Fluorescent in situ hibridisasi

Oleh: Dedy Kurniawan

Sebuah sel metafase positif bagi BCR / ABL penataan ulang (berhubungan dengan myelogenous
leukemia kronis) dengan menggunakan IKAN Kromosom dapat dilihat dengan warna biru
Kromosom yang dilabeli dengan bintik!bintik hi"au dan merah (kiri atas) adalah salah satu
tempat penataan ulang hadir
FISH (fluores#en#e in situ hibridisasi) adalah sebuah #ytogeneti# teknik yang digunakan untuk
mendeteksi dan melokalisasi keberadaan atau ketiadaan spesifik DNA sekuens pada kromosom
IKAN menggunakan lampu fluores#ent probe yang mengikat hanya bagian!bagian kromosom
yang mereka menun"ukkan tingkat tinggi urutan kesamaan $luores#en#e mi#ros#ope dapat
digunakan untuk men#ari tahu di mana neon probe terikat pada kromosom IKAN sering
digunakan untuk menemukan fitur!fitur tertentu pada DNA untuk digunakan dalam konseling
genetik% obat!obatan% dan identifikasi spesies IKAN "uga dapat digunakan untuk mendeteksi
dan melokalisir spesifik m&NA dalam sampel "aringan Dalam konteks ini% dapat membantu
menentukan spasial!temporal pola ekspresi gen dalam sel dan "aringan
Isi
' (robe
o )ibridisasi '%' (ersiapan dan (roses
o $iber '%* IKAN
o +ariasi '%, probe dan analisis
o '%- .!IKAN
o '%/ $low!IKAN
Kedokteran * aplikasi
o Spesies *%' identifikasi
o *%* 0ab!on!a!#hip dan IKAN
o +irtual *%, kariotipe
, 0ihat pula
- 1aleri
/ &eferensi
2 (ranala luar
Probe
Sel 3rothelial ditandai dengan empat probe yang berbeda
(robe sering berasal dari fragmen!fragmen DNA yang terisolasi% disu#ikan% dan diperkuat untuk
digunakan dalam (royek 1enom 4anusia 3kuran genom manusia begitu besar% dibandingkan
dengan pan"ang yang dapat diurutkan se#ara langsung% karena itu perlu untuk membagi genom
men"adi fragmen!fragmen (Dalam analisis akhir% adalah fragmen!fragmen ini dimasukkan ke
dalam order by men#erna salinan dari setiap fragmen ke fragmen yang lebih ke#il masih
menggunakan urutan endonuklease khusus% mengukur ukuran masing!masing fragmen ke#il
dengan menggunakan kromatografi ukuran!penge#ualian% dan menggunakan informasi tersebut
untuk menentukan di mana fragmen besar tumpang tindih satu sama lain) 3ntuk melestarikan
fragmen dengan sekuens DNA indi5idu mereka% fragmen ditambahkan ke dalam sistem populasi
bakteri mereplikasi terus!menerus (opulasi klon bakteri% masing!masing populasi
mempertahankan satu kromosom buatan% disimpan di berbagai laboratorium di seluruh dunia
Kromosom buatan (6A7) dapat tumbuh% diekstrak% dan diberi label% dalam laboratorium
$ragmen ini berada di urutan '88 ribu basis!pasangan% dan merupakan dasar bagi sebagian besar
IKAN probe
Persiapan dan Hibridisasi Proses
Skema prinsip (er#obaan IKAN pelokalan sebuah gen dalam inti
(ertama% probe dibangun (enyelidikan harus #ukup besar untuk berhibridisasi khusus dengan
target tetapi tidak terlalu besar untuk menghambat proses hibridisasi (enyidikan ini ditandai
langsung dengan fluorophores% dengan target untuk antibodi atau dengan biotin (enandaan
dapat dilakukan dengan berbagai #ara% seperti ni#k ter"emahan% atau (7& menggunakan tagged
nukleotida
Kemudian% sebuah interfase atau metafase kromosom persiapan dihasilkan Kromosom yang
melekat erat pada substrat% biasanya ka#a DNA sekuens berulang harus diblokir dengan
menambahkan potongan!potongan pendek DNA sampel (enyidikan ini kemudian diterapkan
pada kromosom DNA dan diinkubasi selama sekitar '* "am sementara hybridi9ing 6eberapa
langkah!langkah men#u#i menghapus semua atau sebagian!unhybridi9ed probe hibridisasi )asil
kemudian di5isualisasikan dan dihitung menggunakan mikroskop yang mampu menarik #airan
dan merekam gambar
:ika neon sinyal lemah% amplifikasi sinyal mungkin diperlukan dalam rangka untuk melampaui
ambang deteksi mikroskop $luores#ent kekuatan sinyal tergantung pada banyak faktor seperti
label probe efisiensi% "enis probe% dan "enis pewarna $luores#ently!tagged antibodi atau
strepta5idin terikat ke molekul pewarna Komponen sekunder ini dipilih sehingga mereka
memiliki sinyal yang kuat
IKAN eksperimen yang diran#ang untuk mendeteksi atau pelokalan ekspresi gen dalam sel dan
"aringan bergantung pada penggunaan gen reporter% seperti satu mengungkapkan green
fluores#ent protein% untuk memberikan sinyal fluoresensi
Fiber IKAN
Dalam teknik alternatif untuk interfase atau metafase persiapan% serat IKAN% interfase
kromosom melekat pada suatu slide dalam sedemikian rupa sehingga mereka berbaring dalam
garis lurus% bukannya melingkar erat% seperti dalam IKAN kon5ensional% atau mengadopsi
konformasi a#ak % seperti dalam interfase IKAN )al ini di#apai dengan menerapkan mekanik
geser sepan"ang slide% baik untuk sel!sel yang telah diperbaiki ke slide dan kemudian lysed% atau
larutan DNA dimurnikan Suatu teknik yang dikenal sebagai menyisir kromosom semakin
digunakan untuk tu"uan ini Konformasi perluasan kromosom resolusi yang lebih tinggi
memungkinkan se#ara dramatis ! bahkan sampai ke beberapa kilobases (ersiapan serat IKAN
sampel% meskipun se#ara konseptual sederhana% adalah seni yang #ukup terampil% dan hanya
khusus menggunakan teknik laboratorium se#ara rutin
[Sunting] Variasi probe dan analisis
Sel interfase positif untuk sebuah kromosom t (;< **) penataan ulang
IKAN adalah teknik yang sangat umum (erbedaan antara berbagai teknik IKAN biasanya
disebabkan oleh 5ariasi dalam urutan dan pelabelan dari probe% dan bagaimana mereka
digunakan dalam kombinasi 6eberapa modifikasi ini memungkinkan semua teknik IKAN
3kuran probe penting karena probe lagi berhibridisasi lebih spesifik daripada probe pendek
=umpang tindih mendefinisikan resolusi fitur dideteksi 4isalnya% "ika tu"uan per#obaan adalah
untuk mendeteksi breakpoint dari translokasi% maka tumpang tindih dari probe ! se"auh mana
suatu urutan DNA terdapat dalam yang berdekatan probe ! mendefinisikan "endela minimum di
mana breakpoint dapat dideteksi
(enyelidikan #ampuran menentukan urutan "enis fitur probe dapat mendeteksi (robe bahwa
berhibridisasi sepan"ang seluruh kromosom digunakan untuk menghitung "umlah kromosom
tertentu% menun"ukkan translokasi% atau ekstra!kromosom mengidentifikasi fragmen kromatin
)al ini sering disebut >seluruh!kromosom lukisan> :ika setiap kemungkinan probe yang
digunakan% setiap kromosom% (seluruh genom) akan ditandai fluores#ently% yang tidak akan
sangat berguna untuk menentukan urutan masing!masing fitur Namun% #ampuran probe yang
lebih ke#il dapat dibuat yang khusus untuk wilayah tertentu (lokus) DNA< #ampuran ini
digunakan untuk mendeteksi mutasi penghapusan Ketika dikombinasikan dengan warna
tertentu% suatu lokus #ampuran probe khusus digunakan untuk mendeteksi translokasi sangat
spesifik 0okus khusus #ampuran probe spesifik sering digunakan untuk menghitung kromosom%
dengan #ara mengikat ke #entromeri# daerah kromosom% yang #ukup unik untuk
mengidentifikasi setiap kromosom (dengan penge#ualian Kromosom ',% '- *'% **)
6erbagai teknik lain menggunakan #ampuran dari probe berwarna berbeda 6erbagai warna
dalam #ampuran dari pewarna fluores#ent dapat dideteksi% sehingga setiap kromosom manusia
dapat diidentifikasi dengan karakteristik warna seluruh!kromosom menggunakan probe
#ampuran dan rasio berbagai warna 4eskipun ada lebih kromosom mudah!dibedakan dari
#elupan berpendar warna% rasio #ampuran penyelidikan dapat digunakan untuk men#iptakan
warna sekunder. Serupa dengan genomik komparatif hibridisasi% pesawat untuk #ampuran warna
sekunder dibuat dengan men#ampur rasio yang benar dari dua set berwarna berbeda probe untuk
kromosom yang sama =eknik ini kadang!kadang disebut 4!IKAN $isika yang sama yang
membuat berbagai warna mungkin untuk 4!IKAN dapat digunakan untuk mendeteksi
translokasi ?aitu% warna yang berdekatan tampak tumpang tindih< warna sekunder diamati
6eberapa tes yang diran#ang sedemikian rupa sehingga warna sekunder akan hadir atau tidak ada
dalam kasus!kasus yang menarik 7ontoh adalah deteksi 67& @ A60 translokasi% di mana warna
sekunder menun"ukkan penyakit +ariasi ini sering disebut double!fusion IKAN atau D!IKAN
Dalam situasi yang berlawanan !!! di mana tidak adanya warna sekunder patologis !!!
diilustrasikan oleh assay digunakan untuk menyelidiki translokasi di mana hanya satu dari
breakpoints diketahui atau konstan 0o#us!probe khusus dibuat untuk satu sisi breakpoint dan
yang lainnya kromosom utuh Dalam sel!sel normal% warna sekunder diamati% tetapi hanya
warna primer adalah translokasi diamati bila ter"adi =eknik ini kadang!kadang disebut >break!
selain IKAN>
Q-IKAN
.!IKAN IKAN mengkombinasikan dengan (NAS dan perangkat lunak komputer untuk
mengukur intensitas fluoresensi =eknik ini digunakan se#ara rutin dalam telomer penelitian
pan"ang
Aliran-IKAN
$low!IKAN menggunakan flow #ytometry untuk melakukan IKAN se#ara otomatis
menggunakan per!sel fluoresensi pengukuran
Medical apliasi
Seringkali orangtua anak!anak dengan keterlambatan perkembangan ingin tahu lebih banyak
tentang kondisi anak mereka sebelum memilih untuk memiliki anak lagi Keprihatinan ini dapat
diatasi dengan analisis dari orang tua dan anak DNA Dalam kasus!kasus di mana
perkembangan anak penundaan itu tidak dipahami% penyebab dapat ditentukan dengan
menggunakan IKAN dan #ytogeneti# teknik 7ontoh penyakit yang didiagnosis dengan
menggunakan IKAN termasuk (rader!Ailli syndrome% sindrom Angelman% Sindrom delesi
**B',% myelogenous leukemia kronis% akut lymphoblasti# leukemia% 7ri!du!#hat%
+elo#ardiofa#ial sindrom% dan sindrom Down
Dalam kedokteran% IKAN dapat digunakan untuk membentuk sebuah diagnosis% untuk
menge5aluasi prognosis% atau untuk menge5aluasi pengampunan dari penyakit% seperti kanker
(erawatan dapat disesuaikan se#ara khusus 3"ian tradisional yang melibatkan analisis
kromosom metafase sering tidak dapat mengenali fitur!fitur yang membedakan satu penyakit dari
yang lain% karena kromosom halus fitur< IKAN dapat men"elaskan perbedaan!perbedaan ini
IKAN "uga dapat digunakan untuk mendeteksi sel!sel yang sakit lebih mudah daripada standar
7ytogeneti# metode% yang membutuhkan sel!sel membagi dan membutuhkan tenaga ker"a dan
waktu persiapan manual intensif dan analisis slide oleh teknolog IKAN% di sisi lain% tidak
memerlukan sel!sel hidup dan dapat diukur se#ara otomatis% komputer akan menghitung "umlah
titik!titik lampu neon sekarang Namun% teknologi yang terlatih diperlukan untuk membedakan
perbedaan!perbedaan yang halus dalam pola banding membungkuk dan memutar kromosom
metafase
[Sunting] Spesies identi!iasi
IKAN sering digunakan dalam studi klinis :ika seorang pasien yang diduga terinfeksi dengan
patogen% bakteri% dari pasien "aringan atau #airan% biasanya tumbuh di agar untuk menentukan
identitas patogen 6anyak bakteri% namun% bahkan terkenal spesies% tidak tumbuh baik di bawah
kondisi laboratorium IKAN dapat digunakan untuk mendeteksi se#ara langsung keberadaan
tersangka sampel ke#il "aringan pasien
IKAN "uga dapat digunakan untuk membandingkan dua biologis genom spesies% untuk
menyimpulkan e5olusi hubungan =eknik hibridisasi serupa disebut noda kebun binatang
IKAN bakteri probe sering primer untuk r&NA '2s daerah
IKAN se#ara luas digunakan dalam bidang ekologi mikroba% untuk mengidentifikasi
mikroorganisme 6iofilm% misalnya% terdiri dari kompleks (sering) multi!spesies bakteri
organisasi 4enyiapkan DNA probe untuk satu spesies dan melakukan IKAN dengan probe ini
memungkinkan seseorang untuk mem5isualisasikan distribusi spesies spesifik ini dalam biofilm
4empersiapkan probe (dalam dua warna yang berbeda) selama dua spesies memungkinkan
untuk mem5isualisasikan @ bela"ar bersama!lokalisasi kedua spesies dalam biofilm% dan dapat
berguna dalam menentukan arsitektur halus biofilm
"ab-on-a-chip dan IKAN
4i#rofluidi# #hip yang mengotomatisasi prosedur IKAN interfase =he mi#ro#hip ditampilkan
hanya memerlukan waktu beberapa menit dari setup oleh teknisi% sebagai lawan dari "am atau
hari ker"a yang diperlukan untuk melakukan IKAN dengan peralatan kon5ensional
4eskipun interfase fluores#en#e in situ hibridisasi (IKAN) adalah alat diagnostik yang sensitif
digunakan untuk mendeteksi kelainan kromosom pada sel!sel dengan dasar% biaya!per!test dan
kompleksitas teknis protokol IKAN saat ini telah menghambat penggunaan yang luas 0ab!on!a!
#hip atau perangkat mi#rofluidi#% menggabungkan "aringan mi#ro#hannels yang dapat
miniaturi9e% mengintegrasikan dan mengotomatisasi teknik analisis kon5ensional ke #hip!style
platform Se"ak mi#ro#hannels i9in tingkat #anggih kontrol fluida (turun ke pi#olitres)%
perangkat ini dapat mengurangi waktu analisis% reagen rendah konsumsi% dan meminimalkan
#ampur tangan manusia
Saat ini% IKAN telah dilakukan pada platform yang mi#rofluidi# ka#a membakukan banyak
protokol berulang menawarkan hasil yang akurat% biaya efektif dan lebih mudah diperoleh dalam
pengaturan klinis
Dibandingkan dengan metode IKAN kon5ensional% implementasi pertama ini on!#hip IKAN
menyediakan '8 kali lipat lebih tinggi throughput dan '8 kali lipat pengurangan biaya pengu"ian%
yang memungkinkan penilaian se#ara simultan dari beberapa kelainan kromosom atau pasien
C'D
)al ini semakin penting bahwa tes diagnostik menentukan "enis dan tingkat kelainan kromosom
untuk lebih banyak informasi diagnosis dan pilihan yang tepat strategi pengobatan Se"ak on!
#hip teknik IKAN sekitar '8!*8 kali lebih hemat biaya daripada metode kon5ensional% dan dapat
sepenuhnya terintegrasi dan otomatis
C*D%
teknologi ini akan membuat pengu"ian genetik luas
pasien lebih mudah dalam pengaturan klinis
Virtual ariotipe
+irtual karyotyping biaya lain yang efektif% klinis tersedia alternatif untuk menggunakan panel
IKAN ribuan sampai "utaan probe pada satu array untuk mendeteksi perubahan nomor menyalin%
genom!lebar% di resolusi belum pernah ter"adi sebelumnya
"ihat pula
In situ hibridisasi
4ole#ular Sitogenetika
+irtual kariotipe
)appy pemetaan
#aleri
0ain skematis dari proses
IKAN
4i#rofluidi# #hip yang menurunkan
biaya!per!tes IKAN sebesar ;8E
Dual label IKAN<
6ifidoba#teria 7y, F
=otal bakteri $I=7
$e!erensi
1. % Sieben% +:< 7S Debes marun% A4 (ilarski% 1+ Kaigala% 04 (ilarski% 7: 6a#khouse (*88G!
82) >IKAN dan keripik: analisis kromosom mi#rofluidi# platform> Iet Nanobiotechnology & (,):
*G!,/ Doi : '8'8-;@iet!nbt: *88288*' http:@@linkaiporg@link@HN6=@'@*G@' Diperoleh
*88;@8'@*2
2. % Sieben% +:< Debes 7S!marun% 04 (ilarski% 7: 6a#khouse (*88I!'') >4i#rofluidi# terpadu
kromosom #hip untuk enumerasi dengan menggunakan fluores#en#e in situ hibridisasi> Lab on a
Chip ' ('*): *'/'!*'/2 Doi : '8'8,;@bI'*--,d
http:@@wwwrs#org@publishing@"ournals@07@arti#leaspHdoiJbI'*--,d Diperoleh *88;@8,@*-
Annelie (ernthaler% :akob (ernthaler% &udolf Amann (*88*): $luores#en#e In Situ
)ibridisasi dan dikatalisis &eporter Kndapan untuk Kelautan Identifikasi 6akteri%
4ikrobiologi =erapan dan 0ingkungan% hal ,8;-!,'8' +ol 2I% No 2 DOI:
'8''*I@AK42I2,8;-!,'8'*88*
4i#hael Aagner% 4atthias )orn dan )olger Daims (*88,): $luores#en#e in situ
hibridisasi untuk identifikasi dan karakterisasi dari prokariota 7urrent Opini di
4ikrobiologi *88,% 2:,8*!,8; DOI: '8'8'2@S',2;!/*G- (8,) 888/-!G