Laboratorio de

Microbiologa General II

Tcnicas de colecta y tincin de
parsitos

Blanco Blanco Ivn
Galicia Lpez Susana Vernica
Laguna Morales Juan Carlos
Mogollan Marn Luis Jonatan

Aprender a colectar material
parasitario de animales de
experimentacin y domsticos.

Conocer utilizar las diferentes
tcnicas de tincin, utilizadas en
Parasitologa.
Es la manipulacin sobre un ser vivo, o bien
sobre parte de l, que tiene por objeto
mantener toda su arquitectura tanto
estructural como qumica lo ms inalterada
posible.
Los fijadores se dividen en 2:

Fsicos:
Calor
Fro
Criodesecacin (liofilizacin)

Qumicos
Lquido de Bouin
Solucin Fijadora de PVA
Solucin de Schaudinn
Gelatina-Glicerol
Formalina
AFA
Se hace a la llama, con lo que se obtiene una
coagulacin rpida de las protenas y por
tanto su estabilizacin.
Fijador de
Protozoarios y
Helmintos.


cido pcrico,
saturado con agua.
Formaldehdo
cido Actico
Glacial
Cloruro de
mercurio, saturado
con agua

Alcohol etlico,
95%

A esta solucin se le agrega
cido actico glacial en
proporciones de 1 parte de c,
actico glacial por 19 partes de
la preparacin, antes de
usarla.
Fijador de quistes,
trofozoitos,
huevos, larvas.

Fijador de trofozoitos y
quistes (combinacin
Schaudinn ms resina).
PVA
cido actico
glacial
Glicerina
Solucin de
Schaudinn

Sirve en preparaciones permanentes de
nematodos
Componentes:
Gelatina
Agua destilada
Glicerina
Fenol (cristales)
Sirve para preservar quistes, helmintos y
protozoarios
Componentes:
Formaldehido 0.5%
Solucin salina (NaCl 0.85%)

Se recomienda calentar a 60-63
o
C
Se utiliza para preservar trematodos y
cestodos
Componentes:
Etanol(96%)
Formaldehido
Agua destilada
Acido actico
La mezcla de etanol, formaldehido y agua
destilada durar varios meses. Cuando se agrega el
acido actico dura un mes.
Es un mtodo en el cual se utilizan
colorantes especiales para pintar o teir a
una clula que ha sido procesada, esto con la
finalidad de poder observarla al microscopio.
Para obtener buenos resultados en una
tincin esta se realiza lo ms rpido posible
despus de la fijacin.

Las tinciones se clasifican en:

Simples: Utilizan solo un colorante.

Diferencial: Ocupa ms de un colorante.

Y se pueden realizar de dos formas:

Progresivas: Son aquellas en las que el material
se coloca en colorante diluido durante el tiempo
necesario para colocar la tincin hasta la
intensidad deseada.
Regresiva: Son las tinciones en las que el material
o preparaciones se colocan en colorante
concentrado hasta lograr una sobre tincin y
posteriormente decolorar hasta lograr la
intensidad deseada.
Parsitos
Ectoparsitos Endoparsitos
Hemoparsitos
Coloracin de Giemsa
Tincin Wright
Tincin Indica
Eosina 5%
Tincin de Gram
Tinciones permanentes de protozoarios

Tie protozoarios,
hemticos e
intestinales.

Para protozoarios se
lava con buffer fosfatos
pH 6.8.

Flagelos, cilios y
ncleos (rojo),
citoplasma y
esporozoitos (azul)
Reactivos:

Giemsa II-Eosina (Azul de
Metileno-Eosina)

Giemsa II (Azul de
Metileno)

Giemsa B (Azur B,
formado por la oxidacin
del Azul de Metileno)-
Eosina (colorantes)

Glicerina (humectante)

Metanol absoluto
(fijador)

Leishmania infantum
Toxoplasma gondii
Tincin de tipo
Romanowsky, debido
a que se produce una
separacin de
colores:

Tie de prpura ncleos
y grnulos neutrofilicos.

De rosa a los Eritrocitos.

De azul a protenas
cidos nucleicos y
citoplasma.


Reactivos:

Tincin de Wright
Eosina Y
Eosina B
Azul de Metileno

Glicerina

Alcohol metlico
absoluto
Melanoma maligno del
perro
til para evidenciar segmentos grvidos
entre Taenia solium y Taenia saginata.

Reactivos:

Tinta india (colorante)
Etanol al 50% o 70% (deshidratante)
Xilol (aclarante)
Se monta en blsamo de Canad
Observacin de parsitos en heces ya que,
estos y sus quistes se resisten a su
coloracin y la materia fecal se tie rosa.
(protozoarios es fondo blanco al igual que
sus quiste)
Reactivos:
Eosina 5%
sta es una tincin diferencial usada para
demostrar las propiedades tintoriales de
bacterias de todos los tipos.
Las bacterias grampositivas retienen el
colorante de cristal violeta despus de la
decoloracin se ven azul oscuro.
Las bacterias gramnegativas no son capaces
de retener el colorante violeta cristal
despus de la decoloracin y se contratien
de color rojo con el colorante de safranina.
Las caractersticas tintoriales pueden ser
atpicas en cultivos muy jvenes, viejos,
muertos o en degeneracin.
Tincin de formas qusticas de Pneumocystis
carinii
Tinciones permanentes:

I. Tincin de Heidenhain con hematoxilina
frrica.
II. Tincin de Wheatley, tricrmica.

Utilizada para la deteccin e identificacin de
protozoos fecales.

Preparacin de hematoxilina
I. Hematoxilina
II. Alcohol etlico de 95
III. Agua destilada


La hematoxilina primero debe ser oxidado
para dar hematena.
Algunos agentes qumicos oxidantes que se
pueden usar son: yodato de sodio,
permanganato de potasio, perxido de
hidrgeno y oxido de mercurio.
La fase de la coloracin (solucin de
alumbre de hierro y amonio al 2% ) es de
mucha importancia. El propsito es disolver
gradualmente algo del color negro de la
preparacin y se contina hasta que la
estructura nuclear de las amebas y
flagelados sea perfectamente visible.

Es una alternativa a la hematoxilina frrica
para la tincin de protozoos.

Permite visualizar las caractersticas de los
organismos.


I. 10mL de cido actico glacial a 6 g de
cromotropo 2 R, 3g de verde brillante y 7g
de cido fosfotngstico.
II. Mover y dejar la mezcla por 30 min.
III. Agregar 1000mL de agua destilada y
mezclar.

Los protozoos tienen citoplasmas de color
entre verde azulado y violeta

Ncleos y cuerpos de inclusin de color entre
rojo y rojo purpreo

El fondo de la muestra es verde.
Las tenias adulto estn
formadas por una serie
de segmentos
rectangulares planos
denominados
progltidos
Cada progltide maduro
contiene ambos rganos
reproductores
Los progltidos se lavan
con formol
Se escoge uno de los
proglotidos terminales
del gusano y se coloca
entre dos portaobjetos
Con un hilo en cada
extremo se presionan los
portaobjetos, se deja uno
de los hilos mas largos
Sujetando el hilo largo se
sumerge en lactofenol, se
extrae hasta que se
aclare
Se abren los
portaobjetos, se toma el
progltido y se coloca en
un portaobjetos limpio
fijndose con resina
Las filarias son nematodos que se localizan
en tejido subcutneo, sangre, ojo y
cavidades de animales y humanos; su forma
larvaria es conocida como Microfilaria, la
cual es ingerida por mosquitos hematfagos,
en estos evolucionan hasta larva III
(infectante) para ser inoculados por picadura
a otros animales.
1.Alumbre de amonio
Agua destilada
2.Hematoxilina
Alcohol 95%
Mezclar y agregar la solucin 1.
3.Glicerina
Alcohol metlico
Agregar la solucin anterior

Loa loa
Reactivos:
Azul de cresilo al 75% en solucin salina
Azul de metileno al 1% es solucin salina
Se usa para teir microfilarias vivas, tie el
ncleo y provee un contraste entre el
portaobjetos y el m.o.
Tipos de
muestra
Cuidados de la
muestra
Tcnicas Parsitos
Sangre Heparina
Azida de sodio
Recin extrada
Gota gruesa
Gota fina
Hemoparsitos,in
tra/extra
eritrocitarios
Ectoparsito Vivo Sacrificado
Fraccionado
Garrapata
Materia Fecal Frasco boca
ancha, limpio y
seco, ausencia de
orina y rotulado
Varios procesos Parsitos
intestinales
Slidas Cerradas( evitar
desecacin) y
refrigeradas 2 C
Cps
Flotacin
Concentracin
Huevos y/o
quistes
nemtodos
Lquidas 37 C recin
obtenidas
Observacin en
fresco
Trofozoitos y
quistes
Tejidos frascos con
fijador
formalina

Varios procesos T. Solium
Impregnacin que se produce al ejercer
presin con un porta objetos sobre el tejido
que va a ser examinado.

Se fijan y se tien como un frotis sanguneo.
Tcnica de Gota
Gruesa
Frotis o extensin fina de sangre
En la molleja o proventrculo suele atacar el
Tetrameres americana.
En el intestino delgado la Ascaridia galli y la
capillaria obstinta.
Tambin pueden detectarse:
o Davainea proglotina
o Amoebotonea
o Hymenolepis carioca

En el ciego (parte del intestino) suele
alojarse el Heteraquis gallinae, Capillaria
anulata.
En la trquea se aloja el Syngamus laringeus

Parsito Localizacin
Trypanosoma sp. Sangre
Trypanoplasma
sp.
sangre
Hexamita sp. Tracto digestivo
Trichodina sp. Branquias
NORMAS OFICIALES MEXICANAS
NOM-062-ZOO-1999

NOM-033-ZOO-1995

NOM-051-ZOO-1995

NOM-059-ECOL-1994
Microscopio
Estereoscopio
1 Pliego de papel absorbente
Un estuche de diseccin
Animales: sapo, gallina, pez carpa
Localice y obtenga
los ectoparsitos de
los animales
asignados
Haga observaciones
de diferentes
porciones del
artrpodo
Sacrifique los
ectoparsitos
Observe con ayuda
del microscopio y
estereoscopio las
muestras
Realice diversas
preparaciones en
solucin salina
utilizando lugol
Coloque en el
portaobjetos limpio
una gota de sangre
extendindola a 1.5 cm
Mueva rpido el
portaobjetos de manera
suave para no lisar los
eritrocitos y teir con el
mtodo de Wright
Deposite una gota de
sangre en uno de los
extremos y realizar
una extensin de la
sangre
Observar en 10x,
40x y 100x en el
microscopio
Se hace un lacado o
lisado de eritrocitos
en agua destilada,
seca y teir con el
mtodo de Giemsa
El frotis de sangre se
cubre con unas gotas
de la tincin de
Wright; se deja
durante 1 minuto.
Este mtodo solo sirve
para frotis delgados
El exceso de
colorante se quita con
agua amortiguada, se
escurre con rapidez y
se deja secar al aire.
Se tie durante
3-5 minutos o
hasta por 15
minutos
Se agrega unas gotas
de agua amortiguada
(pH 6.8 a 7.2); se
debe soplar sobre el
portaobjetos para
mezclar el agua con el
colorante.
Fijar los preparados en
metanol absoluto durante
unos 30 segundos por
inmersin o por goteo del
alcohol sobre el frotis
colocado en un ngulo de
30 a 45.
Secar los frotis en posicin
vertical.
Lavarlos brevemente
en agua amortiguada
neutra o bajo
corriente.
Teirlos unos 20
minutos en una
disolucin de
Giemsa 1:20 o 45
minutos en una
disolucin 1:50.
Dejar que sequen.

Sacrificar mediante
incisin todo lo
largo de la lnea
media ventral
Buscar en la superficie
de los rganos internos
y las membranas serosas
la presencia de quistes
Abrir los rganos huecos
con una tijera y los
esponjosos se
desmenuzaran en busca
de helmintos. Y en el
intestino en busca de
helmintos y protozoarios
Extraer rgano
por rgano, los
que se colocan
en placas con
solucin salina
Realizar impronta con
una pequea y
delgada porcin de
algunos rganos del
animal
Se limpiara de
moco y resto de
tejido a los
helmintos
Conservar los helmintos
limpios en AFA y fijar
posteriormente
Lawrence Ash. Atlas de Parasitologa
Humana. Editorial Panamericana. 5ta.
Edicin. Mxico 2010. Pg. 455
Markell Edward K. Parasitologa, Diagnstico,
Prevencin y Tratamiento. Editorial el Manual
Moderno. 5ta. Ed. Mxico 1984. Pg. 411

Tincin de giemsa
1. Secar los frotis durante varias horas o
hasta el da siguiente. No fijarlos.

2. Teirlos durante 45 minutos con una
disolucin 1:50 del colorante de Giemsa.

3. Lavarlos en agua amortiguada neutra o
bajo agua corriente por 3-5 minutos.

4. Secar los frotis en posicin vertical
1. Fijar solo los frotis delgados en metanol absoluto
aproximadamente durante 30 segundos por inmersin o por goteo
del alcohol sobre el frotis colocado en un ngulo de 30 o 45.

2. Dejar que se sequen

3. Teir ambos frotis simltaneamente durante 45 minutos con
una dilucin Giemsa 1:50.

4. Enjuagar brevemente los frotis delgados por inmersin en agua
amortiguada neutra. Lavar el frotis grueso durante 3-5 minutos
adicionales por inmersin en agua amortiguada sin dejar que el
frotis delgado se ponga en contacto con el agua de lavado.

5. Secar los frotis en posicin vertical con el frotis delgado hacia
abajo.
1. Fijar los frotis de sangre en alcohol metlico
absoluto durante 1 minuto.

2. Dejar secar los portaobjetos.

3. Sumergir los portaobjetos en una solucin de
Giemsa en proporcin de una parte de sta con
30-50 partes de agua amortiguada (pH 6.8 a 7.2).
Teir durante un lapso de 30 minutos a 1 hora.

4. Mojar brevemente los portaobjetos con agua
amortiguada, despus se escurren con rpidez y
se dejan secar al aire.