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Practica N4 Determinacin De La Actividad De Las Enzimas Transaminasas

Propsito
Determinar la actividad de la enzima GPT en suero humano.

Marco Terico
Los aminocidos tienen un rol fundamental en los seres vivientes, ya que constituyen protenas y son precursores de
algunas hormonas y otros compuestos de inters biolgico (neurotransmisores, histamina, anillos porfirnicos,
nucletidos, etc.). El organismo puede sintetizar una parte de los -aminocidos para el suplemento proteico y otra
parte proviene de la dieta (aminocidos esenciales).
Las transaminaciones son reacciones de intercambio de un grupo amino entre dos grupos carbonados, siendo
reemplazado el grupo amino por una funcin cetona. El papel de las transaminaciones es doble:
1. Permiten realizar la interconversin de los aminocidos.
2. Posibilitan la separacin de la parte nitrogenada de los aminocidos apartados en exceso, constituyendo el
primer paso de catabolismo de aminocidos.
Las transaminasas son enzimas que cumplen la funcin de catalizar las transaminaciones para la produccin de los
aminocidos necesarios para la sntesis de protenas en el hgado. La Aspartato Aminotransferasa o Glutmico
Oxalactico Transaminasa (AST o GOT) se localiza sobre todo en la mitocondria y est presente en otros rganos adems
del hgado, como son: el miocardio, musculo esqueltico, riones, cerebro, pncreas, pulmn, leucocitos y eritrocitos.
Por el contrario la Alanino Aminotransferasa o Glutmico Pirvico Transaminasa (ALT o GPT) se localiza
fundamentalmente a nivel citoslico o en el hepatocito, lo que explica su mayor especificidad.
Determinaciones RANDOX
Mtodo colorimtrico (Reitman y Frankel) para la determinacin de transaminasas en suero. La actividad de las
transaminasas es proporcional a la cantidad de oxaloacetato y piruvato formados en un tiempo prefijado, medidos
colorimtricamente por la accin de la 2,4-dinitrofenil-hidrazina (DNFH) en un medio alcalino (tampn fosfatos:

en GOT;

en GPT).

GOT/AST GPT/ALT
La AST/GOT, cataliza la transferencia del grupo amino del
aspartato al oxoglutarato, con la formacin de glutamato
y oxaloacetato. Se mide por la monitorizacin de la
concentracin de oxaloacetato hidrazona formado con
2,4-dinitrofenil-hidrazinina.



La ALT/GPT, cataliza la transferencia del grupo amino de la
alanina al oxoglutarato, con la formacin de glutamato y
piruvato. Se mide por la monitorizacin de la
concentracin de piruvato hidrazona compuesto de 2.4-
dinitrofenil-hidrazina.




Valores Normales
El valor de transaminasas disminuye:
En caso de embarazo.
Insuficiencia vitamina B6.
El valor de transaminas aumenta debido a:
Anomalas hepticas: hepatitis virales, infecciosas o toxicas, cncer de hgado
o cualquier otra enfermedad que cause destruccin de las clulas hepticas.
Otras patologas: enfermedades autoinmunes, obesidad, sobrepeso,
alcoholismo, miopatas, infarto al miocardio, parasitosis y pancreatitis.
Esfuerzos musculares y traumatismos.
Edad: personas mayores de 60 aos pueden presentar niveles muy elevados de transaminasas.


GOT/ASP
Hombres
Mujeres

8-30


6-25


GPT/ALT
Hombres
Mujeres

8-35


6-25


Diagrama de Flujo

Extraer 2-3mL de sangre
venosa y colocar en un tubo
con heparina.
Centrifguar por 15 minutos
a 2000rpm.
Obtener el plasma
sanguineo sin
hemolizacion.
Kit ALT/GPT
Blanco
Aadir 100L de agua
destilada y 500L del
tampon (R1).
Muestra
Aadir 100L de muestra y
500L del tampon (R1).
Mezclar e incubar a
37C por 30min.
Aadir 500L
2,4-DNFH (R2).
Mezclar y reposar a
20-25C por 20 min.
Aadir 5mL de
NaOH (R3).
Mezclar y leer la
absorbancia de la
muestra a 546nm frente
al reactivo blanco al
cabo de 5min.
Kit AST/GOT
Blanco
Aadir 100L de agua
destilada y 500L del
tampon (R1).
Muestra
Aadir 100L de muestra y
500L del tampon (R1).
Mezclar e incubar a
37C por 30min.
Aadir 500L
2,4-DNFH (R2).
Mezclar y reposar a
20-25C por 20 min.
Aadir 5mL de
NaOH (R3).
Mezclar y leer la
absorbancia de la
muestra a 546nm frente
al reactivo blanco al
cabo de 5min.
Con un ayuno no menor
a 8 hrs y no mayor a
12hrs.
R1. Tampon GOT
Tampon fosfato
L-aspartato
-oxoglutarato
R2. 2.a-dinitrofenilhidrazina
R3. NaOH
R1. Tampon
Tampon fosfato
L-alanina
-oxoglutarato
R2. 2.a-dinitrofenilhidrazina
R3. NaOH

Disposicin de Residuos
Inactivar con hipoclorito de sodio y desechar en la tarja.

Resultados Valores de Referencia Kit RANDOX
Lectura absorbancia ALT: 0.105 ALT U/L AST U/L
Lectura absorbancia AST: 0.025 0.025 4 0.020 7
0.050 8 0.030 10
Paciente: -- 0.075 12 0.040 13
Sexo: Femenino Edad: 20 aos 0.100 17 0.050 16
Valor ALT: 8.33 U/L Valor AST: 17.85* U/L Valores Normales en suero: hasta 12U/L para ALT y AST.

Conclusiones
El procedimiento a seguir para la determinacin de actividad de transaminasas, as como los valores normales,
dependen del Kit a usar. Aunque la mayora de los Kits manejan una tcnica colorimtrica, los reactivos, como las
concentraciones y los clculos pueden variar, por lo cual es de suma importancia indicar el Kit que se us y manejar los
valores de referencia y normales que vienen indicados, para evitar algn error en la determinacin.
En este caso, el valor de ALT se encuentra dentro del lmite indicado, mientras que el valor de AST lo rebasa. Aunque el
alto valor de AST puede ser causado por alguna patologa, cabe destacar que la paciente no se encontraba en ayuno,
por lo cual el valor obtenido de AST pudo ser afectado, tambin puede ser debido a un error de toma de tiempos en las
incubaciones.

Cuestionario
1. Escriba la reaccin de la transaminasa TGP


2. Cules son los valores de referencia de la TGP?
Los valores normales de la TGP: 5 - 35 U/mL
3. Cul es el fundamento de la reaccin?
La enzima ALT cataliza la transferencia de un grupo amino desde el aminocido L-alanina hacia el -cetoglutarato
resultando de esta reaccin la formacin de piruvato y L-glutamato. La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la
reduccin del piruvato y la oxidacin simultnea de NADH a NAD
+
. La velocidad resultante de la disminucin de la
absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la ALT.
La transaminasa glutmica pirvica (TGP) del suero, llamada alanina aminotransferasa (ALT) es una de las enzimas que
catalizan el intercambio de grupos amino y oxo entre los -aminocidos y los -oxo cidos.
4. Dnde se encuentran la TGP en el organismo humano?
TGP (ALT o SGPT o GPT) es encontrado en su mayor parte en el hgado. Este no es producido exclusivamente por el
hgado, pero es donde se encuentra ms concentrado. Es liberado en la circulacin sangunea como resultado de dao
heptico. Sirve entonces como un indicador bastante especfico del estado del hgado.
5. Qu significado tiene una elevacin en la concentracin de la TGP?
TGP y TGO son indicadores sensibles de dao heptico en diferentes tipos de enfermedades. Ms debe ser enfatizado
que tener niveles ms altos que lo normal de estas enzimas no indica, necesariamente, una enfermedad heptica
establecida. Ellas pueden indicar algn problema o no. La interpretacin de los niveles altos de TGO e TGP depende del
cuadro clnico en general y as lo mejor es que esto sea determinado por mdicos experimentados en hepatologa.
Los niveles de estas enzimas no miden a extensin de dao en el hgado o muestran un pronstico de la marcha futura.
As, los niveles de TGO y TGP no pueden ser usados para determinar el grado de dao heptico o indicar el futuro. En
pacientes con hepatitis A aguda, las TGO y TGP son muy altos (algunas veces alcanzan millares de unidades), pero la
mayora de estos pacientes con la hepatitis A recupera completamente el hgado, no quedando ningn dao.
En la hepatitis C solo es observada una pequea elevacin en las TGO y TGP, siendo que algunos de estos pacientes
pueden haber avanzado para una enfermedad crnica con fibrosis o cirrosis.

Ejercicios de integracin
1. Haga un diagrama en el que exponga la participacin de la Glutamato deshidrogenasa y la Glutamino
sintetasa para producir glutamina a partir de amoniaco y -cetoglutarato

2. En general, Qu categoras de aminocidos son esenciales en los humanos y cules no lo son?
Los aminocidos esenciales (histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptfano y valina)
son requeridos en la dieta.
La arginina y cantidades suplementarias de histidina son requeridas durante periodos de crecimiento.
Los aminocidos no esenciales pueden ser sintetizados en el organismo. El esqueleto carbonado de 10 de los
aminocidos no esenciales puede ser derivado de la glucosa.
La cistena deriva su azufre del aminocido esencial metionina.
La tirosina se produce por hidroxilacin del aminocido esencial fenilalanina.
Los aminocidos son utilizados para la sntesis de muchos otros compuestos nitrogenados, tales como las bases
pricas y pirimdicas, hemo, creatina, nicotinamida, tiroxina, epinefrina y otras aminas nitrogenadas, melanina,
y esfngosina.
3. Haga una lista de los aminocidos esenciales para un adulto fenilcetonrico y comprelos con los
requerimientos de un adulto normal
La fenilcetonuria impide al organismo procesar adecuadamente la fenilalanina, uno de los aminocidos esenciales que
se encuentran en los alimentos que contienen protenas: carne, pescado, aves, huevos, leche y productos lcteos.

Adulto Normal Adulto Fenilcetonrico
Leucina
Isoleucina
Valina
Lisina
Treonina
Metionina
Fenilalanina
Triptfano
Leucina
Isoleucina
Valina
Lisina
Treonina
Metionina
--
Triptfano

4. Cuntos -aminocidos participan en el Ciclo de la Urea?
3: Glutamina, Alanina, cido glutmico
5. Con base en la respuesta anterior Cuntos pueden usarse para la sntesis de protenas?
Se conoce como sntesis de protenas al proceso por el cual se componen nuevas protenas a partir de los veinte
aminocidos esenciales. En este proceso, se transcribe el ADN en ARN. La sntesis de protenas se realiza en los
ribosomas situados en el citoplasma celular. Entonces los 3 pueden usarse.

Referencias
Catabolismo De Los Aminocidos: Transaminaciones
file:///C:Users/Kiddo/Downloads/16589242.TP%20N%C2%BA%202%=Metabolismo%20de%20Prote%C3%ADna
s%20y%20AAs%20-%20Enzimas%20Transaminasas.pdf
Consultado 09/09/2014
Transaminasas: GOT y GPT
http://salud.kioskea.net/faq/2161-transsaminasas-got-y-gpt
Consultado 09/09/2014
GOT/GPT Color- LINEAR CHEMICALS
http://www.linear.es/ficheros/archivos/1130010C.pdf
Consultado 09/09/2014
El Paciente Con Transaminasas Altas
http://www3.caes.es/archivos_pdf/download/panda/modulo5/REVI5.PDF
Consultado 09/09/2014
Las Transaminasas AST o TGO - ALT o TGP
http://hepato.com/p_transaminases/011_transamin_esp.php
Consultado 23/09/2014
Procedimiento De ALT (TGP) Para La Determinacin Cuantitativa De Alanina Aminotransferasa En Suero UV
http://www.cimascientific.com/2250S.htm
Consultado 23/09/2014
Metabolismo De Aminocidos: Degradacin, Sntesis, Utilizacin
http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/4_Metabolismo/3-Aminoacidos/1-
MetabolismodeAminoacidos.pdf
Consultado 23/09/2014
Las Protenas
http://proteinas.org.es/sintesis-proteinas
Consultado 23/09/2014

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