Mtodos Cromatogrficos

Mtodos Cromatogrficos
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/
CROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
CENTRFUGA CCD
CP
GASOSA LQUIDA
CLSSICA CLAE CG CGAR
Cromatografia
Cromatografia
Histrico
Michael Tswett ()- botnico russo 1906
Etimologia
C CH HR RO OM MA A = Cor
Graphein Graphein Graphein Graphein Graphein Graphein Graphein Graphein = escrever
Dcada de 30 camada delgada
Dcada de 40 - pratos tericos/impulso CG
Dcada de 60 CLAE
http://members.shaw.ca/vict/chemistry_test3.htm
Cromatografia
Cromatografia
Definio
um processo pelo qual diferentes solutos so separados por uma
dinmica diferencial do processo migratrio em um sistema contendo
uma ou mais fases, das quais uma desloca-se continuamente em uma
dada direo e no qual as substncias exibem mobilidades distintas
devido a diferenas de adsoro,partio, solubilidade, presso de vapor,
tamanho da molecular ou densidade de carga inica.
Parmetros em cromatografia:
Tempo de reteno (distncia, volume, tempo de reteno corrigido)
Resoluo
Pratos tericos
Altura equivalente a um prato terico (HETP)
Definio
Mtodo fisico-qumico de
separao de substncias
Presena de duas fases:
Estacionria e mvel
Separao ocorre devido a
diferena de interao
entre as substncias e as
fases
Podendo ser uma analise
qualitativa e/ou quantitativa
Cromatografia em papel
PRINCPIO BSICO
Tcnica de separao e anlise de misturas por
interao dos seus componentes entre uma Fase
Estacionria e uma Fase Mvel.
Uses for Chromatography
Chromatography is used by scientists to:
Analyze examine a mixture, its components,
and their relations to one another
Identify determine the identity of a mixture or
components based on known components
Purify separate components in order to isolate
one of interest for further study
Quantify determine the amount of the a mixture
and/or the components present in the sample
Cromatografia: Classificao
Cromatografia: Classificao
1. Forma fsica do suporte
Cromatografia planar: CP e CCD
Cromatografia em coluna CG e CL
-dimetro interno do tubo(preparativa/ analtica)
-estado fsico da F.M.(gas/lquido/supercrtico)
-tipo de coluna (aberta/fechada)
-fase estacionria (lquido/slido)
2.Mecanismo de separao (processos fsico-qumicos ou
mecnico)
3.Polaridade das fases utilizadas
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
Mecanismos de separao
Polaridade da fase estacionria:
Fase normal - Fase estacionria polar
Fase reversa - Fase estacionria apolar
CCD CCD - - exemplos exemplos
Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma
solvel na FM
estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil
Thin Layer Chromatography - t.l.c.
Series of spots forms
Compare samples in mixture with
known substances.
Measure R
f
values.
Coloured compounds & colourless
compounds.
Separation and identification.
0.32 yellow xanthophylls
0.47 yellow xanthophylls
0.53 yellow xanthophylls
0.58 green chlorophyll b
0.63 blue green chlorophyll a
0.63-0.75 light grey pheophytin b
0.75 grey pheophytin a
0.91 yellow-orange carotene
R
F
value Colour Pigment
Eluent: Cyclohexane : propanone :petroleum ether (low boiling point) 5 : 3 : 2
Cromatografia em Camada Delgada Cromatografia em Camada Delgada
Mtodo rpido (20-40 min.)
Uso de diversos agentes cromognicos
Maior sensibilidade que C.P. (10
-9
g)
Grande gama de compostos pode ser analisada
Mtodo simples e barato
F.M. - sistema de solventes
F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido)
Mtodos de deteco: fsico-qumicos
Princpio: Adsoro (polaridade)
Adsoro:
Alumina, Silica, magnso, carbonato de clcio, amido
Natureza da amostra x Comportamento cromatogrfico
1.saturados x insaturados > reteno insaturados
2.grupos funcionais
COOH > -OH > -NH
3
> -SH > -CHO > C=O > CO
2
R > OCH
3
> CH=CH
e
3. Impedimento estrico
Atividade: I, II ...V ( % de gua adicionada 0----15%)
Cromatografia em papel Cromatografia em papel
Compostos hidrossolveis, cidos
orgnicos e ions metlicos
Princpio: partio (solubilidade)
Quantidade de amostra necessria
10
-3
a 10
-6
g
Tipos: ascendente, descendente,
bidimensional, circular
F.M. - Sistema de solventes
F.E. - gua retida na celulose
(papel Whatman)
Mtodos de deteco: fsico-
qumicos
Anlise qualitativa: Rf (fator de
reteno) - problema :
reprodutibilidade
Anlise quantitativa: densitmetro,
extrao dos solutos
Tipos de adsorventes:
G- aglutinantes (gesso amido ou
talco)
H- sem aglutinante (p/ CL)
P-camada preparativa
F- contm fluorescncia
R- adsorvente sem aditivo
Critrios para escolha da fase mvel:
analitos devem ser solveis diferentemente
no deve haver reao entre analitos/FM e
FM/FE
Adsoro depende:
natureza qumica do
adsorvente
rea de superfcie/
tamanho da partcula
porosidade da partcula
- atividade- - >stios ativos
CP
Vantagens:
tcnica simples
no requer
instrumentao sofisticada
baixo custo
Desvantagens:
uso limitado
alargamento de banda-difuso-
pouca alternativa de reveladores
CCD
Vantagens:
maior sensibilidade
mais rpido
> repetibilidade
< difuso
> faixa de aplicao
reveladores reativos
permite aquecimento
Desvantagens
degradao de compostoslbeis
devido grande superfciede
exposio
dificuldades na quantificao
Comparao
Cromatografia Lquida em coluna aberta
Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (HPLC)
Solvente: Alto grau de pureza, filtrado e degaseificado,
caros
Sistemas de injeo:vlvulas de volumes definidos
Colunas de guarda
Colunas: recheios materiais porosos com partculas
de dimetros o mais homogneo possvel e de
dimetro igual ou menor a 10 um (em geral)Silica e
Alumina.
Colunas com fase ligada silica como suporte
A) formao do ster silicato (Si- O- R)
B)formao da ligao siloxano (Si- O- SiR)
C)Ligao Si- C
At 60.000 pratos tericos
Detector:
Alta sensibilidade
Resposta rpida para todos os compostos da amostra
Insensvel mudanas na Fase mvel
Insensvel mudanas de temperatura
Resposta independente para a fase mvel
Resposta linear
No deve destruir a amostra
Fcil operao
Fornecer informaes qualitativas
Detector Uv- Vis
Detector de Fluorescncia
Detector de arranjo de diodos
Detector de ndice de Refrao
Detectores eletroqumicos
Quantificao:
Calibrao Externa
Calibrao Interna
Cromatografia a Gs
Cromatografia a Gs
Rapidez
Alto poder de separao
Separao de vrias classes
de compostos em uma anlise
Sensibilidade (ppm - ppb)
Facilidade de registrar dados
Variedade de detetor
(especificidade)
Amostras volteis
Compostos termicamente
estveis
Tcnicas auxiliares p/
identificao
Cromatografia a Gs: aplicaes Cromatografia a Gs: aplicaes
Anlise de cidos graxos e triglicerdeos
Anlise de micotoxinas
Anlise de compostos volteis responsveis pelo
aroma caracterstico de alimentos
Anlise de aucares
Anlise de amino cidos
Anlise de pesticidas
Anlise de frmacos
etc
etc
Cromatografia Gs-Slido
FE: slidos (slica, carvo grafitinizado,
polmeros porosos)
Princpio de reteno:(adsoro, volatilidade)
Cromatografia Gs-Lquido ***
Lquido mantido estacionrio em suporte inerte
Princpio de reteno: solubilidade, volatilidade
Cromatografia a Gs: tipos
Cromatografia a Gs: tipos
Cromatografia a Gs: Instrumentao
Cromatografia a Gs: Instrumentao
Gs de arraste (FM) Gs de arraste (FM)
H
2
, N
2
, He, Ar
Funo: transporte da amostra
Propriedades: inerte, compatvel com o detetor, puro
Cromatografia a Gs: Instrumentao Cromatografia a Gs: Instrumentao
Injetor Injetor
Colunas empacotadas -
cmara de aquecimento
Colunas capilares:
split
splitless
on- collum
Cuidados:
Introduzir qtddes reprodutveis
de amostra
Vaporizar totalmente a amostra
sem decomp-la
No discriminar compostos
Cromatografia a Gs: Instrumentao Cromatografia a Gs: Instrumentao
Colunas Colunas - - tipos tipos
Parmetro Coluna empacotada Coluna capilar
Diam. Int. (mm) 1 - 4 0,15 - 0,75
Compri/o (m) 1 - 3 10 -100
Pratos tericos 2400 3000
Espessura F.E.(m) 5 0,5 - 2
Vazo gs (ml/min) 20 - 60 1- 5
Vol. amostra (l) 02 - 20 0,001- 0,5
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/
Apolar: hidrocarbonetos no aromticos, silicones (ex.: SE-30) -
P.E.
Polar: contm grande quantidade de grupos polares (Ex.:
Carbowax)- interaes tipo pontes de hidrognio
Intermediria: grupos polares ou potencialmente polares em
esqueleto apolar (Ex. SE-52)
Escolha da coluna:
Polaridade da fase estacionria,
dimetro e espessura do filme quantidade de amostras, tempo
de anlise, presso (velocidade da FM), temperatura do forno
Comprimento pratos tericos
Cromatografia a Gs: Instrumentao Cromatografia a Gs: Instrumentao
Colunas Colunas - - fase estacionria (FE) fase estacionria (FE)
Abreviao de algumas fases estacionrias
DEGA - adipato de dietileno glicol
DEGS - succinato de dietileno glicol
SE- 30 - metil silicone
OV - 11 - 35% fenil- metilsilicone
Carbowax 20 M - polietilnoglicol
Cromatografia gasosa: Instrumentao Cromatografia gasosa: Instrumentao
Colunas Colunas - - fase estacionria (FE) fase estacionria (FE)
Programao de temperatura
Alta sensibilidade
Baixo nvel de rudo
Faixa linear ampla p/ a resposta
Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos,
especficos)
Insensvel a pequenas mudanas de fluxo e temperatura
Destrutivos/ no destrutivos
Cromatografia a Gs: Instrumentao Cromatografia a Gs: Instrumentao
Detetor Detetor - - requisitos requisitos
Ionizao de chamas FID (alta sensibilidade, resposta quase universal)
FM = hidrognio ou nitrognio, destrutivo
Condutividade trmica (resposta universal, no destri a amostra) - FM
= helio ou hidrognio,no destrutivo
Captura de eltrons (seletivo p/ halognios orgnicos, nitrilas, nitratos e
organometlicos) FM = nitrognio, no destrutivo
Terminico (seletivo p/ compostos contendo N e P)
Cromatografia gasosa: Instrumentao Cromatografia gasosa: Instrumentao
Detetor Detetor - -Tipos Tipos
Formao de ons pela combusto
da amostra na presena de H
2
e O
2.
Origina corrente eltrica no coletor
gerando um sinal do qual a
combusto do gs de arraste
descontada
O bombardeamento do gs de arraste com as particulas B geram
eltrons lentos que migram para o nodo gerando corrente
constante que ser registrada como linha de base.
Qdo a substncia que entra no detector capaz de capturar
eltrons, h diminuio da corrente gerando um sinal negativo
proporcional concentrao do composto.
Tempo de reteno
Tempo de reteno relativo
Co-cromatografia com padres (spiking)
Grficos p/ sries homlogas
ndices de reteno (Kovats, ECL)
Tcnicas auxiliares (EM, IR, RMN)
Cromatografia a Gs: Anlise qualitativa Cromatografia a Gs: Anlise qualitativa
Tr= tempo de reteno
Tm = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer
a coluna
Tr = tempo de reteno corrigido = Tr-Tm
Cromatografia a Gs:Anlise quantitativa Cromatografia a Gs:Anlise quantitativa
Normalizao
Padro interno
Padro externo
Fator de resposta
Relao concentrao
x
rea do pico
Normalizao:
Todo componente produz um pico (f)
A resposta do detector dependente apenas da
concentrao (f)
Calibrao externa
Soluo contendo padres de todas as substncias a serem analisadas
Padres em concentraes prximas amostra
Condies analticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeo
Fator de resposta do detector: determina a real resposta para uma
determinada classe de substncias
Fator de resposta= concentrao/rea
Para um padro contendo a
mesma concentrao de trs
substncias diferentes com
reas A1, A2 e A3
Se assumirmos um fator
como 1,00 por ex. f3 =1,00
Ento, para uma amostra com estas trs substncias, a concentrao de cada
uma calculada utilizando estes fatores:
Exemplo .Uma amostra contm X, Y e Z.
O padro contm 200 mg de cada em 100mL de solvente.
A injeo de 5uL resulta em:
Z a referncia
Fx =1190/238 = 5,8
Fy = 1190/660 = 1,8
II. A anlise da mostra-
problema resulta em:
Multiplica-se cada pico por seu fator:
X= 90 x 5,8 Y = 265 x 1,8 e Z = 460 x 1
rea total = 450 + 477 + 460 = 1387
Depois calcula-se a % de rea
Z deve estar presente em todas as amostras
Esse mtodo corrige a diferena de volume a cada injeo
Padronizao interna
Uma substncia conhecida adicionada em concentrao
definida em todos os padres e nas amostras;
No co-elui com a amostra
estvel e detectado na concentrao em que se encontra
Etapas:
Faz-se uma curva de calibrao baseada na relao entre as
reas e concentraes do PI e da substncia de interesse
Contamina-se a amostra com um volume conhecido da soluo
estoque do padro interno (PI)