Biosintesis tanase dan Penentuan Simultan

Fenolik Senyawa di Aspergillus niger Fermentasi Paddy Straw dengan

HPLC
Abstrak: Produksi tannin asil hidrolase oleh Aspergillus niger dalam fermentasi solid state
menggunakan jerami padi sebagai substrat diselidiki. Maksimum produksi tanase dari 43 U /
g / menit diamati pada 96 jam inkubasi pada 30 C. Pemurnian tanase dengan amonium
sulfat dan kromatografi kolom yang meningkatkan aktivitas enzim. Senyawa fenolik dalam
jerami padi fermentasi dianalisis dengan HPLC. Isi dalam substrat fermentasi adalah asam
galat 0 434 mg / g, Rutin 0 124 / g dan Quercetin 0 202 mg / g massa basah.
Pendahuluan
berbagai sumber daya biomassa yang tersedia di planet kita untuk konversi ke bioproducts.
Ini mungkin termasuk seluruh tanaman, bagian tanaman (misalnya biji, batang), konstituen
tanaman (misalnya pati, lipid, protein dan serat), pengolahan produk sampingan (biji-bijian
penyuling, terlarut jagung), bahan laut asal dan hewan produk sampingan, limbah kota dan
industri [1] dan juga limbah pertanian (sumber daya ini dapat digunakan untuk membuat
biomaterial baru dan ini akan membutuhkan pemahaman yang mendalam tentang komposisi
bahan baku apakah seluruh tanaman atau konstituen, sehingga unsur-unsur fungsional yang
diinginkan dapat diperoleh untuk bioproduk produksi [2] Beberapa produk samping pertanian
alami yang digunakan untuk persiapan enzim dalam fermentasi solid state seperti dedak
gandum, kelapa kue minyak, bungkil kacang tanah minyak, dedak padi, gandum dan jerami
padi, gula beet pulp, tongkol, serbuk gergaji, dedak jagung , beras bubuk sekam, lambung
kedelai, hampas sagu, limbah anggur, sabut kelapa empulur, limbah pisang, ampas teh,
onggok, pulp aspen, manis sorgum bubur, apel pomace, makan kacang dll.
Tanase merupakan enzim yang penting. Tanase digunakan dalam sejumlah aplikasi
industri termasuk pembuatan teh instan, anggur dan asam galat [3] dan solubilisasi teh krim
dalam pengolahan teh instan [4]. Salah satu aplikasi komersial utama dari tanase adalah
hidrolisis asam tanat menjadi asam gallic, kunci menengah diperlukan untuk sintesis obat
antibiotik, trimetoprim [5]. Produksi enzim dengan menggunakan limbah pertanian di
substrat fermentasi padat (SSF) yang lebih murah, kurang berorientasi teknologi dan juga
ekstraksi enzim lebih mudah dengan merilis jumlah diabaikan limbah cair dan dengan
demikian menghasilkan lebih sedikit polusi dibandingkan dengan metode lain.
Asam galat ditemukan di hampir semua tanaman. Tanaman yang dikenal atas konten-
konten asam galat tinggi termasuk gallnuts, anggur, teh, hop dan kulit kayu ek. (1 (asam
Galia (asam benzoat 3,4,5-trihidroksi) adalah senyawa fenolik dan menemukan aplikasi di
berbagai bidang. Penggunaan yang paling penting adalah untuk pembuatan trimethoprim
(TMP), agen antibakteri digunakan dalam kombinasi dengan sulfonamida [5] . Hal ini juga
digunakan dalam industri kulit, dalam pembuatan ester galat asam, misalnya, gallate propil
yang digunakan sebagai antioksidan, dalam pembuatan pirogalol. Pyrogallol digunakan
dalam pewarnaan bulu, kulit dan rambut dan juga sebagai pengembang fotografi [6] produksi
asam Galia telah dilaporkan dari myrabolan, tara [7] sumac [8] dan tanin Cina beberapa
sumber yang kaya tannin dan beberapa mikroorganisme [9]:.. Kar, et al [10] Mukherjee,
Banerjee, [11] Belmares-Cerda, [12] telah digunakan untuk produksi asam galat dan enzim
hidrolitik yang bertanggung jawab untuk produksi adalah tanase atau tannin acylhydrolase.
Dalam penelitian ini jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase oleh
Aspergillus niger dan menentukan asam galat dan senyawa fenolik lainnya di substrat
fermentasi dengan menggunakan HPLC.
BAHAN DAN METODE
penggunaan kultur dan Persiapan inokulum: jamur Aspergillus niger yang digunakan
dalam penelitian ini diisolasi dari tanah dan dipelihara di Potato dextrose agar miring dan
disubkultur setiap 15 hari. Inokulum dibuat dengan menambahkan air suling steril untuk
miring budaya dan membubarkan spora dengan menggunakan lingkaran steril dan diinokulasi
ke medium.

Substrat dan Fermentasi Medium: Substrat yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Jerami padi, yang pertanian-produk. Substrat dicampur dengan larutan garam. Komposisi
larutan garam adalah NH NO 0 5 4 3%, NaCl 0 1%, MgSO4 7H2O 0 1% dan asam Tannic
4% pada pH = 5. 5. Isi disterilisasi dengan autoklaf pada 121C; 15lbps selama 20 menit.
Didinginkan disterilkan substrat padat diinokulasi dengan 1 ml inokulum spora, dicampur
dengan benar dan diinkubasi pada suhu 30 C selama 120 jam.
Ekstraksi dan Pemurnian: Setelah 96 jam inkubasi 0 05 M buffer sitrat, (pH 5.0)
ditambahkan ke substrat fermentasi dan dihomogenisasi dengan mortar dan alu. Enzim
mentah dipisahkan dari materi fermentasi dengan sentrifugasi pada 8000 rpm pada suhu 4 C
selama 20 menit. Ekstrak kasar diendapkan dengan amonium sulfat padat (80%) dan
mengumpulkan endapan dengan sentrifugasi pada 8000 rpm pada suhu 4 C selama 20
menit. Endapan didialisis terhadap buffer sitrat (0 05 M, pH = 5) pada 4 C. Sampel
didialisis menjadi sasaran kolom Chromatography (DEAE Sephadex A-50 kromatografi) dan
mengumpulkan pecahan. Kegiatan tanase diperkirakan dalam setiap langkah pemurnian.
Tanase Assay: tanase diuji berikut Sharma et al. [13] metode menggunakan asam galat
sebagai standar Warna merah muda dikembangkan dibaca pada 520 nm menggunakan
spektrofotometer (Shimadzu UV-160A). Satu unit aktivitas tanase didefinisikan sebagai
jumlah enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan satu mikromol asam gallic per menit
pada kondisi reaksi didefinisikan. Hasil enzim dinyatakan sebagai unit / gram substrat (U /
gram / menit).

A520 = (atest-Ablank) - (Acontrol-Ablank)

Penentuan fenolik Senyawa dengan HPLC Standar
Persiapan: larutan stok standar dari tiga senyawa fenolik disiapkan dalam metanol, pada
konsentrasi 0.420, 0.434, 0.400, 0.402 dan 0.402 mg. mL untuk GA, RU dan QU masing-
masing Semua solusi standar disaring melalui 0 45 mm filter membran (Millipore) dan
disuntikkan oleh autosampler.
Preparasi Sampel: Sampel disiapkan sesuai dengan prosedur El Sohafy et al. [14]. Jerami
padi yang difermentasi (0,5 g) diekstraksi dengan mendidih selama 5 menit dengan 5 mL air,
menyesuaikan volume untuk 5 mL dan penyaringan. 5 mL filtrat ini dihidrolisis dengan
menambahkan 0 5 ml 25% HCl dan pemanasan dalam bak air mendidih selama 25 menit.
Campuran tersebut kemudian diekstraksi dengan empat berturut-turut 4 ml porsi n-butanol.
Dikombinasikan ekstrak n-butanol dikeringkan di bawah tekanan dan dilarutkan kembali
dalam 2 ml metanol.
Kondisi HPLC: Flavonoid dianalisis menggunakan sistem Shimadzu HPLC (Shimadzu
Corp, Kyoto, Jepang) yang terdiri dari pompa LC-10AD, SCL 10A sistem pengendali dan
SPD-M 10A fotodioda detektor array. Kromatografi asam fenolik dicapai dengan
menggunakan prepacked LiChrospher 100 RP C-18 olumn (4'250 mm, 5 m; Merck). Fase
gerak terdiri asam air asetonitril-asetat (88: 10: 2; v / v / v) [15] dan disampaikan pada tingkat
1 mL / menit. Deteksi dipantau pada 280 nm. Semua hasil karya ini adalah rata-rata dua
penentuan independen.
Tiga senyawa fenolik, GA, RU dan QU, adalah molekul polar. Gradien elusi pelarut A [air-
asam asetat (25: 1 v / v)] dan pelarut B (metanol) memiliki pengaruh yang signifikan
terhadap resolusi senyawa. Akibatnya, gradien pelarut dibentuk, menggunakan sistem pompa
ganda, dengan memvariasikan proporsi pelarut A [asam air asetat (25: 1, v / v)] pelarut B
(metanol). Solvent B meningkat menjadi 50% di 4 menit dan kemudian meningkat menjadi
80% dalam 10 menit pada laju alir 1 0 mL / menit. Deteksi panjang gelombang adalah 280
nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi tanase oleh A. niger pada jerami padi dipelajari dan hasilnya ditunjukkan pada
Tabel 1 maksimum produksi tanase diamati pada 96 jam inkubasi pada 30 C. Nisha K. Rana
[16] melaporkan, bahwa hasil total tanase adalah maksimum pada 120 jam untuk SMF dan
LSF, sedangkan itu pada 96 jam pertumbuhan untuk proses SSF. Sebelumnya tanase
ekstraseluler dan asam galat produksi maksimum tercatat di 96 jam dan 120 jam oleh A. niger
dan Rhizopus oryzae [17-19]. Produksi enzim dimulai setelah 48 jam inkubasi dan meningkat
dengan waktu mencapai maksimal pada 96 jam. Ini mungkin jamur masuk ke fase
eksponensial. Setelah itu, produksi enzim mulai menurun.
Pemurnian tanase: Tanase mentah diendapkan dengan amonium sulfat presipitasi kegiatan
adalah 26 U / g / menit. Setelah dialisis aktivitas aktivitas spesifik 32 U / g / menit diperoleh.
Sampel adalah lebih purifiedthrough DEAE-Sephadex A-50 kromatografi dan fraksi terelusi,
yang menunjukkan 43 U / g / menit. (Gbr. 1).
Penentuan Galia Asam, rutin dan quercetin di Fermentasi Paddy Straw dengan HPLC:
Standar Kromatogram senyawa fenolik
Hal ini dapat dilihat dari Gambar 2 bahwa pemisahan yang baik dapat dicapai dalam waktu
15 menit dengan menggunakan kondisi yang dijelaskan. Simetris, puncak tajam dan baik-
diselesaikan diamati untuk standar (GA, RU dan QU). Urutan elusi dan waktu retensi untuk
GA, RU dan QU yang 3. 325, 5 100 dan 5 867 min masing-masing.
Dalam penelitian ini Jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase dengan
menggunakan Aspergillus niger. Kuantifikasi sampel dibandingkan dengan standar.
Kandungan asam fenolik terdeteksi dalam sampel yang dianalisis ditunjukkan pada Gambar 3
Hasil dinyatakan sebagai mg / g substrat fermentasi. Hasil percobaan menunjukkan bahwa
Jerami padi yang difermentasi dengan ekstrak Aspergillus niger mengandung asam galat
(0.43mg. / G berat basah), Rutin (0.124 mg / berat basah) dan Quercetin (0.202 mg / g berat
basah). Hasil tinggi pemulihan asam galat yang terkait dengan kegiatan tanase tinggi
dilaporkan oleh Kar dan Banerjee dan Kar et al. selama fermentasi residu kaya tannin hutan
(biji gilo, Caesalpinia digyna) atau bubuk buah chebula Terminalia menggunakan strain
jamur Rhizopus oryzae dan Aspergillus foetidus (G. Mukherjee, R. Banerjee, 2006 dan
2004).
KESIMPULAN
Fermentasi Solid state(keadaan padat) cocok untuk produksi tanase menggunakan pertanian
oleh-produk. Dalam penelitian ini Jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi
tanase. Analisis HPLC senyawa fenolik yang diperoleh dari jerami padi fermentasi
mengandung jumlah tinggi asam galat dibandingkan dengan senyawa lain. Asam galat
digunakan dalam pembuatan trimethoprim (TMP), agen antibakteri, dalam industri kulit dan
sebagai antioksidan. Beberapa strain jamur dan substrat kaya tannin telah digunakan untuk
produksi asam galat.

Slide 1
Pendahuluan
Berbagai sumber daya biomassa seperti bagian seluruh tanaman, konstituen tanaman,
pengolahan produk sampingan, bahan laut asal dan hewan produk sampingan, dan lain- lain.
Beberapa produk samping pertanian alami yang digunakan untuk persiapan enzim dalam
fermentasi solid state diantaranya yaitu, dedak gandum, dedak padi, jerami padi, lambung
kedelai, hampas sagu, limbah anggur, sabut kelapa empulur, limbah pisang, ampas teh,
onggok dan lain-lain.
Slide 2
Enzim yang sangat berperan yaitu enzim tanase. Salah satu aplikasi komersial utama dari
tanase adalah hidrolisis asam tanat menjadi asam gallic, yang diperlukan untuk sintesis obat
antibiotik dan trimetoprim.
Dalam penelitian ini jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase oleh
Aspergillus niger dan menentukan asam galat dan senyawa fenolik lainnya di substrat
fermentasi dengan menggunakan HPLC.
Slide 3
Bahan dan Metode
Penggunaan kultur dan Persiapan inokulum
Substrat dan Fermentasi Medium
Ekstraksi dan Pemurnian
Uji tenase
Slide 4
Penentuan fenolik Senyawa dengan HPLC Standar
Persiapan
Preparasi sampel
Kondisi HPLC
Slide 5
Hasil dan pembahasan
Slide 6
kesimpulan