharose Heine Lugol
1/1 4,17.10
6
/ml
+++ ++ ++
+++ ++ ++
+++ ++ +
++++ ++ ++
+++ ++ ++
1/10 4,17.10
5
/ml
++ + +
+ ++ +
++ + +
++ ++ +
++ + +
1/15 2,78.10
6
/ml
+ + +
+ + +
+ + +
++ + +
+ + +
1/30 1,39.10
5
/ml
+ + P
+ + P
+ + P
+ + P
+ + +
1/60 6,95.10
4
/ml
+ P P
+ P P
+ + P
+ + -
+ + P
1/120 3,48.10
4
/ml
+ P -
P P -
+ P P
+ P -
+ P -
1/240 1,74.10
4
/ml
P P -
P P -
P P -
P P -
P P -
1/480 8,70. 10
3
/ml
- - -
P P -
- - -
- P -
- - -
1/960 4,35. 10
3
/ml
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
94

Une diffrence entre les rsultats obtenus avec la coloration au saccharose et les
colorations de Heine et au lugol est visible pour les premires dilutions, mais celle-ci
samenuise lorsque la dilution augmente. La coloration la fuchsine et au lugol donnent des
rsultats presque quivalents pour les premires dilutions puis la coloration au lugol semble
moins mettre en vidence les oocystes de C. parvum.

En dessous de 3,48.10
4
/ml les oocystes de Cryptosporidium ne sont plus dtects par
la coloration au lugol alors quils sont encore dtects par la coloration au saccharose et la
fuchsine jusqu 8,70. 10
3
/ml ce qui parait tre le seuil de dtection de C. parvum. A partir de
4,35. 10
3
oocystes /ml aucune des 3 colorations ne dtecte la prsence du protozoaire.

La coloration de Heine apparait donc plus sensible que la coloration au lugol, car elle
permet la mise en vidence des oocystes des concentrations plus faibles que le lugol. A de
faibles concentrations, le saccharose et la fuchsine semblent tre des colorants quivalents.

b) Comparaison pour le genre Giardia
Pour tester la sensibilit des colorants pour la mise en vidence des kystes de giardia, 3
techniques de coloration rapide ont t compares une lame non colore. Ces techniques
sont : la mthode de coloration au saccharose, au lugol et la fuchsine.
Tous les chantillons ont t analyss avec toutes les techniques.

En raison de la faible quantit de prlvements positifs en G. intestinalis chez les
bovins et de la prsence de la mme espce de Giardia chez les bovins et chez les carnivores
domestiques, de petites quantits de fces de chiens prsentant des kystes de giardia (moins de
10%) ont t introduites dans des fces des bovins. Les nouveaux chantillons ont t
analyss de faon identique aux prlvements de bovins purs.
Les rsultats sont renseigns dans le tableau III.

95

Tableau III: Rsultats du nombre de kystes de giardia laide des 4 colorations
Echantillons Sans coloration Saccharose Heine Lugol
1 - - - -
2 - - - -
3 - - - P
4 - - P P
5 - P + +
6 - P P -
7 - P P -
8 - P P P
9 - P P P
10 P - P +
11 P P - -
12 P P - P
13 P P - P
14 P P - P
15 P P P P
16 P P P P
17 P P P P
18 P P P +
19 P P P +
20 P + P +
22 P P P +
23 + + ++ ++
24 ++ + ++ +
25 ++ ++ ++ ++
26 ++ ++ ++ +++
27 +++ ++ ++ +++

- = aucun parasite sur 25 champs ; P = prsence (de 1 5 parasites sur 25 champs) ; + (de 5
10 sur 25 champs) ; ++ (de 10 20 sur 25 champs) ; +++ (>20 sur 25 champs)

Le plus grand nombre de rsultats positifs fortement positifs est retrouv pour la
coloration au lugol, celle-ci parait donc plus sensible que les autres colorations.
Les autres mthodes paraissent sensiblement quivalentes en raison dun nombre
identique de rsultats ngatifs et faibles.

96

Figure 18 : Nombre dchantillons, dans chaque catgorie de semi-quantification de kystes de
giardia, pour les 4 mthodes diagnostiques tudies

Lanalyse des donnes avec le logiciel R, permet de dtecter une diffrence
significative entre la mthode de coloration au lugol et toutes les autres techniques (p<0 ,01).

La mthode de coloration au lugol est donc la coloration la plus sensible parmi les 3
testes. Elle amliore la dtection par rapport une analyse sans mthode de coloration.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
Lugol
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Heine
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Sans coloration
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Saccharose
97

c) Comparaison pour le genre Eimeria
Dans le but de comparer des techniques de coloration rapide, la quantit doocystes
dEimeria observe sur chaque lame est renseigne dans le tableau IV.

Tableau IV: Rsultats du nombre doocystes dEimeria laide des 4 colorations
Echantillons Sans colorant Saccharose Heine Lugol
1 - - - -
2 - - - -
3 P P - -
4 P P P -
5 P P P -
6 P P - P
7 P P - P
8 P P - P
9 P P P P
10 P P P P
11 P P P P
12 P P P P
13 P P P P
14 P P P P
15 P P P P
16 P P P P
17 + P P P
18 + P P P
19 + + P P
20 + + + P
21 + + + P
22 + + P +
23 + + + +
24 + + + +
25 ++ ++ ++ ++
26 ++ + P P
27 +++ +++ +++ ++

- = aucun parasite ; P = prsence (de 1 10 parasites sur la lame) ; + (de 11 50) ; ++ (de 51
100) ; +++ (>100)

98

Figure 19 : Nombre dchantillons dans chaque catgorie de quantit dEimeria pour les 4
mthodes diagnostiques tudies

Aprs analyse statistique, il existe une diffrence significative entre la mthode sans
coloration et les mthodes de coloration au lugol (p<0,01) et de Heine (p<0,01). La technique
sans coloration est donc plus sensible que les colorations au lugol et la fuchsine.
Il nexiste pas de diffrence significative entre la mthode de coloration au saccharose
et la technique sans coloration (p=0,625). La technique au saccharose est significativement
diffrente de la mthode au lugol (p<0,01) et la fuchsine (p<0,01).

Les techniques sans colorant et au saccharose sont donc plus sensibles que les
techniques au lugol et la fuchsine pour ces lments parasitaires.

0
2
4
6
8
10
12
14
16
Sans coloration
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Saccharose
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Lugol
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Heine
99

2. Comparaison de la spcificit des colorants

Selon la technique de dtection employe, les lments parasitaires des 3 genres de
protozoaires se dessinent de faon varie.

a) Genre Cryptosporidium
Les oocystes de C. parvum apparaissent de faon diffrente selon la mthode de
coloration utilise.

Lors dune coloration par la mthode de Ziehl-Neelsen modifie, les oocystes sont
colors en rose sur un fond vert, ce qui reprsente un contraste important. Ce contraste permet
une bonne visualisation des lments parasitaires recherchs. De plus aucun autre lment
prsent sur la lame ne reste color en rose aprs ltape de dcoloration. La recoloration par le
vert de malachite permet donc une coloration en vert de tous les dbris permettant la mise en
vidence des oocystes de C. parvum (voir figure 20). Les parasites sont dtectables laide
dun faible grossissement (objectif x10), mais il est souvent ncessaire de passer un plus fort
grossissement.

Figure 20 : Oocystes de C. parvum par la mthode de Ziehl-Neelsen modifie (objectif x40)

Le montage au saccharose rend les oocystes de C. parvum rfringents, ceux-ci
apparaissent ross sur un fond gris orang (voir figure 21) ce qui permet une bonne
visualisation de ceux-ci. Seuls les oocystes de C. parvum semblent tre teints par le
saccharose. Lors dune prsence dun grand nombre doocystes, ils sont visibles partir du
grossissement observ avec lobjectif x10. Le contenu de loocyste est bien visible lobjectif
100

x4. Les oocystes sont ronds et la morphologie est bien conserve dans les 15 premires
minutes. A partir dune vingtaine de minutes, les oocystes se dforment et deviennent
rniformes. Seules les bulles peuvent apparaitre lgrement roses et rfringentes. Cette
solution fais remonter les oocystes sous la lamelle, ils sont donc tous sur le mme plan.

Figure 21: Oocystes de C. parvum par dans une solution de saccharose (objectif x40)

Lors dune coloration du prlvement par du lugol, les lments parasitaires de C.
parvum apparaissent non colors lgrement rfringents sur un fond jaune-orang (voir figure
22). Les dbris sont colors en orange-brun, lorsque les oocystes se superposent des dbris,
ils deviennent difficilement visibles en raison de leur transparence, il est donc parfois
ncessaire de diluer les fces dans du srum physiologique pour liminer des dbris. Le
contraste ne permet pas toujours une bonne visualisation de ces parasites. Quelques autres
lments apparaissent non colors, mais ceux-ci ne sont pas ronds et nont pas la mme taille
que les oocystes, ils ne peuvent donc pas tre confondus.

Figure 22: Oocystes de C. parvum sur une lame colore par du lugol (objectif x40)

101

Comme pour la coloration au lugol, la mthode de Heine fait paraitre les oocystes
rfringents et non colors. Tous les dbris sont colors en rose (voir figure 23). Tout comme
pour la coloration au lugol, il peut tre difficile de distinguer les lments parasitaires de C.
parvum lorsque ceux-ci se superposent des dbris, et il est parfois utile de diluer le
prlvement pour diminuer la quantit de dbris sur la lame. Avec cette coloration, la
diffrenciation entre les levures et les oocystes se fait facilement, en raison de la coloration
rose prise par les levures grce la fuchsine.

Figure 23 : Oocystes de C. parvum dans une solution de fuchsine (objectif x40)

Les colorations de Ziehl-Neelsen modifies et au saccharose sont les mthodes
permettant le meilleur contraste entre les oocystes et le fond.

b) Genre Giardia
Aucune forme vgtative de Giardia na t observe sur les lames examines, les
formes kystiques le sont diffremment selon la mthode employe.

En labsence de mthode de coloration, les kystes de giardia apparaissent non colors
et assez rfringents. Ils sont ovales, de 8 12 m de longueur et prsentent gnralement un
signe en forme de vague (voir figure 24). Certains kystes apparaissent lgrement plus petits
(entre 8 et 10 m de longueur) et renfermant un contenu granuleux visible. De nombreux
lments sont galement non colors, ovalaires et de 10 15 m de longueur. Il peut donc
tre difficile de faire la distinction entre des kystes de giardia et des dbris. De plus, dans
102

certaines zones o ltalement est pais, les kystes de giardia sont difficilement visibles au
milieu des dbris.

La coloration au saccharose ne modifie pas lapparence des kystes de giardia. Ils sont
non colors, rfringents et leur morphologie nest pas modifie (voir figure 24). Comme pour
la mthode sans coloration, des dbris peuvent facilement tre confondus avec des kystes. Les
kystes sont trs difficilement reprables dans les zones o ltalement est plus pais.
La coloration au saccharose est donc trs peu spcifique pour le genre Giardia.

Figure 24 : Kystes de giardia sur une lame non colore ( gauche) et dans une solution de
saccharose (objectif x40)

Lors de coloration au lugol, les kystes apparaissent ovales de 8 10 m de longueur.
La paroi est colore en brun-vert et souligne la couleur orange du cytoplasme (voir figure
25). La teinte prise par les kystes de giardia avec le lugol permet de pouvoir les distinguer
lobjectif x10, ils sont galement facilement dtectables parmi les dbris. Les dbris,
dapparence proche des lments parasitaires de Giardia sans coloration, ne prennent pas la
mme teinte que les kystes ce qui permet de les distinguer. Toute la lame est colore en
orang-brun, il ny a donc pas un trs bon contraste avec les kystes de giardia qui apparaissent
lgrement plus bruns que les dbris.
La coloration au lugol colore uniquement les kystes de giardia en marron avec la paroi
souligne de vert, cette mthode permet donc de diffrencier les kystes de giardia du reste des
lments prsents sur la lame. A ce titre, elle parait trs spcifique pour la dtection des
lments parasitaires du genre Giardia.

103

Figure 25 : Kystes de giardia colors par du lugol (objectif x40)

Aprs la ralisation de la technique de Heine, les kystes de giardia sont rvls par une
couleur rose entoure par une paroi plus sombre, ils sont ovales et de 8 12 m de longueur
(voir figure 26). Tous les lments prsents sur la lame sont colors en rose. Des dbris de la
taille des kystes apparaissent moins colors que ceux-ci ce qui permet de faire la distinction
(voir figure 26). Mais lorsque ces dbris ressemblants aux kystes se superposent dautres
dbris, il devient difficile de les distinguer des lments parasitaires de G. intestinalis.
Les kystes de giardia sont mis en vidence par la coloration de Heine, par la teinte rose
et la paroi noire acquise aprs coloration. En ce sens, la coloration par la fuchsine semble
relativement spcifique des giardia, car ils prennent un aspect permettant leur diffrenciation.
Cependant, les autres lments de la lame apparaissent dans des teintes trs proches de celles
des kystes de G. intestinalis.

Figure 26 : Kystes de giardia et artefact colors par la mthode de Heine (objectif x40)

104

Le colorant le plus spcifique pour la dtection des kystes de G. intestinalis est le
lugol, il permet une bonne visualisation des lments parasitaires et une bonne distinction de
ceux-ci avec les dbris.

c) Genre Eimeria
Dans le genre Eimeria, il existe diffrentes espces, 11 dentre elles sont retrouves
chez les bovins. Les diffrentes espces sont distinguables par leur forme, leur taille, leur
contenu, la prsence de micropyle ou de capsule polaire et leur couleur.

Les diffrentes espces dEimeria apparaissent lgrement rfringentes lors de
coproscopie sans colorant. La paroi de loocyste est fonce, la cellule unique qui remplit plus
ou moins loocyste apparait granuleuse, grise et rfringente (voir figure 27). Les oocystes
dEimeria sont bien visibles sur les lames, ils peuvent tre plus difficiles distinguer lors
damas de dbris.

La distinction des espces se fait en mesurant les lments parasitaires dans leur
longueur et leur largeur. La couleur, la forme, la prsence dun micropyle ou dune capsule
polaire et la taille de la cellule unique par rapport loocyste sont des lments importants
pour la distinction des espces. E. subspherica, E. zuernii, E. alabamensis, E. bovis, E.
cylindrica et E. ellipsoidalis sont de couleur claire (cf. photographies A F figure 27), leur
contenu apparait de couleur rose et trs rfringent. Les espces E. auburnensis et E.
brasiliensis ont une teinte jaune-marron et E. bukidnonensis et E. pellita apparaissent marron
(cf. photographies G I figure 27).

105

Figure 27 : Oocystes dEimeria photographis sur des lames non colores (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. subspherica ; E : E. cylindrica;
F : E. canadensis ; G : E. auburnensis ; H : E. brasiliensis ; I : E. pellita

Les lments parasitaires du genre Eimeria ne sont pas colors par le saccharose, le
cytoplasme apparait ros tout comme ce que lon peut observer sans coloration (voir figure
28).
Il napparait aucune diffrence pour toutes les espces dEimeria entre leur apparence
sans colorant et dans le saccharose.
La coloration par une solution de saccharose nest donc pas spcifique du genre
Eimeria puisque celle-ci ne les colore pas et ne modifie nullement leur aspect.

A B C
D
A
E F
G
H I
106

Figure 28 : Oocystes dEimeria dans une solution de saccharose (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. subspherica ; E : E. cylindrica;
F : E. canadensis ; G : E. auburnensis ; H : E. pellita

Sur les lames colores au lugol, les lments parasitaires du genre Eimeria
apparaissent teints en jaune plus ou moins fonc sur un fond jauntre, la morphologie nest
pas modifie (cf. figure 29). La distinction par la couleur devient plus difficile car les
diffrentes teintes naturelles des oocystes sont modifies par la couleur jaune. Les oocystes
des espces incolores roses sans colorant apparaissent alors jaune, alors que les oocystes
jauntres apparaissent lgrement plus foncs. Cela diminue donc le contraste de couleur
entre les diverses espces (voir figure 29 G).

A B
C
D E F
G H
107

Figure 29 : Oocystes dEimeria colors par le lugol (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. canadensis ; E : E. auburnensis
F : E. bukidnonensis ; G : E. bovis et E. alabamensis

Comme lors de la recherche de G. intestinalis, la coloration la fuchsine colore tous
les lments de la lame. Les oocystes dEimeria sont donc galement colors en rose.
Certaines espces apparaissent moins colores comme E. zuernii ou E. alabamensis (cf. figure
30 A et B) Au contraire E. bovis semble mieux prendre le colorant et apparait souvent plus
fonc dans les mmes zones (voir figure 30 C et F).
Comme la coloration au lugol, la coloration la fuchsine ne modifie pas la
morphologie des oocystes mais seulement leur couleur. Les oocystes colors perdent leur
rfringence et semblent tre moins facilement diffrenciables des dbris.

A B
C
D
A
E F
G
108

Figure 30 : Oocystes dEimeria colors par la fuchsine (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. cylindrica; E : E. auburnensis
F : E. bovis et E. zuernii

Sans coloration les oocystes du genre Eimeria sont plus facilement reprables sur la
lame en raison dun meilleur contraste. De plus, les douze espces dEimeria sont plus
facilement distinguables lorsquelles ne sont pas colores car le critre de la couleur est alors
utilisable.

A B C
D
E
F
109

3. Comparaison de la mise en pratique des diffrentes techniques de
coloration de formes parasitaires de protozoaires

a) Temps de prparation
Les 3 techniques de coloration compares dans cette tude sont des mthodes rapides.
Le temps de ralisation des techniques est court et approximativement identique pour les
colorations au saccharose, au lugol et la fuchsine.

Pour ces 3 techniques, le temps de prparation est valu 1 minute 30 environ.

Le temps de manipulation de la mthode de Ziehl-Neelsen modifie est cependant bien
plus long. Il correspond au temps de ralisation dun frottis, de schage de celui-ci et le temps
de ralisation des diffrentes tapes de coloration, dcoloration et recoloration.
Le temps de manipulation est donc denviron 8 minutes, mais il faut rajouter la dure
de schage aprs la ralisation du frottis et aprs les tapes de coloration, il faut donc au
minimum une heure et demie entre la ralisation du frottis et la lecture de la lame.

Les techniques de coloration au lugol, au saccharose et la fuchsine sont les mthodes
de coloration ayant une dure de ralisation trs courte.
Ces techniques ne rajoutent que trs peu de temps de manipulation la ralisation
dune coproscopie sans coloration.

b) Cot des diffrentes techniques de coloration
Les colorations employes dans cette tude ncessitent des solutions diffrentes pour
chaque technique, il est donc intressant de connaitre le cot total de chaque technique.
Seul le cot cumul des colorants, des solutions de fixation et des dcolorants a t
calcul. Les tarifs ont t relevs sur le catalogue en ligne de la socit Merck millipore.

La technique de Ziehl-Neelsen modifie est la technique ncessitant le plus de
solutions. Le cot estim pour la coloration dune centaine de lames est de 7,38 .
La technique de coloration au lugol savre tre la moins couteuse. En effet, la
coloration de 100 lames est estime 0,04 .
110

La ralisation dune solution de saccharose permettant de colorer 100 lames cote
0,53.
Pour la mthode de Heine, le cot correspondant au volume de fuchsine phnique
ncessaire pour traiter 100 lames est de 1, 03 .

Toutes ces techniques sont trs peu onreuses, la plus chre tant la mthode de Ziehl-
Neelsen modifie dont le cot est dun peu plus de 7 centimes par lame.

c) Facilit de lecture des diffrentes techniques
Selon le parasite recherch, certaines techniques donnent des lames plus faciles lire
que dautres.

Pour la recherche de cryptosporidies, les lames obtenues laide dune coloration de
Ziehl-Neelsen modifie sont faciles lire en raison dun fort contraste entre les lments
parasitaires recherchs colors en rose et le fond vert.
La solution de Sheather colore les C. parvum en rose et ils deviennent rfringents. Le
contraste nest pas trs important mais le fait que les oocystes apparaissent plus colors sur un
fond gristre facilite la lecture. De plus, lorsque les fces analyses sont trs liquides, le
mlange des selles cette solution fait remonter les oocystes et les repousse sur les bords de la
lamelle. Ils se retrouvent alors juste en dessous de la lamelle et sur le pourtour de celle-ci, ce
qui facilite la recherche surtout lors dune faible quantit doocystes.
Pour les lames colores par de la fuchsine ou du lugol, la lecture est plus dlicate en
raison de la non-coloration des oocystes. En effet, il semble plus difficile de voir des lments
incolores sur un fond color que linverse. A cela sajoute la difficult lorsque des lments
parasitaires se superposent des dbris colors.

Pour la recherche des cryptosporidies, les colorations donnant des lames ayant la plus
grande facilit de lecture sont donc le saccharose et la mthode de Ziehl-Neelsen modifie.

111

Pour la recherche des lments parasitaires de Giardia, les techniques ne colorant pas
les kystes, comme la solution de Sheather, ne permettent pas une lecture facile des lames. En
effet, les kystes tant de petite taille et incolores, ils ressortent difficilement sur le fond
incolore.
Au contraire la coloration de Heine colore tous les lments prsents sur la lame en
rose. Il est alors difficile de dtecter les kystes de G. intestinalis, la lecture est rapidement
fatigante en raison de lapparence de tous les dbris.
La coloration au lugol donne des lames avec un meilleur contraste entre les kystes de
giardia de couleur brun et le fond avec des dbris jaune-orang. De plus la lame peut tre
parcourue plus rapidement en lobservant lobjectif x10.

La coloration au lugol semble tre la technique permettant la lecture la plus facile pour
la dtection des kystes de giardia.

Lors de la recherche doocystes du genre Eimeria, les mthodes ne colorant pas les
formes parasitaires comme la mthode sans coloration ou le saccharose, donnent des lames
relativement faciles lire, les oocystes dEimeria apparaissant lgrement colors sur fond
incolore.
Les mthodes colorant les oocystes dEimeria cest--dire les mthodes de Heine et au
lugol, colorent galement le fond de la prparation, cela diminue donc le contraste entre les
lments parasitaires recherchs et les dbris.

Les mthodes sans coloration et au saccharose donnent les lames les plus faciles lire
pour la recherche dlments parasitaires du genre Eimeria.

4. Comparaison de diffrentes dures des tapes de la coloration de Ziehl -
Neelsen modifie

Divers protocoles de Ziehl-Neelsen modifis ont t publis.
Ils prsentent des temps de coloration la fuchsine diffrents, ils varient de 4 minutes
1 heure. Deux types de solutions ont t dcrits pour ltape de dcoloration, un mlange
acide-alcool ou une solution dacide sulfurique. La recoloration peut galement se faire de
112

plusieurs faons, du vert de malachite est utilis pour recolorer le frottis. La dure de
recoloration varie de 30 secondes 15 minutes. Du bleu de mthylne peut galement tre
utilis.

Des frottis ont t colors en utilisant diffrents temps de coloration la fuchsine (4, 5,
15, 30 minutes et 1 heure). Ltape de dcoloration sest effectue laide dun mlange
acide-alcool pendant quelques secondes suivie dune recoloration par une solution de vert de
malachite 0,5% pendant 1 minute. Les frottis issus de ces essais sont colors de faon
presque identique.
Quelques soit le temps de coloration par la fuchsine, les oocystes se colorent de faon
identique.

Des frottis ont t colors et dcolors en suivant le protocole de lannexe 24. Ltape
de recoloration sest effectue laide de vert de malachite 0,5%. Plusieurs temps de
recoloration ont t tests : 30 secondes, 1 minute, 5 minutes, 10 minutes et 15 minutes.
Les dbris prsents sur les lames se recolorent tous de la mme faon quel que soit la
dure de recoloration.

Il ny a pas dinfluence de la dure de coloration ou de recoloration sur la qualit de
coloration du frottis.

113

IV. DISCUSSION

Lobservation des formes kystiques de protozoaires digestifs dans les selles peut tre
facilite ou non par lutilisation de mthodes de coloration. Le travail prsent dans cette
thse a t ralis afin de faire un bilan des techniques de coproscopie employes en France
pour la recherche des protozoaires digestifs, mais galement afin deffectuer une comparaison
de 3 mthodes de coloration rapides pour la dtection de ces parasites dans les fces de jeunes
ruminants.

A. ENQUETE SUR LES METHODES DE DETECTIONS DES PROTOZOAIRES
DIGESTIFS EN FRANCE

Prs de 90% des laboratoires franais ayant rpondu notre enqute dclarent utiliser
des mthodes de coloration pour la dtection des protozoaires digestifs.

Pour la recherche de C. parvum, les mthodes les plus utilises sont la mthode de
Ziehl-Neelsen modifie (dans 50% des laboratoires), puis celle de Heine (36%) et la mthode
de coloration au saccharose (14%).
Pour la mthode de Ziehl-Neelsen modifie, les laboratoires utilisent des protocoles
lgrement diffrents. Les temps de coloration la fuchsine varient, la dcoloration est
ralise par un mlange dacide et dalcool ou par une solution dacide sulfurique, la
recoloration seffectue avec du vert de malachite, avec une concentration et un temps daction
variant ou avec du bleu de mthylne.
Parmi les laboratoires recherchant les cryptosporidies, 10% dentre eux ont choisi
lemploi dune mthode immunologique pour cette recherche. Le tarif moyen dune recherche
de C. parvum par coloration est de 9,60 alors quil est denviron 15 lors de lemploi dune
technique immunologique.

Lors de la recherche de kystes de giardia, les mthodes employes par les LVD et
LDA sont la coloration au lugol, majoritairement, ainsi que la mthode de MIF. Le tarif
moyen est denviron 11 pour une coloration.
114

Pour cette recherche, prs dun quart des laboratoires utilise une technique
immunologique, le tarif moyen est alors de prs de 19 .

Aucun laboratoire na spcifi utiliser une mthode de coloration ou immunologique
pour rechercher les oocystes du genre Eimeria.

Les laboratoires interrogs sur leurs critres de choix des techniques de coloration ont
rpondu majoritairement slectionner la mthode de coloration en fonction du parasite
recherch et de la facilit de lecture de la lame obtenue.

Ainsi les mthodes cites par les laboratoires lors de notre enqute pour la recherche
de C. parvum et de G. intestinalis, sont les plus rencontres dans la bibliographie. Les
mthodes employes par les laboratoires sont les techniques juges comme ayant de bonnes
sensibilits et spcificits [Khelef et al. (2002)].
Les diffrents protocoles de la mthode de Ziehl-Neelsen modifie utiliss par les
laboratoires proviennent de modifications par diffrents auteurs. Certains protocoles se
rapprochent de la mthode de Ziehl-Neelsen modifie par Henriksen et Pohlenz, la
dcoloration seffectuant avec de lacide sulfurique [Henriksen et Pohlenz (1981)], dautres se
rapprochent de la mthode de Ziehl-Neelsen modifie par Angus qui est beaucoup plus
rapide, la solution dcolorante est alors un mlange dacide chlorhydrique et dthanol
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]. Les derniers sont issus de la modification de la mthode de
Ziehl-Neelsen par Kinyoun qui utilise une dcoloration laide dun mlange acide-alcool
mais galement la recoloration dans du bleu de mthylne [Ortolani (2000)].
Selon certains chercheurs comme Addis [Addis et al. (1991)], les techniques
immunologiques sont trs spcifiques et trs sensibles, elles permettent donc de raliser une
bonne analyse des fces. Les tarifs des techniques immunologiques semblent suprieurs
ceux des techniques de coloration. Certains auteurs ont montr un cot quivalent entre une
technique immunochromatographique et un montage au sucrose pour la dtection de
cryptosporidies chez des veaux [Trotz-Williams et al. (2005)], mais ces tests sont rapides et
peuvent tre raliss par du personnel non expriment. Les tests ELISA ncessitent une
prparation par du personnel qualifi mme sil nest pas ncessaire que celui-ci soit
spcialis en parasitologie. Le laboratoire doit tre quip du matriel ncessaire la
115

ralisation de cette analyse, cela implique donc un cot supplmentaire. Lanalyse dun
prlvement par une technique ELISA parait donc plus coteuse que par de
limmunochromatographie ou de la coloration.
Dans les articles crit par ODonoghue et Martinez et Belda Neto [ODonogue (1995)
et Martinez et Belda Neto (2001)], les auteurs ont montr que les diffrentes colorations
utilises pour la recherche de C. parvum nont pas la mme sensibilit, ni la mme spcificit,
il en est de mme pour G. intestinalis. Il parait donc raisonnable de choisir la mthode de
coloration en fonction du parasite recherch comme le fait la majorit des laboratoires. De
plus la spcificit des colorants permet en gnral damliorer la lecture de la lame en limitant
les situations douteuses, ce qui est galement un autre critre choisi par les laboratoires.

116

B. METHODOLOGIE

Parmi les nombreuses mthodes permettant la coloration dun chantillon de fces
pour la recherche de protozoaires intestinaux, nous avons choisi de comparer 3 techniques : le
montage au saccharose, la mthode de Heine et la coloration au lugol.
Ces colorations ont t slectionnes en raison de plusieurs critres. Comme notre
enqute la montre, ces mthodes font partie des colorations les plus utilises par les
laboratoires franais, ce sont aussi les plus dcrites en mdecine humaine comme vtrinaire
[Polack et al. (1983), ODonoghue (1995), Hendrix (1998)]. Ces techniques font galement
parties des colorations ralisables entre lames et lamelles, elles sont rapides et les solutions
ncessaires sont faiblement toxiques pour les manipulateurs et pour lenvironnement. De plus
la mme quantit de fces est utilise dans ces diffrentes techniques ce qui permet de pouvoir
les comparer. La technique de MIF na pas t slectionne car selon Bailenger, celle-ci
donne des rsultats semblables au lugol pour la coloration des kystes de giardia avec des
ractifs plus compliqus prparer [Bailenger (1982)].
Finalement, les colorations de Heine, au saccharose et au lugol ont t choisies en
raison de leurs importances bibliographiques, de leur frquence dutilisation et de leur rapidit
de ralisation.

Afin de pouvoir les comparer, des mthodes de rfrence ont t choisies pour la
recherche des 3 genres de protozoaires intestinaux tudis.
Pour la comparaison des mthodes de coloration pour les genres Giardia et Eimeria, la
mthode de rfrence que nous avons slectionne est une mthode sans coloration. En effet,
dans lenqute aucun laboratoire na mentionn utiliser de colorant pour lobservation des
coccidies, de plus de nombreuses tudes utilisent une technique sans coloration comme
mthode coproscopique pour la recherche de G. intestinalis dans le cadre de comparaison
avec dautres techniques de diagnostic [Dixon et al. (1997), Aldeen et al. (1995)].
Pour la comparaison des mthodes de coloration lors de la recherche des oocystes de
C. parvum, la mthode de rfrence choisie est la mthode de Ziehl-Neelsen modifie. Cette
technique a t choisie en raison de son importance historique et bibliographique, en effet de
nombreux articles ont t rdigs sur cette mthode et lont compar dautres colorations ou
mthodes immunologiques ou de biologie molculaire [Garcia et al. (1983), Casemore et al.
117

(1985) et MacPherson et McQueen (1993)]. Elle a galement t choisie en raison de sa forte
frquence dutilisation dans les LDA et LVD.
Pour choisir le protocole de Ziehl-Neelsen modifi, nous avons color des frottis selon
les diffrents protocoles mentionns par les laboratoires dans le questionnaire. Aucune
diffrence na t observe. Le temps de coloration par la fuchsine a donc t rduit 4
minutes, le temps de recoloration dans du vert de malachite 0,5% 1 minute. Cela permet
de faciliter la succession des manipulations et de diminuer le temps ncessaire la coloration
du frottis. La solution dcolorante utilise est le mlange acide-alcool, comme dcrit par
Beugnet [Beugnet et al. (2004)]. Selon Lenette cit par Martinez [Martinez et Belda Neto
(2001)], ce protocole permet galement dviter un excs de fuchsine sur la lame, ce qui
diminue le temps de lecture du frottis.

Pour la ralisation des techniques lors de la recherche de C. parvum, seule une goutte
de fces est ncessaire. Cette faible quantit de selles utilise peut donc introduire un biais de
prlvement, en effet, mme si lchantillon est homognis, la quantit dlments
parasitaires prsente dans la goutte peut tre trs diffrente. Lanalyse peut donc ne pas tre
reprsentative du nombre doocystes prsent dans lchantillon de fces. Il en est de mme
pour la recherche de G. intestinalis et dEimeria, malgr une quantit de matire fcale
ncessaire plus importante (5 grammes), il peut galement avoir une fluctuation du nombre
dlments parasitaires dans chaque portion du prlvement [Cartwright (1999)]. Ce biais est
donc prsent pour tous les chantillons et donc toutes les techniques, par consquent, la
comparaison des techniques les unes par rapport aux autres ne doit pas tre modifie par ce
biais.
Lors de la ralisation de la technique de Ziehl-Neelsen modifie, la qualit du frottis
est trs importante. En effet, lorsque la matire fcale est mal rpartie, les oocystes se
superposent et forment des amas avec les dbris, les lames sont alors plus difficiles lire. Le
nombre doocystes peut donc tre sous-estim lors de mauvaise ralisation du frottis.

118

C. COMPARAISON DES 3 METHODES DE COLORATION

1. Pour la recherche de C. parvum

Lors de la comparaison des mthodes de coloration pour la mise en vidence de C.
parvum, Le montage au saccharose sest avr aussi sensible que la mthode de Ziehl-Neelsen
modifie, il est galement trs spcifique. Les colorations au lugol et de Heine sont
significativement moins sensibles que la mthode de Ziehl-Neelsen modifie et le montage au
saccharose, celles-ci sont galement plus difficiles lire en raison dun faible contraste et de
la prsence dun grand nombre de dbris colors. La coloration par la fuchsine reste
cependant plus spcifique que la coloration par le lugol.
Le cot des colorants de toutes les techniques compares est sensiblement identique
(infrieur 1 pour 100 lames) sauf pour la mthode de Ziehl-Neelsen o celui-ci est plus
important (7 pour 100 colorations), cela reste ngligeable sur le cot total de lanalyse
coproscopique.

Dans un article crit par Garcia et al. en 1983, il a t montr que le montage au
saccharose et une coloration de Ziehl-Neelsen modifie sont deux mthodes de diagnostic trs
efficaces lorsque le nombre doocystes prsents dans les selles est assez important, ce que
confirme notre tude.
Les lames colores par le saccharose sont faciles lire en raison de la teinte rose prise
par les oocystes mais galement grce leur rfringence ce qui a t observ lors de nos
exprimentations ainsi que par MacPherson et McQueen en 1993. Peter ODonoghue dcrit
dans un article quun microscope optique contraste de phase peut tre utilis pour augmenter
le contraste, les oocystes de C. parvum apparaissent alors clairs et birfringents sur un fond
noir alors que les levures ne deviennent pas rfringentes [ODonoghue (1995)].
La lecture de la lame se fait trs rapidement, moins de 3 minutes selon MacPherson et
McQueen (1993), environ 10 minutes daprs Trotz-Williams, pour raliser les manipulations
et la lecture [Trotz-Williams et al. (2005)].
Par contre, comme la dcrit MacPherson et McQueen, la solution est trs poisseuse et
visqueuse, elle peut donc tre pnible manipuler et le matriel doit tre rgulirement rinc
leau.
La solution de saccharose est trs facile raliser, elle peut tre faite partir de
saccharose ou de sucre blanc. Pendant la dure de nos expriences, elle a t conserve au
frais, dans un flacon hermtiquement ferm au cours de ce travail et nest pas apparue
119

contamine. Elle peut cependant tre contamine par des moisissures, il peut donc tre
ncessaire de la renouveler.
En rsum, la coloration au saccharose est sensible et spcifique pour la recherche
doocystes de C. Parvum. De plus, le cot est faible, la prparation et la lecture sont trs
rapides en raison de la simplicit du protocole et la facilit de lecture des lames.

La coloration par le lugol nest pas souvent dcrite dans les articles pour la mise en
vidence de C. parvum, en effet notre tude a montr quelle est significativement moins
sensible que la mthode de Ziehl-Neelsen modifie ou le montage au saccharose. Elle apparait
galement moins spcifique, la morphologie des oocystes nest pas bien conserve ils sont
parfois difficiles distinguer de certains dbris incolores de taille identique.
La lecture des lames parait difficile en raison du faible contraste, en effet, comme la
dcrit Garcia, cette mthode est une coloration ngative (les oocystes sont incolores sur un
fond color), ce qui est plus difficile lire que les autres colorations [Garcia et al. (1983)].

La mthode de Heine est une technique de coloration des cryptosporidies
frquemment dcrite. Dans ce travail, la sensibilit de cette mthode sest avre
significativement infrieure celle des colorations de Ziehl-Neelsen et au saccharose,
pourtant elle a t dcrite comme tant une des mthodes les plus sensibles par Khelef [Khelef
et al. (2002)]. Cette diffrence de sensibilit peux provenir de la mthode dobservation, en
effet au cours de ce travail, les lames ont t observes laide dun microscope sans
contraste de phase, alors quelles ont t observes avec un microscope contraste de phase
dans ltude dirige par D. Khelef. Il est donc possible que ce soit la modification de la mise
en vidence faite par le microscope contraste de phase qui augmente la sensibilit [Vohra et
al. (2012)].
La spcificit de la coloration par la fuchsine semble bonne, mais les lames colores
sont difficiles lire en raison de la coloration ngative, tout comme pour la coloration par le
lugol.
Avec cette coloration, nous avons pu lire correctement les lames jusqu 24 heures
aprs la coloration. Cela nest pas le cas avec lobservation laide dun microscope
contraste de phase o la lecture doit tre effectue dans les 15 minutes [Boufassa-Ouzrout et
al. (1986)]. La conservation des lames est donc correcte mme si elle reste infrieure celle
des lames issues de la technique de Ziehl-Neelsen modifie, mais la mthode de Heine est
plus rapide et moins coteuse [Amato Neto et al. (1996), Vohra et al. (2012)].
120

La mthode de Heine est une mthode rapide, peu coteuse mais elle est peu sensible
lorsquelle est observe au microscope sans contraste de phase. La sensibilit peut tre
augmente par lutilisation dun microscope contraste de phase, par consquent, les lames
sont plus faciles lire mais elles doivent tre observes rapidement et le matriel ncessaire
est assez couteux.

Au final, les colorations les plus efficaces pour la dtection de C. parvum sont la
mthode de Ziehl-Neelsen modifie et la coloration au saccharose. Cette dernire est
conseiller en raison de sa rapidit, sa facilit de lecture et son trs faible cot. Elle peut aussi
tre facilement ralise en laboratoire ainsi quen clinique vtrinaire.

2. Pour la recherche de G. intestinalis

Dans la bibliographie, le saccharose a t dcrit comme une solution ne colorant pas
les kystes de giardia, cest galement ce que lon a pu constater au cours des
exprimentations. Le montage au saccharose savre donc identique un protocole sans
coloration, par consquent la sensibilit de ce test est semblable celle de la mthode sans
coloration. Les kystes sont visibles sans coloration [Dixon et al. (1997)], mais ceux-ci peuvent
tre confondus avec des dbris vgtaux, ce qui complique la lecture.
La solution de saccharose peut toutefois avoir une utilit comme liquide de flottation
pour faciliter la dtection des kystes du genre Giardia, [McNabb et al. (1985), Weber et al.
(1992)].

Lors de nos exprimentations, la coloration par le lugol sest montre la technique la
plus sensible pour la mise en vidence de G. intestinalis, ce rsultat est en accord avec la
bibliographie, en effet, cette mthode est la technique conseille par la plupart des auteurs
pour le diagnostic de giardiose en coproscopie [Beugnet et al. (2000), Dorchies et al. (2012)].
La spcificit de cette technique savre importante et trs intressante car celle-ci permet de
distinguer facilement les dbris vgtaux des kystes de giardia qui changent lgrement de
morphologie au contact du lugol. La coloration par une solution de lugol peut donc tre
utilise pour dtecter les kystes de giardia mais aussi pour confirmer leur prsence lors dun
doute sur une coproscopie simple [Dorchies et al. (2012)].
121

La teinte prise par les kystes grce au lugol permet de les reprer plus aisment sur la
lame, celle-ci permet galement de les discerner facilement lors dune observation lobjectif
x10 au lieu de x40 sans coloration, cela diminue donc le temps de lecture. Mais le lugol colore
galement un grand nombre de dbris rendant la lame plus difficile lire.
La solution de lugol se conserve bien lorsquelle est maintenue dans un flacon
hermtique [Bailenger (1982)], de plus elle est peu coteuse, rapide et demande peu de
matriel, cette mthode peut donc tre effectue en laboratoire et dans les cliniques
vtrinaires.
Les lames doivent tre observes rapidement aprs la coloration, en effet, au bout de
quelques dizaines de minutes, le lugol cristallise sur le pourtour de la lamelle. De plus, selon
Tangtrongsups, les kystes semblent se collaber aprs une vingtaine de minutes, lidentification
devient alors plus difficile [Tangtrongsups et Scorza (2010)].
La coloration par le lugol est une mthode sensible et spcifique. Cette technique peut
tre parfois difficile lire, mais elle permet daugmenter la sensibilit et la rapidit de lecture
par rapport une coproscopie simple sans en augmenter la dure ni le cot.

La mthode de Heine na pas t dcrite pour la mise en vidence des kystes de
giardia. Cependant, nous avons observ que la fuchsine colore les kystes en rose mais cette
mthode est significativement moins sensible que le lugol.
La lame est cependant difficile lire car la fuchsine colore les dbris et les kystes dans
la mme teinte, il peut donc savrer ncessaire dutiliser une autre technique pour donner un
diagnostic prcis [Badparva et al. (2009)].

La mthode de coloration la plus efficace pour mettre en vidence les kystes de giardia
est donc la coloration au lugol, elle est rapide et peu coteuse, elle peut galement tre utilise
pour confirmer un diagnostic douteux sur une coproscopie simple.

3. Pour la recherche dEimeria

Tout comme pour les kystes de giardia, le saccharose na pas t dcrit comme
permettant une modification de couleur ou de morphologie des oocystes dEimeria, ce qui
correspond aux observations faites pendant ce travail. Le montage de la lamelle issue dune
122

concentration par flottation dans du saccharose ne montre donc aucun intrt. Cependant la
solution de Sheather peut tre utilise directement pour la flottation [McNabb et al. (1985),
Weber et al. (1992)]. En effet cette solution est utile car nous avons pu constater qu'elle ne
cristallise pas rapidement et ne dforme par les oocystes.

Nous avons observ que le lugol donne une teinte jauntre tous les lments prsents
sur les lames (hormis les oocystes de C. parvum et les kystes de giardia), il teinte donc
galement les oocystes dEimeria ce qui diminue le contraste. La sensibilit est galement
diminue par rapport une mthode sans coloration, de plus le jaunissement des oocystes te
le critre de couleur des caractristiques utilisables pour lidentification des espces
dEimeria. Il a t constat au cours de cette tude, que les oocystes dE. bovis, se colorent
mieux que les autres, ceux-ci sont donc plus faciles reconnaitre grce au lugol, mais cette
solution amliore seulement lidentification de cette espce. Ces observations nont pas t
mentionnes dans dautres tudes, il convient donc de rester prudent quant ces constatations.

Tout comme la coloration au lugol, laction de la fuchsine sur les oocystes dEimeria
na pas t dcrite dans la bibliographie. Les colorations ralises au cours de cette tude,
nous ont permis de voir que la fuchsine colore les oocystes de coccidies et les dbris
vgtaux, la lecture de la lame est rendue plus difficile en raison dune diminution du
contraste par rapport une lame non colore. Lidentification des espces est galement
complique par la fuchsine sauf pour les oocystes dE. bovis qui apparaissent plus foncs que
les autres aprs laction du colorant, mais cette observation na pas t confirme par dautres
tudes.

Au final, les colorations au lugol et la fuchsine apparaissent nfastes sur la mise en
vidence et lidentification des espces dEimeria. Le montage au saccharose semble inutile.
La mthode la plus efficace pour la recherche de coccidies est donc la coproscopie simple.

123

Pour conclure, certaines mthodes de colorations rapides permettent damliorer la
sensibilit et de faciliter la lecture lors de la recherche de formes kystiques de C. parvum ou
de G. intestinalis. De plus elles peuvent tre aisment ralises en laboratoire ou en clinique
vtrinaire. Mais il est important de choisir le colorant en fonction de lhypothse
diagnostique.

Lors de la recherche des oocystes dEimeria ainsi que leur identification, lutilisation
de colorant napporte pas dintrt et diminue mme la sensibilit de la coproscopie. Un
protocole de coloration apparait donc inutile voire nfaste pour la dtection des oocystes de
coccidies. Les colorants nont pas permis de faciliter lidentification des oocystes non
sporuls dEimeria, mais il pourrait tre intressant de raliser nouveau ce test sur des
oocystes sporuls.
Lors dune demande de recherche de cryptosporidies, nous conseillons lutilisation
dune solution de saccharose pour mettre en vidence les oocystes de C. parvum, le montage
au saccharose tant facile raliser et lire, aussi sensible quune mthode de Ziehl-Neelsen
modifie tout en tant plus rapide et moins couteuse. Lutilisation du montage au saccharose
de faon systmatique sur tous les prlvements pourrait permettre la dtection de
nombreuses cryptosporidioses sub-cliniques jusqu prsent non dtectes lors de
coproscopies simples.
En ce qui concerne la recherche de kystes de giardia, le lugol est le colorant rapide de
choix, il permet damliorer significativement la sensibilit et daugmenter la rapidit de
lecture par rapport une coproscopie simple. Malgr lutilisation de ce colorant, le diagnostic
de giardiose peut parfois savrer dlicat, lutilisation de tests immunochromatographiques est
alors un bon moyen de raliser ce diagnostic.
124

125

CONCLUSION GENERALE

Parmi les protozoaires prsents chez les bovins, trois genres ont une importance
majeure. Les lments parasitaires de ces genres sont dtectables en coproscopie, mais la
petite taille de certains peut rendre le diagnostic difficile. Dautres mthodes dexamen des
selles peuvent alors tre utilises afin de les dtecter, comme les mthodes immunologiques
ou de biologies molculaires. Pour faciliter le diagnostic coproscopique, des techniques
utilisant des solutions colorantes ont t dcrites, elles ont des sensibilits et des spcificits
diffrentes et ne concernent pas tous les protozoaires intestinaux.

Dans lenqute ralise pour ce travail auprs des LVD et LDA, la majorit dentre
eux a choisi dutiliser des techniques de coloration pour mettre en vidence les lments
parasitaires de Giardia et de Cryptosporidium.

En effet, aprs comparaison de 3 mthodes de coloration rapides et couramment
utilises dans les laboratoires, il existe des techniques assez sensibles et spcifiques.
Le lugol est le colorant le plus sensible et spcifique pour la dtection des kystes de
giardia, cest galement le colorant le plus utilis par les laboratoires pour cette recherche.
La mthode de Heine observe au microscope optique ne sest pas avre facile ni
efficace pour la dtection des 3 genres de protozoaires tudis.
La coloration au saccharose est aussi sensible et spcifique que la coloration de Ziehl-
Neelsen modifie pour la mise en vidence de C. parvum. Le montage au saccharose est
cependant plus rapide et moins coteux, cest toutefois la mthode la moins utilise dans les
laboratoires ayant rpondus lenqute.
Aucun laboratoire na mentionn utiliser une mthode spciale pour la dtection des
coccidies, et lors de ltude des colorants sur les lments du genre Eimeria, aucune solution
colorant les lments parasitaires na permis damliorer la sensibilit dune coproscopie
simple.

Il est donc ncessaire davoir de bonnes hypothses diagnostiques afin de pouvoir
mettre en place la technique correspondant au parasite recherch.
126

Les techniques de coloration spcifiques dun parasite permettent le diagnostic de
faon aise et elles sont ralisables par une personne non exprimente. Des colorations
pourraient tre testes pour la dtection et la distinction dautres lments parasitaires, comme
par exemple pour les nmatodes ou les trmatodes.

127

127
128

129

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ACHIR I., HAMRIOUI B. (2001)
Grand Cours Institut Pasteur dAlgrie. La coprologie parasitaire.
Editions Pirates, Alger, 39p.

ADAM K.M.G., PAUL J., ZAMAN V. (1971)
Laboratory aids in the diagnosis of protozoan infections
In: Medical and Veterinary protozoology, an illustrated guide.
Longman group limited, Ontario, 162-166.

ADDISS D.G. et al. (1991)
Evaluation of a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay for Giardia
lamblia antigen in stool.
J. Clin. Microbiol. 29, (6), 11371142.

ADJOU K., MICHE N., BRUGERE-PICOUX J. (2006)
Principales affections du systme nerveux des ovins.
Point vt. 263, 2430.

ALDEEN W. E., HALE D.V., ROBISON A.J., CARROLL K. (1995)
Evaluation of a commercially available ELISA assay for detection of Giardia lamblia in fecal
specimens.
Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 21, (2), 7779.

ALLES A.J., WALDRON M.A., SIERRA L.S., MATTIA A. R. (1995)
Prospective comparison of direct immunofluorescence and conventional staining methods for
detection of Giardia and Cryptosporidium spp. in human fecal specimens.
J. Clin. Microbiol. 33, (6), 16321634.

130

AMATO NETO V., BRAZ L.M., DI PIETRO A.O., MODOLO J.R. (1996)
Oocyts of Cryptosporidium sp. In feces: comparison of the modified Kinyoun and Heine
method.
Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 29, (6), 575-578.

ANONYME, Coprologie parasitaire. [en ligne]. In : Universit Lille 2 Droit et Sant, Site de
la facult des Sciences Pharmaceutiques et BiologiquesUniversit de p de Lille 2, Site de
cours en ligne. Site disponible sur : http://pharmacie.univ-
lille2.fr/typo3conf/ext/naw_securedl/secure.php?u=0&file=fileadmin/user_upload/ressources_
communes/aides_pedagogiques/parasitologie/uvb1/copro-parasitaire-
080307.pdf&t=1261977509&hash=6acd8ea0e523af6f658a05bffb00e63c. (Page consulte le
29/08/2012)

BADPARVA E., FALLAHI S., SEPAHVAND A. (2009)
The comparison of the efficacy of various fixatives on diverse staining methods of Giardia
lamblia cyst.
Pak. J. Biol. Sci. 12, (17), 12121216.

BAILENGER J. (1982)
Coprologie parasitaire et fonctionnelle. 4
me
dition
E. Drouillard, Bordeaux, 324p.

BARON E.J., SCHENONE C., TANENBAUM B. (1989)
Comparison of three methods for detection of Cryptosporidium oocysts in a low-prevalence
population.
J. Clin. Microbiol. 27, (1), 223224.

BERTRAND I., GANTZER C., CHESNOT T., SCHWARTZBROD J. (2004)
Improved specificity for Giardia lamblia cyst quantification in wastewater by development of
a real-time PCR method.
J. Microbiol. Methods 57, (1), 4153.

131

BESSIRES M.-H., LINAS M.-D., BOYER M. (1995)
Recherche de cryptosporidies dans les selles.
Rev. fr. Lab. 1995, (279), 125126.

BEUGNET F. (2000)
Diagnostic coproscopique en pratique.
Action vt. 1510, (Cahier clinique n41), 7p.

BEUGNET F., BOURDOISEAU G., VILLENEUVE V. (2000)
La giardiose des carnivores domestiques.
Action vt. 1518, (cahier clinique n49), 7p.

BEUGNET F., POLACK B., DANG H. (2004)
Atlas de coproscopie.
Kalianxis, Clichy, 277p.

BIALEK R., BINDER N., DIETZ K., JOACHIM A., KNOBLOCH J., ZELCK U. E. (2002)
Comparison of fluorescence, antigen and PCR assays to detect Cryptosporidium parvum in
fecal specimens.
Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43, (4), 283288.

Bioforma (1998).
Flagells formes vgtatives et kystes
In Cahier de formation - Amibes et flagells intestinaux.
EGOPRIM, Paris, 169182.

BJRKMAN C., SVENSSON C., CHRISTENSSON B., DE VERDIER K. (2003)
Cryptosporidium parvum and Giardia intestinalis in calf diarrhoea in Sweden.
Acta vet.scand. 44, (3-4), 145152.

BOUFASSA- OUZROUT S., CHERMETTE R., MEISSONNIER E. (1986)
La cryptosporidiose : Une maladie animale et humaine cosmopolite. Srie technique n5.
Office international des Epizooties, Paris, 97 p.

132

BOWMAN D.D. (2003)
Protozoans
In GeorgisParasitology for Veterinarians.
Saunderts, St Louis, 84-114.

BRONSDON M.A. (1984)
Rapid dimethyl sulfoxide-modified acid-fast stain of Cryptosporidium oocysts in stool
specimens.
J. Clin. Microbiol. 19, (6), 952953.

BROUSSARD J.D. (2003)
Optimal fecal assessment.
Clin. Tech. small Anim. Pract.18, (4), 218230.

BULLOCK W.L. (1980)
The use of the Kohn chlorazol black fixative-stain in an intestinal parasite survey in rural
Costa Rica.
J. Parasitol. 66, (5), 811813.

BURKE J. A. (1977)
The clinical and laboratory diagnosis of giardiasis.
CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 7, (4), 373391.

CARTWRIGHT C.P. (1999)
Utility of Multiple-Stool-Specimen ova and parasite examinations in e high prevalence
setting.
J. Clin. Microbiol. 37, (8), 2408-2411.

CASEMORE D.P. (1991)
Laboratory methods for diagnosing cryptosporidiosis.
J. Clin. Pathol. 44, (6), 445-451.

133

CASEMORE D.P., ARMSTRONG M., JACKSON B. (1984)
Screening for cryptosporidium in stools.
Lancet, 1, (8379), 734735.

CASEMORE D. P., ARMSTRONG M., SANDS R.L. (1985)
Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis.
J. Clin. Pathol. 38, (12), 13371341.

CASTRO-HERMIDA J.A., PORS I., POUPIN B., ARES-MAZAS E., CHARTIER C. (2005)
Prevalence of Giardia duodenalis and Cryptosporidium parvum in goat kids in western
France.
Small Ruminant Res. 56, (1-3), 259264.

CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, Parasites - Giardia. [en ligne].
In: CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Site disponible sur :
http://www.cdc.gov/parasites/giardia/biology.html. (Page consulte le 9/09/2012)

CHARTIER C. (2002)
Protozooses digestives.
Dpche vt. 81, 212.

DAUGSCHIES, DITMTMAR : Diagnosis of Bovine coccidiosis. [CD-Rom]. Leverleuser :
Bayer HealthCare Animal Health. 2007

DENIS G., RICHARD A., REYNAUD A., VALOGNES A. (2008)
Prvalence des coccidies chez les veaux laitiers en Vende.
In : Rencontres Recherches Ruminants. 90p.

DEPIERREUX C., PE E., PAQUET A., RAIMOND O., LECLIPTEUX T. (2001)
Limmunochromatographie, technique alternative la microscopie et l ELISA, pour la
dtection rapide, simple, efficace et performante du Cryptosporidium parvum.
Focus diagnostica, 9, (4), 9093.

134

DE WAAL T. (2012)
Advances in diagnosis of protozoan diseases.
Vet. Parasitol. 189, (1), 65-74.

DIAZ-LEE A. et al. (2011)
Cryptosporidium parvum in diarrheic calves detected by microscopy and identified by
immunochromatographic and molecular methods.
Vet. Parasitol. 176, (2-3), 139144.

DIXON B.R., PARENTEAU M., MARTINEAU C., FOURNIER J. (1997)
A comparison of conventional microscopy, immunofluorescence microscopy and flow
cytometry in the detection of Giardia lamblia cysts in beaver fecal samples.
J. immunol. Meth. 202, (1), 2733.

DORCHIES P., DUNCAN J., LOSSON B., ALZIEU J.-P. (2012)
Protozooses.
In Parasitologie clinique des bovins.
Editions MedCom, Paris, 342p.

FAYER R. MORGAN U., UPTON S.J. (2000)
Epidemiology of Cryptosporidium: transmission, detection and identification.
Int. J. Parasitol., 30, 13051322.

FAYER R., SANTIN M., XIAO L. (2005)
Cryptosporidium bovis n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) in cattle (Bos taurus).
J. Parasitol. 91, (3), 624-629.

FAYER R., SPEER C.A., DUBEY J.P. (1990)
Cryptosporidiosis of Man and Animals.
CRC Press, Boca Raton, 356p.

135

GAAFAR M.R. (2011)
Evaluation of enzyme immunoassay techniques for diagnosis of the most common intestinal
protozoa in fecal samples.
Int. J. infect. Dis. 15, (8), 541544.

GARCIA L.S., BREWER T.C., BRUCKNER D.A. (1979)
A comparison of the formalin-ether concentration and trichrome-stained smear methods for
the recovery and identification of intestinal protozoa.
Am. J. med. Technol. 45, (11), 932935.

GARCIA L.S., BRUCKNER D.A., BREWER T.C., SHIMIZU R.Y. (1983)
Techniques for the recovery and identification of Cryptosporidium oocysts from stool
specimens.
J. Clin. Microbiol. 18, (1), 185190.

GARCIA L., SHIMIZU R. (1997)
Evaluation of nine immunoassay kits (enzyme immunoassay and direct fluorescence) for
detection of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum in human fecal specimens.
J. Clin. Microbiol. 35, (6), 15261529.

GOLVAN Y.V., AMBROISE-THOMAS P. (1984)
Les nouvelles techniques en parasitologie.
Flammarion, ed., Chevilly-Larue, 306 p.

HANSCHEID T., CRISTINO J.M., SALGADO M.J. (2008)
Screening of auramine-stained smears of all fecal samples is a rapid and inexpensive way to
increase the detection of coccidial infections.
Int. J. infect. Dis. 12, (1), 4750.

HARRINGTON B.J. (2008)
Micoscopy of 4 pathogenic enteric protozoan parasites: A review.
Lab. med. 39, (4), 231238.

136

HENDRIX C.M. (1998)
Diagnostic Veterinary parasitology. 2
nd
edition.
Mosby, St Louis, 321p.

HENRIKSEN S.A., POHLENZ J.F. (1981)
Staining of cryptosporidia by a modified Ziehl-Neelsen technique.
Acta vet. scand. 22, (3-4), 594596.

HIGGINS J.A. et al. (2001)
Real-time PCR for the detection of Cryptosporidium parvum.
J. Microbiol. Methods, 47, 323337.

HUETINK R.E., VAN DER GIESSEN J.W., NOORDHUIZEN J.P., PLOEGER H.W. (2001)
Epidemiology of Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis on a dairy farm.
Vet. Parasitol. 102, (1-2), 5367.

Institut de llevage (2000)
Les maladies dues des parasites unicellulaires
In Maladies des bovins.
France Agricole, Paris, 548 p.

JOKIPII A.M., JOKIPII L. (1977)
Prepatency of giardiasis.
Lancet, 1, (8021), 10951097.

KAR S., GAWLOWSKA S., DAUGSCHIES A., BANGOURA B. (2011)
Quantitative comparison of different purification and detection methods for Cryptosporidium
parvum oocysts.
Vet. Parasitol. 177, (3-4), 366-370.

KAWAHARA F. et al. (2010)
Genetic analysis and development of species-specific PCR assays based on ITS-1 region of
rRNA in bovine Eimeria parasites.
Vet. Parasitol. 174, (1-2), 4957.
137

KEHL K.S., CICIRELLO H., HAVENS P.L. (1995)
Comparison of four different methods for detection of Cryptosporidium species.
J. Clin. Microbiol. 33, (2), 416418.

KHELEF D., AKAM A., KAIDI R., HUSSEIN M.S.A., UTEU E., COZMA V. (2002)
Evaluation comparative des mthodes de dtection de loocyste de Cryptosporidium parvum
dans les selles des veaux.
Sci. Parasitol. 1, 2227.

KITVIA, Cryptosporidium Ag, test rapide.
In: KITVIA. Biologie Vtrinaire, Industrielle, Agroalimentaire. [en ligne]. Disponible sur :
http://www.kitvia.com/images/sampledata/kitvia/veterinaire/test_diagnostic/test_rapide/crypt
o_ag_bq.pdf. (Page consulte le 23/08/2012)

KUCZYNSKA E., SHELTON D.R. (1999)
Method for detection and enumeration of Cryptosporidium parvum oocysts in feces, manures,
and soils.
Appl. Environ. Microbiol. 65, (7), 28202826.

KVC M., KVETONOV D., PZOV G., DITRICH O. (2003)
Comparison of selected diagnostic methods for identification of Cryptosporidium parvum and
Cryptosporidium andersoni in routine examination of faeces.
J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health, 50, (8), 405411.

LEVINE N.D. (1973)
Protozoan parasites of domestic animals and of man, 2
nd
edition.
Burgess publishing Company, Mineapolis, 406.

LINDSAY D.S., UPTON S.J., OWENS D.S., MORGAN U.M., MEAD J.R., BLAGBURN
B.L. (2000)
Cryptosporidium andersoni n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporiidiae) from cattle, Bos Taurus.
J. Eukaryot. Microbiol. 47, (1), 91-95.

138

MacPHERSON D.W., McQUEEN R. (1993)
Cryptosporidiosis: multiattribute evaluation of six diagnostic methods.
J. Clin. Microbiol. 31, (2), 198202.

MAGNE D., CHOCHILLON C., SAVEL J., GOBERT J.G. (1996)
Giardia intestinalis et giardiose.
Journal de Pdiatrie et de Puriculture, 9, (2), 7483.

MARTINEZ I., BELDA NETO F.M. (2001)
Contribution to the laboratory diagnosis of human cryptosporidiosis.
Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 43, (2), 79-82.

McNABB S.J., HENSEL D.M., WELCH D.F., HEIJBEL H., McKEE G.L., ISTRE G.R.
(1985)
Comparison of sedimentation and flotation techniques for identification of Cryptosporidium
sp. oocysts in a large outbreak of human diarrhea.
J. Clin. Microbiol. 22, (4), 587589.

MEGACOR, Diagnostik megacor. [en ligne]. In: MEGACOR, MegaCor Diagnostik,
Veterinary diagnostic. Site disponible sur : http://www.megacor.at/product.html. (Page
consulte le 01/11/2012)

NACIRI M., LACROIX S., LAURENT F. (2000)
La cryptosporidiose des ruminants.
Action vt. 1536, 1723.

NACIRI M., LEFAY M.P., MANCASSOLA R., POIRIER P., CHERMETTE R. (1999)
Role of Cryptosporidium parvum as a pathogen in neonatal diarrhoea complex in suckling and
dairy calves in France.
Vet. Parasitol. (85), 245257.

139

NAVETAT H., RICHARD A., DURAND Y., BRIANT E. (1996)
Coccidioses bovines cliniques et subcliniques
In: Groupe de recherche et de dveloppement pour l'levage et la pathologie du veau.
Protozooses bovines actualits, Annecy, 3 octobre 1996, Socit franaise de buiatrie, 213.

NICHOLS G., THOM B.T. (1984)
Screening for Cryptosporidium in stools.
Lancet, 1, (8379), 735.

OLSON M.E. et al. (1997)
Giardia and Cryptosporidium in dairy calves in British Columbia.
Can. Vet. J. 38, (11), 703706.

OMS (1997)
Parasitologie mdicale: techniques de base pour le laboratoire.
Organisation Mondiale de la Sant, Genve, 63p.

ORTOLANI E.L. (2000)
Standardization of the modified Ziehl-Neelsen technique to stain oocysts of Cryptosporidium
sp..
Rev. Bras. Parasitol. Vet. 9, (1), 2931.

ODONOGHUE P.J. (1995)
Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animals.
Int. J. Parasitol. 25, (2), 139195.

O'HANDLEY R.M., COCKWILL C., MCALLISTER T.A., JELINSKI M., MORCK D.W.,
OLSON M.E. (1999)
Duration of naturally acquired giardiosis and cryptosporidiosis in dairy calves and their
association with diarrhea.
J Am Vet Med Assoc. 214, (3), 391396.

140

OHANDLEY R.M., OLSON M.E. (2006)
Giardiasis and cryptosporidiosis in ruminants.
Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. 22, (3), 623643.

OHARA S.P., CHEN X.-M. (2011)
The cell biology of cryptosporidium infection.
Microbes Infect. 13, (8-9), 721730.

PAPINI R., CARDINI G. (2006)
Evaluation of a rapid Cryptosporidium / Giardia immunochromatographic test for diagnosis
of giardiasis in dogs.
Rev. Md.Vt. 157, (10), 490493.

PAUL S. et al. (2009)
Comparative evaluation and economic assessment of coprological diagnostic methods and
PCR for detection of Cryptosporidium spp. in bovines.
Vet. Parasitol. 164, 291295.

PITEL P.-H., CHAUVIN A., FORTIER G., BALLET J.-J., FAVENNEC L. (2005)
Quelle attitude adopter lors de giardiose
Point vt. 255, 3435.

POHJOLA S. (1984)
Negative staining method with nigrosin for the detection of cryptosporidial oocysts: a
comparative study.
Res. Vet. Sci. 36, (2), 217219.

POHJOLA S., JOKIPII L., JOKIPII A.M.M. (1985)
Dimethylsulphoxide-Ziehl-Neelsen staining technique for detection of cryptosporidial
oocysts.
Vet. Rec. 116, (16), 442443.

141

POLACK B., CHERMETTE R., SAVEY M., BUSSIERAS J. (1983)
Les cryptosporidies en France. Techniques usuelles didentification et rsultats prliminaires
d'enqutes pidmiologiques.
Point vt. 15, (71), 4146.

QUILEZ J., SANCHEZ-ACEDO C., CLAVEL A., DEL CACHO E., LOPEZ-BERNAD F.
(1996)
Comparison of an acid-fast stain and a monoclonal antibody-based immunofluorescence
reagent for the detection of Cryptosporidium oocysts in faecal specimens from cattle and pigs.
Vet. Parasitol. 67, (1-2), 7581.

RICHARD A., RIZET C., REYNAUD A., VALOGNES A. (2006)
Prvalence des coccidies sur veaux Charolais ltable dans lAllier
In Rencontres Recherches Ruminants. 441p.

ROBERT B., GINTER A., ANTOINE H., COLLARD A., COPPE P. (1990)
Diagnosis of bovine cryptosporidiosis by an enzyme-linked immunosorbent assay.
Vet. Parasitol. 37, (1), 18.

ROUSSET J. (1993)
Copro-parasitologie pratique Intrt et mthodologie.
ESTEM, Paris, 89p.

THERMO SCIENTIFIC, Thermo Scientific rapid new tests that enable swifter diagnosis and
infection control. [en ligne]. In: Rapidmicrobiolgy. Site disponible sur :
http://www.rapidmicrobiology.com/news/603h301.php. (Page consulte le 23/08/2012)

SCORZA V., TANGTRONGSUP S. (2010)
Update on the diagnosis and management of Cryptosporidium spp. infections in dogs and
cats.
Top Companion Anim. Med. 25, (3), 163169.

142

SHETTY N., PRABHU T. (1988)
Evaluation of faecal preservation and staining methods in the diagnosis of acute amoebiasis
and giardiasis.
J. Clin. Pathol. 41, (6), 694699.

ST JEAN G., COUTURE Y., DUBREUIL P., FRECHETTE J.L. (1987)
Diagnosis of Giardia infection in 14 calves.
J Am Vet Med Assoc. 191, (7), 831832.

TAN K.S.W. (2004)
Blastocystis in humans and animals: new insights using modern methodologies.
Vet. parasitol. 126, (1-2), 121-144.

TANGTRONGSUP S., SCORZA V. (2010)
Update on the diagnosis and management of Giardia spp infections in dogs and cats.
Top Companion Anim Med. 25, (3), 155162.

TAYLOR M.A., COOP R.L., WALL R.L. (2007)
Veterinary parasitology, 3
me
dition.
Blackwell publishing, Oxford, 874p.

TAYLOR M.A., WEBSTER K.A. (1998)
Recent advances in the diagnosis in livestock of Cryptosporidium, Toxoplasma, Giardia and
other protozoa of veterinary importance.
Res Vet Sci. 65, 183193.

THORNTON S.A., WEST A.H., DUPONT H.L., PICKERING L.K. (1983)
Comparison of methods for identification of Giardia lamblia.
American J. Clin. Pathol. 80, (6), 858860.

TROTZ-WILLIAMS L.A. et al. (2005)
Multiattribute evaluation of two simple tests for the detection of Cryptosporidium parvum in
calf faeces.
Vet. Parasitol. 134, (1-2), 1523.
143

UNGUREANU E.M., DONTU G.E. (1992)
A new staining technique for the identification of Cryptosporidium oocysts in faecal smears.
Trans. r. Soc. trop. Med. Hyg. 86, (4), 638.

VOHRA P., SHARMA M., CHAUDHARY U. (2012)
A comprehensive review of diagnostic techniques for detection of Cryptosporidium parvum in
stool samples.
IOSR Journal of pharmacy; 2, (5), 15-26.

WEBER R., BRYAN R.T., JURANEK D.D. (1992)
Improved stool concentration procedure for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal
specimens.
J. Clin. Microbiol. 30, (11), 2869-2873.

WOLFE M.S. (1992)
Giardia.
Clin. Microbiol. Rev. 5, (1), 93-100.

XIAO L., HERD R.P., RINGS D.M. (1993)
Concurrent infections of Giardia and Cryptosporidium on two Ohio farms with calf diarrhea.
Vet. Parasitol. 51, (1-2), 4148.

ZIERDT C.H. (1991)
Pathogenicity of Blastocystis hominis.
J. Clin. Microbiol. 29, (3), 662-663.
144

145

ANNEXES
146

Annexe 1 : Les sites de prdilections, les priodes prpatentes des espces dEimeria chez
les bovins
[D'aprs TAYLOR et al. (2007)]

Espces Site de prdilection Priode prpatentes (en
jours)
Espces pathognes
E. alabamensis Intestin grle et gros intestin 6-11
E. zuernii Intestin grle et gros intestin 15-17 (12-14 pr georgis)
E. bovis Intestin grle et gros intestin 16-21
Espces non pathognes
E. auburnensis Intestin grle 16-24
E. brasiliensis ? ?
E. bukidnonensis ? ?
E. canadensis ? ?
E. cylindrica ? 10
E. ellipsoidalis Intestin grle 8-13
E. pellita ? ?
E. subspherica ? 7-18
E. wyomingensis ? 13-15

147

Annexe 2 : Les sites de prdilections et les priodes prpatentes des espces dEimeria
chez les ovins
[D'aprs Taylor et al. (2007)]

Espces Site de prdilection Priode prpatente (en
jours)
Espces pathognes
E. crandallis Intestin grle et gros intestin 15-20
E. ovinoidalis Intestin grle et gros intestin 12-15
E.ahsata Intestin grle 18-30
E. bakuensis Intestin grle 18-29
E. faurei Intestin grle et gros intestin 13-15
E. granulosa ? ?
E. intricata Intestin grle et gros intestin 23-27
E. marsica ? 14-16
E. pallida ? ?
E. parva Intestin grle et gros intestin 12-14
E. weybridgensis Intestin grle 23-33

148

Annexe 3 : Les sites de prdilections et les priodes prpatentes des espces dEimeria
chez les caprins

Espces Site de prdilection Priode prpatente
(en jours)
Espces pathognes
E. caprina Intestin grle et gros intestin 17-20
E. ninakohlyakimovae Intestin grle et gros intestin 10-13
E. christenseni Intestin grle 14-23
E. hirci ? 13-16
E. alijevi Intestin grle et gros intestin 7-12
E. aspheronica ? 14-17
E. arloingi Intestin grle 14-17
E. caprovina ? 14-20
E. jolchijevi ? 14-17

149

Annexe 4 : Schma et description de la morphologie des oocystes sporuls des espces
dEimeria prsentes chez les bovins
[D'aprs Taylor et al. (2007) et Dorchies et al. (2012)]

150

Espces Description des oocystes Taille (m)
Espces pathognes
E. alabamensis

Ovode, transparent, coque lisse, absence de micropyle,
absence de CR doocyste et de sporocyste
18 x 13,4
E. zuernii

Sphrique subsphrique, transparent, absence de micropyle,
absence de corps rsiduel doocyste et de sporocyste
15,6 x 17,8
E. bovis

Ovode subsphrique, transparent, micropyle difficilement
visible, prsence dun CR
27,7 x 20,3
E. auburnensis

Ellipsode ovode, couleur jaune-marron, micropyle avec
granule polaire, absence de CR doocyste, prsence de CR de
sporocyste
38,4 x 23,1
E. brasiliensis

Ellipsode ovode, couleur jaune-marron, micropyle
recouvert dune capsule polaire, granules polaires parfois
prsent, absence de CR doocyste, prsence de CR de
sporocyste
37 x 27
E.
bukidnonensis

Piriforme ovode, aplati un ple, couleur jaune-marron,
coque strie, micropyle, granule polaire parfois prsent
48,6 x 35,4
E. canadensis

Ovode ellipsode, transparent jaune, micropyle et granules
polaires, absence de CR doocyste, prsence de CR de
sporocyste
32,5 x 23,4
E. cylindrica

Allong cylindrique, transparent, coque lisse, absence de
micropyle et de CR doocyste, prsence de CR de sporocyste
23,3 x 12,3
E. ellipsoidalis

Ellipsode ovode, transparent, coque lisse, absence de
micropyle et de CR doocyste, prsence de CR de sporocyste
23,4 x 15,9
E. pellita

Ovode, coque marron prsentant parfois des protubrances,
micropyle et granules polaires, absence de CR doocyste,
prsence de CR de sporocyste
40 x 28
E. subspherica

Sphrique subsphrique, transparent, absence de micropyle
et de CR doocyste et de sporocyste
11 x 10,4
E.
wyomingensis
Ovode, couleur jaune-marron, coque fine, prsence dun
micropyle, absence de CR
40,3 x 28,1

151

dEimeria prsentes chez les ovins

152

Espces Description des oocystes Taille
moyenne
(m)
Espces pathognes
E. crandallis

Ellipsode subsphrique, avec ou sans capsule polaire,
absence de CR doocystes, prsence de CR de sporocystes
21,9 x 19,4
E. ovinoidalis

Ellipsode, transparent jaune ple, absence de CR
doocystes, prsence de CR de sporocystes
23 x 18
E.ahsata

Ovode avec une capsule polaire, couleur jaune-marron,
absence doocyste rsiduel
33,4 x 22,6
E. bakuensis

Ellipsode avec une capsule polaire, couleur jaune-marron
ple, absence de CR doocystes, prsence de CR de
sporocystes
31 x 20
E. faurei

Ovode, couleur jaune-marron ple, absence de CR
doocystes ou de sporocystes
33 x 23
E. granulosa

En forme durne, avec une large capsule polaire, couleur
jaune- marron, absence doocystes rsiduels
29,4 x 20,9
E. intricata

Ellipsode, coque mince et strie couleur marron, absence
doocystes rsiduels
48 x 34
E. marsica

Ellipsode, micropyle inconstant, couleur ple jaune-
marron, absence de CR doocystes et de sporocystes
19 x 13
E. pallida

Ellipsode, coque fine, couleur ple jaune, absence de CR
14 x 10
E. parva

Sphrique subsphrique, couleur ple, absence de CR
16,5 x 14,0
E.
weybridgensis

Ellipsode subsphrique, prsence dun micropyle avec ou
sans calotte, absence de CR doocystes ou de sporocystes
24 x 17

153

dEimeria prsentes chez les caprins

154

Espces Description des oocystes Taille
moyenne (m)
Espces pathognes
E. caprina

Ellipsode, couleur jaune-marron marron fonc,
prsence dun micropyle et de CR de sporocystes.
absence de CR doocystes
32 x 23
E.
ninakohlyakimovae

Ellipsode, coque fine, transparent, absence de
micropyle et de CR doocyste, prsence de CR de
sporocystes
20,7 x 14,8
E. christenseni

Ovode, coque fine, couleur claire jaune ple,
prsence dun micropyle, dune capsule polaire et de
CR de sporocystes, absence de CR doocystes
38 x 25
E. hirci

Rond ovale, couleur jaune ple, prsence dun
micropyle et dune capsule polaire, absence de CR
doocystes
20,7 x 16,2
E. alijevi

Ovode ellipsode, micropyle inconstant, transparent
jaune ple, absence de CR doocystes, prsence de
CR de sporocystes
17 x 15
E. arloingi

Ellipsode, coque fine, prsence dun micropyle, dune
capsule polaire de CR de sporocystes, absence de CR
doocystes
27 x 18
E. aspheronica

Ovode, couleur vert jaune-marron, prsence dun
micropyle et de CRde sporocystes, absence de rsidus
doocystes
31 x 32
E. caprovina

Ellipsode subsphrique, transparent, prsence dun
micropyle et de CR de sporocystes, absence de rsidus
doocystes
30 x 24
E. jolchijevi

Ellipsode ovode, couleur jaune ple, prsence dun
micropyle dune capsule polaire et de CR de
sporocystes, absence de rsidus doocystes
31 x 22

155

Annexe 7 : Protocole de coloration par la mthode de Bailenger et Faraggi
[Bailenger (1982)]

MATERIEL NECESSAIRE :
Violet cristal
Fuchsine basique
Alcool 95
Phnol cristallis
Eau distille

PREPARATION PRELIMINAIRE :
Ractif :
Violet cristal : 50g
Fuchsine basique : 10mg
Alcool 95 : 20 ml
Phnol cristallis fondu : 4 ml
Eau distille : 100 ml
Dissoudre le violet cristal et la fuchsine dans lalcool 95 et le phnol. Ajouter leau aprs
dissolution.
Maintenir le ractif labri de la lumire dans un flacon hermtique. Utiliser
seulement le surnageant.

MODE OPERATOIRE :
1- Mettre une goutte de fces liquide ou raliser un mlange de fces dans une goutte de
srum physiologique
2- Avec le coin dune lamelle mlanger une goutte de ractif
3- Recouvrir dune lamelle
4- Observer au microscope avec un objectif immersion

156

Annexe 8 : Protocole de coloration par la mthode M.I.F.
[Bailenger (1982)]

Solution de lugol
Teinture de merthiolate n99 1 Lilly
Solution de formol

Ractif :
Teinture de merthiolate : 77,5 ml
Lugol : 10 ml
Formol : 12,5 ml

Les proportions peuvent tre modifies car le lugol saltre avec le temps, il peut alors
tre ncessaire daugmenter la proportion de lugol pour compenser sa dtrioration.
La conservation du mlange ne dpasse pas 6 8 heures.

MODE OPERATOIRE :
1- Mlanger une goutte de ractif et une goutte deau distille
2- Dlayer une petite quantit de fces
4- Observer au microscope optique lobjectif x40

157

Annexe 9 : Protocole de coloration de la technique dHeindenhain
[Bailenger (1982)]
Alun de fer
Hmatoxyline cristallise
Alcool 90

Mordant :
Alun de fer : 3g
La solution doit tre ralise froid, elle est jaune et se conserve au rfrigrateur.

Colorant :
Solution mre :
Hmatoxyline cristallise : 10g
Alcool 90 : 100 ml
Cette solution doit tre prpare et laisse la lumire diffuse pendant 15 jours minimum.

Solution extemporane : dilution de la solution mre au dixime

Diffrenciateur : Mordant dilu au demi

MODE OPERATOIRE :
1- Raliser un frottis fcal
2- Fixer la lame
3- Plonger la lame dans le mordant 37C pendant 30 minutes
4- Rincer leau distille
5- Plonger la lame dans la solution extemporane de colorant pendant 30 minutes 37C
ou 24 heures temprature ambiante
6- Laver la lame leau distille
7- Placer la lame sur la platine du microscope (ou sur une boite de Ptri pour ne pas salir
la platine du microscope)
8- Mettre quelques gouttes de diffrenciateur sur la lame
9- Lorsque les structures nuclaires ressortent, rincer la lame leau courante
10- Raliser le montage de la lame
158

Annexe 10 : Protocole de la mthode de coloration de Trichrome de gomori-Weathley
[Bailenger (1982)]

Chromotrope 2R
Vert lumire SF
Acide phosphotungstique
Acide actique cristallisable
Alcool 90

Colorant trichrome de Gomori :
Chromotrope 2R : 0,6g
Vert lumire SF : 0,3g
Acide phosphotungstique : 0,7g
Acide actique cristallisable : 1 ml
15 30 minutes plus tard ajouter 100ml deau distille

Alcool actique :
Alcool 90 : 10 ml
Acide actique cristallisable : 1 goutte

MODE OPERATOIRE :
2- Fixer au Schaudinn actique
3- Laver le frottis
4- Plonger le frottis dans le colorant trichrome pendant une dizaine de minutes
5- Rincer rapidement laide de lalcool actique (10 20 secondes)
6- Monter la lame

159

Annexe 11 : Protocole de la mthode de coloration au noir chlorazol de Kohn
[Bailenger (1982)]

Noir chlorazol
Alcool thylique 90
Alcool mthylique
Acide actique cristallisable
Phnol cristallis fondu
Solution aqueuse dacide phosphotungstique 1%

Ractif :
Noir chlorazol : 0,5g
Broyer au mortier et dissoudre progressivement dans le mlange suivant :
Alcool thylique 90 : 17 ml
Alcool mthylique : 16 ml
Acide actique cristallisable : 2 ml
Phnol cristallis fondu : 2 ml
Solution aqueuse dacide phosphotungstique 1% : 1,2ml
Eau distille : q.s.p. 100 ml

Transvaser les portions bien dissoutes dans un flacon et laisser la lumire pendant
plusieurs semaines. Un dpt se forme, le ractif est un liquide limpide pourpre

MODE OPERATOIRE :
2- Plonger le frottis encore humide dans le colorant pendant une dizaine dheures
3- Rincer les frottis leau courante
4- Monter la lame

160

Annexe 11 : Protocole de coloration par la mthode de Brooke et Goldman
[Bailenger (1982)]

Alcool 70
Alcool 50
Lugol

MODE OPERATOIRE :
1- Raliser et fixer un frottis fcal laide dun fixateur polyvinylique
2- Plonger le frottis fix dans un bain dalcool 70 avec quelques gouttes de lugol
pendant 20 minutes
3- Plonger le frottis dans un bain dalcool 50 pendant 10 minutes
4- Plonger le frottis dans leau pendant 5 minutes
5- Colorer le frottis par une technique de coloration de frottis humide
6- Monter la lame

161

Annexe 12 : Protocole de la mthode de coloration de Giemsa
[Jokipii, Pohjola et Jokipii (1983)]

Mthanol
Solution de Giemsa 10%

MODE OPERATOIRE :
2- Laisser scher lair pendant 1 heure
3- Fixer laide de mthanol pendant 10 minutes
4- Plonger le frottis dans la solution de Giemsa 10% pendant 10 minutes
5- Rincer les frottis leau courante
6- Monter la lame
7- Observer au microscope optique lobjectif x40 et immersion

162

Annexe 13 : Protocole de coloration au lugol
[Bailenger (1982)]

Iode
Iodure de potassium

LUGOL :
Iode (cristallis) : 1 g
Iodure de potassium : 2 g
Eau distille : 100 ml qsp
Faire dissoudre liodure de potassium dans une trs faible quantit deau puis ajouter
lentement les cristaux diode.
Agiter jusqu dissolution puis ajouter le reste de leau. Pour finir filtrer la solution.

MODE OPERATOIRE :
1- Mettre une goutte de fces liquide ou raliser un mlange de fces dans une goutte de
srum physiologique
3- Dposer une goutte de lugol au bord de la lamelle
4- Observer au microscope sur la zone de progression du colorant lobjectif x40

163

Annexe 14 : Protocole de coloration au saccharose
[Beugnet et al. (2004)]

Saccharose
Lame
Lamelle

Solution de saccharose :
Saccharose : 20g
Agiter le mlange jusqu dissolution complte (environ une heure)

MODE OPERATOIRE :
1- Dposer une goutte de solution de saccharose sur une lame
2- Mlanger avec une goutte de matire fcale
4- Observer immdiatement au microscope optique lobjectif x40

Annexe 15 : Protocole de coloration pour la mthode de Heine

Fuchsine

MODE OPERATOIRE :
1- Mettre 10L de fuchsine sur une lame
2- Mlanger 10L de fces
3- Raliser un frottis (ou recouvrir directement par une lamelle)
4- Scher
5- Observer au microscope optique lobjectif x 40 et/ ou immersion

164

Annexe 16 : Protocole de la coloration ngative la nigrosine
[Pohjola (1984)]

Solution de Nigrosine 1%

MODE OPERATOIRE :
1- Mlanger 20 l de fces et 20 l de solution de nigrosine sur une lame
2- Etaler le mlange
3- Laisser scher le frottis lair

165

Annexe 17 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifie par
Henriksen et Pohlenz
[Henriksen et Pohlenz (1981), Jokipii et al. (1983)]

Mthanol 96
Fuchsine basique
Phnol 5%
Ethanol 95
Acide sulfurique
Vert de Malachite 5%

Fuchsine carbolique :
Fuchsine basique : 1g
Ethanol : 10 ml
Phnol 5% : 90ml

MODE OPERATOIRE :
2- Laisser scher lair ambiant
3- Plonger le frottis dans du mthanol 96% pendant 2 5 minutes
4- Laisser scher
5- Fixer brivement la flamme
6- Plonger le frottis dans de la fuchsine carbolique pendant 20 30 minutes froid
7- Rincer leau
8- Dcolorer laide dacide sulfurique (de 0,25 10%) pendant 20 60 secondes
9- Rincer leau
10- Colorer avec la solution de vert de malachite pendant 5 minutes
11- Rincer leau
12- Scher
13- Monter la lame laide dEukitt
14- Observation au microscope optique lobjectif x40 ou immersion

166

Annexe 18 : Protocole de la technique de Ziehl-Neelsen modifie par Angus
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]

Fuchsine phnique
Ethanol 95
Acide chlorhydrique
Vert de Malachite 0,25%

Mlange HCl-thanol :
Acide chlorhydrique : 3ml
Ethanol 95 : 100ml

MODE OPERATOIRE :
3- Fixer le frottis lthanol
4- Laisser scher
5- Plonger le frottis dans de la fuchsine carbolique pendant 5 minutes froid
6- Rincer leau
7- Dcolorer dans le mlange HCl-thanol jusqu ce que le colorant slimine
8- Rincer leau
9- Colorer avec la solution de vert de malachite 0,25% pendant 30 secondes
10- Rincer leau
11- Scher
12- Monter sous lamelle

167

Annexe 19 : Protocole de coloration de dimthylsulphoxyde-Ziehl-Neelsen
[Pohjola et al. (1985)]

Mthanol
Fuchsine diamant
Glycrol
Ethanol 95
Dimthylsulphoxyde
Vert de malachite 2%
Acide actique 99,5%
Glycrol

Solution 1 :
Fuchsine diamant : 4 g
Glycrol : 12 g
Ethanol 95 : 25 ml
Dimthylsulphoxyde : 25 ml
Eau distille : q.s.p. 160ml

Solution 2 :
Vert de malachite 2% : 220 ml
Acide actique 99,5% : 30 ml
Glycrol : 50 ml

MODE OPERATOIRE :
3- Plonger le frottis dans du mthanol pendant 10 minutes
4- Laisser scher
5- Recouvrir de la solution 1 pendant 2 minutes
6- Rincer leau
7- Recouvrir de la solution 2 pendant 1 minute
8- Rincer leau
9- Scher lair
168

Annexe 20 : Protocole de coloration lauramine-fuchsine carbolique
[Casemore et al. (1984)]

Auramine
Fuchsine phnique

Microscope fluorescence avec un filtre Leitz KP 540

MODE OPERATOIRE :
3- Plonger le frottis dans lauramine pendant 5 minutes
4- Rincer leau
5- Immerger rapidement dans la fuchsine phnique (10 secondes environ)
6- Rincer leau
7- Scher
8- Observation au microscope fluorescence avec un objectif x10

169

Annexe 21 : Protocole de coloration lauramine-phnol
[Nichols et Thom (1986)]
Auramine O
Phnol
Acide chlorhydrique
Ethanol 95
Mthanol
Formol
Permanganate de potassium

Microscope fluorescence

Solution dauramine-phnol :
Auramine O : 0,03g
Phnol : 3g

Mlange acide-alcool :
HCl concentr : 3 mL
Ethanol 95 : 100mL

MODE OPERATOIRE :
3- Fixer dans du mthanol pendant 3 minutes
4- Exposer des vapeurs de formol 37C pendant 30 minutes
5- Colorer le frottis avec la solution dauramine-phnol pendant 10 minutes
6- Rincer leau
7- Dcolorer avec le mlange acide-alcool pendant 5 minutes
8- Rincer leau
9- Recolorer avec une solution de permanganate de potassium 0,1% pendant 30
secondes
10- Rincer leau
11- Scher
12- Observation au microscope fluorescence avec un objectif x10

170

Annexe 22 : Protocole de coloration la mpacrine
[Ungureanu et Dontu (1992)]

Formol 10%
Solution de mpacrine 0,05%
Acide chlorhydrique
Ethanol 97
Permanganate de potassium

Microscope fluorescence

Mlange acide-alcool :
Acide chlorhydrique : 1ml
Ethanol 97 : 100 ml

MODE OPERATOIRE :
3- Fixer le frottis dans du formol 10% pendant 2 3 minutes
4- Recouvrir la lame dune solution de mpacrine 0,05% pendant 5 minutes
5- Rincer leau
6- Dcolorer dans le mlange acide-alcool pendant 1 2 minutes
7- Rincer leau
8- Recolorer dans une solution de permanganate de potassium 1% pendant 30 secondes
9- Rincer la lame
10- Scher

171

Annexe 23 : Questionnaire envoy aux laboratoires

METHODES UTILISEES POUR LE DIAGNOSTIC COPROLOGIQUE CHEZ
LES RUMINANTS.
Nous sommes tudiantes vtrinaires et dans le cadre de notre thse dexercice vtrinaire nous
cherchons connaitre les mthodes utilises en coprologie chez les ruminants dans les laboratoires
dpartementaux.
Merci de votre participation cette tude.
Quel est votre dpartement ? : ..
Quels sont vos tarifs en parasitologie ?
- Coprologie simple (qualitative) : ..
- Coprologie quantitative (mac master) : ..
- Recherche spciale : de giardia : .. de cryptosporidies : ..

I. Mthode de flottation
a) Quel liquide de flottation utilisez-vous en routine (merci de prciser sa densit) :
Iodomercurate de potassium Sulfate de zinc Sucrose
Chlorure de sodium Chlorure de zinc Autre (prcisez) : ..

b) Ralisez-vous une coproscopie : Qualitative Semi-quantitative Quantitative

c) Quelle est la dure dune coproscopie simple ? .

d) Quelles mesures de scurit et hygine sont en place lors de la manipulation des liquides :
Port de gants Port de masque Manipulation sous hotte Recyclage
Autre : ..

e) En cas de demande diagnostique prcise, utilisez-vous dautres liquides :
OUI NON si oui lesquelles :

II. Colorations des protozoaires en coproscopie
a) Quelles colorations utilisez-vous en routine :
Ziehl-Neelsen modifi Heine Saccharose Lugol
MIF Autres : (prcisez)

b) Quelles colorations utilisez-vous lors dune demande spcifique (prcisez le parasite recherch)
Ziehl-Neelsen modifi . Heine Saccharose .
Lugol . MIF . Autres : (prcisez)

c) Quelle est la dure dune coloration :

d) Quelles sont les raisons qui vous ont fait choisir les colorants :
Cot Facilit de prparation Type de parasite recherch Facilit de lecture

e) Si vous utilisez la coloration de Zieh-Neelsen modifie, quelles sont les dures et la concentration
des produits pour chaque tape :
1- Fixation mthanol : .. min 2-Coloration fuchsine phnique : min
3-Dcoloration acide sulfurique : .%, tps: . 4-Recoloration vert de Malachite : sec

Fabienne RICHARD : fabienne.richard@vetagro-sup.fr
Jeanne CHANUDET : jeanne.chanudet@vetagro-sup.fr

172

Annexe 24 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifie choisie
pour ltude exprimentale

Fuchsine phnique
Ethanol 95
HCl
Vert de Malachite 0,5%

Mlange HCl 3%-Ethanol 95
HCl concentr : 3 ml
Ethanol 95 : 100 ml

MODE OPERATOIRE :
3- Recouvrir le frottis par de lthanol 95 pendant 5 minutes
4- Fixer brivement la flamme
5- Plonger le frottis dans de la fuchsine pendant 4 minutes
6- Rincer leau
7- Dcolorer laide du mlange acide-alcool par 2 gicles
8- Rincer leau
9- Colorer avec la solution de vert de malachite pendant 1 minute
10- Rincer leau
11- Scher

NOM PRENOM : CHANUDET Jeanne

TITRE : COMPARAISON DE DIFFERENTES COLORATIONS POUR
LA MISE EN EVIDENCE DES PROTOZOAIRES DANS LA
COPROSCOPIE DES RUMINANTS

Thse dEtat de Doctorat Vtrinaire : Lyon, le 21 dcembre 2012

RESUME :
Dans cette tude, nous avons ralis un bilan des diffrentes techniques utilises par les LVD et LDA franais
laid dun questionnaire qui leur a t envoy, mais aussi une comparaison de 3 mthodes de coloration rapides:
la coloration au lugol, le montage au saccharose et la mthode de Heine pour la dtection de 3 genres de
protozoaires intestinaux courants dans les fces.
En France, les laboratoires utilisent en majorit des colorations lors dune recherche spcifique de protozoaires
digestifs comme C. parvum et G. intestinalis. Certains choisissent pour ces recherches des techniques
immunologiques, les tarifs sont alors plus levs.
Les diffrents rsultats ont permis de mettre en vidence 2 techniques de coloration. La coloration par une
solution de saccharose est la mthode la plus sensible, spcifique et facile dutilisation pour mettre en vidence
les oocystes de C. parvum dans les fces. Ce nest pourtant que la troisime mthode la plus employe par les
laboratoires pour cette recherche, derrire la technique de Ziehl-Neelsen modifie et la mthode de Heine.
La coloration par le lugol est la mthode ayant la meilleure sensibilit, la plus forte spcificit et la plus grande
facilit de lecture pour dtecter les kystes de giardia. Cest galement celle qui est la plus employe par les
laboratoires franais. Les laboratoires ayant rpondus notre enqute nutilisent pas de technique de coloration
lors de la recherche de coccidies. En effet, nous avons pu voir que les colorations engendrant une modification
de teinte des oocystes dEimeria (le lugol et la fuchsine), diminuent la sensibilit et compliquent la lecture et
lidentification des oocystes dEimeria.

MOTS CLES : - diagnostic
- coloration
- protozoaire
- coproscopie
- ruminants

JURY :
Prsident : Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLES

1er Assesseur : Monsieur le Professeur Lionel ZENNER
2me Assesseur : Madame le Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI

DATE DE SOUTENANCE : 21 dcembre 2012

ADRESSE DE LAUTEUR :

Corcelette
69910 VILLIE-MORGON

Langue

2012 Lyon 113

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

2012 Lyon 113

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

1

Vous aimerez peut-être aussi